实验五微生物培养基
的配制和灭菌
?目的要求
?实验材料
?实验程序
目的要求
?了解培养基(普通营养琼脂、乳糖胆盐发
酵管等)的配制原理和方法，掌握其配制
过程。
? 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和
加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
? 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工
作及操作方法。
实验材料
?药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蛋白胨、
乳糖、胆盐、溴钾酚紫等。
? 高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱。
? 其它：天平、牛角匙、电炉、1N NaOH、pH试
纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带
玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空
试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳
索、棉花、标签等。
实验程序
?培养基的配制
? 分离培养微生物常用器皿的准备
? 培养基和玻璃器材的灭菌方法
培养基的配制
?培养基的种类
? 培养基的配制方法和步骤
? 三种培养基的配方及配制
? 无菌水的制备
培养基的种类
? 据组成成分可分为:
1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。
2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物
质配制而成。
3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。
? 从培养基的物理状态可分为
1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。
2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固
体状态的培养基或农副产品培养基。
3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.2—0.5%凝固剂而
成的半固体状培养基。
培养基的种类
常用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。
培养基的配制方法和步骤
? 称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。
? 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶
解。
? 调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对
照。
? 加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。
半固体： 1/3
液体分装试管 <1/4
? 分装：注意不要污染棉塞三角烧瓶<1/2
固体分装试管 <1/5
三角烧瓶 <1/2
培养基的配制方法和步骤
?分装
?加塞
培养基的配制方法和步骤
? 包扎、标记：包扎成捆，标签，注明何种培养基。
? 灭菌：牛肉膏蛋白胨培养基
伊红美兰培养基 1210C，15min
生理盐水
乳糖胆盐发酵管 1150C，15min
? 搁置斜面: <1/2
? 无菌检查：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养
24~48h，确定无菌生长，方可使用。
培养基的配制方法和步骤
三种培养基的配方及配制
? 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（用于分离和培养细
菌，是一种天然培养基）配方如下：
牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
琼脂 15~20g
自来水 1000ml
pH 7.2~7.4
灭菌 1.05kg/cm2，15min
三种培养基的配方及配制
? 乳糖胆盐发酵管（用于分离和培养大肠菌群）
配方如下：
蛋白胨 40g
乳糖 20g
胆盐 10g
0.04%溴钾酚紫水溶液 50ml
自来水 1000ml
pH 7.4
灭菌 115℃15min
三种培养基的配方及配制
? 伊红美兰培养基（用于分离和鉴别大肠菌群）
配方如下：
伊红美兰培养基 36g
自来水 1000ml
pH 7.1
灭菌 121℃15min
三种培养基的配方及配制
? 无菌生理盐水的制备（用于制作样品稀释液）
配方如下：
氯化钠 0.85~0.9g
自来水 100ml
灭菌 121℃15min
500mL三角烧瓶（装有玻璃珠），分装225ml
18x80试管，分9.0ml
分离培养微生物常用器皿的准备
? 清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等。
? 棉塞的制作: 包装培养皿和吸管等。
培养基和玻璃器材的灭菌方法
湿热比干热灭菌:
更易于传递热量；
更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构；
培养基和玻璃器材的灭菌方法
加压蒸汽灭菌法 其步骤如下：
1.灭菌器内加入一定量的水
2.将用防水纸包扎好的物品放入其中。
3.接通电源，进行加热。
4.排气：排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气
后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开
排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。
5.升压保温：当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，此时灭菌器
内的温度为1210C，维持15min。对热不稳定的培养基如含有葡萄
糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。
6.降压、取料：灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才
能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。
7.摆放物品
培养基和玻璃器材的灭菌方法
培养基和玻璃器材的灭菌方法
培养基和玻璃器材的灭菌方法
? 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器
其步骤如下：
1.将包扎好的物品放入电热烘箱。
2.接通电源，设定参数。
3.升温。
4. 160~1700C，维持2h。
5.降温
6.开箱取物。待压力降至<700C时，才能打电热烘箱，
取出物品。
培养基和玻璃器材的灭菌方法
? 间歇灭菌法：
待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，每
次煮沸1h，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物
品（指培养基）放在370C恒温条件下培养过夜，这样可
以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便
下次蒸煮时杀灭。
? 过滤除菌法：
不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般
可用细菌过滤器进行除菌。
培养基和玻璃器材的灭菌方法
培养基和玻璃器材的灭菌方法
? 紫外线灭菌法：
一般30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射
0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化
学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿
透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因
此只适用于空气及表面杀菌。
? 化学药剂消毒灭菌：
微生物实验室中常用的化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、
酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶
液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂。
培养基和玻璃器材的灭菌方法
思考题
? 固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问
题？
? 培养基中加琼脂的作用是什么？
? 干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌的场合有
何不同？
? 如何检查培养基灭菌是否彻底？
