2009-7-31
高效毛细管电泳分析
High Performance Capillary
Electrophoresis
(HPCE)
2009-7-31
一、概述
generalization
二、经典电泳分析法
traditional electrophoresis
三、高效毛细管电泳分析法
high performance
capillary electrophoresis
第一节概 述
Generalization
2009-7-31
一,概述在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为 电泳 。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。
1937年,Tiselius(瑞典 )将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳,第一次 将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和 α,β,γ 球蛋白；
发现 样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；
第一次 的 自由溶液电泳； 第一台电泳仪 ；
1948年,获诺贝尔化学奖
2009-7-31
二,经典电泳分析利用 电泳 现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。
按 形状分类,U型管电泳、柱状电泳、板电泳；
按 载体分类,滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、
自由电泳；
传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。
1981年,Jorgenson和 Luckas,用 75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达 40万 /m,促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与 GC,HPLC相媲美的崭新的分离分析技术 —— 高效毛细管电泳 。
2009-7-31
三,高效毛细管电泳分析高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：
一是采用了 0.05mm内径的毛细管,
二是采用了高达数千伏的电压 。
毛细管的采用使产生的热量能够较快散发,大大减小了温度效应,使电场电压可以很高 。
电压升高,电场推动力大,又可进一步使柱径变小,
柱长增加,
高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱,理论塔板数高达几十万块 /米,特殊柱子可以达到数百万 。
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分离过程
电场作用下,毛细管柱中出现,电泳现象和电渗流现象 。
带电粒子的 迁移速度 =电泳 +电渗流； 两种速度的矢量和 。
正离子,两种效应的运动方向一致,在 负极最先流出 ；
中性粒子 无电泳现象,受电渗流影响,在阳离子后流出 ；
阴离子,两种效应的运动方向相反 。 ν 电渗流 >ν 电泳 时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离 。
2009-7-31
高效毛细管电泳的特点
1.仪器简单、易自动化电源、毛细管、检测器、溶液瓶
2.分析速度快、分离效率高在 3.1min内分离 36种无机及有机阴离子,4.1min内分离了 24种阳离子；分离柱效,105～ 107/m理论塔板数,
3.操作方便、消耗少进样量极少，水介质中进行,
4.应用范围极广有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；
分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等,
2009-7-31
一,PHCE基本原理
basic principles of PHCE
二、电渗现象与电渗流
electroosmosis and electroosmotic
flow
三、影响电渗流的因素
factors influenced electroosmosis
四、淌度
mobility
五,PHCE中的参数与关系式
parameters and relation in HPCE
六、影响分离效率的因素
factors influenced separation
efficiency
第二节高效毛细管电泳理论基础
basic theory of HPCE
2009-7-31
一、高效毛细管电泳 (HPCE)基本原理
Basic principles of PHCE
电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度,迁移速度与哪些因素有关？
当带电离子以速度 ν 在电场中移动时，受到大小相等、
方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。
电场力,FE = qE
阻 力,F = fν
故,qE = fν
q— 离子所带的有效电荷；
E — 电场强度；
ν— 离子在电场中的迁移速度；
f — 平动摩擦系数 ( 对于球形离子,f =6πηγ； γ — 离子的表观液态动力学半径； η — 介质的粘度； )
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所以，迁移速度：
EqfqE π6
（ 球形离子 ）
物质离子在电场中 差速迁移 是电泳分离的基础。
淌度 μ：单位电场强度下的平均电泳速度。
π6
q
E
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二、电渗现象与电渗流
electroosmosis and electroosmotic flow
1.电渗流现象当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液 -固界面形成 双电层,二者之间存在电位差。
当液体两端施加电压时，
就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫 电渗现象 。
电渗现象中整体移动着的液体叫 电渗流 （ electroosmotic
flow,简称 EOF）。
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2.HPCE中的电渗现象与电渗流石英毛细管柱，内充液 pH>3时，表面电离成 -SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。
在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度 ν 电渗流 。
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3.HPCE中电渗流的大小与方向电渗流的大小用电渗流速度 ν 电渗流 表示，取决于电渗淌度 μ和电场强度 E。 即
ν 电渗流 = μ E
电渗淌度取决于电泳介质及双电层的 Zeta电势，即
μ = ε 0εξ
ε 0— 真空介电常数； ε — 介电常数； ξ — 毛细管壁的 Zeta电势。
ν 电渗流 = ε 0εξE
实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算
ν 电渗流 = Lef/teo
Lef — 毛细管有效长度； teo— 电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。
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HPCE中电渗流的方向电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：
内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；
内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；
石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；
改变电渗流方向的方法：
（ 1）毛细管改性表面键合阳离子基团；
（ 2）加电渗流反转剂内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。
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4,HPCE中电渗流的流形电荷均匀分布，整体移动,电渗流的流动为平流,塞式流动 （谱带展宽很小）；
液相色谱中的溶液流动为层流,抛物线流型,管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的 2倍（引起谱带展宽较大）。
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5,HPCE中电渗流的作用电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的 5～ 7倍；
各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：
ν + =ν 电渗流 + ν +ef 阳离子运动方向与电渗流 一致 ；
ν - =ν 电渗流 - ν -ef 阴离子运动方向与电渗流 相反 ；
ν 0 =ν 电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；
（ 1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；
（ 2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，
如同改变 LC中的流速；
（ 3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；
在 HPCE中，控制电渗流非常重要 。
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三,HPCE中影响电渗流的因素
factors influenced electroosmosis
1.电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，
电渗流速度正比于工作电压。
2.毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；
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3,电解质溶液性质的影响
（ 1）溶液 pH的影响对于石英毛细管，溶液 pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁 zeta电势增大，电渗流增大,pH=7,达到最大 ；
pH<3,完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持 pH稳定。
（ 2）阴离子的影响在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。
缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。
2009-7-31
2009-7-31
4,温度的影响毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。
温度变化来自于“焦耳热”；
焦耳热,毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；
HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。
温度每变化 1，将引起背景电解质溶液黏度变化 2%～ 3%；
2009-7-31
5,添加剂的影响
（ 1）加入浓度较大的中性盐，如 K2SO4,溶液离子强度增大，
使溶液的黏度增大，电渗流减小。
（ 2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；
加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。
加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（ SDS）,可以使壁表面负电荷增加,zeta电势增大，电渗流增大；
（ 3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，
使电渗流增大。
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四、淌度 mobility
淌度,带电离子在单位电场下的迁移速度；
淌度不同是电泳分离的基础。
1.绝对淌度 (absolute mobility)μab
无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。
2.有效淌度 (effective mobility)μef
实际溶液中的淌度 (实验中测定的 )。 μef=∑ aiμi
ai — 溶质 i 的解离度 ； μi — 溶质 i 在解离状态下的绝对淌度
3.表观淌度 μ ap
离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）：
ν ap=μap? E μap = μef + μeo
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五,HPCE中的参数与关系式
parameters and relation in HPCE
1.迁移时间（保留时间）
HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。
V
LL
E
LLt
ap
ef
ap
ef
ap
ef
V— 外加电压； L— 毛细管总长度；
2.分离效率（塔板数）
在 HPCE中，仅存在纵向扩散,σ 2=2Dt
2
2/1
54.5;22
Y
tn
D
EL
DL
VLn Refapefap
扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。
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3.分离度
DL
VLR efap?
平均
1 77.0
影响分离度的主要因素；工作电压 V； 毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：
2
21 apap
平均
12
12 )(2
WW
ttR
2009-7-31
六、影响分离效率的因素 — 区带展宽
factors influenced the efficiency— band broadening
1.纵向扩散的影响在 HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽,σ 2=2Dt
由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。
2.进样的影响当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度,
Winj= (24D t )1/2
实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的 1%～ 2%。
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3.焦耳热与温度梯度的影响电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：
2
2π EcΛLr
IVQ
bm?
m— 电解质溶液的摩尔电导； I— 工作电流,cm— 电解质浓度；
散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），
破坏了塞流，导致区带展宽。
改善方法：
（ 1）减小毛细管内径； (2）控制散热；
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4.溶质与管壁间的相互作用存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；
蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大 难题 。
细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。
减小吸附的方法和途径,加入两性离子代替强电解质，
两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的 100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。
2009-7-31
5.其他影响因素
（ 1）电分散作用对谱带展宽的影响当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。
（ 2）“层流”现象对谱带展宽的影响一般情况下,HPCE中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流；
产生的原因,毛细管两端液面高度不同。
实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液 平面高度相同 。
2009-7-31
一、高效毛细管电泳仪
high performance capillary
electrophoresis apparatus
二、流程与主要部件
process and main assembly
三、进样方式
injection method
第三节高效毛细管电泳仪
high performance capillary
electrophoresis apparatus
2009-7-31
一、高效毛细管电泳仪
high performance capillary electrophoresis apparatus
2009-7-31
仪器 2
2009-7-31
仪器 3
2009-7-31
二、仪器流程与主要部件
process and main assembly
电压,0～ 30kV；
分离柱不涂敷任何固定液；
紫外或激光诱导荧光检测器；
（ 可检测到,10-19～ 10-21 mol/L）
2009-7-31
1.高压电源
（ 1） 0～ 30 kV 稳定、连续可调的直流电源；
（ 2）具有恒压、恒流、恒功率输出；
（ 3）电场强度程序控制系统；
（ 4）电压稳定性,0.1%；
（ 5）电源极性易转换；
2,毛细管柱
（ 1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；
（ 2）规格：内径 20～
75μ m,外径 350～ 400μ m；
长度 <=1m
2009-7-31
3.缓冲液池化学惰性，机械稳定性好；
4,检测器要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；
检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；
类型 检测限 /mol 特点紫外 -可见 10-13～ 10-15 加二极管阵列，光谱信息荧光 10-15～ 10-17 灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光 10-18～ 10-20 灵敏度极高，样品需衍生电导 10-18～ 10-19 离子灵敏，需专用的装置；
2009-7-31
三、毛细管电泳的进样方式
injection method of HPCE
进样量：毛细管长度的 1%-2%；纳升级、非常小；
1,流体力学进样方式
（ 1）进样端加压
（ 2）出口端抽真空
（ 3）虹吸进样
t
L
Pd
1 2 8
π4进样体积
2009-7-31
毛细管一端插入样品瓶，加电压；
2,电动进样方式
tL ctrVefeo
2π)
（进样量进样不均,电歧视现象，淌度大的离子比淌度大的进样量大；
离子丢失,淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去；
特别适合黏度大的试样
2009-7-31
一、毛细管区带电泳 (CZE)
Capillary zone electrophoresis
二、毛细管凝胶电泳 (CGE)
Capillary gel electrophoresis
三、胶束电动毛细管色谱
Micelle electrokinetic capillary
electrophoresis
四、毛细管电色谱
Capillary electrochromatography
五,其 他第四节高效毛细管电泳分离模式
Separate types of HPCE
2009-7-31
一、毛细管区带电泳
Capillary zone electrophoresis,CZE
带电粒子的迁移速度 =电泳和电渗流速度的矢量和。
正离子,两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；
中性粒子,无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；
阴离子,两种效应的运动方向相反； ν 电渗流 >ν 电泳 时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于 差速迁移 被相互分离。
最基本、应用广的分离模式；
2009-7-31
二、毛细管凝胶电泳
Capillary gel electrophoresis,CGE
将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。
其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。
蛋白质,DNA等的电荷 /质量比与分子大小无关,CZE模式很难分离，采用 CGE能获得良好分离,DAN排序的重要手段。
特点,抗对流性好，散热性好，分离度极高。
无胶筛分技术,采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。
2009-7-31
1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。
三,胶束电动毛细管色谱 （ MECC,MEKC）
Micellar electrokinetic capillary chromatography,MEKC
在电场力的作用下，胶束在柱中移动。
2009-7-31
2,电泳流和电渗流的方向相反，且 ν 电渗流 > ν 电泳,
负电胶束以较慢的速度向负极移动；
5.色谱与电泳分离模式的结合。
3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；
4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围 ；
2009-7-31
在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定相，或在管内填充固定相，
根据溶质在固定相和流动相中的分配系数的不同和自身的电泳淌度差异得以分离．
四,毛细管电色谱 (CEC )
Capillary electrochromatography
2009-7-31
几种主要类型开管毛细管电色谱柱 OT-CEC
填充毛细管电色谱柱 P-CEC
整体毛细管电色谱柱 ML-CEC
2009-7-31
填充毛细管电色谱柱
P-CEC是最早研究的，其填料巨大的比表面使其对污染不敏感，分析结果的重现性较好，但因其填充及制备柱两端塞子的困难，以及由此带来的气泡效应和塞子效应等阻碍了它的进一步发展。但人们至今仍在努力并取得可喜进展 。
2009-7-31
开管毛细管电色谱柱
OT-CEC柱中无塞子和填料，气泡效应和涡流扩散的影响小，分析中可获得较高柱效，适用于混合物的快速分析，
但其相比小，柱容量低，寿命短，使其应用亦受到一定限制。
2009-7-31
整体毛细管电色谱柱
ML-CEC通过在毛细管内原位聚合或固化的方法制成具有均一多孔结构的整体式柱床，使毛细管柱的制备比较简单，且无塞子效应,
2009-7-31
1,根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；
2,毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（ 6～ 8V）
时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的 pH梯度；
3,氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液 pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；
五、毛细管等电聚焦
Capillary isoelectric focusing,CIEF
2009-7-31
4,聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点 pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；
5,阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀 NaOH溶液；
6,加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；
7,电渗流在 CIEF中不利，应消除或减小。
2009-7-31
1,将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子 (充满毛细管 )和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，
并以同一速度移动。
2,负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。
六、毛细管等速电泳
Capillary isotachophoresis,CITP
2009-7-31
3,不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同
(ν =μ E),淌度大的离子区带电场强度小；
沿出口到进口，将不同区带依次排序 1,2,3,4
电场强度依次增大。假设,2”号中离子扩散到,3”号，
该区电场强度大，离子被加速，返回到,2”区；当,2”号中离子跑到,1”号区，离子被减速使之归队；
4,特点：界面明显，富集、浓缩作用；
capillary isotachophoresis,CITP
2009-7-31
应用
略
高效毛细管电泳分析
High Performance Capillary
Electrophoresis
(HPCE)
2009-7-31
一、概述
generalization
二、经典电泳分析法
traditional electrophoresis
三、高效毛细管电泳分析法
high performance
capillary electrophoresis
第一节概 述
Generalization
2009-7-31
一,概述在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为 电泳 。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。
1937年,Tiselius(瑞典 )将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳,第一次 将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和 α,β,γ 球蛋白；
发现 样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；
第一次 的 自由溶液电泳； 第一台电泳仪 ；
1948年,获诺贝尔化学奖
2009-7-31
二,经典电泳分析利用 电泳 现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。
按 形状分类,U型管电泳、柱状电泳、板电泳；
按 载体分类,滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、
自由电泳；
传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。
1981年,Jorgenson和 Luckas,用 75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达 40万 /m,促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与 GC,HPLC相媲美的崭新的分离分析技术 —— 高效毛细管电泳 。
2009-7-31
三,高效毛细管电泳分析高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：
一是采用了 0.05mm内径的毛细管,
二是采用了高达数千伏的电压 。
毛细管的采用使产生的热量能够较快散发,大大减小了温度效应,使电场电压可以很高 。
电压升高,电场推动力大,又可进一步使柱径变小,
柱长增加,
高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱,理论塔板数高达几十万块 /米,特殊柱子可以达到数百万 。
2009-7-31
分离过程
电场作用下,毛细管柱中出现,电泳现象和电渗流现象 。
带电粒子的 迁移速度 =电泳 +电渗流； 两种速度的矢量和 。
正离子,两种效应的运动方向一致,在 负极最先流出 ；
中性粒子 无电泳现象,受电渗流影响,在阳离子后流出 ；
阴离子,两种效应的运动方向相反 。 ν 电渗流 >ν 电泳 时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离 。
2009-7-31
高效毛细管电泳的特点
1.仪器简单、易自动化电源、毛细管、检测器、溶液瓶
2.分析速度快、分离效率高在 3.1min内分离 36种无机及有机阴离子,4.1min内分离了 24种阳离子；分离柱效,105～ 107/m理论塔板数,
3.操作方便、消耗少进样量极少，水介质中进行,
4.应用范围极广有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；
分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等,
2009-7-31
一,PHCE基本原理
basic principles of PHCE
二、电渗现象与电渗流
electroosmosis and electroosmotic
flow
三、影响电渗流的因素
factors influenced electroosmosis
四、淌度
mobility
五,PHCE中的参数与关系式
parameters and relation in HPCE
六、影响分离效率的因素
factors influenced separation
efficiency
第二节高效毛细管电泳理论基础
basic theory of HPCE
2009-7-31
一、高效毛细管电泳 (HPCE)基本原理
Basic principles of PHCE
电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度,迁移速度与哪些因素有关？
当带电离子以速度 ν 在电场中移动时，受到大小相等、
方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。
电场力,FE = qE
阻 力,F = fν
故,qE = fν
q— 离子所带的有效电荷；
E — 电场强度；
ν— 离子在电场中的迁移速度；
f — 平动摩擦系数 ( 对于球形离子,f =6πηγ； γ — 离子的表观液态动力学半径； η — 介质的粘度； )
2009-7-31
所以，迁移速度：
EqfqE π6
（ 球形离子 ）
物质离子在电场中 差速迁移 是电泳分离的基础。
淌度 μ：单位电场强度下的平均电泳速度。
π6
q
E
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二、电渗现象与电渗流
electroosmosis and electroosmotic flow
1.电渗流现象当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液 -固界面形成 双电层,二者之间存在电位差。
当液体两端施加电压时，
就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫 电渗现象 。
电渗现象中整体移动着的液体叫 电渗流 （ electroosmotic
flow,简称 EOF）。
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2.HPCE中的电渗现象与电渗流石英毛细管柱，内充液 pH>3时，表面电离成 -SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。
在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度 ν 电渗流 。
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3.HPCE中电渗流的大小与方向电渗流的大小用电渗流速度 ν 电渗流 表示，取决于电渗淌度 μ和电场强度 E。 即
ν 电渗流 = μ E
电渗淌度取决于电泳介质及双电层的 Zeta电势，即
μ = ε 0εξ
ε 0— 真空介电常数； ε — 介电常数； ξ — 毛细管壁的 Zeta电势。
ν 电渗流 = ε 0εξE
实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算
ν 电渗流 = Lef/teo
Lef — 毛细管有效长度； teo— 电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。
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HPCE中电渗流的方向电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：
内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；
内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；
石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；
改变电渗流方向的方法：
（ 1）毛细管改性表面键合阳离子基团；
（ 2）加电渗流反转剂内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。
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4,HPCE中电渗流的流形电荷均匀分布，整体移动,电渗流的流动为平流,塞式流动 （谱带展宽很小）；
液相色谱中的溶液流动为层流,抛物线流型,管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的 2倍（引起谱带展宽较大）。
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5,HPCE中电渗流的作用电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的 5～ 7倍；
各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：
ν + =ν 电渗流 + ν +ef 阳离子运动方向与电渗流 一致 ；
ν - =ν 电渗流 - ν -ef 阴离子运动方向与电渗流 相反 ；
ν 0 =ν 电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；
（ 1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；
（ 2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，
如同改变 LC中的流速；
（ 3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；
在 HPCE中，控制电渗流非常重要 。
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三,HPCE中影响电渗流的因素
factors influenced electroosmosis
1.电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，
电渗流速度正比于工作电压。
2.毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；
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3,电解质溶液性质的影响
（ 1）溶液 pH的影响对于石英毛细管，溶液 pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁 zeta电势增大，电渗流增大,pH=7,达到最大 ；
pH<3,完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持 pH稳定。
（ 2）阴离子的影响在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。
缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。
2009-7-31
2009-7-31
4,温度的影响毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。
温度变化来自于“焦耳热”；
焦耳热,毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；
HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。
温度每变化 1，将引起背景电解质溶液黏度变化 2%～ 3%；
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5,添加剂的影响
（ 1）加入浓度较大的中性盐，如 K2SO4,溶液离子强度增大，
使溶液的黏度增大，电渗流减小。
（ 2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；
加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。
加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（ SDS）,可以使壁表面负电荷增加,zeta电势增大，电渗流增大；
（ 3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，
使电渗流增大。
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四、淌度 mobility
淌度,带电离子在单位电场下的迁移速度；
淌度不同是电泳分离的基础。
1.绝对淌度 (absolute mobility)μab
无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。
2.有效淌度 (effective mobility)μef
实际溶液中的淌度 (实验中测定的 )。 μef=∑ aiμi
ai — 溶质 i 的解离度 ； μi — 溶质 i 在解离状态下的绝对淌度
3.表观淌度 μ ap
离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）：
ν ap=μap? E μap = μef + μeo
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五,HPCE中的参数与关系式
parameters and relation in HPCE
1.迁移时间（保留时间）
HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。
V
LL
E
LLt
ap
ef
ap
ef
ap
ef
V— 外加电压； L— 毛细管总长度；
2.分离效率（塔板数）
在 HPCE中，仅存在纵向扩散,σ 2=2Dt
2
2/1
54.5;22
Y
tn
D
EL
DL
VLn Refapefap
扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。
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3.分离度
DL
VLR efap?
平均
1 77.0
影响分离度的主要因素；工作电压 V； 毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：
2
21 apap
平均
12
12 )(2
WW
ttR
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六、影响分离效率的因素 — 区带展宽
factors influenced the efficiency— band broadening
1.纵向扩散的影响在 HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽,σ 2=2Dt
由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。
2.进样的影响当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度,
Winj= (24D t )1/2
实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的 1%～ 2%。
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3.焦耳热与温度梯度的影响电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：
2
2π EcΛLr
IVQ
bm?
m— 电解质溶液的摩尔电导； I— 工作电流,cm— 电解质浓度；
散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），
破坏了塞流，导致区带展宽。
改善方法：
（ 1）减小毛细管内径； (2）控制散热；
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4.溶质与管壁间的相互作用存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；
蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大 难题 。
细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。
减小吸附的方法和途径,加入两性离子代替强电解质，
两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的 100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。
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5.其他影响因素
（ 1）电分散作用对谱带展宽的影响当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时，也造成谱带展宽；尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。
（ 2）“层流”现象对谱带展宽的影响一般情况下,HPCE中不存在层流，但当毛细管两端存在压力差时，出现抛物线形的层流；
产生的原因,毛细管两端液面高度不同。
实际操作时，保持毛细管两端缓冲溶液 平面高度相同 。
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一、高效毛细管电泳仪
high performance capillary
electrophoresis apparatus
二、流程与主要部件
process and main assembly
三、进样方式
injection method
第三节高效毛细管电泳仪
high performance capillary
electrophoresis apparatus
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一、高效毛细管电泳仪
high performance capillary electrophoresis apparatus
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仪器 2
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仪器 3
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二、仪器流程与主要部件
process and main assembly
电压,0～ 30kV；
分离柱不涂敷任何固定液；
紫外或激光诱导荧光检测器；
（ 可检测到,10-19～ 10-21 mol/L）
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1.高压电源
（ 1） 0～ 30 kV 稳定、连续可调的直流电源；
（ 2）具有恒压、恒流、恒功率输出；
（ 3）电场强度程序控制系统；
（ 4）电压稳定性,0.1%；
（ 5）电源极性易转换；
2,毛细管柱
（ 1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；
（ 2）规格：内径 20～
75μ m,外径 350～ 400μ m；
长度 <=1m
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3.缓冲液池化学惰性，机械稳定性好；
4,检测器要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；
检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；
类型 检测限 /mol 特点紫外 -可见 10-13～ 10-15 加二极管阵列，光谱信息荧光 10-15～ 10-17 灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光 10-18～ 10-20 灵敏度极高，样品需衍生电导 10-18～ 10-19 离子灵敏，需专用的装置；
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三、毛细管电泳的进样方式
injection method of HPCE
进样量：毛细管长度的 1%-2%；纳升级、非常小；
1,流体力学进样方式
（ 1）进样端加压
（ 2）出口端抽真空
（ 3）虹吸进样
t
L
Pd
1 2 8
π4进样体积
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毛细管一端插入样品瓶，加电压；
2,电动进样方式
tL ctrVefeo
2π)
（进样量进样不均,电歧视现象，淌度大的离子比淌度大的进样量大；
离子丢失,淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去；
特别适合黏度大的试样
2009-7-31
一、毛细管区带电泳 (CZE)
Capillary zone electrophoresis
二、毛细管凝胶电泳 (CGE)
Capillary gel electrophoresis
三、胶束电动毛细管色谱
Micelle electrokinetic capillary
electrophoresis
四、毛细管电色谱
Capillary electrochromatography
五,其 他第四节高效毛细管电泳分离模式
Separate types of HPCE
2009-7-31
一、毛细管区带电泳
Capillary zone electrophoresis,CZE
带电粒子的迁移速度 =电泳和电渗流速度的矢量和。
正离子,两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；
中性粒子,无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；
阴离子,两种效应的运动方向相反； ν 电渗流 >ν 电泳 时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于 差速迁移 被相互分离。
最基本、应用广的分离模式；
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二、毛细管凝胶电泳
Capillary gel electrophoresis,CGE
将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。
其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。
蛋白质,DNA等的电荷 /质量比与分子大小无关,CZE模式很难分离，采用 CGE能获得良好分离,DAN排序的重要手段。
特点,抗对流性好，散热性好，分离度极高。
无胶筛分技术,采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。
2009-7-31
1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。
三,胶束电动毛细管色谱 （ MECC,MEKC）
Micellar electrokinetic capillary chromatography,MEKC
在电场力的作用下，胶束在柱中移动。
2009-7-31
2,电泳流和电渗流的方向相反，且 ν 电渗流 > ν 电泳,
负电胶束以较慢的速度向负极移动；
5.色谱与电泳分离模式的结合。
3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；
4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围 ；
2009-7-31
在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定相，或在管内填充固定相，
根据溶质在固定相和流动相中的分配系数的不同和自身的电泳淌度差异得以分离．
四,毛细管电色谱 (CEC )
Capillary electrochromatography
2009-7-31
几种主要类型开管毛细管电色谱柱 OT-CEC
填充毛细管电色谱柱 P-CEC
整体毛细管电色谱柱 ML-CEC
2009-7-31
填充毛细管电色谱柱
P-CEC是最早研究的，其填料巨大的比表面使其对污染不敏感，分析结果的重现性较好，但因其填充及制备柱两端塞子的困难，以及由此带来的气泡效应和塞子效应等阻碍了它的进一步发展。但人们至今仍在努力并取得可喜进展 。
2009-7-31
开管毛细管电色谱柱
OT-CEC柱中无塞子和填料，气泡效应和涡流扩散的影响小，分析中可获得较高柱效，适用于混合物的快速分析，
但其相比小，柱容量低，寿命短，使其应用亦受到一定限制。
2009-7-31
整体毛细管电色谱柱
ML-CEC通过在毛细管内原位聚合或固化的方法制成具有均一多孔结构的整体式柱床，使毛细管柱的制备比较简单，且无塞子效应,
2009-7-31
1,根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；
2,毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（ 6～ 8V）
时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的 pH梯度；
3,氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液 pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；
五、毛细管等电聚焦
Capillary isoelectric focusing,CIEF
2009-7-31
4,聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点 pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；
5,阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀 NaOH溶液；
6,加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；
7,电渗流在 CIEF中不利，应消除或减小。
2009-7-31
1,将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子 (充满毛细管 )和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，
并以同一速度移动。
2,负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。
六、毛细管等速电泳
Capillary isotachophoresis,CITP
2009-7-31
3,不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同
(ν =μ E),淌度大的离子区带电场强度小；
沿出口到进口，将不同区带依次排序 1,2,3,4
电场强度依次增大。假设,2”号中离子扩散到,3”号，
该区电场强度大，离子被加速，返回到,2”区；当,2”号中离子跑到,1”号区，离子被减速使之归队；
4,特点：界面明显，富集、浓缩作用；
capillary isotachophoresis,CITP
2009-7-31
应用
略
