Chapter 4 replication
DNA replication
DNA damage and repair
Reverse transcription
RNA replication
DNA复制的基本特点
? 半保留复制（ self-conservative replication）
? 复制子（ replicon)
半保留复制
? 1958年,Meselson 和 Stahl首次用实验证
实了 DNA的半保留复制。
? 步骤：
? 用普通培养基（ 14N）培养 15N标记的大肠
杆菌。用 CsCl密度梯度离心法分析 DNA。
? 加热子一代 DNA分子。
复制子（ replicon)
? 复制子,基因组中能单独进行复制的单位。
每个起始点到终止点的区域为一个复制子。
起始点（ origin of replication,ori):原核生物 DNA
分子中只有一个，长度 200bp左右。大肠杆菌
ori C有 245 bp。真核生物有多个复制起始点。
? 终点（ ter）,D,A,C,B（ 23bp共有序列）
Tus（ terminator utilization substance）识别终止
序列。
? 复制的方向,单向或双向
原核生物 DNA聚合酶
（ DNA polymerase,DNA pol)
? 1958年 Kornberg首先从大肠杆菌提取
? DNA polⅠ, 聚合作用, 5` → 3`
? 3` → 5` 外切酶活性,校对功能
? 5` → 3` 外切酶活性,引物切除、损伤修
复
? 主要功能是切除引物，填补冈崎片段产
生的空隙及 DNA损伤的修复
DNA polⅠ 是单一肽链的大分子,分子量为 109kD,
二级结构以 α-螺旋为主。
用特异的蛋白酶处理，可把 DNA polⅠ 水解为两
个片段，即在 F,G螺旋之间发生断裂。
小片段,323个氨基酸残基,5` → 3` 外切酶活性
大片段或称 Klenow片段,604个氨基酸残基，
DNA聚合酶活性和 3` → 5` 外切酶活性
? DNA pol Ⅱ, 5` → 3` 聚合酶活性及 3` →
5`外切核酸酶活性。
? DNA polⅢ, 由 10 个亚基组成，分别为 α、
ε,θ,τ,δ,δ`,β,κ及 ψ。是原核生物
体内真正起复制作用的酶。
α亚基,5` → 3` 聚合酶活性
ε亚基,3` → 5` 外切酶,校对和编辑
θ为装配必须
大肠杆菌 DNA聚合酶 Ⅲ
真核生物 DNA聚合酶
α,β,γ及 δ四种，都有 5`→ 3` 聚合功能。 α
及 δ参与核 DNA复制；
α：链合成的引发,δ：链的延长
polδ；切除引物后填补空隙
β：外切核酸酶
γ：线粒体 DNA复制
其它环状 DNA分子的复制
? 1,θ复制,首先由 J.Carins 从大肠杆菌中观
察到,又称为 Carins复制。
? 2、滚环复制（ rolling circle replication)
? 3,D环复制（ D loop replication)：线粒
体 DNA复制
端粒与端粒酶 (telomerase)
? Telomere:真核生物线性染色体 3末端的一种特
殊结构。核苷酸重复序列富含 G，和端粒结合
蛋白组成核蛋白复合物。人的 DNA端粒含有
TTAGGG重复序列，长度 5~15kb。
? 作用：保护染色体末端免于化学修饰或核酸酶
降解；解决染色体复制时末端丢失问题。
?
? Telomerase,由 RNA和蛋白质组成的酶。兼有
模板和逆转录酶两方面的作用。
? 1995年,Junli Feng等克隆了人类端粒酶 RNA基
因，长约 450个碱基的 RNA序列中有一段长 11
个核苷酸的区域（ 5-CUAACCCUAAC-3）与人
的端粒序列（ TTAGGG） n互补。
? 端粒酶蛋白质的分离：四膜虫端粒酶两个多肽
成分 p80和 p95。
端粒与衰老
实验,在无端粒酶活性的成纤维细胞中表
达端粒酶时，端粒的缩短和细胞的衰老
都受到抑制。
结论,细胞的衰老是由端粒驱动的。
体外培养的细胞端粒的长度随细胞逐代相
传而缩短，丢失到一定程度便失去对染
色体的保护作用。细胞随之发生衰老和
死亡。
可把端粒看成一面钟，端粒的长度是钟上
的刻度，记载了细胞分裂的次数，称为
“端粒钟”，或有丝分裂钟 或“生命的
时钟”，可通过测定端粒的长度预测细
胞的寿命。
胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度并不随细
胞分裂次数的增加而缩短，具有无限的
分裂能力，原因在于端粒酶的存在。
端粒酶与肿瘤
? 人体内除了生殖细胞和少数一些体细胞如淋巴
细胞等细胞外，绝大多数体细胞中无法检测到
端粒酶的活性，而在多数肿瘤细胞中能检测到
端粒酶的活性。
? 肿瘤的端粒长度很短，其继续缩短导致染色体
融合、细胞死亡，而端粒酶的激活可以维持端
粒的长度，维持肿瘤的继续分裂、增殖。
? 端粒酶的表达可能是肿瘤形成和发展的共同途
径。
? 端粒酶与恶性肿瘤之间有相关性使之在
肿瘤的诊断和治疗上有望成为新的靶目
标。
? 可以通过各种途径抑制端粒酶的活性有
效抑制大多数肿瘤的生长，而对正常细
胞没有影响。
逆转录（ reverse
transcription)
? 逆转录酶 （ reverse transcription)
? 逆转录病毒的基因组复制过程
? 乙肝病毒基因组的复制
逆转录酶 （ reverse
transcription)
? 1964年,Temin发现 Rous肉瘤病毒等 RNA病毒
所造成的感染可被 DNA合成抑制剂遏制。
表明,RNA肿瘤病毒的 RNA复制过程中要合成
DNA。
? Temin又发现放线菌素 D能抑制致癌 RNA病毒
的复制，但不能抑制一般 RNA病毒的复制。
表明：转录对于 RNA病毒增殖是必需的。
? Temin提出前病毒假说：原病毒 DNA是
RNA肿瘤病毒在复制和致癌中的中间物。
? 1970年,Temin 在 Rouse肉瘤病毒、
Baltimore在白血病病毒中发现逆转录酶。
? 多功能酶：
1,RNA指导的 DNA聚合酶活性
2,RNA酶 H（ RNaseH）活性：水解 RNA-
DNA杂交体上的 RNA
3,DNA指导的 DNA聚合酶活性：合成互
补 DNA。
4、没有 3`→5` 外切酶活性。
? 特点：
? 含有 Zn2+
? DNA合成反应要求有模板和引物。
? 需适当浓度的二价阳离子（ Mg2+,Mn2+）
? 5’ →3’
→
逆转录病毒 的基因
组复制过程
? 第一阶段：合成负股 cDNA的大部分
? 第二阶段：以负股 DNA为模板合成一小
部分正股 DNA链。
? 第三阶段：完成 cDNA的全部复制。
乙肝病毒基因组 的复制
? 其复制需通过逆转录过程经 RNA中间体
实现,其 DNA聚合酶也是一种逆转录酶。
? 逆转录病毒,RNA → DNA → RNA
? 乙肝病毒,DNA→RNA → DNA
试管内 cDNA的合成
? 常用于获得或研究真核生物基因的方法。
提取某一种特定的 mRNA，经逆转录生
成的 cDNA可代表某一特定基因。
? 常用的逆转录酶有两种：来自鸟类成髓
细胞瘤逆转录病毒称为 AMV-RT；来自
鼠白血病毒称为 MMLV-RT。
病毒 RNA复制的主要方式
? 1、病毒含有正链 RNA，如灰质炎病毒。 RNA
（ +） → 蛋白质（酶） → RNA复制
? 2、病毒含有负链 RNA和复制酶如狂犬病毒。
RNA（ — ） → RNA（ +） → 蛋白质、复制病
毒 RNA。
? 3、病毒含有双链 RNA和复制酶。如呼肠孤。
双链 RNA → RNA （ +） → 蛋白质 → RNA（ — ）
→ 双链 RNA
? 4、逆转录病毒。
讨论题
? 如何知道 DNA复制中先要有 RNA引物的
合成？
? 原料
? 新合成 DNA序列分析
? 专一核酸酶水解
? 某种病毒 DNA的碱基组成（摩尔百分比）
如下：
A=32； G=16； T=40； C=12
该病毒 DNA的特点如何？
? 简要说明怎样进行构建 cDNA文库？
? 组织培养的哺乳动物细胞 S期长达 5 小时，
经放射自显影测定 DNA复制的速度是 0.5
微米 /分，已知哺乳动物细胞 DNA全长 1.2
米，计算染色体复制时共有多少复制叉
在复制？
? 8× 103
? 已知抹香鲸和猪的胰岛素具有相同的氨
基酸序列，然而某些抗血清却能将它们
区别开来，这岂不与“蛋白质的一级结
构决定其高级结构”的理论相矛盾吗？
你如何解释？
? 将某种纯蛋白 1mg进行氨基酸分析，得
19.5ug的异亮氨酸（分子量 =131.2），
那么该蛋白质的最小分子量是多少？
质粒 DNA的提取与纯化
? 1、细菌的培养
? 2、细菌的收集与裂解
? 3、质粒 DNA的纯化：
碱裂解法
? 原理：在 pH12.0~12.6的碱性环境中，线
性的大分子量细菌染色体变性，而共价
闭环的质粒 DNA仍为自然状态
DNA replication
DNA damage and repair
Reverse transcription
RNA replication
DNA复制的基本特点
? 半保留复制（ self-conservative replication）
? 复制子（ replicon)
半保留复制
? 1958年,Meselson 和 Stahl首次用实验证
实了 DNA的半保留复制。
? 步骤：
? 用普通培养基（ 14N）培养 15N标记的大肠
杆菌。用 CsCl密度梯度离心法分析 DNA。
? 加热子一代 DNA分子。
复制子（ replicon)
? 复制子,基因组中能单独进行复制的单位。
每个起始点到终止点的区域为一个复制子。
起始点（ origin of replication,ori):原核生物 DNA
分子中只有一个，长度 200bp左右。大肠杆菌
ori C有 245 bp。真核生物有多个复制起始点。
? 终点（ ter）,D,A,C,B（ 23bp共有序列）
Tus（ terminator utilization substance）识别终止
序列。
? 复制的方向,单向或双向
原核生物 DNA聚合酶
（ DNA polymerase,DNA pol)
? 1958年 Kornberg首先从大肠杆菌提取
? DNA polⅠ, 聚合作用, 5` → 3`
? 3` → 5` 外切酶活性,校对功能
? 5` → 3` 外切酶活性,引物切除、损伤修
复
? 主要功能是切除引物，填补冈崎片段产
生的空隙及 DNA损伤的修复
DNA polⅠ 是单一肽链的大分子,分子量为 109kD,
二级结构以 α-螺旋为主。
用特异的蛋白酶处理，可把 DNA polⅠ 水解为两
个片段，即在 F,G螺旋之间发生断裂。
小片段,323个氨基酸残基,5` → 3` 外切酶活性
大片段或称 Klenow片段,604个氨基酸残基，
DNA聚合酶活性和 3` → 5` 外切酶活性
? DNA pol Ⅱ, 5` → 3` 聚合酶活性及 3` →
5`外切核酸酶活性。
? DNA polⅢ, 由 10 个亚基组成，分别为 α、
ε,θ,τ,δ,δ`,β,κ及 ψ。是原核生物
体内真正起复制作用的酶。
α亚基,5` → 3` 聚合酶活性
ε亚基,3` → 5` 外切酶,校对和编辑
θ为装配必须
大肠杆菌 DNA聚合酶 Ⅲ
真核生物 DNA聚合酶
α,β,γ及 δ四种，都有 5`→ 3` 聚合功能。 α
及 δ参与核 DNA复制；
α：链合成的引发,δ：链的延长
polδ；切除引物后填补空隙
β：外切核酸酶
γ：线粒体 DNA复制
其它环状 DNA分子的复制
? 1,θ复制,首先由 J.Carins 从大肠杆菌中观
察到,又称为 Carins复制。
? 2、滚环复制（ rolling circle replication)
? 3,D环复制（ D loop replication)：线粒
体 DNA复制
端粒与端粒酶 (telomerase)
? Telomere:真核生物线性染色体 3末端的一种特
殊结构。核苷酸重复序列富含 G，和端粒结合
蛋白组成核蛋白复合物。人的 DNA端粒含有
TTAGGG重复序列，长度 5~15kb。
? 作用：保护染色体末端免于化学修饰或核酸酶
降解；解决染色体复制时末端丢失问题。
?
? Telomerase,由 RNA和蛋白质组成的酶。兼有
模板和逆转录酶两方面的作用。
? 1995年,Junli Feng等克隆了人类端粒酶 RNA基
因，长约 450个碱基的 RNA序列中有一段长 11
个核苷酸的区域（ 5-CUAACCCUAAC-3）与人
的端粒序列（ TTAGGG） n互补。
? 端粒酶蛋白质的分离：四膜虫端粒酶两个多肽
成分 p80和 p95。
端粒与衰老
实验,在无端粒酶活性的成纤维细胞中表
达端粒酶时，端粒的缩短和细胞的衰老
都受到抑制。
结论,细胞的衰老是由端粒驱动的。
体外培养的细胞端粒的长度随细胞逐代相
传而缩短，丢失到一定程度便失去对染
色体的保护作用。细胞随之发生衰老和
死亡。
可把端粒看成一面钟，端粒的长度是钟上
的刻度，记载了细胞分裂的次数，称为
“端粒钟”，或有丝分裂钟 或“生命的
时钟”，可通过测定端粒的长度预测细
胞的寿命。
胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度并不随细
胞分裂次数的增加而缩短，具有无限的
分裂能力，原因在于端粒酶的存在。
端粒酶与肿瘤
? 人体内除了生殖细胞和少数一些体细胞如淋巴
细胞等细胞外，绝大多数体细胞中无法检测到
端粒酶的活性，而在多数肿瘤细胞中能检测到
端粒酶的活性。
? 肿瘤的端粒长度很短，其继续缩短导致染色体
融合、细胞死亡，而端粒酶的激活可以维持端
粒的长度，维持肿瘤的继续分裂、增殖。
? 端粒酶的表达可能是肿瘤形成和发展的共同途
径。
? 端粒酶与恶性肿瘤之间有相关性使之在
肿瘤的诊断和治疗上有望成为新的靶目
标。
? 可以通过各种途径抑制端粒酶的活性有
效抑制大多数肿瘤的生长，而对正常细
胞没有影响。
逆转录（ reverse
transcription)
? 逆转录酶 （ reverse transcription)
? 逆转录病毒的基因组复制过程
? 乙肝病毒基因组的复制
逆转录酶 （ reverse
transcription)
? 1964年,Temin发现 Rous肉瘤病毒等 RNA病毒
所造成的感染可被 DNA合成抑制剂遏制。
表明,RNA肿瘤病毒的 RNA复制过程中要合成
DNA。
? Temin又发现放线菌素 D能抑制致癌 RNA病毒
的复制，但不能抑制一般 RNA病毒的复制。
表明：转录对于 RNA病毒增殖是必需的。
? Temin提出前病毒假说：原病毒 DNA是
RNA肿瘤病毒在复制和致癌中的中间物。
? 1970年,Temin 在 Rouse肉瘤病毒、
Baltimore在白血病病毒中发现逆转录酶。
? 多功能酶：
1,RNA指导的 DNA聚合酶活性
2,RNA酶 H（ RNaseH）活性：水解 RNA-
DNA杂交体上的 RNA
3,DNA指导的 DNA聚合酶活性：合成互
补 DNA。
4、没有 3`→5` 外切酶活性。
? 特点：
? 含有 Zn2+
? DNA合成反应要求有模板和引物。
? 需适当浓度的二价阳离子（ Mg2+,Mn2+）
? 5’ →3’
→
逆转录病毒 的基因
组复制过程
? 第一阶段：合成负股 cDNA的大部分
? 第二阶段：以负股 DNA为模板合成一小
部分正股 DNA链。
? 第三阶段：完成 cDNA的全部复制。
乙肝病毒基因组 的复制
? 其复制需通过逆转录过程经 RNA中间体
实现,其 DNA聚合酶也是一种逆转录酶。
? 逆转录病毒,RNA → DNA → RNA
? 乙肝病毒,DNA→RNA → DNA
试管内 cDNA的合成
? 常用于获得或研究真核生物基因的方法。
提取某一种特定的 mRNA，经逆转录生
成的 cDNA可代表某一特定基因。
? 常用的逆转录酶有两种：来自鸟类成髓
细胞瘤逆转录病毒称为 AMV-RT；来自
鼠白血病毒称为 MMLV-RT。
病毒 RNA复制的主要方式
? 1、病毒含有正链 RNA，如灰质炎病毒。 RNA
（ +） → 蛋白质（酶） → RNA复制
? 2、病毒含有负链 RNA和复制酶如狂犬病毒。
RNA（ — ） → RNA（ +） → 蛋白质、复制病
毒 RNA。
? 3、病毒含有双链 RNA和复制酶。如呼肠孤。
双链 RNA → RNA （ +） → 蛋白质 → RNA（ — ）
→ 双链 RNA
? 4、逆转录病毒。
讨论题
? 如何知道 DNA复制中先要有 RNA引物的
合成？
? 原料
? 新合成 DNA序列分析
? 专一核酸酶水解
? 某种病毒 DNA的碱基组成（摩尔百分比）
如下：
A=32； G=16； T=40； C=12
该病毒 DNA的特点如何？
? 简要说明怎样进行构建 cDNA文库？
? 组织培养的哺乳动物细胞 S期长达 5 小时，
经放射自显影测定 DNA复制的速度是 0.5
微米 /分，已知哺乳动物细胞 DNA全长 1.2
米，计算染色体复制时共有多少复制叉
在复制？
? 8× 103
? 已知抹香鲸和猪的胰岛素具有相同的氨
基酸序列，然而某些抗血清却能将它们
区别开来，这岂不与“蛋白质的一级结
构决定其高级结构”的理论相矛盾吗？
你如何解释？
? 将某种纯蛋白 1mg进行氨基酸分析，得
19.5ug的异亮氨酸（分子量 =131.2），
那么该蛋白质的最小分子量是多少？
质粒 DNA的提取与纯化
? 1、细菌的培养
? 2、细菌的收集与裂解
? 3、质粒 DNA的纯化：
碱裂解法
? 原理：在 pH12.0~12.6的碱性环境中，线
性的大分子量细菌染色体变性，而共价
闭环的质粒 DNA仍为自然状态
