雅致放射毛霉液体深层通气发酵培养基本操作 1.培养基的组成及配制 1.2种子培养基 培养基组成： 200ml：豆粕粉 6g， 饴糖1g，酵母膏0.2g，MgSO40.4g，KH2PO40.4g。放入高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。灭菌操作完毕，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前20min进行紫外空气灭菌。 1.3产酶培养基 培养基组成： 1000ml：豆粕粉30g，蔗糖8g，酵母膏1g，MgSO43.6g，KH2PO41.2g，CaCl21g。放入高压灭菌锅中，121℃、20min灭菌。操作完毕，取出置于超净台内，接种前20分钟进行紫外空气灭菌。 2．雅致放射毛霉液体深层培养技术 2．2种子的培养 接种前4小时从冰箱取出1支菌种，在25℃条件下活化。在超净台内，以无菌生理盐水洗涤菌种斜面。孢子悬浮液以每瓶10ml的接种量，接入种子培养基。从超净台取出接好的种子三角瓶，转入摇床，在28℃、250rpm的条件下培养14～16小时，至种子瓶内呈粘稠浆糊状为止。 2．3雅致放射毛霉的产酶培养过程 将已经灭菌的产酶培养基转入超净台，紫外空气灭菌20分钟。将培养好的种子用灭过菌的小烧杯进行转接，每支产酶培养基三角瓶接入20ml左右的种子。在28℃、250rpm的条件下培养36～48小时，至发酵液颜色变深、澄清为止。 蛋白酶活力测定 （1）定义 1 g固体酶粉，在一定温度和pH值条件下，1 min水解酪素产生1 ug酪氨酸为一个酶活单位，以u/g表示。 （2）原理 蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。 （3）试剂和溶液 ① 三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4 mol/L：称取三氯乙酸32.7 g，用水溶解并定容至500 mL ② 磷酸缓冲溶液（pH=7.5）适用于中性蛋白酶：称取磷酸氢二纳（Na2HPO4·12H2O）3.01 g和磷酸二氢纳（NaH2PO4·2H2O）0.25 g，加水溶解并定容至500 mL。 ③ 100 ug/mL L—酪氨酸标准溶液： a.称取预先于105 ℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.100 g，精确至0.001 g，用1 mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL，即为1 mg/mL酪氨酸标准溶液。 b.吸取1 mg/mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1 mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100 ug/mL L—酪氨酸标准溶液。 ④ 10 g/L酪素溶液：称取酪素1.000 g，精确至0.001 g，用少量0.5 mol/L氢氧化钠湿润后，加入适量的缓冲溶液约80 mL，在沸水域中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用缓冲溶液稀释至刻度。 ⑤ 待测酶液 精确取2.00ml，用水使充分溶解，然后将上清夜小心倾入50 mL容量瓶中，并定容至刻度，供测试用。(此时相当于稀释25倍)。 （4）分析步骤 ① 求K值 （K取135） ② 测定 a. 先将酪素溶液放入（40±0.2）摄氏度恒温水域中，预热5 min； b. 按下列程序操作：取10ml试管，5ml 10倍 试管A（空白） 试管B（酶试样，作三个平行样） ↓ ↓ 加酶液2.00 mL 加酶液2.00 mL ↓（40±0.2℃），2 min ↓（40±0.2℃），2 min 加三氯乙酸4.00 mL（摇匀） 加酪素2.00 mL（摇匀） ↓（40±0.2℃），10 min ↓（40±0.2℃），10 min 加酪素2.00 mL（摇匀） 加三氯乙酸4.00 mL（摇匀） ↓ ↓ 取出静止10 min，过滤 取出静止10 min，过滤 ↓ ↓ 在275 nm波长下，用 10 mm 在275 nm波长下，用 10 mm 比色皿测其吸光度 比色皿测其吸光度 （5）计算 X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E 式中 X——样品的酶活力（u/g） A——试样溶液的平均吸光度 K——吸光常数（K=135） 8——反应试剂的总体积（mL） 2——吸取酶液2.00 mL，以1 mL计 1/10——反应时间10 min，以1 min计 n——稀释倍数 E——紫外法与福林法的换算系数（取0.50）