第十七章 基因治疗
第一节 概 述
一、基因治疗的概念
基因治疗（ gene therapy） —— 就是向有
功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以
纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗
的目的。
对象,体细胞 生殖细胞
二、基因治疗的必要条件
1,发病机制在 DNA水平上已经清楚
2,要转移的基因已经克隆分离，其表达
产物有详尽的了解
3,该基因正常表达的组织可在体外进行
遗传操作
理想的基因治疗还必须：
1,外源基因可有效导入靶细胞
2,外源基因能在靶细胞中长期稳定存留
3,导入基因能适量表达
4,导入基因的方法及载体对宿主细胞安
全无害
三、基因治疗的主要内容或策略
㈠ 基因标记 (gene labeling)
Neo基因，逆转录病毒载体
㈡基因置换（基因矫正）
定位重组或同源重组纠正缺陷基因或异
常序列
㈢ 基因添加（基因增补）
导入外源基因使靶细胞表达其本身不表
达的基因
1,导入正常的基因补偿缺陷基因的
功能
2,导入新的基因，利用表达产物治
疗
㈣ 基因干预 (gene interference)
指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或
者通过破坏某个基因而使之不表达，以达
到治疗疾病的目的。 (mRNA,DNA)
导入寡核苷酸抑制内源基因的表达
1,反义核酸 封闭基因表达
2,核酶 裂解特异的靶 mRNA
第二节 基因转移技术和
靶细胞
基因治疗的基本方式：
1,体内直接转基因
体内法 in vivo
2,体细胞介导的基因治疗
回体法 ex vivo
基因转移的方法：
生物学方法
逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺病
毒相关病毒载体，单纯疱疹病毒载
体
非生物学方法
脂质体，直接注射，受体介导基因转
移技术，其它方法
一、基因转移的生物学方法
㈠ 逆转录病毒载体：
1,逆转录病毒载体的结构
将病毒前 DNA经适当改造并插入质粒后构建
而成
5′LTR/ 3′LTR
包装信号（ ψ序列）
Neo基因 / Ampr
酶切位点（多克隆位点）
2,包装细胞 (packaging cell)
将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转
录病毒导入哺乳动物细胞，大量产生病毒
包装蛋白。 NIH/3T3
三代包装细胞：
ψ— 2
PA317
ψCRIP
逆转录病毒载体导入包装细胞后，载体转
录出病毒基因组的部分序列、标记基因、
外源基因，被包装成病毒颗粒。
缺陷型的逆转录病毒颗粒
一过性感染
病毒滴度 106CFU/ml以上
3,逆转录病毒载体的特点：
缺陷型的逆转录病毒感染细胞
RNA进入靶细胞后，变成前病毒并整
合到宿主细胞的染色体上，可稳定
表达
只能感染处于增殖期的细胞
4,安全性问题
逆转录病毒感染的可能性
污染的可能性
逆转录病毒在靶细胞基因组上的整合
破坏细胞正常生长的必须基因 /抑癌基因
LTR激活原癌基因
染色体重排激活原癌基因
二、基因转移的非生物学方法
㈠ 脂质体
㈡直接注射
㈢受体介导基因转移技术
㈣其它方法
㈠ 脂质体 ( liposome )
1,脂质体是由脂类形成的一种可以高
效包装 DNA的人造单层膜，是一种
脂质双层包围水溶液的脂质微球。
2,其结构和性质与细胞膜极为相似，
二者易于融合,DNA由于细胞的内
吞作用进入细胞。
人工脂质体膜具有如下特点：
1,与体细胞相容，无毒性和免疫原性
2,可生物降解，不会在体内堆积
3,可制成球状 (0.03~50 ?m)，包容大小不同
的生物活性分子
4,可带有不同的电荷
5,具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度
敏感性，能适应不同的生理要求
㈡ 直接注射
方法：注射，包埋
溶液类型对基因表达有影响：
重组 DNA可贮存于 5%~30%的蔗糖溶
液中
也可用生理盐水或 PBS
㈢ 受体介导基因转移技术
受体介导的细胞内吞作用
特点：
1,具有细胞、组织或器官专一性，配
体只能被一些特异的细胞吞噬
2,配体进入细胞的转移效率很高
核酸运载工具：
配体 +多聚赖氨酸（ PL）
配体 — PL— 核酸
脱唾液酸血清类粘蛋白（ ASGP） 配体
肝细胞 受体
㈣ 其它方法
磷酸钙共沉淀法
电穿孔法
显微注射法
基因枪法
三、基因转移的靶细胞
靶细胞的选择须考虑：
1,最好为组织特异性细胞
2,细胞较易获得，且生命周期较长
3,离体细胞较易受外源基因转化
4,离体细胞经转染和一定时间培养后再植回
体内，仍较易成活
目前常用的靶细胞有：
1,造血细胞
2,皮肤成纤维细胞
3,肝细胞
4,血管内皮细胞
5,淋巴细胞
6,肌肉细胞
7,肿瘤细胞
第三节 反义 RNA、核酶和三
链 DNA在基因治疗中的作用
一、反义 RNA
㈠ 反义 RNA在基因治疗中的意义及需解决
的问题
反义 RNA与特异的 mRNA结合而调控
其翻译
1,体外合成反义 RNA
2,构建转录反义 RNA的重组质粒
㈡ 受体介导反义 RNA转移技术
ASGP— PL— 反义 RNA
㈢ 应用前景
1,安全性高
2,反义 RNA设计和制备方便
3,具有剂量调节效应
4,能直接作用于一些 RNA病毒
二、核 酶
㈠ 核酶的设计
靶序列
1,无二级结构
2,切割位点 GUN
3,容易与其它 RNA互补结合
㈡ 核酶的应用
核酶结构稳定
可重复使用
三、三链 DNA
㈠ 三链 DNA在基因治疗中的意义
寡聚脱氧核苷酸（ ODN）以 DNA双螺旋分子
的专一性序列为靶子，通过与该序列形成
三螺旋 DNA来阻止转录
㈡作用机制
㈡ 作用机制
合成脱氧寡核苷酸（ ODN）（同聚嘌
呤或同聚嘧啶）
DNA分子中同聚嘌呤 · 同聚嘧啶
ODN也被称为 TFO(triplex-forming oligo)
㈢ 技术关键
TFO 的设计与合成
1,专一性
2,稳定性
3,摄取与分布
第四节 基因治疗的应用研究
一、遗传病的基因治疗研究
1990.9.14 首例基因治疗
4岁 女孩 严重免疫缺陷症 (SCID)
缺乏腺苷酸脱氨酶 (ADA) 2--脱氧腺苷含
量升高 毒性 严重破坏免疫功能
ADA基因 LN逆转录病毒载体
靶细胞为病人淋巴细胞 回输
二、肿瘤的基因治疗研究
㈠ 修正肿瘤相关基因的功能
1,恢复抑癌基因的功能
2,纠正癌基因的表达
㈡导入特定的基因产生肿瘤特异的药物敏
感性
自杀基因疗法
HSV-tk
㈢ 肿瘤的免疫基因治疗
1,外源基因导入肿瘤细胞
细胞因子,MHC ⅠⅡ
2,外源基因导入免疫细胞
TNF
3,肿瘤的免疫基因治疗面临的问题
细胞因子作用的双重性
细胞因子基因转染肿瘤细胞疫苗的有效性
第五节 基因治疗的前景与问题
第一节 概 述
一、基因治疗的概念
基因治疗（ gene therapy） —— 就是向有
功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以
纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗
的目的。
对象,体细胞 生殖细胞
二、基因治疗的必要条件
1,发病机制在 DNA水平上已经清楚
2,要转移的基因已经克隆分离，其表达
产物有详尽的了解
3,该基因正常表达的组织可在体外进行
遗传操作
理想的基因治疗还必须：
1,外源基因可有效导入靶细胞
2,外源基因能在靶细胞中长期稳定存留
3,导入基因能适量表达
4,导入基因的方法及载体对宿主细胞安
全无害
三、基因治疗的主要内容或策略
㈠ 基因标记 (gene labeling)
Neo基因，逆转录病毒载体
㈡基因置换（基因矫正）
定位重组或同源重组纠正缺陷基因或异
常序列
㈢ 基因添加（基因增补）
导入外源基因使靶细胞表达其本身不表
达的基因
1,导入正常的基因补偿缺陷基因的
功能
2,导入新的基因，利用表达产物治
疗
㈣ 基因干预 (gene interference)
指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或
者通过破坏某个基因而使之不表达，以达
到治疗疾病的目的。 (mRNA,DNA)
导入寡核苷酸抑制内源基因的表达
1,反义核酸 封闭基因表达
2,核酶 裂解特异的靶 mRNA
第二节 基因转移技术和
靶细胞
基因治疗的基本方式：
1,体内直接转基因
体内法 in vivo
2,体细胞介导的基因治疗
回体法 ex vivo
基因转移的方法：
生物学方法
逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺病
毒相关病毒载体，单纯疱疹病毒载
体
非生物学方法
脂质体，直接注射，受体介导基因转
移技术，其它方法
一、基因转移的生物学方法
㈠ 逆转录病毒载体：
1,逆转录病毒载体的结构
将病毒前 DNA经适当改造并插入质粒后构建
而成
5′LTR/ 3′LTR
包装信号（ ψ序列）
Neo基因 / Ampr
酶切位点（多克隆位点）
2,包装细胞 (packaging cell)
将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转
录病毒导入哺乳动物细胞，大量产生病毒
包装蛋白。 NIH/3T3
三代包装细胞：
ψ— 2
PA317
ψCRIP
逆转录病毒载体导入包装细胞后，载体转
录出病毒基因组的部分序列、标记基因、
外源基因，被包装成病毒颗粒。
缺陷型的逆转录病毒颗粒
一过性感染
病毒滴度 106CFU/ml以上
3,逆转录病毒载体的特点：
缺陷型的逆转录病毒感染细胞
RNA进入靶细胞后，变成前病毒并整
合到宿主细胞的染色体上，可稳定
表达
只能感染处于增殖期的细胞
4,安全性问题
逆转录病毒感染的可能性
污染的可能性
逆转录病毒在靶细胞基因组上的整合
破坏细胞正常生长的必须基因 /抑癌基因
LTR激活原癌基因
染色体重排激活原癌基因
二、基因转移的非生物学方法
㈠ 脂质体
㈡直接注射
㈢受体介导基因转移技术
㈣其它方法
㈠ 脂质体 ( liposome )
1,脂质体是由脂类形成的一种可以高
效包装 DNA的人造单层膜，是一种
脂质双层包围水溶液的脂质微球。
2,其结构和性质与细胞膜极为相似，
二者易于融合,DNA由于细胞的内
吞作用进入细胞。
人工脂质体膜具有如下特点：
1,与体细胞相容，无毒性和免疫原性
2,可生物降解，不会在体内堆积
3,可制成球状 (0.03~50 ?m)，包容大小不同
的生物活性分子
4,可带有不同的电荷
5,具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度
敏感性，能适应不同的生理要求
㈡ 直接注射
方法：注射，包埋
溶液类型对基因表达有影响：
重组 DNA可贮存于 5%~30%的蔗糖溶
液中
也可用生理盐水或 PBS
㈢ 受体介导基因转移技术
受体介导的细胞内吞作用
特点：
1,具有细胞、组织或器官专一性，配
体只能被一些特异的细胞吞噬
2,配体进入细胞的转移效率很高
核酸运载工具：
配体 +多聚赖氨酸（ PL）
配体 — PL— 核酸
脱唾液酸血清类粘蛋白（ ASGP） 配体
肝细胞 受体
㈣ 其它方法
磷酸钙共沉淀法
电穿孔法
显微注射法
基因枪法
三、基因转移的靶细胞
靶细胞的选择须考虑：
1,最好为组织特异性细胞
2,细胞较易获得，且生命周期较长
3,离体细胞较易受外源基因转化
4,离体细胞经转染和一定时间培养后再植回
体内，仍较易成活
目前常用的靶细胞有：
1,造血细胞
2,皮肤成纤维细胞
3,肝细胞
4,血管内皮细胞
5,淋巴细胞
6,肌肉细胞
7,肿瘤细胞
第三节 反义 RNA、核酶和三
链 DNA在基因治疗中的作用
一、反义 RNA
㈠ 反义 RNA在基因治疗中的意义及需解决
的问题
反义 RNA与特异的 mRNA结合而调控
其翻译
1,体外合成反义 RNA
2,构建转录反义 RNA的重组质粒
㈡ 受体介导反义 RNA转移技术
ASGP— PL— 反义 RNA
㈢ 应用前景
1,安全性高
2,反义 RNA设计和制备方便
3,具有剂量调节效应
4,能直接作用于一些 RNA病毒
二、核 酶
㈠ 核酶的设计
靶序列
1,无二级结构
2,切割位点 GUN
3,容易与其它 RNA互补结合
㈡ 核酶的应用
核酶结构稳定
可重复使用
三、三链 DNA
㈠ 三链 DNA在基因治疗中的意义
寡聚脱氧核苷酸（ ODN）以 DNA双螺旋分子
的专一性序列为靶子，通过与该序列形成
三螺旋 DNA来阻止转录
㈡作用机制
㈡ 作用机制
合成脱氧寡核苷酸（ ODN）（同聚嘌
呤或同聚嘧啶）
DNA分子中同聚嘌呤 · 同聚嘧啶
ODN也被称为 TFO(triplex-forming oligo)
㈢ 技术关键
TFO 的设计与合成
1,专一性
2,稳定性
3,摄取与分布
第四节 基因治疗的应用研究
一、遗传病的基因治疗研究
1990.9.14 首例基因治疗
4岁 女孩 严重免疫缺陷症 (SCID)
缺乏腺苷酸脱氨酶 (ADA) 2--脱氧腺苷含
量升高 毒性 严重破坏免疫功能
ADA基因 LN逆转录病毒载体
靶细胞为病人淋巴细胞 回输
二、肿瘤的基因治疗研究
㈠ 修正肿瘤相关基因的功能
1,恢复抑癌基因的功能
2,纠正癌基因的表达
㈡导入特定的基因产生肿瘤特异的药物敏
感性
自杀基因疗法
HSV-tk
㈢ 肿瘤的免疫基因治疗
1,外源基因导入肿瘤细胞
细胞因子,MHC ⅠⅡ
2,外源基因导入免疫细胞
TNF
3,肿瘤的免疫基因治疗面临的问题
细胞因子作用的双重性
细胞因子基因转染肿瘤细胞疫苗的有效性
第五节 基因治疗的前景与问题
