2010-5-20 1
医学分子生物学
盛 德 乔
2010-5-20 2
第十一章 核酸的体外扩增
2010-5-20 3
第一节 聚合酶链式反应
polymerase chain reaction
PCR
第十一章
2010-5-20 4
一,PCR的基本原理
PCR的基本原理
变性、复性、半保留复制
PCR三步曲
– 变性 90～ 97℃
– 退火 45～ 55℃
– 延伸 72℃ 左右
第十一章
2010-5-20 5
± ? D ?
? ó é ì
í ? ? e
9 0 ? ? 9 5 ? ?
4 0 ? ? 6 0 ? ?7 0 ? ? 7 5 ? ?
第十一章
2010-5-20 6
二,PCR引物设计
1,一对引物，与 3′端互补
2,长度,15～ 30个核苷酸
3,碱基分布随机
4,引物内、引物间不应有互补序列
5,引物与非特异扩增区无同源性
6,3′端必须互补
7,5′端可游离
第十一章
2010-5-20 7
三、模板的制备
DNA
1,从细胞中提取 DNA,血细胞、绒毛、尿
样、毛发、精斑、口腔上皮细胞
2,固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶 K
消化
RNA
新鲜组织或细胞
所用器皿和试剂必需经高温灭菌或 DEPC处
理
第十一章
2010-5-20 8
四,PCR的基本反应
（一）、以 DNA为模板的反应：
10× 缓冲液 10 ?l
4种 dNTP混合物 各 200 ?mol/L
引物 各 10～ 100 pmol
模板 DNA 0.1～ 2 ?g
Taq DNA聚合酶 2.5 u
Mg2+ 1.5 mmol/L
加双或三蒸水至 100 ?l
第十一章
2010-5-20 9
PCR反应五要素, 引物,酶, dNTP、
模板和 Mg2+
Taq DNA聚合酶
来自水生栖热菌 Thermusaquaticus
良好的耐热性
Mg2+依赖性
无校正功能
第十一章
2010-5-20 10
（ 二）、以 mRNA为模板的反应
mRNA 5 ?l
5× Buffer 4 ?l
dNTP 2 ?l(10mmol/L)
RNasin 1 ?l(20u)
AMV RTase 1 ?l(10u)
Oligo(dT)12— 18(或下游引物 ) 1 ?l
ddH2O 6?l /20 ?l
42℃ 水浴 1小时,95 ℃ 水浴 10分钟灭活逆转
录酶。向上述反应体系中添加如下试剂,
第十一章
2010-5-20 11
10× Buffer 5 ?l
25mmol/L Mg2+ 3?l
Taq酶 0.5 ?l（ 2.5u）
上游引物 1?l
ddH2O 20.5?l /50 ?l
按 PCR循环参数进行
RT--PCR
第十一章
2010-5-20 12
（三 ） PCR产物的积累规律
– DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。
– 反应初期，目的 DNA片段呈指数形式
（ 2n）,随着目的 DNA的积累，在引物 —
模板与 DNA聚合酶达到一定比例时，酶的
催化反应趋于饱和 — 平台期 。（ 25个循环）
（四） PCR反应的自动化
第十一章
2010-5-20 13
五,PCR反应条件的控制
（一） PCR反应的缓冲溶液
提供合适的酸碱度和某些离子
10～ 50mmol/L Tris-HCl缓冲液
50mmol/L KCl
BSA或明胶
（二）镁离子浓度
Taq酶活性需要 Mg2+,
Mg2+浓度过高导致非特异扩增。
一般常用 1.5mmol/L
第十一章
2010-5-20 14
（三）底物浓度
dNTP浓度在 20～ 200 ?mol/L
四种 dNTP必须浓度相等
（四） Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶在 70～ 80℃ 具有最高聚合活
性
第十一章
2010-5-20 15
（五）引物
引物浓度一般为 0.1～ 0.5?mol/L
（ 六）反应温度和循环次数
1,变性温度和时间 95℃ /30 ～ 60s
2,退火温度和时间 45～ 55℃ /30 ～ 60s
3,延伸温度和时间 72℃
4,循环次数 25～ 30 不超过 35
第十一章
2010-5-20 16
六,PCR中应注意的事项
PCR反应中可能出现的问题,
? 假阴性，不出现扩增条带
? 假阳性
? 出现非特异扩增带
第十一章
2010-5-20 17
（一）防止污染
试剂小量分装
吸头及 EP管一次性使用
器皿及工作区域要分开，无菌操作
（ 二）设立对照,
阳性对照,阳性模板
阴性对照,阴性模板
试剂对照,除模板外的所有组分
注意的事项,
第十一章
2010-5-20 18
七,PCR技术的主要类型
㈠ 筑巢 PCR ㈥ 彩色 PCR
㈡ 多重 PCR ㈦ 原位 PCR
㈢ 不对称 PCR ㈧ 定量 PCR
㈣ 共享引物 PCR ㈨ 差异显示 PCR
㈤ 锚定 PCR ㈩ 重组 PCR
第十一章
2010-5-20 19
PCR反应的特点
1,特异性强,
2,灵敏度高, PCR产物的生成量是以指数方式
增加的，能将皮克 (pg=10- 12)量级的起始待
测模板扩增到微克 (?g=-6)水平
3,简便、快速, PCR反应一般在 2～ 4 小时完
成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不
一定要用同位素，无放射性污染、易推广 。
第十一章
2010-5-20 20
4.对标本的纯度要求低,
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，
DNA 粗制品及总 RNA均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽
液、毛发、细胞、活组织等粗制的 DNA
扩增检测。
2010-5-20 21
第二节 连接酶链反应
Ligase chain reaction
LCR
第十一章
2010-5-20 22
一,LCR的基本原理
LCR是以 DNA连接酶将某一 DNA链的 5′磷
酸与另一相邻链的 3′羟基连接为基础的
循环反应。
第十一章
2010-5-20 23
第十一章
2010-5-20 24
二,LCR产物的检测
?标记引物：
– 放射性标记
– 荧光素标记
– 地高辛标记
第十一章
2010-5-20 25
三、影响 LCR的重要因素
㈠ 引物
基因的突变位点
长度足够
㈡ LCR的反应条件
2010-5-20 26
第三节 RNA的体外扩增
RNA— PCR
第十一章
2010-5-20 27
1,转录依赖的扩增系统 (transcript-based
amplification system,TAS)
2,自主维持序列扩增或再生式序列复制
（ self-sustained sequence
replication,3SR)
3,核酸序列的扩增 （ nucleic acid
sequence-based amplification,NASBA）
第十一章
2010-5-20 28
一、基本原理
以 RNA为模板在体外大量扩增 RNA
非循环相
逆转录
转录
循环相
聚合酶链式反应
反应体系温度均一
RNA产物以 10的指数方式增加
第十一章
2010-5-20 29
第十一章
2010-5-20 30
酶,
逆转录酶,RNase H,T7RNA聚合酶
引物,
引物 A— 与 RNA3′端互补,5 ′端含启动子
引物 B— 与 cDNA第一条链 3′端互补
底物, dNTP,NTP
模板,
缓冲液,
RNA— PCR反应体系的组成
第十一章
2010-5-20 31
二, 产物的检测
三,RNA— PCR技术的特点及应用
特点：
扩增效率极高
特异性强
应用：
检测 RNA,RNA测序，临床诊断
医学分子生物学
盛 德 乔
2010-5-20 2
第十一章 核酸的体外扩增
2010-5-20 3
第一节 聚合酶链式反应
polymerase chain reaction
PCR
第十一章
2010-5-20 4
一,PCR的基本原理
PCR的基本原理
变性、复性、半保留复制
PCR三步曲
– 变性 90～ 97℃
– 退火 45～ 55℃
– 延伸 72℃ 左右
第十一章
2010-5-20 5
± ? D ?
? ó é ì
í ? ? e
9 0 ? ? 9 5 ? ?
4 0 ? ? 6 0 ? ?7 0 ? ? 7 5 ? ?
第十一章
2010-5-20 6
二,PCR引物设计
1,一对引物，与 3′端互补
2,长度,15～ 30个核苷酸
3,碱基分布随机
4,引物内、引物间不应有互补序列
5,引物与非特异扩增区无同源性
6,3′端必须互补
7,5′端可游离
第十一章
2010-5-20 7
三、模板的制备
DNA
1,从细胞中提取 DNA,血细胞、绒毛、尿
样、毛发、精斑、口腔上皮细胞
2,固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶 K
消化
RNA
新鲜组织或细胞
所用器皿和试剂必需经高温灭菌或 DEPC处
理
第十一章
2010-5-20 8
四,PCR的基本反应
（一）、以 DNA为模板的反应：
10× 缓冲液 10 ?l
4种 dNTP混合物 各 200 ?mol/L
引物 各 10～ 100 pmol
模板 DNA 0.1～ 2 ?g
Taq DNA聚合酶 2.5 u
Mg2+ 1.5 mmol/L
加双或三蒸水至 100 ?l
第十一章
2010-5-20 9
PCR反应五要素, 引物,酶, dNTP、
模板和 Mg2+
Taq DNA聚合酶
来自水生栖热菌 Thermusaquaticus
良好的耐热性
Mg2+依赖性
无校正功能
第十一章
2010-5-20 10
（ 二）、以 mRNA为模板的反应
mRNA 5 ?l
5× Buffer 4 ?l
dNTP 2 ?l(10mmol/L)
RNasin 1 ?l(20u)
AMV RTase 1 ?l(10u)
Oligo(dT)12— 18(或下游引物 ) 1 ?l
ddH2O 6?l /20 ?l
42℃ 水浴 1小时,95 ℃ 水浴 10分钟灭活逆转
录酶。向上述反应体系中添加如下试剂,
第十一章
2010-5-20 11
10× Buffer 5 ?l
25mmol/L Mg2+ 3?l
Taq酶 0.5 ?l（ 2.5u）
上游引物 1?l
ddH2O 20.5?l /50 ?l
按 PCR循环参数进行
RT--PCR
第十一章
2010-5-20 12
（三 ） PCR产物的积累规律
– DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。
– 反应初期，目的 DNA片段呈指数形式
（ 2n）,随着目的 DNA的积累，在引物 —
模板与 DNA聚合酶达到一定比例时，酶的
催化反应趋于饱和 — 平台期 。（ 25个循环）
（四） PCR反应的自动化
第十一章
2010-5-20 13
五,PCR反应条件的控制
（一） PCR反应的缓冲溶液
提供合适的酸碱度和某些离子
10～ 50mmol/L Tris-HCl缓冲液
50mmol/L KCl
BSA或明胶
（二）镁离子浓度
Taq酶活性需要 Mg2+,
Mg2+浓度过高导致非特异扩增。
一般常用 1.5mmol/L
第十一章
2010-5-20 14
（三）底物浓度
dNTP浓度在 20～ 200 ?mol/L
四种 dNTP必须浓度相等
（四） Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶在 70～ 80℃ 具有最高聚合活
性
第十一章
2010-5-20 15
（五）引物
引物浓度一般为 0.1～ 0.5?mol/L
（ 六）反应温度和循环次数
1,变性温度和时间 95℃ /30 ～ 60s
2,退火温度和时间 45～ 55℃ /30 ～ 60s
3,延伸温度和时间 72℃
4,循环次数 25～ 30 不超过 35
第十一章
2010-5-20 16
六,PCR中应注意的事项
PCR反应中可能出现的问题,
? 假阴性，不出现扩增条带
? 假阳性
? 出现非特异扩增带
第十一章
2010-5-20 17
（一）防止污染
试剂小量分装
吸头及 EP管一次性使用
器皿及工作区域要分开，无菌操作
（ 二）设立对照,
阳性对照,阳性模板
阴性对照,阴性模板
试剂对照,除模板外的所有组分
注意的事项,
第十一章
2010-5-20 18
七,PCR技术的主要类型
㈠ 筑巢 PCR ㈥ 彩色 PCR
㈡ 多重 PCR ㈦ 原位 PCR
㈢ 不对称 PCR ㈧ 定量 PCR
㈣ 共享引物 PCR ㈨ 差异显示 PCR
㈤ 锚定 PCR ㈩ 重组 PCR
第十一章
2010-5-20 19
PCR反应的特点
1,特异性强,
2,灵敏度高, PCR产物的生成量是以指数方式
增加的，能将皮克 (pg=10- 12)量级的起始待
测模板扩增到微克 (?g=-6)水平
3,简便、快速, PCR反应一般在 2～ 4 小时完
成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不
一定要用同位素，无放射性污染、易推广 。
第十一章
2010-5-20 20
4.对标本的纯度要求低,
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，
DNA 粗制品及总 RNA均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽
液、毛发、细胞、活组织等粗制的 DNA
扩增检测。
2010-5-20 21
第二节 连接酶链反应
Ligase chain reaction
LCR
第十一章
2010-5-20 22
一,LCR的基本原理
LCR是以 DNA连接酶将某一 DNA链的 5′磷
酸与另一相邻链的 3′羟基连接为基础的
循环反应。
第十一章
2010-5-20 23
第十一章
2010-5-20 24
二,LCR产物的检测
?标记引物：
– 放射性标记
– 荧光素标记
– 地高辛标记
第十一章
2010-5-20 25
三、影响 LCR的重要因素
㈠ 引物
基因的突变位点
长度足够
㈡ LCR的反应条件
2010-5-20 26
第三节 RNA的体外扩增
RNA— PCR
第十一章
2010-5-20 27
1,转录依赖的扩增系统 (transcript-based
amplification system,TAS)
2,自主维持序列扩增或再生式序列复制
（ self-sustained sequence
replication,3SR)
3,核酸序列的扩增 （ nucleic acid
sequence-based amplification,NASBA）
第十一章
2010-5-20 28
一、基本原理
以 RNA为模板在体外大量扩增 RNA
非循环相
逆转录
转录
循环相
聚合酶链式反应
反应体系温度均一
RNA产物以 10的指数方式增加
第十一章
2010-5-20 29
第十一章
2010-5-20 30
酶,
逆转录酶,RNase H,T7RNA聚合酶
引物,
引物 A— 与 RNA3′端互补,5 ′端含启动子
引物 B— 与 cDNA第一条链 3′端互补
底物, dNTP,NTP
模板,
缓冲液,
RNA— PCR反应体系的组成
第十一章
2010-5-20 31
二, 产物的检测
三,RNA— PCR技术的特点及应用
特点：
扩增效率极高
特异性强
应用：
检测 RNA,RNA测序，临床诊断
