转基因生物和基因打靶
? 转基因动物
? 转基因植物
? 基因打靶
转基因动物 (transgenic animal)
? 用人工方法将外源基因导入或整合到基
因组内，并能稳定传代的一类动物
? 特点
– 分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平
表达
基本原理
? 目的基因 显微注射 受精卵或胚胎细胞
整合 植入输卵管
? 外源基因：顺式作用元件 结构基因 报
告基因 (report gene) 融合基因
基本方法
? 显微注射法
? 胚胎干细胞法 (embryonic stem cells,ES细胞 )
? 逆转录病毒感染法
? 精子载体法
? 转基因动物中外源基因的检测
– 染色体及基因水平：斑点杂交,Southern杂交、
PCR
– 转录水平,Northern杂交
– 蛋白质水平,Western印迹
转基因动物的应用
? 基因特异表达的研究
? 发现基因的新功能
? 发现新基因
? 建立基因表达、调控的动物模型
? 建立人类疾病的动物模型等
转基因植物 (transgenic plant)
? 基本方法
– 获得目的基因
– 受体细胞培养：如植物愈伤组织等
– 目的基因导入受体细胞
– 培养转化细胞
– 筛选、培植、鉴定
? 农杆菌介导的基因转移：
– 冠瘿瘤 Ti质粒 (tumor-in-ducing plasmid) 转移
DNA(transfer DNA,T-DNA)
? 转基因植物在医学上的应用
– 生产药用蛋白
– 生产新的疫苗等
? 转基因植物的安全性探讨
基因打靶 (gene targeting)
? 通过 DNA定点同源重组，改变基因组中
的某一特定基因，在生物活体内研究该
基因的功能。
? 基因敲除 (gene knockout)：定向敲除
? 基因敲入 (gene knockin)：定向替代
基因打靶的必备条件
? 胚胎干细胞 (ES细胞 )
– 能在体外培养，保留发育的全能性
? 打靶载体
– Neo（新霉素）阳性筛选标志
– HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒
(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶
(thymidine kinase)
基因敲除的基本程序
? 打靶载体的构建
? 打靶载体导入 ES细胞：重组置换
? 基因敲除 ES细胞注射入胚泡
? 胚泡植入假孕小鼠的子宫中
? 嵌合体的杂交育种
基因打靶在医学中的应用
? 基因打靶与遗传病
? 基因打靶与肿瘤的研究
? 基因打靶与生物制药
第十四章 基因与疾病
? 基因结构异常的分子机制
? 基因结构变异与异常血红蛋白病
? 基因结构变异与地中海贫血
? 基因结构变异与血友病甲
? 基因结构变异与血友病乙
基因结构异常的分子机制
? DNA一级结构变异的分子机制
– 自发突变；诱发突变
– 诱变因素：诱变剂
* 碱基和核苷类似物,5-氟尿嘧啶； 6-巯基嘌呤
* 烷化剂：氮芥、环磷酰胺；活性烷基
* 抗生素类：放线菌素 D
* 染色剂：吖啶黄
* 亚硝酸盐
* 电离辐射和紫外线照射
诱变剂的作用机制
? 碱基类似物诱发突变
– 取代天然化合物，引起配对错误，如 5-嗅尿
嘧啶使 A-T变 G-C
? 改变 DNA的化学结构
– 亚硝酸盐（ HNO2），氧化脱氨
? 结合到 DNA上诱发移码突变：如吖啶类
? 紫外线及其它射线引起的 DNA分子的变
化
突变类型及其遗传效应
? 突变类型
– 点突变：转换，颠换；缺失；插入；倒位
? 突变的遗传效应：改变了 DNA的碱基排
列顺序
– 遗传密码的改变：错义突变；无义突变；同
义突变；移码突变
– 对 mRNA剪接的影响
– 蛋白质肽链中的片段缺失
基因结构变异与异常血红蛋白病
? 血红蛋白 (Hb)变异的分子基础
– 单个碱基替代
– 密码子的缺失与嵌入
– 移码突变
– 终止密码突变
– 融合基因
不稳定血红蛋白病
? 成因
– 与血红素接触的氨基酸发生了置换：疏水的
“血红素口袋”
– 在 α-螺旋上的氨基酸发生了替代
– α1β1接触面上的氨基酸发生置换
– 氨基酸缺失
? 结果：血红素脱下，排出；珠蛋白，亨
氏小体，溶血性贫血
? 血红蛋白 M病
– 高铁血红蛋白（ Hb M）：珠蛋白点突变，
His被 Tyr取代，氧亲和力下降，紫绀
? 伴有红细胞增多症的异常血红蛋白病
– 位于 α1β2接触面上的氨基酸发生取代
– 位于珠蛋白肽链羧基端的氨基酸间不能形成
盐桥
– 氨基酸取代影响 β链与 2,3-二磷酸甘油酸
(2,3-DPG)的结合
–,血红素口袋”四周的氨基酸被取代
基因结构变异与地中海贫血
? 地中海贫血：珠蛋白肽链合成受到抑制
所引起的溶血性贫血
? α-地中海贫血,α链的合成受到抑制
– α-珠蛋白基因家族,α类,α和 δ； β类,β、
γ,δ和 ε
– α-地中海贫血的分子基础
β-地中海贫血
? 原因,β链的合成明显减少或完全不能合成
? 突变对基因表达的影响：
– 转录水平降低
– RNA剪接异常
– 翻译缺陷
– RNA修饰缺陷
– 生成不稳定的 β珠蛋白
– 基因缺失引起的 β0-地中海贫血
基因结构变异与血友病甲
?,经典”血友病,X染色体连锁，自发性
出血
? 病因：因子 Ⅷ 活性缺乏，因子 Ⅷ 基因的
缺陷
– 基因缺失
– 插入突变
– 点突变
– 基因重排
基因结构变异与血友病乙
? 性连锁遗传性出血性疾病，因子 Ⅸ 缺乏
? 因子 Ⅸ 基因缺陷
– 基因缺失
– 基因插入
– RNA剪接部位突变
– 无义突变
– 错义突变
? 转基因动物
? 转基因植物
? 基因打靶
转基因动物 (transgenic animal)
? 用人工方法将外源基因导入或整合到基
因组内，并能稳定传代的一类动物
? 特点
– 分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平
表达
基本原理
? 目的基因 显微注射 受精卵或胚胎细胞
整合 植入输卵管
? 外源基因：顺式作用元件 结构基因 报
告基因 (report gene) 融合基因
基本方法
? 显微注射法
? 胚胎干细胞法 (embryonic stem cells,ES细胞 )
? 逆转录病毒感染法
? 精子载体法
? 转基因动物中外源基因的检测
– 染色体及基因水平：斑点杂交,Southern杂交、
PCR
– 转录水平,Northern杂交
– 蛋白质水平,Western印迹
转基因动物的应用
? 基因特异表达的研究
? 发现基因的新功能
? 发现新基因
? 建立基因表达、调控的动物模型
? 建立人类疾病的动物模型等
转基因植物 (transgenic plant)
? 基本方法
– 获得目的基因
– 受体细胞培养：如植物愈伤组织等
– 目的基因导入受体细胞
– 培养转化细胞
– 筛选、培植、鉴定
? 农杆菌介导的基因转移：
– 冠瘿瘤 Ti质粒 (tumor-in-ducing plasmid) 转移
DNA(transfer DNA,T-DNA)
? 转基因植物在医学上的应用
– 生产药用蛋白
– 生产新的疫苗等
? 转基因植物的安全性探讨
基因打靶 (gene targeting)
? 通过 DNA定点同源重组，改变基因组中
的某一特定基因，在生物活体内研究该
基因的功能。
? 基因敲除 (gene knockout)：定向敲除
? 基因敲入 (gene knockin)：定向替代
基因打靶的必备条件
? 胚胎干细胞 (ES细胞 )
– 能在体外培养，保留发育的全能性
? 打靶载体
– Neo（新霉素）阳性筛选标志
– HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒
(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶
(thymidine kinase)
基因敲除的基本程序
? 打靶载体的构建
? 打靶载体导入 ES细胞：重组置换
? 基因敲除 ES细胞注射入胚泡
? 胚泡植入假孕小鼠的子宫中
? 嵌合体的杂交育种
基因打靶在医学中的应用
? 基因打靶与遗传病
? 基因打靶与肿瘤的研究
? 基因打靶与生物制药
第十四章 基因与疾病
? 基因结构异常的分子机制
? 基因结构变异与异常血红蛋白病
? 基因结构变异与地中海贫血
? 基因结构变异与血友病甲
? 基因结构变异与血友病乙
基因结构异常的分子机制
? DNA一级结构变异的分子机制
– 自发突变；诱发突变
– 诱变因素：诱变剂
* 碱基和核苷类似物,5-氟尿嘧啶； 6-巯基嘌呤
* 烷化剂：氮芥、环磷酰胺；活性烷基
* 抗生素类：放线菌素 D
* 染色剂：吖啶黄
* 亚硝酸盐
* 电离辐射和紫外线照射
诱变剂的作用机制
? 碱基类似物诱发突变
– 取代天然化合物，引起配对错误，如 5-嗅尿
嘧啶使 A-T变 G-C
? 改变 DNA的化学结构
– 亚硝酸盐（ HNO2），氧化脱氨
? 结合到 DNA上诱发移码突变：如吖啶类
? 紫外线及其它射线引起的 DNA分子的变
化
突变类型及其遗传效应
? 突变类型
– 点突变：转换，颠换；缺失；插入；倒位
? 突变的遗传效应：改变了 DNA的碱基排
列顺序
– 遗传密码的改变：错义突变；无义突变；同
义突变；移码突变
– 对 mRNA剪接的影响
– 蛋白质肽链中的片段缺失
基因结构变异与异常血红蛋白病
? 血红蛋白 (Hb)变异的分子基础
– 单个碱基替代
– 密码子的缺失与嵌入
– 移码突变
– 终止密码突变
– 融合基因
不稳定血红蛋白病
? 成因
– 与血红素接触的氨基酸发生了置换：疏水的
“血红素口袋”
– 在 α-螺旋上的氨基酸发生了替代
– α1β1接触面上的氨基酸发生置换
– 氨基酸缺失
? 结果：血红素脱下，排出；珠蛋白，亨
氏小体，溶血性贫血
? 血红蛋白 M病
– 高铁血红蛋白（ Hb M）：珠蛋白点突变，
His被 Tyr取代，氧亲和力下降，紫绀
? 伴有红细胞增多症的异常血红蛋白病
– 位于 α1β2接触面上的氨基酸发生取代
– 位于珠蛋白肽链羧基端的氨基酸间不能形成
盐桥
– 氨基酸取代影响 β链与 2,3-二磷酸甘油酸
(2,3-DPG)的结合
–,血红素口袋”四周的氨基酸被取代
基因结构变异与地中海贫血
? 地中海贫血：珠蛋白肽链合成受到抑制
所引起的溶血性贫血
? α-地中海贫血,α链的合成受到抑制
– α-珠蛋白基因家族,α类,α和 δ； β类,β、
γ,δ和 ε
– α-地中海贫血的分子基础
β-地中海贫血
? 原因,β链的合成明显减少或完全不能合成
? 突变对基因表达的影响：
– 转录水平降低
– RNA剪接异常
– 翻译缺陷
– RNA修饰缺陷
– 生成不稳定的 β珠蛋白
– 基因缺失引起的 β0-地中海贫血
基因结构变异与血友病甲
?,经典”血友病,X染色体连锁，自发性
出血
? 病因：因子 Ⅷ 活性缺乏，因子 Ⅷ 基因的
缺陷
– 基因缺失
– 插入突变
– 点突变
– 基因重排
基因结构变异与血友病乙
? 性连锁遗传性出血性疾病，因子 Ⅸ 缺乏
? 因子 Ⅸ 基因缺陷
– 基因缺失
– 基因插入
– RNA剪接部位突变
– 无义突变
– 错义突变
