大连水产学院：水产动物生理学：实验指导

水产动物生理学实验指导 目 录 第一部分 水产动物生理学实验概述 一、水产动物生理学实验的目的、任务与要求 二、水产动物生理学实验报告的写作 第二部分 基本生理实验操作 第一节 组织、器官的机能实验 实验1 生理学常用仪器使用方法介绍 实验2 坐骨神经—腓肠肌标本的制备 实验3 刺激强度对骨骼肌收缩的影响 实验4 刺激频率对骨骼肌收缩的影响 实验5 蛙心起博点 实验6 期前收缩与代偿间歇 实验7 蛙心灌流 实验8 鱼类心脏灌流 实验9 离体小肠平滑肌的生理特性 实验10 反射中枢活动的某些基本特征及反射弧分析 第二节 血液组成成分及其性质的分析、血清中部分物质含量的测定 实验11 红细胞与白细胞计数 实验12 血红蛋白含量测定 实验13 血涂片制作与白细胞分类计数 实验14 红细胞沉降率的测定 实验15 红细胞比容的测定 实验16 红细胞渗透脆性的测定—浓度梯度法 实验17 蛋白质含量的测定I—双缩脲法 实验18 血清γ—球蛋白的分析测定—盐析法 实验19 血清白蛋白和球蛋白的分析测定—盐析法 实验20 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白 实验21 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白 实验22 糖含量的测定II—邻甲苯胺法 实验23 总脂的测定—香草醛法 实验24 胆固醇的测定—邻苯二甲醛法 实验25 血清尿素氮的测定 第三节 酶活力的分析测定 实验26 过氧化氢酶活力的测定 实验27 酸性磷酸酶活力的测定 实验28 硷性磷酸酶活力的测定 实验29 谷丙转氨酶（GPT）活力的测定 实验30 蛋白酶活力的测定 实验31 淀粉酶活力的测定 实验32 脂肪酶活力的测定 第四节 营养、消化、吸收与代谢机能实验 实验33 耗氧率的测定 实验34 氨氮排泄率的测定 第三部分 研究设计型实验 第一节 疾病对水产动物机能影响的研究实验 参考选题 1、中国对虾（或南美白对虾）红腿病的发病机制的分析研究 2、中国对虾黑鳃病几项生理、生化、免疫指标变化的分析研究 3、鲤肠炎病几项生理、生化、免疫指标变化的分析研究 4、草鱼出血病几项生理，生化，免疫指标变化的分析研究 5、寡糖类免疫增效剂对提高中国对虾抗病力的影响及其作用机制 6、微生态制剂对提高鲤抗病能力的影响及其作用机制 7、抗生素对鲤免疫机能影响及其作用机制 第二节 环境因子对水产动物机能影响的研究实验 参考选题 1、温度对鲤（或牙鲆）生长、消化、代谢、消化酶活力及免疫力的影响 2、低温条件下鲤、鲫、鲢、鳙抗寒力的比较研究 3、氨氮、硝态氮、亚硝态氮对鲤抗病力影响的研究 4、农药对南美白对虾几项生理、生化、免疫指标的影响 5、水质净化剂对提高中国对虾免疫力的影响及其作用机制 第三节 营养和非营养因素对水产动物生长和物质利用影响的研究实验 参考选题 1、饥饿对美国红鱼的消化、代谢机能的影响 2、不同脂肪源对牙鲆生长和代谢的影响 3、美国红鱼的营养需求量的研究 4、微生态制剂饲料添加剂对促进鲤生长的影响及其作用机制 附录 常用试剂配制 第一部分 水产动物生理学实验概述 一、水产动物生理学实验的目的、任务与要求 （一）生理实验课的目的和任务 水产动物生理学实验是水产动物生理学的配套课程，也是水产养殖专业的专业基础课，更是主要实践环节之一。本课程的主要先修课是组织胚胎学、普通动物学、生物化学实验，后续课为水产动物病理学、水产动物营养学等课实验等。 该课程不仅能强化理论课的教学，还具有独自的教育作用。培养学生实际操作能力和实验报告写作能力，培养学生提出问题、分析问题、解决问题的科学思维方法，养成实事求是、严谨求证的工作态度和规范操作、分工协作的工作作风，以及爱科学、爱公物的素养。 通过本课程学习，学生应获得以下知识和能力： 1.掌握基本生理指标测量方法； 2.掌握生理实验技能和生理手术基本操作技能； 3.了解电生理基本操作技能； 4.能独立分析实验结果、写出规范的实验报告； 5.知道生理实验设计的一般原则和方法，并作初步尝试。 6.进一步培养学生进行研究设计型实验。 水产动物生理学是一门实验学科，实验在课程学习和知能掌握中具有重要作用。水产动物生理学实验独立设课能强化学生的重视程度，有助于培养目标的落实。教程所列实验项目为学生操作或教师示范的选择内容，对不同专业可采用不同的实验对象甚至教学内容。实际行课时，课程结构中的实验概述、基本操作、综合实验和录像示教内容宜混合编排，有机组合，一次实验可安排一个或多个项目，甚至跨章的综合性内容。实验设计在课程进程中间布置、课程末尾答辩。实验课成绩评定强调全面性与全程性，包括每次实验操作和报告撰写、自行设计实验和期末考核。期末考核由口试、准备器具和操作组成。综合评定成绩不及格者必须重修本课。 （二）生理学实验方法 水产动物生理学的知识来自对生命现象的客观观察和科学实验。所谓生理学实验，就是人为地创造一定条件，以利于对平时不能从外表观察到的隐蔽或细微的生理活动能被观察，或某种生理过程能被认识。器官组织水平的生理实验方法主要分为急性和慢性两大类。急性实验法又可分为离体组织器官法和活体解剖法。如离体蛙心灌流即是离体组织器官法，如胃肠运动的直接观察即是活体解剖法。急性生理实验持续时间短暂，条件简单、容易排除其他因素干扰，并有可能对研究的对象进行直接的观察和细致的分析。动物实验后一般不能存活，也无须无菌条件。但所获得的结果可能与正常生理机能相差较大，不能轻易推断。慢性生理实验通常先实施慢性生理手术，在无菌条件下安置体内电极、安装瘘管或切除移植腺体等，待动物术后恢复时，再在机体清醒完整的情况下进行记录、取样等实验项目。这类实验过程较长，实验室条件也要求较高，实验动物模型也可使用较长时间，其机能活动更接近正常。自然，每种方法都有它的长处，也都存在—定的局限性，要了解并选择适当的方法，以与一定的研究目的和实验对象相适应。 （三）生理学实验课的要求 一堂完整的实验课包括实验前、实验和实验后三个环节。实验前应有目的地做好充分准备，仔细阅读和研究实验指导，了解实验原理和基本操作方法，复习有关的生理学知识，预期实验中可能出现的结果和问题。这是避免被动盲目操作、提高实验课质量的重要前提。 实验时必须遵守实验室规则，入室前穿好实验服，室内保持安静，不随意走动，不做与实验无关的事。节约实验用品，实验动物只能由教师统一发给。实验器材每次专人负责，领取清点，归还复核，损坏登记，丢失赔偿。已调试好的仪器不要任意调动，实验器具不得与其他组调换，如需要可向准备教师要求添加或更换。实验时要注意动脑思考，实验中自行更改或设计项目应征求同伴和教师意见。组内分工合作，认真有条理地操作，耐心细致地观察，及时准确地记录，原始记录交教师签字认可后方能结束实验。实验完成较早，通过教师允许可以利用动物预习下次操作、补做上次内容或自行练习等，此时仍要注意规范操作和动物福利。 实验结束后，各组清理好自己的场地、物品，归还实验用品，动物尸体放指定位置。值日同学清理好公共用品和场地，报教师同意后方可离开。每人转录、整理原始记录，及对写好实验报告上交。 特别强调要珍惜实验条件和机会，保证实验课质量；绝对不许用动物和手术器械开玩笑。有兴趣的同学可以申请参加实验准备和预备实验。 二、水产动物生理学实验报告的写作 写实验报告是对所做实验的再理解再创造的工作，是检查学生知识掌握和衡量能力的重要尺度之一，是今后撰写科学论文的初始演练。 (一)一般要求 使用学校统一印制的报告纸。填全各栏目，并标明学号或组号，“日期”一栏填做实验日期，写报告日期可标于文末。“指导教师”一栏不写，系留阅报告人签名用。报告要求格式标准、卷面整洁、图表准确、字迹端正、简明精练，按时上交。注意文字规范，语句通顺，不用自造的不规范的简化字、代号。 (二)基本格式与写法 生理实验有的侧重于操作方法(如神经-肌肉标本制备)，有的侧重于现象观察(胃肠运动的直接观察)，有的侧重于结果及分析(影响尿生成的因素)，多数则兼而有之。应根据实验类型，选用合适的报告格式及详略安排各栏目。 实验报告大体上有两种格式：一种是一般实验报告式，另一种是仿学术论文式，其对应关系如下表。一般认为操作类宜选用前者，而侧重结果的实验后者更适用。 表 实验报告的基本格式 一般实验报告式 仿学术论文式  题目(内容) 题目  目的原理 引言(导言)  实验对象与用品 材料与方法  方法步骤   结果与分析 结果与分析  讨论 讨论与结论(语)  (结论或结语)   注意事项原始记录 附录(含原始记录，公式  实验分工体会与建议 推导，参考文献，致谢等）   (三)注意事项 写报告应以事实为根据，尽量用自己的话表述，忌抄书，不许修改、编造数据。实验方法与步骤可视重要否而详略，但报告应独立成章，不可用“见书第××页”字样而省略。有的实验报告中，结果、分析甚至实验项目可以列表表达。“讨论”是一篇报告的核心，应紧扣结果联系相关理论进行，忌就事论事或离题万里；结果也不可轻易推断或引申。“结果与分析”一栏可在实验小组内讨论，必要时也可以参考其他组数据(需注明)，但报告必须按要求独立完成，禁止互相抄袭。 第二部分 基本生理实验操作 第一节 组织、器官的机能实验 实验1 生理常用仪器设备的使用方法介绍（必修） D－951微机化生理实验教学系统是一种智能化的四导生物信号采集分析系统，适用于80X86系列微机。具备示波器加记录仪加放大器加刺激器等传统生理仪器的全部功能。另外，还具有自动分析、参数预置、操作提示、动画释疑、中文显示、下拉菜单、鼠标驱动和在线帮助等微机特有的功能。有些实验还设计了模拟实验的内容。本系统的功能特点包括：图形化界面；Windows风格；键盘与鼠标操作兼容；模仿仪器面板式操作界面；项目化参数预置；实时记录与实验模拟并行；实时无间隙存盘（＞24h）；自动基线；项目标记；波形编辑等。硬件方面采用程控放大器（程控平衡调节）和程序刺激器，废除了传统的开关和旋钮。参数的调整，通道的切换全部由软件控制。 (1)系统结构:微机化生理实验教学系统由微机、采样及程控专用接口、程控电生物放大器、换能器接口、程控刺激器、专用软件和打印机等组成。通过记录电极或换能器引导出的生物信号，经放大后通过A/D转换送入微机处理。同时微机还可通过专用接口控制放大器的参数和状态整个系统硬件集成为两块硬卡，一块程控放大卡，一块A/D卡。
（2）基本功能：可同步记录4路生物信号。电信号2路：神经干动作电位、传导速度测定、神经放电诱发电位、心电、脑电、肌电等。换能器信号2路：压力(血压、胸膜腔内压、中心静脉压）、张力（肌肉、肠管、蛙心、呼吸等）。 程控刺激输出：频率、波宽、幅度分别可调，可正负双向输出。 (3)操作举例： 1)血压调节：血压换能器连接到3通道，心电信号连接到1通道（可选）。选择：‘血压调节，，项目。采样周期建议为32ms，压缩比建议为1：4。连接好相应装置，用鼠标点击
空格键开始记录。曲线显示的位置及幅度可通过相应的推钮进行调节。若基线位置不合适，可用鼠标点击“自动基线”按钮，使曲线回到合适的位置。所实施的实验项目可通过标功能直接标记在记录曲线上。进行刺激时，可通过面板上的按钮打开刺激器，用推钮调节刺激频率和幅度。实验结束后通过
钮左右移动图形，流浏览实验结果压（缩比可改加1：8），并通过剪贴功能能重新编辑图形。编辑好的图形可存盘作永久保存，也可通过打印机打印出来（图Ⅱ-1）。
图Ⅱ-1动脉血压的变化 1．正常；2．夹闭颈总动脉；3．刺激降压神经；4．刺激迷走神经；5．肾上腺素 2）神经干动作电位：记录电极连接到：通道和2通道，刺激电极连接刺激输出。选择“神经干AP记”项目。程控放大器参数（按“F”键）设定为增益：200；滤波：10K；时间常数：0．05s。按t键（触发采样），程序进入扫描等待状态。按“TNTER”键，程序发出刺激信号，同时进行一次扫描。也可用鼠标选择单次或连续刺激。精细调节刺激幅度可观察动作电位幅度与刺激间的关系，从而找表！阈刺激。逐步调节双刺激间隔，以观察不应期。改变刺激极性（刺激反向）可观察到（刺激伪迹倒向，而动作电位不倒向。按空格键退出触发扫描。通过相应的按键完成存盘、波形测量、打印等操作（图Ⅱ-2）。 2．BL-410电脑化实验系统 （1）概述：BL-410生物机能实验系统是配置在计算机上的4通道生物信号采集、放大、显示、记录与处理系统。它由以下三个主要部分构成： IBM兼容微机。 Biolap410智能型生物信号采集、放大硬卡。 Biolap98生物信号显示与处理软件。 Biolap410智能型生物信号采集、放大卡是一台程序可控的，代4通道生物采集与放大功能，并集成高精度、高可靠性以及宽适应范围的程控刺激器与一体的硬卡。Biolap98生物信号显示与处理软件利用微机强大的图形显示与数据处理功能，可同时显示4道从生物体内或离体器官中探测到的生物电信号或张力、压力等非生物电信号的波形，并可对实验数据进行存贮、分析及打印，它完全替代了原有的利用分离的放大器、示波器、记录仪、刺激器等所构成的繁琐而性能低下的生物信号观测系统，功能更强大与灵活。 （2）系统功能特点： 1）采用12位A/D转换器，最高采样速度可达60kHz。 2）4通道增益（2-50000倍）、低噪音，程控的生物放大器。各通道扫描速度分别可调。 3）程控电刺激器：电压输出（0±35V步长500mV和50mV两挡）和电流输出（0±10mA步长100μA和10μA）两种模式。 4）程控全导联心电选择。 5）以中文win98为软件平台，全中文图形化操作界面。 6）以生理实验为基础，预设置了八个系统约32个实验模块。 7）数据分析功能：可实时地对原始生物信号以及储存在磁盘上的反演信号进行积分、微分、频谱、频率直方等运算、分析；并同步显示该处理后的图形。 8）测量功能：对信号进行实时测量（单点测量、两点测量以及区间测量），也可测量出多项指标，如：最大、最小以及平均值，信号的频率、面积、变化率以及持续时间等。 9）可独立调节4个通道波形的扫描速度 10）有数据反演功能：在反演数据过程中，可用鼠标拖动数据查找滚动条进行快速查找；并可对反演信号进行数据、图形剪切。 11）有打印单、多通道的实验数据功能；在打印时，还可进行图形比例压缩，确定打印位置。 实验2 坐骨神经—腓肠肌标本制备（必修） [目的与原理] 掌握机能学实验的基本组织分离技术；掌握蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本制备的基本操作方法。 蟾蜍等两栖类动物的某些基本生命活动和生理功能与温血动物相似，其离体组织的实验条件较简单且易于控制，在机能实验中常用蛙或蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本观察神经、肌肉兴奋性、刺激与反应的关系及肌肉收缩等某些基本特性或活动规律。 [实验对象] 蟾蜍或蛙。 [试剂与器材] 任氏液、蛙板、玻璃板、粗剪刀、手术剪、镊子、金属探针、玻璃钩针、蛙钉、滴管、培养皿、锌铜弓、烧杯。 [实验步骤] 1、破坏脑脊髓： （1）取蟾蜍一只，用自来水冲洗干净。左手握住蟾蜍，用食指按其头部使之略向前屈，拇指按住其背部，其余三指则握住蟾蜍的四肢和腹部，其手法如图1-7-1A。 （2）用右手持金属探针，在头颅后缘，自枕骨大孔与脊椎管之间刺入椎管，先左右摆动，离断脊髓；再向前插入颅腔，向左右摆动数次，捣毁全部脑组织，如探针确已插入颅腔，则向各方向摆动时，即有触及颅骨的感觉。 （3）将探针撤回至枕骨大孔，但不拔出皮肤，直接向后插入脊椎管，直达骶部，轻轻转动探针，以破坏脊髓。如探针确已在脊椎管中，则不能左右摆动，探针不得穿透脊椎管，以免损伤内脏。最后拔出探针，用小棉球堵塞创口以止血。 脑脊髓破坏完全后，蟾蜍将失去一切反射活动，全身肌肉软瘫。如动物仍有反射动作，表示破坏不彻底，必须重新破坏。 2、去皮和制作下肢标本：
图1-7-1破坏蟾蜍脑脊髓及剥去皮肤 （1）左手握住蟾蜍的脊柱，用粗剪刀在前肢腋窝处，将脊柱横断，并沿脊柱两侧避开坐骨神经剪开腹壁，此时头、躯干上部及内脏全部下垂，剪除头、全部躯干及内脏组织，剪去肛周皮肤，留下脊柱和后肢（图1-7-1B、C）。 （2）用圆头镊子夹住脊柱边缘，注意不要碰到坐骨神经，捏住皮肤边缘，逐步向下牵拉剥离皮肤。（图1-7-1D）将全部皮肤剥除后，标本放于盛有任氏液的小烧杯中。随即洗净蛙板、剪刀和双手上的污物及毒汁。 （3）用粗剪刀沿脊柱和骨盆的中线，将标本纵剖为两半，注意勿损伤坐骨神经。一半置于蛙板上，以制备标本；另一半置于盛有任氏液的玻璃平皿中备用。 3、制备神经－腓肠肌标本： （1）把下肢的背面朝上，参照图1-7-2A所示，辨认蟾蜍大腿的三头肌、二头肌和半膜肌，以及小腿的腓肠肌。 （2）用玻璃钩针和镊子仔细把二头肌和半膜肌分开，便可看到一条粗大的神经，此即坐骨神经。用玻璃钩针把神经挑起，剪去通往大腿肌肉的神经分支，顺着神经走行方向，转向腹腔面沿脊柱逐渐把神经主干全部分出，直到所连的椎骨为止。用粗剪刀剪除多余的肌肉和脊椎骨，仅留下与坐骨神经相连的一小块脊椎骨，用镊子夹住这块脊椎骨，轻轻提起坐骨神经，用手术剪剪去残余的分支，并将坐骨神经一直分离到膝关节附近。 （3）分离腓肠肌的跟腱，用线结扎跟腱，在结扎处以下将跟腱剪断。持线提起腓肠肌，用粗剪刀剪去小腿骨和其上的肌肉，再将大腿肌肉剪去，只留长约1～2cm的股骨，并将其上肌肉刮干净，以便在肌动器上固定此标本（如图1-7-2B）。 4、检验标本：用锌铜弓的两端轻轻接触神经，若肌肉产生收缩，则表示此标本的机能状态良好。 [方法评估] 此为机能学基础理论验证性实验操作技术中的最简单的手术之一。只要仔细操作均能成功 [应用意义] 为检验骨骼肌生理特性的基础手术。在完成此手术的基础上再进行其它神经肌肉特性的实验。 [注意事项] 1、避免蟾蜍毒液及其它污物等污染坐骨神经标本。 2、不得用镊子等金属器械接触神经或用力拉扯神经。 3、剪除神经分支时不得损伤其主 干。 图1-7-2 蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本制备法 1.骨二头肌;2.半膜肌；3.坐骨神经；4.腓肠肌 4、移动制备好的标本时，应用镊子分别夹持脊椎骨片和股骨断端。 5、制作过程中应经常用任氏液湿润标本，以防干燥，标本必须放在任式液中浸泡数分钟后再开始实验。 [思考题] 为什么在标本的制作过程中不能用清水冲洗标本只能用任氏液湿润或浸泡标本？ 实验3 刺激强度对骨骼肌收缩的影响（必修） [目的与原理] 掌握刺激、记录肌肉收缩的方法和测量组织兴奋性的方法；观察刺激强度与肌肉收缩反应的关系；理解阈刺激、阈上刺激、阈下刺激、最大刺激等基本概念。 神经、肌肉组织具有兴奋性，能接受刺激而发生反应。但刺激要引起组织兴奋，其强度和作用时间必须达到一定的阈值（称强度阈值及时间阈值）。兴奋性不同的组织其阈值大小亦不相同，兴奋性高的阈值小，因此，阈值常作为衡量组织兴奋性高低的客观指标。 不同种类的组织兴奋性高低不同，同一组织的不同单位其兴奋性也不同，例如腓肠肌是由许多肌纤维组成的，个个肌纤维的兴奋性高低并不相同。当用刺激时间一定的单个刺激直接（或通过神经间接）刺激腓肠肌时，如刺激强度太弱，不能引起肌肉收缩（强度未达到阈值的刺激为阈下刺激）；只有当刺激增强到一定强度时，才能引起肌肉发生最微弱的收缩，这种刚能引起最小反应的最小刺激强度称阈强度（或强度阈值），强度达到阈值的刺激即称阈刺激，此时只是少数兴奋性较高的肌纤维产生了收缩。以后随着刺激强度的增加，越来越多的肌纤维被兴奋，肌肉的收缩也相应地逐步增大（强度超过阈值的刺激称为阈上刺激）；当刺激强度增大到某一个强度时，整块骨胳肌中所有的肌纤维均产生了兴奋，肌肉出现最大的收缩反应，此时如再继续增大刺激强度，肌肉的收缩却不再增大。这种能使肌肉发生最大收缩反应的最低刺激强度称为顶强度（或最适强度）。具有顶强度的刺激称为最大刺激，最大刺激引起的肌肉收缩称最大收缩。可见，在一定范围内，骨胳肌收缩的大小取决于刺激的强度，这是刺激与组织反应之间的一个普遍规律。 [实验对象] 蟾蜍或蛙。 [试剂与器材] 任氏液、计算机、生物信息采集处理系统（或二道生理记录仪、电子刺激器）、张力换能器、肌动器、铁支台、双凹夹、蛙类手术器械等。 [实验步骤] 1、按实验72的方法制备坐骨神经-腓肠肌标本，在任氏液中浸泡10～20min （本实验也可只用腓肠肌标本，但为练习标本制作，仍然制成坐骨神经-腓肠肌标本）。 2、熟悉计算机实验教学系统的结构、功能及其基本操作方法。 3、将坐骨神经-腓肠肌标本固定在肌动器上，并将神经搭在其刺激电极上，把刺激的输出线与肌动器刺激电极的接线柱连接，或在接线柱上再接上两根细漆包线（其两端漆皮要去掉），直接插入腓肠肌的两端作刺激电极用。 4、将张力换能器用双凹夹固定于铁支台上，其换能器的输出线插入计算机的信号输入插口。 5、将腓肠肌跟腱结扎线的一端与换能器的簧片相连，不能拉得太紧。 6、打开计算机等待自动进入智能型生物信息采集处理系统主页界面，在空白处双击后进入主界面，于顶级菜单“实验项目”处单击，打开子菜单后点击“肌肉神经实验，再选择“刺激强度与反应的关系”项单击，出现对话框填入合适的数据后点“OK”进入实验的监视。实验方式可选程控。 7、观察生物信号的显示：窗口可见弱刺激开始时肌肉无收缩反应，随着刺激强度的加大刚能记录出收缩反应时为阈强度，以后收缩高度逐渐加高直到连续三、四个收缩的高度不再随着刺激强度的加大而加高为止，收缩高度不发生改变的最小刺激强度为顶强度（最适强度），此刺激就是最大刺激。可根据结果调节填入对话框的数据（主要是起始刺激强度、刺激强度增量的设置），以描绘出满意的图形，见图1-7-3。
图1-7-3 刺激强度对骨骼肌收缩的影响 [方法评估] 此方法比较简单为检测骨骼肌兴奋收缩特性与刺激强度的关系的常用方法。 [应用意义] 此为骨骼肌生理特性的验证性实验之一，主要应用于观察刺激强度对骨骼肌收缩的影响以及测量骨骼肌兴奋性的高低。 [注意事项] 1、每次连续刺激时间不宜太长，且每两次刺激之间应让标本休息0.5-1min，以防肌肉疲劳影响实验结果。 2、随时用任氏液湿润标本，以保持其良好的兴奋性。 3、标本固定的松紧要适度，并防止肌肉产生持续的强直收缩，才能保证做出良好的肌肉收缩曲线图。 [思考题] 1、引起组织兴奋的刺激必须具备哪些条件？ 2、什么是阈刺激、阈上刺激、阈下刺激及最大刺激？ 3、为什么在一定范围内腓肠肌收缩曲线的幅度会随着刺激强度（在一定范围内）的增加而不断增大？ 实验4 刺激频率对骨胳肌收缩的影响（必修） [目的与原理] 观察肌肉收缩的形式及刺激频率与肌肉收缩之间的关系，了解与掌握单收缩、复合收缩、强直收缩的特征及其形成的基本原理。 当给肌肉一个阈上刺激时，肌肉即发生一次收缩反应，这是肌肉收缩的最简单形式，称为单收缩，其总时程为0.11s，包括潜伏期、收缩期共0.05s，舒张期0.06s。如相继给予肌肉两个以上强度相同的阈上刺激时，若刺激之间的间隔时间超过一次单收缩的持续时间，则肌肉将出现一连串各个分开的单收缩；若间隔时间比一次单收缩的持续时间短，则前一个收缩波还未结束就开始后一个收缩，这样两次收缩就会重叠起来，这种现象称为复合收缩。如果后一个收缩是在前一个收缩的舒张期内发生的，各次收缩复合的结果，会出现持续的锯齿状的收缩曲线，称为不完全强直收缩。若刺激的间隔时间比单收缩的收缩期短，后一收缩就在前一收缩的收缩期内发生，结果会出现一持续的平滑收缩曲线，称为完全强直收缩，刺激强度一定时，强直收缩的高度要比单收缩高，而且在一定范围内，收缩高度随刺激频率的增加而增高。（图1-7-4） [实验对象] 蟾蜍或蛙。 [试剂与器材] 任氏液、计算机、生物信息采集处理系统（或二道生理记录仪，电子刺激器）、张力换能器、肌动器、铁架台，双凹夹、蛙类手术器械等。 [实验步骤] 1、按实验72的方法制备坐骨神给腓肠肌标本，在任氏液中浸泡10～20min（本实验也可只用腓肠肌标本，但为练习标本制作，仍然制成坐骨神经-腓肠肌标本）。 2、将坐骨神经-腓肠肌标本固定在肌动器上，并将神经搭在肌动器刺激电极上，把刺激的输出线与肌动器刺激电极的接线柱连接，或在接线柱上再接两根细漆包线（其两端漆皮要去掉），直接插入腓肠肌的两端作刺激电极用。 3、将张力换能器用双凹夹固定于铁支台上，其换能器的输出线插入计算机的信号输入插口。 4、将腓肠肌跟腱结扎线的一端与换能器的簧片相连。注意：不能拉得太紧。 5、打开计算机等待自动进入智能型生物信息采集处理系统主页界面，在空白处双击后进入主页界面，于顶级菜单“实验项目”处单击，打开子菜单后点击“肌肉神经实验”，再选择“刺激频率与反应的关系”项单击，出现对话框后选择现代或经典实验进入实验的监视。 6、调节对话框的数据，如刺激强度（一般为5—7.5V）、刺激频率增量（一般为1、6、10、15、20、30Hz）的设置，直至做出满意的肌肉收缩曲线图形，即记录出几个单收缩曲线和一段不完全强直收缩及完全强直收缩曲线，见图1-7-4。
图1-7-4 骨骼肌的单收缩和强直收缩 上：收缩曲线 下：刺激标记 1.单收缩 2.不完全强直收缩 3.完全强直收缩 [方法评估] 为检验骨骼肌兴奋收缩特性与刺激频率关系的常用方法，操作简单易于掌握。 [应用意义] 为骨骼肌生理特性验证性实验之一，主要应用于观察刺激频率对骨骼肌收缩的影响。 [注意事项] 1、连续刺激时间不宜太长，每次刺激持续时间要保持一致，不得超过3—4s，且每两次刺激之间应让标本休息0.5-1min，以防肌肉疲劳影响实验结果。 2、经常用任氏液湿润标本，以保持其良好的兴奋性。 3、标本固定的松紧要适度，才能保证做出良好的肌肉收缩曲线图。 [思考题] 1、何谓单收缩？单收缩的潜伏期包括哪些时间因素？有神经和无神经的标本有何差异？ 2、为什么刺激频率增高，骨骼肌收缩幅度也增高？ 3、何谓不完全强直收缩、完全强直收缩？它们是如何形成的？ 4、如果能用单根的腓肠肌纤维重复以上实验，预期的实验结果将会怎样？为什么？ 实验5 蛙心起搏点（必修） [目的与原理] 利用改变局部温度和结扎方法来观察蛙心起搏点和蛙心脏不同部位的自律性高低。 动物心脏的特殊传导系统具有自动节律性，但心脏各部分自律性高低不同，哺乳动物以窦房结的自律性最高。正常心脏搏动每次都是自窦房结传出，传到心房，心室引起收缩，所以窦房结被称为哺乳动物的心搏起点。两栖类动物心搏起点是静脉窦，鱼类的心脏则具有2～3个这样的自动节律性中枢。 [实验对象] 蟾蜍或蛙 [试剂与器材] 蛙类手术器械、蛙心夹、滴管、线、任氏液、小试管、35～40℃热水。 [实验步骤] 1、取蟾蜍一只，用探针破坏脑和脊髓后将蟾蜍仰卧固定在蛙板上，用剪刀剪开胸骨表面皮肤并沿中线剪开胸骨，可见心脏在心包内，仔细剪开心包暴露心脏。 2、参照图l-7-7、图1-7-8识别静脉窦，心房和心室。观察它们的跳动程序并计算它们在单位时间内的跳动次数。 3、用盛有35～40℃热水的小试管分别靠近心室与心房，静脉窦，改变其局部温度观察它们的跳动次数有何改变。 4、用镊子在主动脉：下穿一线备用，用玻璃针穿过主动脉干下面，将心尖翻向头端，暴露心脏背面，在静脉窦和心房交界的半月形(窦房沟)处将线作一结扎以阻断静脉窦与心房之间的传导，观察心房的跳动是否停止?静脉窦是否仍在跳动? 5、待心房、心室恢复跳动后，分别计数单位时间内静脉窦和心房、心室跳动频率，两者是否一致? 6、记录上述实验观察结果，并根据其结果作出分析和讨论。
图1-7-7 蟾蜍心脏腹面观
图1-7-8 蟾蜍心脏背面观 [方法评估] 验证心肌自律性的基本方法，操作简单易于掌握。 [应用意义] 为心肌生理特性验证性实验，应用于检测心脏起搏点及其心脏各部位自律性高低。 [注意事项] 在沿窦房沟用丝线结扎时，结扎线应尽量靠近心房端，以免伤及静脉窦。同时可确保心房侧无静脉窦组织残留；结扎要紧以完全阻断静脉窦与心房间的传导。结扎后，应注意观察心脏各部分节律性活动先是出现什么变化?而后又将如何? [思考题] 1、在正常情况下，静脉窦、心房和心室三者的节律性舒缩活动有何不同?为什么? 2、分别用盛有40℃左右热水的小试管接触心室、心房和静脉窦，将引起什么变化?为什么? 3、在静脉窦与心房交界部的窦房沟处作一结扎，观察心脏各部分的节律性活动立即有何变化?为什么? 4、稍待片刻，再观察心脏各部分的节律性活动又将如何?为什么？ 实验6 期前收缩与代偿间歇（必修） [目的与原理] 掌握心脏活动的描记方法，观察在心脏活动的不同时期给予刺激时心肌兴奋性的阶段性变化，了解心脏活动的特点及期前收缩、代偿间歇产生的的基本原理。 心肌每兴奋一次，其兴奋性就发生一次周期性变化。心肌兴奋性的特点在于其有效不应期特别长，几乎相当于整个收缩期和舒张早期。因此，在心脏的收缩期和舒张早期内，任何刺激均不能引起心肌兴奋而收缩，但在舒张早期以后，给予一次较强的阈上刺激就可以在正常节律性兴奋到达之前，产生一次提前出现的兴奋和收缩，称之为期前收缩或额外收缩。同时，期前收缩亦有不应期，因此，如果下一次正常的窦性节律性兴奋到达时正好落在期前收缩的有效不应期内，便不能引起心肌兴奋而收缩，这样在期前收缩之后就会出现一个较长的舒张期，这就是代偿问歇。 [实验对象] 蟾蜍或蛙。 [试剂与器材] 任氏液、计算机、生物信息采集处理系统（二道仪、刺激器）、蛙类手术器械、蛙心夹、刺激电极、机械换能器、铁架台、双凹夹、小试管、滴管、丝线。 [实验步骤] 1、取蟾蜍一只，破坏脑和脊髓，将其仰卧位固定于蛙板上。由剑突水平向两肩关节方向剪开皮肤，然后沿胸骨打开胸腔，剪开心包，充分暴露心脏。 2、将连有线的蛙心夹在心室舒张期夹住心尖后，再将连线缚于机械换能器的簧片上，调整机械换能器，使连线松紧适度。 3、将与计算机连接的刺激电极的两端分别与蛙心夹和蟾蜍的身体相连。 4、打开计算机，进入Bio1ap98菜单条→实验项目（单击）→循环系统→期前收缩与代偿间歇（单击）。调节刺激频率到单刺激，刺激强度到中等强度。 5、当用鼠标给予额外刺激时，观察刺激落到心室收缩期和舒张早期能否引起期前收缩？当刺激落在心室舒张早期之后能否引起期前收缩？如能引起期前收缩，观察其后是否出现代偿间歇？
图1-7-9 期前收缩与代偿间歇 6、记录一段正常心肌收缩曲线和期前收缩、代偿间歇的曲线图形。（图1-7-9） [方法评估] 检验心肌生理特性的基本方法之一，为常用方法，手术及其操作均简单易于掌握。 [应用意义] 为心肌生理特性验证性实验，主要应用于检测心肌接受一次刺激后兴奋性的变化及期前收缩代偿间歇的产生。 [注意事项] 1、破坏蟾蜍脑和脊髓要完全。 2、蛙心夹与机械换能器间的连线一定要垂直，且与心轴一致，并应有一定的紧张度。 3、注意滴加任氏液，以保持蛙心适宜的环境。 [思考题] 1、心肌受到一次刺激产生兴奋后，兴奋性的周期性变化的特点是什么？与骨骼肌有什么不同？ 2、心肌为什么能产生自动节律性的收缩与舒张？ 3、期前收缩和代偿间歇产生的原理。 实验7 蛙心灌流（选修） [目的与原理] 掌握离体蛙心的灌流方法；了解内环境理化因素的相对恒定对维持心脏正常节律性活动的重要作用；并观察Na+、K+、Ca2+、肾上腺素、乙酰胆碱等对心脏活动的影响。 蛙心起搏点静脉窦能按一定节律自动产生兴奋，因此将离体蛙心保持在适宜的环境中，在一定时间内仍能产生节律性兴奋和收缩活动；心脏正常的节律性活动有赖于内环境理化因素的相对稳定，所以改变灌流液的成分，则可以引起心脏活动的改变。 [实验对象] 蛙或蟾蜍。 [试剂与器材] 任氏液、0．65%NaC1、2%CaC12、1%KC1、1：10000肾上腺素、1：10000乙酰胆碱、计算机、生物信息采集处理系统（或二道仪、刺激器）、蛙类手术器械、蛙心夹、蛙心插管、机械换能器、铁架台、双凹夹、试管夹、小烧杯、滴管、丝线、玻璃分针。 [实验步骤] 1、离体蛙心的制备： （1）取蟾蜍一只破坏其脑和脊髓后，仰卧位固定于蛙板上，剪开胸壁，暴露心脏，在两个主动脉干下穿两根细线将其中一根打活结备用（用以结扎和固定插管）。将连有细线的蛙心夹在心舒期夹住心尖部。 （2）用玻璃分针将心脏轻轻向上翻转，将主动脉干下的另一根细线向下拉，在静脉窦的远端做一结扎（切勿扎在静脉窦上），以阻止血液回流心脏。 （3）将心脏翻回原位置，用眼科剪在主动脉球上端向下剪一斜向的切口，将盛有少量任氏液的蛙心插管由切口插入动脉球，再将蛙心插管尖端转向背侧及左下方，于心缩期插入心室内（插管不可插得太深）。插管如已进入心室，则见管中液面随着心搏而升降，此时即可将预置线的活结扎紧，并固定于插管壁的小钩上，以免插管滑出心室。 （4）将心脏连同静脉窦一起剪下，必须注意不得损伤静脉窦。吸去管内的血液，并用任氏液反复冲洗心室内的余血，以防止血液凝固而影响实验的进行。 2、实验装置：将蛙心插管用试管夹固定于铁架台上，蛙心夹的细线连接在机械换能器的簧片上。换能器的输出线与计算机的输入接口相连接。 3、打开计算机，进入Biolap98菜单条 →实验项目（单击）→循环实验→蛙心灌流（单击），并根据蛙心的灌流液做好标记。（图1-7-10） 4、观察项目： （l）记录心脏收缩曲线，观察心率及收缩幅度，作为正常对照。 （2）吸去插管内的任氏液，换以等量的0．65%NaC1，观察并记录心脏的活动变化。 （3）吸出管内溶液并用任氏液冲洗数次后换以等量任氏液，待心脏恢复正常后，加入2%CaC121～2滴，观察并记录心脏的活动变化。 （4）同上法冲洗并换以等量任氏液，待心脏 恢复正常后，加入1%KCI 1～2滴，观察并记录 心脏的活动变化。 图1-7-10蛙心灌流仪器连接方法 （5）同上法冲洗并换以等量任氏液，待心脏恢复正常后，加入1：10000肾上腺素2～3滴，观察并记录心脏的活动变化。 （6）同上法冲洗并换以等量任氏液，待心脏恢复正常后，加入1：10000乙酰胆碱1～2滴，观察并记录心脏的活动变化。 [方法评估] 检验心肌生理特性的基本方法之二，手术及操作亦较简单易于掌握。 [应用意义] 为心肌生理特性验证性实验，主要用于验证或检测内环境因子对心脏活动的影响。 [注意事项] 1、蛙心夹应一次夹住心尖，不宜反复多次以致损伤心脏，导致漏液。蛙心夹与换能器簧片的连线呈一定的倾斜度，以防止溶液滴入换能器。 2、当各项实验效果明显后，应及时将插管内溶液吸出，用任氏液反复冲洗数次，待心跳恢复正常后，再进行下一项实验。 3、各种溶液的吸管必须分开，不要混用。 4、在实验过程中，蛙心插管内灌流液的液面高度应适宜，一般为1～2cm，在各项观察项目中，液面高度应保持一致。仪器各项参数一经调好也不可变动。 5、加药后效果不明显可适量滴加并密切注意计量增加后的实验结果，出现变化应立即更换任氏液，加药过量会导致不可挽回的后果或难以恢复的心脏停跳。 6、每进行观察项目时，先记录一段正常对照曲线，然后再加入待试液，并记录其效应。 [思考题] 1、高K+高Ca2+高Na+对心脏活动有什么影响，其机理如何？ 2、从心肌生理特性分析以上实验结果。 实验8 鱼类心脏灌流（选修） [目的和原理] 掌握鱼类离体心脏灌流方法，并通过自主性药物对心脏活动的影响，加深对鱼类心肌某些特性的理解。 离体心脏在生理盐溶液中能保持一定的节律性兴奋与收缩活动。将离体鱼心置于生理盐溶液中，并通过导管对心脏进行灌流，再通过记录装置，便可记录与分析心脏活动规律。同时利用这一装置，可以研究内环境渗透压、自主性药物、及其它因子等对心脏活动的影响，特别是对心肌自动节律性的影响，从而加深对心肌细胞生理特性的理解。 [试剂与器材] 材料：鲤 试剂： 1、灌流液（鱼类生理盐溶液：）NaCl：7.526g ，KCl：0.417g，CaCl2：0.322g，MgCl2：0.095g，NaHCO3：0.193g，KH2PO4：0.122g，葡萄糖：2.91g，蒸馏水：lL，配好后溶液的pH值为6.9。 2、肾上腺素，乙酰胆碱、5一羟色胺：用灌流液配制成10－5的浓度。 器材： 实验装置(如图1-7-11所示) [实验步骤] 用MS-222把鱼麻醉，打开胸腔，迅速取出心脏，要保留一定长度的腹大动脉和主 静脉，放入盛有100ml灌流液的培养缸中。 2、如图1-7-11所示，从后主静脉或肝静脉插入一塑料小管(选择合适的管径)，在窦房结处结扎，从腹大动脉插入另一管，在与动脉球连接处结扎。 3、按图1-7-11所示接好灌流装置。灌流速度调整为2—3ml／min。灌流液从容器中经蠕动泵，稳流烧瓶和导管进入静脉窦，再从动脉球流出，流出的液体用量简收集，计算其速度。用压力换能器记录心脏活动。换能器上有一根短的钨丝、其末端连着一个小塑料珠子(4mm)。珠子紧靠心室放置，心房和心室收缩引起钨丝偏斜，经放大而显示在内应力测定记录仪上(Dynagraph recorder)。 4、在3—6s内，从注射阀门注入药物0.05-0.2ml，观察心脏收缩的变化。每种药物注入后，要经过一段时间让心脏恢复正常，才能注入第二种药物。
图1-7-11 鱼心脏灌流装置图 [方法评估] 该方法为了解鱼类心肌某些特性的基本实验方法之一，其实验装置和手术操作都较复杂，且较难以掌握，可用于研究性实验。 [应用意义] 了解鱼类心肌特性的验证性实验也可用作研究各种因素（如农药、有机物污染、高氨氮等）对鱼类等水产动物心脏功能的影响。 [注意事项] 1、手术一定要认真仔细，以免穿透心脏难以进行灌流； 2、在灌流过程中一定注意要在恢复正常后才能加入第二种药物； 3、出现曲线变化后即刻换掉药物以免长时间作用难以恢复生理功能。 [思考题] 1、实验中化学物质对鱼类心脏活动的影响如何；与高等脊椎动物比较有何不同。 2、分析对比肾上腺素、乙酰胆碱、5-羟色胺等对心脏收缩的影响并讨论其作用机理。 实验9 离体小肠平滑肌的生理特性（必修） [目的与原理] 掌握离体小肠平滑肌收缩的记录方法。通过观察化学物质、温度变化对离体小肠平滑肌收缩的影响，加深对平滑肌某些基本特性的理解。 消化道平滑肌除具有与骨骼肌相同的某些特性（如兴奋性、收缩性）外，还具有自动节律性和对某些化学物质特别敏感的特性；离体肠段还具有一定紧张性。 离体小肠平滑肌在适宜环境中仍可保持其生理功能，因此可以将小肠肠段置于模拟的内环境中观察各种理化因子的变化对小肠平滑肌收缩活动的影响。 [实验对象] 家兔离体肠段。 [试剂和器材] 木槌，平滑肌恒温浴槽，生物信息采集处理系统，计算机，球胆，氧气，滴管，烧杯，普通剪刀，手术剪，镊子，热水，冰块，台氏液，肾上腺素(1：10 ,000)，乙酰胆碱(1：100 ,000)，10g／LCaCl2，NaOH(1mol/L )，HCl(1 mol/L)。 [实验步骤] 1、实验准备 (1)制备标本：提起家兔后肢将其倒悬，用木槌猛击头部致昏迷。立即开腹，在十二指肠及其邻近部位剪20 ～ 30cm长的肠段，用台氏液冲洗肠段中的内容物，然后剪成数小段(每段长约2 -3cm)，用棉线结扎肠段两端，置于4～6℃台氏液中备用。 (2)加热恒温浴槽：将台氏液加入恒温浴槽中心管内，外部容器中装入温水(略低于38℃)，开启电源加热，浴槽温度就会自动控制在38℃左右。 (3)连接好仪器，选择适当的参数。 (4)放置标本，连接实验装置：将肠段一端结扎线连在中心浴槽内标本固定钩上，另一端结扎线连在张力换能器上，将浴槽充气管与充满氧气的球胆相连，调节三通开关．使气泡小而连续地通至中心浴槽．以供给标本足够的氧气。换能器的输出线与计算机输入接口相连接。参看图1-7-12。 (5)打开计算机，在功能菜单上选择本实验的软件后，使系统进入信号采集状态。单击实验项目→平滑肌实验，并根据注入的药物做好标记。 2、观察项目 (1)自动节律收缩：在不施加刺激的情况下，观察记录其舒缩状况。注意节律、波形、幅度及紧张性(依据曲线的基线变化而定)。 (2)Ach的作用：用接有腰穿针头的注射器抽取1：100 ,000Ach 0.4 ml。插入浴槽内适当深度后注入，使其迅速发挥作用。观察曲线变化．出现明显效果后．立即更换浴槽内台氏液，反复3次。待平滑肌收缩恢复后，再进行下一项观察。 (3)肾上腺素的作用：按上法注入1：10 ,000肾上腺素0.4 ml，记录到曲线明显变化后，按上法更换台氏液。 (4)CaCl2的作用：按上法给予1：100CaCl20.4ml。观察平滑肌的反应后，按前法更换台氏液。 (5)温度的影响：在浴槽中加一小块台氏液制的冰块，以降低浴液温度（约至25℃左右），观察平滑肌的反应。待冰块融化，浴槽内温度回升后，即可进行下一项而不必换液。 (6)HCI的作用：将1mol/L的HCl0.4 ml加入浴槽内，观察平滑肌的反应，按前法更换台氏液。 (7)NaOH的作用：将1mol／L的NaOH 0.4ml加入浴槽内,观察平滑肌的反应。
　　　 图1-7-12 离体小肠平滑肌实验装置 [方法评估] 上述实验可使用两套浴槽中的任一套，用玻璃浴槽简便但控温不理想。恒温浴槽控温较好也较简便，价格较贵。 [应用意义] 为平滑肌生理特性验证性实验，主要应运于观察分析平滑肌生理特性自动节律性、收缩性及其各种理化因子对它的影响。 [注意事项] 1、注意保持浴槽内温度在38℃左右，每次更换台氏液前，要先将台氏液加热至38℃左右再加入浴槽内。 2、每项实验出现作用后，要及时更换台氏液并冲洗数次，待肠段恢复正常后再进行下一个实验。 3、滴加药液时，要有一定深度，且需计量适度，不可加药过量。 [思考题] 1、小肠平滑肌有哪些特性? 2、小肠平滑肌受哪些因素调节? 实验10 反射中枢活动的某些基本特征及反射弧的分析（选修） [目的与原理] 通过对某些脊髓反射（如脊蛙的屈肌反射）的分析，了解反射弧完整性与反射活动的关系 掌握反射时的测定方法，通过用不同浓度的硫酸溶液刺激蛙趾引起屈肌反射，了解刺激强度与反射时的关系。 以脊蛙的屈肌反射为指标，观察反射中枢活动的某些基本特征，并分析它们产生的机制。 在中枢神经系统的参与下，机体对刺激所产生的具有适应意义的规性律性反应过程称为反射。将动物的高位中枢切除仅保留脊髓的动物成为脊髓动物（如脊蛙），它们产生的反射活动为单纯的脊髓反射，由于失去高位中枢的控制反射活动较为简单，便与观察与分析反射过程的某些特征。 反射活动的结构基础是反射弧。典型的反射弧由感受器、传入神经、神经中枢、传出神经和效应器五个部分组成。反射弧必须保持完整性，才能引起反射，其中任何一个环节受到破坏，反射活动就无法实现。 在反射活动中，由于神经元特别是中间神经元联系方式的不同，使反射活动表现出种种特征。如：反射时（从刺激作用于感受器至效应器出现反应所经历的时间）的长短、反射活动空间范围的大小、反射活动持续时间的久暂以及引起反射活动的刺激条件等等。 [实验对象] 蟾蜍。 [试剂与器材] 硫酸溶液（0．1%、0．3%、0．5%、1%）、纱布。蛙类手术器械、铁架台、血管钳一把、秒表、玻璃平皿、肌夹、搪瓷杯、小滤纸（约1cm×1cm）、刺激电极两个、双输出电刺激器一台、烧杯。 [实验步骤] 1、实验准备 取蟾蜍一只，用粗剪刀由两侧口裂剪去上方头颅，制成脊蟾蜍。将动物俯卧位固定在蛙板上，于右侧大腿背侧纵行剪开皮肤，在股二头肌和半膜肌之间的沟内找到坐骨神经干，在神经干下穿一条细线备用。手术完后，用肌夹夹住动物下颌，悬挂在铁架台上。 2、实验项目 （l）反射中枢活动的某些基本特征 ①反射时的测定：在平皿内盛适量0.1%硫酸溶液，将蟾蜍一侧后肢的一个脚趾尖浸入硫酸溶液中，同时按动秒表记录从浸入时起至后肢发生屈曲所需要的时间，并立即将该足趾浸入搪瓷杯水中浸洗数次，然后用纱布拭干。用上述方法重复三次，注意每次浸入趾尖的深度要一致。三次所测时间的平均值，即为此反射的反射时（两次实验间隔至少2～3min）。然后平皿中分别换以0.3%、0.5%、1%的硫酸溶液再重复上述测定，比较四种浓度硫酸所测之反射时是否相同。 ②反射的空间范围（扩散）：将一个电极放在蟾蜍后肢的足面皮肤上，先给予弱的连续电刺激，观察发生的反应，然后依次增加刺激强度，观察每次增加强度所引起反射的空间范围有何变化。 ③反射的持续时间（后放）：在观察反射的空间范围中，还要注意观察随刺激强度的增加，所引起反射持续的时间有何变化，并以秒表计算至刺激停止起到反射活动结束之间共持续多少时间（后放）。 ④阈下刺激引起反射的条件：将两个刺激电极各连接刺激器的输出端，然后分别与蟾蜍同一后肢相同的皮肤区域接触，用单个电刺激找出引起屈肌反射的阈值，再用略低于此阈值的阈下刺激分别给以单个电刺激，如均不引起反应，然后把两个电极放在皮肤的同一区域，距离不超过0.5cm，当同时给予阈下刺激时，观察可否引起反射。 另外，只放一个电极在后肢皮肤上，在给一次阈下刺激不能引起反射的情况下，换以连续刺激并依次增加刺激频率，记录哪一频率最早引起反射，并计算该频率刺激的时间间隔（即刺激频率的倒数）。 ⑤反射的抑制：用0．5%硫酸溶液测定反射时，然后用止血钳夹住一侧前肢，给一个较强的刺激，待动物安静后再测反射时，观察其有无延长？ （2）反射弧的分析 ①用浸有1%硫酸溶液的小滤纸片贴在下腹部。观察双后肢有何反应？待反应出现后，将动物浸于搪瓷杯的清水内洗掉滤纸片和硫酸，用纱布擦干皮肤。提起穿在右侧坐骨神经下的细线，剪断坐骨神经，再重复上述实验，比较两次结果有何不同？ ②分别将左右后肢趾尖浸入盛有1%硫酸的小平皿内（两侧浸没的范围相等且仅限于趾尖），双侧后肢是否都发生反应？ ③沿左后肢趾关节上做一环形皮肤切口，将切口以下的皮肤全部剥脱（趾尖皮肤一定要剥干净），再用1%硫酸溶液浸泡该趾尖（切不可将其他趾尖浸入），观察该侧后肢的反应。 ④将一1%硫酸纸片贴于左后肢皮肤，观察引起的反应，用搪瓷杯中清水洗掉纸片及硫酸，擦干皮肤后，将探针插入脊髓腔内反复捣毁脊髓，再重复刚才的实验。结果如何？ [方法评估] 操作简单、易于掌握，为常规实验方法。 [应用意义] 为了解中枢神经系统某些特征及活动规律的验证性实验，主要用于观察分析中枢神经系统内反射中枢的活动规律及反射弧的完整与反射活动的关系。 [注意事项] 1、离断颅脑部位要适当，太高可能保留部分脑组织而出现自主活动，太低也会影响反射的引出。 2、每次用硫酸溶液或纸片处理后，应迅速用搪瓷杯中的清水洗去皮肤上残存的硫酸，并用纱布擦干，以保护皮肤并防止冲淡硫酸溶液。测定反射时的硫酸浓度应由低到高。 3、施加电刺激时，要区别是通过皮肤刺激了传出神经或肌肉引起的局部反应，还是引起的反射性反应。 4、浸入硫酸溶液的趾尖应仅限于一个，而且每次浸泡的范围也应恒定，切勿浸入太多。 [思考题] 1、何谓反射时，反射时与刺激强度之间有何关系？ 2、反射弧包括哪几部分？剥去趾关节以下的皮肤后不再出现原有的反射活动，为什么？ 3、何谓时间总和和空间总合？ 第二节 血液组成成分及其性质的分析测定 鱼类等脊椎动物血细胞的形态、数量、白细胞分类及其比例、生理特性（红细胞悬浮稳定性及渗透脆性等）以及血浆中的各种组成成分（包括多种蛋白质、非蛋白氮及其它有机物、无机物）、理化特性（包括比重、粘滞性、渗透压、pH等）都是相对稳定的，即为内环境相对稳定性，它具有重要的生理意义。 机体感染疾病或受到环境污染物的胁迫时，以上各项生理生化指标，特别是血细胞形态（变形率）、数量、白总分、血细胞生理特性及血浆中各组成成分会发生较大的变化。测定水产动物（鱼类）这些指标的变化及其变化幅度有助于水产动物（鱼类）疾病的初步诊断及其抗病力、抗污染力的分析研究。 本节所介绍的内容为以上各项生理生化指标的常规检测方法和基本操作技能，其实验设备简单、实验方法经典成熟、操作简便易行，主要应用于鱼类血液中各项生理生化指标的检测，由于无脊椎动物（虾、贝类）血细胞形态、分类、功能、性质及血液各组成成分与鱼类等脊椎动物存在较大的差异，所以这些方法只能参考应用。 实验11 红细胞与白细胞的计数（必修） [目的与原理] 掌握鱼类采血技术和鱼类红、白细胞计数的原理和方法，并测定不同鱼类的红、白细胞含量及其差异。 采用稀释法计数鱼类单位容积血液内的红细胞和白细胞数。由于血液中红、白血细胞数很多无法直接计数，故需用适当的溶液将血液稀释。然后将稀释血滴入血细胞计数板上，在显微镜下计数一定容积的红、白细胞数。再将所得的结果换算为每立方mm血液中红、白细胞个数。 [实验对象] 鲤、鲫或草鱼。 [试剂与器材] 显微镜，血细胞计数板，计数器，鱼用注射器（1ml或5ml），吸血管，凹瓷盘，消毒棉球，纱布，擦镜纸，小试管及试管架，移液管（1ml及2ml），红、白细胞稀释液（或0.85—0.9%的NaCl溶液），75%的酒精，蒸馏水，抗凝剂（1%肝素钠溶液或10%草酸钾溶液）。 [实验步骤] 1、熟悉血细胞计数板的构造：血细胞计数板为一长方形厚玻璃板。其中计数室方格大小的划分，各种产品略有不同，但基本原理相同。其中央横沟的两边各有一计数室，两计数室的划分完全相同（图1-5-1）。在显微镜低倍下观察，可见每个计数室用双线划分成9个大方格（图1-5-2）。大方格每边长1.0mm。四角的大方格每个又分为16个中方格，这是用以计数白细胞的。中央的一个大方格用双线分成25个中方格，每个中方格又等分成16个小方格（用单线），中方格每边长为0.2mm，计数红细胞时，数中央大方格的5个中方格（即四角和中央的中方格）内的红细胞数目（图1-5-2）。计数室较两边的盖玻片支柱低0.1mm，因此，放上盖玻片后，计数板与盖玻片之间的距离为0.1mm，此为计数室的高度。 2、采血及稀释：以2ml移液管在干净的小试管内准确加入红细胞稀释液或0.85~0.9%的NaCl溶液2ml，另用1ml移液管在另一干净的小试管内加入白细胞稀释液0.38ml，备用。 鱼类血液可从心脏或尾动脉中采取。方法是将鱼腹部向上固定在鱼解剖台上，或用纱布包好握在手里，用浸润过抗凝剂的注射器沿鱼体中线与两腹鳍根部之间相交部位刺入，依据解剖部位确认已刺入心脏，可稍后拔针管，如有血液吸入即可，否则重新拔出再刺。
图 1-5-1 血细胞计数室结构 图 1-5-2 血细胞计数区 尾动脉取血方法是用注射器从鱼体臀鳍后部插入至椎体腹侧，尾静脉血液顺势流入针管，每尾鱼可用此方法数次采血，但每次针头插入部位应在前次插入之前。 将抽出的血液放入经抗凝剂处理的凹瓷盘内，用微量（血红蛋白）吸血管吸取10μl血液至红细胞稀释液试管内，再吸取20μl血液至白细胞稀释液试管内，轻轻挤出血液并反复吸洗2～3次。然后将血液与稀释液混和均匀，但不可用力振荡，以免细胞破碎。 3、充液：将盖玻片先盖在计数板上，用洁净的吸血管吸取摇匀的稀释血液，然后将吸管口轻轻斜置盖玻片的边缘，滴出少量稀释血液，使溶液借毛细管现象而流入计数室内。但必须注意，如滴入过多时，流出室外凹沟中，易造成盖玻片浮起，体积不准；过少时，经多次充液，易造成气泡，所以都应洗去重新充液。 4、计数：稀释血液滴入计数室后，须静置2—3分钟，然后低倍镜下计数（显微镜焦距准确，缩小光圈并降低聚光器。使视野较暗）。计数白细胞时，数四角四个大方格内的白细胞总数。计数红细胞时数中央大方格四角的四个中方格和中央的一个中方格（共5个中方格）内的红细胞总数，计数时应循一定的路径以免遗漏或重复。对于分布在划线上的血细胞，依照“数上不数下， 数左不数右”的原则进行计数（图1-5-3）。 计数白细胞时，如发现每个大方格白细胞数相差10个以上；计数红细胞时，如发现各个中格之间的红细胞数相差超过15个，表示血细胞分布不均匀。应将计数板洗净，重新摇匀稀释血液，再充液计数。 5．计算 红细胞数目：将5个中方格内数得的红细胞总数乘以10，000．即得每立方mm血液中红细胞总数。 图1-5-3 血细胞计数方式 （实心圈表示计数的红细胞， 空心圈表示不应计数的红细胞） 计算公式为：红细胞数/mm3 = 5个中格红细胞数×稀释 倍数/计数的5个中格容积 稀释倍数等于稀释液2ml除以加入血10μL（0.01ml），为200倍。 计数室5 个中格容积为0.2×0.2×0.1×5 = 0.02 mm3。 白细胞数目：将4个大方格内数得白细胞总数乘以50，即每立方mm血液的白细胞总数。 计算公式为：白细胞数/ mm3 = 4个大方格白细胞数×稀释倍数/ 计数的4 个大格容积 稀释倍数等于稀释液0.38ml+血20μL（0.02ml）/0.02ml，为20倍。 计数室4个大方格容积为1×1×0.1×4= 0.4 mm3。 [方法评估] 采用显微镜目视计数法为血液红、白细胞数量测定的最常用的基本方法，目前虽有各种自动化分析方法，但该方法由于经典、方便、实用，仍较广泛用于血液检验和科研实践中。 [应用意义] 红细胞是血液中数量最多的有形成分，在正常情况下几乎占血容量的1／2，故使血液呈红色粘稠混悬液。红细胞数量正常情况下保持相对稳定的。多数鱼100—300万个/mm 3，高者可达400万个/mm3 低者数十万/ mm3。 鱼类红细胞数也因性别不同而有差异，一般雄鱼的红细胞数比雌鱼多。此外鱼类红细胞数量常因鱼种、年龄、外界环境变化、机体不同生理状况（运动状况、患病、营养状况等）而出现一定的差异。环境变化如长期缺氧红细胞代偿性增多。 鱼类白细胞数量随种类、年龄、生理状况（产卵）、疾病以及一些外界环境因素影响而变化，此外，鱼类白细胞还与饲养条件、营养状况有关：饱食消化力旺盛时多，长期饥饿白细胞（特别是嗜酸性白细胞）显著减少。 [注意事项] 1、各种用具要事前清洗。清洗吸管时按照蒸馏水（两次）→ 95%酒精（两次）→ 乙醚（两次）的方法清洗。计数室用蒸馏水洗后，再用软纱布或擦镜纸吸干。 2、采血要求迅速、准确，不能凝血，也不能有气泡，否则弃去重采。 3、血吸管用完后必须立即清洗干净，以防血液凝固堵塞管口。 [思考题] 1、综合实验所得结果，与红、白细胞的正常值相对照，有何变异？为什么？ 2、为什么机体正常血细胞数可维持在相对稳定的数量水平？ 3、试讨论鱼类红细胞的正常值及其应用意义？ 4、白细胞数量的变化有何生理意义？ 5、血细胞计数室中央的大方各中每一种方格的容积是多少？ 附 血细胞稀释液 1、白细胞稀释液 冰醋酸（破坏红细胞） 1.5毫升 1%龙胆紫（染白细胞核便于计数） 1毫升 蒸馏水 加至100毫升 2、红细胞稀释液 NaCl (维持渗透压) 0.5克 Na2SO4 (使溶液比重增加，红细胞分布不易下沉) 2.5克 HgCl （固定红细胞形状） 0.25克 蒸馏水 加至100毫升 实验12 血红蛋白含量的测定（必修） 方法一、酸化血红蛋白稀释测定法（改良沙利氏法） [目的与原理] 掌握测定鱼类血红蛋白含量的原理和方法，应用改良沙利氏法测定不同鱼类血红蛋白含量。 本实验是应用比色法测定鱼的血红蛋白量。血红蛋白本身的色泽，常随所结合的氧量多少而改变，不便比色。但是加入稀盐酸于血液中可使血红蛋白变成不易变色的高铁血红蛋白，这就可以与标准色相比，从而测出其含量。通常以每100ml血液中含血红蛋白克数来表示，正常鱼血红蛋白含量为7—8g。 [实验对象] 鲤、鲫或草鱼。 [试剂与器材] 血红蛋白比色计，血吸管，注射器，凹瓷盘，小试管，试管架，蒸馏水，75%酒精，棉球，0.1mol/L盐酸，蒸馏水，滴管，纱布，抗凝剂（1%肝素钠溶液或10%草酸钾溶液）。 [实验步骤] 1、了解血红蛋白比色计的构成 血红蛋白计主要包括吸血管、比色计和比色管等部件。吸血管为一厚壁毛细玻璃管，其上有10μl、20μl的刻度，尾端连有橡皮头，供吸血用。比色计的两侧，装有标准浓度的高铁血红蛋白溶液，也有用比色玻璃柱（或片）来代替的。比色管可插在比色计中，与两侧的标准比色柱进行比色。比色管的两侧通常刻有两行刻度。一行为血红蛋白的绝对值，以g计数（每100毫升血液中所含血红蛋白的克数）来表示，刻度范围为2～22。另一行为血红蛋白相对值，以%（即相当于正常平均值的百分数）来表示，刻度范围为10%～160%。目前测定常用绝对值来表示。 2、用蒸馏水将比色管洗净，吸血管则依次用蒸馏水，95%酒精和乙醚洗净干燥备用。 3、用滴管加0.1mol/L盐酸4—6滴到刻度比色管内，约加到管下端刻度“2”或“10%”处为止。 4、采血：采血方法见实验49，用吸血管吸血至20μl刻度（要准确）。用绵球仔细将管尖端外面的血拭去。 5、将吸血管中血液轻轻地滴到比色管中盐酸底部，并用上层较清的盐酸溶液反复清洗吸血管3次。使吸血管内的血液完全洗净。切勿带入空气，以至形成气泡影响比色。吸血管尖端残留的液体，应在比色管内壁上沥净。取出吸血管后，轻轻摇动比色管使血液与盐酸充分混合，静置15分钟使管内的盐酸和血红蛋白作用完全，形成棕色的高铁血红蛋白。 6、把比色管插入标准比色架两色柱中央的空格中，使无刻度的两侧面位于空格的前后方，便于透光和比色。 7、用吸管将蒸馏水逐滴地加入比色管内，每加一滴都应充分混匀并观察比色管内的颜色，直到比色管内溶液的色度和血红蛋白计上标准色度相同时为准，读出管内液面所在的刻度数，（读数应以溶液凹面最低点相一致的刻度为佳）。即为每100ml血液中所含血红蛋白的克数（用g/100ml表示）。 8、实验完毕应将吸血管和比色管洗净，放回盒内。 [方法评估] 采用目视比色法测定血红蛋白含量是比较常用及简便的方法，但此法误差较大，而且同仪器的准确度有关。 [应用意义] 血红蛋白含量与年令、性别、性周期、营养状况、活动情况、季节变化等有关，营养不良或长期饥饿可引起血红蛋白量显著降低。 [注意事项] 1、用吸血管吸血过程应仔细、认真，准确把握住吸入的血液量是初学者的一个难点，也是实验结果准确与否的一个关键。 2、血红蛋白吸管很容易被损坏，应妥善爱护。管内有凝血块时不可用金属丝疏通，可浸泡入氨水或45%尿素溶液中，待血块去除后再用水洗净，并按蒸馏水→ 95%酒精→ 乙醚的顺序清洗，最后吹干吸管。 3、盐酸浓度不可过稀。血液与盐酸作用时间不可过短，必须在10分钟以上方可稀释比色，否则血红蛋白不能充分转变成高铁血红蛋白。最好在30分钟内比色完毕。 4、滴加蒸馏水时，宜少量多次，逐滴加入后混匀比色，以免稀释过度，得不到准确结果。 5、比色应在自然光线下进行，避免在阴暗处或有色灯光下比色，并将比色管刻度转向两侧，以免影响比色效果。 方法二、氰化高铁血红蛋白测定法 [目的与原理] 应用氰化高铁血红蛋白（HiCN）法，测定不同鱼类血红蛋白含量。 血红蛋白(Hb)被高铁氰化钾[K3Fe(CN)6]氧化为高铁血红蛋白（Hi），Hi与氰离子结合成氰化高铁血红蛋白（HiCN），它在540nm有一吸收峰，通过测定其光密度而得血红蛋白含量。 [实验对象] 鲤、鲫或草鱼。 [试剂与器材] 分光光度计，试管若干，移液管（5ml），吸血管（20u1），注射器，凹瓷盘，试管，试管架，蒸馏水，75%酒精，棉球，纱布，抗凝剂（1%肝素钠溶液或10%草酸钾溶液）。 氰化高铁血红蛋白稀释试剂：称取高铁氰化钾[K3Fe(CN)6]200mg、氰化钾（KCN）50mg、无水磷酸二氢钾140mg，Triton X-100 1.0ml，用蒸馏水溶解并稀释至1L。此试剂应呈透明、淡黄色，pH在7.0～7.4之间，以蒸馏水作空白，在540nm比色，读数也是0。此溶液应放置棕色试剂瓶中，塞紧后保存于冰箱中（但不宜冻结），至少可稳定数月。如发现试剂变绿、浑浊则不能使用。 [实验步骤] 1、在一试管中准确加入HiCN稀释试剂5.0ml，作为测定管。 2、用血红蛋白吸管准确吸取全血20u1，擦去管端血迹，置于试剂中，冲洗3次，混和。 3、将混合液放置3分钟以后，倒入光径1cm比色皿，用分光光度计在540nm进行比色。以蒸馏水或HiCN稀释试剂作空白管，校正光密度到0点，读取测定管光密度读数。 4、计算： 血红蛋白（g/L）= 测定管光密度×（64458/44000）×251 = 测定管光密度 × 367.7 式中： （1）64458 是目前国际公认的血红蛋白分子量。 （2）44000 是国际血液学标准化委员会公布的血红蛋白摩尔吸光度。 （3）251是稀释倍数。 [方法评估] HiCN法操作简便，试剂单一，除SHb外所有血红蛋白均可迅速转化为HiCN，显色快且稳定，可以根据吸光度直接计算结果，因此被列为国际血红蛋白测定的参考方法，也是我国推荐的首选方法，但其试剂中氰化钾为剧毒药品，须妥善保存、处理。另外，高球蛋白血症和白细胞明显增高的标本可导致反应液浑浊而影响结果。 [应用意义] 同改良沙利氏法。 [注意事项] 1、血红蛋白测定方法很多。但无论采用何种方法，都必须以HiCN法为标准，绘制标准曲线。 2、HiCN稀释液不能贮存在塑料瓶中，否则会使CNˉ丢失，测定结果偏低。HiCN稀释液应贮存在棕色有塞玻璃瓶中，4℃冰箱保存一般可用数月，但不能在0℃以下保存，因为结冰可引起高铁氰化钾还原，使溶液褪色失效。 3、氰化钾是剧毒品，配制稀释液时要按剧毒品管理程序操作。配制好的HiCN稀释液中因氰化钾含量低，又有高铁氰化钾存在，毒性不是很大。若进入体内，高铁氰化钾氧化血红蛋白，生成高铁血红蛋白。后者结合CNˉ，起到一定的解毒作用，但仍应妥善保管。测定后的废液不能与酸性溶液混合，因为氰化钾遇酸可产生剧毒的氰氢酸气体。为防止氰化钾污染环境，比色测定后的废液集中于广口瓶中。应注意废液处理，可用除毒液除毒。 除毒方法为：取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）二份加NaOH一份，在研钵中研细，配成100g／L的悬液。每1000ml废液加上述除毒液5ml，放置3小时，不时搅拌，使剧毒的氰化钾成为无毒的亚铁氰化钾。 [思考题] 1、实验所得结果，与血红蛋白正常值相对照，有何变异？为什么？ 2、血红蛋白含量相对稳定有何生理意义？ 3、试讨论血红蛋白含量与水生动物生理机能的关系。 实验13 血涂片制作和白细胞分类计数（必修） [目的与原理] 了解各种类型白细胞的形态特征，掌握血涂片制作方法和白细胞分类计数方法，进行不同鱼类白细胞分类计数和血细胞形态特征、变形率等的观察。 白细胞依据其形状、染色颗粒、细胞质和细胞核的形状大小可以进行分类。通常的分类方法是根据细胞浆中有无特殊的嗜色颗粒，将其分成颗粒细胞和无颗粒细胞。颗粒细胞又依据所含颗粒对染色剂反应特性，被区分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞；无颗粒细胞则分成单核细胞和淋巴细胞。中性粒细胞有较强的吞噬能力，能将侵入机体的微生物消灭掉，并可参与免疫复合物和坏死组织的清除工作。嗜酸性粒细胞的细胞内含有过氧化物酶和酸性磷酸酶，吞噬能力与中性粒细胞相当或稍弱，能吞噬抗原-抗体复合物，此外，嗜酸性粒细胞具有抗炎作用。嗜碱性粒细胞含有多种化学物质，如组织胺、肝素和5-羟色胺等，当抗原-抗体发生反应时，或机体在寒冷环境中时，都能引起嗜碱性粒细胞释放组织胺和肝素。血液中的单核细胞穿出血管壁进入组织，变成巨噬细胞，可对抗组织内的致病物，各种细菌和病毒。淋巴细胞有免疫功能，对异己构型的物质具有杀灭和消除作用。 各种白细胞必须经过染色，才易于区分其类别。常用者为瑞氏（Wright’s）染色法和姬姆萨(Giemsa)染色法。 [实验对象] 鱼（淡水鱼和海水鱼均可）。 [试剂与器材] 试剂： 染色液的配制： 1、姬姆萨（Giemsa）染液的配制 （1）原液配制 Giemsa 粉剂 0.8 g 甘油（医用） 50 ml 甲醇 50 ml 将Giemsa粉剂溶于甲醇中，在乳钵中充分研磨，溶解后再加甘油，混合均匀，置于37～40℃温箱内8～12h，过滤，装入棕色试剂瓶内，密封保存备用。 （2）稀释液 临用时取Giemsa原液5ml，加磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8）50 ml，即为Giemsa稀释液。 （3）pH6.4~6.8磷酸盐缓冲液 取磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g，加少量蒸馏水溶解，调整pH至6.4~6.8，加水至1000ml。 2、 瑞氏（Wright′s）染液的配制 （1）原液配制 瑞氏染料粉剂 0.1g 纯甲醇 60 ml (2) 配制步骤： ① 将瑞氏染料粉放人乳钵内，加少量甲醇研磨。 ② 将已溶解的染料倒入洁净的玻璃瓶内，剩下未溶解的染料再加入少量甲醇进行研磨，如此反复操作，直至全部染料溶解为止。 ③ 装入玻璃瓶内密封，在室温下保存一周即可使用。 ④ 新鲜配制的染料偏碱性，放置后呈酸性，染液储存时间越久，染色愈好。 器材： 显微镜，香柏油，载玻片，盖玻片，玻片水平支架，采血针或注射器，计数器，小滴管，蜡笔，消毒棉球，瑞氏染液，pH6.4~6.8磷酸盐缓冲液，姬姆萨染液，蒸馏水。 [实验步骤] 1、血涂片的制作：取一滴血（采血方法见实验49），滴于洁净无油脂的玻片一端。左手持玻片，右手再取边缘光滑的另一玻片作为推片。将推片边缘置于血滴前方，然后向后拉，当与血滴接触后，血即均匀附在二玻片之间。此后以二玻片约呈30—45度的角度平稳地向前推至玻片另一端（图1-5-4）。推时角度要一致，用力应均匀，即推出均匀的血膜（血膜不可过厚、过薄）。将制好的血涂片晾干，不可加热。 2、血涂片的染色步骤： （1）用蜡笔在血膜两端各划一道线，以免染料外溢，置涂片于水平的支架上。 （2）用小滴管将瑞氏染液滴于涂片上，并盖满划出的涂片部分固定约半分钟。 （3）用小滴管再加1.5倍缓冲液或姬姆萨（Glemsa）染液，轻轻摇动，并轻吹液体使染色液与缓冲液混合均匀，静置5—10分钟。 （4）用蒸馏水冲洗（如自来水的pH值稳定于7.2左右时亦可代用）。冲洗血膜时应将玻璃片持平，冲洗后斜置血涂片于空气中干燥。或先用滤纸吸取水分迅速干燥，即可镜检。 3、白细胞分类计数：先用低倍镜检查涂片及染色是否均匀。然后加一滴香柏油于血膜厚薄均匀处（一般在体尾交界处），在油镜下由此处开始按其形态特征进行分类计数，计数移动时避免重复。根据所见到的100个白细胞，记录各种白细胞所占的百分数。 例如：嗜中性白细胞分数（%）=计数嗜中性白细胞个数/计数总白细胞个数×100%。
图1-5-4 血涂片制备示意图 红细胞呈桔红色；中性粒细胞核为蓝紫色，颗粒呈蓝紫至紫红色；嗜酸性粒细胞颗粒呈鲜红至桔红色；嗜碱性粒细胞颗粒呈深蓝紫色；淋巴细胞核呈深蓝紫色，胞质呈天蓝色；单核细胞核呈浅紫色，胞质呈灰蓝色。 [方法评估] 显微镜法白细胞分类是经典、传统的血细胞分类法，目前还无任何仪器可以完全取代。它能够准确地根据细胞形态特征进行分类计数，并可及时发现异常细胞。血液分析仪进行细胞分类主要是从细胞的体积大小、细胞核形、细胞化学染色等方面进行检测，检测速度快，分析细胞多，适宜于大批量标本的分析。对其检测出来的异常标本，要准确识别细胞类别及确认病理改变还必须以显微镜检查为准。 [应用意义] 在不同的生理状态下，不同种类白细胞数目波动较大。如运动、寒冷、消化期、繁殖期等，此外，在机体失血、剧痛、急性炎症、慢性炎症等病理状态下，白细胞也增多。例如，急性感染、急性中毒、严重组织损伤、恶性肿瘤等中性粒细胞增多；某些病毒、细菌感染、某些慢性感染时，淋巴细胞数量增多。 [注意事项] 1、所用玻片必须干净，无油污。 2、如染色太浅，可按照原来步骤重染；染色太深或有沉淀物则可用甲醇脱色后重染。 3、如白细胞核为天蓝色则染色时间过短。如红细胞呈紫红色，表示染色时间过长。 4、染色时切勿使染液干涸，否则发生不易去掉的沉淀。 5、冲洗时不可先倾倒染色，应先轻轻摇动玻片，缓慢加水使沉渣泛起，然后再用水冲洗。 6、水冲洗时间不宜过长，否则会脱色。 [思考题] 1、试述瑞氏（Wright’s）染色法区分各种白细胞的依据？ 2、怎样才能制备一个形态清晰的血涂片？ 3、实验所得结果与正常值相对照，有何变异？为什么？ 实验14 红细胞沉降率的测定（选修） [目的与原理] 掌握测定红细胞沉降率的方法，并测定不同鱼类和患病鱼类的红细胞沉降率。 红细胞在循环血液中具有悬浮稳定性，但将加有抗凝剂的血液置于一垂直血沉管中，红细胞由于重力的关系，将逐渐向下沉降。通常以在第1小时末红细胞下降的距离作为沉降率的指标。红细胞的沉降率在某些疾病加快，这主要由于红细胞能较快地发生叠连，使其总外表面积与容积之比减小，因而与血浆的摩擦力减小，下沉加快。红细胞叠连的形成，主要取决于血浆性质的变化，这种测定有助于某些疾病诊断。目前测定红细胞沉降率常用的方法已有多种。本实验只介绍魏氏（Westergren）法。 [实验对象] 鲤、鲫或草鱼。 [试剂与器材] 魏氏沉降管，血沉架，吸管，5ml注射器，8号注射针头，3.8％枸橼酸钠溶液。 [实验步骤] 1、准备一个容量为5ml的小瓶盛3.8％枸橼酸钠溶液0.4ml, 然后用注射器从鱼尾静脉或直接从心脏取血2ml，准确地将1.6ml血液注入小瓶内。随后颠倒小瓶3～4次，使血液与抗凝剂充分混匀，但需避免剧烈振荡，以免破坏红细胞。 2、用魏氏沉降管吸取上层抗凝血液到刻度“0”处，不能有气泡混入。擦去尖端周围的血液，将血沉管垂直固定于血沉架上静置，并记录时间。 3、1小时末，观察沉降管内血浆层的高度，并记下mm数值，该值即为红细胞沉降率（mm／h末）。 4、小心取下沉降管，用水洗涤，并晾干。 [方法评估]： （Westergren）法为测定红细胞沉降率的标准方法。 [应用意义] 血沉可用来表示红细胞悬浮稳定性的大小。红细胞沉降率受生殖周期、营养情况、化学物质、季节变化、疾病等影响。当有炎症反应时，血沉加快。 [注意事项] 1、本实验血液与抗凝剂的容积比规定为4：1，应用新配制的抗凝剂。 2、自采血时起，本试验应在2h内完毕，否则会影响结果的准确性。 3、实验用的器材应清洁、干燥。 4、若红细胞上端成斜坡形或尖锋形时，应选择斜坡部分的中间位置计算。 5、血沉的快、慢与温度有关。在一定范围内温度愈高，血沉愈快。故实验时室温以18~25℃左右为宜。 [思考题] 1、红细胞沉降率为什么可以保持相对稳定？ 2、影响血沉的因素有哪些？为什么？ 3、实验动物红细胞沉降率的正常值是多少？检测血沉有何意义？ 实验15 红细胞比容的测定（选修） [目的与原理] 掌握测定红细胞比容的方法，并测定不同鱼类的红细胞比容。 实验用Wintrobe 管（简称温氏管或称分血计）测定。从血管中抽出血液，放入加有一定量抗凝剂的Wintrobe管中，经离心沉淀后，管中的血液分为两层：上层是淡黄色的透明液体—血浆，下层是挤压得很紧的呈暗红色的红细胞，红细胞与全血的容积之比称为红细胞比容，也称红细胞压积，通常用百分数表示。大部分鱼类的红细胞比容在20~30%之间。 [实验对象] 鲤、鲫或草鱼。 [试剂与器材] Wintrobe 管，台式离心机（4000rpm），抗凝剂（1%肝素钠溶液或草酸盐溶液），5ml注射器，消毒棉球，凹瓷盘，细长吸管 [实验步骤] 1、采血：用经肝素液湿润过的注射器采血。鱼在鳃静脉或心脏取血。 2、用细长吸管取经充分混合的抗凝血注入温氏管至“0”处，注意勿产生气泡。然后经3000——3500rpm离心沉淀20分钟，停机取出温氏管，读数并记录。再离心10分钟，取出样品管第二次读数。如两次读数一样，说明红细胞层体积不再缩小。如读数小了，还须第三次离心。直至红细胞层高度不再变化，最后一次读数即为红细胞层真实高度。红细胞层的上面常有一层白细胞和血小板组成的白色层，读数时不要将此层计算在内。 3、测定了红细胞层的高度和总液体的高度，然后按下面公式计算红细胞比容： 红细胞比容（%）= 红细胞的高度（mm）/ 总液体高度（mm）×100 [方法评估] 测定红细胞比容的常用方法，简便易于操作。 [应用意义] 该项指标可用作判断机体的健康状况和营养状况。 贫血时，红细胞数下降，红细胞比容下降；养状况不良出现贫血或由于其它疾病引起贫血时，红细胞比容下降。而且红细胞比容是影响全血粘度最重要的指标。 [注意事项] 1、取血时一定要避免溶血。 2、自采血时起，本试验应在2h内测定完毕。 [思考题] 1、红细胞比容的变化与何因素有关？ 2、测定红细胞比容有哪些实际意义？ 3、将血吸入温氏管时如何防止有气泡？ 实验16 红细胞渗透脆性的测定——浓度梯度法（必修） [目的与原理] 掌握测定红细胞渗透脆性的方法，测定不同鱼类红细胞渗透脆性并理解细胞外液渗透压对维持细胞正常形态与功能的重要性。 正常情况下，动物红细胞内的渗透压与血浆的渗透压相等，哺乳动物约相当于0.9％NaC1溶液的渗透压，鱼类的等渗溶液为0.85％～1.0％NaC1溶液。将红细胞置于等渗溶液中， 其形态和容积可保持不变。若将红细胞悬浮于低渗的NaC1溶液中，则水分进入红细胞使之膨胀甚至破裂溶解，但红细胞对低渗溶液具有一定的抵抗力，其抵抗力大小与红细胞膜脆性有关。通常用不同浓度的NaC1溶液来测定红细胞膜的渗透脆性，红细胞膜渗透脆性大的，则对低渗NaC1溶液的抵抗力小，NaC1溶液的渗透压稍有降低，此类红细胞便发生破裂而溶血。反之，脆性小的则对NaC1溶液的抵抗力大，Nac1溶液的渗透压降到很低时才使这些红细胞破裂溶血。刚能引起一部分红细胞溶解的低渗NaCl的浓度可以代表最小抵抗值；使全部红细胞溶解的NaCl浓度为最大抵抗值。通常就以抵抗值表示红细胞的渗透脆性。在刚成熟的红细胞，其膜的渗透脆性较小，而衰老的红细胞膜的渗透脆性较大。 [实验对象] 鲤、鲫或草鱼。 [试剂与器材] 5毫升无菌注射器，消毒棉球，中试管，小试管，试管架，滴管，1%NaCl， 蒸馏水，75%酒精，碘酒，凹瓷盘，1%肝素钠或10%草酸钾溶液，3.8% 枸橼酸钠。 [实验步骤] 取小试管10支，编号后，按下表制成不同浓度的NaCl 溶液。 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10  1%NaCl (ml) 0.90 0.65 0.60 0.55 0.5 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25  蒸馏水（ml） 0.1 0.35 0.40 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.70 0.75  NaCl溶液浓度（%） 0.9 0.65 0.60 0.55 0.5 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25  用润湿过抗凝剂的注射器从鱼尾静脉采1毫升血，立即向每一试管中各加一滴血，将试管夹在两掌心中迅速搓动，使血液与管内NaCl溶液混匀（切勿用力震荡），室温下放置2小时后观察结果。多余血液注入盛有0.1毫升3.8% 枸橼酸钠的试管内。加以混合，以备重复实验使用。 3、观察结果：记录开始溶血和完全溶血的两管NaCl溶液浓度。 按下列标准判断有无溶血、不完全溶血或完全溶血。 （1）上清液无色，管底为混浊红色或有沉淀的红细胞，表示没有溶血。 （2）上清液呈淡红色，管底为混浊红色表示只有部分红细胞破裂溶解，为不完全溶血。开始出现部分溶血的NaCl溶液浓度，即为红细胞的最小抵抗值，也是红细胞的最大脆性。 （3）管内液体完全变成透明的红色，管底无细胞沉积，为完全溶血。引起红细胞完全溶解的最低NaCl溶液浓度，即为红细胞的最大抵抗值，即红细胞的最小脆性。 [方法评估] 该方法筒单实用，但应严格控制血量（血液和NaCl溶液之比约为1:25）和防止血标本在体外溶血，否则易影响试验的准确度。本试验敏感性较差，需结合其他实验室检查结果进行分析。 [应用意义] 渗透脆性指标对于掌握细胞膜的特性、形态和生理功能具有一定意义，如膜的特性、流动性、结构、组成成分等的改变，均使膜的脆性发生改变。 [注意事项] 1、配制1.0%NaCl溶液，称量必须准确。 2、取血时一定要避免溶血。 3、滴加血液时要靠近液面，使血滴轻轻滴入溶液以免血滴冲击力太大，使红细胞破损而造成溶血的假象。． 4、加入血滴后，轻轻摇匀溶液，切勿剧烈振荡。 5、应在光线明亮处观察结果。如对完全溶血管有疑问，可用离心机离心后，取试管底部液体一滴，在显微镜下观察是否有红细胞存在。 [思考题] 1、为什么同一个体的红细胞渗透脆性可以不一样？ 影响红细胞渗透脆性的因素有哪些？ 2、何谓红细胞的最小抵抗值和最大抵抗值？ 3、输液时为何要采用等渗溶液？ 实验17 蛋白质含量的测定Ⅰ—双缩脲法（必修） [目的与原理] 掌握测定蛋白质含量的原理及技术，并应用双缩脲法测定血清或组织提取液中蛋白质的含量，加深对双缩脲试剂与蛋白质反应机理的了解。 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物：
在碱性溶液中双缩脲与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应称双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都有双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键,在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色化合物，在540nm处有最大吸收。干扰物有巯基乙醇(硫醇)以及具有肽性质的缓冲液如Tris缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物,即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质,弃去上清液,再用已知体积的0.05—0.10mol/L氢氧化钠溶解蛋白质。 [试剂与器材] 试剂： 1、酪蛋白标准溶液(10mg/ml) 准确称取一定量已定氮牛血清白蛋白或酪蛋白(干酪素)，{其中酪蛋白(干酪素)用0.05mol/L氢氧化钠溶液溶解}配成浓度为10mg/ml的标准溶液，冰箱存放备用。 2、双缩脲试剂 溶解1.50g硫酸铜(CuSO4.5H2O)和6.0g酒石酸钾钠(NaKC4H4O6.4H2O)于500ml蒸馏水中，在搅拌下加入300ml 10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml，贮存在内壁涂以石蜡的瓶中，此试剂可长期保存。 3、蛋白质样品液 将待测样品用0.05mol/L氢氧化钠配制成适当浓度的溶液(使测定值在标准曲线范围内)，学生实验中可用酪蛋白配制或用血清样品稀释10倍，冰箱存放待用。 器材： 移液管（1 ml、2 ml、5ml各1支），移液管架，试管（14支），试管架（1个），分光光度计。 [实验步骤] 1、标准曲线的制作 取12支试管编号为0~5（0′~5′）号，按下表操作，以A540为纵坐标，蛋白含量为横坐标绘制标准曲线。 2、样品液的测定 取2支试管编号为6（6′）号，按表1-2-1操作，从标准曲线上查出蛋白质含量，即为样品液的蛋白质含量（mg/ml）。 表1-2-1 标准曲线及未知样品液的测定 管号 0（0′） 1（1′） 2（2′） 3（3′） 4（4′） 5（5′） 6（6′）  酪蛋白标准液（ml） 未知样品液（ml） 蒸馏水（ml） 双缩脲试剂（ml） 0 –– 1.0 4.0 0.2 –– 0.8 4.0 0.4 –– 0.6 4.0 0.6 –– 0.4 4.0 0.8 –– 0.2 4.0 1.0 –– 0.0 4.0 –– 1.0 –– 4.0  摇匀，室温（15~25°C）下放置30min  A540         ā540          [方法评估] 蛋白质含量可根据其物理化学性质来测定,最常用的方法有：凯氏定氮法和分光光度法。用于测定蛋白质含量的分光光度法有双缩脲法、Folin-酚法和紫外吸收法等. 双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质含量的方法,至今仍被采用，在需要快速，但不很精确的测定中，最常用此法。硫酸铵不干扰显色，因此在蛋白质提纯的早期阶段（常用硫酸铵分级）可用此法来测定蛋白质含量。 [应用意义] 动物血清或生物组织提取液的蛋白质含量测定。 [注意事项] 1、本实验须于显色后30min内比色测定。30min后，可有雾状沉淀发生。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。 2、有大量脂肪性物质同时存在时，会产生混浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取清液再测定。 [思考题] 1、干扰本实验的因素有哪些？ 2、双缩脲试剂中为何没有Cu（OH）2沉淀？ 实验18 血清r球蛋白的分析测定－盐析法（选修） [目的与原理] 应用盐析法测定血清r球蛋白含量。 在血清中加入适量的硫酸铵及氯化钠溶液，使混合后此两种盐类的浓度分别为18.5％及2.9%，溶液的pH调节至r球蛋白的等电点（pH6.4），此时r球蛋白沉淀析出而其它蛋白质则留于溶液中。离心除去上清液，将沉淀溶于氯化钠溶液中，用双缩脲法测定蛋白质的量，此为血清r球蛋白含量 [试剂与器材] 试剂： 1、硫酸铵—氯化钠溶液：称取硫酸铵（A.R.或C.P.）195g及氯化钠（A.R.或C.P.）29.3g，溶于蒸馏水约700ml中。试测pH并用氨水或硫酸溶液调节pH至6.4（如准确测定pH有困难，这一步骤可省去）。将溶液全部转移入1L容量瓶中，用蒸馏水稀释至1L刻度。 2、0.9％氯化钠溶液：称取氯化钠9.0g, 用蒸馏水溶解并稀释至1L。 3、双缩脲试剂：见《血清（浆）总蛋白测定》。 4、标准血清：见《血清（浆）总蛋白测定》。 器材： 可见分光光度计，离心机， 试管若干及试管架，旋涡混合器，500ml塑料试剂瓶，1L容量瓶，烧杯 2个，吸管若干支，滤纸，擦镜纸。 [实验步骤] 1、吸取硫酸铵—氯化钠溶液5.7ml，置于15ml尖底离心管中，加入血清标本0.30ml加塞，轻轻混和数次，然后将离心管放入冰水浴中15分钟。离心（3000转/分）10分钟。吸去上清液，再离心5分钟。用滤纸条将残留的液体尽量吸干，因为较多的硫酸铵可影响双缩脲显色，加入0.9％氯化钠溶液2.0ml，轻轻摇动使沉淀溶解，必要时可用细玻璃棒搅拌。此管即为“测定管”。另取同样的离心管2只，分别加入0.9％氯化钠溶液2.0ml，作为“空白管”及“标准管” 2、3管中各加入双缩脲试剂8.0ml，混和，在室温放置30分钟，用540nm或绿色滤光片进行比色，以空白管校正光密度到0点，读取各管光密度读数。 3、计算 将所得光密度按下列公式计算r球蛋白量 血清r球蛋白（g/100ml）=测定管光密度/标准管光密度 × 0.1/0.3×标准血清蛋白含量。 [方法评估] 本方法用盐析法直接测定血清r球蛋白量，方法简便，稳定。与电泳法结果相似。但目前应用较为普遍的是电泳方法，其分离谱带成分多，样品用量少。 [应用意义] 血清蛋白可看作是抗体蛋白，其含量变化与机体免疫状态有关。 [注意事项] 1、本测定时先应熟悉双缩脲法的特点。如r球蛋白含量较高，测定管光密度超过标准曲线的直线范围，可用双缩脲试剂稀释液（双缩脲试剂8份加0.9％氯化钠溶液2份）进行稀释后再作测定，并将测得的结果乘以稀释倍数。 2、本法不适用于测定血浆的r球蛋白，因血浆中的纤维蛋白原将与r球蛋白一并沉淀。 [思考题] 1、测定血清r球蛋白的方法和原理？ 2、分析你所测得的数值与正常值相比有何差异？为什么？3、与机体免疫状态有关的血液指标有哪些？ 实验19 血清白蛋白和球蛋白的分析测定－盐析法（选修） [目的与原理] 掌握血清白蛋白和球蛋白测定的原理和方法，并用盐析法测定水产动物血清中白蛋白和球蛋白的含量。 血清中含有多种不同成分的蛋白质，主要为白蛋白和球蛋白。用盐析法沉淀血清中球蛋白，用双缩脲法测定上清液中白蛋白，同时测定血清总蛋白。血清球蛋白的量从两者的差值求得。 [试剂与器材] 试剂： 1、球蛋白沉淀剂：称取硫酸钠（Na2SO4）208g，及亚硫酸钠（Na2SO3）70g，加入蒸馏水约900ml，并加入浓硫酸2ml，使蒸馏水酸化。不停搅拌，待完全溶解后将溶液移入1L容量瓶内，用蒸馏水稀释至1L刻度。保存于25℃以上的温度中。 2、双缩脲试剂：见《血清（浆）总蛋白测定》。 3、标准血清：市售或配制。配制方法见《血清（浆）总蛋白测定》。 4、乙醚 器材： 可见分光光度计，离心机， 试管若干及试管架，旋涡混合器，塑料试剂瓶，1L容量瓶，烧杯 2个，吸管若干支，滤纸，擦镜纸。 [实验步骤] 1、准确吸取血清样本0.2ml，置于10×100mm试管内。以5ml刻度吸管加入球蛋白沉淀剂3.8ml，塞住管口，反复倒转混和10次（不宜过多）。以1ml刻度吸管吸取悬液1ml（相当于血清0.05ml），置于另一试管内，作为“总蛋白测定管”。剩余的混悬液另加乙醚约2ml，揿住管口，在约20秒钟内颠倒混和40次，然后经每分钟2500转的速度离心沉淀5分钟。此时试管内分成三层：上层为乙醚，中层为球蛋白，下层为澄清的白蛋白溶液。将试管斜置在桌面片刻或轻击试管，待蛋白块自管壁分离后，将1ml吸管插入白蛋白溶液中并吸取此溶液1ml（小心，准确，且不可触及球蛋白块片）。取出吸管，用滤纸拭去管尖可能附着的球蛋白沉淀，将白蛋白溶液加入另一试管内，作为“白蛋白测定管”。在另一试管内加入标准血清0.2ml及球蛋白沉淀剂3.8ml，混和后准确吸取混悬液1ml，加入一试管中作为“标准管”。再取一试管加球蛋白沉淀1ml，作为“空白管”‘ 2、每管中各加入双缩脲试剂4毫升，充分混和后置室温暗处30分钟，用540nm或绿色滤光片进行比色，以空白管校正光密度到0点，读取各管光密度读数。 3、计算 将所测得的光密度读数按下列公式计算出白、球蛋白含量及其比值： （1）总蛋白测定管光密度 / 标准管光密度×标准血清蛋白浓度（g/100ml）＝血清总蛋白g/100ml （2）白蛋白测定管光密度 /标准管光密度×标准血清蛋白浓度（g/100ml）＝血清白蛋白g/100ml （3）血清总蛋白—血清白蛋白＝血清球蛋白g/100ml （4）血清白蛋白÷血清球蛋白＝血清白蛋白、球蛋白比值（A/G） 4、标准曲线绘制：同血清（浆）总蛋白测定双缩脲法见《血清（浆）总蛋白测定》。 但用球蛋白沉淀剂代替生理盐水作为标准血清的稀释剂。 [方法评估] 本方法采用盐析法定量测定白蛋白和球蛋白的，用硫酸钠和亚硫酸钠分离血清白、球蛋白，所得结果与电泳法相符合。但由于盐类浓度较高，操作需在较高的温度下进行，否则将有结晶析出。在25°C操作时，无结晶析出。用亚硫酸钠作为沉淀剂除可在较低的温度操作外，还有另一个优点，即它具有缓冲作用。亚硫酸钠溶液呈碱性，其pH值高于所有血清蛋白的等电点，使各蛋白质均带有相同的电荷，这将有利于它们的分离。血清经盐析分离后,蛋白质的测定一般均用比色法. [应用意义] 白蛋白和球蛋白的量是按鱼种不同而有所变化，一些鱼白蛋白＞球蛋白，另一些鱼白蛋白＜球蛋白，白蛋白与球蛋白的成分按性别、年龄、成长、季节的变化，营养不良、饥饿、应激刺激等所发生变化。 [注意事项] 1、某些用乙醚及离心沉淀不易得到白蛋白澄清液的标本，在加入球蛋白沉淀剂后，可不加乙醚，而用优质小张中速滤纸在370C水浴箱中反复过滤多次，最后可获得澄清液作白蛋白测定，必要时可按1﹕20比例扩大血清及球蛋白沉淀剂用量。 2、本法测定结果与电泳法相符合，但操作须在250C以上的室温中进行。如受实验室条件限制，只能在较低的温度下进行测定时，可改用盐浓度较低的球蛋白沉淀剂（其它试剂及操作方法均与本法相同），但测定结果白蛋白值较本法略高。常用的低浓度球蛋白沉淀剂为23％硫酸钠溶液（无水硫酸钠230g，加蒸馏水至1L）或21％亚硫酸钠溶液（无水亚硫酸钠210g,加蒸馏水到1L）。 [思考题] 1、盐析法测定白蛋白和球蛋白的原理？ 2、综合实验所得结果，与白蛋白和球蛋白的正常值相对照，有何变异？为什么？ 3、试讨论鱼类的白蛋白和球蛋白正常值及其应用意义？ 实验20 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白（选修） [目的与原理] 掌握醋酸纤维素薄膜电泳原理及操作技术，利用该电泳技术分析和测定人或鱼血清中各种蛋白质相对百分含量。 醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate membrance electrophoresis）以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。 本实验以醋酸纤维素为支持物，分离各种血清蛋白，血清中含有清蛋白，α—球蛋白、β—球蛋白、γ—球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同（表1-2-8），在电场中迁移速度不同，分子量小、等电点低、在相同碱性pH缓冲系统中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。 表1-2-8 人血清中蛋白质的等电点及分子量 蛋白质名称 等电点（pI） 分子量 血清蛋白 4.88 6900 α—球蛋白 5.06 α1—200 000 α2—300 000 β—球蛋白 5.12 90 000—150 000 γ—球蛋白 6.85—7.50 156 000—300 000 例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白（如图1-2-7）。这些区带经洗脱后可用分光光度计法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。临床医学常利用它们间相对百分比的改变或异常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。此法由于操作简单、快速、分辨率高及重复性好等优点。目前，以成为临床生化检验的常规操作之一。它不仅可用于分离血清蛋白，还可以分离脂蛋白，血红蛋白及同工酶的分离测定。
图1-2-7正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1．为清蛋白，2，３，４，５，分别为α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白，６为点样原点 [试剂与器材] 试剂： 1、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06） 称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，备用。 2、血清蛋白染色 （1）染色液（0.5％氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml混匀溶解后置具塞试剂瓶中贮存。 （2）漂洗液：取95％乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸馏水50 ml混匀置具塞试剂瓶贮存。 （3）透明液：临用前配制。 甲液：取冰乙酸（AR）15ml，无水乙醇（AR）85ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 乙液：取冰乙酸（AR）25ml，无水乙醇（AR）75ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 （4）保存液：液体石蜡。 （5）定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）：称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。 材料： 未溶血的人或动物血清 器材： 醋酸纤维薄膜（2×8厘米）；常压电泳仪；点样器（市售或自制）；培养皿（染色及漂洗）（直径9cm—10cm）；普通滤纸；玻璃板；钝头镊子；白瓷反应板；试管（15～20ml）；水浴；分光光度计；离心机；比色杯（光径1cm） [实验步骤] 1、电泳槽与薄膜的制备 （1）醋酸纤维素薄膜的湿润与选择 用钝头镊子取一片薄膜，在薄膜无光泽面上，距边2cm处用铅笔各划一条直线此线为点样标志区。 小心地平放在盛有缓冲液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在15s—30s内迅速湿润，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜湿润缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点，则表示薄膜厚薄不均匀应舍去，以免影响电泳结果，将选好的薄膜用竹夹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后方可用于电泳。 （2）电泳槽的准备 根据电泳槽的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部浸润后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素膜的桥梁，因而称为滤纸桥。 2、点样 用钝头镊子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液，无光泽面向上平放在点样板上，点样时用点样器沾少许血清，再将点样器轻轻印在点样区内，样品线长度一般为1.5cm，宽度一般不超过3mm如图1-2-8所示，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线，此步是实验的关键，点样前应在滤纸上反复练习，掌握点样技术后在正式点样。
图1-2-8醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图，虚线处为点样位置。 3、电泳 用钝头镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。如图1-2-9所示，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂，如一电泳槽同时安放几张薄膜，则薄膜之间应隔几毫米，盖上电泳槽盖使薄膜平衡10min。 用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，调旋钮调到每厘米电流强度为0.3mA（8块薄膜则为4.8mA）。通电10min—15min后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA（8片共8mA），电泳时间约50min—60min。电泳后调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源或自然风干。
图1-2-9 醋酸纤维素薄膜装置示意图 4、染色与漂洗 用钝头镊子取出电泳后的薄膜，无光泽面向上，放在含有0.5％氨基黑10B染色液的培养皿中，浸染5min。取出后用自来水冲去多余染料，然后放到盛有漂洗液的培养皿中，每隔10min换漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。取出后放在滤纸上，用电吹风的冷风将薄膜吹干。 5、透明 将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min，立即放入透明乙液中浸泡1min，取出后立即紧贴于干净玻璃板上，两者间不能有气泡。约2min—3min薄膜完全透明。若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次垂直放置待其自然干燥，或用吹风机冷风吹干且无酸味。再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗，当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角，用手轻轻将透明的薄膜取下，用滤纸吸干所有的水分，最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min，再用滤纸吸干液体石蜡，压平。此薄膜透明，区带着色清晰，可用于光吸收计扫描。长期保存不褪色。 6、定量 （1）浸泡 将膜片上的各蛋白质分离区带分段剪下，分别置于相应的标有编号的试管内，然后各加入0.4mol/L的氢氧化钠溶液进行浸泡。浸泡淡色带所加入的0.4mol/L氢氧化钠溶液的量为4ml，深色带为8ml（此时的稀释倍数是淡色带的2倍）。室温下的浸泡时间为30min～60min。若在37℃水浴中浸泡，则为10min～15min。浸泡期间振荡数次，使蛋白质区带浸出。另外再剪取与色带膜条大小相同的无色带膜条作为空白，以相同的方式浸泡在0.4mol/L氢氧化钠溶液中。 （2）比色 浸泡完毕，将浸出的有色溶液在分光光度计上进行比色测定。测定波长为620nm，光径为1cm。若浸出液有混浊或沉淀，则以4000r/min的转速离心10min～20min除去，然后再取上清液进行比色测定。 （3）计算 比色测定结束后，各组分的含量按下式计算： 某蛋白质组分百分含量＝某蛋白质组分的光吸收值/样品中各蛋白质组分的光吸收值总和×100％ 上式中深色带蛋白质组分的光吸收值应乘以稀释倍数2，例如血清白蛋白组分的分离区带为深色带，浸泡时所加入的0.4mol/L氢氧化钠的量是其它淡色带的2倍，所以应乘以2。 [方法评估] 1、醋酸纤维素薄膜与滤纸相比较，有以下优点 （1）醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。 （2）快速省时。由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45—60min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。 （3）灵敏度高，样品用量少。 血清蛋白仅需2μl血清，甚至加样体积少至0.1μl，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。 （4）应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。 （5）醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。 2、醋酸纤维素薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，操作简单，但分离效果不太好。如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只能分离出5—6条区带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数10条区带。 [应用意义] 由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、廉价。目前已广泛用于检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病，肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而成为医学和临床检验的常规技术。 [注意事项] 1、醋酸纤维素薄膜的预处理 市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度，如漂浮15s—30s时，膜片吸水不均匀，则有白斑点或条纹，这提示膜片厚薄不匀，应舍去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小，浸泡30min以上是保证膜片上有一定量的缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走。点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹感染，取膜时，应戴指套或用镊子。 2、缓冲液的选择 醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥溶液，其浓度为0.05mol/L—0.09mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关。选择时，先初步定下某一浓度，如电泳槽两极之间的膜长度为8 cm—10cm，则需电压25V/cm膜长，电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm膜宽。当电泳达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中不易分辨。 3、加样量 加样品的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量则越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。如电泳后用洗脱法定量时，每厘米加样线上需加样品0.1μl—0.5μl约相当于5μg—1000μg蛋白。血清蛋白常规电泳分离时，每厘米加样线加样量不超过1μl，相当于60μg—80μg的蛋白质。但糖蛋白和脂蛋白电泳时，加样量则应多些。对每种样品加样量均应先作预实验加以选择。 点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。 4、电量的选择 电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm宽膜为宜。电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。 5、染色液的选择 对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择。其原则是染料对被分离样品有较强的着色力，背景易脱色；应尽量采用水溶性染料，不宜选择醇溶性染料，以免引起醋酸纤维素膜溶解。 应控制染色时间。时间长，薄膜底色深不易脱去；时间短，着色浅不宜区分，或造成条带染色不均，必要时可进行复染。 6、透明及保存 透明液应临用前配制，以免冰乙酸及乙醇挥发影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明前，薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好，如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。 透明后的薄膜完全干燥后才浸入石蜡中，使薄膜软化。如有水，则液体石蜡不易浸入，薄膜不易平展。 [思考题] 1、根据人血清蛋白各组分等电点，分子量，推断它们在pH8.6巴比妥—巴比妥钠电极缓冲液中移动的相对位置。 2、染色时无光泽面为何向上？ 实验21 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白（选修） [目的与原理] 掌握一种聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的方法，并用此法进一步分析血清蛋白的组成。 1、聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）、NN′—甲叉双丙烯酰胺（Bis），在催化剂过硫酸铵（ammonium persulfate (NH4)2S2O8 简称AP）或核黄素（ribofavin 即vitamin B2 ,C17H20O6N4）和加速剂N,N, N′,N′—四甲基乙二胺（N,N,, N′N′—ytetramethyl ethyenediamine，简称TEMEM）的作用下，聚合而成的三维网状结构。 a.目前常用的催化体系： Ap—TEMED： ① TEMED催化Ap生成硫酸自由基： S2O82— →2SO4°— （过硫酸） （硫酸自由基） ②硫酸自由基的氧原子激活Acr单体，并形成单体长链：
③Bis将单体长链间连成网状结构：
从反应式中可看出此凝胶是三维网状的，带不活泼的酰胺基侧链的聚合物，没有或很少带有离子侧链，因而凝胶性能稳定，无电渗作用。在碱性条件下，凝胶易聚合，其聚合的速度与Ap浓度平方根成正比。杂质、某些金属离子，低温和氧分子能延长或阻止碳链的延长与聚合作用。用此法聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶。 核黄素—TEMED： 这是光聚合作用。TEMED可加速凝胶的聚合，但不加也可聚合，光聚合作用通常需要痕量氧原子存在才能发生，核黄素在TEMED及光照条件下，还原成无色核黄素，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用。但过量氧会阻止链长的增加，因此应避免过量氧的存在。 b.凝胶的性质 (1) 机械性能与孔径 T＝（a+b）/m×100% T:凝胶总浓度，a：Acr克数，b：Bis克数，m，缓冲液体积（ml） C=b/(a+b)×100% C：交联度 a/b(w/w)与凝胶的机械性密切相关。当a/b<10时凝胶脆而易碎，坚硬呈乳白色；a/b>100时，即使5％的凝胶也呈糊状，易断裂。预制备完全透明而又有弹性的凝胶应控制a/b＝30左右。不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，B.J.Davis的实验发现Acr<2％，Bis<0.5%,凝胶就不能聚合，当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度，通常T为2%—5％时，a/b＝20左右；T为5%—10％时，a/b＝40左右。T为15%—20％时，a/b＝125—200左右。在研究核酸大分子时，常用T=2.4%大孔凝胶，此时凝胶太软不易操作，最好加入0.5％琼脂糖，有的在3％凝胶中加入20％蔗糖，也可增加其机械强度而不影响其孔径的大小。一般来说，T浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大；T浓度小，孔径大，移动颗粒穿过网孔阻力小。 （2）分子量范围与凝胶浓度关系如下表1-2-9 2、电泳原理 （1）浓缩效应 ①凝胶孔径不连续；样品胶T＝2.5％为大孔胶，分离胶T＝7.5％为小孔胶。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中遇到的阻力小，移动速度快，当进入小孔胶时，蛋白质颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢，所以在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性，使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。 表1-2-9 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度（﹪）  蛋白质 <104 1-4×104 1-5×104-1×105 1×105 >5×105  20-30 15-20 10-15 5-10 2-5  核酸（RNA） <104 104-105 105-2×106  15-20 5-10 2-2.6   ②缓冲体系离子成分及pH值的不连续性（电位梯度不连续性）样品胶和浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl,缓冲液，电极缓冲液为pH8.3的Tris-Gly。HCl在任何pH溶液中均易解离出Cl—,而Gly的pI为5.97，所以Gly在样品胶和浓缩胶中解离度很小，仅有1%－0.1%。而有效迁移率＝mα（m为迁移率，α为解离度），所以Cl—的有效迁移率最快成为快离子，而Gly的有效迁移率最慢成为慢离子，在样品胶和浓缩胶中所选用的pH值必须使有效迁移率满足下述条件： 快离子>样品离子>慢离子。因此在快离子后边形成一个离子浓度低的区域，即：低电导区，又因为E＝I/η（E：电位梯度，η：电导率，I：电流）。低电导率将产生一个高电位梯度，因而在高电压梯度区和低电压梯度区之间，形成一个迅速移动的界面（如图1-2-11）。由于样品的有效迁移率恰好介于快慢离子之间，所以就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的样品薄膜。 （2） 分子筛效应：进入分离胶后，分离胶为pH为8.9的Tris—HCl 缓冲液Gly解离度增大，因而它的有效迁移率也增加，此时Gly很快就赶上并超过样品分子，这样高电压梯度就不存在了，使样品进入一个均一的电位梯度和pH条件的分离胶中。分离胶的孔径较小，分子量或形状不同的样品通过分离胶，所受的摩擦力不同，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率。 (3)电荷效应：进入分离胶后，样品除了具有分子筛效应外还根据带电荷不同，迁移率不同进行分离。 图1-2-11不连续电泳浓缩效应示意图 [试剂与器材] 试剂： 1、按下表配制贮液和工作液 贮液 100 ml 溶液中的含量 pH 工作溶液混合比  1 1mol/L HCI 48.0 ml Tris 36.6g TEMED 0.23 ml 8.9  小孔径胶〈分离胶 ) 1 号贮液 :2 号贮液: 蒸 馏水:3 号贮液=1:2:1:4 pH8.9 凝胶浓度为 7%            2 Acr 28.0g Bis 0.753g         3 Ap 0.14g    4 1mol/L HCI 48.0 ml Tris 5.98g TEMED 0.46ml 6.7  大孔径胶〈浓缩胶 〉 4号贮液 :5号贮液:6号贮液：7号贮液=1:2:1:4 pH6.7凝胶浓度为 2.5%            5 Acr 10.0g Bis 2.5g         6 核黄素 4.0mg    7 蔗糖 40.0g     电极缓冲液 Tris 6.0g Gly 28.8g 加水至1000ml 8.3 用时稀释 10 倍  2、0.1％溴酚蓝指示剂 3、染色液 用7％醋酸液配制成1％氨基黑10B染色液。 4、脱色液 7％醋酸溶液 材料： 人、鱼等动物血清。 器材： 常压电泳仪；圆盘电泳槽；玻璃管（内径约0.5 cm—0.7cm，长度约8 cm—10cm）；有机玻璃架（或自制木头架）；微量进样（100μL）器；5ml注射器；长、短注射针头；长、短颈滴管；日光灯或100w白炽灯；乳胶管；玻璃球（或小段玻璃棒）；培养皿；烧杯；洗耳球。 [实验步骤] 一般先制分离胶，再在分离胶上面制作浓缩胶。将贮液提前由冰箱中取出，达到室温后，按上表的比例配制工作溶液。 1、分离胶的制备 先在一只烧杯按比例加入分离胶原液1号、2号贮液和蒸馏水，在另一只烧杯中加入3号贮液，将上述两烧杯均置于真空干燥器中，抽气约20分钟。取出后，立即将两烧杯溶液小心混匀（沿壁倒入溶液并在桌面上小心转动烧杯或用玻璃棒缓慢搅动使其混匀），注意避免溶液中产生气泡。用带长针头的注射器或长颈滴管吸取分离胶混合液，沿着管壁加到预先准备好的玻璃管中（玻璃管的一端用带有玻璃球的小段乳胶管塞紧，并加入2滴40％蔗糖液后插在有机玻璃架上）。灌入的分离胶混合液高约6.5cm，然后立即用注射器或滴管在距胶面约0.1cm处沿管壁缓缓加入蒸馏水层（切忌搅动胶面），水层约高0.5cm以隔绝空气，在室温下（冬天室温过低，可置25℃温箱中）静置使其聚合。刚加好水层时能看出界面，后逐渐消失。待再次看到界面时，表明凝胶已经聚合，一般约需10min—20min。再静置30min使其聚合完全。 2、浓缩胶的制备 用注射器或滴管吸去分离胶面上的水层，并用滤纸条吸去残留的水液（滤纸条不能接触胶面），在分离胶面上制作浓缩胶层。 接上表比例在一只烧杯中加入4、5、6和在另一只烧杯中加入7号贮液，将上述两烧杯均置于真空干燥器中，抽气约20min。取出后，立即将两烧杯溶液小心混匀（沿壁倒入溶液并在桌面上小心转动烧杯或用玻璃棒缓慢搅动使其混匀），注意避免溶液中产生气泡，立即在分离胶面上加入浓缩胶混合液约1cm高，并立即用水封，置日光电灯下进行光聚合反应。当看到浓缩胶呈现乳白色时，表明已经聚合，一般约需5min—10min。继续光照30min使其聚合完全。然后除去水层，用滤纸条吸干后，再加电极缓冲液至管顶备用。 3、装槽 凝胶管制备好后，先将下边的乳胶管除去。注意先拉开乳胶管使空气进入后，再拔下来以防止将凝胶拉环拉坏。再将每一根凝胶管固定在圆盘电泳槽上的橡皮塞孔上，应保持垂直，橡皮塞孔要密封不漏。使每个凝胶管的下端悬上一滴缓冲液，再把上槽放到已盛有电极缓冲液的下槽上（应避免管下有气泡，如出现气泡，可轻轻振荡，或用弯头滴管排出）。最后在上槽中加入电极缓冲液，上槽电极缓冲液应没过凝胶管。 4、加样 3μl血清加入0.15ml（4号贮液：蒸馏水：20％蔗糖溶液＝1︰3：4）混合液后并加入5μl 0.1％溴酚蓝指示剂混合，即为样品液。用微量进样器吸取0.15 ml样品液，小心地加到玻璃管中浓缩胶与电极缓冲液的界面处。因样品液比重大，会平铺到凝胶表面上。 5、电泳 各管加样毕，将电泳槽与电泳仪连接好。上槽接负极，下槽接正极。打开电源开关，调节电流。开始电泳时1 mA/管—2mA/管。当样品液进入浓缩胶与电极缓冲液的界面处时，升高电流到3 mA /管—5 mA /管。待溴酚蓝指示剂移动到凝胶柱的下端约0.5cm处时，关闭电源开关，停止电泳，取出玻璃管。 电极缓冲液可回收使用，但上下槽缓冲液不能混淆，因下槽缓冲液已混入催化剂和Cl—等。 6、剥胶 用长针头注射器吸满水。一般将针头从浓缩胶一端插入凝胶条与玻璃管壁之间（注意紧贴管壁），一面沿管壁转动并推针前进，靠水的压力和润滑作用使玻璃管内壁与凝胶条分开。待水从玻璃管另一端流出时，再慢慢将针头退出。用洗耳球插入管口吹气，缓慢将凝胶条自玻璃管脱出。 7、固定与染色 剥出的凝胶条立即浸泡盛有染色液的培养皿中约10min，同时进行蛋白质区带固定和染色。染色液用毕回收可反复使用。 8、脱色 染色后的凝胶条先用自来水冲掉表面的多余染料，再用7％醋酸溶液浸泡脱色。经常更换醋酸液，直到凝胶条上没有染料脱下来，背景几乎无色为止。约需2d—3d。 9、绘图 脱色清楚后的凝胶条上出现一个个圆盘状的蛋白质区带，将分离结果绘图。 [方法评估] 1、在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。 2、化学性质稳定，与被分离物质不起化学反应。 3、对pH和温度变化较稳定。 4、几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。 5、凝胶孔径可调节，根据被分离的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。 6、分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩，分子筛和电荷效应为一体，因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。 [应用意义] PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等。 [注意事项] 1、贮液放冰箱中一般可保持1—2个月，但3号贮液只能保存一周。如有不溶物可过滤。 2、Acr和Bis对神经系统有毒害，使用时要小心，注意勿与皮肤接触。但聚合后的凝胶对人体无害。 3、电泳时的电流最好不超过5mA/管，以免产生过多热量。室温高时应进行冷却或冷库内进行电泳。 4、本实验需时间较长。在一次实验中可安排到脱色一步，再于下一次实验中观察脱色后的胶条并绘图。 5、在碱性条件下，凝胶易聚合，其聚合速度与Ap浓度平方根成正比，一般在室温下，pH8.8时，7.5％丙烯酰胺溶液30min完成聚合作用，在pH4.3时聚合速度很低，约需90min才能聚合，此外应选择高纯度的Acr和Bis。杂质。某些金属离子、低温和氧分子能延长或阻止碳链的延长与聚合作用。 [思考题] 1、为什么样品会在浓缩胶中被压缩成一薄层？ 2、上下槽电极缓冲液电泳后，能否混合存放？为什么？ 实验22 糖含量的测定Ⅱ－邻甲苯胺法（必修） [目的与原理] 掌握邻甲苯胺法测定血糖的原理和操作技术，并用此法测定鱼类等水产动物的血糖含量。 葡萄糖在热的醋酸溶液中与邻甲苯胺缩合成蓝色（或蓝绿色）西夫氏碱(Schiff-base)其反应如下：
[试剂与器材] 试剂： 1、邻甲苯胺(o—toluidine) 试剂：称取硫脲（A.R.）2.5g，溶于冰醋酸（A.R.）750ml中。将此溶液转入1L容量瓶内，加邻甲苯胺150ml，2.4％硼酸溶液100ml,再加冰醋酸至1L刻度，置棕色瓶中，至少可应用2个月。 2、葡萄糖贮存标准液（100mg/ml）：将少量无水葡萄糖（A.R.或C.P.）置于硫酸干燥器内一夜。精确称取此葡萄糖1.000g，以饱和苯甲酸溶液溶解并转移入100ml容量瓶内，再以饱和苯甲酸溶液稀释至100ml刻度。置冰箱中可长期保存。 3、葡萄糖标准液（1.5mg/ml）：在100ml容量瓶内，加入葡萄糖贮存标准液15.0ml，用饱和苯甲酸溶液稀释至100ml刻度，混和。 材料：新鲜血清 器材： 可见分光光度计，1000w电炉， 试管及试管架，旋涡混合器，1000 ml烧杯 2个， 吸管(5ml 1支，0.1ml 若干或0.1ml可调移液器1支)，滤纸，擦镜纸。 [实验步骤] 1、样品测定 准备好三只试管，分别标明空白管、标准管、测定管，然后按表1-1-2加液。 表1-1-2血液葡萄糖测定邻甲苯胺法操作步骤 空白管 标准管 测定管 ml ml ml 邻甲苯胺试剂 5.0 5.0 5.0 血浆（或血清） — — 0.1 葡萄糖应用标准液（1.5mg/ml） — 0.1 — 蒸馏水 0.1 — — 混合后置沸水浴中加热15分钟。取出，用流水或冷水浴冷却。用630nm或红色滤光片进行比色。以空白管校正光密度到0点，读取各管光密度读数。 2、所得的光密度按下列公式计算血糖含量 测定管光密度 / 标准管光密度×150＝葡萄糖（mg/100ml） 3、标准曲线绘制 取10ml容量瓶5个，分别编号1、2、3、4、5依次加入葡萄糖贮存液0.5、1.0、2.0、3.0、及4.0ml。再经饱和苯甲酸溶液稀释至10ml刻度，混和。以上溶液的葡萄糖浓度依次为50、100、200、300、及400mg/ml。然后将此5种浓度的标准液及蒸馏水（空白管）按上表步骤操作。最后以空白管校正光密度到0点，读取各浓度标准管光密度读数。将各光密度读数与其相应的葡萄糖浓度在坐标纸上作图，绘成标准曲线。 [方法评估] 葡萄糖在加热的有机酸溶液中能与某些芳香族胺类如苯胺、联苯胺、氨基联苯、邻甲苯胺等生成有色衍生物。利用这一原理建立的邻甲苯胺法测定血液葡萄糖时特异性很高，除去葡萄糖后的血浆、血清与此试剂基本上不起反应。此法的另一优点为操作简便，可不需作无蛋白滤液而直接用血浆或血清进行测定。 [应用意义] 葡萄糖含量的变化与机体的内分泌功能有关，当激素调节失去原有的相对平衡时，则出现高血糖（高于正常值）或低血糖（低于正常值）；在运动，饥饿等状态下，可出现生理性或暂时性低血糖；当肝脏疾病，长期营养不良，或消耗性疾病时，血糖含量可持续性降低，出现病理性低血糖。 [注意事项] 1、测定液的显色强度与反应条件有关，邻甲苯胺的批号、邻甲苯胺试剂的新旧（如试剂配制后过久，呈色变浅）以及加热温度和加热时间等都会影响显色强度。因此，测定管、标准管、空白管的加热时间与温度必须完全一致，每批测定管数不宜过多，以便能较好地控制反应条件。有些批号冰醋酸会产生棕色反应，影响测定结果。 2、最终反应液偶尔会产生混浊，常见原因是血液中脂肪含量过高。另外，轻度溶血不干扰测定结果。 [思考题] 1、如何获得血浆和血清？ 2、测定血糖时为什么要在空腹状态下取血？ 3、应用所测定的血糖指标判断机体的生理状态？ 实验23 总脂的测定-香草醛法（必修） [目的与原理] 掌握测定血清总脂的原理和方法，并应用香草醛法测定水产动物血清中总脂含量。 血清总脂为血清中各种脂类物质的总和，包括甘油三酯、磷脂、胆固醇（30％游离，70％酯化）及很少量的游离脂肪酸等。脂类物质不溶于水，或略溶于水。血清脂质能处于溶解状态的主要原因是它们与蛋白质结合成脂蛋白分子。除游离脂肪酸与白蛋白结合外，其余的都与球蛋白结合，而分为高密度脂蛋白（简称HDL，即α脂蛋白）、低密度脂蛋白（简称LDL。即β脂蛋白）、极低密度脂蛋白（简称VLDL，即前β脂蛋白）及乳糜微粒（简称CM）等四种。血清脂质，是体内脂类转运的主要形式，并且反映各种生理和病理过程中脂代谢的改变情况。 本实验是以比色法测定血清总脂含量，其方法为血清中的不饱和脂类与硫酸作用水解后生成碳酸离子。试剂中的磷酸与香草醛的羟基作用产生芳香族的磷酸酯，并且改变了香草醛分子中的电子分配。使醛基变成反应增强的醛基，碳鎓离子与磷酸香酯的羰基起反应，生成红色醌化物。反应式如下：
[试剂与器材] 试剂： 1、浓硫酸（A.R.）。 2、浓磷酸（A.R.）。 3、0.6％香草醛溶液：称取香草醛0.6g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。贮于棕色瓶内可稳定2月。 4、总脂标准液（4mg/ml）：精确称取纯胆固醇400mg，置于100ml容量瓶内，用冰醋酸溶解并稀释至100ml刻度。 器材： 可见分光光度计， 试管及试管架， 1000 ml烧杯 1个， 吸管(5ml 1支，0.1ml 若干或0.5 ml可调移液器1支，1ml 1支，2ml 1支)，滤纸，擦镜纸。 [实验步骤] 准备好六支试管，分别标明空白管、标准管。测定管（各二支），然后按表1-1-3操作。 表1-1-3 血清总脂测定比色法操作步骤 空白管 标准管 测定管   ml ml ml  血 清 总脂标准液（4mg/ml） 浓硫酸 — — — — 0.05 1.2 0.05 — 1.2  充分混和，置于沸水中加热10分钟，使脂类水解。取出，冷水浴中冷却  吸出上述水解液加入另一试管中 浓磷酸 0.6％香草醛溶液 — 3.0 1.0 0.20 2.8 1.0 0.20 2.8 1.0   用玻棒充分搅匀。20分钟后用525nm或绿色滤光板比色，以空白管校正光密度到0点，读取光密度读数。 计算： 血清总脂mg/100ml =测定管光密度/标准管光密度×0.05×4×100/0.05 = 测定管光密度/标准管光密度×400 [方法评估] 测定血清总脂的方法常用的有下列几种： 1、称量法：系将血脂抽提液纯化，挥发至干后，称取脂质的重量，此法比较准确，但血清用量较大。 2、比色法：例如：硫酸一磷酸一香草醛试剂与脂质作用产生红色，此法可用血清直接测定，筒便易行，故近来采用者较多。 3、比浊法。 4、染色法：直接将一定量血清滴于滤纸片上，以标准血清（或脂质）作对比，用苏丹黑B染色，根据染色深浅计算血脂含量。此法准确性差。 [应用意义] 在研究脂类代谢或转运中，一般需要了解胆固醇及甘油三酯的变化情况，血清总脂的增高或降低可以代表血清总胆固醇及甘油三酯的增高或降低，但是仅仅测定总脂含量尚不能满足对机体脂类代谢分析的要求，因此在这方面研究工作中已很少采用。总脂测定结合脂蛋白电泳分析，可用于估计各部分脂蛋白中的脂质含量。 [注意事项] 1、因为本反应的显色强度与脂肪酸的饱和度有关。所以测定结果与所采用的参考标准物质有关。一般认为血清中饱和脂类与不饱和脂类之比为3:7。目前多采用胆固醇或橄榄油作为标准，与上述情况比较接近。然而两者的显色强度仍有差别，在同样浓度下橄榄油呈色较胆固醇为浅，故最好用已知总脂含量的血清作为标准液，则测定结果更符合实际情况。 2、显色后，一般在2小时内其光密度无明显改变。 [思考题] 1、试述血清总脂的测定原理和方法？ 2、实验所得结果，与正常值比较，有何变异？ 实验24 胆固醇测定－邻苯二甲醛法（必修） [目的与原理] 掌握血清胆固醇测定的原理和方法并采用邻苯二甲醛直接显色法测定水产动物血清总胆固醇含量。 胆固醇及其脂在硫酸存在下与邻本二甲醛作用。产生紫红色物质，此物质对560nm波长的光有最大吸收，可用比色法定量测定。100ml样品中胆固醇含量在400mg之内与吸光度呈良好线性关系。 [试剂与器材] 试剂： 1、邻苯二甲醛溶液：称取邻苯二甲醛［C6H4（CHO）2］5mg，溶于冰醋酸（A.R．）100ml中，存于棕色瓶内。 2、浓硫酸（A．R．）。 3、胆固醇标准液：称取重结晶胆固醇200mg，以冰醋酸（A.R．）配制成100ml。 器材： 可见分光光度计，离心机，试管若干及试管架，旋涡混合器，1L容量瓶，烧杯2个，吸管(5ml2支，0.1ml 1支或0.1ml可调移液器1支，1ml 1支)，滤纸，擦镜纸。 [实验步骤] 取三只试管，分别标明空白（B）、标准（S）和测定（U）按表1-1-5加入试剂和血清。 表1-1-5 邻苯二甲醛直接显色法操作步骤 空白管 标准管 测定管   血清 胆固醇标准液 邻苯二甲醛溶液 浓硫酸 ml — — 3.0 2.0 ml — 0.02 3.0 2.0 ml 0.02 — 3.0 2.0  摇动混合，5min后用560nm进行比色，以空白管校正光密度到0点，读取各管光密度读数。  计算： 总胆固醇mg／100ml = 测定管光密度/ 标准管光密度 ×200 [方法评估] 血清胆固醇测定方法很多，有比色法、荧光法、比浊法、吸附层析、气相层析及酶学法等。但以比色法最为实用，且灵敏、稳定，故目前通用比色法。 [应用意义] 胆固醇含量与动物种类、年龄、性别，摄食习惯、运动等有关。严重贫血、急性感染、营养不良及长期疾病等胆固醇含量下降。 [注意事项] 1、本法中邻苯二甲醛溶液及浓硫酸可以用半量。 2、本法所显颜色比较稳定，光密度在5分钟内可达最高值，60分钟内无明显改变，室温高低对结果的影响不明显。测定范围可达400mg／100ml血清。 3、血清蛋白及标本轻度溶血对本法结果无明显影响，但严重溶血可使结果偏高。 [思考题] 1、邻苯二甲醛法测定血胆固醇的原理及测定时的注意事项？ 2、应用所测定的指标判断机体的生理状态？ 实验25 血清尿素氮测定（必修） [目的与原理] 掌握测定血清尿素氮的原理和方法，并应用二乙酰一肟法测定不同鱼类的血清尿素氮含量和理解血中尿素氮含量变化的生理意义。 尿素是体内氨基酸分解代谢的最终产物之一。氨基酸经脱氨基作用生成氨，氨对动物机体具有毒性。肝细胞具有使氨生成尿素的作用，所以尿素的生成是肝脏的解毒功能之一。肝脏合成的尿素通过血液运输至肾脏，由尿液中排出体外。所以血中尿素的来源是肝脏，而去路是通过肾脏的排泄作用。利用血液及尿中尿素氮含量可作为排泄功能的检验。 本实验采用二乙酰一肟法测定血清尿素氮。二乙酰一肟法系根据双乙酰与尿素形成二嗪衍生物的有色复合物的显色反应。由于双乙酰本身不稳定，故用二乙酰一肟来代替，其反应式如下：
[试剂与器材] 试剂 1、酸性试剂：在1L容量瓶中加入蒸馏水约100ml，然后加入浓硫酸44ml及85％磷酸66ml冷却至室温后，加入硫氨脲50mg，及硫酸镉（3CbSO4·8 Ho）2g，溶解后用蒸馏水稀释至1L刻度。置于棕色瓶中放冰箱内可用半年不变。 2、2％二乙酰一肟试剂：称取二乙酰一肟20g。加入蒸馏水约900ml，溶解后再用蒸馏水稀释至1L，贮于棕色瓶中置冰箱内半年不变。 3、尿素氮标准液（60mg/100ml）:精确称取干燥纯尿素128.4mg，加蒸馏水溶解后转移入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至100ml刻度。加氯仿6滴作防腐剂，贮存于冰箱中保存半年不变。 器材 ： 721型分光光度计，水浴锅，试管1.5cm×15cm（若干）, 吸管1.0ml（若干）、0.2ml（1支）、5ml（若干），微量吸液器 1只。 [实验步骤] 1、取1.5cm×15cm试管两只，标明“空白管”和“测定管”。两管中各加入酸性试剂5ml。在空白管中加蒸馏水20ul，在测定管中加血浆或血清20ul，在两管中各加入二乙酰一肟试剂0.5ml。混和后置沸水浴中12分钟。置冷水浴中冷却5分钟后。用540nm或绿色滤光片进行比色，以空白管校正光密度到0点，读取测定管光密度读数，查标准曲线即得血清或血浆尿素氮浓度。 2、标准曲线绘制：在顺序编号为1、2、3、4的试管中依次加入尿素氮标准液（60mg/100ml）1.0、2.0、3.0、4.0ml，再依次加入蒸馏水5.0、4.0、3.0、2.0ml，混和。各管中尿素氮的浓度依次为10、20、30、40mg/100ml。另取试管五只。编号0、1、2、3、4，将0号试管作空白管，其余四管作上述四种浓度的标准管，按上述操作法中的空白管及标准管加液并进行操作。最后以0号管作空白，读取各标准管光密度读数，将所得读数与其相应的尿素氮浓度作图，绘成标准曲线。 [方法评估] 尿素氮测定的方法有好多种，如次溴酸钠法、尿素酶法及二乙酰一肟法等，但生化检验常用的为尿素酶法及二乙酰一肟法。二乙酰一肟法易受标本混浊、黄疸、溶血等因素影响，操作时应注意。 [应用意义] 尿素氮是评价肾功能的重要诊断指标，在肌酐浓度发生明显变化前，血尿素氮通常已升高，因此监测血尿素氮浓度对病程非常有用。肾脏病变可引起血清尿素氮增高。引起体内蛋白质分解代谢增强的疾病，如急性传染病、大面积烧伤、高热等也可使尿素氮增高。 [注意事项] 1、由于反应在强酸中进行，产生的羟胺是干扰物质，所以必须用氧化剂将其氧化除去。提高酸的浓度可以提高显色反应的灵敏度。 2、如血浆或血清尿素氮浓度超过40mg/100ml时，则必须将标本用生理盐水稀释后再操作，结果乘稀释倍数。 3、二乙酰一肟与尿素的显色反应并不专一，与瓜氨酸亦能显色。但在血清中瓜氨酸的浓度不高，因此影响甚少。 [思考题] 1、综合实验所得结果，与正常值相对照，有何变异？为什么？ 2、试述尿素氮测定的原理和方法？ 3、试讨论鱼类尿素氮的正常值及其应用意义？ 第三节 酶活力的分析测定 酶是由组织细胞合成的具有特殊催化功能的蛋白质。酶的最重要特征是具有催化一定化学反应的能力，在酶的作用下化学反应进行的速率可代表酶的活性，但酶反应速率还要受温度、pH、离子强度及底物浓度等多种因素影响，因此酶活性实指在特定条件下的酶催化活性或酶促反应速率。酶反应速率的测定是酶实验的核心，进行酶活性的测定首先必须了解和获得某些酶的基本知识，包括酶在细胞内定位及酶分布的器官差异；酶促反应中需要哪些因子的参与，如底物、金属离子、辅酶等；酶促反应的最适条件；样品采集或贮存技术的误差等因素。同工酶是指生物体内能催化相同反应的有关酶类。由于同工酶在组织分布、细胞内定位等方面都可能有所差异，因此可利用这些差异来增加酶学检测的特异性和灵敏性。 酶活性的测定有助于了解和评价水产动物的新陈代谢及各组织器官机能活动的特点，如营养物质的消化吸收，蛋白质、糖及脂类代谢活动的规律及其变化，免疫机能等。而同工酶的分离与检测则有助于分析研究水产动物不同种族的代谢差异，和各组织器官不同的代谢途径，了解在病理情况下或环境条件发生变化（如污染、低温等）的情况下机体代谢的异常变化及其免疫机制的变化等。 酶活性的测定必须建立便于鉴定和监测酶反应中所发生的物理、化学或生物学变化的方法，其中最直接的方法是监测反应中底物或产物浓度的变化，诸如分光光度法、荧光分析法、酸碱滴定法及放射化学法等。同工酶不同酶带的分离和活性测定，一般采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、淀粉凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳和醋酸薄膜电泳等技术。 本节介绍的内容为水产动物各种酶活力测定方法、同工酶的分离及其活性的测定方法，有的比较经典、成熟；有的操作简便、快速并易于掌握。其中许多方法经过多年来在水产动物酶学研究中的应用，证明较适用于水产动物酶活力及其酶促反应动力学的分析研究和水产动物免疫机能的分析研究。 实验26 过氧化氢酶活力的测定（必修） [目的与原理] 掌握过氧化氢酶活力的测定原理和比色测定方法，并用此方法测定水产动物血清中过氧化氢酶的活力。 血清中的过氧化氢酶（CAT）分解H2O2的反应，可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，即可计算出CAT的活力，CAT活力单位定义为：每1分钟分解1μmol的过氧化氢即为1个酶活力单位（U）。 [试剂与器材] 试剂： 1、磷酸盐缓冲液（67mmol / l，pH=7.4）：取Na2HP04 7.60g，KH2P041.82g，溶于1L蒸馏水中，调pH至7.4。 2、基质液（65μmol/ l, H2O2）：取30% H2O2 3.69 ml加pH7.4磷酸盐缓冲液至500ml。 3、钼酸铵：称取［(NH4)6Mo7O24］20.2g溶于500ml蒸馏水中。 器材： 721分光光度计 , 0.5cm比色杯，恒温水箱（37℃±0.5℃），试管 16mm×100mm，移液管，吸耳球，可调微量进样器。 [实验步骤] 1、样品测定：基质液置于37℃水浴 5 min，然后按下列步骤操作 试剂 对照管 标准管 测定管  基质液 1.0ml 1.0ml 1.0ml  钼酸铵 1.0ml 1.0ml —  缓冲液 — 0.2ml —  血清 0.2ml — 0.2ml  37℃水浴准确温育60s后，立即加入钼酸铵1.0ml摇匀，10min后于405nm以蒸馏水调零比色。记录各管吸光度值（A）   2、计算： 过氧化氢酶活力(U/ L)= [(A对－A测)/ A标] ×（65×1×1000/0.2 ×1000） = [(A对－A测)/ A标]×325 (式中65为标准管H2O2浓度，1为1.0ml H2O2体积，1000换算成1L血清，0.2为血清用量， 1000为μmol 换算成 mmol) [方法评估] 本实验采用分光光度法测定底物（H2O2）的减少量来评价过氧化氢酶活力。此法操作简便、准确，在实验时间（1小时）内显色稳定，适于科研和实验检验用。 [应用意义] CAT具有重要的生理功能，细胞内与产生H2O2的需氧脱氢酶类（如氨基酸氧化酶等）同时存在，能将细胞代谢所产生的毒性物质H2O2迅速加以清除，从而共同保护血红蛋白、巯基酶、膜蛋白和解毒作用。此外，CAT清除H2O2后可减少过氧化脂质生成和对人体的毒害，因而有抗衰老和保护作用。 [注意事项] 1、反应时间在80秒内吸光度降低与反应时间成反比关系，故选用60秒为测定时间（所以本法不宜大批量样品同时测定，以每批4～5份为宜）。 2、酶活力在100~140U范围内呈线性关系；钼酸铵和H2O2呈色反应在pH＜7时吸光度升高，当pH＞7.6时吸光度下降，故选用pH7.4作为测定条件。 3、黄色复合物至少在1h内稳定。 4、血清不能溶血，溶血样品应该弃去。 5、加入钼酸铵后，由于释放O2，气泡会干扰比色，宜在显色10min后比色。 [思考题] 1、试述过氧化氢酶的测定方法？ 2、底物与血液中过氧化氢酶反应时间为什么要准确定为60秒？3、试述过氧化氢酶催化H2O2反应的机制？ 实验27 酸性磷酸酶活力的测定（选修） [目的与原理] 掌握酸性磷酸酶活力的测定原理和方法，并用此法测定水产动物血清中酸性磷酸酶活力。 酸性磷酸酶（ACP）同碱性磷酸酶一样是一组对基质专一性很差的酶，在酸性条件下能水解各种磷酸酯。用于测定碱性磷酸酶的各种磷酸酯基质也可用来进行酸性磷酸酶的测定。酶作用的最适pH 随着不同的基质及不同来源的磷酸酶而有所不同。酸性磷酸酶分解磷酸苯二钠产生游离酚和磷酸，酚在酸性溶液中与4一氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌的衍生物，根据红色深浅测出酶活力高低。 酸性磷酸酶活力单位定义：100ml血清中37℃，与底物作用60min，产生1mg酚为1个活力单位。 [试剂与器材] 试剂： 1、柠檬酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH=4.9）：将42g柠檬酸（含1分子结晶水）于蒸馏水800ml中，校正pH至4.9（约加入1mol/L氢氧化钠176ml），用蒸馏水稀释至1L。加氯仿数滴，保存于冰箱中。 2、磷酸苯二钠溶液（20mmol/L）先将500ml水煮沸，消灭微生物，迅速加入2.54g含2分子结晶水的磷酸苯二钠（或2.18g不含结晶水的磷酸苯二钠），冷却后加2ml三氯甲烷防腐，置冰箱保存，称为底物溶液。 3、铁氰化钾溶液：称取2.5g铁氰化钾、17g硼酸，各溶于400ml蒸馏水中，然后将两液混合，加水至1000ml，混匀，棕色瓶中暗处保存。 4、碱性溶液： 称取碳酸氢钠4.2g，4－氨基安替比啉0.1g，溶于蒸馏水100ml中，加入0.5 mol·L-1氢氧化钠100ml，混匀。 ５、酚标准贮备液：溶解酚（A.R.）1g 于0.1N盐酸中，用0.1N盐酸稀释至1L。此溶液每1mｌ含1mg酚。 ６、酚标准应用溶液 取5ml酚标准贮备溶液，加水至100ml混匀。此溶液每1ml含0.05mg酚，只能保存2～3d。 器材： 分光光度计 1.0cm比色杯，恒温水箱 （37℃±0.5℃），试管 16mm×100mm，离心机。 [实验步骤] 1、标准曲线的绘制。取6个试管按下表配制标准系列。 标准系列的配制 加入试剂 管号   0 0 1.1 1.0 1 0.2 0.9 1.0 2 0.4 0.7 1.0 3 0.6 0.5 1.0 4 0.8 0.3 1.0 5 1.0 0.1 1.0  酚标准应用液/ml        水/ml        柠檬酸缓冲液/ ml        置37℃水浴中5min  碱性溶液/ ml 2.0 3.0 0 2.0 3.0 2 2.0 3.0 4 2.0 3.0 6 2.0 3.0 8 2.0 3.0 10  铁氰化钾溶液/ ml        相当金氏活力单位         立即混匀，用1.0cm比色皿，以0号管作参比调零，在510nm波长处测量吸光度，并结合相应酶活力单位绘制标准曲线。 2、样品测定。取2个16mm×100mm试管按下表操作。 血清酸性磷酸酶操作步骤 顺序 加入试剂 管号 操作条件    测定管 对照管   1 血清/ml 0.1 0 置37℃水浴5min  2 柠檬酸盐缓冲液/ml 1.0 1.0 2.0 3.0 0 1.0 1.0   3 磷酸苯二钠溶液（预温37℃）/ml   混匀，置37℃水浴，准确保温60min  4 碱性溶液/ml  2.0 3.0 立即混匀，用1.0cm比色皿，以蒸馏水作参比调零，测定光密度  5 铁氰化钾溶液/ml     6 血清/ml  0.1   3、结果 以（测定管光密度－对照管光密度）查标准曲线，求得酶活力大小。 [方法评估] 本方法是基于测定基质解离了磷酸根而剩下的羟基化合物。该羟基化合物需要经过显色试剂的作用方能进行比色测定，如采用磷酸苯二钠为基质的方法，酶反应产生的苯酚尚需用酚试剂或4一氨基安替比林、高铁氰化钾等显色方能测定。 [应用意义] 酸性磷酸酶在自然界的分布很广,动物、植物、微生物中均有存在，在动物体内酸性磷酸酶遍及各组织细胞内，肝脏、脾脏、乳汁、胃、肌肉、皮肤、红细胞、前列腺等中含量较高，而以前列腺中含量最为丰富。研究表明,酸性磷酸酶主要参与磷酸酯的代谢,除此之外,其中的一部分还具有一些重要的生物学功能,包括代谢调节、能量转化以及信号传导等。在水生动物中酸性磷酸酶催化各种磷化合物的水解，是生物磷代谢的重要酶类。而水环境各种因素的变化，对机体磷酸酶的活力发生影响，进而影响动物的正常生理活动和物质代谢。 [注意事项] 1、血清中酸性磷酸酶不稳定，尤其是在37℃和pH>7.0的条件下活力很快丧失，血清放在室温1～2h酶活力可丧失50％。 2、采血后应尽快分离血清，如不能及时测定，应将血清管加紧塞冰冻保存，或每1ml血清中加50μL 5 mol·L-1乙酸，使pH值降至5.4，酸化后血清置室温可稳定数小时，置冰箱内可稳定7d。 3、血清不能溶血，因为红细胞比血清中的酸性磷酸酶高100倍左右。 [思考题] 1、试就酸性磷酸酶的测定值与正常值比较有何差异？为什么？ 2、试述酸性磷酸酶在机体中的分布及生理作用。 实验28 碱性磷酸酶活力的测定（必修） [目的与原理] 掌握碱性磷酸酶活力的测定原理和方法，通过碱性磷酸酶催化磷酸苯二钠生成酚的量确定碱性磷酸酶的活力。 在pH=10的碱性反应液中，碱性磷酸酶催化底物磷酸苯二钠水解，生成游离酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4－氨基安替比啉结合，并经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物，颜色深浅与酚含量成正比，可在波长510nm处测定吸光度，查标准曲线得碱性磷酸酶活力单位。其反应式如下，
碱性磷酸酶（AKP）活力单位定义：100ml血清中37℃，与底物作用15min，产生1mg酚为1个活力单位。 [试剂与器材] 试剂： 1、碳酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH=10）将6.36g无水碳酸钠、3.36g碳酸氢钠、1.5g 4－氨基安替比啉于800ml蒸馏水中溶解，转入1000ml容量瓶中，加水至刻度，置棕色瓶中贮存。 2、磷酸苯二钠溶液（20mmol/L）先将500ml水煮沸，消灭微生物，迅速加入2.54g含2分子结晶水的磷酸苯二钠（或2.18g不含结晶水的磷酸苯二钠），冷却后加2ml三氯甲烷防腐，置冰箱保存，称为底物溶液。 3、铁氰化钾溶液：分别称取2.5g铁氰化钾、17g硼酸，各溶于400ml蒸馏水中，然后将两液混合，加水至1000ml，混匀，棕色瓶中暗处保存。 4、酚标准贮备液：溶解酚（A.R.）1g 于0.1N盐酸中，用0.1N盐酸稀释至1L。此溶液每1ml含1mg酚。 5、酚标准应用溶液：取5ml酚标准贮备溶液，加水至100ml混匀。此溶液每1ml含0.05mg酚，只能保存2～3d。 器材： 分光光度计 ，1.0cm比色皿， 恒温水箱（37℃±0.5℃）， 试管 16mm×100mm， 离心机。 [实验步骤] 1、标准曲线的绘制。取6个试管按下表配制标准系列。 标准曲线的操作步骤 管 号 酚标准应用液/ml 水/ml 碳酸盐缓冲液/ ml 铁氰化钾溶液/ ml 相当金氏活力单位  0 1 2 3 4 5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.1 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 0 10 20 30 40 50  立即混匀，用1.0cm吸收池，以0号管作参比调零，在510nm波长处测量吸光度，并与相应酶活力单位为横坐标绘制标准曲线。 2、样品测定。取2个16mm×100mm试管按下表操作。 血清碱性磷酸酶操作步骤 顺序 加入试剂 管号 操作条件    测定管 对照管   1 血清/ml 0.1 0 置37℃水浴5min  2 碳酸盐缓冲液/ml 1.0 1.0   3 磷酸苯二钠溶液（预温37℃）/ml 1.0 1.0 混匀，置37℃水浴，准确保温15min  4 铁氰化钾溶液/ml 3.0 3.0 立即混匀，用1.0cm吸收池，以蒸馏水作参比调零，测定吸光度  5 血清/ml 0 0.1   结果 以（测定管光密度－对照管光密度）后查曲线，求得酶活力大小。 [方法评估] 同实验27。 [应用意义] 碱性磷酸酶几乎存在于身体各种组织中，是膜结合酶。肠上皮、肾小管、成骨细胞、肝脏、胎盘及白细胞中尤其丰富。血清中碱性磷酸酶主要来源于肝和骨。AKP与肠内脂质转移及骨质钙化有关。血清AKP测定主要用于肝胆系统及骨骼系统疾病的诊断。 [注意事项] 1、加入铁氰化钾溶液后必须迅速混匀，否则显色不充分。 2、铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定显色的作用。 3、血清中碱性磷酸酶一般不是单一的酶，而是一组酶，在碱性条件下具有较高的活力，特异性较低，所以测定此酶活力时底物多达几十种。 4、磷酸苯二钠底物液在保存过程中应避免其分解，所用蒸馏水应煮沸除微生物，冷却后加入氯仿防腐，置冰箱可保存1个月。 5、因血清中很少有酚或酚类化合物，故常用试剂空白代替血清对照管。试剂空白可检查底物是否分解，吸光度增大，呈红色时不能用。 [思考题] 1、举例说明在机体中碱性磷酸酶作用的底物有哪些？ 2、试述磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶的原理和方法？ 3、分析你所测得实验结果，说明有何生理意义？ 实验29 谷丙转氨酶（GPT）活力的测定（必修） [目的和原理] 掌握测定谷丙转氨酶的原理和方法，并用赖氏法测定水产动物血清中的转氨酶活力。 丙氨酸和α一酮戊二酸在血清谷丙转氨酶作用下生成丙酮酸和谷氨酸，在酶反应达规定时间时，加入2,4-二硝基苯肼盐酸溶液以终止反应。生成的丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用，产生丙酮酸－2,4-二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下呈红棕色，显色的深浅在一定范围内可反映所生成的酮酸量多少。 [试剂与器材] 试剂： 1、0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）：称取无水磷酸二氢钾2.69g和磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）13.97g,加蒸馏水溶解移至1L容量瓶中，校正pH至7.4，然后加蒸馏水至刻度，贮存于冰箱备用。 2、谷丙转氨酶基质液（DL-丙氨酸200mmol/L, α-酮戊二酸2mmol/L）：精确称取DL-丙氨酸1.79g和α-酮戊二酸29.2mg，先溶于0.1 mol/L磷酸盐缓冲液约50ml中，然后以1 mol/L氢氧化钠校正pH到7.4。再用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液稀释到100ml，充分混合，分装在小瓶中，冰冻保存。 3、2、4二硝基苯肼溶液（1 mmol/L）：精确称取2、4二硝基苯肼19.8 mg，溶于10 mol/L盐酸10 ml中，溶解后加蒸馏水至100 ml。置棕色玻璃瓶内室温中保存，若有结晶析出应重新配制。 4、0.4 mol/L氢氧化钠：取标定的1 mol/L氢氧化钠400 ml，加蒸馏水至1L，混合,置具有塑料塞的试剂瓶中，室温中可长期稳定。 5、丙酮酸标准溶液（2 mmol/L）:准确称取丙酮酸钠（A.R.）22.0 mg, 置于100ml容量瓶中，以0.1 mol/L硫酸溶解并稀释至刻度。混均匀后，置于冰箱保存。 器材： 新鲜血清，721可见分光光度计，恒温水浴， 试管及试管架，旋涡混合器，烧杯 2个， 吸管(5.0ml 1支,0.5ml 2支，0.1ml 若干或0.1ml可调移液器1支)，滤纸，擦镜纸。 [实验步骤] 1、将测定所用试剂，除氢氧化钠溶液外全部置于37℃水浴箱内，预热至37℃然后使用。 2、取试管二只，标明测定管及试剂空白管。于测定管内加血清标本0.1 ml，试剂空白管内加0.1M磷酸盐缓冲液0.1 ml，放入37℃水浴箱内预热5min。 3、在测定管及试剂空白管中各加入谷丙转氨酶基质液0.5 ml，混匀，并立即计时。 准30分钟后，在测定管及试剂空白管中各加入2、4二硝基苯肼0.5 ml，混匀。 4、20分钟后，在测定管及试剂空白管中各加入0.4 mol/L氢氧化钠5 ml混匀。10分钟后将试管从水浴箱取出，冷却至室温。 5、用520nm或绿色滤光板进行比色，以蒸馏水校正光密度到0点，读取试剂空白管及测定管读数。 标准曲线绘制： 加入试剂 管号   0 1 2 3 4 5   0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(ml) 基 质 液(ml) 丙酮酸标准液（ml）  0.10 0.50 0  0.10 0.45 0.05  0.10 0.40 0.10  0.10 0.35 0.15  0.10 0.30 0.20  0.10 0.25 0.25  相当于丙酮酸实际含量(umol) 相当于酶活力（单位） 0 0 0.1 28 0.2 57 0.3 97 0.4 150 0.5 200   上列各管平行作三份，在37℃水浴箱内预热5min后，向各试管中加2、4二硝基苯肼溶液0.5 ml，混匀。以下步骤同酶测定操作方法，然后以蒸馏水校正光密度至0点，读取各管光密度读数，并计算出各管的三个重复测定的光密度均值，将各管光密度的均值减去0号管光密度的均值，所得差值与其对应的酶活力作图，即成标准曲线。并将0号管读数的均值标在标准曲线图上，供标本测定校定试剂空白管用。 [方法评估] 国内采用的血清转氨酶比色测定方法有三种：即赖氏（Reitman-Frankel）法、金氏（King）法、改良穆氏（Mohun）法。这三种方法的原理、试剂和操作步骤包括血清和试剂的用量以及作用温度等方面均基本相同，在酶作用时间上金氏法为60分钟，其余两种方法为30分钟。三种方法的主要不同点在于其单位定义和标准曲线的绘制方法，因此测定结果的单位数值也不相同。由于改良穆氏法单位定义的不合理和金氏法有酶作用时间太长等缺点，因此本文选用赖氏法，其优点是：标准曲线中两种酮酸的量客观地反应了酶作用的实际情况；标准曲线上单位的数字准确地反应出酶活力的大小。 [应用意义] 正常时，谷丙转氨酶主要存在于各组织细胞中（以肝细胞中含量最多，心肌细胞中含量次之），只有极少量释放入血液中，所以血清中此酶活力很低，当这些组织病变，细胞坏死或通透性增加时，细胞内的酶即可大量释放人血液中，使血清中GPT活力显著增高。所以在各种肝炎的急性期，药物中毒性肝细胞坏死等疾病时，血清GPT活力明显增高；肝癌、肝硬化、慢性肝炎、心肌梗塞等疾病时，血清中此酶活力中等度增高。 [注意事项] 1、由于α–酮戊二酸也与2、4二硝基苯肼作用而显色，为了减少其对丙酮酸测定的干扰作用，基质中α–酮戊二酸的浓度很低，不能保证酶反应的充分进行，因此标准曲线不呈直线，随着酶活力的增大，曲线的斜度逐渐趋于平坦，测定结果的准确性也相应减少。 2、酮酸和苯肼形成苯腙时的温度以及加碱后显色时的温度对同一标本显出的红棕色深浅都有影响。因此在进行一批标本测定时，反应试剂应置于37℃水浴箱预温，反应时间一律从第一管算起。加入氢氧化钠溶液10分钟，整架管子从水浴箱里取出浸于冷水中。冷却后再进行比色。 [思考题] 1、为什么测定谷丙转氨酶时试剂需要置于37℃水浴箱内恒温？2、血清谷丙转氨酶升高说明什么生理现象？3、试述转氨酶在机体代谢中的作用？ 实验30 胆碱酯酶活力的测定（选修） [目的与原理] 掌握胆碱酯酶活力测定的原理和方法，并用羟胺三氯化铁显色法测定鱼脑胆碱酯酶活力。 在神经冲动的传递过程中，乙酰胆碱是重要的化学因素。在神经系统中，存在着催化合成乙酰胆碱的胆碱乙酰化酶和催化乙酰胆碱水解的胆碱酯酶。 在一定温度、pH条件下，酶的反应速率与酶的量、反应速率，以及作用时间成近似的线性关系。通过测定所加入乙酰胆碱在胆碱酯酶作用下减少的量，就可得知胆碱酯酶活力的水平。未经胆碱酯酶水解的乙酰胆碱与羟氨作用生成乙酰羟氨，乙酰羟氨酸性条件下与三氯化铁(FeCl3)作用生成深褐色的络合物，其颜色与乙酰胆碱的浓度成正比，因而可以进行比色测定。 [试剂与器材] 试剂： 1、磷酸盐缓冲液（pH7.2） （1）称取23.752克磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O） 溶于蒸馏水并稀释至1000ml。 （2）称取18.156g磷酸二氢钾(KH2PO4) 溶于蒸馏水稀释至1000ml。 取（1）液72ml和(2)液28ml，混合即成。 2、已酰胆碱底物 称取乙酰胆碱0.0905g，加0.001M醋酸缓冲液（pH为4.5）至10ml，即成0.04mol贮备液，置冰箱内保存（不超过2星期）。临用时取0.04M贮备液1份，加9份磷酸盐缓冲液配制成0.004mol使用液。 3、1M盐酸羟氨溶液 称取13.9克盐酸羟氨，溶于蒸馏水后稀释200ml。室温高于300C时，应置于冰箱内。 4、14％NaOH 称取14gNaOH，加蒸馏水溶解至100ml。 5、10％三氯乙酸溶液 称取10g三氯乙酸，溶于10N盐酸溶液，再稀释到100ml。 6、10％三氯化铁溶液 称取三氯化铁10.0g，加0.83ml浓盐酸和10ml蒸馏水，待全部溶解后加蒸馏水到100ml。 7、0.001mol醋酸缓冲液（pH4.5） 称取醋酸钠（NaAC·3H2O）13.6g，加蒸馏水溶解后再稀释至100ml即成0.1mol。量取冰醋酸0.58ml加水至100ml即配成0.1mol。取前液57ml、后液43ml混合后再以蒸馏水稀释100倍即成。 8、碱性羟胺溶液 临用前20分钟配制，将1mol盐酸羟氨与14％NaOH液等体积混合即成。 材料： 鱼脑组织（或鱼血液） 器材： 分光光度计，恒温水浴，匀浆器，冰盘，解剖器械。 [实验步骤] 1、取新鲜或﹣20℃冷冻鱼，从鱼头背面剖骨，仔细取出完整的鱼脑，用滤纸轻轻吸去表面体液，剪碎、称重，在冰浴下加1毫升磷酸缓冲液匀浆，再用磷酸缓冲液稀释成每ml含2mg脑组织液。 2、按下表加入试剂 试剂 试 管   样品管 对照管 空白管 标准管  乙酰胆碱（ml） 磷酸缓冲液（ml） 鱼脑组织液（ml） 1.0 － 1.0 1.0 － － － 2.0 － 1.0 1.0 －  3、准确保温（如20、25、或30℃）20分钟，取出试管，立即每管加碱性羟胺溶液4.0ml。充分摇匀，并在对照管加1ml鱼脑组织液。 4、加10％三氯乙酸溶液2.0ml，充分摇匀，然后每管再加10％三氯化铁溶液2.0毫升，充分摇匀。 5、各管试液用滤纸过滤，以除蛋白质。 6、显色后将所得滤液置2cm比色管，在525nm波长下以空白管为0测量其余各管的光密度。 7、计算 脑胆碱酯酶活力＝ ×4÷2×60/20 = ×6 胆碱酯酶活力以每mg脑组织每小时催化水解乙酰胆碱的μg分子数表示（μg/mg/min）。 [方法评估] 本实验是采用测定酶作用后剩余基质的方法．即羟胺三氯化铁法。由于乙酰胆碱酯酶的活力受基质浓度的影响，本法的消耗基质，应过量加入30～70％，在此范围外易产生误差。此方法在国内应用较普遍。 [应用意义] 多种神经毒物，如有机磷农药、氨基甲酸酯农药、毒扁豆碱及烟碱等对胆碱酯酶都具有强烈的抑制作用，从而破坏神经冲动的正常传递。因此，可以通过测定鱼脑胆碱酯酶活力的抑制程度，了解水体受有机磷农药及其它污染的程度，同时掌握水体污染对鱼类等水生动物的影响。 [注意事项] 1、测定胆碱酯酶活力时温度、反应时间应严格控制。 2、由于鱼脑胆碱酯酶的活力除受有机污染物影响外，水体中多种因素也对该酶有一定影响，正常鱼脑胆碱酯酶活力有30%的波动。因此测定时一定要有足够的样品数量，以保证实验结果的准确性。 [思考题] 1、试述胆碱酯酶的作用原理？ 2、取脑的酶组织液时为什么要用冰浴？ 3、当水体受有机磷污染时，鱼脑胆碱酯酶活力有何变化？为什么？ 实验31 蛋白酶活力的测定（必修） [目的与原理] 掌握蛋白酶活力的测定方法，测定鱼、虾、贝等水产动物主要消化器官肝胰脏、胃、肠等蛋白酶的活力。 动物消化器官内含有各种消化腺，这些消化腺分泌消化酶进行化学性消化作用，将机体摄入的大分子营养物质转变为可溶性小分子物质而吸收进入血液循环。本实验采用福林—酚法测定机体内主要消化酶—蛋白酶活力。福林—酚试剂（Folinphenol）在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物。蛋白质中含有酚基的氨基酸包括（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用蛋白酶分解酪蛋白（底物），生成含酚基的氨基酸与福林－酚试剂成蓝色反应，可从蓝色的深浅测知酶活力多少。 [试剂与器材] 试剂： 1、福林试剂：在2000ml磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4·2 H2O）100g，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g，水700ml，35％磷酸50ml，浓盐酸100ml，文火回流10小时，然后加人硫酸锂50g，水50ml和溴水数滴，摇匀，去除冷凝器，继续煮沸15分钟，以除去多余的溴。溶液呈金黄色，冷却后，定容至1000ml，过滤，滤液即福林试剂（试剂不应呈绿色，否则需重配）。置于棕色瓶中保存，使用时用氢氧化钠标定，稀释至1N。 2、0.55M碳酸钠溶液 3、10％三氯乙酸 4、0.02M pH7.5磷酸缓冲液： 0.02M 磷酸氢二钠溶液的配制：取Na2HPO4·2H2O 3.561g (或Na2HPO412H2O 7.164g)，溶解于1L蒸馏水中。0.02M 磷酸二氢钠溶液的配制：取NaH2PO4 H2O 2.76g (或NaH2PO4 2H2O 3.121g)，溶解于1L蒸馏水中。 将0.02M 磷酸氢二钠溶液84ml与0.02M 磷酸二氢钠溶液16ml混合，即为0.02M pH7.5磷酸缓冲液。 5、0.5％酪素：（酪蛋白）0.5克，以0.5N NaOH 1ml湿润。再加少量0.02MpH7.5磷酸缓冲液稀释。在热水浴中溶解，定容至100ml，冰箱中可保存一周。 材料： 鲜活鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。 器材： 分光光度计、光径1.0cm比色杯、离心管、电子天平、离心机、匀浆器、剪子、镊子、冰块、试管若干、移液管若干。 [实验步骤] 1、酶粗提液的制备 取新鲜肝胰脏、胃、肠组织称重，在冰盘上剔除脂肪及内容物，以10倍缓冲液或去离子水匀浆各组织，将组织悬液低温下离心（3000rpm/min）,上清液为酶粗提液（酶液）。 2、酶活力测定 （1）标准曲线的制作：精确称取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2N盐酸溶解，定容至100ml，分别配制溶液0—100μg/ml不同浓度溶液，不同浓度各取酪氨酸溶液1ml，加0.5％酪素2ml，于370C 水浴中反应15分钟，然后加入三氯乙酸3ml，离心除去沉淀。取清液1ml，加入0.55M碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于370C水浴显色15分钟，在680nm波长下比色，测光密度（O D）。以光密度读数为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标，绘制曲线。 （2）样品测定 样品测定设对照管和测定管。 对照管 测定管  适当稀释酶溶液 / 1ml 去离子水 1ml /   370C水浴预热3---5分钟  0.5酪素（预热过） 2ml 2ml   370C水浴准确反应15分钟  10％三氯乙酸 3ml 3ml  离心去除沉淀  取上清液于另外试管内 1ml 1ml  0.55M碳酸钠 5ml 5ml  福林试剂 1ml 1ml  37℃水浴显色15分钟，680nm波长比色，以对照管校零，读取测定管光密度。 3、计算 在37℃下每分钟水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位 蛋白酶的活力单位＝A/15×F A为样品测得光密度查曲线，得相应酪氨酸μg数 F 为酶液最终稀释倍数，15为反应时间（min） [方法评估] 福林—酚法测定蛋白酶活力是生产实践和科学研究中应用的基本实验方法。 [应用意义] 水产动物消化系统内的消化酶随动物种类而异，而且消化酶的种类和在消化道中分布的差别是和动物食性相适应的。分析消化蛋白酶活力有助于了解动物对蛋白质食物的消化能力，掌握动物的营养需求。 [注意事项] 1、实验材料应新鲜，不新鲜会发生组织自溶和酶原被破坏。 2、酶液与底物作用时间、作用温度要严格控制，否则数据误差很大。 3、酶液要用适当缓冲液稀释到测定光密度在0.2—0.6之间。 [思考题] 1、试述蛋白酶活力的测定原理？ 2、为什么提取酶的组织要新鲜，提取过程要在低温下进行？ 3、试表明蛋白酶活力的定义？ 实验32 淀粉酶活力的测定（必修） [目的与原理] 掌握淀粉酶活力的测定方法，测定水产经济动物的主要消化器官肝胰脏、胃、肠内的淀粉酶活力。 淀粉酶催化淀粉分子中葡萄糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖等。在基质充分的条件下，反应后加入的碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色深浅与未经酶促反应的空白管比较其吸光度，从而推算出淀粉酶的活力单位。 [试剂与器材] 试剂： 1、0.04%可溶性淀粉 精确称取可溶性淀粉0.20g，置于20ml烧杯内，加入蒸馏水约5ml，摇匀使成淀粉混悬液，另称取无水磷酸二氢钠13.3g及苯甲酸4.3g，共置于500ml烧杯内，加入蒸馏水约250ml,煮沸后，将淀粉混悬液倒入此烧杯内，并用蒸馏水洗涤装淀粉混悬液的烧杯数次，洗涤亦倒入此烧杯内。继续煮沸1分钟，冷却至室温后倒入500ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至500ml刻度。此淀粉液pH应为7.0±0.1，在室温下保存2―3个月。 2、0.1N碘贮存液：精确称取碘酸钾(KIO3) 3.567g及碘化钾（KI）45g置于1L容量瓶内，加入蒸馏水约800ml，然后缓慢加入浓盐酸9ml，摇匀后用蒸馏水稀释至1L刻度，置冰箱内备用。 3、0.01N碘应用液：取0.1N碘贮存液50ml，用蒸馏水稀释至500ml，盛于棕色瓶中置冰箱内约保存1个月。 材料： 新鲜鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。 器材： 分光光度计、电子天平、离心机、pH测定仪，恒温水箱、匀浆器、剪子、镊子、冰块、50ml比色管若干、移液管若干，500ml容量瓶，烧杯。 [实验步骤] 1、酶提取液的制备（见实验蛋白酶活力的测定） 2、淀粉酶活力的测定 取50ml刻度比色管二只，标明为对照管，测定管。 对照管 测定管  0.04％可溶性淀粉 5.0ml 5.0ml  将两管在37℃水浴中预热2—5分钟  酶液 — 0.1ml  测定管混匀后，再置37℃水浴中反应7.5分钟  0.01N碘应用液 5.0ml 5.0ml   用蒸馏水稀释至50ml，立即混匀。用660nm或红色滤光板进行比色，以蒸馏水校正光密度0点，读取对照管和测定管光密度读数。 3、计算 淀粉酶活力单位定义：在370C、30min内，100ml酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉10mg称为一个淀粉酶活力单位。 淀粉酶活力单位/100ml＝（对照管光密度—测定管光密度）/对照管光密度×2/10×30/7.5×100/0.1=（对照管光密度—测定管光密度）/对照管光密度×800 [方法评估] 测定淀粉酶的方法有很多种，大致可分为两类：即测定底物（淀粉）的减少量和测定产物（如还原性糖）的生成量。本实验采用前者的淀粉—碘比色法。 [应用意义] 分析淀粉酶的活力有助于了解水产动物对食物中淀粉的消化能力，由于鱼虾等水产动物种类与大小的差异和所提供食物品质的不同，以及动物所处生活环境的变化，各种水产动物对食物的消化吸收有明显的差别。认识鱼虾消化酶变化特性，为研究水产种类饲料配伍提供科学依据 [注意事项] 1、0.04%可溶性淀粉溶液5ml内含淀粉量为2mg，在本法条件下，当2mg淀粉完全水解时相当于800淀粉酶单位／100ml（即：2/10 × 30/7.5 × 100/0.1 = 800）。 2、对照管内含淀粉2mg，由于淀粉溶液比较稳定，故对照管在固定比色计上的光密度读数并不改变，因而在测定中不必每次作对照管。 3、当淀粉酶接近800单位时，由于淀粉已几乎完全被水解，故加入碘液后也不再显蓝色，因此淀粉酶单位较高时（接近600单位）宜将标本稀释（2～5倍）后重新测定，并将测定结果乘以稀释倍数。 4、如淀粉溶液出现混浊或絮状物，表示淀粉溶液污染或变质，不能再用。 5、唾液内含有大量的淀粉酶，故即使是唾液的飞沫污染，也能使测定结果显著偏高。 [思考题] 1、试述淀粉—碘比色法测定淀粉酶活力的原理？ 2、影响淀粉酶活力大小的因素有哪些？ 实验33 脂肪酶活力的测定（选修） [目的与原理] 掌握脂肪酶活力的测定方法，并测定鱼、虾、贝体内消化器官肝胰脏、胃、肠的脂肪酶活力。 脂肪酶在一定条件下，将甘油三酯水解。在不同水解阶段可分别产生脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯及甘油。水解所产生的脂肪酸可以用标准的氢氧化钠滴定，用滴定值表示酶活力。 [试剂与器材] 试剂： 1、聚乙烯醇(P. V. P.)橄榄油乳化液：称取40克聚乙烯醇，加蒸馏水约1000毫升，在小火上加热，并不停搅拌，至聚乙烯醇全部溶解，冷却后定容至1000毫升。用双层纱布过滤，滤液备用。取4％聚乙烯醇溶液150毫升，加50毫升橄榄油，用高速组织捣碎机搅动6分钟，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液，保存于低温下（4℃）备用。 2、0.025M磷酸缓冲液（pH7.5）。0.025M磷酸氢二钠溶液的配置：取Na2HPO4·2H2O 4.45g溶于1L蒸馏水中，0.025M磷酸二氢钠溶液的配置：取NaH2PO4·H2O 3.45g（或NaH2PO4·2H2O 3.90g）溶于1L蒸馏水中。将0.025M磷酸氢二钠84ml与0.025M磷酸二氢钠16ml混合，即为0.025M磷酸缓冲液。 3、0.05N氢氧化钠标准溶液 4、1％酚酞指示剂：取1g酚酞溶于100ml 70％乙醇溶剂中。 5、95％乙醇 材料： 鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。 器材： 匀浆器、离心机、恒温水浴。高速组织捣碎机、酸式滴定管、滴定管架、镊子、剪子、锥形瓶、移液管、烧杯。 [实验步骤] 1、酶粗提液的制备（见蛋白酶活力的测定）。 2、取100ml锥形瓶3个，一个作为对照组，另两个为测定组 对照组 测定组1 测定组2 0.025M磷酸缓冲液（pH7.5） 5ml 5ml 5ml 聚乙醇橄榄油乳化液 4ml 4ml 4ml 95％乙醇 15ml 40℃水浴预热5—10分钟 酶液 1ml 1ml 1ml 40℃水浴保温15分钟（精确计时） 95％乙醇 — 15ml 15ml 酚酞指示剂 3滴 3滴 3滴 用0.05N标准氢氧化钠滴定至微红色，记录滴定用去ml数。 计算： 酶活力以国际单位表示，即在一定条件下，脂肪酶水解脂肪每分钟产生1微克分子脂肪酸的酶量定为一个国际单位。 脂肪酶活力单位＝（A－B）N·f t 式中： A为样品耗碱液ml数， B为对照组耗碱液ml数 N为每毫升碱液微克分子数，f为稀释倍数 t为作用时间 (分) [方法评估] 测定脂肪酶活力的方法大致可分为3类：即测定产物（游离脂肪酸）的增加量（如滴定法、比色法、分光光度法、荧光法和pH电极法等）；测定底物的减少量（如比浊法、扩散法等）；测定脂酶的实际量（如放射免疫法和乳胶凝集法等）。本实验用滴定法测定脂肪酶活力，此法灵敏度较差，样品用量大，但所需设备较简单，可随时进行检测。 [应用意义] 脂肪酶是动物消化脂肪的重要酶类其分泌量和活力与动物对脂肪的消化、吸收、利用有关。水产动物肝胰脏或胰脏是脂肪酶的主要分泌器官，胃肠粘膜及肝脏亦能分泌，有的鱼类幽门垂中脂肪酶活力最高。测定水产动物各部位脂肪酶活力有助于研究、分析其对脂肪的消化能力及各部位消化功能状况。 [注意事项] 1、使用聚乙烯醇的聚合度为1000－1750，如聚合度低，乳化效果差。橄榄油乳化液在冰箱中保存三天左右仍能保持稳定。 2、反应终了加乙醇可停止酶作用和溶解脂肪酸，以利滴定，乙醇用量以不低于总容量60%为宜。 [思考题] 1、试述脂肪酶在机体内的分布及脂肪酶的作用机制？ 2、试分析实验条件下脂肪酶活力变化的意义？ 3、为什么提取酶的组织要新鲜，提取过程要用重蒸馏水？ 第四节 吸收与代谢机能实验 实验34 耗氧率的测定（必修） [目的与原理] 掌握测定鱼类等水产动物耗氧率的方法，并用此法测定水产动物的耗氧率，分析和计算被测动物的代谢率（或代谢强度）。 耗氧率经常被直接用来表示机体的代谢强度，因为机体的代谢率与它们的耗氧率呈正相关性，这是一种简便的测算方法，对于养殖工作者来说是非常适用的。除此以外，耗氧率也是间接测定能量代谢的重要指标之一。 测定水生生物耗氧率的仪器装置及测定方法有多种。常用的有两类：一是静水式，二是流水式。本实验采用的是静水密闭测定法。 [试剂与器材] 试剂： 1、硫酸锰：称取52gMnSO4·5H2O（或37gMnSO4·H2O），用90毫升蒸馏水溶解，然后稀释到100ml。静置数日，取清液使用。 2、碱性碘化钾：50gNaOH(或70克KOH)及15g固体KI，分别溶于50及35ml纯水中。然后将两液混合，冷却后稀释到100ml。放入到聚乙烯瓶中盖严保存，不可用磨口试剂瓶保存。 3、浓H2SO4：市售比重1.84的试剂。 4、HCL（1：1） 5、0.05N Na2S2O3：称取2.5gNa2S2O3·5H2O ,用煮沸后冷却的蒸馏水配制成500ml，加入NaOH 0.2g使溶液呈碱性，减慢Na2S2O3分解，贮存于棕色瓶中，浓度要标定。 6、0.5％淀粉：称取1g可溶性淀粉于300ml烧杯中，用少量纯水调成悬浊液。冲入刚煮沸的200ml纯水，并再煮沸即可。 材料： 鲫、罗非鱼或其它水生动物。 器材： 水产动物呼吸实验装置；采样瓶（或磨口试剂瓶）30ml若干；三角锥瓶100ml若干；微量滴定管；乳胶管；滴定架；蝴蝶夹；罗纹水止；移液管；吸耳球。 [实验步骤] 1、安装呼吸室（见图1-8-4或1-8-5）：呼吸室为一个巨塞大口玻璃瓶，容积根据动物个体大小而定。要求是水生动物在呼吸室内活动自如，在实验时间内动物保持充足的氧供应。呼吸室入口装二只玻璃管，分别为入水管和出水管，另外呼吸室上面有温度计可测量呼吸室内的水温。安装时，首先将呼吸室充满水，放入实验动物（实验动物放入前需称量），使测试动物稳定半小时方可开始实验。
图 1-8-4 静水密闭法装置
图1-8-5流水密闭法装置 2、测定实验开始时水中溶解氧（初溶氧），及实验结束时水中溶解氧（末溶氧）。 3、溶氧测定方法：用30ml细口瓶（具塞磨口瓶）作为水样瓶，用虹吸法取样一满瓶水样后，立即加硫酸锰3滴，碱性碘化钾3滴，盖上瓶盖（瓶中不可有气泡），上下摇动约1分钟。静置，待沉淀下降到中部后，加浓硫酸5滴，盖上盖再摇匀。取酸化后水样15ml于锥形瓶中，用0.050N硫代硫酸钠滴定到溶液为淡黄色时，加0.5％淀粉5～6滴，再继续滴定到蓝色刚刚消失。记录滴定消耗体积V（毫升）。 4、耗氧率计算： NV 溶解氧（mg/l）= ___________ ×1000 V样 (初溶氧－末溶氧) 耗氧率（O2g/kg/h）= ____________________________________×呼吸室体积 （动物体重×实验时间） [方法评估] 测定耗氧率有流水密闭法和静水密闭法，该法属静水密闭法，方法简单易掌握，但不能连续测定耗氧率的变化。如果要测定水产动物24小时的耗氧率变化需用密闭式流水测定法。 [应用意义] 该实验通过测定鱼类等水生动物的耗氧率，可以反映动物体通过生物氧化过程产生的能量，从而可以衡量机体能量代谢程度。 [注意事项] 1、水中溶氧浓度与耗氧率存在正相关，所以在测定耗氧率时，每次测定时间一般为1-2小时。 2、整个实验过程应使实验动物保持安静状态，避免运动、紧张等因素影响实验结果。 3、如果要通过耗氧率测定其产热量，还要同时测定二氧化碳的生成量，求其呼吸商，从而计算产热量。 [思考题] 1、采用静水式和流水式方法进行耗氧率测定各有何优缺点？ 2、为何用静水式测定耗氧率要在一昼夜采取3—4个的时间段进行测定，并取其平均值，为什么？ 实验35 氨氮排泄率的测定（必修） [目的与原理] 掌握水产动物氨氮排泄率的测定方法，并通过测定鱼类等水生动物的氨氮排泄率来计算蛋白质的代谢率。 水生生物在进行能量代谢时，消耗体内的蛋白质，蛋白质分解后大部分产物以氨氮形式排入水中，使水中氨氮含量增加，测定一定时间内水中氨氮含量的变化即为氨氮排泄率。 氨氮量的测定依据游离态的氨或铵离子与纳氏试剂反应，生成黄棕色络合物。该络合物的色度与氨氮的含量呈正比，可用分光光度计测定。 [试剂与器材] 试剂： 1、 0.35%的硫代硫酸钠：称取3.5g硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O）溶于水，稀释至1000ml。 2、25％的氢氧化钠溶液 3、 纳氏试剂：称取16g氢氧化钠溶于50ml水中，冷却至室温。称取7.0g碘化钾和10.0g碘化汞，溶于少量水中。然后将此溶液在搅拌下缓慢加入到氢氧化钠溶液中，用水稀释至100ml,于暗处静置24小时，倾倒出的上层清液，贮存于比色瓶中，在暗处存放。有效期可达一年。 4、50％的酒石酸钾钠溶液：称取50g酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O）溶于水中，煮沸除氨，冷却后用水稀释至100ml。 5、氯化氨标准贮备液：称取经100～110℃干燥2小时的氯化铵3.8190g溶于水，移入1000ml容量瓶中，稀释至标线，混合均匀。此溶液1.00ml含1.000mg氨态氮。 6、氯化铵标准溶液：吸取1.00ml氯化铵标准贮备液于1000ml容量瓶中，用水稀释至标线。此溶液1.00ml含0.010mg氨态氮。 器材： 水生动物呼吸室，及其耗氧率测定装置，分光光度计，比色管（50ml），比色管架，移液管，10mm比色杯， [实验步骤] 1、安装呼吸室（见实验86） 2、测定实验开始时水中氨氮值（初氨氮量）及结束时水中氨氮值（末氨氮量），同时记录实验时间 3、水中氨氮测定方法 （1）取清洁水样或预处理后的澄清水样50ml于50ml比色管中，加入50％得酒石酸钾钠溶液1.0ml,混合均匀。再加入纳氏试剂1.0ml,摇匀。放置10分钟后进行比色。 （2）在一组50ml比色管中分别加入氯化氨标准溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00、10.00ml，加水至标线，按步骤1.显色。 用10mm比色杯，在波长420nm处以水作参比，测定水样及标准系列的吸光度。同时以50ml水代替水样按与水样完全相同的操作步骤（包括预处理）进行空白试验，并测定其吸光度。 （3）绘制标准曲线，标准系列所测得的吸光度减去试剂空白（零浓度）的吸光度值，绘制吸光度对氨氮含量（μg）的标准曲线。 （4）结果计算： C N (mg/L) = m/V 式中m------从标准曲线查得的水样氨氮含量（ug） V------水体体积（ml） 4、氨氮排泄率的计算 （末氨氮量－初氨氮量） 氨氮排泄率＝ ____________________________________× 呼吸室体积 动物体重×实验时间 [方法评估] 这是一种经典的方法，简便、易于操作。 [应用意义] 水产动物的排泄氮主要是氨氮，通过测定水产动物的排氨率，可以反映机体对蛋白质的排泄量；另外通过测定排氨率，结合食入氮、粪氮和体内沉积氮的测定，可以研究水产动物的氮收支。 [注意事项] 1、操作应在无氨的环境中进行。 2、氨氮含量大于2mg/L时，水样应先稀释再进行测定。 3、样品中含有悬浮物，余氯金属离子硫化物和有机物等对测定有干扰，处理方法如下： （1）含有余氯的水样加入适量的硫代硫酸钠溶液，每0.5ml可除去0.25mg余氯。 （2）水样浑浊，有色或含硫化氢或易为碱沉淀的金属离子时，取100ml水样于具塞碘量瓶中，加0.3％硫酸锌溶液1ml和25％氢氧化钠溶液0.1～0.2ml，使水样pH值约为10.5，混合均匀，放置10分钟，用滤纸过滤，弃去2～5ml初滤液后，接取滤液备用。 （3）加50％酒石酸钾钠溶液络合掩蔽钙镁等金属离子以消除干扰。 （4）对污染严重的水样，或用凝聚沉淀及络合掩蔽后仍浑浊带色的水样，应采用蒸馏—纳氏试剂分光光度法。 [思考题] 1、测定氨氮排泄率应注意哪些问题？ 2、如何通过氨氮排泄率来研究水产动物的氮收支？ 附录 常用试剂配制 1、生理溶液盐溶液 成分 生理盐水 仁氏（Ringer）液,两栖类用 乐氏（Locke）液，哺乳类用 台氏（Tyrode）液,哺乳类用更适于小肠   两栖类用 哺乳类用     氯化钠 氯化钾 氯化钙* 碳酸氢钠 磷酸二氢钠 氯化镁 葡萄糖** 蒸馏水*** 6.5-7.0 8.5-9.0 6.5g 0.14g 0.12g 0.20g 0.01g — 2.0g 9.0g 0.42g 0.24g 0.1-0.3g — — 1.0-2.5g 8.0g 0.2g 0.2g 1.0g 0.05g 0.1g 1.0g   均加到1000ml  *氯化钙须先配成10%或20%的溶液后，再按需要量加入已制备好的生理溶液中，以免产生不溶解的磷酸钙而使溶液混浊。 **葡萄糖根据实验要求可用可不用。 ***蒸馏水应当新鲜的。pH在7.2-7.8之间。 ２、鱼用生理盐水 最常用的BurnstocK淡水鱼生理盐水配法： 先配制三种贮备液各500ml： A液：NaCl:29.5g KCl:1.25g MgSO4·H2O：1.45g KH2PO4：8.00g B液：CaCl2：1.4g C液：NaHCO3：10.6g。使用时，A、B、C液各取10毫升加入到70毫升蒸馏水中。 第三部分 研究设计型实验 研究设计型实验主要是应用生理生化等基础知识和基本操作技能进行与水产养殖专业生产与科研实践相关的生态生理、疾病防治、营养饲料等方面的研究。 在开展研究设计型实验之前教师可根据已有的实验条件给学生提供选题范围和实验要求等。由学生查阅相关资料、立题并制定实验设计与方案交指导教师审阅与讨论。然后经修改后方能实施其基本程序详见附录。 第一节 疾病对水产动物生理功能影响的研究实验 [目的意义及实验要求] 一、目的意义 现代病因学认为疾病是由原因和条件综合作用的结果，原因是引起疾病不可缺少的因素，并且决定了疾病的特异性。它与相应的疾病有着必然的因果关系；而条件则往往通过作用于致病因子或改变机体的反应性，对疾病的发生、发展起促进或阻碍作用。在分析水产动物疾病的病因和条件时，首先要考虑到这些疾病因子和条件对其生理功能的影响程度，反过来也可通过某些生理功能的改变来分析病因和致病条件。本实验采用不同方式对水产动物进行人工感染疾病来探讨和研究致病因子和致病条件对其生理功能（各项生理生化指标）的变化原因及其规律。完成本实验需要学生综合运用所学的生理学、生物化学、水产动物疾病学、病理学、病理生理学等知识。因此，可培养学生综合应用所学各门相关知识以及从事相关科研实践的能力。 二、实验要求 根据实验需要按排实验时间，一般在人工感染情况下慢毒实验一般要进行一到两周。分别得到24h、48h、72h、96h、1周、2周的各项生理生化指标值，急毒实验要进行4天，分别得到24h、48h、72h、96h的各项生理生化指标值 实验人员分组：每大组6到8人，每小组2人。每大组可选择同一研究课题后按不同的研究内容分成3到4个子课题，每小组一个子课题。以大组组织讨论和制定实验方案、准备实验、饲养动物、进行人工感染并统一采样，然后个小组按不同的实验内容完成各项指标的测定与数据整理，独立撰写实验报告。 [主要内容] 一、致病因子与条件致病机制的分析与研究 不同致病因子 1细菌性疾病 2病毒性疾病 3寄生虫病 4其它因子（如农药，贝毒等） （二） 条件 1温度 2溶氧 3水质条件 4有机物污染 5农药污染 6其它 （三）疾病防治中不同药物，生物制剂等的应用及防治效果 1不同药物（各种抗生素及其它等） 2不同免疫增效剂（疫苗，复合疫苗，生物制剂，中草药及其它等） 3不同的饲料添加剂 　二、药物、免疫增效剂对提高水产动物抗病力的研究 ［参考选题］ １．中国对虾（或南美白对虾）红腿病的发病机制的分析研究 ２．中国对虾黑鳃病几项生理、生化、免疫指标变化的分析研究 ３．鲤肠炎病几项生理、生化指标变化的分析、研究 ４．草鱼出血病几项生理、生化、免疫指标变化的分析、研究 ５．寡糖类免疫增效剂对提高中国对虾抗病力的影响及其作用机制 ６．微生态制剂对提高鲤鱼抗病能力的影响及作用机制 ７．抗生素对鲤免疫机能影响及作用机制 ［设计提示］ 一、实验动物的选择：鱼、虾、贝等水产动物均可选择但要求同一来源、健康，体重、体长均匀，一般鱼类推荐使用鲤，甲壳类使用中国对虾和南美白对虾，贝类使用海湾扇贝。 二、实验方式 1实验动物暂养：经检测健康的实验动物暂养于循环水族箱内，暂养时间可按实验方案而定，一般1到2周。 2.人工感染疾病：感染方式可采用注射、投喂、浸泡等。 3.分不同时段采取实验样本 4.进行各项生理生化指标的测定 三、实验组的设置 四、感染病源的确定 采用的细菌或病毒包括各种细菌性疾病的病原菌及病毒性疾病的病虾（鱼、贝）的组织抽提液等，推荐使用鱼类的烂鳃、肠炎等病原菌、虾的红腿病、黑鳃病等的病原菌或本实验室已有的病原菌等。 五、感染病源浓度的确定 根据实验方案和预实验结果选择并按100、10-1、10-2、10-3…间差配置，每个浓度梯度需用5尾以上。 六、实验条件的控制 1.水温 2.水质条件 3.光照条件 ［讨论题］（根据实验设计选择） 1. 根据实验结果讨论不同致病因子（细菌、病毒、寄生虫、其它等）对鱼（或虾、贝等）生理功能（肝功能，肾功能，代谢功能，消化吸收功能，抗病力，抗逆性等）的影响及其作用机制（影响了肝脏功能或造成排泄失衡，代谢紊乱等）。 2. 根据实验结果论述，致病因子（某一致病因子）在不同致病条件下（温度、pH、水质条件等）对鱼（虾、贝）生理功能的影响及其作用机制。 3. 根据实验结果论述不同药物（或免疫增效剂、添加剂等）对鱼(虾、贝)生理功能的影响及其作用机制。 4. 根据实验结果论述不同药物（或免疫增效剂等）对感染致病因子的鱼（虾、贝）生理功能的影响及其作用机制。 5. 根据实验结果论述影响水产动物肝、肾功能的因素有哪些其作用机制。 6. 根据实验结果论述影响水产动物抗病力、抗逆性的因素有哪些？其作用机制？ 7. 根据实验结果论述水产动物消化吸收功能、代谢功能及其生长的因素有哪些？其作用机制? 　　　8. 设计一个多处理因素和多层次的实验证明不同致病因子和不同致病条件对水产动物生理功能的影响其设计要点是什么？如何处理多因素之间的关系，以及如何设计更具科学性。 ［参考文献］ １．尾崎久雄著．许学龙等译．鱼类血液与循环生理．上海科学技术出版社．１９８２． ２．蔡完其．孙佩芳．三种鲫鱼对爆发性鱼病的抗病力．水产学报．１９９３．１７（１）：４５－７０ ３．杜爱芳．中国对虾血细胞吞噬功能的研究．中国水产科学．１９９７，４（２）：１． ４．李光友．中国对虾疾病与免疫机制，海洋生物篇．１９９５，４（３）：１ ５．刘树清．免疫多糖对中国对虾血清溶菌酶磷酸酶和过氧化氢酶的作用．海洋与湖沼．１９９９，３０（３）：２８０ ６．刘岩．聚甘露糖醛酸对中国对虾免疫相关酶活性和溶菌、溶血活性的影响．水产学报．２０００，２４（６）：５５２． ７．陶保华等．副溶血弧菌对斑节对虾和日本对虾的致病力的研究．中国水产科学．２０００，７（３）． ８．王雷．中国对虾血淋巴中的抗菌、溶菌活力和酚氧化酶活力的测定及其特性的研究．海洋与湖沼．１９９５，２６（２）１７９－１８５． ９．王茜、刘凤岐．中国对虾黑鳃病病原及病变机理的研究．动物科学与动物医学．２０００，１７（５）． １０．吴惠仙．日本对虾黑鳃病几种同工酶的变化与病理分析．海洋湖沼通报．２００２． １１．曹又杰．生物技术在饲料业中的应用前景－饲料添加剂对提高鲤抗病力的研究．中国微生态学杂志．１９９４，６（６）：２７－３３． １２．桂远明、吴垠等．复方回春生对鲤爆发性肝炎治疗效果的初步研究报告．中国微生态学杂志．１９９２，４（２）：４７－５０． １３．桂远明、何志辉、吴垠等．生态制品（Jy10、Jy31复合制剂）饲料添加剂对提高鲤抗病力的研究．中国微生态学杂志．１９９４，６（６）：２７－３３． １４．吴垠、王斌等．微生态调节剂对提高对虾抗病力的研究．中国微生态学杂志．１９９６，８（１） ：28-31． １５．华雪铭、周洪琪等．饲料中添加芽孢杆菌和硒酵母对异域银鲫的生长和抗病力的影响．水产学报．２００１，２５（5）：４４８－４５３． 第二节 环境因子对水产动物机能影响的研究实验 [目的意义与实验要求] 一、目的意义 水产养殖中水环境因子对水产动物影响是个非常重要的因子。同时随养殖化的发展水环境因子越来越南以控制，因此对水环境因子对水产动物的影响成了人们研究的重要课题；水环境因子大多是水产动物致病的条件如温度、pH、理化因素、农药等，特别是农药的施用，流入江河、湖泊甚至海洋造成污染直接影响了水产动物疾病的发生发展及其存活。 本实验通过将水产动物饲养在不同水温条件下，观察和检测相关的生理生化指标的变化来分析、研究水产动物在低温或高温下死亡的生理原因及其生理功能变化的原因、变化规律；影响水产动物生长、发育存活的温度范围。 二、实验要求 [主要内容] 在设计这类研究实验时须注意。一是水环境因子作为致病条件的致病性，即变化在什么范围内是无害或少害，超过什么范围即有害，二是各种水环境因子与致病因子的综合作用，对水产动物生理功能的影响程度，三是相应生理生化指标的选择，四是水环境因子的改良对水产动物生理生化指标变化作用或影响。 （一）水环境理化因子对水产动物机能影响及其作用机制的研究 1 温度、pH值、溶氧 2 水质条件（氨氮、亚硝态氮、硝态氮、有机物等） （二）水体污染对水产动物机能影响及其作用机制的研究 1农药 2重金属 3 其他非生物因素 （三）其他生物因子对水产动物机能影响及其作用机制的研究 1藻毒（或贝毒） 2其他有毒水生生物 （四）净水剂的净水作用和对提高水产动物免疫能力的研究 [参考选题] 　1．温度对鲤免疫能力的影响 　２．低温条件下鲤、鲫、鲢、鳙抗寒力的比较研究 　３．氨氮、硝态氮、亚硝态氮对鲤抗病力影响的研究 　４．农药对南美白对虾几项指标的影响 　５．水质净化剂对提高中国对虾免疫力的影响及作用机制 ［设计提示］ 　１．实验动物的选择 　２．实验方式 　３．实验组设置 　４．环境因子的确定 　５．各因子浓度的确定 　６．实验条件的控制 ［讨论题］ 　1. 根据实验结果论述不同环境因子及其变化对水产动物生理功能的影响及其作用机制。 　2. 试论述环境因子恶劣（如低温氨氮过高，亚硝酸，亚硝酸盐过高）导致水产动物死亡的生理原因。 　3. 试论述农药对水产动物生理功能的影响及其作用的生理机制，损害最严重的是机体的何种功能。 　4. 水产动物对恶劣的水环境是否具有抵抗能力，根据你设计的实验结果论述机体抗逆性的高低及其生理机制。 　5. 如何证明各种水质改良剂（净化剂）的净水效果，要从化学和生物两方面实验结果进行论述。 　6. 设计一个判断导致死亡的原因属于疾病还是环境因子的实验，要点是什么，处理因素是单因素还是多因素，如何处理各因素之间的关系。 ［参考文献］ １．邓会山、桂远明等．鱼血红细胞膜流动性的研究．大连水产学院学报．１９９３，８（１）：９－１３． ２．桂远明、吴垠等．几种养殖鱼类越冬生理生化指标的变化?－血液指标及代谢率．大连水产学院学报．１９９４，９（３）：１５－２７． ３．吴垠、桂远明等．几种养殖鱼类越冬生理生化指标的变化ш．大连水产学院． ４．丁美丽．有机污染对中国对虾体内外环境的研究．海洋与湖沼．１９９７，２８（１）：７－１１． ５．龚瑞忠、蔡道基．拟除虫菊酯类农药对水生生物的毒性研究．环境科学研究．１９８８，１（４）：３９． ６．贾翠红、汝少国．久效磷对真鲷中枢神经系统中乙酰胆碱酯酶活性的影响研究．海洋环境科学．１９９９，３（２）． ７．孙建军．氨氮对中国对虾抗病力的影响．海洋与湖沼．１９９９，３０（３）． ８．唐学玺．蒽队黑鲪超氧化物岐化酶活性的影响．水产学报，２０００，２４（３）． ９．魏海辉、汝少国．有机磷农药对鱼类的毒性效应及内分泌扰乱作用．海洋科学，２００２，２６（９）． １０．沈晓民等．团头鲂血液指标与水环境的关系．生态学报，１９９１，１（３）：９２－９４． １１．王鸿泰．池塘中亚硝酸盐对草鱼种的毒害及防治．水产学报，１９８９，１３（３）：２０７－２１３． １２．余瑞兰等．分子氨和亚硝酸盐对鱼类的危害及其对策．中国水产科学，１９９９，６（３）：７３－７７． １３．王明学等．亚硝酸盐对团头鲂鱼种血红蛋白含量和耗氧率的影响．淡水渔业，１９９７，２７（１）：１４－１５． １４．陈家长等．水体中ＮＨ３－Ｎ对建鲤非特异性免疫功能的影响。湛江水产大学学报２０００，２０（３）：１３－１６。 １５．刘法生等。敌百虫对鲤鱼组织乙酰胆碱酯酶和脲三磷酸酶活力的影响．环境科学研究，１９９７，１０（３）：２１－２５． １６．王兰等．镉在河蟹五种组织器官的积累及对脂酶同工酶的影响．动物学报，２００１，４７（专刊）：９６－１００． 第三节 营养对水产动物生长、发育、免疫功能影响的研究实验 ［目的意义及实验要求］ 一、目的意义 　　水产动物的养殖除了疾病防治和水质监控外，更重要的是饲料及其营养价值，水产动物营养饲料研究的理论基础，则是其营养生理生化和营养要求；配合饲料及其添加剂的营养评价；促长效果及其机理。因此从应用和学术两方面目的来讲，营养生理的研究都是十分重要的。 学术上讲要通过机体生长、发育和体内的化学变化来认识养殖水产动物的营养生理功能。营养生化变化及其营养需求来阐明饲料及其添加剂的营养对水产动物机体的影响；应用上讲则是要为高效低成本人工饲料的配制提供理论依据，从而提高养殖生产水平。 １．通过将水产动物饲料于水环境相同（或基本相同）条件下，投喂不同的配合饲料观察，检测相关的生理生化指标来分析、研究不同营养成分的饲料对水产动物生长生理功能的影响及其促长机理。 ２．通过将水产动物饲养于水环境相同（或基本相同）的条件下，投喂不同的饲料添加剂（生物类、化学类、其它等）观察、检测相关的生理生化指标来分析研究各种饲料添加剂对水产动物生长、生理功能以及抗病力、抗逆性的影响及其作用机理 ３．通过将投喂不同饲料（或饲料添加剂）的水产动物饲养在不同水环境条件下（高氨氮，农药或其它因子等）下观察和检测相关生理生化指标来分析、研究水环境条件对水产动物饲料（或添加剂）营养生理功能的影响及其作用机理。 二、实验要求 ［主要内容］ 一、饲料营养成分的分析及其评价 1饲料中蛋白质、脂肪、纤维、灰分比测定及其营养评价 2饲料矿物质的测定与分析 二、配合饲料的配方设计及其营养分析 1配方设计 2营养分析 三、机体营养分析及其营养需求 1肌肉、肝脏等组织生化分析 2不同营养物质的生理功能 四、不同饲料及添加剂对水产动物生长、抗病力、抗逆性的影响及其作用机制 1促长作用及其机理 2抗病抗逆作用及其机理 ［参考选题］ １．不同人工配合饲料营养成分的分析及其营养评价 ２．不同饲料添加剂成分分析及其营养评价 ３．微生态制剂对水产动物生长的影响及其作用机制 ４．寡糖对水产动物免疫力的影响 ５．饥饿对美国红鱼的消化、代谢机能的影响 ［设计提示］ １．实验动物的选择 ２．实验方式 ３．实验组设置 ４．营养物质种类的选择 ５．营养物质浓度用量的选择 ６．实验条件的控制 ［讨论题］ 1． 根据其实验结果论述水产动物对各种物质的要求量，用什么方法确定其需求量。 2． 如何评价饲料的营养价值（蛋白质营养评价为主）要评价蛋白质的营养价值，设计实验的要点及内容如何？ 3． 在营养研究中为什么要在可控环境中可控因素包括哪些，如何控制？ ４．多因素正交方式如何进行设计，设计的要点是什么，举例说明。 ５．根据实验结果论述不同饲料（或饲料添加剂）对水产动物生长生理功能、抗病力、抗逆性的影响。 ［参考文献］ １．胡东兴等．微生态制剂及其作用机理．中国饲料，２００１，（３）：１４－１７． ２．桂远明＼何幽峰等．生态制品对鲤生长的影响及其作用机理的研究．中国微生态学杂志，１９９３，５（４）：１１－１６． ３．潘康成等．微生物添加剂对鱼类生长和消化酶活性的影响研究．饲料工业，１９９７，１８（１０）：４１－４２． 实验目的 通过对水产动物（鱼、虾、贝）施用（注射，浸浴，投喂，灌喂等）不同药物，免疫增效剂，添加剂后观察其活动情况死亡情况及检测相关生理生化指标的变化、设计实验来分析、研究上述药物增效剂、添加剂等对水产动物的抗病力、抗逆性、营养、生长、代谢等生理功能的影响。 实验目的 通过对感染致病因子前、后的水产动物施用（注射、浸法、投喂、灌喂等）不同药物免疫增效剂，添加剂等后观察其活动情况死亡情况及检测相关生理生化指标的变化，设计实验来分析研究，上述药物等对感染疾病的水产动物抗病力、抗逆性、营养、生长、代谢等生理功能的影响。 处理因素提示：在处理因素方面更复杂，有不同水平(感染前、感染后、空白等不同计量、浓度)，也有不同因素（不同药物等）不同条件（温度等），不同处理方法（注射等）因此在设计时必须根据生物统计学原理周密考虑。 二 设计提示 （一）立题提示 可根据立题原则和上述实验目的要求自行选择处理因素、处理方法、测定指标或根据生产实践需要和已掌握的资料等来立题。立题要简明扼要，不要超过25个字，上述五个实验中可立题若干个，如生态制剂对鲤抗病力的影响；中国对虾红腿病几项生理指标的变化；中草药对南美白对虾抗病力的影响等等。 （二）设计思路提示 首先是实验组的设置：实验组的设置要根据已选择的处理因素（致病因子，致病条件，处理方法不同药物、不同检测指标等）单因素，多因素，不同水平与不同因素等按设计原则周密考虑，非处理因素要严格控制。 其次是实验指标的选择，要根据实验目的要求和处理因素选择相应生理生化指标，如抗病力，抗逆性等多选择相关的血液生理生化和免疫指标生长、营养、代谢等多选择相关的血液生理生化指标、消化酶活力、增重、物质转化、能量积累（代谢率等）消化吸收率等指标。 第三是实验技术路线与实验方法的选择。根据实验目的选择的处理因素。实验指标选择简便易行的实验方法和层次较少、方法简捷的综合实验技术路线 处理因素提示：温度因素必须设定变化幅度可按自然变化幅度、人为设定和变温恒温16，16±4℃，20，20±4℃，24，24±4℃，28，28±4℃等，也可设恒温变化幅度，4℃，15℃，20℃，25℃，30℃等或单设的低温0℃，2℃，4℃，6℃，8℃等。 实验二 水质化学因子对水产动物生理功能的影响 实验目的 通过将水产动物饲养在不同水化因子条件（氨氮、亚硝态氮、硝态氮、其它等）下观察和检测相关的生理生化指标的变化，设计实验来分析、研究水产动物在高氨氮、亚硝态氮等条件下死亡的原因及其生理功能变化的原因、变化规律；水产动物对上述水质化因子的耐受能力及范围。 实验对象：鱼、虾、贝 实验药品与器材：按实验目的和检测指标选订 实验方法与步骤：按实验目的和检测指标的要求选择相关的实验方法 实验指标提示：死亡率，半致死浓度，血液生理生化指标，免疫指标，肝功、肾功、抗病力和抗逆性指标等 处理因素提示：可采用单因素或多因素，慢性或急性，不同浓度梯度等。 验目的 通过将水产动物饲养在不同水化因子和不同温度条件下观察和检测相关生理生化指标的变化，设计实验来分析，研究温度和水化因子对水产动物生理功能的综合影响（协同和拮抗） 实验目的 通过对水产动物注射（浸浴，投喂等）不同致病因子后饲养在不同水化因子（或其它水环境因子）条件下观察和检测相关生理生化指标变化，设计实验来分析研究，不同水质因子对致病因子致病性的影响及水产动物在不同水质条件下的抗病力、抗逆性。 处理因素提示：处理因素更为复杂有不同水平、不同因素多重交叉，如不同致病因子（及其不同剂量）不同水质条件（及其变化幅度）不同作用时间（急性、慢性）等，必须抓住主要因素依据统计学原理周密考虑。 实验五 不同农药对水产动物生理功能的影响 实验目的 通过将水产动物饲养在含有不同剂量不同农药的水体中，也可采用注射投喂低剂量农药），观察和检测相关生理生化指标的变化，设计实验来分析、研究农药对水产生理功能的影响及水产动物的抗逆性。 实验对象：鱼、虾、贝 实验药品与器材：按实验方法和检测指标选订 实验方法与步骤：按实验目的和检测指标的要求选择相关实验方法 实验指标提示：死亡率，半致死浓度（量），血液生理生化指标肝功、肾功、抗病力和抗逆性相关指标 处理因素提示：可采用不同浓度的单因素进行急性和慢性实验。 实验六 不同水质净化剂对水产动物生理功能的影响 实验目的 通过将注射（浸浴、投喂）不同致病因子和未注射（浸浴、投喂）致病因子的水产动物饲养在用水质净化剂处理和未用水质净化处理的水体中观察和检测相关生理生化指标的变化。先将水产动物也可对饲养在不同水质净化剂处理（或未处理）水体中注射或浸泡或投喂不同治病因子设计实验来分析、研究上述各处理因素对水产动物生理功能的影响及水产动物的抗逆性的变化机理。 实验对象：鱼、虾、贝 实验药品与器材：按实验目的和检测需求选订 实验方法与步骤：按实验目的和检测指标选择相关实验方法 实验指标提示：死亡率，半致死浓度（50LD）和半数有效量（ED50），血液生理生化指标（肝功、肾功、抗病力和抗逆性等） 处理因素提示：均为多处理因素必须按统计学要求周密考虑，合理安排，可进行急毒和慢毒实验。 二 设计提示 （一）立题提示 可根据立题原则和上述实验目的要求自行选择处理因素处理方法、测定指标或根据生产实践需要和已掌握的资料等来立题。立题要简明扼要，如几种（或一种）农药对鲤抗逆性的影响；亚硝酸盐对鲤几项血液指标的影响；温度对鱼类几项血液指标的影响；水质净化剂对南美白对虾抗逆性的影响等。本单元至少可立出30—40不同的课程 （二）设计思路提示 首先是实验组的设置：选择处理因素时尽量选择单因素，如要选多因素，应设置不同的水平不同的因素，交叉因素必须设置得当和符合统计学原理，样本不能过多（工作量太大难于完成），又不能太少（其实验结果难以说明问题），非处理因素要严格监控。 其次是实验指标的选择，不同的处理因素，选择的指标应不同，一般可选死亡率和肝肾功能的指标，如红细胞脆性流动性转氨酶，尿素氮等，血液指标和组织中某些酶类如：胆碱酯酶、乳酸脱氢酶、酸、碱性磷酸酶，抗氧化酶系统中的酶类及其同工酶等抗病力、抗逆性指标。 第三技术路线和实验方法“尽量选用经典成熟的方法和简便的方法，技术路线也要选择便捷的途径。最好采用急毒实验。 首先是实验组的设置，与选择的处理因素和水平有关，单因素比较简单，多因素多用正交实验，需要根据统计学原理考虑。 其次为实验指标的选择，既需选营养生理指标如消化吸收代谢、能量转化率等又需要检测一些抗病力抗逆性转换率等指标和免疫指标等，要按主题的主要目的选择有价值，能说明问题的生理生化指标。 第三在设计实验时非处理因素的监控十分重要在单一说明不同饲料的营养价值时必须将环境因子（水溶、水化条件、对照等）控制在相对稳定又一致的条件下饲料管理，投喂次数，换水，充气等也要求一致。 第四技术路线尽力选层次少，简捷的途径实验方法尽量选择经典的便于重要的方法。 第三节 营养和非营养因素对水产动物生长和物质利用影响得研究形试验 [目的意义及实验要求] 目的意义 本实验的目的是培养学生独立进行营养学实验得初步能力，包括实验方案的设计、实验分组、日粮配制、实验独立操作的正确实施、实验条件控制与观测、数据处理等。水产养殖学专业的毕业生在从事水产养殖、饲料研究、生产与销售等工作时都需要掌握这方面的知识和技能。下面一些任务在今后的工作中是常常会遇到的：研究各种饲料添加剂（酶制剂、微量元素和维生素、微生态制剂、寡糖等）对水产动物生长、消化、物质利用、消化酶活力和免疫机能等影响，研究不同蛋白源、不同脂肪源、不同糖类等对水产动物生长、消化、物质利用等影响，研究非营养因素（如饥饿、温度、盐度等）对水产动物生长、消化、物质利用等影响，研究水产动物的营养需要量时，都需要了解或者直接进行水产动物的营养学实验。 实验要求 根据实验时间的长短选择不同类型的实验以及测定不同的实验指标。有关营养和非营养因素对生长的影响和测定营养需要量方面的实验，实验期一般要在四周以上。对消化酶活性和消化吸收、物质利用方面的实验可相对短一些，比如进行7-10天实验即可。用方差分析等数学分析手段处理实验数据，以研究各种因素对实验指标有无影响。用正交实验法处理营养需要量数据，得到水产动物的营养需要量。 工作量很大的选题，可以将实验内容分成小课题。6-8人一大组，2人一个小组。以大组组织讨论、确定实验方案；按小组分工，每个小组完成一个小课题的全部实验。小组的数据全大组共享，数据处理各小组分别完成。实验报告每人独立撰写。 二、内容提要 实验设计 可采用单因子实验设计、二因子实验设计、正交实验设计。单因子实验设计主要研究单个因子的影响，二因子实验设计还可以研究不同因子间的交互作用，正交实验设计主要研究营养物质的需要量。具体采用何种实验设计，可根据不同因子、不同实验目的进行选择。 实验方式 实验在水族箱中进行。每天换水，每次换水三分之一。每天投饵两次。 试验日粮 日粮的配制要参考实验动物的营养需要、结合实验的目的进行配制。在各种营养因素对实验指标的影响的实验中，除了要考察的因素，日粮中其它营养指标均应一致。在各种非营养因素对实验指标的影响的实验中，各组的实验日粮均应相同。在研究营养需要量时，一般同时研究水产动物对蛋白质、脂类、糖类、粗纤维等的营养需要；日粮的配制一般采用精制饲料。 实验动物 实验动物可根据实验需要和实验条件进行选择。一般采用某些方面指标没有研究过的动物进行研究。实验前在实验室暂养一段时间，暂养时间根据不同的动物、不同的驯养程度灵活掌握，一般采用暂养两周，以鱼正常摄食为准。 因子梯度的确定 在各种因素对实验指标的影响的实验中，一般采用两个以上的梯度。 在营养需要量的实验中，一般采用三个梯度。 实验条件的控制 可采用常温实验法和恒定温度实验法。前者一般在夏季进行，后者可在任何时间进行。恒温控制一般在22度左右，不同的动物可灵活掌握。 参考文献 牙鲆幼鱼对水溶性维生素B3需要量的研究 牙鲆幼鱼饲料中铜的适宜添加量研究 黄颡鱼幼鱼蛋白质需要量的研究 三、参考选题 这方面的选题很多，可以根据学校当时的具体条件和学生的兴趣确定。下面的几个选题可供参考。 说明： 饥饿对美国红鱼的消化、代谢机能的影响 设置不同的饥饿时间，如5天、10天、20天、30天，每个饥饿时间为一个处理，每个处理三个重复，每个重复10－20尾鱼。测定营养物质消化率、体成分、排氨率，摄食量、增重等，用方差分析处理数据。 饥饿后的养殖期一个月，期间应测定不同组饥饿开始时和结束后、饥饿后养殖半个月和一个月的体重；饥饿5天、10天、20天、30天的消化率、排氨率和体成分，饥饿后养殖一个月的摄食量和体成分等。 试验日粮采用同一种日粮，日粮的营养指标要符合美国红鱼的营养要求。 根据不同饥饿时间的数据，讨论美国红鱼的营养补偿能力。 考虑实验工作量很大，可以6-8人一大组，二人一小组。按照大组讨论、确定实验方案，按小组分工，每个小组完成一个饥饿时间的全部实验。 推荐文献： 鲤鱼的补偿生长及饥饿对淀粉酶的影响 温度对不同饥饿程度南方鲇稚鱼摄食量的影响 温度对牙鲆生长、消化和代谢、消化酶活性的影响 说明： 设置不同的温度，如10℃，14℃，18℃，22℃，26℃，每个温度为一个处理，每个处理三个重复，每个重复10－20尾鱼。测定营养物质消化率、体成分、排氨率，摄食量、增重和消化酶活性等，用方差分析处理数据。 2、试验日粮采用同一种日粮，日粮的营养指标要符合牙鲆的营养要求。 根据温度的数据，讨论温度对牙鲆生长和其他指标标的影响。 考虑实验工作量很大，可以6-8人一大组，二人一小组。按照大组讨论、确定实验方案，按小组分工，每个小组完成一个温度梯度的全部实验。 不同脂肪源对牙鲆生长和代谢的影响 说明： 采用不同的脂肪源，如鱼油、豆油、鱼油+豆油，每种脂肪源为一个处理，每个处理三个重复，每个重复10－20尾鱼。测定营养物质消化率、体成分、排氨率，摄食量、增重等，用方差分析处理数据。 试验日粮除脂肪源不同外，其他营养指标都相同，日粮的营养指标要符合牙鲆的营养要求。 据实验的数据，考察牙鲆对脂类和脂肪酸需求的特点。 考虑实验工作量很大，可以6-8人一大组，二人一小组。按照大组讨论、确定实验方案，按小组分工，每个小组完成一种脂肪源的全部实验。 参考文献： 饲料中不同脂肪源对黑鲷幼鱼生长和鱼体脂肪酸组成的影响 不同脂肪源对幼蟹生长的影响 不同脂肪源饲料对团头鲂稚鱼生长的影响 不同脂肪源对真鲷幼鱼生长、存活及体内脂肪酸组成的影响 （四）美国红鱼的营养需要量的研究 说明： 采用正交实验，研究美国红鱼对蛋白质、脂肪、糖类、纤维素的需要量。每种营养素采用三个水平，中间水平参考前人对美国红鱼的研究进行设定。每个处理三个重复，每个重复10－20尾鱼。测定各组的生长、摄食量、成活率等，按正交实验法分析处理数据。 试验日粮采用精制饲料，即用酪蛋白、鱼油和豆油、纤维素、葡萄糖、复合预混料等配制实验要求的各种日粮。 试验期为30天。 本实验实验工作量很大，可以6-8人一大组，二人一小组。按照大组讨论、确定实验方案，按小组分工，每个小组完成一种脂肪源的全部实验。 参考文献： 1、高淳仁，雷霁霖，中华绒螯蟹配合饲料中蛋白质、脂肪、纤维素的适宜含量，中国水产科学，1995（3） 李爱杰等，鲤鱼营养需要的研究，水利渔业。1995,(5) 杨家新，暗纹东方魨幼鱼对蛋白质的最适需要量，水产学报。2003，（5）： 附录：研究、设计型实验的基本程序 一、查阅相关资料 在确立研究课题之前或后需要查阅大量的参考文献及资料，以了解目前国内外相关研究的动态及其研究的前景然后 确定研究的目的、意义及研究的范围。 二、立题： 确立要研究的课题，是实验设计的前提，同时也决定了研究的方向和研究内容。立题的正确性和科学性关系到实验结果是否准确，结论是否可行，所以必须慎重立题。 立题的基本原则： 目的性、应用性：立题首先应有明确具体的目的，即通过该实验究竟要解决什么问题，这些问题必须是当前生产实践急待解决的问题，在生产实践中具有广泛的应用前景，具有一定的实践意义和理论意义同时题目要简练，不易过繁过大。一个实验能解决1—2个问题即可。 前瞻性、创新性：科学研究是创新工作，必须具有前瞻性和创新性，即前人尚未做过，尚未解决或做得不完善，尚未得出结论的问题，这就需要查阅大量文献和国内外科研资料，充分考虑到通过该实验研究能否（或拟）提出新的规律，新的见解、新的技术、新的方法或对原规律技术提出补充或修改。 科学性、可行性： 对所研究的课题，首先要有一个设想，然后设计实验去证实设想是否正确，因此立题必须有充分的科学依据。要与已证实的科学理论，科学规律相符合，不能毫无根据的凭空设想。采用的方法和技术应是先进而可行的，立题必须符合实验者的知识水平、技术水平和进行该项研究所需的实验条件。 三、实验设计 实验设计就是研究计划和实验实施方案的制定，实验方法的确立。必须根据所立课题的目的要求、预期结果，结合专业和统计学的要求，制定出周密实验内容、方法和计划，使学生在整个实验过程中有据可依，循序渐进，有条不紊地进行实验，并能提高实验研究的质量，最终达到预期目的。 （一）实验设计的内容 1实验的方案、计划及技术路线 主要根据该实验的目的利用已知的科学规律和已有的研究成果，制定可操作（或研究）的实验途径和方案，以达到预期的实验目的，其研究设计可采用多层次、多学科、多种方法的综合性研究途径（技术路线）与方案。 2实验方法与实验步骤 主要是进行实验（研究）时的具体实验方法和实验步骤，同一个实验也可选用几种方法进行预实验，最后确定一个最合适的方法。 3所需的仪器、器材、药品及试剂 根据实验目的、实验方法、实验步骤选择相应的仪器，器材、备足药品和相关试剂。 4实验动物的选择：必须是健康的水产动物（鱼、虾、贝），年龄、规格（体长、体重）、性别、来源最好基本一致，以减少个体间的生物差异。 5处理因素：根据实验的目的，由实验者人为的加给实验动物的因素，称为处理因素，如不同的营养条件，不同的致病因子，不同的水环境因子等等。处理因素设计注意几个问题。 ① 抓住实验的主要因素 ，在一次实验中只观察一个因素的效应称为单因素效应，一次实验中观察多种因素的效应称为多因素效应。一次实验的处理因素不要过多，否则分组过多，检测指标的样本过多，实验耗时过长，且难以掌握，实验处理因素又不宜过少，否则影响实验的深度、广度和效率。 ② 处理因素的强度和标准：强度就是处理因素量的大小，药物的剂量强度必须适当，同一因素有时可设几个不同强度或不同剂量即处理因素的水平。处理因素的水平亦不宜过多。处理因素在整个实验过程中应保持不变即应标准 化，否则会影响实验结果的评价。如采用相同的计量标准对药物的质量（成分、纯度、生产厂、批号、配制方法等），仪器参数应作出统一规定并相对固定，强度亦应采用相同的剂量标准。 ③ 严格控制非处理因素 即干扰因素，除处理因素外其它因素，如处理因素为不同致病因子，那么温度、水质条件等因素即为干扰因素，需要严格控制使各组处于基本相同条件下进行实验。 6实验效应 主要是选择什么样指标来表达和说明处理因素对实验动物的效应或影响，这包括定性指标和定量指标，主观指标和客观指标等，各指标的选择可根据如下原则。 ① 特异性 观测的指标应能特异性的反应某一特定的现象或效应，如研究抗病力，可选择相关的血液或免疫指标；研究营养状况可选择相关的消化吸收，代谢等指标。 ②客观性 所观测的指标应尽量避免由于主观因素干扰所造成的误差，应选择易于量化且可通过仪器测量和检验所获得的指标，如血液生理生化指标的检测，细菌培养结果等等。 ③ 重复性 即在相同的条件下，指标可重复出现，为提高重复性，应注意仪器的稳定性，并尽量减少操作的误差，严格控制实验动物的机能状态以及其它环境（特别是水质）条件和稳定性，重复性小的指标不宜采用。 ④精确性 各指标重复数据的平均值相接近，其差值为随机误差，观测值与真值接近程度，主要受系统误差的影响。变异较大的指标不宜选用 ⑤灵敏性 选择的指标如果灵敏性较高，则可使微小的效应显示出来，灵敏性很低，则使本应出现的效应不易出现，灵敏性较低的指标不宜选用。 ⑥可行性 就实验室的设备条件及研究者的技术水平选择检测指标，同时所选择的检测指标的检测方法应为经典的实验方法或有充分的文献依据。自己创立的检测方法，必须经过与经典的方法多次比较并有优越性的方法。 （二）实验设计原则 为确保实验设计的科学性，实验设计必须遵循对照、随机、重复的原则。 1.对照原则：对照的意义在于使处理因素和非处理因素的差异有一个科学的对比。通常实验分组为对照组和处理组（实验组），影响机体、机能的因素很多，设立对照组除处理因素外，其它非处理因素均相同，这就使对照组与实验组的非处理因素影响得以抵消，而处理因素的效应更加显露，如实验动物的基本条件（规格、来源、年龄、性别等）实验环境（温度、水质条件等）实验条件（实验方法，操作过程，使用仪器等）以及检测指标等，对照组与实验组均相同，只是实验组施加了不同的处理因素，这样才能消除非处理因素的干扰和影响。 对照组的设置可根据研究目的和要求不同选用不同的对照形式如： ①空白对照组，对实验动物不加任何处理因素的空白对照组；如实验组动物注射不同的药物时，空白对照组则不注射，以排除动物本身自然生长，正常生活可能的影响。 ②实验对照组（假处理对照） 在某种相关实验条件下，进行观测，如进行相同手术，注射等，但对照组不给药（可注射生理盐水）不作关键处理，以此排除注射或手术影响。 ③标准对照组 可用标准或正常值作为对照，将实验测得的值与正常值进行比较，正常值即为标准对照，但由于水产动物机能影响因素很多常常找不到真正的标准值，所以在水产动物实验中很少采用。 ④ 自身对照 实验动物在实验前后指标变化，如根据实验前的体长、体重各项指标与给药或处理后的体长体重等各项指标的对比可判断处理前后的差异与效应。 ⑤相互对照（又称组间对照） 各实验组用不同的处理因素处理或用不同的方法处理。几种处理方法或处理因素之间互为对照。 2重复原则 由于实验动物的个体差异，重复是消除非处理因素影响的又一重要手段，只有可重复的实验结果，才是可信的、科学的，这就要求设置的实验组和对照组均需有足够的组数或样本数。如果组数和样本过少，仅在一组一次或一个样本获得的结果，往往由于个体差异，实验误差影响其结果的准确性，组数和样本又不宜过多，过多工作量太大造成人力物力的浪费，重复组与样本数的选择要根据生物统计学原理或根据文献资料，预实验结果或以往经验来决定，通常设立三个平行组（即重复组）每组8—10个动物，这样每个实验组（或对照组）可获得24—30个样本。 3 随机原则 随机原则是指在实验研究中每个动物都有均等机会被分配到任何一个组中，分组结果不受人为因素的干扰和影响，同时实验动物每次接受实验的顺序是随机的，通过随机化的处理，可使抽取的样本能够代表总体，减少抽样误差，还可使各组样本的条件尽量一致，消除或减少组间人为的误差，使处理因素效应更为客观、正确。通常在随机分组前，要对较能明显影响实验结果的因素先加以控制，如性别、年龄、大小、健康状况等，随机化方法很多，可参阅有关生物统计学。 （三）实验设计的要求 1学生应在生理、生化、病理生理和饲料营养学、水产动物疾病学等有关基础理论和应用理论的基础上，通过大量收集和阅读相关文献或根据以往实验中所观察的实验记录或生产实践中所观察到的现象或产生的问题来选定实验题目。 2立题后对该课题有关基本理论，还必须继续深入学习，认真体会，融会贯通后，制定出合理的实验方案，才能确保更好的进行实验，完成该课题各项目标。 3在设计实验方案时，应根据实验室条件所提供的仪器、设备等，并根据自己所学的知识和对查阅资料的深入了解，制定切实可行的实验方案，尽量采用简易的实验方法。 4设计每一个环节，每一个步骤都要具有科学性，严格遵守实验设计的原则，以确保研究实验结果的可信性和客观性。 5实验设计中要求学生敞开思路，自行提出问题，以问题为中心，设计实验方案，来解决提出的问题，并力求较完善的解决问题。 6实验设计要努力体现创新性、科学性、逻辑性，实验内容设计要简洁明了，目的明确。 四 预备实验 预备实验的目的，一是对选择的实验效应指标进行初步筛选；二是对实验的处理因素进行筛选；三是对实验方法进行筛选。 （一）实验效应指标的筛选：通过预实验对实验指标进行筛选，应尽量选择一些灵敏性较高，重复性较好，特异性较强而且测定简便的指标进行正式试验。 （二）处理因素的筛选：有些处理因素的强度、剂量、处理时间等等，都要经过预实验进行初步探索，方能确保正式实验的成功。 （三）实验方法的筛选： 有些用于高等动物的实验方法对低等水产动物不一定完全适用，必须熟悉实验方法与实验技术，并根据实际情况做出修改。甚至有的抗凝剂的选择，生理盐溶液的成分与配制等都要经过预实验来筛选，再如实验过程中将出现什么问题有什么值得进一步研究的线索等，都要逐一摸清。总之预实验的目的在于检查各项准备工作是否完善，实验方法和实验步骤是否可行，检测的指标是否稳定可靠，而且要初步了解试验结果与预期结果的距离，从而为选题和实验设计提供修改依据，也为正式实验提供补充和修正意见，使研究实验顺利进行，并达到预期目的。 五 正式实验 按预实验后修改的实验方案、实验方法、实验步骤进行，要求必须认真仔细的操作，并独立实践。 六实验观察、记录 （一）对运来的实验动物要进行7天左右的驯养，以使其适应新的实验环境，并淘汰不适合实验的体弱动物。 （二）实验动物分组后实验前要检测基础指标的数据，如规格（体长、体重）耗氧率等，按设组与实验需要监测。 （三）分组施加不同的处理因素后要观察动物活动状况及其产生的变化（如死亡情况、患病情况等等）即时作以处理和详细记录 （四）按阶段（以时间推移为准），采样检测各项实验指标直至实验结束并全程记录。记录的方式可以是文字、数字、表格、图形、照片或录像等。结果的记录必须做到系统、客观、真实和准确，特别要注意原始记录的原始性和真实性。 （五）记录的项目及内容。 1实验名称、实验日期、实验者 2实验动物分组，规格（体长、体重）年龄、性别、来源、健康状况等。 3施加的处理因素、种类、来源（生产厂，批号）、剂量、剂型、给药方法。 4实验仪器。 5实验条件，主要是饲养的水质条件及其饲养管理方法 6实验方法、步骤：检测内容及方法。 7实验指标名称，单位，数值及其变化曲线等。 七 实验结果的分析、处理 （一）对原始资料或数据的分析与处理：对取得的一定数量样本的原始数据，首先要进行生物统计学处理，获得可用来对实验结果的规律进行说明评价的数据（如 平均值、标准差、标准误、相关系数等等）这些经统计学处理的结果数据可以制成一定的统计表或统计图，以便进一步研究其变化规律，其次还可以做相应的统计学检验其差异的显著性或计数某些特征参数等 。 在处理原始数据时，必须坚持真实性、客观性的原则，不能凭主观愿望在计数均值或数率时，将某些数据任意取舍，必须实事求是，也不能人为地强求实验结果符合自己的假说和预期目的，而是根据实验结果去修正假说得出正确结论。 （二）实验结果的表示方法 1以表格方式表达其结果，将所得数据均值及标准差，先绘制成表格，如对定量检查的数据高低、长短、快慢、轻重、多少等，均应以法定计量单位（如 ㎜、㎝、m 、ml 、L、 g、 kg、 g/h 、kg/h、 g/ml等等）和数值予以表达并绘制成表格，一目了然。 2 以变化的曲线方式表达其结果，在可以记录到曲线变化的实验项目中，应尽量用曲线来表达实验结果，并要求在所记录到的曲线上，仔细写明各项图注，使他人易于观察和识别曲线表达的内在含义，如用纵坐标代表酶活力（单位）横坐标代表温度或pH（单位）的变化，绘制的曲线，说明了酶活力随温度或pH变化的规律等。 3 以柱形图等方式表达实验结果，可将实验结果绘成不同高低的柱形图表达其结果高低、长短、多少等。 4 以照片和录像的方式表达实验结果，许多电泳实验结果（如同工酶、蛋白质等电泳）或观察形态变化，如血细胞形态，吞噬细胞吞噬过程，均可用照片（包括显微照像）或录像记录其不同的实验结果。 （三） 研究（实验）的结论 科学研究或研究设计型实验经过立题，实验设计，预实验，正式实验，获得原始数据，再经数据分析处理，就可以根据这些处理好的数据做出研究总结得出结论，这个结论要对原提出的假说和预期的目的作出说明是否正确，同时要对实验中出现的问题或发生的新现象，并参照收集到的资料进一步做出理论解释、说明，而其结论内容必须严谨、精练、准确。 八 研究论文的撰写 撰写研究（实验）论文是科学研究的最后也是极为重要的一项工作。论文的撰写首先要以实验设计和实验结果为依据，同时一篇高质量的科研论文又要较全面的概括研究（实验）工作的全过程。充分体现研究（实验）者在整个研究（实验）中的新方法、新发现、新观念及研究价值，包括其理论意义和实践意义，同时也体现出研究（实验）的阶段性总结，为下阶段或今后的研究（实验）工作奠定基础，对于学生来说是学习一种科研方法，也是对其科研(实验)能力的考核。 （一）撰写研究（实验）论文的要求。 科学价值和表达形式是研究（实验）论文的两大要素，科学价值及水平决定于实验设计和获得的实验结果数据，表达形式则通过各数据的整理分析与写作水平来反映，因此要撰写出好的、水平较高的研究（实验）论文首先要求有严密 先进的实验设计和真实有效的实验结果；其次是准确完善的表达形式，通顺流利精练的语言，方能充分体现出研究（实验）论文的科学水平与学术价值；第三要求研究者要有较强的逻辑思维能力和表达能力，注重论文的科学性，创新性和可读性。 （二）撰写研究（实验）论文格式和内容 1研究题目：要求反映研究（实验）课题基本要素，要简明扼要，字数不超25个字。 2作者与班级：如有两者以上按贡献大小排名，并注明指导教师。 3摘要：按照目的、方法、结果、结论四个部分进行简述，要求有重要的数据，并能概括全文的主要内容与观点，字数约300－400字。 4关键词 选择主要的词5个以下。 5前言：简要说明该课题有关领域的国内外研究概况，发展动态和本研究的理论与宗旨。 6材料与方法：包括实验动物的来源、规格、实验用药品、仪器、实验分组（处理因素及处理过程）实验模型、实验过程（动物的饲养等）观察检测指标及其检测方法，数据处理方法等等 7结果：用文字及图表来表示实验结果整理出的数据。 8讨论：根据实验结果结合有关理论或参考相关文献资料进行分析、讨论，并做出相应结论。 9参考文献：列出重要参考文献，注明作者、标题、期刊、或著作、出版社、发表时间卷期、起止页码等。