第十六章
药物分析中的新技术、
新方法
手性分离色谱
一、手性药物的现状
手性药物
（ 579）
药物
（ 1992）
天然和半
合成药物
（ 556）
合成药物
（ 1436）
非手性药物
（ 857） 单一异构体
（ 73）
外消旋体
（ 506）
手性药物
（ 547）
非手性药物
（ 9） 单一异构体
（ 537）
外消旋体
（ 10）
二、手性药物对映体的药效学差异
1,治疗作用完全依赖一种异构体
如,S(-)-α-甲基多巴
2,药理作用差别不大 如：异丙嗪
3,药理作用类似，但反应强度有差别
4,药理与毒理作用存在“质”的区别
二、手性药物对映体的药动学差异
1,吸收
2,蛋白结合
3,代谢
1,间接法拆分对映异构体即衍生
化试剂法（ CDR）
2,直接法拆分对映异构体
? 手性固定相法（ CSP）
? 手性流动相添加剂法（ CMP）
三、手性药物拆分的高效液相色谱
法分类
? 采用非手性固定相
四、拆分原理：
1,CDR
(R) –SE +
(R) –SA → ( R) –SE –(R) –SA
(S) –SA→ ( R) –SE –(S) –SA
C
B
DA
E
C
B
AD
E
C
B
A
D
C
X
Y
Z C
D
A
B
C
Y
X
Z
C
D
A
B
C
X
Y
Z C
B
A
D
C
Y
X
Z
? 手性衍生化特点：
1,需要高光学纯度的手性衍生化
试剂；
2,反应繁琐费时；
3,衍生化反应速率重现性较差
4,只需使用价格便宜、柱效较高
的非手性柱
5,衍生化过程可同时纯化样品
柱前衍生化 -反相高效液相色谱法
拆分酮洛芬对映异构体
S-(?)-酮洛芬 R-(-)-酮洛芬
酮洛芬对映体的柱前衍生化示意图
＊
＊
酮洛芬对映体的柱前衍生化方法
酮洛芬对照
品溶液 (1
mg/mL)0.1
mL
加入正己烷 0.6 mL
二氯亚砜溶液
0.2 mL
75℃
1 h
冷却
至室
温
吹干后加入 S-
NEA溶液 0.2 mL 5 min
振摇 加入 2.0 mol/L
H2SO4 0.5 mL
混
匀 吹干后溶解进样
二氯甲烷,乙醚
2:1
?色谱条件
色谱柱,Hypersil C18,5 ? m,
150?5.0mm ID，
流动相：乙腈 ?水 -乙酸 -三乙胺
(55, 45, 0.1, 0.02,v/v)，
流速, 1 ml/min,
检测波长,254 nm
酮洛芬对映体衍生化物色谱图
m i n 2 4 6 8 10 12 14
m A u
0
50
100
150
200
RS
酮洛芬对映体衍生化物的保留时间为
tR=7.3 min,tR=8.5 min，分离度为 1.9
2,CSP
利用手性固定相与对映体消旋
物相互作用，其中一个与手性固定
相生成不稳定的短暂的对映体复合
物，使两种异构体在色谱柱上的保
留时间不同，从而得到分离。
? 常用的手性固定相：
1,Pirkle型相
2,合成多聚相
3,环糊精键合相
特点
1.适用范围广
2.制备分离方便
3.定量分析的可靠性高
4.价格昂贵
奈基乙脲键合硅胶柱拆分苏氨酸（ A）
和苯丙氨酸（ B）的 p-溴代苯甲酰胺衍
生物对映体色谱图
3,CMP
将手性试剂添加到流动相中，
利用手性试剂与药物消旋物中各对
映体结合的稳定常数不同，以及药
物与结合物在固定相上分配的差异，
实现对映体的分离。
? 常用的手性添加剂：
1,配基交换型手性添加剂
2,手性离子对络合剂
3,环糊精添加剂
特点
1.可采用普通的非手性固定相
2.不需对样品进行衍生化
3.手性添加物的可变范围较宽
高效毛细管电泳
（ HPCE）
HPCE是经典电泳技术与现代
微柱分离相结合的一种快速、高效
的液相分离技术。具有以下特点：
1,高效
2,高速
3,微量
4,低消耗
高压电源
毛细管恒温系统
检测器 数据
处
理
系
统毛
细
管
缓冲液 /样品 缓冲液
（ +） (－ )
毛细管电泳装置示意图
（一）基本原理：
v = veo+ vep = (μeo+μep)E
veo,电渗流速度 μeo,电渗流淌度
vep,电泳流速度 μep,电泳流淌度
E,电场强度
－－
－－
－
－－
－－
－
－－
－－
－－
－
－
++
++
++
++
+
+
+
+
+ +
++ +
++
+ +
++
+ +
+
(－ )
(+)
电渗的产生
－－
－－
－
－－
－－
－
－－
－－
－－
－
－
(－ )
(+)
+
+
+
+
+
+
++
++ +
+
++
++
- -
-
--
--
-
-
-
-
-
-
--
-
毛细电泳中不同组分的迁移示意图
（二）主要分离模式
1,毛细管区带电泳（ CZE）
2,胶束动电毛细管色谱
（ MECC）
3,毛细管凝胶电泳（ CGE）
4,毛细管等电聚焦（ CIEF）
模式 缓冲液体系 分离机理
CZE 自由缓冲液 离子淌度
MECC 胶束－缓冲 溶液 疏水性 /离子性相互作用
CGE 凝胶－缓冲 溶液 分子大小和 荷电数目
CIEF 两性电解质 等电点
1,毛细管区带电泳
最基本、最广泛的分离模式。
适用于所有具有不同淌度的
荷电粒子的分离，但不能中性物
质及质荷比相同的组分。
2,胶束动电毛细管色谱
用离子胶束溶液代替简单
的缓冲溶液，使中性组分可按
其疏水性的不同及在两相间的
分配系数的不同而分离。采用
手性分配相，可用于手性化合
物的分离。
3,毛细管凝胶电泳
凝胶的网络结构对溶质具
有分子筛的作用，可分离质荷
比相同但分子大小不同的组分。
在分子生物学和蛋白质化
学上有着十分广泛的应用。
4,毛细管等电聚焦
根据蛋白质的等电点不同
而进行分离。
A A A A
A A
B B
B
B
B
B
C
C
C
C DDDD
D
EE E E
EF F
AA
AA
BB
BB
CC
CC
DD
DD
EE
EE
FF
FF
pH梯度 高低
? 应用：
1,监测药物生产过程
如：监测青霉素发酵液中有关物
质的量
青霉素发酵液的高效毛细管电泳图
1,青霉素 G钠 ； 2,6-APA ； 3,对羟基苯乙酸 ；
4,邻羟基苯乙酸 ； 5,苯乙酸
2,中药成分分析
如：黄酮及其甙类分析
黄芩中 6种黄酮类成分的
胶束电动毛细管色谱分离图
1.汉黄芩甙； 2,黄芩素； 3.黄芩甙； 4,千层子素；
5,汉黄芩素； 6.内标水杨酸； 7.白杨素
3,手性拆分
4,体内分析
质谱法及其应用
进样系统 离子源 质量分析器
检测器控制和数据 处理系统
真空系统
一、离子源及离子化技术
1,EI（电子轰击离子化）
V
加速电压
试样蒸汽
阴极
阳极
电子束
离子
x
y z
电子轰击质谱示意图
? 优点：
灵敏度高，有丰富的碎片离子信息
和成熟的离子开裂理论，是结构分析、
鉴定的有力手段；重现性好，有标准
图谱，可以通过谱库检索对未知物进
行结构鉴定。
? 缺点：
样品须汽化后才可离子化
? 适用化合物：
易挥发、热稳定化合物。
2,CI（化学离子化）
软电离技术
? 优点：
可以得到较强的准分子离子峰，
有利于分子量的测定
? 缺点：
样品须汽化后才可离子化
? 适用化合物：
易挥发、热稳定化合物
3,FAB（快原子轰击离子化） 软电
离技术
? 优点,样品不须汽化；既给出化合
物的分子量信息，又给出结构信息。
适用范围广，仪器商品化较早，普
及率高。
? 缺点,重现性差，灵敏度较 EI低。
? 适用化合物：
极性、高分子量、非挥发性及热不
稳定化合物。
+
+
+
+
+
快原子枪
样品靶
原子束
质量分析器
二次离子束
快原子轰击质谱示意图
4,MALDI（基质辅助激光解吸离子
化）
软电离技术
? 优点：
通常只给出分子离子峰（或准分子
离子峰）。
? 适用化合物：
蛋白质、多肽、寡核苷酸等生物
大分子
5,API（大气压离子化）
软电离技术
（ 1） ESI（电喷雾离子化）
? 特点：
能够产生多电荷离子。
? 适用化合物：
对生物大分子及其他分子量大的
化合物的分析较有利。
+
+
++
+
－
－
－
－ －
－
+
++
+
+－
－
－ －－
－
+
++
－－
－
－
＋－
－ ＋
毛细管
+ 4kV
含离子的液滴
随液滴蒸发，
电场加强，离
子向表面移动
离子从表面蒸发
离子蒸发机理
（ 2） APCI（大气压化学离子化）
最软的电离方式之一
? 特点：
一般只给出化合物的分子量信息，
通过源内 CID（碰撞诱导分解）可
同时获得结构信息。
? 适用化合物：
与 ESI比较，更适于分析极性及分
子量小（＜ 1000 amu）的化合物。
反应气等
离子体
Corona
放电
电极
真空
样品
+
溶剂
雾化气
加热管
APCI电离原理
二、质量分析器及质量分离原理
1、扇型磁场质谱仪
2、四极质谱仪
3、飞行时间质谱仪
4、离子阱质谱仪
药物分析中的新技术、
新方法
手性分离色谱
一、手性药物的现状
手性药物
（ 579）
药物
（ 1992）
天然和半
合成药物
（ 556）
合成药物
（ 1436）
非手性药物
（ 857） 单一异构体
（ 73）
外消旋体
（ 506）
手性药物
（ 547）
非手性药物
（ 9） 单一异构体
（ 537）
外消旋体
（ 10）
二、手性药物对映体的药效学差异
1,治疗作用完全依赖一种异构体
如,S(-)-α-甲基多巴
2,药理作用差别不大 如：异丙嗪
3,药理作用类似，但反应强度有差别
4,药理与毒理作用存在“质”的区别
二、手性药物对映体的药动学差异
1,吸收
2,蛋白结合
3,代谢
1,间接法拆分对映异构体即衍生
化试剂法（ CDR）
2,直接法拆分对映异构体
? 手性固定相法（ CSP）
? 手性流动相添加剂法（ CMP）
三、手性药物拆分的高效液相色谱
法分类
? 采用非手性固定相
四、拆分原理：
1,CDR
(R) –SE +
(R) –SA → ( R) –SE –(R) –SA
(S) –SA→ ( R) –SE –(S) –SA
C
B
DA
E
C
B
AD
E
C
B
A
D
C
X
Y
Z C
D
A
B
C
Y
X
Z
C
D
A
B
C
X
Y
Z C
B
A
D
C
Y
X
Z
? 手性衍生化特点：
1,需要高光学纯度的手性衍生化
试剂；
2,反应繁琐费时；
3,衍生化反应速率重现性较差
4,只需使用价格便宜、柱效较高
的非手性柱
5,衍生化过程可同时纯化样品
柱前衍生化 -反相高效液相色谱法
拆分酮洛芬对映异构体
S-(?)-酮洛芬 R-(-)-酮洛芬
酮洛芬对映体的柱前衍生化示意图
＊
＊
酮洛芬对映体的柱前衍生化方法
酮洛芬对照
品溶液 (1
mg/mL)0.1
mL
加入正己烷 0.6 mL
二氯亚砜溶液
0.2 mL
75℃
1 h
冷却
至室
温
吹干后加入 S-
NEA溶液 0.2 mL 5 min
振摇 加入 2.0 mol/L
H2SO4 0.5 mL
混
匀 吹干后溶解进样
二氯甲烷,乙醚
2:1
?色谱条件
色谱柱,Hypersil C18,5 ? m,
150?5.0mm ID，
流动相：乙腈 ?水 -乙酸 -三乙胺
(55, 45, 0.1, 0.02,v/v)，
流速, 1 ml/min,
检测波长,254 nm
酮洛芬对映体衍生化物色谱图
m i n 2 4 6 8 10 12 14
m A u
0
50
100
150
200
RS
酮洛芬对映体衍生化物的保留时间为
tR=7.3 min,tR=8.5 min，分离度为 1.9
2,CSP
利用手性固定相与对映体消旋
物相互作用，其中一个与手性固定
相生成不稳定的短暂的对映体复合
物，使两种异构体在色谱柱上的保
留时间不同，从而得到分离。
? 常用的手性固定相：
1,Pirkle型相
2,合成多聚相
3,环糊精键合相
特点
1.适用范围广
2.制备分离方便
3.定量分析的可靠性高
4.价格昂贵
奈基乙脲键合硅胶柱拆分苏氨酸（ A）
和苯丙氨酸（ B）的 p-溴代苯甲酰胺衍
生物对映体色谱图
3,CMP
将手性试剂添加到流动相中，
利用手性试剂与药物消旋物中各对
映体结合的稳定常数不同，以及药
物与结合物在固定相上分配的差异，
实现对映体的分离。
? 常用的手性添加剂：
1,配基交换型手性添加剂
2,手性离子对络合剂
3,环糊精添加剂
特点
1.可采用普通的非手性固定相
2.不需对样品进行衍生化
3.手性添加物的可变范围较宽
高效毛细管电泳
（ HPCE）
HPCE是经典电泳技术与现代
微柱分离相结合的一种快速、高效
的液相分离技术。具有以下特点：
1,高效
2,高速
3,微量
4,低消耗
高压电源
毛细管恒温系统
检测器 数据
处
理
系
统毛
细
管
缓冲液 /样品 缓冲液
（ +） (－ )
毛细管电泳装置示意图
（一）基本原理：
v = veo+ vep = (μeo+μep)E
veo,电渗流速度 μeo,电渗流淌度
vep,电泳流速度 μep,电泳流淌度
E,电场强度
－－
－－
－
－－
－－
－
－－
－－
－－
－
－
++
++
++
++
+
+
+
+
+ +
++ +
++
+ +
++
+ +
+
(－ )
(+)
电渗的产生
－－
－－
－
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－－
－
－－
－－
－－
－
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(－ )
(+)
+
+
+
+
+
+
++
++ +
+
++
++
- -
-
--
--
-
-
-
-
-
-
--
-
毛细电泳中不同组分的迁移示意图
（二）主要分离模式
1,毛细管区带电泳（ CZE）
2,胶束动电毛细管色谱
（ MECC）
3,毛细管凝胶电泳（ CGE）
4,毛细管等电聚焦（ CIEF）
模式 缓冲液体系 分离机理
CZE 自由缓冲液 离子淌度
MECC 胶束－缓冲 溶液 疏水性 /离子性相互作用
CGE 凝胶－缓冲 溶液 分子大小和 荷电数目
CIEF 两性电解质 等电点
1,毛细管区带电泳
最基本、最广泛的分离模式。
适用于所有具有不同淌度的
荷电粒子的分离，但不能中性物
质及质荷比相同的组分。
2,胶束动电毛细管色谱
用离子胶束溶液代替简单
的缓冲溶液，使中性组分可按
其疏水性的不同及在两相间的
分配系数的不同而分离。采用
手性分配相，可用于手性化合
物的分离。
3,毛细管凝胶电泳
凝胶的网络结构对溶质具
有分子筛的作用，可分离质荷
比相同但分子大小不同的组分。
在分子生物学和蛋白质化
学上有着十分广泛的应用。
4,毛细管等电聚焦
根据蛋白质的等电点不同
而进行分离。
A A A A
A A
B B
B
B
B
B
C
C
C
C DDDD
D
EE E E
EF F
AA
AA
BB
BB
CC
CC
DD
DD
EE
EE
FF
FF
pH梯度 高低
? 应用：
1,监测药物生产过程
如：监测青霉素发酵液中有关物
质的量
青霉素发酵液的高效毛细管电泳图
1,青霉素 G钠 ； 2,6-APA ； 3,对羟基苯乙酸 ；
4,邻羟基苯乙酸 ； 5,苯乙酸
2,中药成分分析
如：黄酮及其甙类分析
黄芩中 6种黄酮类成分的
胶束电动毛细管色谱分离图
1.汉黄芩甙； 2,黄芩素； 3.黄芩甙； 4,千层子素；
5,汉黄芩素； 6.内标水杨酸； 7.白杨素
3,手性拆分
4,体内分析
质谱法及其应用
进样系统 离子源 质量分析器
检测器控制和数据 处理系统
真空系统
一、离子源及离子化技术
1,EI（电子轰击离子化）
V
加速电压
试样蒸汽
阴极
阳极
电子束
离子
x
y z
电子轰击质谱示意图
? 优点：
灵敏度高，有丰富的碎片离子信息
和成熟的离子开裂理论，是结构分析、
鉴定的有力手段；重现性好，有标准
图谱，可以通过谱库检索对未知物进
行结构鉴定。
? 缺点：
样品须汽化后才可离子化
? 适用化合物：
易挥发、热稳定化合物。
2,CI（化学离子化）
软电离技术
? 优点：
可以得到较强的准分子离子峰，
有利于分子量的测定
? 缺点：
样品须汽化后才可离子化
? 适用化合物：
易挥发、热稳定化合物
3,FAB（快原子轰击离子化） 软电
离技术
? 优点,样品不须汽化；既给出化合
物的分子量信息，又给出结构信息。
适用范围广，仪器商品化较早，普
及率高。
? 缺点,重现性差，灵敏度较 EI低。
? 适用化合物：
极性、高分子量、非挥发性及热不
稳定化合物。
+
+
+
+
+
快原子枪
样品靶
原子束
质量分析器
二次离子束
快原子轰击质谱示意图
4,MALDI（基质辅助激光解吸离子
化）
软电离技术
? 优点：
通常只给出分子离子峰（或准分子
离子峰）。
? 适用化合物：
蛋白质、多肽、寡核苷酸等生物
大分子
5,API（大气压离子化）
软电离技术
（ 1） ESI（电喷雾离子化）
? 特点：
能够产生多电荷离子。
? 适用化合物：
对生物大分子及其他分子量大的
化合物的分析较有利。
+
+
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－
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－ －
－
+
++
+
+－
－
－ －－
－
+
++
－－
－
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＋－
－ ＋
毛细管
+ 4kV
含离子的液滴
随液滴蒸发，
电场加强，离
子向表面移动
离子从表面蒸发
离子蒸发机理
（ 2） APCI（大气压化学离子化）
最软的电离方式之一
? 特点：
一般只给出化合物的分子量信息，
通过源内 CID（碰撞诱导分解）可
同时获得结构信息。
? 适用化合物：
与 ESI比较，更适于分析极性及分
子量小（＜ 1000 amu）的化合物。
反应气等
离子体
Corona
放电
电极
真空
样品
+
溶剂
雾化气
加热管
APCI电离原理
二、质量分析器及质量分离原理
1、扇型磁场质谱仪
2、四极质谱仪
3、飞行时间质谱仪
4、离子阱质谱仪
