第九章 血清学反应
第一节 概 述
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一 血清学反应的概念及一般特点
抗原及相应抗体在体内或体外均能发生特异性
结合，在体外结合能发生可见免疫反应。由于抗体
主要存在于血清中，故称为血清学反应。
血清学反应根据抗原性质、反应条件、参与反
应物质，则表现出反应有多种多样。其反应的一般
特点是：
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（一）特异性和交叉性
血清学反应具有高度特异性。由于抗原决定
簇的组成、结构以及排列不同，所诱导产生的抗
体也不同。抗原只能与相应抗体结合，而不能与
其他抗体相结合。
生物体的组成是复杂的，包含有多种抗原成
分，在进化过程中形成不同的种类，有各不相同
的特异性抗原，在亲缘种系中往往含有部分相同
的抗原成分，能引起交叉反应。
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（二）结合的可逆性
抗原抗体结合是分子表面结合，这一结
合受理化因素的影响，当温度超过 60?C或 pH
降至 3以下时，则抗原抗体复合物又重新离
群。离群后的抗原、抗体，其理化性质、免
疫活性保留。利用抗原抗体结合的可逆性，
可进行免疫吸附层析，纯化抗原或抗体。
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（三）最适比与带现象
抗原与抗体结合，其比例适当时才可出现可见反应。
当抗原抗体比例适当时，两者结合后，尚有未饱和的结
合点，可以继续与游离的抗体、抗原或与抗原抗体的结
合物的未饱和点相联结，逐渐形成愈来愈大的复合物，
出现了肉眼可见反应。比例最适合，出现反应最快，反
应产物愈多。
如果抗原或抗体过多，抗体和抗原结合点的聚合一
开始时即达到饱和，形成小的复合物则不能继续与相邻
抗原、抗体结合，不出现可见反应，谓之区带现象或带
现象。为了避免血清学反应的带现象，需要将抗原或抗
体作适当的稀释。
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? 比例不适合 — 不能完成第二步反应 — 带现象
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（四）反应的阶段性
抗原与抗体进行结合，可分为两个阶段：
第一阶段为抗原与抗体的特异性结合阶段，反
应快，几秒钟至几分钟即完成，但无可见反应；
第二阶段为抗原与抗体的反应可见阶段，表现
为凝集、沉淀、补体结合等，反应进行较慢，需几
分钟或更久。第二阶段受电解质、温度,pH值等影
响。两个阶段在反应进行中无严格界限。
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（五）影响反应的因素
1.电解质
血清学反应须在适当浓度的电解质参与下，
才出现可见反应。在凝集、沉淀反应操作时，一
般用生理盐水或 8%— 10%高渗盐水作稀释，才出现
较强反应。
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2.温度
温度升高，可增加抗原与抗体分子运动而碰撞接触，
加速反应的出现，故通常将抗原抗体混合后，放置 37?C
温箱或水浴箱中，保持一定时间，促进反应。温度高，
加速反应；温度低，反应时间延长，但反应结合充分，
故在补体结合反应、免疫吸附实验中，采用的低温中放
置过夜。
3.酸碱度
血清学反应通常用 pH6～ 8，过酸或过碱都可使复合
物离群,pH值在等电点时，可引起非特异凝集。
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二 血清学反应的类型和参与成分
(见课本表 9-1)
三 血清学反应的应用方式和目的
抗原抗体反应是特异性的，在应用时必须有一个是
已知的，通过反应来鉴定另一个未知的。例如鉴定某一
病原微生物时，多用已知抗体。诊断传染病时，对慢性
病可用已知的抗原检测未知的特异性抗体；诊断急性病
则用已知的抗体检测未知的抗原（病原），如炭疽病等。
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（一）抗原与抗体的快速检测
在诊断传染病、寄生虫病、变态反应、肿瘤、
自身免疫疾病时，均已广泛应用血清学方法检查抗
体或抗原（细菌、病毒）的存在，作为诊断疾病的
手段。现已应用的间接血凝技术、对流电泳、标记
抗体技术，均能快速、简便的确诊抗原或抗体。
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（二）生物活性物质的超微定量
应用酶联免疫吸附实验、放射免疫等技术，抗原抗体检
测的敏感度均大为提高，已达到能精确测出 Pg的水平，其敏
感度已大大超过了常规的化学分析。此类技术已应用于测定
动物体内的激素、维生素、药物及其他病理过程中的微量产
物。
（三）抗原或抗体在细胞与亚细胞水平的定位
用荧光抗体、酶标抗体技术，可以检测病毒或细菌在动
物各种组织细胞中的分布。应用免疫酶组化法及铁蛋白标记
技术进行免疫电镜观察，可以测定病毒在亚细胞水平的定位，
也可测定淋巴细胞表面免疫球蛋白及抗体的产生情况。据此
可分析传染病发生的机制及对免疫机理的探讨。
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（四）微生物的鉴定与分析
应用交叉凝集实验、凝集吸收实验、沉淀实验等
血清学实验，进行微生物的鉴定及区别微生物的血清
型，从而确定微生物的类型及其亲缘关系。还可应用
琼脂扩散实验、免疫电泳等技术，对微生物的抗原组
分进行分析。
（五）血型鉴定
用细胞直接凝集实验、血凝抑制实验、溶血实验、
Coomb实验等技术，可作血型鉴定、亲子关系的确定、
新生儿和出生幼畜溶血病的诊断。
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第二节 沉淀试验
可溶性抗原与相应抗体结合, 在适量电解质存在
下, 形成肉眼可见的絮状白色沉淀, 称之为沉淀试验 。
可溶性抗原 + 免疫血清 出现沉淀现象
(病毒等 ) （ 抗体 ） 比例适合
沉淀原 沉淀素 比例不适合 无沉淀现象
容易过多 前带现象
0.85%NaCl
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一 液相沉淀试验
1,环状沉淀试验
原理：小试管内，下层沉
淀素与上层沉淀原
在液界面应形成白
色沉淀环。
用途：检测皮毛中的炭疽
杆菌抗原（ Ascoli试验）
2,絮状沉淀试验
抗原与抗体在试管内混合，在电解质的存在下抗原
抗体复合物可形成絮状凝聚物。此法多用于毒素和抗毒
素测定。
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二 琼脂扩散试验
琼脂是一种含有硫酸基的多糖，加热溶解于水，冷
却后凝固成凝胶，琼脂凝胶是一种多孔结构，其孔径大
小与琼脂含量有关,1%琼脂凝胶孔径为 85nm，能使许多
可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散。当抗原与抗体在凝胶
中的一定位置上相遇时，则两者结合形成沉淀线。沉淀
线的位置与抗原、抗体颗粒的大小、浓度，沉淀线的数
目和所含抗原组分有关。琼脂扩散可分为单扩散（抗原
或抗体中一种成分扩散）和双扩散。
根据其扩散的方向可分为单向单扩、单向双扩、双
向单扩、双向双扩，其中双向双扩应用最广。
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1,单向单扩散
亦称 Oudin。将 0.6%-1%琼脂加热熔化后，加
入定量经预热的稀释抗血清，混合均匀后，加入
小试管中，待凝固后加入 0.5ml抗原于其上，直立，
置于 37?C中,2-3h后出现沉淀线。由于抗原的扩
散，使沉淀线不断向下推移，而最初形成的沉淀
带随抗原的扩散而向下推移，最后稳定。沉淀带
距抗原愈近，其浓度愈大，可作抗原浓度测定。
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2, 单向双扩散
亦称 Oakley。基本作法同上，但在抗原与抗体之间加一层
不含抗体的盐水琼脂，抗原与抗体均向中间琼脂扩散，形成沉
淀带。主要用于抗原成分的分析。
3, 双向单扩散
亦称辐射扩散。在平皿或玻板上进行。用 2%缓冲琼脂盐水，
加热融化，待冷后加入经预热的抗血清（用 1,5-10倍稀释），
混合后倒入平皿或玻板上，厚 2-3mm。凝固后在凝胶板上打孔，
孔径 2-3mm，孔内滴加抗原液，放置湿盒中 37?C下扩散。抗原在
孔内向四周扩散，与凝胶中的抗体接触，形成白色沉淀环，白
环的大小随抗原的浓度而增大。此法在兽医临床上用于蛋白质
定量实验。
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4．双向琼脂扩散（琼扩）
此法系采用 1%琼脂倒于平皿或玻片上，制成凝胶板，可
按需要打孔。将抗原、抗体分别滴入孔内，放置湿盒中，在
37?C湿箱中 24-72h后观察。在抗原与抗体孔间形成沉淀带。每
一种抗原成分出现一条沉淀带。
结果判断：
如两个相邻孔之间抗原
相同，则沉淀带融合；抗
原则不同，则互相交叉；
部分相同则部分融合，
另外不同部分则交叉。
特点,简便、敏感性低、耗时、应用最广
用途,常用于细菌、病毒的鉴定，抗血清效价的测定，抗原组分
的分析及传染病的诊断等，如马传染性贫血病的诊断。
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三,免疫电泳
琼脂扩散与电泳技术结合起来称免疫电泳。由于抗原颗粒带
电荷不同，在同一电场中其泳动速度不同，故起迁移率不同，因
而通过电泳可将抗原成分分开。停止电泳后加抗血清进行扩散，
如有一队抗原抗体出现一条沉淀线，因而大大加强了免疫扩散的
分辨率及敏感性。此法可应用于抗原成分及含量成分的分析、免
疫球蛋白纯度的鉴定，以及传染病的快速诊断等。
1,微量免疫电泳
用 pH8.6的巴比妥缓冲液（ VB液）配成 1%的琼脂液，制成凝
胶板。在凝胶板 1/3处打孔 2个，孔径 2-3mm，两孔间距 10-12mm。
孔内滴加抗原，置于电泳槽上，两端用滤纸或纱布做桥，连接电
泳液。电泳时，按凝胶板宽度测电流，电泳 45min-2h。电泳完毕，
滴加抗血清，进行扩散。抗原成分不同，泳动速度不同，与抗血
清形成数条清晰的沉淀弧。本法用于血清成分分析及提取的 Ig纯
度鉴定。
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正常人血清蛋白的免疫图象
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2．对流免疫电泳
试验时在凝胶板上打孔，两孔为一组，并排打孔两组，
然后加样。抗原滴入负极端孔内，抗体滴入正极端孔内，进
行电泳。泳动 30-90min，观察结果。在两孔之间出现沉淀带，
为阳性反应。
结果判断, Ag Ab
特点,反应时间短, 敏感性提高
用途,定性, 已不多用 （ 水貂阿留申病, 以病原 Ag检测病貂血
清中的抗体 ）
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3,火箭电泳
将双向单扩散与电泳技术结合起来，其沉淀线似火
箭，故称火箭电泳。
本法将琼脂融化、冷却，在融化的琼脂中加入一定
量的已知抗血清，制成凝胶板。在其一端打一小列孔，
分别在孔中加入待检抗原或已知抗原，放置电泳槽中，
加样品端位于负极，用双层滤纸连接琼脂板的槽内缓冲
液，接通电源，板端电压 4V/cm，电流 3mA/cm，电泳 2-
10h。电泳后，抗原在有抗血清琼脂板内向正极迁移，前
端与抗体接触，形成火箭状况沉淀弧。在同一抗体浓度
下形成峰的高低，与抗原浓度大小成正比。本法用于抗
原量的测定（先用已知抗原浓度测定制成曲线）。
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火箭电泳图
①②③为标本；④⑤⑥为标准抗原
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第三节 凝集试验
细菌、红细胞等颗粒状态的抗原与相应的抗
体结合后，在电解质存在时相互凝集成絮片状团
块，这种试验称为凝集试验（ Agglutiation
test）。
参与反应的抗原叫凝集原；参与反应的抗体
称为凝集素，主要有 IgG,IgM。凝集实验有直接
凝集试验和间接凝集试验两种。
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基本原理,
生理盐水
颗粒性抗原 + 相应抗血清 抗原颗粒凝集
(细菌, 红细胞 ) 比例适合
凝集原 凝集素
过多 后带现象
（ 稀释血清 ）
一、直接凝集试验
颗粒性抗原与相应抗体在电解质的参与下，直接结
合，凝集成团的现象，称直接凝集试验。按其操作方法
可分为玻片发和试管法。
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1．玻片凝集试验
将已知的抗血清 1-2滴，滴于清洁玻片上，取待检菌液
（抗原）加于其上，混合均匀，数分钟后可出现颗粒状或
絮片状凝集，谓之阳性反应。。
特点,简单、快速
用途,定性，细菌鉴定、血型鉴定。如用已知的沙门
氏菌血清，鉴定沙门氏杆菌的抗原组分以定型。此法也用
于畜禽传染病诊断，如用已知的鸡白痢有色平板抗原，检
查鸡血清中有无相应抗体，进行鸡白痢检疫
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2．试管凝集试验
是一种定性与定量相结合的方法。试验时用一列
试管，将待检血清用 0.5%石炭酸生理盐水作 10倍递进
稀释，每管维持量为 0.5ml，一管不加血清作对照。每
管中加入一定浓度的抗原 0.5ml，混合均匀，在 37?C或
室温下静置数小时，观察液体的亮度及沉淀物，视不
同的凝集程度记录为 ++++（ 100%菌体凝集）,+++
（ 75%凝集）,+（ 25%凝集）。
凡能与一定量抗原发生 50%凝集（ ++）的血清最高
稀释度，为血清的凝集价或效价（滴度）。在试验时，
必须建立阴性、阳性血清对照管。
特点,准确、耗时
用途,诊断布氏杆菌病，测定抗体的凝集价 (定量 )
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二, 间接凝集试验
基本原理：
可溶性抗原 +惰性载体 （ 聚苯乙烯乳胶微粒, 炭粒,
绵羊红细胞等 ） 抗原致敏载体
抗原致敏载体 +相应免疫血清 (抗体 ) 电解质
被动载体凝集 (间接乳胶凝集, 间接炭素凝集, 间接
红细胞凝集等 )
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特点,敏感 (在微量反应板中进行试验 )、快速。
用途,用已知抗原致敏的载体可检测血清中的
特异抗体及其效价。
若用已知免疫血清（ Ab）致敏的红细胞，
则可检测病毒等可溶性抗原 —— 称为反向间接
血凝试验。
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（正向）间接凝集反应原理示意图
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（反向）间接凝集反应原理示意图
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间接凝集抑制反应原理示意图
A：标本中含抗原 B：标本中不含抗原
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三、抗球蛋白试验
抗球蛋白试验系 Coombs等首先创立，故又称 Coombs试验。
试验主要用于测定单价抗体（不完全抗体）。在正常凝集试
验时，应用本法可提高其敏感度。单价抗体与颗粒抗原相结
合，不出现可见的凝集反应，但该抗原表面决定簇已被单价
抗体所封闭，不能与相应的完全抗体相结合而发生凝集现象，
故谓之阻断试验。阻断试验特异性不高，故很少使用，现多
用抗球蛋白试验。由于抗体本身就是一种良好的抗原，用该
动物的正常免疫球蛋白免疫异种动物，可获得抗球蛋白的抗
体。抗球蛋白的抗体与已吸附单价抗体的颗粒抗原相结合，
即可发生凝集，其实质也是一种间接凝集。本法用于人 Rh血
型测定及布氏杆菌单价抗体的检测。
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第四节 与补体有关的试验
一、补体的性质
补体是存在于正常动物血清中的一组蛋白质。
补体没有特异性，它能与任何抗原抗体复合物相结
合，但不能与游离的抗原或抗体相结合。
补体与抗原抗体的复合物结合后，可出现溶血反应、
溶菌反应、补体结合反应、凝集反应、免疫黏膜试验等。
由于补体具有这一特性，故常用其来检验抗原或抗体是
否发生特异性结合，特异性抗原或抗体是否存在。
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二、溶解试验
1.溶血试验
红细胞与相应的抗体（溶血素）相结合后，在
补体的参与下，可发生溶血反应（直接溶血反应），
以作补体结合反应的指示系统。
吸附抗原的红细胞与抗体结合后，在补体存在
下可以引起溶血反应，这种反应称为间接溶血反应。
间接溶血反应只能用新鲜红细胞，而新鲜红细胞不
易保存，限制了本法的应用。
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2.溶菌试验
某些细菌（如霍乱弧菌）与抗体结合后，如有
补体存在，可发生细菌溶解或被杀死，这种反应称
为溶菌反应或杀菌反应。
本试验的测定可用比浊法。也可用菌落计数
法；。本法敏感性高，但细菌抗原容易被溶解，且
操作时间较长。
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三．补体参与的试验 — 补体结合试验
1．参与反应：抗原抗体反应系统、补体（豚鼠血清）、
指示系统（绵羊红细胞、溶血素）。
2．反应原理：（如下图所示）。
3．特点：敏感性特异性高。
正式试验前要进行下列测定，操作较繁（溶血素
效价、补体效价、抗原效价）。
4．用途：用于牛肺疫、副结核、布氏杆菌病、锥虫病、
马传贫、鼻疽等的检疫。
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中和试验 （病毒、毒素中和试验）
原理,病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易
感动物、鸡或鸡胚、细胞的活性。
例 1
NDV 9～ 11d鸡胚 24～ 48h 鸡胚死亡
NDV+抗血清 9～ 11d鸡胚 鸡胚不死亡
第四节 中和试验
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例 2
口蹄疫病毒 (FMDV) 4～ 7d乳鼠 乳鼠死亡
FMDV+抗血清 4～ 7d乳鼠 乳鼠不死亡
用途：
1.用已知血清鉴定病毒 —— 诊断病毒病
2.用已知病毒检测血清抗体 —— 诊断病毒感染，测定病毒
免疫血清效价（中和价）。
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第六节 免疫标记技术
免疫标记技术即是将某一个特定的易于检测的分
子或原子，联结在抗体或抗原上，利用抗体（或抗原）
能与相应的抗原（或抗体）结合的特性，从而检测抗
原或抗体的存在及所在部位（定位）。
免疫标记技术是近年来研究血清学反应的一项新
技术。这项技术大大开拓了免疫学的应用范畴，使血
清学反应进入了一个新的天地。它不仅可以用于抗原
抗体的定性、定量，还可用于抗原抗体的定位。由于
其反应的特异性敏感性高，不但在诊断疾病时广为应
用，亦可应用于生物领域其他方面。
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1.荧光标记抗体技术（免疫荧光技术）
免疫荧光技术是将荧光染料标记在抗体球蛋白分子上，
制成荧光抗体。当荧光抗体与相应抗原结合时，就形成带
有荧光的抗原抗体复合物，在荧光显微镜下，可观察到此
复合物发出的荧光。可检测标本中某种抗原的存在或抗原
所在的部位（定位）。
原理,荧光素（ F） + Ab AbF(FITC） )
AbF + Ag Ag- AbF 紫外光 Ag- AbF
用途,用 AbF检测抗原 （定性、定位）
特点,敏感，需荧光显微镜
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方法,直接法 间接法
F
F
Ag
Ag
比较,检测一种抗原 标记一种动物的 γ
就须标记特异 球蛋白 AbF，就能
的一种 AbF 检测多种抗原
较特异 较敏感
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2.酶标记抗体技术（酶免疫测定技术）
（ 1） 间接法 （ 2）双抗体夹心法
原理,
用途,已知抗原、酶标 已知血清抗体、酶
抗体测血清抗体 标抗体测抗原
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3,放射免疫测定法
原理, Ag+AbR Ag-AbR
或 AgR+Ab AgR-Ab
用液相闪烁仪测 R放出的射线量
特点,敏感性极高，需高级闪烁仪
同位素对人有放射性危害
用途,用于药物、激素、酶、肿瘤抗原等测定
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四、其他免疫标记技术
（一）免疫电镜技术
将免疫学技术与电镜技术结合起来，发展成一种血清
学反应超微技术，应用于抗原或抗体的定位，达到亚细胞
水平。
（二）生物素 -亲和素标记技术
生物素即维生素 H，在动物体内广泛存在，以蛋白、
肝、肾等组织中的含量为最高。亲和素又称抗生物素，对
生物素有较强的亲和力，结合常数高。近年来，利用生物
素与亲和素结合，成为一种生物素 -亲和素系统 。
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（三）核酸探针技术
微生物的遗传物质就是 DNA。核苷酸是由磷酸、核
糖和碱基组成的，而多核苷酸则是由若干个核苷酸连
接成的一个大的聚合物。
核酸探针具有检测的灵敏度高，特异性强，是按碱
基配对和核酸碱基顺序进行的；使用方便，不需特殊仪
器等特点。
核酸探针可用于鉴定病毒、细菌以及某些真核细胞。
对那些不易分离培养的病毒可以直接鉴定。
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第七节 葡萄球菌 A蛋白及其应用
葡萄球菌 A蛋白是大多数金黄色葡萄球菌细胞壁
上所含的一种成分，具有多种生物学特性，能与人及
多种哺乳动物的 IgG的 Fc段呈非特异性结合，结合后
仍保持其抗体活性。同时与酶、荧光颜料偶联，因而
应用于免疫领域。
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一、葡萄球菌 A蛋白的主要特性
葡萄球菌 A蛋白是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种成分，
存在于细菌表面，胞膜中含量很少。金色葡萄球菌的 Cowan株
葡萄球菌含大量 A蛋白。等电点 pH5.1，对热稳定，经 100℃ 1h
后仍保持与 IgG结合的活性。
葡萄球菌 A蛋白可以与人及多种哺乳动物（如猪、兔、小
白鼠）的 IgG结合，并在琼脂中形成沉淀线。葡萄球菌 A蛋白能
与人的 IgG1,IgG2,IgG4及猪的 IgG等结合，形成复合物。这
种结合是一种假免疫反应，是一种与 IgG Fc段非特异的化学结
合，结合后能激活补体，亦仍保持 Fab的免疫活性。这一活性，
已应用于 免疫学领域中。
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二,葡萄球菌 A蛋白在免疫学上的应用
（一）协同凝集试验
细胞壁上葡萄球菌 A蛋白与抗体结合，被覆
着特异性抗体的金黄色葡萄球菌与相应的抗原结
合时，就可使互相联结引起协同凝集反应。这种
方法应用于多种细菌和某些病毒的快速诊断。
试验方法常采用玻片法，也可采用试管凝集
法，每种方法均应设不含葡萄球菌 A蛋白的阴性
菌液对照。
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（二）标记葡萄球菌 A蛋白技术
从富含葡萄球菌 A蛋白的菌株中，提取葡萄球
菌 A成分，用酶、荧光染料标记，代替标记第二抗
体，用于检测抗体或抗原。此法可避免制造第二抗
体的麻烦，保存期长，因而广泛应用于实验室诊断
中。
end
第一节 概 述
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一 血清学反应的概念及一般特点
抗原及相应抗体在体内或体外均能发生特异性
结合，在体外结合能发生可见免疫反应。由于抗体
主要存在于血清中，故称为血清学反应。
血清学反应根据抗原性质、反应条件、参与反
应物质，则表现出反应有多种多样。其反应的一般
特点是：
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（一）特异性和交叉性
血清学反应具有高度特异性。由于抗原决定
簇的组成、结构以及排列不同，所诱导产生的抗
体也不同。抗原只能与相应抗体结合，而不能与
其他抗体相结合。
生物体的组成是复杂的，包含有多种抗原成
分，在进化过程中形成不同的种类，有各不相同
的特异性抗原，在亲缘种系中往往含有部分相同
的抗原成分，能引起交叉反应。
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（二）结合的可逆性
抗原抗体结合是分子表面结合，这一结
合受理化因素的影响，当温度超过 60?C或 pH
降至 3以下时，则抗原抗体复合物又重新离
群。离群后的抗原、抗体，其理化性质、免
疫活性保留。利用抗原抗体结合的可逆性，
可进行免疫吸附层析，纯化抗原或抗体。
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（三）最适比与带现象
抗原与抗体结合，其比例适当时才可出现可见反应。
当抗原抗体比例适当时，两者结合后，尚有未饱和的结
合点，可以继续与游离的抗体、抗原或与抗原抗体的结
合物的未饱和点相联结，逐渐形成愈来愈大的复合物，
出现了肉眼可见反应。比例最适合，出现反应最快，反
应产物愈多。
如果抗原或抗体过多，抗体和抗原结合点的聚合一
开始时即达到饱和，形成小的复合物则不能继续与相邻
抗原、抗体结合，不出现可见反应，谓之区带现象或带
现象。为了避免血清学反应的带现象，需要将抗原或抗
体作适当的稀释。
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? 比例不适合 — 不能完成第二步反应 — 带现象
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（四）反应的阶段性
抗原与抗体进行结合，可分为两个阶段：
第一阶段为抗原与抗体的特异性结合阶段，反
应快，几秒钟至几分钟即完成，但无可见反应；
第二阶段为抗原与抗体的反应可见阶段，表现
为凝集、沉淀、补体结合等，反应进行较慢，需几
分钟或更久。第二阶段受电解质、温度,pH值等影
响。两个阶段在反应进行中无严格界限。
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（五）影响反应的因素
1.电解质
血清学反应须在适当浓度的电解质参与下，
才出现可见反应。在凝集、沉淀反应操作时，一
般用生理盐水或 8%— 10%高渗盐水作稀释，才出现
较强反应。
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2.温度
温度升高，可增加抗原与抗体分子运动而碰撞接触，
加速反应的出现，故通常将抗原抗体混合后，放置 37?C
温箱或水浴箱中，保持一定时间，促进反应。温度高，
加速反应；温度低，反应时间延长，但反应结合充分，
故在补体结合反应、免疫吸附实验中，采用的低温中放
置过夜。
3.酸碱度
血清学反应通常用 pH6～ 8，过酸或过碱都可使复合
物离群,pH值在等电点时，可引起非特异凝集。
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二 血清学反应的类型和参与成分
(见课本表 9-1)
三 血清学反应的应用方式和目的
抗原抗体反应是特异性的，在应用时必须有一个是
已知的，通过反应来鉴定另一个未知的。例如鉴定某一
病原微生物时，多用已知抗体。诊断传染病时，对慢性
病可用已知的抗原检测未知的特异性抗体；诊断急性病
则用已知的抗体检测未知的抗原（病原），如炭疽病等。
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（一）抗原与抗体的快速检测
在诊断传染病、寄生虫病、变态反应、肿瘤、
自身免疫疾病时，均已广泛应用血清学方法检查抗
体或抗原（细菌、病毒）的存在，作为诊断疾病的
手段。现已应用的间接血凝技术、对流电泳、标记
抗体技术，均能快速、简便的确诊抗原或抗体。
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（二）生物活性物质的超微定量
应用酶联免疫吸附实验、放射免疫等技术，抗原抗体检
测的敏感度均大为提高，已达到能精确测出 Pg的水平，其敏
感度已大大超过了常规的化学分析。此类技术已应用于测定
动物体内的激素、维生素、药物及其他病理过程中的微量产
物。
（三）抗原或抗体在细胞与亚细胞水平的定位
用荧光抗体、酶标抗体技术，可以检测病毒或细菌在动
物各种组织细胞中的分布。应用免疫酶组化法及铁蛋白标记
技术进行免疫电镜观察，可以测定病毒在亚细胞水平的定位，
也可测定淋巴细胞表面免疫球蛋白及抗体的产生情况。据此
可分析传染病发生的机制及对免疫机理的探讨。
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（四）微生物的鉴定与分析
应用交叉凝集实验、凝集吸收实验、沉淀实验等
血清学实验，进行微生物的鉴定及区别微生物的血清
型，从而确定微生物的类型及其亲缘关系。还可应用
琼脂扩散实验、免疫电泳等技术，对微生物的抗原组
分进行分析。
（五）血型鉴定
用细胞直接凝集实验、血凝抑制实验、溶血实验、
Coomb实验等技术，可作血型鉴定、亲子关系的确定、
新生儿和出生幼畜溶血病的诊断。
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第二节 沉淀试验
可溶性抗原与相应抗体结合, 在适量电解质存在
下, 形成肉眼可见的絮状白色沉淀, 称之为沉淀试验 。
可溶性抗原 + 免疫血清 出现沉淀现象
(病毒等 ) （ 抗体 ） 比例适合
沉淀原 沉淀素 比例不适合 无沉淀现象
容易过多 前带现象
0.85%NaCl
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一 液相沉淀试验
1,环状沉淀试验
原理：小试管内，下层沉
淀素与上层沉淀原
在液界面应形成白
色沉淀环。
用途：检测皮毛中的炭疽
杆菌抗原（ Ascoli试验）
2,絮状沉淀试验
抗原与抗体在试管内混合，在电解质的存在下抗原
抗体复合物可形成絮状凝聚物。此法多用于毒素和抗毒
素测定。
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二 琼脂扩散试验
琼脂是一种含有硫酸基的多糖，加热溶解于水，冷
却后凝固成凝胶，琼脂凝胶是一种多孔结构，其孔径大
小与琼脂含量有关,1%琼脂凝胶孔径为 85nm，能使许多
可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散。当抗原与抗体在凝胶
中的一定位置上相遇时，则两者结合形成沉淀线。沉淀
线的位置与抗原、抗体颗粒的大小、浓度，沉淀线的数
目和所含抗原组分有关。琼脂扩散可分为单扩散（抗原
或抗体中一种成分扩散）和双扩散。
根据其扩散的方向可分为单向单扩、单向双扩、双
向单扩、双向双扩，其中双向双扩应用最广。
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1,单向单扩散
亦称 Oudin。将 0.6%-1%琼脂加热熔化后，加
入定量经预热的稀释抗血清，混合均匀后，加入
小试管中，待凝固后加入 0.5ml抗原于其上，直立，
置于 37?C中,2-3h后出现沉淀线。由于抗原的扩
散，使沉淀线不断向下推移，而最初形成的沉淀
带随抗原的扩散而向下推移，最后稳定。沉淀带
距抗原愈近，其浓度愈大，可作抗原浓度测定。
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2, 单向双扩散
亦称 Oakley。基本作法同上，但在抗原与抗体之间加一层
不含抗体的盐水琼脂，抗原与抗体均向中间琼脂扩散，形成沉
淀带。主要用于抗原成分的分析。
3, 双向单扩散
亦称辐射扩散。在平皿或玻板上进行。用 2%缓冲琼脂盐水，
加热融化，待冷后加入经预热的抗血清（用 1,5-10倍稀释），
混合后倒入平皿或玻板上，厚 2-3mm。凝固后在凝胶板上打孔，
孔径 2-3mm，孔内滴加抗原液，放置湿盒中 37?C下扩散。抗原在
孔内向四周扩散，与凝胶中的抗体接触，形成白色沉淀环，白
环的大小随抗原的浓度而增大。此法在兽医临床上用于蛋白质
定量实验。
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4．双向琼脂扩散（琼扩）
此法系采用 1%琼脂倒于平皿或玻片上，制成凝胶板，可
按需要打孔。将抗原、抗体分别滴入孔内，放置湿盒中，在
37?C湿箱中 24-72h后观察。在抗原与抗体孔间形成沉淀带。每
一种抗原成分出现一条沉淀带。
结果判断：
如两个相邻孔之间抗原
相同，则沉淀带融合；抗
原则不同，则互相交叉；
部分相同则部分融合，
另外不同部分则交叉。
特点,简便、敏感性低、耗时、应用最广
用途,常用于细菌、病毒的鉴定，抗血清效价的测定，抗原组分
的分析及传染病的诊断等，如马传染性贫血病的诊断。
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三,免疫电泳
琼脂扩散与电泳技术结合起来称免疫电泳。由于抗原颗粒带
电荷不同，在同一电场中其泳动速度不同，故起迁移率不同，因
而通过电泳可将抗原成分分开。停止电泳后加抗血清进行扩散，
如有一队抗原抗体出现一条沉淀线，因而大大加强了免疫扩散的
分辨率及敏感性。此法可应用于抗原成分及含量成分的分析、免
疫球蛋白纯度的鉴定，以及传染病的快速诊断等。
1,微量免疫电泳
用 pH8.6的巴比妥缓冲液（ VB液）配成 1%的琼脂液，制成凝
胶板。在凝胶板 1/3处打孔 2个，孔径 2-3mm，两孔间距 10-12mm。
孔内滴加抗原，置于电泳槽上，两端用滤纸或纱布做桥，连接电
泳液。电泳时，按凝胶板宽度测电流，电泳 45min-2h。电泳完毕，
滴加抗血清，进行扩散。抗原成分不同，泳动速度不同，与抗血
清形成数条清晰的沉淀弧。本法用于血清成分分析及提取的 Ig纯
度鉴定。
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正常人血清蛋白的免疫图象
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2．对流免疫电泳
试验时在凝胶板上打孔，两孔为一组，并排打孔两组，
然后加样。抗原滴入负极端孔内，抗体滴入正极端孔内，进
行电泳。泳动 30-90min，观察结果。在两孔之间出现沉淀带，
为阳性反应。
结果判断, Ag Ab
特点,反应时间短, 敏感性提高
用途,定性, 已不多用 （ 水貂阿留申病, 以病原 Ag检测病貂血
清中的抗体 ）
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3,火箭电泳
将双向单扩散与电泳技术结合起来，其沉淀线似火
箭，故称火箭电泳。
本法将琼脂融化、冷却，在融化的琼脂中加入一定
量的已知抗血清，制成凝胶板。在其一端打一小列孔，
分别在孔中加入待检抗原或已知抗原，放置电泳槽中，
加样品端位于负极，用双层滤纸连接琼脂板的槽内缓冲
液，接通电源，板端电压 4V/cm，电流 3mA/cm，电泳 2-
10h。电泳后，抗原在有抗血清琼脂板内向正极迁移，前
端与抗体接触，形成火箭状况沉淀弧。在同一抗体浓度
下形成峰的高低，与抗原浓度大小成正比。本法用于抗
原量的测定（先用已知抗原浓度测定制成曲线）。
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火箭电泳图
①②③为标本；④⑤⑥为标准抗原
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第三节 凝集试验
细菌、红细胞等颗粒状态的抗原与相应的抗
体结合后，在电解质存在时相互凝集成絮片状团
块，这种试验称为凝集试验（ Agglutiation
test）。
参与反应的抗原叫凝集原；参与反应的抗体
称为凝集素，主要有 IgG,IgM。凝集实验有直接
凝集试验和间接凝集试验两种。
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基本原理,
生理盐水
颗粒性抗原 + 相应抗血清 抗原颗粒凝集
(细菌, 红细胞 ) 比例适合
凝集原 凝集素
过多 后带现象
（ 稀释血清 ）
一、直接凝集试验
颗粒性抗原与相应抗体在电解质的参与下，直接结
合，凝集成团的现象，称直接凝集试验。按其操作方法
可分为玻片发和试管法。
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1．玻片凝集试验
将已知的抗血清 1-2滴，滴于清洁玻片上，取待检菌液
（抗原）加于其上，混合均匀，数分钟后可出现颗粒状或
絮片状凝集，谓之阳性反应。。
特点,简单、快速
用途,定性，细菌鉴定、血型鉴定。如用已知的沙门
氏菌血清，鉴定沙门氏杆菌的抗原组分以定型。此法也用
于畜禽传染病诊断，如用已知的鸡白痢有色平板抗原，检
查鸡血清中有无相应抗体，进行鸡白痢检疫
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2．试管凝集试验
是一种定性与定量相结合的方法。试验时用一列
试管，将待检血清用 0.5%石炭酸生理盐水作 10倍递进
稀释，每管维持量为 0.5ml，一管不加血清作对照。每
管中加入一定浓度的抗原 0.5ml，混合均匀，在 37?C或
室温下静置数小时，观察液体的亮度及沉淀物，视不
同的凝集程度记录为 ++++（ 100%菌体凝集）,+++
（ 75%凝集）,+（ 25%凝集）。
凡能与一定量抗原发生 50%凝集（ ++）的血清最高
稀释度，为血清的凝集价或效价（滴度）。在试验时，
必须建立阴性、阳性血清对照管。
特点,准确、耗时
用途,诊断布氏杆菌病，测定抗体的凝集价 (定量 )
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二, 间接凝集试验
基本原理：
可溶性抗原 +惰性载体 （ 聚苯乙烯乳胶微粒, 炭粒,
绵羊红细胞等 ） 抗原致敏载体
抗原致敏载体 +相应免疫血清 (抗体 ) 电解质
被动载体凝集 (间接乳胶凝集, 间接炭素凝集, 间接
红细胞凝集等 )
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特点,敏感 (在微量反应板中进行试验 )、快速。
用途,用已知抗原致敏的载体可检测血清中的
特异抗体及其效价。
若用已知免疫血清（ Ab）致敏的红细胞，
则可检测病毒等可溶性抗原 —— 称为反向间接
血凝试验。
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（正向）间接凝集反应原理示意图
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（反向）间接凝集反应原理示意图
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间接凝集抑制反应原理示意图
A：标本中含抗原 B：标本中不含抗原
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三、抗球蛋白试验
抗球蛋白试验系 Coombs等首先创立，故又称 Coombs试验。
试验主要用于测定单价抗体（不完全抗体）。在正常凝集试
验时，应用本法可提高其敏感度。单价抗体与颗粒抗原相结
合，不出现可见的凝集反应，但该抗原表面决定簇已被单价
抗体所封闭，不能与相应的完全抗体相结合而发生凝集现象，
故谓之阻断试验。阻断试验特异性不高，故很少使用，现多
用抗球蛋白试验。由于抗体本身就是一种良好的抗原，用该
动物的正常免疫球蛋白免疫异种动物，可获得抗球蛋白的抗
体。抗球蛋白的抗体与已吸附单价抗体的颗粒抗原相结合，
即可发生凝集，其实质也是一种间接凝集。本法用于人 Rh血
型测定及布氏杆菌单价抗体的检测。
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第四节 与补体有关的试验
一、补体的性质
补体是存在于正常动物血清中的一组蛋白质。
补体没有特异性，它能与任何抗原抗体复合物相结
合，但不能与游离的抗原或抗体相结合。
补体与抗原抗体的复合物结合后，可出现溶血反应、
溶菌反应、补体结合反应、凝集反应、免疫黏膜试验等。
由于补体具有这一特性，故常用其来检验抗原或抗体是
否发生特异性结合，特异性抗原或抗体是否存在。
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二、溶解试验
1.溶血试验
红细胞与相应的抗体（溶血素）相结合后，在
补体的参与下，可发生溶血反应（直接溶血反应），
以作补体结合反应的指示系统。
吸附抗原的红细胞与抗体结合后，在补体存在
下可以引起溶血反应，这种反应称为间接溶血反应。
间接溶血反应只能用新鲜红细胞，而新鲜红细胞不
易保存，限制了本法的应用。
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2.溶菌试验
某些细菌（如霍乱弧菌）与抗体结合后，如有
补体存在，可发生细菌溶解或被杀死，这种反应称
为溶菌反应或杀菌反应。
本试验的测定可用比浊法。也可用菌落计数
法；。本法敏感性高，但细菌抗原容易被溶解，且
操作时间较长。
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三．补体参与的试验 — 补体结合试验
1．参与反应：抗原抗体反应系统、补体（豚鼠血清）、
指示系统（绵羊红细胞、溶血素）。
2．反应原理：（如下图所示）。
3．特点：敏感性特异性高。
正式试验前要进行下列测定，操作较繁（溶血素
效价、补体效价、抗原效价）。
4．用途：用于牛肺疫、副结核、布氏杆菌病、锥虫病、
马传贫、鼻疽等的检疫。
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中和试验 （病毒、毒素中和试验）
原理,病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易
感动物、鸡或鸡胚、细胞的活性。
例 1
NDV 9～ 11d鸡胚 24～ 48h 鸡胚死亡
NDV+抗血清 9～ 11d鸡胚 鸡胚不死亡
第四节 中和试验
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例 2
口蹄疫病毒 (FMDV) 4～ 7d乳鼠 乳鼠死亡
FMDV+抗血清 4～ 7d乳鼠 乳鼠不死亡
用途：
1.用已知血清鉴定病毒 —— 诊断病毒病
2.用已知病毒检测血清抗体 —— 诊断病毒感染，测定病毒
免疫血清效价（中和价）。
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第六节 免疫标记技术
免疫标记技术即是将某一个特定的易于检测的分
子或原子，联结在抗体或抗原上，利用抗体（或抗原）
能与相应的抗原（或抗体）结合的特性，从而检测抗
原或抗体的存在及所在部位（定位）。
免疫标记技术是近年来研究血清学反应的一项新
技术。这项技术大大开拓了免疫学的应用范畴，使血
清学反应进入了一个新的天地。它不仅可以用于抗原
抗体的定性、定量，还可用于抗原抗体的定位。由于
其反应的特异性敏感性高，不但在诊断疾病时广为应
用，亦可应用于生物领域其他方面。
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1.荧光标记抗体技术（免疫荧光技术）
免疫荧光技术是将荧光染料标记在抗体球蛋白分子上，
制成荧光抗体。当荧光抗体与相应抗原结合时，就形成带
有荧光的抗原抗体复合物，在荧光显微镜下，可观察到此
复合物发出的荧光。可检测标本中某种抗原的存在或抗原
所在的部位（定位）。
原理,荧光素（ F） + Ab AbF(FITC） )
AbF + Ag Ag- AbF 紫外光 Ag- AbF
用途,用 AbF检测抗原 （定性、定位）
特点,敏感，需荧光显微镜
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方法,直接法 间接法
F
F
Ag
Ag
比较,检测一种抗原 标记一种动物的 γ
就须标记特异 球蛋白 AbF，就能
的一种 AbF 检测多种抗原
较特异 较敏感
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2.酶标记抗体技术（酶免疫测定技术）
（ 1） 间接法 （ 2）双抗体夹心法
原理,
用途,已知抗原、酶标 已知血清抗体、酶
抗体测血清抗体 标抗体测抗原
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3,放射免疫测定法
原理, Ag+AbR Ag-AbR
或 AgR+Ab AgR-Ab
用液相闪烁仪测 R放出的射线量
特点,敏感性极高，需高级闪烁仪
同位素对人有放射性危害
用途,用于药物、激素、酶、肿瘤抗原等测定
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四、其他免疫标记技术
（一）免疫电镜技术
将免疫学技术与电镜技术结合起来，发展成一种血清
学反应超微技术，应用于抗原或抗体的定位，达到亚细胞
水平。
（二）生物素 -亲和素标记技术
生物素即维生素 H，在动物体内广泛存在，以蛋白、
肝、肾等组织中的含量为最高。亲和素又称抗生物素，对
生物素有较强的亲和力，结合常数高。近年来，利用生物
素与亲和素结合，成为一种生物素 -亲和素系统 。
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（三）核酸探针技术
微生物的遗传物质就是 DNA。核苷酸是由磷酸、核
糖和碱基组成的，而多核苷酸则是由若干个核苷酸连
接成的一个大的聚合物。
核酸探针具有检测的灵敏度高，特异性强，是按碱
基配对和核酸碱基顺序进行的；使用方便，不需特殊仪
器等特点。
核酸探针可用于鉴定病毒、细菌以及某些真核细胞。
对那些不易分离培养的病毒可以直接鉴定。
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第七节 葡萄球菌 A蛋白及其应用
葡萄球菌 A蛋白是大多数金黄色葡萄球菌细胞壁
上所含的一种成分，具有多种生物学特性，能与人及
多种哺乳动物的 IgG的 Fc段呈非特异性结合，结合后
仍保持其抗体活性。同时与酶、荧光颜料偶联，因而
应用于免疫领域。
2010-5-16
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一、葡萄球菌 A蛋白的主要特性
葡萄球菌 A蛋白是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种成分，
存在于细菌表面，胞膜中含量很少。金色葡萄球菌的 Cowan株
葡萄球菌含大量 A蛋白。等电点 pH5.1，对热稳定，经 100℃ 1h
后仍保持与 IgG结合的活性。
葡萄球菌 A蛋白可以与人及多种哺乳动物（如猪、兔、小
白鼠）的 IgG结合，并在琼脂中形成沉淀线。葡萄球菌 A蛋白能
与人的 IgG1,IgG2,IgG4及猪的 IgG等结合，形成复合物。这
种结合是一种假免疫反应，是一种与 IgG Fc段非特异的化学结
合，结合后能激活补体，亦仍保持 Fab的免疫活性。这一活性，
已应用于 免疫学领域中。
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二,葡萄球菌 A蛋白在免疫学上的应用
（一）协同凝集试验
细胞壁上葡萄球菌 A蛋白与抗体结合，被覆
着特异性抗体的金黄色葡萄球菌与相应的抗原结
合时，就可使互相联结引起协同凝集反应。这种
方法应用于多种细菌和某些病毒的快速诊断。
试验方法常采用玻片法，也可采用试管凝集
法，每种方法均应设不含葡萄球菌 A蛋白的阴性
菌液对照。
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（二）标记葡萄球菌 A蛋白技术
从富含葡萄球菌 A蛋白的菌株中，提取葡萄球
菌 A成分，用酶、荧光染料标记，代替标记第二抗
体，用于检测抗体或抗原。此法可避免制造第二抗
体的麻烦，保存期长，因而广泛应用于实验室诊断
中。
end
