第八章 基因工程
? 基因工程 ( genetic engineering)、基因
克隆,DNA重组,DNA克隆、分子克隆
? 克隆（ clone） 无性繁殖
– 应用酶学的方法，在体外将 目的基因 与 载体
DNA结合成一具有自我复制能力的 DNA分
子（ 复制子、重组体 ），继而通过转化或转
染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子
细胞，再进行扩增、提取获得大量同一 DNA
分子拷贝，或其 表达产物 。
? 基因克隆示意图
载体 D N A
( 限制性内切酶切开 ) 目的基因
＋
宿主细胞
＋ 重组体
已转化的宿主细胞
阳性克隆株
繁殖
表达
基因工程大事记
? 1973 Cohen第一例成功的克隆实验
? 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上
第一种基因工程蛋白药物
? 1982 第一个基因工程药物 --重组人胰岛
素在英、美获准使用
? 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），
中国 转基因鱼
? 1993 基因工程西红柿在美国上市
? 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊
? 1999.9 中国获准加入人类基因组计划,
负责测定人类基因组全部序列的 1%
? 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作
草图
? 2001.2.11 公布人类基因组基本信息
? 生物技术工程,基因工程、蛋白质工程、
酶工程、细胞工程
* 胰岛素
* 人生长激素
* 干扰素
* 白细胞介素 2
* 粒细胞集落刺激因子
* 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
* 红细胞生成素 EPO
* 组织纤溶酶原激活剂
* 生长激素
* 促生长素
* 抗血友病因子 Ⅷ
* 脱氧核糖核酸酶
* 葡糖脑苷脂酶
* 鼠单克隆抗体
自然界的基因转移和重组
? 基因重组 (genetic recombination)— — 整
段 DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种
间进行交换,并能在新的位置上复制,转录
和翻译
? 自然界的基因转移和重组是无目的
? 基因工程有目的
? 结合作用
– 质粒 DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个
细胞（细菌）
? 转化作用 transformation
– 通过自动获取或人为地供给外源 DNA，使
细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的
过程
转导作用 transduction
? 病毒、噬菌体介导
– 溶菌途径；溶原菌途径
裂解
溶原
基因工程
? 工具酶
? 载体
? 重组 DNA技术的基本过程
? 真核细胞转染
? 克隆基因的表达
工具酶
限制性核酸内切酶 切割 DNA
DNA连接酶 生成 3′- 5′磷酸二酯键
DNA聚合酶 Ⅰ 探针标记、补平 3′末端
反转录酶 cDNA合成
多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记
末端转移酶 3′末端多聚尾
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
常用的工具酶：
一把特殊的剪刀
— 限制性内切酶的发现
阿尔伯 (Arber)、史密斯 (Smith)和内森斯
(Nathans)，获 1978年诺贝尔生理学和医学奖
? 1953年,Arber研究噬菌体与细菌（ A、
B）的关系。
? 发现 100-200个子代噬菌体中，只有 1个
可感染 B，即其他的噬菌体在 B中受到限
制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后
感染成功。
? 细菌 B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌
死亡。
? 原因：细菌无法对自己的 DNA进行修饰。
? 假设：限制性内切酶与修饰酶。
? 1967年,Smith，分析限制性内切酶的识别和
切割序列，认为它由 5-6个碱基组成
? 原因：限制性酶将 T7DNA切成平均长度为 1000
碱基的片段。
? 识别和切割序列：中心对称的回文结构。
? 限制性酶,HindⅡ
? Nathans：用限制性酶切割猴子 SV40DNA，
DNA测序。
C - A - P u - P y - T - G
G - T - P y - P u - A - C5'
3' 5'
3'
限制性核酸内切酶
(restriction enzyme)
? 识别双链 DNA内部特异位点并裂解磷酸
二酯键
? 分类,Ⅰ 型,Ⅱ 型, Ⅲ 型
? 命名：
– EcoRⅠ (E：属名； co：种名； R：株； Ⅰ,
发现次序 )
? 识别和切割位点
– 回文结构 4～ 6 bp
– 出现两种末端
*粘性末端 粘端
*平头末端 平端
? 同工异源酶,来源不同，但能识别和切
割同一位点
? 同尾酶,识别序列不同，但产生相同的
粘性末端
粘性末端与平头末端
E c o R Ⅰ
G A A T T C
C T T A A G
5′ 3′
5′3′
5′ G
C T T A A
A A T T C
G3′
3′
5′
粘性末端
S m a Ⅰ
C C C G G G
G G G C C C
5′
3′
3′
5′
5′ C C C
G G G
G G G
C C C3′
3′
5′
平头末端
修饰酶
? DNA聚合酶 Ⅰ
? 逆转录酶 (reverse transcriptase)
? T4DNA连接酶 (T4 ligase)
? 碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase)
? 末端脱氧核苷酰转移酶 (terminal
deoxynucleotidyl transferase,TdT)
? Taq DNA聚合酶
DNA聚合酶 Ⅰ (pol Ⅰ )的活性
? 5′至 3′的聚合活性
– 5′→ 3′ 方向
? 核酸 外切酶活性
– 5′→ 3′ 外切酶活性
– 3′→ 5′ 外切酶活性
? pol Ⅰ 经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段
– 大片段 （ Klenow片段 ）：聚合活性,3′→ 5′ 外
切活性 常用的工具酶
核酸外切酶活性
? 3′→5′ 外切酶活性
? 5′→3′ 外切酶活性
5 ′ →3 ′ 外切酶活性
3 ′ →5 ′ 外切酶活性
′
′′
′
5
3
3
5
末端脱氧核
苷酰转移酶
(TDT)
载体 vector
? DNA,能在宿主细胞中进行自我复制和
表达
? 克隆载体、表达载体
– 原核载体,质粒 (pBR322,pUC… ）
噬菌体（ λ,M13）等
– 真核载体,动物病毒载体 pLXSN等
常用的克隆载体
? 质粒 (plasmid)— 存在于细菌染色体外的
小型环状双链 DNA分子
– 理想的质粒
* 拷贝数多 ;
* 两三个遗传标志，如抗药性基因,抗氨苄青霉素
基因 (ampr),抗四环素基因 (terr)； β-半乳糖苷酶
基因 (lacZ) 筛选标志
* 多个限制酶的单一切点，即 多克隆位点 (multiple
cloning sites,MCS)
四环素
抗性基因
氨苄青霉素
抗性基因
O r i
P s t Ⅰ
S a l Ⅰ
P v u Ⅱ
A v a Ⅰ
B a m H Ⅰ
H i n d Ⅲ
E c o R Ⅰ
p B R 3 22
( a m p
r
)
( t e r
r
)
常用的克隆载体
? λ噬菌体 (λphage)
– 基因组分三个区域：左侧区,中间区 （非必需区）、
右侧区
– DNA，替换型载体，外源 DNA,9~23kb
– 常用,EMBL 系列,λgt 系列,charon系列
? 粘性质粒 (cosmid),λDNA的 cos区 +质粒，双
链环状 DNA，克隆容量,40~50kb
? M13噬菌体
– 最大优点：产生单链 DNA
cos:cohesive-
end site
特点：
RF DNA:
replicational form
DNA
优点：
表达载体 (expressing vector)
? 特点：带表达构件 — 转录和翻译所需的 DNA序
列
? 大肠杆菌表达载体：含启动子 — 核糖体结合位
点 — 克隆位点 — 转录终止信号
– 启动子,trp-lac(tac)启动子,λ噬菌体 PL启动子、
T7噬菌体启动子
– 核糖体结合位点 (ribosome-binding site,RBS)：起始
密码子 (ATG)和 SD序列
– 转录终止序列
哺乳动物表达载体
? 真核表达元件：启动子 /增强子 — 克隆位
点 — 终止信号和加 poly(A)信号
重组 DNA技术的基本过程
? 目的基因的制备
? 载体的选择和制备
? DNA分子的体外连接
? 将外源 DNA导入宿主细胞
? 目的基因的筛选和鉴定
目的基因 (target DNA)的制备
? 目的基因（外源基因）
? 制备基因组 DNA
- 基因文库 (genomic library)— 存在于转化细菌
中、克隆载体携带的所有基因组 DNA的集合
? 制备 cDNA
- cDNA文库 (cDNA library)
? 制备用于表达的基因片段,PCR技术、化
学合成
R N A 模板
杂化双链
单链 DNA
双链 DNA
反转录酶
R N a s eH 碱水解
DNA 聚合酶
整合
S1 核酸酶
细胞内复制 试管内合成
反转录酶
反转录酶
? 载体的选择和制备,λ噬菌体、粘性质
粒,pUC系列,M13噬菌体
? DNA分子的体外连接（ DNA连接酶）
– 粘性末端连接 连接效率高
* 相同酶切末端
– 平端连接 连接效率低
– 人工接头 (linker)法
– 同聚物接尾法
同聚物接尾法
目的基因载体 DNA
+ d G T P
+ d C T P
P o l y G
P o l y C
3′
3′
3′
3′
将外源 DNA导入宿主细胞
? 基因工程菌 HB101,JM109
? 转化 (transformation)
– 制备 感受态细胞 冷的氯化钙处理，细胞处于最适
摄取和容忍外来 DNA的生理状态
? 感染 (infaction)
– 转导 (transduction),由噬菌体和细胞病毒介导的遗
传信息转移过程
? 转染 (transfection)：真核细胞主动摄取或被动
导入外源 DNA片段而获得新的表型的过程。
目的基因的筛选和鉴定
(screening/selection)
? 遗传学方法
– 插入灭活法 (insertion inactivation):抗药性标志选择
– 标志补救 表达产物与营养缺陷互补
* α-互补 蓝白斑 筛选
? 免疫学方法
? 分子杂交 探针
– 原位杂交
? PCR
? 限制性酶切图谱
IPTG;X-gal(5-
溴 -4-氯 -3-吲哚 -
β-D-半乳糖苷 )
bp
—1534
— 994
— 695
— 515
— 377
— 237
A B C M
克隆基因的表达
? 载体有转录、翻译的元件； 密码子通用
? 原核表达体系
– 原核表达载体的标准
*合适的筛选标志
*强启动子
*翻译控制序列
*多克隆位点
? 融合蛋白（ fusion protein,包涵体）
– 表达的蛋白质或多肽的 N末端由原核 DNA
编码,C末断由克隆的真核 DNA编目。
? 大肠杆菌表达体系的不足
– 缺乏转录后加工机制，只能表达 cDNA
– 缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化
– 融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性
– 很难表达大量的可溶性蛋白
真核表达体系
? 转染方法
– 磷酸钙沉淀
– DEAE葡聚糖介导转染
– 电穿孔
– 脂质体转染；人造膜
– 显微注射
? 筛选标志 tk- Neor G418
? 瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组
? 稳定转染 目的基因整合进宿主基因组
tk- 细胞突变株筛选转染细胞
? 胸苷激酶（ tk）
– TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合
成
– HAT选择（ H：次黄嘌呤； A：氨甲喋呤；
T：胸苷）
– tk+：生长
– tk-+带 tk基因的质粒：生长
药物筛选转染细胞
? neor
– 新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质
合成
– G418：干扰原核、真核生物
– neo：磷酸转移酶，使 G418失活
– neo 与目的基因连锁,转染
目的基因的定点诱变及其应用
? 基因定点诱变技术
? 基因定点诱变技术的应用
? 基因工程 ( genetic engineering)、基因
克隆,DNA重组,DNA克隆、分子克隆
? 克隆（ clone） 无性繁殖
– 应用酶学的方法，在体外将 目的基因 与 载体
DNA结合成一具有自我复制能力的 DNA分
子（ 复制子、重组体 ），继而通过转化或转
染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子
细胞，再进行扩增、提取获得大量同一 DNA
分子拷贝，或其 表达产物 。
? 基因克隆示意图
载体 D N A
( 限制性内切酶切开 ) 目的基因
＋
宿主细胞
＋ 重组体
已转化的宿主细胞
阳性克隆株
繁殖
表达
基因工程大事记
? 1973 Cohen第一例成功的克隆实验
? 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上
第一种基因工程蛋白药物
? 1982 第一个基因工程药物 --重组人胰岛
素在英、美获准使用
? 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），
中国 转基因鱼
? 1993 基因工程西红柿在美国上市
? 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊
? 1999.9 中国获准加入人类基因组计划,
负责测定人类基因组全部序列的 1%
? 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作
草图
? 2001.2.11 公布人类基因组基本信息
? 生物技术工程,基因工程、蛋白质工程、
酶工程、细胞工程
* 胰岛素
* 人生长激素
* 干扰素
* 白细胞介素 2
* 粒细胞集落刺激因子
* 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
* 红细胞生成素 EPO
* 组织纤溶酶原激活剂
* 生长激素
* 促生长素
* 抗血友病因子 Ⅷ
* 脱氧核糖核酸酶
* 葡糖脑苷脂酶
* 鼠单克隆抗体
自然界的基因转移和重组
? 基因重组 (genetic recombination)— — 整
段 DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种
间进行交换,并能在新的位置上复制,转录
和翻译
? 自然界的基因转移和重组是无目的
? 基因工程有目的
? 结合作用
– 质粒 DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个
细胞（细菌）
? 转化作用 transformation
– 通过自动获取或人为地供给外源 DNA，使
细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的
过程
转导作用 transduction
? 病毒、噬菌体介导
– 溶菌途径；溶原菌途径
裂解
溶原
基因工程
? 工具酶
? 载体
? 重组 DNA技术的基本过程
? 真核细胞转染
? 克隆基因的表达
工具酶
限制性核酸内切酶 切割 DNA
DNA连接酶 生成 3′- 5′磷酸二酯键
DNA聚合酶 Ⅰ 探针标记、补平 3′末端
反转录酶 cDNA合成
多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记
末端转移酶 3′末端多聚尾
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
常用的工具酶：
一把特殊的剪刀
— 限制性内切酶的发现
阿尔伯 (Arber)、史密斯 (Smith)和内森斯
(Nathans)，获 1978年诺贝尔生理学和医学奖
? 1953年,Arber研究噬菌体与细菌（ A、
B）的关系。
? 发现 100-200个子代噬菌体中，只有 1个
可感染 B，即其他的噬菌体在 B中受到限
制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后
感染成功。
? 细菌 B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌
死亡。
? 原因：细菌无法对自己的 DNA进行修饰。
? 假设：限制性内切酶与修饰酶。
? 1967年,Smith，分析限制性内切酶的识别和
切割序列，认为它由 5-6个碱基组成
? 原因：限制性酶将 T7DNA切成平均长度为 1000
碱基的片段。
? 识别和切割序列：中心对称的回文结构。
? 限制性酶,HindⅡ
? Nathans：用限制性酶切割猴子 SV40DNA，
DNA测序。
C - A - P u - P y - T - G
G - T - P y - P u - A - C5'
3' 5'
3'
限制性核酸内切酶
(restriction enzyme)
? 识别双链 DNA内部特异位点并裂解磷酸
二酯键
? 分类,Ⅰ 型,Ⅱ 型, Ⅲ 型
? 命名：
– EcoRⅠ (E：属名； co：种名； R：株； Ⅰ,
发现次序 )
? 识别和切割位点
– 回文结构 4～ 6 bp
– 出现两种末端
*粘性末端 粘端
*平头末端 平端
? 同工异源酶,来源不同，但能识别和切
割同一位点
? 同尾酶,识别序列不同，但产生相同的
粘性末端
粘性末端与平头末端
E c o R Ⅰ
G A A T T C
C T T A A G
5′ 3′
5′3′
5′ G
C T T A A
A A T T C
G3′
3′
5′
粘性末端
S m a Ⅰ
C C C G G G
G G G C C C
5′
3′
3′
5′
5′ C C C
G G G
G G G
C C C3′
3′
5′
平头末端
修饰酶
? DNA聚合酶 Ⅰ
? 逆转录酶 (reverse transcriptase)
? T4DNA连接酶 (T4 ligase)
? 碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase)
? 末端脱氧核苷酰转移酶 (terminal
deoxynucleotidyl transferase,TdT)
? Taq DNA聚合酶
DNA聚合酶 Ⅰ (pol Ⅰ )的活性
? 5′至 3′的聚合活性
– 5′→ 3′ 方向
? 核酸 外切酶活性
– 5′→ 3′ 外切酶活性
– 3′→ 5′ 外切酶活性
? pol Ⅰ 经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段
– 大片段 （ Klenow片段 ）：聚合活性,3′→ 5′ 外
切活性 常用的工具酶
核酸外切酶活性
? 3′→5′ 外切酶活性
? 5′→3′ 外切酶活性
5 ′ →3 ′ 外切酶活性
3 ′ →5 ′ 外切酶活性
′
′′
′
5
3
3
5
末端脱氧核
苷酰转移酶
(TDT)
载体 vector
? DNA,能在宿主细胞中进行自我复制和
表达
? 克隆载体、表达载体
– 原核载体,质粒 (pBR322,pUC… ）
噬菌体（ λ,M13）等
– 真核载体,动物病毒载体 pLXSN等
常用的克隆载体
? 质粒 (plasmid)— 存在于细菌染色体外的
小型环状双链 DNA分子
– 理想的质粒
* 拷贝数多 ;
* 两三个遗传标志，如抗药性基因,抗氨苄青霉素
基因 (ampr),抗四环素基因 (terr)； β-半乳糖苷酶
基因 (lacZ) 筛选标志
* 多个限制酶的单一切点，即 多克隆位点 (multiple
cloning sites,MCS)
四环素
抗性基因
氨苄青霉素
抗性基因
O r i
P s t Ⅰ
S a l Ⅰ
P v u Ⅱ
A v a Ⅰ
B a m H Ⅰ
H i n d Ⅲ
E c o R Ⅰ
p B R 3 22
( a m p
r
)
( t e r
r
)
常用的克隆载体
? λ噬菌体 (λphage)
– 基因组分三个区域：左侧区,中间区 （非必需区）、
右侧区
– DNA，替换型载体，外源 DNA,9~23kb
– 常用,EMBL 系列,λgt 系列,charon系列
? 粘性质粒 (cosmid),λDNA的 cos区 +质粒，双
链环状 DNA，克隆容量,40~50kb
? M13噬菌体
– 最大优点：产生单链 DNA
cos:cohesive-
end site
特点：
RF DNA:
replicational form
DNA
优点：
表达载体 (expressing vector)
? 特点：带表达构件 — 转录和翻译所需的 DNA序
列
? 大肠杆菌表达载体：含启动子 — 核糖体结合位
点 — 克隆位点 — 转录终止信号
– 启动子,trp-lac(tac)启动子,λ噬菌体 PL启动子、
T7噬菌体启动子
– 核糖体结合位点 (ribosome-binding site,RBS)：起始
密码子 (ATG)和 SD序列
– 转录终止序列
哺乳动物表达载体
? 真核表达元件：启动子 /增强子 — 克隆位
点 — 终止信号和加 poly(A)信号
重组 DNA技术的基本过程
? 目的基因的制备
? 载体的选择和制备
? DNA分子的体外连接
? 将外源 DNA导入宿主细胞
? 目的基因的筛选和鉴定
目的基因 (target DNA)的制备
? 目的基因（外源基因）
? 制备基因组 DNA
- 基因文库 (genomic library)— 存在于转化细菌
中、克隆载体携带的所有基因组 DNA的集合
? 制备 cDNA
- cDNA文库 (cDNA library)
? 制备用于表达的基因片段,PCR技术、化
学合成
R N A 模板
杂化双链
单链 DNA
双链 DNA
反转录酶
R N a s eH 碱水解
DNA 聚合酶
整合
S1 核酸酶
细胞内复制 试管内合成
反转录酶
反转录酶
? 载体的选择和制备,λ噬菌体、粘性质
粒,pUC系列,M13噬菌体
? DNA分子的体外连接（ DNA连接酶）
– 粘性末端连接 连接效率高
* 相同酶切末端
– 平端连接 连接效率低
– 人工接头 (linker)法
– 同聚物接尾法
同聚物接尾法
目的基因载体 DNA
+ d G T P
+ d C T P
P o l y G
P o l y C
3′
3′
3′
3′
将外源 DNA导入宿主细胞
? 基因工程菌 HB101,JM109
? 转化 (transformation)
– 制备 感受态细胞 冷的氯化钙处理，细胞处于最适
摄取和容忍外来 DNA的生理状态
? 感染 (infaction)
– 转导 (transduction),由噬菌体和细胞病毒介导的遗
传信息转移过程
? 转染 (transfection)：真核细胞主动摄取或被动
导入外源 DNA片段而获得新的表型的过程。
目的基因的筛选和鉴定
(screening/selection)
? 遗传学方法
– 插入灭活法 (insertion inactivation):抗药性标志选择
– 标志补救 表达产物与营养缺陷互补
* α-互补 蓝白斑 筛选
? 免疫学方法
? 分子杂交 探针
– 原位杂交
? PCR
? 限制性酶切图谱
IPTG;X-gal(5-
溴 -4-氯 -3-吲哚 -
β-D-半乳糖苷 )
bp
—1534
— 994
— 695
— 515
— 377
— 237
A B C M
克隆基因的表达
? 载体有转录、翻译的元件； 密码子通用
? 原核表达体系
– 原核表达载体的标准
*合适的筛选标志
*强启动子
*翻译控制序列
*多克隆位点
? 融合蛋白（ fusion protein,包涵体）
– 表达的蛋白质或多肽的 N末端由原核 DNA
编码,C末断由克隆的真核 DNA编目。
? 大肠杆菌表达体系的不足
– 缺乏转录后加工机制，只能表达 cDNA
– 缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化
– 融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性
– 很难表达大量的可溶性蛋白
真核表达体系
? 转染方法
– 磷酸钙沉淀
– DEAE葡聚糖介导转染
– 电穿孔
– 脂质体转染；人造膜
– 显微注射
? 筛选标志 tk- Neor G418
? 瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组
? 稳定转染 目的基因整合进宿主基因组
tk- 细胞突变株筛选转染细胞
? 胸苷激酶（ tk）
– TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合
成
– HAT选择（ H：次黄嘌呤； A：氨甲喋呤；
T：胸苷）
– tk+：生长
– tk-+带 tk基因的质粒：生长
药物筛选转染细胞
? neor
– 新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质
合成
– G418：干扰原核、真核生物
– neo：磷酸转移酶，使 G418失活
– neo 与目的基因连锁,转染
目的基因的定点诱变及其应用
? 基因定点诱变技术
? 基因定点诱变技术的应用
