真核表达体系
? 转染方法
– 磷酸钙沉淀
– DEAE葡聚糖介导转染
– 电穿孔
– 脂质体转染；人造膜
– 显微注射
? 筛选标志 tk- Neor G418
? 瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组
? 稳定转染 目的基因整合进宿主基因组
tk- 细胞突变株筛选转染细胞
? 胸苷激酶（ tk）
– TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合
成
– HAT选择（ H：次黄嘌呤； A：氨甲喋呤；
T：胸苷）
– tk+：生长
– tk-+带 tk基因的质粒：生长
药物筛选转染细胞
? neor
– 新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质
合成
– G418：干扰原核、真核生物
– neo：磷酸转移酶，使 G418失活
– neo 与目的基因连锁,转染
目的基因的定点诱变及其应用
? 基因定点诱变技术
? 基因定点诱变技术的应用
– 长效胰岛素、快速吸收胰岛素
– 基因克隆的改建
* 碱性成纤维细胞生长因子（ bFGH）：牛源性 →
人源性,2个核苷酸的差异
第九章 DNA序列测定
? 末端终止法 --待测单链 DNA 模板 引物
四种 dNTP(其中一种用 32P/35S标记 ) 终止剂
(ddNTP) DNA聚合酶
? Sanger发明：两次获得 诺贝尔奖
? 分别得到 ddA ddT ddG ddC结尾的片段
? 测序过程,
– 1.模板与引物杂交
– 2.引物的延长和合成阻断
* 四个试管分别加入 DNA聚合酶 dNTP 标记底物
* 终止剂不同 ddA ddG ddC ddT
* 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸
的聚合链
– 3.电泳 ACGT次序 高压电泳
– 4.放射自显影得到直读图象
第十章 核酸分子杂交技术
? 概念：具有互补序列的两条核酸单链在
一定条件下，按碱基配对原则形成双链
的过程。
? 探针 待测核酸 杂交分子
? 核酸分子杂交的基本原理
? 核酸分子杂交的基本方法
? 探针的标记
核酸分子杂交的基本原理
? DNA变性
– 方法
* 热变性,90~100℃
* 酸碱变性：常采用碱变性
* 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等
– 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶
解温度 (melting temperature,Tm)
? DNA复性或杂交 (hybridization)
– DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
影响杂交的因素
? 核酸分子的浓度和长度
– 浓度大，复性快；分子量大，复性慢
? 温度
? 离子强度
? 杂交液中的甲酰胺
? 核酸分子的复杂性
? 非特异性杂交反应
– 预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子 DNA
分子杂交的基本方法
? Southern 印迹法
? Northern 印迹法
? 斑点印迹杂交
? 原位杂交
? Western 印迹法
? 液相杂交
bp
—1534
— 994
— 695
— 515
— 377
— 237
A B C M
Southern 印迹杂交
? 1975年，英国 Southern创建
? DNA/DNA杂交，即将 DNA电泳、转印到
固相支持物上，用探针进行检测的方法。
Southern 杂交 (Southern bloting)的主要步骤
? 待测 DNA样品的制备、酶切
? 待测 DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳
? 凝胶中 DNA的变性：碱变性
? Southern转膜：
– 硝酸纤维素 (NC)膜、尼龙膜
– 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法
? 探针的制备
? Southern杂交
? 杂交结果的检测
Northern 印迹杂交 (Northern bloting)
? 检测 RNA（主要是 mRNA）的方法
? 与 Southern杂交的不同
– 靶核酸,RNA
– RNA电泳
– 转膜：不需变性
斑点印迹杂交 (dot bloting)
? 将 RNA或 DNA变性后直接点样于 NC膜或
尼龙膜上
? 优点：简单、快速、可同时检测多个样
品
原位杂交 (in situ hybridization)
? 将标记的核酸探针与 细胞或组织中的 核
酸进行杂交，称为原位杂交。
? 特点
– 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究
– 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低
的靶序列灵敏度高
– 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态
核酸原位杂交的基本步骤
? 细胞或组织的固定：载玻片
? 组织细胞杂交前的预处理
– 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质
? 探针的选择和标记
? 杂交
? 杂交结果检测
Western 杂交印迹法 (Western bloting)
? 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋
白质转移到固相载体上，用特异的抗血
清对蛋白质进行鉴定及定量的方法
? 主要步骤：
– 蛋白质样品的制备
– SDS-聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE)电泳
– 蛋白质的电转移,NC膜
– 靶蛋白的免疫学检测
* 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应
* 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应
* 显色反应：酶促反应
液相杂交
? 核酸分子与核酸探针存在于杂交液中
? RNA酶保护分析法
? 核酸酶 S1保护分析法
探针的标记
? 探针的种类
– cDNA 探针、基因组 DNA探针、寡核苷酸探针、
RNA探针
? 标记物
– 核素标记物（同位素标记）,32P,35S,3H等
– 非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地
高辛、荧光素等
? 探针标记方法
– 缺口平移法 (nick translation)
– 随机引物法 (random primer)：六核苷酸残
基的引物
– PCR标记法
– 末端标记法
? 探针的纯化
? 转染方法
– 磷酸钙沉淀
– DEAE葡聚糖介导转染
– 电穿孔
– 脂质体转染；人造膜
– 显微注射
? 筛选标志 tk- Neor G418
? 瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组
? 稳定转染 目的基因整合进宿主基因组
tk- 细胞突变株筛选转染细胞
? 胸苷激酶（ tk）
– TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合
成
– HAT选择（ H：次黄嘌呤； A：氨甲喋呤；
T：胸苷）
– tk+：生长
– tk-+带 tk基因的质粒：生长
药物筛选转染细胞
? neor
– 新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质
合成
– G418：干扰原核、真核生物
– neo：磷酸转移酶，使 G418失活
– neo 与目的基因连锁,转染
目的基因的定点诱变及其应用
? 基因定点诱变技术
? 基因定点诱变技术的应用
– 长效胰岛素、快速吸收胰岛素
– 基因克隆的改建
* 碱性成纤维细胞生长因子（ bFGH）：牛源性 →
人源性,2个核苷酸的差异
第九章 DNA序列测定
? 末端终止法 --待测单链 DNA 模板 引物
四种 dNTP(其中一种用 32P/35S标记 ) 终止剂
(ddNTP) DNA聚合酶
? Sanger发明：两次获得 诺贝尔奖
? 分别得到 ddA ddT ddG ddC结尾的片段
? 测序过程,
– 1.模板与引物杂交
– 2.引物的延长和合成阻断
* 四个试管分别加入 DNA聚合酶 dNTP 标记底物
* 终止剂不同 ddA ddG ddC ddT
* 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸
的聚合链
– 3.电泳 ACGT次序 高压电泳
– 4.放射自显影得到直读图象
第十章 核酸分子杂交技术
? 概念：具有互补序列的两条核酸单链在
一定条件下，按碱基配对原则形成双链
的过程。
? 探针 待测核酸 杂交分子
? 核酸分子杂交的基本原理
? 核酸分子杂交的基本方法
? 探针的标记
核酸分子杂交的基本原理
? DNA变性
– 方法
* 热变性,90~100℃
* 酸碱变性：常采用碱变性
* 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等
– 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶
解温度 (melting temperature,Tm)
? DNA复性或杂交 (hybridization)
– DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等
影响杂交的因素
? 核酸分子的浓度和长度
– 浓度大，复性快；分子量大，复性慢
? 温度
? 离子强度
? 杂交液中的甲酰胺
? 核酸分子的复杂性
? 非特异性杂交反应
– 预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子 DNA
分子杂交的基本方法
? Southern 印迹法
? Northern 印迹法
? 斑点印迹杂交
? 原位杂交
? Western 印迹法
? 液相杂交
bp
—1534
— 994
— 695
— 515
— 377
— 237
A B C M
Southern 印迹杂交
? 1975年，英国 Southern创建
? DNA/DNA杂交，即将 DNA电泳、转印到
固相支持物上，用探针进行检测的方法。
Southern 杂交 (Southern bloting)的主要步骤
? 待测 DNA样品的制备、酶切
? 待测 DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳
? 凝胶中 DNA的变性：碱变性
? Southern转膜：
– 硝酸纤维素 (NC)膜、尼龙膜
– 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法
? 探针的制备
? Southern杂交
? 杂交结果的检测
Northern 印迹杂交 (Northern bloting)
? 检测 RNA（主要是 mRNA）的方法
? 与 Southern杂交的不同
– 靶核酸,RNA
– RNA电泳
– 转膜：不需变性
斑点印迹杂交 (dot bloting)
? 将 RNA或 DNA变性后直接点样于 NC膜或
尼龙膜上
? 优点：简单、快速、可同时检测多个样
品
原位杂交 (in situ hybridization)
? 将标记的核酸探针与 细胞或组织中的 核
酸进行杂交，称为原位杂交。
? 特点
– 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究
– 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低
的靶序列灵敏度高
– 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态
核酸原位杂交的基本步骤
? 细胞或组织的固定：载玻片
? 组织细胞杂交前的预处理
– 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质
? 探针的选择和标记
? 杂交
? 杂交结果检测
Western 杂交印迹法 (Western bloting)
? 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋
白质转移到固相载体上，用特异的抗血
清对蛋白质进行鉴定及定量的方法
? 主要步骤：
– 蛋白质样品的制备
– SDS-聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE)电泳
– 蛋白质的电转移,NC膜
– 靶蛋白的免疫学检测
* 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应
* 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应
* 显色反应：酶促反应
液相杂交
? 核酸分子与核酸探针存在于杂交液中
? RNA酶保护分析法
? 核酸酶 S1保护分析法
探针的标记
? 探针的种类
– cDNA 探针、基因组 DNA探针、寡核苷酸探针、
RNA探针
? 标记物
– 核素标记物（同位素标记）,32P,35S,3H等
– 非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地
高辛、荧光素等
? 探针标记方法
– 缺口平移法 (nick translation)
– 随机引物法 (random primer)：六核苷酸残
基的引物
– PCR标记法
– 末端标记法
? 探针的纯化
