1
纸上层析
Paper Chromatography
2
目录
一 纸色谱法的基本理论
二 几种特殊类型的纸色谱法
三 应用举例
3
原理,根据溶质 A在流动相与固定相（纸纤维中吸着的水分）中的分配系数不同，流动相因毛细现象沿纸上升,KD大的前进慢,KD小的上升快，因而溶质得到分离。
D
[ A ]
[ A ]
K? 固 定 相流 动 相固定相 —— 滤纸上的吸附水
(或用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇处理 )
流动相 —— 溶剂
（乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶的溶剂）
（但也有人认为属离子交换色谱和吸附色谱或三者皆有）
一,基本原理
4
纸色谱示意图
Rf > 0.02,A,B可分离,
1
2
f
1
f
2
f
x
R
y
x
R
y
x
R
y
比移值溶剂前沿起始线
（原点）
展开剂
yx
2
x1
层析缸层析纸与标样比较可定性鉴定
5
氨基酸的 Rf值展开剂正丁醇 +吡啶 +水 0.20 0.29 0.60 0.20 0.33 0.24
1,1,1
正丁醇 +醋酸 +水 0.23 0.23 0.70 0.28 0.22 0.11
12,3,5
天冬氨酸甘氨酸白氨酸谷氨酸丝氨酸组氨酸
1,展开剂种类二,影响 Rf的因素
6
2,滤纸的性质粘稠展开剂 (正丁醇等 ) ------快速滤纸黏度小的展开剂 (石油醚等 ) ------慢速滤纸
4,展开方式上行 ---- 慢 (常用 )
下行 ----快 ( 适用于比移值小的溶质 )
3,温度的影响影响分配系数的变化，而且展开剂组成也受温度影响而有一定程度改变，但影响较小。一般不需要特别的恒温装置
7
三,纸色谱法的基本操作
3.1 纸的准备
3.2 点样
3.3 展开
3.4 显色及定位
3.5 定量
8
3.1 纸的准备一般纸色谱法使用的滤纸应具备以下条件：
（ 1） 滤纸中应不含有水或有机溶剂能溶解的杂质 。
（ 2） 滤纸被溶剂浸润时,不应有机械折痕和损伤 。 即应具有一定的强度 。
（ 3） 滤纸对溶剂的渗透速度应适当,渗透速度太快时易引起斑点拖尾,影响分离效果,速度太慢时,耗费时间太长 。
（ 4） 纸质应均一,否则会影响实验结果的重复性,特别是定量实验中这点更是重要 。
9
层析纸 按需要剪裁成长条形（或筒型）3.2 点样用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。
试样点的直径一般应小于 5mm。可并排点多个试样同时展开。
10
展开时必须在密闭的容器中进行。
3.3 展开展开剂不得浸泡到点样线一元展开二元展开（双向展开）
多段展开将滤纸浸于层析缸中的展开剂中，使展开剂通过滤纸的毛细作用上升（或下降），
实现试样的分离
11
例,氨基酸混合液点在 15× 15cm滤纸边 2cm处，风干，
展开剂用 CH3OH-H2O-吡啶（ 20:5:1）,当溶剂移动至
14cm处，取出风干。 （ 第一次展开）
将滤纸折成筒状，
使斑点处于下方，再用叔丁醇 -甲基乙基酮 -
H2O-二乙胺 (10:10:5:1)
展开至 14cm，取出风干。
(第二次展开 )
显色,茚三酮 -4-乙 -2-
甲氮苯 -冰 HAc
x
x
第二次展开双向纸色谱法第一次展开
12
3.4 显色及定位经上述展开至溶剂前沿到达纸的另一端时,即可将纸取出,待溶剂挥干后用适宜方法确定组分斑点的位置有色物质,展开后即可直接观察到各个色斑紫外光照射下产生荧光,观察荧光 （ 例如生物碱 ）
喷以试剂使斑点显色 （ 显色剂,
碘蒸气熏或氨水熏等 ）
13
显色举例
1,磺胺类药物如磺胺噻唑和磺胺嘧啶混合物的分离和检出,可用 1% 的氨水作展开剂,用对二甲胺基苯甲醛 （ 即 Ehrlich试剂 ）
乙醇溶液作显色剂 。 [5]
2,氨基酸的分离和检出,一般需用双向层析 。 先用酚：水 （ 7：
3） 作展开剂进行第一次展开；再用丁醇：醋酸：水 （ 4,1,2） 作展开剂进行第二次展开,可分离出近 20 种氨基酸 。 展开后喷以茚三酮的丁醇溶液,使之显色 。 [1]
3,纸上层析法不但可用于分离各种常见无机离子,由于它需用试样量很少,因此在各种贵金属和稀有元素的分离方面也已得到了很好的应用 。 例如金,铂,钯,铑离子的分离,可用乙醚：丁醇：
浓盐酸 （ 1,2,2.5） 混合溶液作展开剂,展开后喷以 SnCl2溶液
,金,铂,钯立即出现色斑,铑则在稍温热后显色 。 铑,钌,钯,
铂,铱,金离子的分离则可用 N-N二仲辛基乙酰胺为固定相,5M
HCl 溶液为展开剂进行纸上反相层析等 。
14
3.5 定量
1.洗脱测定法操作步骤多,测定时间长,但洗脱法不需要贵重仪器设备,测定结果有较好的准确度 。
紫外分光光度法、
比色法及其它方法如极谱、库仑滴定、
荧光测定等。
15
2 直接测定法
a 目测法 样品经分离后,直接观察所得斑点的大小和颜色的深浅,并与标准品在相同条件下展开所得到的一系列已知不同浓度的标准斑点相比较,而近似地判断样品中所测成分的含量 。 （ 误差较大 ）
b 测面积法 展开后色谱上的斑点面积与化合物含量间存在一定关系,所以可以用测定斑点面积的方法来测定样品含量 。
16
c 仪器测定法
纸色谱中纸为半透明物体，故可以用类似于分光光度计结构的光密度计
（ densitometer ）扫描滤纸，测定透光强度的变化而定量。
17
四,应用举例
(一 )分离和分光光度法测定氯原酸
(二 )用色谱法测定岩石及矿物中金、锑
硒、砷、铊（铋）
(三 )贵金属元素的反相纸色谱分离研究
18
(一 ) 分离和分光光度法测定氯原酸
1,搞要 氯原酸是杜仲,金银花等多种中草药抗菌消炎的有效成份之一 。 氯原酸的测定有多种方法,本文用纸色谱法的分离条件和氯原酸的配位效应进行显色的有关参数,建立了测定氯原酸的可见分光光度法 。 方法具有仪器简单,灵敏度高,选择性好,快速准确,容易普及等优点 。
19
2 实验部分
a 仪器和试剂 色谱用滤纸 （ 杭州新华纸业有限公司 ）
721型分光光度计 （ 上海分析仪器三厂 ）
KQ— 1500型超声波发生器 （ 昆山市超声仪器有限公司 ） 等 。
b 样品预处理和测量 吸取 5.0000g 干燥杜仲叶粉末,加蒸馏水浸泡 24h,超声波振荡处理 3 次,每次 30min,合并滤液,定容于
100ml 容量瓶中 。 吸取 50ul 提取液,点样于色谱滤纸上,用正丁醇 -水 -冰醋酸 （ 4,2,1，
V/V） 作展开剂,按常规操作展开,风干滤纸,
在 365nm 紫外分析仪上点划出淡蓝色荧光斑点,剪下,并 剪 成 细 条 状,收 集 于
20ml具塞刻度试管中,加 10ml 蒸馏水,超声波振荡处理 15min,所得溶液测量吸光度 A。
20
3,结果与讨论：
a) 显色吸收光谱 紫红色络合物的吸收光谱,最大吸收波长为 526nm。
b) 显色化合物的稳定时间 室温加入乙醇,然后显色,
显色化合物的吸光度在 1.5h 内无变化,完全能够满足测定的要求 。
c) 杜仲叶提取氯原酸的纸色谱分离 对杜仲叶提取液的纸色谱分离展开剂进行了不同组成和配比的对比实验,
其中以正丁醇 -醋酸 -水 （ 4,1,2,V/V） 分离效果最好,
可使氯原酸与干扰物质完全分离 。 氯原酸的 Rf 值为
0.75。
21
(二 )贵金属元素的反相纸色谱分离研究文献研究了以不同浓度 P350 和 P507 (含磷的萃取剂 )为固定相,不同展开体系为流动相的 Au,Rh,Ru、
Pd等 6 种贵金属离子的反相纸色谱行为,讨论了温度对 Rf 值的影响,并获得了某些多组分混合体系的良好分离 。
仪器与试剂,2 × 24cm,4× 24cm 国产新华牌色层滤纸,将其在不同浓度的 P350,P507苯溶液中浸渍
2min,取 出 晾 干,放 入 干 燥 器 中 备 用 。
12× 12× 24cm 层析缸色谱及显色,按常规上行方法展开 2-3 小时,溶剂前沿为 18± 1cm,以 SnCl2 盐酸溶液显色 。
实验发现,不同温度下各种金属离子的 Rf 值,除 Ag+、
Au+外,随温度升高,各离子的 Rf 值不同程度增加 。
22
(三 ) 用色谱法测定岩石及矿物中金、锑、
硒、砷、铊（铋）
文献报道了用纸色谱法测定岩石及矿物中铜,铅,锌十二种元素的研究,并对其影响因素也作了探讨 。 而金,锑,硒,砷,铊 （ 铋 ）
在 4mol/l饱和正丁醇展开剂中用纸色谱法进行分离的文献已有介绍,但利用此方法在岩石及矿物中对它们进行测定却未见报道 。 本文在此基础上,利用新华大张定性滤纸 （ 50× 60cm）
作载体展开后,将谱带分别剪下进行测定 。 经实验证明,这种方法既简单,又快速,还能解决干扰问题 。
23
作 业
1,简述纸色谱的原理
2,比移值的概念
3,纸色谱的应用对象
24
谢 谢 ！
纸上层析
Paper Chromatography
2
目录
一 纸色谱法的基本理论
二 几种特殊类型的纸色谱法
三 应用举例
3
原理,根据溶质 A在流动相与固定相（纸纤维中吸着的水分）中的分配系数不同，流动相因毛细现象沿纸上升,KD大的前进慢,KD小的上升快，因而溶质得到分离。
D
[ A ]
[ A ]
K? 固 定 相流 动 相固定相 —— 滤纸上的吸附水
(或用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇处理 )
流动相 —— 溶剂
（乙醇、丙醇、丙酮及与水不相溶的溶剂）
（但也有人认为属离子交换色谱和吸附色谱或三者皆有）
一,基本原理
4
纸色谱示意图
Rf > 0.02,A,B可分离,
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f
1
f
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x
R
y
x
R
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R
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比移值溶剂前沿起始线
（原点）
展开剂
yx
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x1
层析缸层析纸与标样比较可定性鉴定
5
氨基酸的 Rf值展开剂正丁醇 +吡啶 +水 0.20 0.29 0.60 0.20 0.33 0.24
1,1,1
正丁醇 +醋酸 +水 0.23 0.23 0.70 0.28 0.22 0.11
12,3,5
天冬氨酸甘氨酸白氨酸谷氨酸丝氨酸组氨酸
1,展开剂种类二,影响 Rf的因素
6
2,滤纸的性质粘稠展开剂 (正丁醇等 ) ------快速滤纸黏度小的展开剂 (石油醚等 ) ------慢速滤纸
4,展开方式上行 ---- 慢 (常用 )
下行 ----快 ( 适用于比移值小的溶质 )
3,温度的影响影响分配系数的变化，而且展开剂组成也受温度影响而有一定程度改变，但影响较小。一般不需要特别的恒温装置
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三,纸色谱法的基本操作
3.1 纸的准备
3.2 点样
3.3 展开
3.4 显色及定位
3.5 定量
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3.1 纸的准备一般纸色谱法使用的滤纸应具备以下条件：
（ 1） 滤纸中应不含有水或有机溶剂能溶解的杂质 。
（ 2） 滤纸被溶剂浸润时,不应有机械折痕和损伤 。 即应具有一定的强度 。
（ 3） 滤纸对溶剂的渗透速度应适当,渗透速度太快时易引起斑点拖尾,影响分离效果,速度太慢时,耗费时间太长 。
（ 4） 纸质应均一,否则会影响实验结果的重复性,特别是定量实验中这点更是重要 。
9
层析纸 按需要剪裁成长条形（或筒型）3.2 点样用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。
试样点的直径一般应小于 5mm。可并排点多个试样同时展开。
10
展开时必须在密闭的容器中进行。
3.3 展开展开剂不得浸泡到点样线一元展开二元展开（双向展开）
多段展开将滤纸浸于层析缸中的展开剂中，使展开剂通过滤纸的毛细作用上升（或下降），
实现试样的分离
11
例,氨基酸混合液点在 15× 15cm滤纸边 2cm处，风干，
展开剂用 CH3OH-H2O-吡啶（ 20:5:1）,当溶剂移动至
14cm处，取出风干。 （ 第一次展开）
将滤纸折成筒状，
使斑点处于下方，再用叔丁醇 -甲基乙基酮 -
H2O-二乙胺 (10:10:5:1)
展开至 14cm，取出风干。
(第二次展开 )
显色,茚三酮 -4-乙 -2-
甲氮苯 -冰 HAc
x
x
第二次展开双向纸色谱法第一次展开
12
3.4 显色及定位经上述展开至溶剂前沿到达纸的另一端时,即可将纸取出,待溶剂挥干后用适宜方法确定组分斑点的位置有色物质,展开后即可直接观察到各个色斑紫外光照射下产生荧光,观察荧光 （ 例如生物碱 ）
喷以试剂使斑点显色 （ 显色剂,
碘蒸气熏或氨水熏等 ）
13
显色举例
1,磺胺类药物如磺胺噻唑和磺胺嘧啶混合物的分离和检出,可用 1% 的氨水作展开剂,用对二甲胺基苯甲醛 （ 即 Ehrlich试剂 ）
乙醇溶液作显色剂 。 [5]
2,氨基酸的分离和检出,一般需用双向层析 。 先用酚：水 （ 7：
3） 作展开剂进行第一次展开；再用丁醇：醋酸：水 （ 4,1,2） 作展开剂进行第二次展开,可分离出近 20 种氨基酸 。 展开后喷以茚三酮的丁醇溶液,使之显色 。 [1]
3,纸上层析法不但可用于分离各种常见无机离子,由于它需用试样量很少,因此在各种贵金属和稀有元素的分离方面也已得到了很好的应用 。 例如金,铂,钯,铑离子的分离,可用乙醚：丁醇：
浓盐酸 （ 1,2,2.5） 混合溶液作展开剂,展开后喷以 SnCl2溶液
,金,铂,钯立即出现色斑,铑则在稍温热后显色 。 铑,钌,钯,
铂,铱,金离子的分离则可用 N-N二仲辛基乙酰胺为固定相,5M
HCl 溶液为展开剂进行纸上反相层析等 。
14
3.5 定量
1.洗脱测定法操作步骤多,测定时间长,但洗脱法不需要贵重仪器设备,测定结果有较好的准确度 。
紫外分光光度法、
比色法及其它方法如极谱、库仑滴定、
荧光测定等。
15
2 直接测定法
a 目测法 样品经分离后,直接观察所得斑点的大小和颜色的深浅,并与标准品在相同条件下展开所得到的一系列已知不同浓度的标准斑点相比较,而近似地判断样品中所测成分的含量 。 （ 误差较大 ）
b 测面积法 展开后色谱上的斑点面积与化合物含量间存在一定关系,所以可以用测定斑点面积的方法来测定样品含量 。
16
c 仪器测定法
纸色谱中纸为半透明物体，故可以用类似于分光光度计结构的光密度计
（ densitometer ）扫描滤纸，测定透光强度的变化而定量。
17
四,应用举例
(一 )分离和分光光度法测定氯原酸
(二 )用色谱法测定岩石及矿物中金、锑
硒、砷、铊（铋）
(三 )贵金属元素的反相纸色谱分离研究
18
(一 ) 分离和分光光度法测定氯原酸
1,搞要 氯原酸是杜仲,金银花等多种中草药抗菌消炎的有效成份之一 。 氯原酸的测定有多种方法,本文用纸色谱法的分离条件和氯原酸的配位效应进行显色的有关参数,建立了测定氯原酸的可见分光光度法 。 方法具有仪器简单,灵敏度高,选择性好,快速准确,容易普及等优点 。
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2 实验部分
a 仪器和试剂 色谱用滤纸 （ 杭州新华纸业有限公司 ）
721型分光光度计 （ 上海分析仪器三厂 ）
KQ— 1500型超声波发生器 （ 昆山市超声仪器有限公司 ） 等 。
b 样品预处理和测量 吸取 5.0000g 干燥杜仲叶粉末,加蒸馏水浸泡 24h,超声波振荡处理 3 次,每次 30min,合并滤液,定容于
100ml 容量瓶中 。 吸取 50ul 提取液,点样于色谱滤纸上,用正丁醇 -水 -冰醋酸 （ 4,2,1，
V/V） 作展开剂,按常规操作展开,风干滤纸,
在 365nm 紫外分析仪上点划出淡蓝色荧光斑点,剪下,并 剪 成 细 条 状,收 集 于
20ml具塞刻度试管中,加 10ml 蒸馏水,超声波振荡处理 15min,所得溶液测量吸光度 A。
20
3,结果与讨论：
a) 显色吸收光谱 紫红色络合物的吸收光谱,最大吸收波长为 526nm。
b) 显色化合物的稳定时间 室温加入乙醇,然后显色,
显色化合物的吸光度在 1.5h 内无变化,完全能够满足测定的要求 。
c) 杜仲叶提取氯原酸的纸色谱分离 对杜仲叶提取液的纸色谱分离展开剂进行了不同组成和配比的对比实验,
其中以正丁醇 -醋酸 -水 （ 4,1,2,V/V） 分离效果最好,
可使氯原酸与干扰物质完全分离 。 氯原酸的 Rf 值为
0.75。
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(二 )贵金属元素的反相纸色谱分离研究文献研究了以不同浓度 P350 和 P507 (含磷的萃取剂 )为固定相,不同展开体系为流动相的 Au,Rh,Ru、
Pd等 6 种贵金属离子的反相纸色谱行为,讨论了温度对 Rf 值的影响,并获得了某些多组分混合体系的良好分离 。
仪器与试剂,2 × 24cm,4× 24cm 国产新华牌色层滤纸,将其在不同浓度的 P350,P507苯溶液中浸渍
2min,取 出 晾 干,放 入 干 燥 器 中 备 用 。
12× 12× 24cm 层析缸色谱及显色,按常规上行方法展开 2-3 小时,溶剂前沿为 18± 1cm,以 SnCl2 盐酸溶液显色 。
实验发现,不同温度下各种金属离子的 Rf 值,除 Ag+、
Au+外,随温度升高,各离子的 Rf 值不同程度增加 。
22
(三 ) 用色谱法测定岩石及矿物中金、锑、
硒、砷、铊（铋）
文献报道了用纸色谱法测定岩石及矿物中铜,铅,锌十二种元素的研究,并对其影响因素也作了探讨 。 而金,锑,硒,砷,铊 （ 铋 ）
在 4mol/l饱和正丁醇展开剂中用纸色谱法进行分离的文献已有介绍,但利用此方法在岩石及矿物中对它们进行测定却未见报道 。 本文在此基础上,利用新华大张定性滤纸 （ 50× 60cm）
作载体展开后,将谱带分别剪下进行测定 。 经实验证明,这种方法既简单,又快速,还能解决干扰问题 。
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作 业
1,简述纸色谱的原理
2,比移值的概念
3,纸色谱的应用对象
24
谢 谢 ！
