第 15 卷第 2 期 大 连 水 产 学 院 学 报 Vol115 No12
2 0 0 0 年 6 月 J OURNAL OF DAL IAN FISHERIES UN IV ERSIT Y J un 1 2 0 0 0
文章编号,1000 - 9957 (2000) 02 - 0079 - 07
诺氟沙星在鱼类细菌性疾病中的应用研究张雅斌 1, 张祚新 2, 郑 伟 1, 刘艳辉 1
(1,吉林省水产科学研究所,长春 130051 ;21 解放军军需大学军事兽医研究所,长春 130062)
摘要,以鲤细菌出血性败血病致病菌强毒力菌株对诺氟沙星 (Norfloxacin) 等 7 种抑菌药物进行体外敏感性测定,其中诺氟沙星高度敏感,最小抑菌浓度 < 012μ g/ mL。体内抗菌药效试验结果表明,每 kg 鱼体重注射 1 mg 诺氟沙星和口服 10 mg/ d 诺氟沙星均能有效杀灭致病菌,提高感染鱼成活率。诺氟沙星的药动学研究结果表明,混饲给药后 0175 h
至 24 h,血药浓度在 012μ g/ mL 以上。据此确定给药方案,口服给药剂量为 10 mg/ (kg·
d),连续给药 5 次,在生产中应用效果良好。诺氟沙星对鲤急性口灌毒性实验结果 LD50
> 1000 mg/ kg (96 h),肌肉残毒测定结果证明,停药 144 h 即无诺氟沙星检出,该药安全范围大,残余期短。
关键词,诺氟沙星 ; 抗菌药效 ; 给药方案 ; 鱼类细菌性疾病中图分类号,S943142 文献标识码,A
诺氟沙星 (Norfloxacin) 是氟喹诺酮类药物之一,因其具有抗菌谱广、抗菌力强,
无交叉耐药性 \[1,2 \]等特点,已被广泛用于医学、兽医界 \[3,4 \]。近年来,诺氟沙星应用于淡水养殖鱼类细菌病的防治已有报道 \[5～ 7 \]。由于以往研究成果仅限于药效学研究,只参考药效学数据或凭经验制定给药方案,在生产中应用显然缺乏理论依据。作者研究了诺氟沙星在鲤体内外的抗菌活性和生产中防治效果,并通过诺氟沙星在鲤体内的药代动力学研究,制定了合理的给药方案,确定了休药期。对药效学、药动学的研究以及急性毒性试验结果,为诺氟沙星在淡水养殖鱼类细菌病防治中的广泛应用提供了理论依据。
1 材料与方法
111 致病菌的毒力试验鲤细菌性败血病致病菌豚鼠气单胞菌 N2,L1菌株由解放军农牧大学及吉林省水产研究所鱼病室提供,供试鱼为吉林省水产研究所实验站一龄健康鲤,体重为 (46 ± 9)
g/ 尾。感染方法如下,
1) 背部肌肉注射 菌悬液浓度为 411 × 107 个 / mL,注射剂量 015 mL/ 尾。
2) 浸泡 Ⅰ 拔去背侧鳞片 3～ 4 枚,移入含菌 112 × 108 个 / L 的水族箱内。
收稿日期,1999210225
基金项目,农业部“九五”重点科研项目 (渔 95 - B - 96 - 03 - 02)
作者简介,张雅斌 (1956 - ),女,高级工程师。
3) 侵泡 Ⅱ 如 2) 法拔去鳞片,将鱼放入约含菌 700 × 109 个 / L 的水容器中浸泡 5
min,再移入自来水水族箱内。对照组注射等量生理盐水或拔掉鳞片后移入自来水水族箱内。随时观察并捞出死鱼,记录结果。取强毒力菌株进行药物试验,试验水温 25～
28 ℃,p H 712。
112 致病菌体外药效试验
1) 纸片法 磺胺类药物用无胨培养基,其他药物用营养培养基,以 N2 菌株按常规操作,26 ℃下培养 24 h 后,测定抑菌圈直径。
2) 试管法 磺胺类药物用无胨营养液体培养基,其他药物用肉膏营养液体培养基。
倍比稀释,配制成含有系列浓度药物的营养液体,接种 N2 菌株,26 ℃下培养 24 h 后记录最小抑菌浓度 (M IC),并将此培养液与相邻的两个浓度培养液分别接种于平板,验证准确性。
诺氟沙星对鱼类细菌性烂鳃病、打印病、赤皮病、肠炎病致病菌 G4,ST78 - 3 - 3,
56 - 12 - 10,58 - 20 - 9 的 M IC 测定同试管法。上述菌种由中国科学院水生生物研究所提供。
113 体内抗菌药效试验
1) 先感染后注射给药 试验组鲤背部肌肉注射约含 411 × 107 个 / mL N2 菌悬液
015 mL/ 尾,2 h 后背肌注射诺氟沙星,剂量为每 kg 鱼体重 1 mg。对照组注射等量菌悬液和生理盐水。观察 7 d,及时捞出显症病鱼和死鱼,记录存活数。
2) 先口服给药后感染 鲤饲料中加入诺氟沙星原药,加水混匀并加热至 80 ℃使成糊状,按每 kg 鱼体重给药 10 mg,以钝头特大号注射器灌入受试鱼前肠,无回吐者保留试验。 2 h 后按上述感染剂量背肌注射菌悬液。对照组口灌相同剂量的糊状饲料及菌悬液。依此法每日一次连续口灌 5 次。观察记录方法同前。
114 口灌急性毒性试验健康鲤 8 尾,平均体重 (46 ± 9) g,在去氯自来水中暂养 5～ 10 d。诺氟沙星 (由解放军军事兽医研究所提供,其质量分数为 9817 %) 用自制钝头注射器灌入鱼前肠,
给药剂量为每 kg 鱼体重 1000 mg。灌后未出现回吐者饲养观察 96 h,记录受试鱼活动情况。
115 诺氟沙星药代动力学研究以,113”中口服给药相同给药方式、给药剂量一次性给药。定时采取心腔血,用
HPLC 法测定血浆中不同时间相应的诺氟沙星含量,并经计算机处理得出相关参数。
诺氟沙星标准品由中国兽药监察所提供,其质量分数为 9915 %。
仪器与色谱条件,用美国 Waters Baseline - 810 高效液相色谱仪,u - Boxdapck -
C18 319 × 300 mm I1D 柱,检测波长 278 nm,进样量 20μ L 。
用 9000 3P87 实用药代动力学软件处理药时数据。
08 大 连 水 产 学 院 学 报 第 15 卷
116 生产性治疗试验以鱼体摄入药量为每 kg 鱼体重 10 mg 计算,鱼类摄食率为 5 %左右,每日投饵 5
次,按每日给药一次,每 100 kg 饵料应加入诺氟沙星原药 50 g。药饵制作,用少量水溶解稀释诺氟沙星原药,然后均匀拌入饲料原料中,再加工成颗粒饲料。治疗时每日投饵一次,连投 5 d 为一个疗程,预防时投喂 3 d 为一个疗程,同时泼洒含氯消毒剂。
治疗试验在吉林省水产研究所实验站发病鱼池中进行,同时对有发病史鱼池进行预防试验,并进行效益分析。
117 鲤肌肉中诺氟沙星残余量的测定给鲤按 10 mg/ kg 灌服诺氟沙星糊状饲料,每日一次,连续 5 d 后停药。取不同停药时间的受试鱼肌肉进行处理,测定药物含量。
2 结果
211 致病菌毒性人工感染 24 h 内即可发病,感染鱼症状与自然病鱼症状基本一致,均出现败血症状。不同感染方法均可引起死亡,死亡率为 8913 %～ 100 %,见表 1。 N2 与 L1 菌株致死强度差异不显著。由于 N2 菌株出现率较高,所以用药物所做的体内外抗菌效果试验中均采用 N2 菌株作为致病菌。
表 1 人工感染试验结果菌株 鱼平均体重 / g
肌 注 法菌悬液注射量
/ (mL·尾 - 1)
死亡数 /
试验鱼数死亡率
/ %
浸 泡 Ⅰ法含菌量
/ (个· mL - 1)
死亡数 /
试验鱼数死亡率
/ %
浸 泡 Ⅱ法含菌量
/ (个· mL - 1)
死亡数 /
试验鱼数死亡率
/ %
N2 46 ± 9 015 25/ 26 9612 1 × 108 25/ 28 8913 700 × 109 28/ 28 10010
L 1 46 ± 9 015 24/ 24 10010 1 × 108 26/ 28 9218 700 × 109 26/ 28 9218
对照 46 ± 9 0 2/ 26 717 0 1/ 28 315 0 3/ 27 1111
212 致病菌体内外抗菌效果
21211 体外抗菌效果 纸片法测定结果见表 2。可见该菌对诺氟沙星、呋喃唑酮高度敏感。试管法测定结果见表 3。平板接种培养结果验证上述结果正确率 100 %。
表 2 药物纸片法测定几种药物的敏感性项目 诺氟沙星 呋喃唑酮 复方新诺明 磺胺嘧啶 氯霉素 土霉素 红霉素纸片药物浓度 /μ g 10 50 50 50 20 20 20
抑菌圈 / mm > 30 19 < 10 < 10 < 10 < 10 < 16
敏感性判断 高敏 高敏 耐药 耐药 耐药 耐药 中敏
18第 2 期 张雅斌等,诺氟沙星在鱼类细菌性疾病中的应用研究
表 3 试管法测定几种药物的 MIC mg/ L
药物 诺氟沙星 呋喃唑酮 复方新诺明 磺胺嘧啶 氯霉素 土霉素 红霉素
MIC < 012 018 > 50 > 50 25 > 50 25
诺氟沙星对淡水鱼类几种细菌性常见病病原菌的 M IC 见表 4。烂鳃 ( G4),白头白嘴 ( G4),打印 (ST78 - 3 - 3),赤皮 (56 - 12 - 10),肠炎 (58 - 20 - 9) 等致病菌对诺氟沙星均高度敏感,同时经 24,48,72 h 观察,最小抑菌浓度试管中未见细菌生长,
证明诺氟沙星对各致病菌最小抑菌浓度与最小杀菌浓度相同。
21212 体内抗菌效果 先感染后注射给药试验组的存活率为
8715 %,先口服给药后感染试验组的存活率为 8113 %,而对照
表 4 试管法测定诺氟沙星对几种致病菌的 MIC mg/ L
菌株 N2 G4 ST78 - 3 - 3 56 - 12 - 10 58 - 20 - 9
MIC < 012 018 < 012 < 012 < 012
组的存活率分别为 1516 %和 613 %,二者差异显著 ( p < 0101) 。见表 5、表 6。
表 5 先感染后注射给药组的存活率组别 鱼平均体重 / g
N2 菌液注射量
/ (mL·尾 - 1)
诺氟沙星注射量
/ (mg· kg - 1)
存活数 /
试验鱼尾数存活率
/ %
死亡率
/ %
试验组 46 015 1 29/ 32 8715 1215
对照组 46 015 0 5/ 32 1516 8414
表 6 先口服给药后感染的存活率组别 鱼平均体重 / g
N2 菌液注射量
/ (mL·尾 - 1)
诺氟沙星口服量
/ (mg· kg - 1· d - 1)
存活数 /
试验鱼尾数存活率
/ %
死亡率
/ %
试验组 46 015 10 26/ 32 8113 1817
对照组 46 015 0 2/ 32 613 9317
图 1 诺氟沙星混饲给药的药时曲线
213 诺氟沙星急性口灌毒性试验试验鱼在口灌 1000 mg/ kg 诺氟沙星后,96 h 内未出现任何异常现象,说明该药对鲤的口服 96 h LD50大于 1000 mg/ kg。推算其安全剂量大于 100 mg/ kg。说明诺氟沙星口服对鲤十分安全。
214 诺氟沙星在鲤体内的药代动
力学研究混饲口服给药后不同时间鲤血浆中诺氟沙星含量如图 1 所示 。
给药 0175 h 血药浓度达 012
μ g/ mL以上,给药 2 h 血药浓度达到高峰,为 1168μ g/ mL,给药
24 h 血药浓度为 0134μ g/ mL 。
28 大 连 水 产 学 院 学 报 第 15 卷
215 鲤肌肉中诺氟沙星残留量停药后肌肉中诺氟沙星迅速消除,4 h 药物浓度为 0188μ g/ mL,12 h 为 0114μ g/ mL,36 h 为 0102μ g/ mL,停药
144 h 肌肉中未检出诺氟沙星。
216 用诺氟沙星防治鲤细菌性败血病的生产性试验
1996 年 8 月 16 日,吉林省水产研究所室验站 3 排 2 号 0145 hm2 鲤育种池暴发鲤细菌性败血病,在所检查的 11 尾样本中 7 尾发病 (占 64 %),第 1 d 死鱼 74 尾,第 2 d 死鱼多达 700 尾以上。按预定治疗方案投喂诺氟沙星药饵,每日 1 次,连投 5 d。第 3 d
死鱼减少至 100 多尾,第 5 d 死鱼停止。投喂药饵同时泼洒含氯消毒剂对池水进行消毒,每日 1 次,连续泼 3 次。 10 月该塘每 hm2 收获鲤鱼种 9300 kg,最终成活率 80 %。
同时发病的 2 排 3 号,3 排 3 号两个鱼池,发病率为 31 %,26 %,未投喂诺氟沙星药饵,只泼洒含氯消毒剂,虽死鱼逐渐减少,成活率达 80 %,但病程长达半个月,严重影响鲤鱼种的摄食,出塘规格较小,每 hm2 收获鲤鱼种 7725 kg,比 3 排 2 号池减产
17 %。 1996 年因疏于预防,试验站 1719 hm2 池塘发病面积达 89 %,比历年鱼产量减产近 2 万 kg,造成经济损失十几万元。 1997 年加强了综合管理,每月按上述预防方法投药一次,7,8 月份投药两次,使鱼类细菌性疾病发病率减少至 18 %,单产量比 1996 年提高 12 %,增加产值 1812 万元。
1996 年 3 排 2 号池诺氟沙星治疗费用为 70 元。 1997 年 1719 hm2 池塘共使用诺氟沙星 814 kg,药费 4960 元,每 hm2 平均费用 222 元,不到整个生产费用的 1 %。
3 讨论
311 诺氟沙星的抗菌药效体外抗菌效果试验表明,诺氟沙星为一种抗菌谱广、抗菌作用强的高效抗菌药物,
淡水养殖鱼类的多种常见病如细菌性败血病、烂鳃病、白头白嘴病、打印病、赤皮病、
肠炎病等病原菌对其均高度敏感,最小抑菌浓度与最小杀菌浓度一致,药效稳定持久。
采用毒力较强的鲤细菌性败血病 N2菌株进行体内抗菌效果试验,结果肌肉注射给药 1
mg/ kg、混饲口服给药 10 mg/ (kg· d) 即对上述致病菌有良好的抗菌作用,无论先感染后给药,还是先给药后感染,两组存活率均在 80 %以上,显著高于对照组。生产中应用诺氟沙星能有效减少细菌性疾病发病率,提高鱼产量。诺氟沙星对鲤的口灌急性毒性试验证明该药安全范围大 (100 mg/ kg 以上 ) 。以上研究结果充分证明,诺氟沙星用于防治淡水养殖鱼类细菌性疾病疗效明显,用药量少,安全可靠,可以广泛使用。
312 给药方案的确定药动学研究与药效学研究是药理学研究不可缺少的两个组成部分 。水产动物的药动学研究起步较晚 \[8,9 \],和兽医学相比,缺少完整、系统的药代动力学研究 \[10 \],往往参
38第 2 期 张雅斌等,诺氟沙星在鱼类细菌性疾病中的应用研究照人医或兽医的给药方案,或依据药效学数据推测给药 \[5,6 \]。给药剂量按日平均多次投喂的方法可能不能尽快发挥药效,迅速达到治疗目的。采用混饲口灌方式给药,以
HPLC 法进行的药动学研究结果表明,以 10 mg/ kg 混饲给药后 0175 h 血药浓度已超过诺氟沙星对鲤细菌出血性败血病致病菌的最小抑菌浓度,24 h 血药浓度为 0134μ g/ mL,
即给药 0175～ 24 h 之间可有效抑菌,据此确定治疗鲤细菌性败血病的给药方案为,诺氟沙星给药剂量为 10 mg/ kg 时,混饲给药的间隔为 24 h。如果考虑到饲料投放水中可能造成药物损失和鱼类个体摄食的不确切性,在急性感染期间可把给药间隔缩短为 12
h。依此类推,可初步确定治疗鱼类赤皮病、打印病、肠炎病的给药方案。而治疗鱼类细菌性烂鳃病的疗效,由于其最小抑菌浓度为 018 mg/ L,则必须通过提高给药剂量或增加给药次数来获得。
313 休药期的确定以 HPLC 法测定肌肉中的诺氟沙星含量,在停药 144 h 时肌肉未检出药物残留,即使用诺氟沙星 6 d 后方可食用。休药期的确立,为水产养殖产品安全卫生及食用者的健康提供了保障。
314 关于水产动物药动学的研究方法相同给药剂量,不同给药方式的药动学参数相差很大,肌注给药时鲤对诺氟沙星吸收良好,血药浓度最大吸收值为 17199μ g/ mL \[11 \]。但除珍稀水产动物外,几乎全部养殖鱼类均采用药饵投喂方式给药,药物经口服后通过吸收进入淋巴和血液,作用于病变组织而发挥药效。有些药物成分会在消化道被破坏,有些不能被消化道吸收,有些成分还可能会与饲料中的某些成分起拮抗作用,这些都会影响药物的效果,使试验数据与实际药效之间存在一定距离。本试验表明,肌注给药时,给药剂量为 1 mg/ kg,给药一次可提高感染鱼存活率,口服给药按 10 mg/ (kg· d) 剂量给药 5 次,能有效提高存活率,
仅一次给药剂量就相差 10 倍。同样给药方式的药动学研究结果说明,上述口服剂量是合理的。因此,对鱼类及其他水产动物的药动学研究,宜使用口服法给药。
参考文献,
\[ 1 \] 郭惠元 1 我国喹诺酮类抗菌药物研究开发概况 \[J \]1 中国医药工业杂志,1989,20 (9),421 - 4241
\[2 \] VANCU TSEM P,BABISH J G,SCWARD W S1 The fluoroquinolones antimicrobial,structure,antimicrobial ani2
mals and toxicity\[J \]1 Cornell Vet,1990,80 (2),173 - 1861
\[ 3 \] 曹瑞敏,刘昕 1 新抗菌药烟酸诺氟沙星含量测定方法的研究 \[J \]1 白求恩医科大学学报,1996,22 (3),245 - 2461
\[4 \] BROWN S A,COPPER J,GAUZE J J,et al1 Pharmacokinetics of Norfloxacin in dogs after single intravenous and
single and multiple oral administrations of the drug\[J \]1 Am J Vet Res,1990,51,1065 - 10701
\[5 \] 严雪芬,王杏明,张黎明 1 团头鲂、鲤、鲫等鱼类暴发性疾病的药物防治研究 \[ A \]1 鱼病学研究论文集,第二集
\[ C\]1 北京,海洋出版社,1995,40 - 461
\[ 6 \] 汪开毓 1 喹诺酮类抗菌鱼药的开发应用 \[J \]1 淡水渔业,1997,27 (2),22 - 251
\[ 7 \] 张雅斌,王兆军 1 养殖新技术 \[ M \]1 长春,吉林科学技术出版社,1999,134 - 1371
48 大 连 水 产 学 院 学 报 第 15 卷
\[ 8 \] 陈文银,卯春华 1 诺氟沙星在中华鳖体内的药代动力学研究 \[J \]1 水产学报,1997,21 (4),434 - 4371
\[ 9 \] 陈四清 1 饲喂土霉素对鲤鱼生长及代谢残留的研究 \[J \]1 饲料工业,1997,18 (5),19 - 201
\[ 10 \] 冯淇辉 1 兽医药物代谢动力学 \[ M \]1 北京,科学出版社,19871
\[ 11 \] 张祚新,张雅斌,郑伟,等 1 诺氟沙星在鲤鱼体内的药代动力学 \[J \]1 中国兽医学报,2000,20 (1),66 - 691
Application of Norfloxacin in treatment
of bacterial diseases in f ishes
ZHAN G Ya2bin1, ZHAN G Zuo2xin2, ZHEN G Wei1, L IU Yan2hui1
(11Jilin Privince Aquatic Scientific Institute,Changchun 130051 ; 21Military Veterinary
Institute,University of Agriculture and Animal Sciences,Changchun 130062 )
Abstract,Norfloxacin of the seven bacteriostasis drugs tested is the highest sensitive (M ICρ
< 012μ g/ mL) to Noxfloxacin pathogenic bacteria infection bacterial hemorrhagic septicemia
in Carp1 The experiment of internal antic - bacteria effect showed that Norfloxacin either in2
jected into the fish at 1 mg/ kg or oral administration at 10 mg/ kg has the desired action such
as improving the survival rate of infected fish,The effect of pharmacokinetics research shows
that the drug level in the fish’ s blood is upto 012μ g/ mL,during the course of taking drug
mixed in diet 0175 h to 24 h1 On the basis of the experiment,the administration of drug is
established,that is,the dose orally is 10 mg/ kg,at the intervals of 24 h for 5 times1 The
effect applied in production is good1 The poisonous test,pouring impatientty Norfloxacin
down the throat with Carp,shows LD50 > 1000 mg/ kg (96 h) 1 There was no remains of the
Norfloxacin in the muscle after administration of 144 h.
Key words,Norfloxacin ; effect of autisepic drug ; scheme of taking drug ;fish bacterial disease
58第 2 期 张雅斌等,诺氟沙星在鱼类细菌性疾病中的应用研究
2 0 0 0 年 6 月 J OURNAL OF DAL IAN FISHERIES UN IV ERSIT Y J un 1 2 0 0 0
文章编号,1000 - 9957 (2000) 02 - 0079 - 07
诺氟沙星在鱼类细菌性疾病中的应用研究张雅斌 1, 张祚新 2, 郑 伟 1, 刘艳辉 1
(1,吉林省水产科学研究所,长春 130051 ;21 解放军军需大学军事兽医研究所,长春 130062)
摘要,以鲤细菌出血性败血病致病菌强毒力菌株对诺氟沙星 (Norfloxacin) 等 7 种抑菌药物进行体外敏感性测定,其中诺氟沙星高度敏感,最小抑菌浓度 < 012μ g/ mL。体内抗菌药效试验结果表明,每 kg 鱼体重注射 1 mg 诺氟沙星和口服 10 mg/ d 诺氟沙星均能有效杀灭致病菌,提高感染鱼成活率。诺氟沙星的药动学研究结果表明,混饲给药后 0175 h
至 24 h,血药浓度在 012μ g/ mL 以上。据此确定给药方案,口服给药剂量为 10 mg/ (kg·
d),连续给药 5 次,在生产中应用效果良好。诺氟沙星对鲤急性口灌毒性实验结果 LD50
> 1000 mg/ kg (96 h),肌肉残毒测定结果证明,停药 144 h 即无诺氟沙星检出,该药安全范围大,残余期短。
关键词,诺氟沙星 ; 抗菌药效 ; 给药方案 ; 鱼类细菌性疾病中图分类号,S943142 文献标识码,A
诺氟沙星 (Norfloxacin) 是氟喹诺酮类药物之一,因其具有抗菌谱广、抗菌力强,
无交叉耐药性 \[1,2 \]等特点,已被广泛用于医学、兽医界 \[3,4 \]。近年来,诺氟沙星应用于淡水养殖鱼类细菌病的防治已有报道 \[5～ 7 \]。由于以往研究成果仅限于药效学研究,只参考药效学数据或凭经验制定给药方案,在生产中应用显然缺乏理论依据。作者研究了诺氟沙星在鲤体内外的抗菌活性和生产中防治效果,并通过诺氟沙星在鲤体内的药代动力学研究,制定了合理的给药方案,确定了休药期。对药效学、药动学的研究以及急性毒性试验结果,为诺氟沙星在淡水养殖鱼类细菌病防治中的广泛应用提供了理论依据。
1 材料与方法
111 致病菌的毒力试验鲤细菌性败血病致病菌豚鼠气单胞菌 N2,L1菌株由解放军农牧大学及吉林省水产研究所鱼病室提供,供试鱼为吉林省水产研究所实验站一龄健康鲤,体重为 (46 ± 9)
g/ 尾。感染方法如下,
1) 背部肌肉注射 菌悬液浓度为 411 × 107 个 / mL,注射剂量 015 mL/ 尾。
2) 浸泡 Ⅰ 拔去背侧鳞片 3～ 4 枚,移入含菌 112 × 108 个 / L 的水族箱内。
收稿日期,1999210225
基金项目,农业部“九五”重点科研项目 (渔 95 - B - 96 - 03 - 02)
作者简介,张雅斌 (1956 - ),女,高级工程师。
3) 侵泡 Ⅱ 如 2) 法拔去鳞片,将鱼放入约含菌 700 × 109 个 / L 的水容器中浸泡 5
min,再移入自来水水族箱内。对照组注射等量生理盐水或拔掉鳞片后移入自来水水族箱内。随时观察并捞出死鱼,记录结果。取强毒力菌株进行药物试验,试验水温 25～
28 ℃,p H 712。
112 致病菌体外药效试验
1) 纸片法 磺胺类药物用无胨培养基,其他药物用营养培养基,以 N2 菌株按常规操作,26 ℃下培养 24 h 后,测定抑菌圈直径。
2) 试管法 磺胺类药物用无胨营养液体培养基,其他药物用肉膏营养液体培养基。
倍比稀释,配制成含有系列浓度药物的营养液体,接种 N2 菌株,26 ℃下培养 24 h 后记录最小抑菌浓度 (M IC),并将此培养液与相邻的两个浓度培养液分别接种于平板,验证准确性。
诺氟沙星对鱼类细菌性烂鳃病、打印病、赤皮病、肠炎病致病菌 G4,ST78 - 3 - 3,
56 - 12 - 10,58 - 20 - 9 的 M IC 测定同试管法。上述菌种由中国科学院水生生物研究所提供。
113 体内抗菌药效试验
1) 先感染后注射给药 试验组鲤背部肌肉注射约含 411 × 107 个 / mL N2 菌悬液
015 mL/ 尾,2 h 后背肌注射诺氟沙星,剂量为每 kg 鱼体重 1 mg。对照组注射等量菌悬液和生理盐水。观察 7 d,及时捞出显症病鱼和死鱼,记录存活数。
2) 先口服给药后感染 鲤饲料中加入诺氟沙星原药,加水混匀并加热至 80 ℃使成糊状,按每 kg 鱼体重给药 10 mg,以钝头特大号注射器灌入受试鱼前肠,无回吐者保留试验。 2 h 后按上述感染剂量背肌注射菌悬液。对照组口灌相同剂量的糊状饲料及菌悬液。依此法每日一次连续口灌 5 次。观察记录方法同前。
114 口灌急性毒性试验健康鲤 8 尾,平均体重 (46 ± 9) g,在去氯自来水中暂养 5～ 10 d。诺氟沙星 (由解放军军事兽医研究所提供,其质量分数为 9817 %) 用自制钝头注射器灌入鱼前肠,
给药剂量为每 kg 鱼体重 1000 mg。灌后未出现回吐者饲养观察 96 h,记录受试鱼活动情况。
115 诺氟沙星药代动力学研究以,113”中口服给药相同给药方式、给药剂量一次性给药。定时采取心腔血,用
HPLC 法测定血浆中不同时间相应的诺氟沙星含量,并经计算机处理得出相关参数。
诺氟沙星标准品由中国兽药监察所提供,其质量分数为 9915 %。
仪器与色谱条件,用美国 Waters Baseline - 810 高效液相色谱仪,u - Boxdapck -
C18 319 × 300 mm I1D 柱,检测波长 278 nm,进样量 20μ L 。
用 9000 3P87 实用药代动力学软件处理药时数据。
08 大 连 水 产 学 院 学 报 第 15 卷
116 生产性治疗试验以鱼体摄入药量为每 kg 鱼体重 10 mg 计算,鱼类摄食率为 5 %左右,每日投饵 5
次,按每日给药一次,每 100 kg 饵料应加入诺氟沙星原药 50 g。药饵制作,用少量水溶解稀释诺氟沙星原药,然后均匀拌入饲料原料中,再加工成颗粒饲料。治疗时每日投饵一次,连投 5 d 为一个疗程,预防时投喂 3 d 为一个疗程,同时泼洒含氯消毒剂。
治疗试验在吉林省水产研究所实验站发病鱼池中进行,同时对有发病史鱼池进行预防试验,并进行效益分析。
117 鲤肌肉中诺氟沙星残余量的测定给鲤按 10 mg/ kg 灌服诺氟沙星糊状饲料,每日一次,连续 5 d 后停药。取不同停药时间的受试鱼肌肉进行处理,测定药物含量。
2 结果
211 致病菌毒性人工感染 24 h 内即可发病,感染鱼症状与自然病鱼症状基本一致,均出现败血症状。不同感染方法均可引起死亡,死亡率为 8913 %～ 100 %,见表 1。 N2 与 L1 菌株致死强度差异不显著。由于 N2 菌株出现率较高,所以用药物所做的体内外抗菌效果试验中均采用 N2 菌株作为致病菌。
表 1 人工感染试验结果菌株 鱼平均体重 / g
肌 注 法菌悬液注射量
/ (mL·尾 - 1)
死亡数 /
试验鱼数死亡率
/ %
浸 泡 Ⅰ法含菌量
/ (个· mL - 1)
死亡数 /
试验鱼数死亡率
/ %
浸 泡 Ⅱ法含菌量
/ (个· mL - 1)
死亡数 /
试验鱼数死亡率
/ %
N2 46 ± 9 015 25/ 26 9612 1 × 108 25/ 28 8913 700 × 109 28/ 28 10010
L 1 46 ± 9 015 24/ 24 10010 1 × 108 26/ 28 9218 700 × 109 26/ 28 9218
对照 46 ± 9 0 2/ 26 717 0 1/ 28 315 0 3/ 27 1111
212 致病菌体内外抗菌效果
21211 体外抗菌效果 纸片法测定结果见表 2。可见该菌对诺氟沙星、呋喃唑酮高度敏感。试管法测定结果见表 3。平板接种培养结果验证上述结果正确率 100 %。
表 2 药物纸片法测定几种药物的敏感性项目 诺氟沙星 呋喃唑酮 复方新诺明 磺胺嘧啶 氯霉素 土霉素 红霉素纸片药物浓度 /μ g 10 50 50 50 20 20 20
抑菌圈 / mm > 30 19 < 10 < 10 < 10 < 10 < 16
敏感性判断 高敏 高敏 耐药 耐药 耐药 耐药 中敏
18第 2 期 张雅斌等,诺氟沙星在鱼类细菌性疾病中的应用研究
表 3 试管法测定几种药物的 MIC mg/ L
药物 诺氟沙星 呋喃唑酮 复方新诺明 磺胺嘧啶 氯霉素 土霉素 红霉素
MIC < 012 018 > 50 > 50 25 > 50 25
诺氟沙星对淡水鱼类几种细菌性常见病病原菌的 M IC 见表 4。烂鳃 ( G4),白头白嘴 ( G4),打印 (ST78 - 3 - 3),赤皮 (56 - 12 - 10),肠炎 (58 - 20 - 9) 等致病菌对诺氟沙星均高度敏感,同时经 24,48,72 h 观察,最小抑菌浓度试管中未见细菌生长,
证明诺氟沙星对各致病菌最小抑菌浓度与最小杀菌浓度相同。
21212 体内抗菌效果 先感染后注射给药试验组的存活率为
8715 %,先口服给药后感染试验组的存活率为 8113 %,而对照
表 4 试管法测定诺氟沙星对几种致病菌的 MIC mg/ L
菌株 N2 G4 ST78 - 3 - 3 56 - 12 - 10 58 - 20 - 9
MIC < 012 018 < 012 < 012 < 012
组的存活率分别为 1516 %和 613 %,二者差异显著 ( p < 0101) 。见表 5、表 6。
表 5 先感染后注射给药组的存活率组别 鱼平均体重 / g
N2 菌液注射量
/ (mL·尾 - 1)
诺氟沙星注射量
/ (mg· kg - 1)
存活数 /
试验鱼尾数存活率
/ %
死亡率
/ %
试验组 46 015 1 29/ 32 8715 1215
对照组 46 015 0 5/ 32 1516 8414
表 6 先口服给药后感染的存活率组别 鱼平均体重 / g
N2 菌液注射量
/ (mL·尾 - 1)
诺氟沙星口服量
/ (mg· kg - 1· d - 1)
存活数 /
试验鱼尾数存活率
/ %
死亡率
/ %
试验组 46 015 10 26/ 32 8113 1817
对照组 46 015 0 2/ 32 613 9317
图 1 诺氟沙星混饲给药的药时曲线
213 诺氟沙星急性口灌毒性试验试验鱼在口灌 1000 mg/ kg 诺氟沙星后,96 h 内未出现任何异常现象,说明该药对鲤的口服 96 h LD50大于 1000 mg/ kg。推算其安全剂量大于 100 mg/ kg。说明诺氟沙星口服对鲤十分安全。
214 诺氟沙星在鲤体内的药代动
力学研究混饲口服给药后不同时间鲤血浆中诺氟沙星含量如图 1 所示 。
给药 0175 h 血药浓度达 012
μ g/ mL以上,给药 2 h 血药浓度达到高峰,为 1168μ g/ mL,给药
24 h 血药浓度为 0134μ g/ mL 。
28 大 连 水 产 学 院 学 报 第 15 卷
215 鲤肌肉中诺氟沙星残留量停药后肌肉中诺氟沙星迅速消除,4 h 药物浓度为 0188μ g/ mL,12 h 为 0114μ g/ mL,36 h 为 0102μ g/ mL,停药
144 h 肌肉中未检出诺氟沙星。
216 用诺氟沙星防治鲤细菌性败血病的生产性试验
1996 年 8 月 16 日,吉林省水产研究所室验站 3 排 2 号 0145 hm2 鲤育种池暴发鲤细菌性败血病,在所检查的 11 尾样本中 7 尾发病 (占 64 %),第 1 d 死鱼 74 尾,第 2 d 死鱼多达 700 尾以上。按预定治疗方案投喂诺氟沙星药饵,每日 1 次,连投 5 d。第 3 d
死鱼减少至 100 多尾,第 5 d 死鱼停止。投喂药饵同时泼洒含氯消毒剂对池水进行消毒,每日 1 次,连续泼 3 次。 10 月该塘每 hm2 收获鲤鱼种 9300 kg,最终成活率 80 %。
同时发病的 2 排 3 号,3 排 3 号两个鱼池,发病率为 31 %,26 %,未投喂诺氟沙星药饵,只泼洒含氯消毒剂,虽死鱼逐渐减少,成活率达 80 %,但病程长达半个月,严重影响鲤鱼种的摄食,出塘规格较小,每 hm2 收获鲤鱼种 7725 kg,比 3 排 2 号池减产
17 %。 1996 年因疏于预防,试验站 1719 hm2 池塘发病面积达 89 %,比历年鱼产量减产近 2 万 kg,造成经济损失十几万元。 1997 年加强了综合管理,每月按上述预防方法投药一次,7,8 月份投药两次,使鱼类细菌性疾病发病率减少至 18 %,单产量比 1996 年提高 12 %,增加产值 1812 万元。
1996 年 3 排 2 号池诺氟沙星治疗费用为 70 元。 1997 年 1719 hm2 池塘共使用诺氟沙星 814 kg,药费 4960 元,每 hm2 平均费用 222 元,不到整个生产费用的 1 %。
3 讨论
311 诺氟沙星的抗菌药效体外抗菌效果试验表明,诺氟沙星为一种抗菌谱广、抗菌作用强的高效抗菌药物,
淡水养殖鱼类的多种常见病如细菌性败血病、烂鳃病、白头白嘴病、打印病、赤皮病、
肠炎病等病原菌对其均高度敏感,最小抑菌浓度与最小杀菌浓度一致,药效稳定持久。
采用毒力较强的鲤细菌性败血病 N2菌株进行体内抗菌效果试验,结果肌肉注射给药 1
mg/ kg、混饲口服给药 10 mg/ (kg· d) 即对上述致病菌有良好的抗菌作用,无论先感染后给药,还是先给药后感染,两组存活率均在 80 %以上,显著高于对照组。生产中应用诺氟沙星能有效减少细菌性疾病发病率,提高鱼产量。诺氟沙星对鲤的口灌急性毒性试验证明该药安全范围大 (100 mg/ kg 以上 ) 。以上研究结果充分证明,诺氟沙星用于防治淡水养殖鱼类细菌性疾病疗效明显,用药量少,安全可靠,可以广泛使用。
312 给药方案的确定药动学研究与药效学研究是药理学研究不可缺少的两个组成部分 。水产动物的药动学研究起步较晚 \[8,9 \],和兽医学相比,缺少完整、系统的药代动力学研究 \[10 \],往往参
38第 2 期 张雅斌等,诺氟沙星在鱼类细菌性疾病中的应用研究照人医或兽医的给药方案,或依据药效学数据推测给药 \[5,6 \]。给药剂量按日平均多次投喂的方法可能不能尽快发挥药效,迅速达到治疗目的。采用混饲口灌方式给药,以
HPLC 法进行的药动学研究结果表明,以 10 mg/ kg 混饲给药后 0175 h 血药浓度已超过诺氟沙星对鲤细菌出血性败血病致病菌的最小抑菌浓度,24 h 血药浓度为 0134μ g/ mL,
即给药 0175～ 24 h 之间可有效抑菌,据此确定治疗鲤细菌性败血病的给药方案为,诺氟沙星给药剂量为 10 mg/ kg 时,混饲给药的间隔为 24 h。如果考虑到饲料投放水中可能造成药物损失和鱼类个体摄食的不确切性,在急性感染期间可把给药间隔缩短为 12
h。依此类推,可初步确定治疗鱼类赤皮病、打印病、肠炎病的给药方案。而治疗鱼类细菌性烂鳃病的疗效,由于其最小抑菌浓度为 018 mg/ L,则必须通过提高给药剂量或增加给药次数来获得。
313 休药期的确定以 HPLC 法测定肌肉中的诺氟沙星含量,在停药 144 h 时肌肉未检出药物残留,即使用诺氟沙星 6 d 后方可食用。休药期的确立,为水产养殖产品安全卫生及食用者的健康提供了保障。
314 关于水产动物药动学的研究方法相同给药剂量,不同给药方式的药动学参数相差很大,肌注给药时鲤对诺氟沙星吸收良好,血药浓度最大吸收值为 17199μ g/ mL \[11 \]。但除珍稀水产动物外,几乎全部养殖鱼类均采用药饵投喂方式给药,药物经口服后通过吸收进入淋巴和血液,作用于病变组织而发挥药效。有些药物成分会在消化道被破坏,有些不能被消化道吸收,有些成分还可能会与饲料中的某些成分起拮抗作用,这些都会影响药物的效果,使试验数据与实际药效之间存在一定距离。本试验表明,肌注给药时,给药剂量为 1 mg/ kg,给药一次可提高感染鱼存活率,口服给药按 10 mg/ (kg· d) 剂量给药 5 次,能有效提高存活率,
仅一次给药剂量就相差 10 倍。同样给药方式的药动学研究结果说明,上述口服剂量是合理的。因此,对鱼类及其他水产动物的药动学研究,宜使用口服法给药。
参考文献,
\[ 1 \] 郭惠元 1 我国喹诺酮类抗菌药物研究开发概况 \[J \]1 中国医药工业杂志,1989,20 (9),421 - 4241
\[2 \] VANCU TSEM P,BABISH J G,SCWARD W S1 The fluoroquinolones antimicrobial,structure,antimicrobial ani2
mals and toxicity\[J \]1 Cornell Vet,1990,80 (2),173 - 1861
\[ 3 \] 曹瑞敏,刘昕 1 新抗菌药烟酸诺氟沙星含量测定方法的研究 \[J \]1 白求恩医科大学学报,1996,22 (3),245 - 2461
\[4 \] BROWN S A,COPPER J,GAUZE J J,et al1 Pharmacokinetics of Norfloxacin in dogs after single intravenous and
single and multiple oral administrations of the drug\[J \]1 Am J Vet Res,1990,51,1065 - 10701
\[5 \] 严雪芬,王杏明,张黎明 1 团头鲂、鲤、鲫等鱼类暴发性疾病的药物防治研究 \[ A \]1 鱼病学研究论文集,第二集
\[ C\]1 北京,海洋出版社,1995,40 - 461
\[ 6 \] 汪开毓 1 喹诺酮类抗菌鱼药的开发应用 \[J \]1 淡水渔业,1997,27 (2),22 - 251
\[ 7 \] 张雅斌,王兆军 1 养殖新技术 \[ M \]1 长春,吉林科学技术出版社,1999,134 - 1371
48 大 连 水 产 学 院 学 报 第 15 卷
\[ 8 \] 陈文银,卯春华 1 诺氟沙星在中华鳖体内的药代动力学研究 \[J \]1 水产学报,1997,21 (4),434 - 4371
\[ 9 \] 陈四清 1 饲喂土霉素对鲤鱼生长及代谢残留的研究 \[J \]1 饲料工业,1997,18 (5),19 - 201
\[ 10 \] 冯淇辉 1 兽医药物代谢动力学 \[ M \]1 北京,科学出版社,19871
\[ 11 \] 张祚新,张雅斌,郑伟,等 1 诺氟沙星在鲤鱼体内的药代动力学 \[J \]1 中国兽医学报,2000,20 (1),66 - 691
Application of Norfloxacin in treatment
of bacterial diseases in f ishes
ZHAN G Ya2bin1, ZHAN G Zuo2xin2, ZHEN G Wei1, L IU Yan2hui1
(11Jilin Privince Aquatic Scientific Institute,Changchun 130051 ; 21Military Veterinary
Institute,University of Agriculture and Animal Sciences,Changchun 130062 )
Abstract,Norfloxacin of the seven bacteriostasis drugs tested is the highest sensitive (M ICρ
< 012μ g/ mL) to Noxfloxacin pathogenic bacteria infection bacterial hemorrhagic septicemia
in Carp1 The experiment of internal antic - bacteria effect showed that Norfloxacin either in2
jected into the fish at 1 mg/ kg or oral administration at 10 mg/ kg has the desired action such
as improving the survival rate of infected fish,The effect of pharmacokinetics research shows
that the drug level in the fish’ s blood is upto 012μ g/ mL,during the course of taking drug
mixed in diet 0175 h to 24 h1 On the basis of the experiment,the administration of drug is
established,that is,the dose orally is 10 mg/ kg,at the intervals of 24 h for 5 times1 The
effect applied in production is good1 The poisonous test,pouring impatientty Norfloxacin
down the throat with Carp,shows LD50 > 1000 mg/ kg (96 h) 1 There was no remains of the
Norfloxacin in the muscle after administration of 144 h.
Key words,Norfloxacin ; effect of autisepic drug ; scheme of taking drug ;fish bacterial disease
58第 2 期 张雅斌等,诺氟沙星在鱼类细菌性疾病中的应用研究
