鱼肉中氟喹诺酮类药物多残留检测方法的建立及恩诺沙星在鲫鱼体内残留消除规律的研究刘慧慧 1,饶钦雄 1,刘向明 1,李海燕 1,沈建忠 1,2,江海洋 1,2,丁双阳 1,2
(1,中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100094; 2,国家兽药残留基准实验室,北京 海淀 100094)
中图分类号,S859,84 文献标识码,B 文章编号,052926005 (2007) 0120074203
氟喹诺酮 (FQ s)是第三代喹诺酮类药物,目前在兽医及人医临床应用广泛,对水产鱼类的消化道及鳃细菌性疾病也有良好的防治作用。近些年,由于该类药物的广泛使用,有关其耐药性的报道越来越多,对
FQ s 耐药的沙门氏菌和弯曲杆菌所引发的人类食源性疾病也大多被证实与食用动物中使用 FQ s 有关 \[ 1 \],
该类药物在动物性食品中的残留问题已经收稿日期,2006210216
作者简介,刘慧慧 (19812),女,助理兽医师,硕士生,主要从事兽医药理学与毒理学研究,E2m ail,liuhh615@ 163,com
通讯作者,丁双阳,E2m ail,D ingsy@cau,edu,cn
成为人们关注的焦点。目前,对该类药物的检测手段较多,有微生物抑制实验 (M IA ) \[ 2 \]、免疫方法、薄层色谱 (TL C) \[ 3 \]、高效液相色谱法 (H PL C) \[ 4 \]、毛细管电泳法 \[ 5 \]、气质联用法 (GC M S)、液质联用法 (L C M S、
L C M S M S) \[ 6 \]、酶联免疫分析方法 \[ 7 \]等,其中高效液相色谱方法是最常用的方法之一。作者对这些方法进行改进与优化,建立了鱼肌肉组织中环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星的高效液相色谱检测方法。该方法具有灵敏度高、准确、简便、快捷、节约等优点,适用于水产品中该四种药物的 检测。
通过该系统收集、分析、发布动物健康、管理及生产状况等方面的数据,并研究家畜的健康及健康管理方法。英国、澳大利亚 (NA H SS,2006) 等国都建立了国家级的动物疫病监测系统 (N ational A n im al H ealth
Su rveillance System ),还有基于网络的人 2动物疾病监测系统 (Co llin s,2005) (M ich igan,2005),从而将动物健康监测计划与调查活动整合在一起,系统地收集动物的健康数据,对数据进行整理、分析,及时传播动物健康信息。
2 微观决策知识体系微观决策主要指养殖场、兽医站及相关兽医检验检疫部门等基层单位在临床实践,这些基层单位是兽医实践的主体,正是由大量的微观主体才能构成宏观上的兽医卫生体系。对于基层单位而言,主要涉及临床的诊疗、预防及配合宏观上的对疫病的控制。其知识也是按这几方面进行划分的。
2,1 诊断知识 对于兽医临床而言,诊断是疾病发生后的首先要完成的任务,在诊断过程中需要大量的知识,只有依靠知识才能得到准确的诊断结果。目前已经建立了很多用于临床的基于知识的诊断系统,如动物疾病诊断专家系统。
2,2 治疗决策知识 对于不同的病例,由于动物个体差异、疾病程度不同等,应采取合理的治疗方法,在临床治疗决策过程中,需要综合利用已有的知识制定最佳的治疗方案,即需要把握好治疗原则,选择恰当的治疗方法,又要了解药物的特性。兽医拥有的治疗知识是治疗效果的重要决定因素,对临床上的治疗知识进行分析、整理,建立治疗知识模型对于提高临床治疗的水平具有重要的意义。
2,3 预防决策知识 目前,预防是养殖业能够健康发展的重要保证,预防要从疾病的病原、病因、流行病学等多个角度着手,在临床上,兽医往往根据以往疾病的流行、发生情况可以制定相应的预防措施,可能分别从饲料、饲养管理、环境、动物个体免疫等多个角度进行有计划的防范,预防知识是建立一个预防方案的主要依据和动力,若建立一个有效的预防机制,有必要对建立一个完整的预防知识体系,以规范临床预防体系,
并为预防方法的更新、完善奠定基础。
微观层面的知识在临床上有着广泛的应用,目前最流行的是临床决策支持系统 (CD SS),如 IN T ERN IST
I,M YC IN,ON COC IN 等 (M iller RA,1982) (E,H.
Sho rtliffe,1976) (Sho rtliffe,1988),CD SS 是一种使用 2 条以上的病畜的疾病数据提出诊疗建议的一种活的知识系统 (W yatt J,Sp iegelhalter D,1991)。 CD SS 主要有 4 个作用 (Perreau lt L,1999),(1) 临床资料管理,
主要包括临床文档、编码的维护,实践规程的授权,推介等。 (2)病畜管理,病例预约,对病畜的全程跟踪、病历管理,预防性护理等。 (3)诊费控制,通过对病患临床诊疗过程的管理,避免诊疗重复,防止不必要的浪费。 (4) 决策支持,临床诊断、治疗及预防决策支持,以便提供最佳的临床服务,根据不同病例使用不同的诊疗方法,对病畜进行全群管理等。
47 中国兽医杂志 2007 年 (第 43 卷 )第 1 期 Ch inese Journal of V eterinary M edicine
1 材料与方法
1,1 W aters600 型高效液相色谱仪,W aters717 自动进样器,W aters2475 型荧光检测器,Em pow er 色谱工作站 ; 旋涡混合器 ; 隔膜真空泵 ; 超纯水仪,M illi2
Q (美国 ) ; 振荡器 ; SPE 柱,Bond E lu t,3cc,200m g,
C18 (迪马公司 ) ; 高速冷冻离心机,B iofuge strato s
(H eraeu s,德国 ) ; 实验室 pH 计,PH SJ 24A。
1,2 喹诺酮药物对照品 恩诺沙星 (En rofloxa2cin)、
环丙沙星 (C ip rofloxacin)、沙拉沙星 Saraflo2xacin),
含量≥ 99,6% (中国兽医药品监察所 ) ; 双氟沙星
(D ifloxacin),含量为 98,4% (Sigm a Co.,美国 ) ; 甲醇、乙腈为色谱纯 ; 磷酸二氢钾、氢氧化钠、柠檬酸、乙酸铵 (分析纯 )。
1,3 色谱分析条件 流动相,0,05 m o l 柠檬酸 + 0,1
m o l 乙酸铵 2乙腈 (体积比为 80∶ 20) ; 流速,1 m l
m in ; 色谱柱,InertsilOD S 23 ( 5 Lm,4,6 mm × 2 5 0
mm ) ; 柱温,20℃ ; 荧光检测波长 Kex = 280,Kem =
450; 进样量,20 Ll。
1,4 标准曲线绘制 取适量混合标准储备液,用流动相逐级稀释为 1 000 ng m l,500 ng m l,200 ng
m l,100 ng m l,50 ng m l,10 ng m l,2 ng m l,0,1
ng m l,8 个浓度,按照上述色谱条件进样,以各药物峰面积 Y 对药物浓度 X (ng m l)进行线性回归分析。
1,5 组织样品前处理 准确称取 2,0 g 组织,置于 50
m l 聚丙烯具塞离心管中。加入 15 m l 提取液,涡动 1
m in,振荡 10 m in,离心 10 m in (15 000 r m in,18℃ )。
上清液转移至另一 50 m l 离心管中,下层沉淀中复加
5 m l 提取液,重复提取 1 次,合并两次提取液,过 SPE
柱。
将 SPE 柱置于固相萃取真空歧管装置上,用 3 m l
甲醇,3 m l 提取液平衡柱 ; 将上一步骤 20 m l 提取液过柱,调整真空泵的压力,使流速约 1 滴 s; 3 m l 水淋洗,
水完全流过 SPE 柱后,使其继续在真空下干燥 3 m in;
4 m l 流动相洗脱,收集洗脱液于 5 m l 具塞刻度试管中,涡动混匀。 1 m l 注射器吸取适量洗脱液,经过滤,
转入液相小瓶,供高效液相色谱分析。
1,6 检测限的测定 取空白鱼肉样品,设 6 个平行,
按上述样品前处理方法进行处理,得到空白鱼肉色谱图,将信噪比 S N = 3 作为检测限 (LOD )。
1,7 添加回收率与精密度 取空白鱼肉 2,0 g,添加一定体积的混合标准工作液,使组织中药物浓度为 5、
20,100 ng g,涡动 1 m in,静置 15 m in。样品经处理后进行 H PL C 测定,每个浓度每天做 3 个平行样品,计算回收率和日内变异系数,连续测定 3 天,计算日间变异系数。
1,8 鲫鱼肌肉组织中恩诺沙星残留消除规律的研究
1,8,1 实验动物 健康鲫鱼,体重 150± 10 g,由北京海宁通养殖有限公司提供。饲养于中国农业大学国家兽药安全评价中心实验动物房,试验前驯化 2 周,
每日投喂空白颗粒饵料,水温 20± 0,5℃。
1,8,2 给药方法和剂量 盐酸恩诺沙星,含量 98%,
其中恩诺沙星含量为 92%。将药物配制成浓度为 4
m g m l 的水溶液,按 5 m g kg 体重剂量灌胃给药,每天 1 次,连续 5 天,将不回吐的实验鱼用于试验。
1,8,3 组织样品的采集与测定 最后 1 次给药后第
3,6,12,24,48,96,168,240,480,720,1416,2136 h
采集样品,每一时间点取 4 尾鱼,冷冻处死后,去皮、
剔骨、匀浆,处理后的肌肉组织置于 - 20℃冷冻保存。
样品经处理后用 H PL C 检测。
2 结果
2,1 标准曲线 FQ s 4 种药物在上述色谱条件下得到良好的分离,见图 1 (A )。环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星的标准曲线回归方程分别为 Y= 7,34
× 103X + 6,84× 103,Y= 7,67× 103X + 3,52× 103,Y
= 2,36× 103X + 3,03× 103,Y = 2,36× 103X + 3,03
× 103,相关系数 (R 2) 均为 0,9999,线性范围均为 0,1
～ 1 000 ng m l。
图 1 4 种喹诺酮类药物的典型 HPLC-FLD 色谱图
(A ) 2,5 ng m l 混合标准溶液,由左至右依次为,
环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星 ;
(B)空白鱼肉组织 ;
2,2 检测限 取 6 个空白样品基线噪音值的平均值,以信噪比为 3 计,鱼肉中 4 种药物检测限 (LOD )
分别为,环丙沙星 0,3 ng g,恩诺沙星 1,0 ng g,沙拉沙星 0,2 ng g,双氟沙星 0,2 ng g。空白样品色谱图见图 1 (B )。
2,3 回收率与精密度 4 种药物低、中、高 3 个浓度的样品添加回收率和日内、日间变异系数见表 1。
2,4 鲫鱼肌肉组织中恩诺沙星残留消除规律的研究
恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星总量的残留消
57 Ch inese Journal of V eterinary M edicine 中国兽医杂志 2007 年 (第 43 卷 )第 1 期除曲线见图 2。
图 2 给药后 (5 m g kg 体重 - 1×天 - 1)鲫鱼肌肉组织中环丙沙星与恩诺沙星残留总量的浓度—时间曲线
3 讨论本检测方法是在参照国标方法 \[ 8 \],Zhen ling Z\[ 9 \]
的基础上建立起来的,以 pH 2,4 磷酸 2乙腈 (82+ 18)
为流动相,环丙沙星与恩诺沙星分离较好,但双氟沙星与沙拉沙星无法完全分离,作者对流动相的 pH 进行了系统研究,pH 2,4～ 3,2 时,药物峰形较好,但双氟沙星、沙拉沙星两种药物分离不完全,pH > 4,0
时,4 种药物分离较好,但峰形较差,只有当 pH = 4.
0,才能兼顾峰形与分离度,采用该流动相体系,药物出峰时间对 pH 依赖性很大,重现性差。按照 Zhen ling
Z 方法采用 0,05 m o l 柠檬酸 + 0,1 m o l 乙酸铵 2乙腈为流动相,无需调节 pH,药物分离好,峰形对称且无拖尾现象。
表 1 回收率及变异系数药物 添加浓度 (ng g) 测定浓度 (ng g) 平均回收率 (± SD,% ) 变异系数 (n= 3,% )
环丙沙星 5 4,02 4,36 3,95 82,2± 4,39 5,33
20 18,76 17,54 18,28 90,9± 3,07 3,38
100 80,70 79,10 77,30 79,0± 1,70 2,15
恩诺沙星 5 4,55 4,68 4,44 91,1± 2,45 2,69
20 19,42 18,78 18,28 94,1± 2,86 3,04
100 85,20 84,70 82,30 84,1± 1,55 1,84
沙拉沙星 5 4,16 4,29 4,53 86,5± 3,71 4,29
20 18,26 17,10 16,66 86,7± 4,14 4,77
100 77,70 75,80 73,80 75,8± 1,95 2,57
双氟沙星 5 4,11 4,07 4,25 83,8± 1,95 2,33
20 18,76 19,22 19,38 95,6± 1,61 1,68
100 87,30 87,60 85,70 86,9± 1,03 1,18
采用 pH 7,0 的磷酸盐缓冲液提取鱼肉中药物,回收率不稳定,基线噪音较大,将 pH 调节为 7,4,情况得到改善。本文将高速 (15 000 r m in) 离心与低速离心
(4 000 r m in) 进行对比,结果发现低速离心时上层提取液较浑浊,在净化程序中,可能堵塞固相萃取柱,而且低速离心不足以使组织与提取液完全分离,产生的上层清液量较少,这将直接导致回收率的降低。
残留消除试验,给药后 3 h 后,鱼肌肉组织中恩诺沙星浓度为 6,2 m g kg,48 h 药物浓度降低近 1 2,
264 h 药物浓度降至 0,68 m g kg,之后药物代谢非常缓慢,720 h 药物浓度为 96 ng g,低于最高残留限量
100 ng g\[ 10 \]。活性代谢产物环丙沙星在停药后 3 h,浓度达到 0,18 m g kg 在停药后 1 天内维持在较高浓度
(≈ 0,2 m g kg),之后缓慢降低,1416 h 后检测不出。
目前我国还没有对恩诺沙星在水产动物体内的休药期作出明确的规定,但一般药物规定为 400℃ 2日
2500℃ 2日 \[ 11 \]。 500℃ 2日时,恩诺沙星在鲫鱼体内含量仍然高于最高残留限量。根据本试验结果,在 20℃水温条件下,600℃ 2日鲫鱼体内药物浓度可以满足
M RL 要求,但鉴于实际生产中水温条件可能低于本试验条件,故推荐的安全休药期为 740℃ 2日。
参考文献,
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\[10 \] 中华人民共和国农业部公告第 235 号,动物性食品中兽药最高残留限量 [S \],2002.
\[ 11 \] 农业部公告第 278 号,兽药休药期规定 [S \],2003.
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(1,中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100094; 2,国家兽药残留基准实验室,北京 海淀 100094)
中图分类号,S859,84 文献标识码,B 文章编号,052926005 (2007) 0120074203
氟喹诺酮 (FQ s)是第三代喹诺酮类药物,目前在兽医及人医临床应用广泛,对水产鱼类的消化道及鳃细菌性疾病也有良好的防治作用。近些年,由于该类药物的广泛使用,有关其耐药性的报道越来越多,对
FQ s 耐药的沙门氏菌和弯曲杆菌所引发的人类食源性疾病也大多被证实与食用动物中使用 FQ s 有关 \[ 1 \],
该类药物在动物性食品中的残留问题已经收稿日期,2006210216
作者简介,刘慧慧 (19812),女,助理兽医师,硕士生,主要从事兽医药理学与毒理学研究,E2m ail,liuhh615@ 163,com
通讯作者,丁双阳,E2m ail,D ingsy@cau,edu,cn
成为人们关注的焦点。目前,对该类药物的检测手段较多,有微生物抑制实验 (M IA ) \[ 2 \]、免疫方法、薄层色谱 (TL C) \[ 3 \]、高效液相色谱法 (H PL C) \[ 4 \]、毛细管电泳法 \[ 5 \]、气质联用法 (GC M S)、液质联用法 (L C M S、
L C M S M S) \[ 6 \]、酶联免疫分析方法 \[ 7 \]等,其中高效液相色谱方法是最常用的方法之一。作者对这些方法进行改进与优化,建立了鱼肌肉组织中环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星的高效液相色谱检测方法。该方法具有灵敏度高、准确、简便、快捷、节约等优点,适用于水产品中该四种药物的 检测。
通过该系统收集、分析、发布动物健康、管理及生产状况等方面的数据,并研究家畜的健康及健康管理方法。英国、澳大利亚 (NA H SS,2006) 等国都建立了国家级的动物疫病监测系统 (N ational A n im al H ealth
Su rveillance System ),还有基于网络的人 2动物疾病监测系统 (Co llin s,2005) (M ich igan,2005),从而将动物健康监测计划与调查活动整合在一起,系统地收集动物的健康数据,对数据进行整理、分析,及时传播动物健康信息。
2 微观决策知识体系微观决策主要指养殖场、兽医站及相关兽医检验检疫部门等基层单位在临床实践,这些基层单位是兽医实践的主体,正是由大量的微观主体才能构成宏观上的兽医卫生体系。对于基层单位而言,主要涉及临床的诊疗、预防及配合宏观上的对疫病的控制。其知识也是按这几方面进行划分的。
2,1 诊断知识 对于兽医临床而言,诊断是疾病发生后的首先要完成的任务,在诊断过程中需要大量的知识,只有依靠知识才能得到准确的诊断结果。目前已经建立了很多用于临床的基于知识的诊断系统,如动物疾病诊断专家系统。
2,2 治疗决策知识 对于不同的病例,由于动物个体差异、疾病程度不同等,应采取合理的治疗方法,在临床治疗决策过程中,需要综合利用已有的知识制定最佳的治疗方案,即需要把握好治疗原则,选择恰当的治疗方法,又要了解药物的特性。兽医拥有的治疗知识是治疗效果的重要决定因素,对临床上的治疗知识进行分析、整理,建立治疗知识模型对于提高临床治疗的水平具有重要的意义。
2,3 预防决策知识 目前,预防是养殖业能够健康发展的重要保证,预防要从疾病的病原、病因、流行病学等多个角度着手,在临床上,兽医往往根据以往疾病的流行、发生情况可以制定相应的预防措施,可能分别从饲料、饲养管理、环境、动物个体免疫等多个角度进行有计划的防范,预防知识是建立一个预防方案的主要依据和动力,若建立一个有效的预防机制,有必要对建立一个完整的预防知识体系,以规范临床预防体系,
并为预防方法的更新、完善奠定基础。
微观层面的知识在临床上有着广泛的应用,目前最流行的是临床决策支持系统 (CD SS),如 IN T ERN IST
I,M YC IN,ON COC IN 等 (M iller RA,1982) (E,H.
Sho rtliffe,1976) (Sho rtliffe,1988),CD SS 是一种使用 2 条以上的病畜的疾病数据提出诊疗建议的一种活的知识系统 (W yatt J,Sp iegelhalter D,1991)。 CD SS 主要有 4 个作用 (Perreau lt L,1999),(1) 临床资料管理,
主要包括临床文档、编码的维护,实践规程的授权,推介等。 (2)病畜管理,病例预约,对病畜的全程跟踪、病历管理,预防性护理等。 (3)诊费控制,通过对病患临床诊疗过程的管理,避免诊疗重复,防止不必要的浪费。 (4) 决策支持,临床诊断、治疗及预防决策支持,以便提供最佳的临床服务,根据不同病例使用不同的诊疗方法,对病畜进行全群管理等。
47 中国兽医杂志 2007 年 (第 43 卷 )第 1 期 Ch inese Journal of V eterinary M edicine
1 材料与方法
1,1 W aters600 型高效液相色谱仪,W aters717 自动进样器,W aters2475 型荧光检测器,Em pow er 色谱工作站 ; 旋涡混合器 ; 隔膜真空泵 ; 超纯水仪,M illi2
Q (美国 ) ; 振荡器 ; SPE 柱,Bond E lu t,3cc,200m g,
C18 (迪马公司 ) ; 高速冷冻离心机,B iofuge strato s
(H eraeu s,德国 ) ; 实验室 pH 计,PH SJ 24A。
1,2 喹诺酮药物对照品 恩诺沙星 (En rofloxa2cin)、
环丙沙星 (C ip rofloxacin)、沙拉沙星 Saraflo2xacin),
含量≥ 99,6% (中国兽医药品监察所 ) ; 双氟沙星
(D ifloxacin),含量为 98,4% (Sigm a Co.,美国 ) ; 甲醇、乙腈为色谱纯 ; 磷酸二氢钾、氢氧化钠、柠檬酸、乙酸铵 (分析纯 )。
1,3 色谱分析条件 流动相,0,05 m o l 柠檬酸 + 0,1
m o l 乙酸铵 2乙腈 (体积比为 80∶ 20) ; 流速,1 m l
m in ; 色谱柱,InertsilOD S 23 ( 5 Lm,4,6 mm × 2 5 0
mm ) ; 柱温,20℃ ; 荧光检测波长 Kex = 280,Kem =
450; 进样量,20 Ll。
1,4 标准曲线绘制 取适量混合标准储备液,用流动相逐级稀释为 1 000 ng m l,500 ng m l,200 ng
m l,100 ng m l,50 ng m l,10 ng m l,2 ng m l,0,1
ng m l,8 个浓度,按照上述色谱条件进样,以各药物峰面积 Y 对药物浓度 X (ng m l)进行线性回归分析。
1,5 组织样品前处理 准确称取 2,0 g 组织,置于 50
m l 聚丙烯具塞离心管中。加入 15 m l 提取液,涡动 1
m in,振荡 10 m in,离心 10 m in (15 000 r m in,18℃ )。
上清液转移至另一 50 m l 离心管中,下层沉淀中复加
5 m l 提取液,重复提取 1 次,合并两次提取液,过 SPE
柱。
将 SPE 柱置于固相萃取真空歧管装置上,用 3 m l
甲醇,3 m l 提取液平衡柱 ; 将上一步骤 20 m l 提取液过柱,调整真空泵的压力,使流速约 1 滴 s; 3 m l 水淋洗,
水完全流过 SPE 柱后,使其继续在真空下干燥 3 m in;
4 m l 流动相洗脱,收集洗脱液于 5 m l 具塞刻度试管中,涡动混匀。 1 m l 注射器吸取适量洗脱液,经过滤,
转入液相小瓶,供高效液相色谱分析。
1,6 检测限的测定 取空白鱼肉样品,设 6 个平行,
按上述样品前处理方法进行处理,得到空白鱼肉色谱图,将信噪比 S N = 3 作为检测限 (LOD )。
1,7 添加回收率与精密度 取空白鱼肉 2,0 g,添加一定体积的混合标准工作液,使组织中药物浓度为 5、
20,100 ng g,涡动 1 m in,静置 15 m in。样品经处理后进行 H PL C 测定,每个浓度每天做 3 个平行样品,计算回收率和日内变异系数,连续测定 3 天,计算日间变异系数。
1,8 鲫鱼肌肉组织中恩诺沙星残留消除规律的研究
1,8,1 实验动物 健康鲫鱼,体重 150± 10 g,由北京海宁通养殖有限公司提供。饲养于中国农业大学国家兽药安全评价中心实验动物房,试验前驯化 2 周,
每日投喂空白颗粒饵料,水温 20± 0,5℃。
1,8,2 给药方法和剂量 盐酸恩诺沙星,含量 98%,
其中恩诺沙星含量为 92%。将药物配制成浓度为 4
m g m l 的水溶液,按 5 m g kg 体重剂量灌胃给药,每天 1 次,连续 5 天,将不回吐的实验鱼用于试验。
1,8,3 组织样品的采集与测定 最后 1 次给药后第
3,6,12,24,48,96,168,240,480,720,1416,2136 h
采集样品,每一时间点取 4 尾鱼,冷冻处死后,去皮、
剔骨、匀浆,处理后的肌肉组织置于 - 20℃冷冻保存。
样品经处理后用 H PL C 检测。
2 结果
2,1 标准曲线 FQ s 4 种药物在上述色谱条件下得到良好的分离,见图 1 (A )。环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星的标准曲线回归方程分别为 Y= 7,34
× 103X + 6,84× 103,Y= 7,67× 103X + 3,52× 103,Y
= 2,36× 103X + 3,03× 103,Y = 2,36× 103X + 3,03
× 103,相关系数 (R 2) 均为 0,9999,线性范围均为 0,1
～ 1 000 ng m l。
图 1 4 种喹诺酮类药物的典型 HPLC-FLD 色谱图
(A ) 2,5 ng m l 混合标准溶液,由左至右依次为,
环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星 ;
(B)空白鱼肉组织 ;
2,2 检测限 取 6 个空白样品基线噪音值的平均值,以信噪比为 3 计,鱼肉中 4 种药物检测限 (LOD )
分别为,环丙沙星 0,3 ng g,恩诺沙星 1,0 ng g,沙拉沙星 0,2 ng g,双氟沙星 0,2 ng g。空白样品色谱图见图 1 (B )。
2,3 回收率与精密度 4 种药物低、中、高 3 个浓度的样品添加回收率和日内、日间变异系数见表 1。
2,4 鲫鱼肌肉组织中恩诺沙星残留消除规律的研究
恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星总量的残留消
57 Ch inese Journal of V eterinary M edicine 中国兽医杂志 2007 年 (第 43 卷 )第 1 期除曲线见图 2。
图 2 给药后 (5 m g kg 体重 - 1×天 - 1)鲫鱼肌肉组织中环丙沙星与恩诺沙星残留总量的浓度—时间曲线
3 讨论本检测方法是在参照国标方法 \[ 8 \],Zhen ling Z\[ 9 \]
的基础上建立起来的,以 pH 2,4 磷酸 2乙腈 (82+ 18)
为流动相,环丙沙星与恩诺沙星分离较好,但双氟沙星与沙拉沙星无法完全分离,作者对流动相的 pH 进行了系统研究,pH 2,4～ 3,2 时,药物峰形较好,但双氟沙星、沙拉沙星两种药物分离不完全,pH > 4,0
时,4 种药物分离较好,但峰形较差,只有当 pH = 4.
0,才能兼顾峰形与分离度,采用该流动相体系,药物出峰时间对 pH 依赖性很大,重现性差。按照 Zhen ling
Z 方法采用 0,05 m o l 柠檬酸 + 0,1 m o l 乙酸铵 2乙腈为流动相,无需调节 pH,药物分离好,峰形对称且无拖尾现象。
表 1 回收率及变异系数药物 添加浓度 (ng g) 测定浓度 (ng g) 平均回收率 (± SD,% ) 变异系数 (n= 3,% )
环丙沙星 5 4,02 4,36 3,95 82,2± 4,39 5,33
20 18,76 17,54 18,28 90,9± 3,07 3,38
100 80,70 79,10 77,30 79,0± 1,70 2,15
恩诺沙星 5 4,55 4,68 4,44 91,1± 2,45 2,69
20 19,42 18,78 18,28 94,1± 2,86 3,04
100 85,20 84,70 82,30 84,1± 1,55 1,84
沙拉沙星 5 4,16 4,29 4,53 86,5± 3,71 4,29
20 18,26 17,10 16,66 86,7± 4,14 4,77
100 77,70 75,80 73,80 75,8± 1,95 2,57
双氟沙星 5 4,11 4,07 4,25 83,8± 1,95 2,33
20 18,76 19,22 19,38 95,6± 1,61 1,68
100 87,30 87,60 85,70 86,9± 1,03 1,18
采用 pH 7,0 的磷酸盐缓冲液提取鱼肉中药物,回收率不稳定,基线噪音较大,将 pH 调节为 7,4,情况得到改善。本文将高速 (15 000 r m in) 离心与低速离心
(4 000 r m in) 进行对比,结果发现低速离心时上层提取液较浑浊,在净化程序中,可能堵塞固相萃取柱,而且低速离心不足以使组织与提取液完全分离,产生的上层清液量较少,这将直接导致回收率的降低。
残留消除试验,给药后 3 h 后,鱼肌肉组织中恩诺沙星浓度为 6,2 m g kg,48 h 药物浓度降低近 1 2,
264 h 药物浓度降至 0,68 m g kg,之后药物代谢非常缓慢,720 h 药物浓度为 96 ng g,低于最高残留限量
100 ng g\[ 10 \]。活性代谢产物环丙沙星在停药后 3 h,浓度达到 0,18 m g kg 在停药后 1 天内维持在较高浓度
(≈ 0,2 m g kg),之后缓慢降低,1416 h 后检测不出。
目前我国还没有对恩诺沙星在水产动物体内的休药期作出明确的规定,但一般药物规定为 400℃ 2日
2500℃ 2日 \[ 11 \]。 500℃ 2日时,恩诺沙星在鲫鱼体内含量仍然高于最高残留限量。根据本试验结果,在 20℃水温条件下,600℃ 2日鲫鱼体内药物浓度可以满足
M RL 要求,但鉴于实际生产中水温条件可能低于本试验条件,故推荐的安全休药期为 740℃ 2日。
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