课程编号,教案、讲稿 总学时：30学时
食品卫生检验
第四章 食品中毒性微生物的检验
（8学时）
第一节 食品中毒概述第二节 沙门氏菌及其检验
第三节 致病性大肠杆菌及其检验第四节 变形杆菌及其检测第五节 志贺氏菌及其检测
第六节 葡萄球菌及其检验第七节 链球菌及其检验
适用专业：食品工程与科学
授课班级：食工2003（3）
授课教师,王 长 远
黑龙江八一农垦大学食品学院
2005年2月22日教 学 基 本 信 息教学单位
黑龙江八一农垦大学食品学院
主讲教师
王长远
职 称
助教
说 明
课 程
食品卫生检验
专 业
食品工程与科学
《食品卫生检验学》是食品科学与工程的选修课程。以食品的腐败变质与控制、食品微生物指标、食物中毒微生物的检验、常见病原微生物的检验为主要内容。
年 级
食工2003
班 级
食工2003（3）
学生人数
55
授课时间
2004-2005
第二学期
周 学 时
2
总 学 时
30
理论学时
20
实验学时
10
使用教材
食品微生物检验（刘兴友）
主要参考书
《食品卫生微生物检验标准手册》
《食品安全与卫生学》
第四章 食品中毒性微生物的检验
章节号
名称及内容
重点和难点
第一节 食物中毒概述第二节 沙门氏菌及其检验第三节 致病性大肠埃希氏菌及其检验第四节 变形杆菌类及其检验第五节 志贺氏菌及其检验第六节 葡萄球菌及其检验第七节 链球菌及其检验第八节 肉毒梭菌及其毒素的检验第九节 蜡样芽胞杆菌及其检验第十节 平酸菌及其检验第十一节 黄曲霉菌及其毒素的检验第十二节 赭曲霉菌及其毒素的检验第十三节 镰刀菌及其毒素的检验第十四节 青霉菌及其毒素的检验
常见的细菌性食物中毒的各种有毒细菌的生物学特征及其检测方法
教 学 进 度 计 划周次
学时
教 学 内 容
备 注
1
绪 论
1
微生物检验基本知识、常规鉴定技术
1
食品检验样品的采集与处理
1
食品微生物检验指标
8
食品中毒性微生物的检验
2
常见病原微生物的检验
2
肉与肉制品中的微生物及其检验
2
乳与乳制品中的微生物及其检验
2
罐头食品中的微生物及其检验
2
其它食品中的微生物及其检验
课 堂 教 学 计 划（2学时）
名 称
食物中毒的概述
沙门氏菌及其检验
目 的要 求
食物中毒的概念、分类以及特点，掌握沙门氏菌及其检验方法。
重 点难 点
食物中毒的特点，沙门氏菌的检验。
教 学 内 容 及 教 学 组 织
教学方法、手段及时间安排
第一节 食物中毒概述一、食物中毒的概念和分类
（一）、概念
（二）、食物中毒的分类
（三）、细菌性食物中毒
(四)细菌性食物中毒的临床特征二、微生物性食物中毒的特点
第二节 沙门氏菌及其检验
一、生物学特性二、致病性三、主要症状
四、流行病学特点五、检 验
主要通过讲授和演示等方式进行；采用先提问，引导学生探索，并逐步得出结论，互动式与启发式并用，讲练结合，注重理论与实践的结合。
课 堂 教 学 计 划（2学时）
名 称
致病性大肠埃希氏菌及其检测
变形杆菌及其检测
志贺氏菌及其检测
目 的要 求
掌握致病性大肠埃希氏菌及其检测、变形杆菌及其检测和志贺氏菌及其检测方法。
重 点难 点
致病性大肠埃希氏菌及其检测
教 学 内 容 及 教 学 组 织
教学方法、手段及时间安排
第三节 致病性大肠埃希氏菌及其检验一、生物学特性二、致病性
三、主要症状四、流行病学特点五、检 验第四节 变形杆菌类及其检验
一、生物学特性
二、致病性三、主要症状
四、流行病学特点五、检 验
第五节 志贺氏菌及其检验一、生物学特性
二、致病性
三、主要症状
主要通过讲授和演示等方式进行；采用先提问，引导学生探索，并逐步得出结论，互动式与启发式并用，讲练结合，注重理论与实践的结合。
课 堂 教 学 计 划（2学时）
名 称
葡萄球菌及其检测
链球菌及其检测
肉毒梭菌及其毒素的检验第九节 蜡样芽胞杆菌及其检验
目 的要 求
掌握葡萄球菌及其检测、链球菌、蜡样芽胞杆菌和肉毒梭菌及其毒素的检验。
重 点难 点
葡萄球菌、链球菌和肉毒梭菌的生物学特性及检测方法。
教 学 内 容 及 教 学 组 织
教学方法、手段及时间安排
第六节 葡萄球菌及其检验一、生物学特性二、致病性
三、临床症状：
四、流行病学特点五、检 验
第七节 链球菌及其检验一、生物学特性二、检 验第八节 肉毒梭菌及其毒素的检验一、生物学特性
二、致病性三、临床症状四、流行病学特点五、检 验
第九节 蜡样芽胞杆菌及其检验
主要通过讲授和演示等方式进行，讲练结合，列举事实，注重理论与实践的结合。
充分调动学生的积极性与学习的兴趣。
课 堂 教 学 计 划（2学时）
名 称
第十节 平酸菌及其检验第十一节 黄曲霉菌及其毒素的检验第十二节 赭曲霉菌及其毒素的检验第十三节 镰刀菌及其毒素的检验第十四节 青霉菌及其毒素的检验
目 的要 求
掌握平酸菌、黄曲霉菌及其毒素,赭曲霉菌及其毒素,镰刀菌及其毒素、青霉菌及其毒素的检验
重 点难 点
平酸菌、黄曲霉菌及其毒素、青霉菌及其毒素的检验方法。
教 学 内 容 及 教 学 组 织
教学方法、手段及时间安排
第十节 平酸菌及其检验一、生物学特性
二、检 验
第十一节 黄曲霉菌及其毒素的检验一、黄曲霉菌及其毒素的种类二、黄曲霉毒素的特性
三、黄曲霉毒素在食品中的允许含量标准四、检验第十二节 赭曲霉菌及其毒素的检验一、赭曲霉菌及其毒素的种类二、赭曲霉毒素的特性三、OCT的检验第十三节 镰刀菌及其毒素的检验第十四节 青霉菌及其毒素的检样
根据本节的特点，主要通过讲授等方式进行；采用先回忆提问，互动式与启发式并用。
第四章 食品中毒性微生物的检验第一节 食物中毒概述
一、食物中毒的概念和分类
（一）、概念食源性疾病：指通过摄食进入人体内的各种治病因子引起的、通常具有感染性质或中毒性质的一类疾病。
食物中毒：是指健康人经口摄人正常数量食品后，所引起的以急性病理过程为主的疾病。
微生物性食物中毒：食用被微生物或微生物毒素污染的食品而引起的中毒称为微生物性食物中毒。
发病原因多见于食用了食物中毒性微生物或其毒素，有毒化学物质，有毒生物组织(如甲状腺、脑垂体、肾上腺、毒鱼、有毒食用菌等)以及食品引起的变态反应等。
食物中毒属食源性疾病的范畴，是食源性疾病中最为常见的疾病。食物中毒步不包括因暴饮暴食而引起的急性胃肠炎、食源性肠道传染病(如伤寒)和寄生虫病(如旋毛虫病、囊虫病)，也不包括因一次大量或长期少量多次摄人某些有毒、有害物质而引起的以慢性毒害为主要特征的疾病。
（二）、食物中毒的分类
一般按病原物质，将食物中毒分为五类。
1．细菌性食物中毒 是指摄人含有细菌或细菌毒素的食品而引起的食物中毒。
2．真菌及其毒素食物中毒 是指摄人被真菌及其毒素污染的食物而引起的食物中毒
3．动物性食物中毒 是指摄人动物性中毒食品而引起的食物中毒。
4．有毒植物中毒 是指摄人植物性中毒食品引起的食物中毒。
5．化学性食物中毒 是指摄人化学性中毒食品引起的食物中毒。
（三）、细菌性食物中毒
细菌性食物中毒：
是指人们吃了被大量活的食物c霉些组瀛或绷嘘产生的毒素污染韵食品所引起的中毒现象。
近几年来统计资料表明，我国发生的细菌性食物中毒是食物中毒较为常见，其次为副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌食物中毒。细菌性食物中毒可分为感染型食物中毒、毒素型食物中毒和混合型食物中毒。
1．感染型食物中毒
指食物被污染并繁殖了大量食物中毒性微生物(包括病原菌和条件致病菌)，如沙门氏菌、致病性大肠杆菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、蜡样芽胞杆菌，魏氏梭菌、耶尔森氏菌、嗜盐菌、枯草杆菌及劈球菌等，这种含有大量活菌(一般含菌数在107个／g以上)的食物被摄入机体后，引起一系列消化道症状的现象，称为感染型食物中毒，此类中毒是由细菌本身引起的。
发病机制：病原菌随食物进入肠道，在肠道内继续生长繁殖，靠其侵袭力附于肠黏膜或侵入黏膜及黏膜下层，引起肠黏膜充血、白细胞浸润、水肿、渗出等炎性病理变化。某些病原菌如沙门氏菌进入黏膜固有层后可被吞噬细胞吞噬或杀灭，病原菌菌体裂解后释放出电壹塞，内毒素可作为致热源刺激体温调节中枢引起体温升高，亦可协同致病菌作用于肠黏膜，引起腹泻等胃肠道症状。
2．毒素型食物中毒
食物被能产生毒素的微生物如葡萄球菌、肉毒梭菌、魏氏梭菌等污染，并在适宜的条件下生长繁殖，产生了某种毒素，这种毒素同污染的微生物一起或单独随食物被摄人人体后，所引起的一系列中毒现象，称为毒素型食物中毒。
此种中毒主要是细菌产生的大量毒素所引起的，如葡萄球菌肠毒素，魏氏梭菌毒素引起的食物中毒及肉毒毒素引起的食物中毒等，均属于毒素型食物中毒。
3．混合型食物中毒
有的细菌性食物中毒。聂具有甚染型食物中毒的特征，又具有毒素型食物中毒的特征，称为混合型食物中毒。如魏氏梭菌,蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒。这种中毒在检验时，应特别重视对其毒素的测定。
副溶血性弧菌等病原菌，进入肠道除侵入黏膜引起肠黏膜的炎性反应外，还可以产生肠毒素引起急性胃肠道症状。这类病原菌引起的食物中毒是致病菌对肠道的侵入及其产生的肠毒素的协同作用，因此，其发病机制为混合型。
(四)细菌性食物中毒的临床特征
1．感染型食物中毒的临床特征
1）潜伏期短，一般几小时到24小时，平均为12小时左右，潜伏期长短主要与进入机体的细菌量及个体体质状况有关。
2）病程短，通常为1—3天，个别细菌可长达7～14天，如沙门氏菌3－7天、小肠结肠炎耶尔森氏菌为3—14天，溶血性链球菌为2—7天等。
3）发病症状以急性胃肠炎为主。
表现为恶心、呕吐、腹泻，体温升高、头痛等。从病人和原因食品中均可分离出相同的病原微生物。
2．毒素型食物中毒的临床特征
1）潜伏期长短不一，如金黄色葡萄球菌肠毒素所引起的中毒潜伏期为2—5小时； 肉毒素中毒潜伏期2小时到10天，甚至10天以上。
2）病程长短不一，如金黄色葡萄球菌毒素中毒能够迅速痊愈，而肉毒毒素中毒则恢复很慢，一般为2—3天，长的达2—3周。
3）胃肠型症状不明显．如葡萄球菌肠毒素所引起的中毒虽有频繁的呕吐、腹痛，但腹泻很少见，体温正常或微升高。 肉霉毒素所引起的中毒，虽然初期表现为恶心、呕吐，有时有腹泻，但其主要症状为痉挛 乏却坤经失调、分泌机能失调等神经症状和虚脱，出现不能抬头、瞳孔放大、光反应迟钝，言语困难、吞咽不易、呼吸不畅等。
(三)霉菌毒素性食物中毒
1、是指某些霉菌如黄曲霉菌、赭曲霉菌污染了食品，并在适宜条件下繁殖，同时产生了毒素，这些毒素达到一定量后，随被污染的食品一同摄人人体内而引起的食物中毒。
2、当霉菌毒素的量很小时，则不能引起食物中毒．但长期少量摄入某种霉菌毒素，则可导致癌症或发生“三致”（致癌、致畸、致突变）作用。
要禁止使用发霉的原料生产食品和使用发霉的饲料饲养动物。
二、微生物性食物中毒的特点
1．与饮食有关，不吃者不发病
2．引起中毒的原因食品除掉后，不再有新的患者发生
3．发病呈暴发性：
微生物性食物中毒和其他食物中毒一样，突然发生，根据食用原因食品的人数不同，可有数百人致数千人同时发病，而且表现的临床症状一致。
4．发病季节性强
一般多发生在4—10月份，6～9月进入高峰期，这主要与这段时间气温高、微生物易于生长繁殖和人们的饮食习惯(吃凉食，冷饮较多)有关。
5．中毒症状以急性胃肠炎为主，不具有传染性
微生物性食物中毒中经常发生的是细 菌性食物中毒，因此在症状上多数都具有恶心、呕吐、腹痛、腹泻等急性胃肠炎症状，而且不相互传染。
6．从病人和原因食品中均可检测到同样的病原微生物或微生物毒素
发生微生物性食物中毒时，都能从病人急性发病期的呕吐物、血液及后期的粪便中和引起中毒的食品中分离到同一血清型的微生物或微生物毒素。
三、引起微生物性食物中毒的原因
发生微生物性食物中毒的根本原因是食品受到了某些微生物或微生物毒素的污染，微生物污染的原因有内源性污染和有外源性污染，其中外源性污染是经常性的和主要的，概括起来主要有以下几个方面：
1．食品原料受到了污染
2．生产、加工、运输、销售及食用过程中的污染
3．加工方法不当
主要是某些大块食品在烧煮时时间太短或温度太低，不能足以杀死微生物，或油炸食品时中心未熟透等。
4．交叉污染
在食品制作时，发生了生熟食品交叉污染，如用盛放过生食品的容器、用具、刀板等与熟食品发生接触，而导致生食品中的某些微生物污染到熟食品上，这种熟品在食用前没有经过再加热或加热温度不足以杀灭污染的微生物。
5．工作人员的污染
接触食品的工作人员的个人卫生状况不良，如患有某种肠道传染病或带菌，则可以将这种病原微生物污染到食品上而导致食物中毒或食物感染。
四、微生物性食物中毒的预防
微生物性食物中毒常常给人类带来严重的危害。是食品卫生检验的重要内容之一。
1．严格执行有关法规
严格遵守国家颁布《中华人民共和国食品卫生法》和其他有关的条例、规定，以及各地区制定的各种规定与卫生要求．加强食品卫生的检验与监督工左。
2．严格防止食品污染
3．控制微生物在食品上的繁殖
一般食物中毒性细菌的最适生长温度在35+37℃；绝大部分在低温下即停止繁殖或缓慢繁殖，因此，低温贮存食品是控制污染微生物在食品上繁殖的重要措施。
4．杀灭污染食品中的微生物
杀灭食品中微生物的方法很多，如降低食品pH值、提高食品的渗透压(盐腌、糖溃)、采用紫外线照射或其它辐射线照射和加热灭菌等；其中加热灭菌法对微生物的杀灭最为彻底，这在食品罐头生产中已广泛应用。
5．加强食品卫生检验和宣传工作
第二节 沙门氏菌及其检验
沙门氏菌(Salmonella)可引起混合型的食物中毒。
一是内源性污染；
二是外源性污染。由于沙门氏菌的分布广，如果畜禽粪便污染了食品加工场所的环境或用具，就会造成食品在加工、运输、贮存、销售及动物屠宰等环节受到沙门氏菌的污染。一旦条件适宜，沙门氏菌就会迅速的生长繁殖，当菌数在食品中达到一定数量，被消费者食用后就会造成食物中毒，危害人的身体健康，甚至危及生命。
在微生物分类学中，沙门氏菌属是肠杆菌科的一个大属，包括2000多个血清型，它们在形态结构、培养特性、生化特性和抗原构造方面都非常相似，是一类形态短小的革兰氏阴性杆菌，主要寄居于人和其它温血动物的肠道中，可引起多种性质的疾病，根据沙门氏菌的致病范围，可将其分为三大类群。
第一类群：专门对人致病。如伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌,乙型副伤寒伤门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌。
第二类群：能引起人类食物中毒，称之为食物中毒沙门氏菌群，如鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、纽波特沙门氏菌等。
第三类群：专门对动物致病，很少感染人，如马流产沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌，此类群中尽管很少感染人，但近年也有感染人的报道。
沙门氏菌属（Salmonella）是一大群寄生于人类和动物肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌统称为沙门氏杆菌。1880年Eberth首先发现伤寒杆菌，1885年Salmon分离到猪霍乱杆菌，由于Salmon发现本属细菌的时间较早，在研究中的贡献较大，遂定名为沙门氏菌属。此菌可引起禽伤寒、鸡白痢、猪霍乱、鼠伤寒沙门氏菌、猪副伤寒、马流产沙门氏菌等疾病。致病性最强的是猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholerae)，其次是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)。
一、生物学特性
1、形态染色特性
革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌（比大肠杆菌细），（0.7～1.5um）×（2～5um）散在，无荚膜和芽胞，（除鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌外）都具有周身鞭毛，能运动，大多数具有菌毛，能吸附于宿主细胞表面或凝集豚鼠红细胞。
2．培养特性
1）需氧及兼性厌氧菌
2）在普通琼脂培养基上生长良好，培养24小时后，形成中等大小、圆形、表面光滑、无色半透明、边缘整齐的菌落，其菌落特征亦与大肠杆菌相似（无粪臭味）。
3）鉴别培养基（麦康凯、SS、伊红美兰）：一般无色菌落
4）三糖铁琼脂斜面：斜面为红色，底部变黑并产气。
3．生化特性
1）发酵葡萄糖，麦芽糖，甘露醇和山梨醇产气；
2）不发酵乳糖、蔗糖和侧金盏花醇；
3）不产吲哚、V-P反应阴性；
4）不水解尿素和对苯丙氨酸不脱氨。
伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌及一部分鸡白痢沙门氏菌发酵糖不产气，大多数鸡白痢沙门氏菌不发酵麦芽糖；除鸡白痢沙门氏菌、猪伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和仙台沙门氏菌等外，均能利用枸橼酸盐。
4．血清学特性
沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般沙门氏菌具有菌体(O)抗原、鞭毛(H)抗原和表面抗原(荚膜或包膜抗原)三种抗原，见表5-3。
1）O抗原（菌体抗原）
a存在于菌体表面，为脂多糖，多糖部分决定其特异性，
b性质稳定，耐热性强，100℃ 2h不破坏。
c一个菌体具有一种或多种不同的O抗原。
d沙门氏菌的O抗原共有65种，以阿拉伯数字1、2、3、4……代表,
2）、H抗原
a、H抗原存在于鞭毛中,不耐热，化学成分蛋白质，其抗原性可以被酒精所破坏。
b、H抗原可分为两相第1相：为特异相，用小写英文字母表示，a～z，Z以后则从z1、z2……，已编到z83。
第2相：为非特异相以阿拉伯数字表示，共7种。
具有第1相和第2相H抗原的细菌称为双相菌，大多数沙门氏菌属于此；仅有一相者称单相菌，如肠炎沙门氏菌。每一组沙门氏杆菌根据H抗原不同，可进一步分种或型。极少数无鞭毛菌两相抗原都不具有，称为无相菌，如鸡白痢沙门氏菌。H抗原刺激机体主要产生lgG抗体。
3） Vi抗原为包膜抗原少数沙门氏菌，如伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌的新分离菌株，常具有这种包膜抗原，经过几次传代、60C热处理或石炭酸处理后容易消失。
5、抵抗力
沙门氏菌属不耐热，55C 1h、60 C 15—30min即被杀死。
沙门氏菌属在外界的生活力较强，在10C～42C的范围内均能生长，最适生长温度为37C。最适生长的pH值为6.8—7.8。
在普通水中虽不易繁殖，但可生存2—3周。在粪便中可存活1—2个月。
在牛乳和肉类食品中，存活数月，在食盐含量为10％－15％的腌肉中亦可存活2—3个月。
烹调大块鱼、肉类食品时，如果食品内部达不到沙门氏菌的致死温度，其中的沙门氏菌仍能存活，食用后可导致食物中毒。冷冻对于沙门氏菌无杀灭作用，即使在-25℃低温环境中仍可存乏10个月左右。
由于沙门氏菌属不分解蛋白质，不产生靛基质，污染食物后无感官性状的变化，易被忽视而引起食物中毒。
6．毒素特性
沙门氏菌不产生外毒素，但菌体裂解时．可产生毒性很强的内毒素，此种毒素为致病的主要因素，可引起人体发冷、发热及白细胞减少等病症。
二、致病性
1、沙门氏菌经口进入人体以后，在肠道内大量繁殖，经淋巴系统进入血液，造成一过性菌血症，即感染过程。
2、随后，沙门氏菌在肠道和血液中受到机体的抵抗而被裂解、破坏，释放大量内毒素，使人体中毒，出现中毒症状。
三、主要症状急性胃肠炎。
潜伏期为6—12小时，最长可达24小时，病人临床表现为恶心、头痛、出冷汗、面色苍白，继而出现呕吐、腹泻、发热，体温高达38~C一40C，大便水样或带有脓血、粘液，中毒严重者出现寒战、惊厥、抽搐和昏迷等，此菌中毒死亡率较低。
四、流行病学特点
1．季节性特点 全年皆可发生，多见于夏、秋两季。5—10月发病起数和发病人数可达全年发病总起数和总人数的80％。
2．食品种类 沙门氏菌食物中毒的食品主要为动物性食品，特别是畜肉类及其制品，其次为禽肉、蛋类、乳类及其制品，由植物性食品引起者很少。
3．食品中沙门氏菌的来源 由于沙门氏菌属广泛分布于自然界，在人及动物，如家畜中猪、牛、马、羊、猫、犬，家禽中鸡、鸭、鹅等均有广泛的宿主，因此，沙门氏菌污染肉类食物的几率很高。
（1）家畜、家禽的生前感染和宰后污染。
(2)乳中沙门氏菌的来源。患沙门氏菌病的奶牛其乳中可能带菌，即使是健康奶牛的乳在挤出后亦容易受到污染。亦容易受到污染。
(3)蛋类沙门氏菌的来源。
蛋类及其制品感染或污染沙门氏菌的机会较多，尤其是鸭、鹅等水禽及其蛋类，其带菌率一般在30％一40％之间。家禽及蛋类沙门氏菌除原发和继发感染使卵巢、卵黄、全身带菌外，禽蛋在经泄殖腔排出时，粪便中的沙门氏菌污染肛门腔内的禽蛋蛋壳，并可通过蛋亮气孔侵入蛋内。
(4)熟制品中沙门氏菌的米源。
烹调后的熟制晶可再次受到带菌容器、烹调工具等污染或食品从业人员带菌者的污染。
(5)发病率及影响因素。
沙门氏菌食物中毒发病率较高，占总食物中毒的40％一60％，最高可达90％。沙门氏菌致病力强弱与菌型有关，致病力越强的菌型越易致病，猪霍乱沙门氏苗致病力最强，其次为鼠伤寒沙门氏菌，鸭沙门氏菌致病力较弱；对于幼儿、停弱老人及其他疾病患者等易感性较商的人群，即便是较少菌量或较弱致病力的菌型仍可引起食物中毒，甚至出现较重的临床症状。
五、检 验
食品中沙门氏菌的检验方法，应按《中华人民共和国国家标准——食品卫生检验方法(微生物学部分)》的沙门氏菌检验方法(GB4789．4-84)进行，其检验程序如图5-1。
（一）、增菌培养
冻肉、蛋品，乳品及其它加工食品首先需要进行前增菌。
1、取样25g (m1)，加入225ml缓冲蛋白胨水中。固体食品可先用均质器以8000～10000转／分打碎1分钟，或用乳钵加灭菌砂磨碎；粉状食品用灭菌匙或玻璃棒研磨使其乳化。
2、36+1℃培养4小时，移取10ml接种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42C培养18～24小时。同时，另取10ml，加入于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36+1℃培养18～24小时。
鲜肉，鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌，各取25g(m1)加入灭菌生理盐水25ml按上述方法做成匀浆，取其半量接种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42C培养18～24小时；另一半量接种于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36+1℃培养18—24小时。
（二）、分离培养
用铂金耳取一环增菌液分别划线接种于：
亚硫酸铋琼脂平板(BS)和DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、SS琼脂平板)各一个，于36+1℃分别培养18—24小时(DHL、HE、SS)或40—48小时(BS)。观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌属亚属工、Ⅱ、Ⅳ、V和Ⅲ型在各个平板上的菌落特征见表5-4。
（三）、生化试验
挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落，接种于三糖铁琼脂培养基中。在三糖铁琼脂内，各菌属的主要反应结果如表5—5。
表5—5说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸同时H2S阴性的菌株可排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时均有不是沙门氏菌的可能，都需要作进一步的生化试验，必要时作涂片染色镜检(沙门氏菌为革兰氏阴性短杆菌)。
接种三糖铁琼脂的同时，还要接种蛋白胨水，pH7.2尿素琼脂、KCN培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管，于36+1℃培养18～24小时，必要时可延长至48小时，按表5-6判定结果。沙门氏菌的结果应属于Al、A2和Bl，其他五种反应结果均可以排除。
反应序号Al，典型反应判定为沙门氏菌属。如果尿素、KCN和赖氨酸三项中有一项异常，按表5-7仍可判定为沙门氏菌，如有两项异常，则按A3判定为枸橼酸杆菌。
（四）、血清学分型鉴定用分离出的沙门氏菌与已知A-F多价O血清及H因子进行玻片凝集试验。
1、抗原的准备
2、O抗原的鉴定
用A—F多价O血清做玻片凝集试验，以生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株；不能分型。
3、H抗原的鉴定
4、Vi抗原的鉴定
（五）、菌型的判定和结果报告
综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照常见沙门氏菌抗原表及其补充表判定菌型。并报告结果。
目前，对于沙门氏菌的检验技术已有很大进展．一些快速检验方法已有应用。如荧光抗体技术检验食品中沙门氏菌已在国际二得到公认，其些国家作为商品生产的荧光抗体试剂箱．即可应用于沙门氏菌的快速检验。我匡在这方面也取得一定的进展，如固相载体吸附免疫技术、免疫染色法，酶联A蛋白染色等快速检验方法均具有快速、方便、经济和准确等特点，还有许多新方法、新技术仍处在实验和研究阶段，有待于我们去研究探讨，以便更好服务于实践。
第三节 致病性大肠埃希氏菌及其检验
致病性大肠埃希氏菌是指能使人、动物(尤其是婴儿和幼龄动物)感染及人食物中毒的一群大肠杆菌。
在自然界中本菌分布广泛，主要寄居场所是人和其它温血动物的肠道中，是一类条件性致病菌。致病性大肠埃希氏菌的形态特点、培养特性和生化特性均与非致病性大肠埃希氏菌非常相似，以至难以区分，只能通过血清学的方法，从抗原结构的差异来区别。在致病性大肠埃希氏菌中，有些血清型能够引起人的食物中毒，有些血清型能够引起人的肠道内外感染。还有一些血清型的菌株能够使畜禽发病，危害畜牧业，降低畜产食品的质量。致病性大肠埃希氏菌可从饮用水，未消毒牛乳，病畜脏器、禽类及其人畜粪便污染的各种食品中分离出来。
致病性大肠埃希氏菌属主要分为五大类，首先根据发病机理分为三大类，
1、产毒素型大肠埃希氏菌(ETEC)，
2、侵袭型大肠埃希氏菌(EIEC)
3、肠道致病性大肠埃希氏菌(EPEC)
近来又提出另外两类
4、即出血性大肠埃希氏菌(EHEC)
5、肠粘附性大肠埃希氏菌(EAEC)
但是，致病性大肠埃希氏菌的致病性是一个很复杂的问题，也并非由某一方面的因素所决定。
致病性大肠埃希氏菌中，一般认为能产生耐热{ST)和不耐热(LT)肠毒素的两种菌株均可引起人的食物中毒。引起大肠埃希氏菌币毒的主要是一些动物性食品，如乳与乳制品、肉类、水产品等，牛和猪是传播这种病菌、引起中毒的主要原因。
1996年7月在日本就发生了大肠杆菌0157型引起的食物中毒，造成9017多人中毒，10人死亡，其原因与生食萝卜苗有关，其中92例并发出血性肠炎及出血性尿毒症。2001年，再江苏、安徽等地爆发的肠出血性大肠杆菌0157:H7食物中毒，造成177人死亡，中毒人数超过2万人。
如仔猪黄、白痢、猪水肿病、牛腹泻和败血症等均可由大肠杆菌引起。
一、生物学特性
1．形态与染色特性
菌体两端钝圆、中等大小，杆状(有时呈卵圆形)、1—3um X 0.6um、周生鞭毛，能运动，不产生荚膜，革兰氏阴性，而且一般是对碱性染料着色较好，但有时两端着色较浓，要与巴氏杆菌区分开来。
2．培养特性
1)需氧及兼性厌氧菌
2)对营养的要求不高，在普通琼脂上就生长良好，在15C-45℃范围内均可生长，但最适生长温度为37℃，最适pH为7.2—7.4。
3)在普通琼脂平板上培养24小时，可形成圆形、凸起、光滑、湿润、半透明、边缘整齐、中等大小的菌落．其菌落与沙门氏菌比较相似，但是，大肠杆菌菌落对光(45角折射)观察可见荧光。
4)在肉汤培养基中生长18～24小时变为均匀浑，而后底部出现粘性沉淀物，并伴有 臭味。
5）部分菌落可出现β溶血。
6）在远藤琼脂上长成带金属光泽的红色菌落
7）在S．S琼脂平板上多不生长，少数生长的细菌，也因发酵乳糖产酸而形成红色菌落；
8）在伊红美兰琼脂上形成具有金属光泽的黑色菌落
9）在麦康凯琼脂上培养24小时后孤立菌落呈红色
3．生化特性
1）可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，有些不典型的菌株不发酵或迟缓发酵乳糖；
2）不同菌株对蔗糖，卫矛醇、水杨苷发酵结果不一致。
3）本菌可使赖氨酸脱鞍、不能使苯丙氨酸脱羧。
4）不产生H2S，不液化明胶，不分解尿素，
5）、不能在氰化钾培养基上生长，靛基质试验阳性，V-P试验阴性，不利用枸橼酸盐。后四项生化特性是典型的大肠埃希氏菌，与此不一致的即为非典型大肠埃希氏菌菌。
IMViC试验：如IMViC试验为+、+、-、-，且乳糖发酵，表明被检物已有粪便污染，有发生肠道传染病的危险，这是卫生细菌中常用的检测指标。（I：吲哚形成试验，M：甲基红试验，Vi：V-P试验，C：枸橼酸盐利用试验）
4.血清学特性
大肠埃希氏菌的抗原构造主要由菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)和荚膜抗原(K)三部分组成。
1）O抗原
成分为细胞壁上的糖、类脂和蛋白质复合物，也是细菌的内毒素，热稳定性较强，高压蒸汽处理2小时不被破坏。每一血清型只含有一种O抗原，本菌已发现有167种O抗原，分别以阿拉伯数字表示。
2）H抗原
为蛋白质；一种大肠埃希氏菌只有一种H抗原，无鞭毛则无H抗原，H抗原能在80度被破坏，也能被酒精破坏。H抗原共有64种。
3）K抗原
是细胞外部的荚膜或的表面物质，又称包膜抗原。新分离的大肠埃希氏菌70％具有K抗原。根据K抗原耐热的敏感性．可把K抗原分为A、B、L三类，共有103种，致病性大肠埃希氏菌的抗原主要为B抗原，少数为L抗原，B抗原与L抗原均可在煮沸后被破坏，A抗原耐热性强，可耐受煮沸1小时而不被破坏。,
O抗原可将大肠埃希氏菌分成若干血清群，再根据K抗原和H抗原进一步分为若干个血清型或亚型，根据大肠埃希氏菌抗原的鉴定结果，写出其抗原式如O111：K58(B)H12，一般认为H抗原与致病性无关，因此，一般不需要进行H抗原的鉴定。
5．抵抗力
抵抗力中等，各菌型之间存在差异。此菌对青霉素有中等抵抗力，对一般消毒剂都比较敏感。对氯尤为敏感，水中游离氯达到0．2mg／L时，即可杀死此菌。此菌在土壤中、水中及粪便中可存活数月以上。
6．毒素特性
有些大肠埃希氏菌产生肠毒素，
1）不耐热(LT)肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT）：化学成分为蛋白质，分子量较大，60℃ 30分破坏，具有免疫原性，可引起肠道分泌增加，出现腹泻。
（2）、耐热肠毒素（heat-stable enterotoxin，ST）：分子量较小，无抗原性，100℃ 30分钟，仍有活性，可引起肠分泌增加。
二、致病性
致病性大肠埃希氏菌属引起酌食物中毒主要有两种类型，一种是肠道内感染，另一种是肠道外感染，两者具有不同的机理和症状,
1．肠道内感染
1）、肠毒素型大肠杆菌（ETEC）：主要引起腹泻（幼畜或雏鸡），约有40个血清型。肠毒素型菌株进入肠道后主要在小肠内繁殖，不损害肠上皮细胞。繁殖过程中产生肠毒素。
2）、肠致病型大肠杆菌（EPEC）：是引起婴儿腹泻的主要病原菌，该菌不产肠毒素，也无侵袭力，致病机理不清，约有18个血清型。
3）、肠侵袭型大肠杆菌（EIEC）：较少见，该菌不产肠毒素，但侵袭大肠肠壁上皮细胞，引起炎症反应，形成溃疡，约有8个血清型。引起类似痢疾的症状。
2．肠道外感染
三、主要症状肠道内感染主要造成腹泻与痢疾样疾病；肠道外感染主要引起尿路感染，新生儿脑膜炎、败血症及其他部位的感染。
致病菌引起的食物中毒是感染型和毒素型的综合作用，致病性大肠杆菌引起的食物中毒主要症状为急性肠胃炎，潜伏期为12～24小时，临床出现呕吐、腹泻、发热(体温一般不超过39℃)、头痛、腹痛等，病程一般为1—3天。
四、流行病学特点
1、发病季节 多发生在夏秋季
2、引起中毒的食品种类
与沙门氏菌相同。
3、食品种大肠埃希氏菌的来源
由于大肠杆菌存在于人和动物的肠道中，健康人肠道致病性大肠埃希氏菌率为2—8％，高者达44％，而成人患肠炎、婴儿患腹泻时，致病性大肠埃希氏菌率较健康人高，达29—52％。大肠杆菌随粪便排出而污染水源和土壤，进而直接或间接污染食物。
五、检 验
致病性大肠埃希氏菌的检验应按《中华人民共和国国家标准——食品卫生检验方法(微生物学部分)》(GB489．6-84)的有关内容进行检验。其检验程序如图5－2。 ·
（一）、增菌培养
1、以无菌操作的方法称取样品25g，加入225ml营养肉汤培养基中，可用灭菌砂在研钵中磨碎或以均质器打碎样品。
2、取适量接种于乳糖胆盐培养基中，测定大肠菌群MPN，其余移入500ml三角瓶中于36±1℃培养6小时。挑取一环，接种于一管30ml肠道菌增菌汤中，42℃增菌培养18小时。
（二）、分离培养
1、将乳糖胆盐发酵阳性管液与增菌液分别划线接种于麦康凯或伊红美兰琼脂平板上。
2、于36±1℃培养18—24小时观察菌落对于污染严重的食品可直接按划线法接种，不经过增菌过程。
（三）、生化试验
1、初筛试验
选取在麦康凯或伊红美兰平板上发酵乳糖或不发酵乳糖的菌落5个以上，分别接种于克氏双糖铁、pH7.2尿素和阿拉伯糖中．经36C培养18～24小时，弃去H2S阳性或尿素酶阳性或阿拉伯糖阴性的培养物。
2、复筛试验
把筛留下的培养物分别接种于缓冲葡萄糖蛋白胨和KCN培养基中，经36+1℃培养48小时，观察生长结果并做V-P试验，弃去V-P阳性及KCN阳性的培养物。
3、证实试验
致病性大肠埃希氏菌属除氧化酶阴性，革兰氏阴性的特征以外，还有以下特性：葡萄糖产酸+，葡萄糖产气+／一，乳糖产酸+90％，柠檬酸盐—，尿素酶一，KCN-，V-P-，动力+或—，阿拉伯糖十，靛基质十95％：可按这些主化特性进一步证实其是否为致病性大肠埃希氏菌属。
（四）血清学试验
1、致病性大肠埃希氏菌血清学试验
假定试验：
从平板上选菌落生长稠密处挑取培养物，用致病性大肠埃希氏菌三种OK多价血清做玻片凝集试验。不凝集的培养物可做阴性报告。
证实试验,
2、侵袭性大肠埃希氏菌血清学试验
在平板上菌落生长稠密处挑取培养物，用侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清做玻片凝集试验，侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清包括两种：OK多价血清和9种OK单价血清：
（五）、产肠毒素大肠埃希氏菌毒素试验
1、动物试验
将经过生化证实试验的大肠埃希氏菌培养物接种肉汤管，于36+1℃培养24小时，3000转／分离心30分钟。取上清液用G6滤器过滤后分作两份，一份加热60℃30分钟，供ST测定用，另一份不加热，供LT测定用。
1）家免结轧回肠段试验：
取体重为2kg的家兔，禁食使肠内容物排空。麻醉后剖腹，取出回肠段，按10～15cm为一段，分段结扎，取一段注射肉汤2mL作为阴性对照，另一段注射已知产毒菌肉汤培养物的上清液2ml作为阳性对照。其他各段分别注射待试菌株肉汤培养物的滤液2mL。将腹壁缝合。
测定LT时，于注射后18小时剖腹检查测定ST时，于注射后6—8小时剖腹检查取出肠管分别抽取肠段的积液，测定其容量，并测定肠段的长度。积液量(mL)与肠段长度(cm)之比大于l者为阳性。
2）乳鼠灌胃试验：
2、双向琼脂扩散试验
将被检菌按5点环形接种于Elek氏培养基上，以同样操作共做两份，36±1℃培养48小时，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素纸片，36+1℃经5—6时，使抗生素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的园并用一滴琼脂垫底。在一份平板的孔内滴加LT抗毒素30ul，另一份平板的孔内滴加ST毒素30ul。放于36+1℃经15～20小时观察结果，在菌斑和抗毒素之间出现白色沉淀带为阳性，无沉淀带者为阴性。
（六）豚鼠角膜试验
供测定侵袭性大肠埃希氏菌用，将经过生化证实试验的待试菌株18—20小时琼脂培养物，用肉汤洗下，使成每lml含菌9亿个菌悬液，作为接种材料。
体重400--500g的健康豚鼠(角膜与结膜外观正常，并经细菌培养检查)的角膜上接种待试菌悬液1滴。
48小时后观察结果，结膜充血浮肿、角膜混浊、眼内充盈泪液或浆液性分物者为阳性，自结膜囊取样分离细菌，鉴定应与原接种菌一致。
（七）、结果报告
根据以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验和豚鼠角膜试验的结果出报告，如果是产毒大肠埃希氏菌时应有肠毒素试验的结果；如果是侵袭性大肠埃希氏荫应有豚鼠角膜试验和血清学试验的结果；如果是肠致病性大肠埃希氏菌时应有血清学试验结果。
第四节 变形杆菌类及其检验
变形杆菌类为有动力的革兰氏阴性杆菌，包括变形杆菌属、普罗菲登属和摩根氏菌属。变形杆菌属分为普通变形杆菌(P．vulgaris)、奇异变形菌(P．mirabilis)、产粘液变形杆菌(P．myxofaciens．)和潘氏变形杆菌(P．pennea)。普罗菲登斯菌属共有5个种。摩根氏菌属只有一个种，即摩根氏菌(Morganella morganii)。
变形杆菌类是腐物寄生菌，自然界中广泛分布，水、土壤、腐败有机物中以及动物肠中都有存在，是一种条件致病菌，这种活菌在肉品上大量繁殖，被人摄食后进人人体，在条件适合时，就有可能引起食物中毒。所以只从样品中检出变形杆菌并无实际意义，只有变形杆菌类严重污染的食品被人摄食后，才能引起食物中毒。
检验变形杆菌引起的食物中毒时，不仅要分离鉴定变形杆菌而且还要检验变形杆菌在每克食品中的最近似数。
4起中毒事件概况
1.1 2003年4月18日，康乐县苏集乡古洞沟村一村民在家举行宗教活动，参加活动的66人就餐后发生食物中毒。经及时救治，未发生死亡。对所食鸡肉和烩菜进行检验,检出变形杆菌；
1.2 2003年4月18日，广河县阿里麻土乡古城村一村民在家举行宗教活动，参加活动的90人就餐后有62人发生食物中毒。经及时救治，未发生死亡。对所食羊肉进行检验，检出变形杆菌；
1.3 2003年5月16日，康乐县白王乡老树村一村民宰杀病畜分食，30人发生食物中毒，未发生死亡。经采样检验，检出变形杆菌；
1.4 2003年5月26日，和政县梁家寺乡宋家沟村一清真寺举行宗教活动，参加活动者集体就餐，115人发生食物中毒，无死亡。经采样检验，检出变形杆菌。
一、生物学特性
1．形态与染色特性
变形杆菌是一类大小、形态不一的细菌，有时球形，有时丝状，呈明显的多形性，周身鞭毛，能运动，无芽孢荚膜，革兰氏阴性。
2．培养特性
1）需氧及兼性厌氧
2）对营养要求不高，在普通琼脂上生长良好，
3）在固体培养基上普通和奇异变形杆菌常扩散生长，形成一层波纹薄膜，叫做迁徙生长现象。
4）变形杆菌最适生长温度为20~C，在10C――43~C均可生长
5)在琼脂上形成圆形、扁平，半透明的无色菌落，易与沙氏门菌菌落混淆，本菌有溶血现象，在肉汤中成均匀混浊生长，表面可形成菌膜。
6) 在SS平板上可以形成圆形、扁薄、半透明的菌落，易与其它肠道致病菌混淆。
3．生化特性
本族细菌苯丙氨酸脱羧酶为阳性，它们发酵葡萄糖产酸及少量气体，对果糖、半乳糖与甘油的发酵能力不一致，甲基红试验(MR)阳性。对左旋伯胶糖、糊精、卫矛醇、肝糖，菊糖、乳糖、山梨醇和淀粉无作用。除奇异变形杆菌外，都产生靛基质(引哚)，能在KCN培养基上生长。各种变形杆菌和普罗菲登斯菌的生化特性如表5-12所示。
4．血清学特性
变形杆菌的抗原结构较复杂，均含O抗原和H抗原，所以可根据所含O抗原和H抗原来确定它的菌型。普通变形杆菌和奇变形杆菌分为49个O抗原，19个H抗原；摩根氏变形杆菌分为34个O抗原和25个H抗原；雷极氏变形杆菌分为34个O抗原和26个H抗原。普通变形杆菌和奇异变形杆菌O抗原和H抗原如表5—13。
5．抵抗力
本菌的抵抗力中等，对巴氏灭菌及常用消毒剂敏感。
6．毒素特性
变形杆菌能产生肠毒素，化学成分为蛋白质和碳水化合物的复合物，具有抗原性．引起中毒性胃肠炎。
二、致病性
1、一种是摄入含有大量变形杆菌的食物后，变形杆菌进入人体胃肠道中，先在小肠内生长繁殖，从而引起感染。同时，变形杆菌还能够产生肠毒素，这种肠毒素就会引起人的中毒性胃肠炎；
2、另一种是由于摩根变形杆菌产生很强的脱羧酶，在这种脱羧酶的强力催化下，食品中的组氨酸脱羧生成组胺，从而使人体产生过敏型中毒。
三、主要症状变形杆菌类食物中毒是最常见的一种食物中毒，尤其是熟肉类和凉拌菜，以及因吃病死畜肉而引起的食物中毒的事例更是常有发生。这种食物中毒潜伏期短，一般为3－4小时，主要症状为恶心、呕吐、腹痛剧烈如刀割、腹泻、头疼、发热、全身无力等，腹泻一日数次，多为水样便、有恶臭、少数带粘液。病程较短．一般为1－3天。
摩根氏菌往往能引起过敏反应，潜伏期一般为30—40分钟，也可短至5分钟或长达数小时，主要表现为颜面潮红、酒醉状、头疼、荨麻疹、血压下降、心博过速等，有时也伴有发热、呕吐、腹泻等症状，多在12小时内恢复。水产品引起的中毒多为此类。
四、流行病学特点
1、季节性特点
全年均可发生，大多数发生在5－10月，以7－9月常见。
2、食品的种类
主要是动物性食品，特别是熟肉以及内脏的熟制品。熟制品被变形杆菌污染通常无感观形状的变化，极易引起食物中毒。
3、食物中变形杆菌的来源
广泛存在自然界。生的肉类食品，尤其动物内脏变形杆菌带菌率较高，在食品烹调加工是，处理生、熟食品的工具、容器未严格分开，可污染熟制品。或食用前未加热或加热不彻底，食后即引起食物中毒。
五、检 验
食品中变形杆菌的检验主要分五个步骤即：分离培养、生化鉴定、血清学检查、变形杆菌菌数的测定、动物试验。
1．分离培养
将所取样品分别划线接种于肠道菌选择培养基(S，S琼脂或D·C琼脂)及鉴别培养基(伊红美兰琼脂或麦康凯琼脂)平板各一个，在37~C的条件下培养18—24小时后，观察菌落特征，变形杆菌的菌落特征是：在鉴别培养基上为无色透明，有的蔓延生长，有的不蔓延生长，在选择培养平板上形成单个菌落，有的菌落边缘呈扩散状，对光观察，菌落周围淡蓝色中心稍厚，打开平皿时有臭味，有粘性，选出可疑菌落，在平皿底部做好标记。
2．生化试验
选择可疑菌落接种于苯丙氨酸琼堕斜面(爱德华氏改良培养基)，37~C培养6—8小时后观察结果，如果苯丙氨酸琼脂斜面变为棕黑色，则为苯丙氨酸脱羧酶阳性，经革兰氏染色镜检，如为革兰氏阴性杆菌，可初步判定为变形杆菌。
3．血清学检查
4．变形杆菌菌数的测定
菌数的测定方法是将检样在研钵中研磨制成悬液后，以生理盐水对原样品进行l：100，1：1000，1：10000，l：100000等稀释度的稀释。然后以移液管分别移取每种稀释度的悬液0.1ml接种于琼脂斜面底部的凝结水内，但勿接触培养基斜面表面。在37~C条件下培养24—48小时，观察生长状况。变形杆菌可自下而上弥漫生长，以出现生长的最高稀释度乘以10，则为每克检样中变形杆菌的最近似数。，
5．动物试验
把检样中分离纯化出的变形杆菌培养物，分别饲喂小白鼠或豚鼠、家兔等供试动物，如供试动物出现寒战、竖毛、腹泻等中毒症状则进一步证实为变形杆菌。
第五节 志贺氏菌及其检验
志贺氏菌属即通称的痢疾杆菌，为一类能时人和猿产生痢疾疾病的革兰氏阴性杆菌。志贺通常志贺氏杆菌(Bacillus，shigae)仅指I型痢疾志贺氏菌。志贺氏杆菌是日本志贺诘在1898年首次分离得到的，因此而得名。
志贺氏菌属有四个血清组，即A。 B、C,D。
(1)A群:又称痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae),通称志贺氏痢疾杆菌。不发酵甘露醇。有12个血清型，其中8型又分为三个亚型。
（2）B群：又称福氏志贺氏菌（Sh.flexneri），通称福氏痢疾杆菌。发酵甘露醇。有15个血清型（含亚型及变种），抗原构造复杂，有群抗原和型抗原。根据型抗原的不同，分为6型，又根据群抗原的不同将型分为亚型；X、Y变种没有特异性抗原，仅有不同的群抗原。
（3）C群：又称鲍氏志贺氏菌（Sh.boydii），通称鲍氏痢疾杆菌。发酵甘露醇，有18个血清型，各型间无交叉反应。
（4）D群：又称宋内氏志贺氏菌（Sh.sonnei），通称宋内氏痢疾杆菌。发酵甘露醇，并迟缓发酵乳糖，一般需要3～4天。只有一个血清型。有两个变异相，即Ⅰ相和Ⅱ相；Ⅰ相为S型，Ⅱ相为R型。
一、生物学特性
1．形态与染色特性
本属细菌为两侧平行、末端钝圆的短杆菌,2－3umX0.5—0.7um与其他肠道杆菌相似。无荚膜，无鞭毛，不形成芽孢，革兰氏阴性，个别菌带有菌毛。
2．培养特性
1)需氧或兼性厌氧，但厌氧时生长不很旺盛。
2)对营养要求不高，在普通琼脂培养基上易于生长。
3)在10℃一40℃范围内可生长。最适温度为37℃左右。最适pH值为7．2。
4）在固体培养基上，培养18－24小时后．形成圆形、隆起、透明，直径2—3mm、表面光滑、湿润、边缘整齐的菌落。
3．生化特性
A亚群一般不发酵甘露醇，除少数以外，一般不发酵乳糖、蔗糖和棉子糖。A群从不发酵山梨醇和阿拉伯糖，由此可以与其它血清型相区别。
B亚群细菌发酵甘露醇，不发酵乳糖，偶尔有迟缓发酵蔗糖的菌株。B亚群中的6型又可分成鲍氏—88、曼彻斯特、新城三个生化亚型。
C亚群为发酵甘霹醇产酸但不产气的菌株，不发酵乳糖、蔗糖、棉子糖； ·
D亚群菌迟缓发酵乳糖，迅速发酵甘露醇、阿拉伯糖和鼠李糖，但不发酵卫矛醇和山梨醇。
志贺氏菌的靛基质试验结果及其他生化特性如表5—14。 ；·
4．血清学特性志贺氏菌四个亚群各具有不同的抗原构造，都是由菌体抗原(O)及表面抗原(K)所组成。B亚群细菌的抗原关系比较复杂，根据各血清型的群抗原和型抗原构成的不同，尚可再分为亚型，如1型可分为1a亚型和1b亚型等。B亚群有6个血清型，连同亚型X、Y两个变种共13种不同的抗原构造。
5．抵抗力
抵抗力较弱，在一般情况下。
本属细菌在染菌的衣物中，室温暗处可存活5～46日在泥土中，于室温暗处可存活9—12日，自然污染的粪便，如使之保持碱性并湿润，可在其中存活很多天，但如有大肠杆菌或其它产酸菌活动时，数小时便可死亡，在水里可存活数月，在－2℃的冰块中可存活53日，其中宋内氏志贺氏菌比福氏志贺氏菌2a型存活数多。
在猪肉、米、面等食品中，志贺氏菌的增殖率随温度上升而增加，在37~C比在10℃的增殖数量约高一万倍。
志贺氏菌经55℃加热1小时、或0．5％石炭酸作用6小时或1％石炭酸作用15～30分钟即可杀死。
6．毒素特性
志贺氏菌既可产生内毒素和外毒素。
内毒素是一种耐热性肠毒素，其化学成分为脂多糖和蛋白质复合物，并与菌体的O抗原相当。在实验动物(小自鼠、大白鼠)体内，可引起腹泻,白细胞减少，发热、肝糖原下降等。
外毒素也叫神经毒素，是不耐热的蛋白质，经80~C加热1小时即被破坏。仅痢疾志贺氏菌和部分舒密次杆菌产生此种毒素。以家兔最为敏感，人的中毒剂量为 0．00006mg，外毒素主要作用于小血管，使小白鼠和家兔出现神经症状，使大白鼠和家兔出现肠道水肿和出血，使地鼠出现肺水肿和胸腔出血，而一般豚鼠对其具有抵抗力。
二、致病性
志贺氏杆菌是侵入性细菌，只需千个、百个、甚至几个就可能引起疾病发生，与大肠埃希氏菌不同。后者需要食入大量细菌才会引起中毒。
菌体进入体内后侵入空肠粘膜上皮细胞繁殖，产生外毒素，菌体破坏后产生内毒素作用于肠壁、肠壁粘膜和肠壁植物性神经。
三、主要症状潜伏期一般为10—20h，短者6h，病人会出现剧烈的腹痛、呕吐及频繁的腹泻，并伴有水样便，便中混有血液，发热，体温高者可达40度以上，有的病人出现痉挛。
四、流行病学
1、季节性特点
多发生于7－10月。
2、食品的种类主要是凉拌菜。
3、食品被污染和中毒发生的原因本菌携带者或食品加工、集体食堂、饮食行业的从业人员患有痢疾时，手时污染食品的主要因素。熟食品被污染后，存放在较高的温度下，志贺氏菌大量繁殖，食后引起中毒。
五、检 验志贺氏菌检验程序(GB4789．5-84)如图5-5。
1、临床特点符合志贺氏菌食物中毒流行病学特点，病人有类似痢疾样症状，粪便中有血液等。
2、采样按照采样原则对食品进行采集。如果有食物中毒，可从剩余食物、病人吐泻物分离志贺氏菌。
3、增菌
称取样品25g加入到装有225ml GN增菌液的500mL三角瓶中，如果是固体食品应用均质器以8000~10000转／分打碎1分钟，或用研钵加灭菌砂磨碎。粉状食品用灭 菌金属匙或玻璃棒研磨使其乳化。在36+1℃的条件下培养6～8小时。
4、分离培养
用接种环挑取增菌液1环，划线接种于HE平板或S．S琼脂平伴一个，麦康凯琼脂平板或伊红美兰琼脂平板一个，于36±1℃培养18—24小时。志贺氏菌在这些培养基上出现无色透明不发酵乳糖的菌落。
5、生化试验
挑取平板上的可疑菌落；接种三糖铁和半固体培养基各1管。志贺氏菌在三糖铁培养基中表现为底层产酸、不产气，斜面声碱，不产H2S。无动力，固体管内沿穿刺线生长。
4、血清学试验
挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用四种志贺氏菌多价血清检查。
5、快速诊断法
1．荧光菌球法：适于检查急性菌痢的粪便标本。将标本接种于含有荧光素标记的志贺氏菌免疫血清液体培养基中，37℃培养4～8小时。如标本中有相应型别的痢疾杆菌，繁殖后与荧光素抗体凝集成小菌球，在低倍或高倍荧光显微镜下易于检出。方法简便、快速，有一定的特异性。
2．协同凝集试验：用志贺氏菌的lgG抗体与富含A蛋白的葡萄球菌结合，以此为试剂，测定患者粪便滤液中志贺氏菌的可溶性抗原。
第六节 葡萄球菌及其检验
葡萄球菌在自然界中广泛存在于空气、土壤、水及物品上，特别是人和家畜的体表及外界相通的腔道检出率都相当高。
可分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生性葡萄球菌。葡萄球菌常引起人及动物组织器官脓肿、创伤化脓及败血症、食物中毒。其食物中毒主要是金黄色葡萄球菌引起，是由该菌产生的肠毒素引起的，通常是通过患病的动物产品以及患化脓创的食品加工人员及环境因素引起食品污染，如果条件适宜，就有毒素产生，12小时能产生足以引起中毒的量。这些污染食物被人食用后，则会引起食物中毒。
一、生物学特性
1．形态与染色特性
革兰氏阳性菌，为圆球形，直径为0．4～1。2um，大小不一，无鞭毛、无芽胞，一般不形成荚膜，易被碱性染料着色。致病性的葡萄球菌较非致寄性的葡萄球菌菌体小，在固体培养基上繁殖时堆积成葡萄串状。
但衰老、死亡或被白细胞吞噬的菌体，染色特性发生逆转，革兰氏染色为革兰氏阴性。
2．培养特性
1）为需氧或兼性厌氧菌，在含有二氧化碳20％～30％的环境中有利于毒素的产生。
2）营养要求不高，在普遍培养基上生长良好。培养18～24小时后，可形成圆形、凸起、边缘整齐，表面光滑、湿润有光泽、不透明的中等大菌落；葡萄球菌在固体培养基上生长，不同的菌株产生不同的颜色，据颜色不同而将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌，白色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌。该菌产生的色素为脂溶性的。
在含有血液、血清或葡萄糖的培养基上生长更好。本菌生长的最适温度为37℃．最适pH为7.4。
4）该菌耐盐性强，在含10％一15％氯化钠培养基中亦能生长，故可用高盐培养基分离全黄色葡萄球菌。
5）鲜血琼脂平板形成较大的菌落；多数菌株能产生溶血素而使菌落周围出现溶血环。非致病菌则无此现象。
6）Baird-parker氏琼脂
圆形、光滑、凸起、湿润，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带并在其外层有一透明带。
3．生化特性葡萄球菌的生化反应不规则，大多数菌株能分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖产酸不产气。金黄色葡萄球菌在厌氧条件下分解甘露醇产酸，非致病性菌则无此现象。
根据葡萄球菌的生化特性不同及产生的毒素及细胞结构的差异，可将该菌分为三种，即金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生性葡萄球菌。
4．抗原特性
葡萄球菌的抗原结构较复杂，细胞壁经水解后，用沉淀法可得到两种抗原成份：即蛋白质抗原和多糖类抗原；
1）、蛋白质抗原
(1)、为细胞壁表面上的一种蛋白质，称为葡萄球菌A蛋白(Staphylococcald protein A,SPA)，位于菌体表面，与胞壁的粘肽相结合。
(2)、完全抗原，具有种属特异性，无型特异性。
(3)、所有来自人的菌株均含有SPA，而来自动物的菌株则少见。
(4)、SPA 可与IgG的Fc片段结合。它与人及多种哺乳动物血清中的lgG的 Fc 段结合，因而可用含SPA的葡萄球菌作为载体，结合特异性抗体，进行协同凝集试验，可作快速的诊断方法。
2）、多糖抗原
(1)、半抗原；
(2)、具有型特异性，可用此抗原将葡萄球菌分为三个型(A、B、C型)。金黄色葡萄球菌目前主要采用噬菌体进行分型，共分成5个群(组)23(23)个型。
金黄色葡萄球菌除具有以上特性外，其在生长繁殖过程中还产生很多毒素和酶，其中主要有溶血毒素、肠毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶、DNA酶、耐热性核酸酶和透明质酸酶等。
5．抵抗力
在无芽胞的细菌中，葡萄球菌的抵抗力最强。
在干燥的脓汁中可生存数月，湿热80℃30分钟才能将其杀死。5％石炭酸，0．1％升汞中10～15分钟死亡。耐盐性强。
如培养基中加入龙胆紫液可抑制其生长。在冷藏环境中不易死亡。临床上用1-3%龙胆紫治疗有本菌引起的化脓，效果很好。
对磺胺类药物敏感性较低。对红霉素、链霉素、氯霉素及四环素较敏感。
肠毒素的耐热性强。带有毒素的食物煮沸120分钟方能破坏其毒素。低温下2个月以上方失去毒力。
二、致病性
金黄色葡萄球菌致病的特点是化脓性炎症，产生肠毒素的菌株能引起食物中毒：金黄色葡萄球菌的致病物质主要有毒素和酶。
1、溶血毒素（Staphyolysin）：
外毒素，可使动物红细胞溶解，培养时出现溶血环。按抗原性不同，至少有α、β、γ、δ、ε五种，对人类在致病作用的主要是α溶血素。
它是一种“攻击因子”，化学成分为蛋白质,65℃30分钟即可破坏。如将α-溶血素注入动物皮内，能引起皮肤坏死，如静脉注射，则导致动物迅速死亡。α溶血素还能使小血管收缩，导致局部缺血和坏死，并能引起平滑肌痉挛。α溶血素是一种外毒素，具有良好的抗原性。经甲醛处理可制成类毒素。
2、杀白细胞素（Leukocidin）：使寄主白细胞崩解死亡，是一种毒性蛋白。（能杀死人和兔的多形核粒细胞和巨噬细胞。此毒素有抗原性，不耐热，产生的抗体能阻止葡萄球菌感染的复发。）
3、肠毒素（Enterotoxin）：可溶性蛋白，分A、B、C1、C2、C3、D、E和F八个型，以A型引起的食物中毒最多。（肠毒素可引起急性胃肠炎即食物中毒。）耐热，100℃30分钟不破坏。
与产毒菌株污染了牛奶、肉类、鱼是虾、蛋类等食品有关，在20℃以上经8～10小时即可产生大量的肠毒素。肠毒素是一种可溶性蛋白质，耐热，经100℃煮沸30分钟不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响，故误食污染肠毒素的食物后，在肠道作用于内脂神经受体，传入中枢，刺激呕吐中枢，引起呕吐，并产生急性胃肠炎症状。发病急，病程短，恢复快。一般潜伏期为1～6小时，出现头晕、呕吐、腹泻，发病1～2日可自行恢复，预后良好。
4、血浆凝固酶（Coagulase）,是能使含有枸椽酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类物质，致病菌株多能产生，常作为鉴别葡萄球菌有无致病性的重要标志。使血浆中纤维蛋白凝固在菌体表面，保护细菌。
凝固酶和葡萄球菌的毒力关系密切。凝固酶阳性菌株进入机体后，使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面，阻碍体内吞噬细胞的吞噬，即使被吞噬后，也不易被杀死。同时，凝固酶集聚在菌体四周，亦能保护病菌不受血清中杀菌物质的作用。葡萄球菌引起的感染易于局限化和形成血栓，与凝固酶的生成有关。
凝固酶具有免疫原性，刺激机体产生的抗体对凝固酶阳性的细菌感染有一定的保护作用。慢性感染患者血清可有凝固酶抗体的存在。
是一种能使经过枸橼酸钠或肝素抗凝的家兔或人的血浆凝固的酶。大多数致病性葡萄球菌能产生此酶，而非致病菌不产生此酶。
5、DNA酶、溶纤维蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、透明质酸酶(Hyaluronidase)，脂酶(Lipase)等，使细菌具有侵袭力。
三、临床症状：
潜伏期一般为1—6小时，最短者0.5小时即发病。
症状主要是恶心、呕吐、流涎，胃部不适或疼痛，继之腹泻(但少见)。呕吐为多发症，为喷射状呕吐，一般腹泻后多有腹痛，初为上腹部后成全腹部，呕吐或便中常可见有血和粘液。少数患者有头痛、肌肉痛、心跳减弱、盗汗和虚脱现象。体温不高，不超过38~C，病程1天，呈急性经过，很少有死亡，预后良好。
四、流行病学特点
1．季节性特点
全年皆可发生，但多见于夏秋季。
2．食品的种类
引起中毒的食物种类很多，主要是乳类及乳制品、肉类、剩饭等食品。
3．食品被污染的原因及肠毒素的形成
(1)食物中金黄色葡萄球菌来源金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界，人和动物的鼻腔、咽、消化道带菌率均较高。据报道，上呼吸道被金黄色葡萄球菌感染的患者，其鼻腔带菌率为83．3％，而健康人带菌率也达到20％～30％。人和动物的化脓性感染部位常成为污染源，如奶牛患化脓性乳腺炎时，乳汁中可能带有金黄色葡萄球菌；带菌从业人员直接或间接污染各种食物；畜、禽局部患化脓性感染时，感染部位的金黄色葡萄球菌对体内其他部位的污染。
(2)肠毒素形成肠毒素的形成与温度、食品受污染的程度、食品的种类及性状有密切的关系。一般说，在37℃以下的范围内食物存放的温度越高，产生肠毒素需要的时间越短，在20～37C下经4－8h即可产生毒素，而在5—6℃的温度下需经18d方可产生毒素。食物受金黄鱼葡萄球菌污染的程度越严重，繁殖越快亦越易形成毒素。
五、检 验
1、采样
采集样品首先采取可疑的食物，其次采取病人的呕吐物，剩余的食品，或采取病人的粪便、血液。以及有关食品加工人员的皮肤感染性化脓创的脓汁等。,
2．国家标准检验方法 GB4789．10-84，检验程序如图5-9。
1）增菌和分离培养
将25g检样加于225mL灭菌生理盐水中或吸取液体检样5ml于7．5％氯化钠肉汤50ml进行增菌；同时挑取混悬液接种血平板及Bakd-Rarker氏培养基；取可疑菌落再接种血琼脂平板做纯培养。然后进行革兰氏染色。
2）血浆凝固酶试验
吸取1：4新鲜兔血浆0．5mL于小试管中，再加入培养24小时葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0．5mL振荡混匀，37℃温箱或水浴内每半小时观察一次，观察6小时，如呈现凝块即为阳性，同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉浸液肉汤作为对照。
血浆凝固试验也可采用玻片法。把兔血浆滴加于载玻片的一端，然后用白金耳挑取菌落与血浆充分混匀、在载玻片另一端以生理盐水代替血浆做阴性对照。混合舌立即观察，若出现凝块即为阳性。
病原性葡萄球菌多数产生血浆凝固酶，非病原性的一般不产生。因此，该法是判定葡萄球菌有无致病性的重要指标。
3．肠毒素的测定
动物试验可用检样稀释液直接作动物试验或按以下方法将分离菌株培养制备肠毒素。
①肠毒素的制备：
肠毒素的制备有固体培养法和液体培养法。
②肠毒素测定：
注射前应先喂给幼猫少量的食物，以便观察反应。取上清液按幼猫体重每100g 1mL的剂量腹腔注射或加大2—3倍量口服。然后仔细观察，一般攻毒后0．5～2小时内幼猫发生呕吐、腹泻、体温上升、畏寒等症状，经4～5小时后逐渐恢复。同时实验时用未接种菌的培养基做同样处理的阴性对照。
4、血清学反应
可用于检测食物、培养物或滤液等标本中的细菌或肠毒素。血清学反应不仅简便快捷，而且能对毒素做出最后定型：
①菌体荧光抗体染色法
涂片：食品样品接种于葡萄糖肉汤培养基，37~C培养24～48小时。用接种环取上述增菌液，涂布于载玻片上。
干燥：每一个培养物涂布3～4个点,37度培养箱内干燥。
固定：将干燥好的玻片放在克氏固定液中固定3－5分钟，再将固定的玻片标本放入95％酒精中浸泡1分钟，
加抗血清：然后充分干燥，用接种环取1环荧光抗血清轻轻加于菌膜上．
反应：然后37度培养箱内作用30分钟。
冲洗浸泡：取出作用好的玻片用0.01mol/L PH7.4 PBS液冲洗玻片上荧光血清，最后将标本放于95％酒精液中浸泡1分钟左右取出，用荧光显微镜镜检。
有特异性明亮荧光的为阳性或者菌量在一个视野中有数个或十几个细菌以上者为阳性。
②毒素的检出
金黄色葡萄球菌毒素蛇检出有免疫琼脂扩散法、反向间接血凝法，放射免疫测定法、免疫荧光法、酶联免疫吸附测定法、A蛋白血凝试验、核酸探针检测，乳胶凝集试验等。
5．噬菌体分型试验
第七节 链球菌及其检验
链球菌系指一大类呈链状排列的球菌。本菌广泛分布于自然界，一般存在于水、乳、粪便以及人和动物的病灶内。健康人和动物的皮肤和粘膜上，呼吸道和消化道内往往带菌。有些可引起各种化脓性炎症，猩红热，丹毒，脑膜炎，产褥热以及链球菌变态反应性疾病等，还有马腺疫链球菌，肺炎、乳腺炎、败血症等。
本菌在血液琼脂上培养时，按其对红细胞的落解现象，将其分为三类,；
1）甲型溶血(又称为α溶血),菌落周围呈现弱溶血，并有绿色环，放冰箱一夜后，绿色环周围呈现溶血环，
2）亚甲型溶血(又称为α溶血) 在菌落周围无明显溶血境界，溶血环狭小；镜检时，可见部分残留红细胞。
3）乙型溶血(又称β溶血) 菌落周围红细胞完全溶解，并有明显的溶血境界，出现完全透明的溶直环．本型包括大部分对人畜致病的链球菌。
此外，还有的链球菌无任何溶血现象。
链球菌的检验工作不仅在临床和流行病学上具有重要意义，在食品卫生工作上也具有十分重要的意义，一方面根据食品卫生要求，对食品中(如牛乳及乳制品)的致病性链球菌进行检验；另一方面，在可疑为链球菌引起食物中毒暴发时，应通过检验证实该菌与食物中毒的关系。
链球菌在自然界分布广泛，是食物污染的重要原因。文献报导，许多由食物引起的脓毒性咽喉痛和猩红热，是由A群链球菌引起，近年来，由链球菌引起的食物中毒已逐渐为人们所注意。
链球菌性食物中毒，经常由乳、肉类食品所引起，多为α溶血型。β溶血型链球菌引起食物中毒较少。
一、生物学特性
1、形态与染色特性
本菌为圆形或卵圆形，常排列成链状，链的长短不一。致病性链球菌一般较长，非致病性或毒力弱的菌株菌链较短，在液体培养中易呈长链，在固体培养基上常呈短链。
大多数链球菌无鞭毛，不能运动，但D群中某些菌株具有鞭毛。不能形成芽胞。多数链球菌在血清肉汤幼龄培养物中，易发现荚膜，当培养时间延长，荚膜即逐渐消失。
2、培养特性
1）需氧或兼性厌氧菌。多数菌株的生长温度为20C－42 C，最适温度为37 C 。本菌最适pH为7．4～7．6。
2）多数致病性菌株的营养要求较高，在普通培养基上生长不良，必须加血液、血清、腹水等。
3）血琼脂平板：37℃经18—24小时，形成灰白色、半透明或不透明，表面光滑，有乳光，细小菌落。适菌落周围可有不同的溶血现象，有的完全溶血，有的不完全溶血，形成草绿色溶血环；有的不发生溶血，无溶血环可见。
4）马铃薯培养基：
致病性链球菌发育良好．而致病性链球菌则不生长或生长不良。
3．生化特性
对常用的糖类，发酵后产酸不产气。分解葡萄糖后产生乳酸和少量甲酸、醋酸与乙醇。对乳糖、甘露醇、水杨苷、蔷蓑醇或重糖的发酵能力因菌株不同而异；链球菌一敏不分解菊糖，不被胆汁改10％胆盐所溶解，这点可用来鉴别链球菌和肺炎双球菌·。
肠链球菌可在6．5％氯化钠葡萄糖肉汤、40％胆汁肉汤，pH9．6葡萄糖肉汤和0．1％美兰牛乳培养基中生长，能在10~C和45℃下生长．这几点可作为肠链球菌和其他链球菌的鉴别。
4．抗原构造
1、核蛋白抗原或称P抗原：无群型特异性，各种链球菌均同，与葡萄球菌有交叉，不能用于分类。
2、多糖抗原或称C抗原（群特异性抗原）：具有群特异性，是细菌壁的多糖成份。对人致病的90%属于A族，其次为B族，其它族少见；据此可将链球菌分为20个血清群。
3、型特异性抗原：又称蛋白质抗原或称表面抗原，是链球菌细胞壁的蛋白质抗原（M抗原），是位于多糖抗原之外的蛋白质抗原；具有型特异性，基于M蛋白抗原性的不同，可将A群链球菌区分为100多个不同的血清型。
5．致病性
致病性链球菌常可产生多种酶和外毒素 。
链球菌种类多，致病复杂，毒力强弱决定于分泌的毒素和酶，A族链球菌有较强的侵袭力，可产生多种酶和外毒素。
1）、链球菌溶血素（Streptolysin）：有溶解红细胞，杀死白细胞、血小板及毒害心脏的作用，主要有“溶血素O”和“溶血素S”两种。
链球菌溶血素O能破坏白细胞和血小板。动物试验又证实对心脏有急性毒害作用，使心脏骤停。抗原性强，感染后2～3周，85%以上病上产生抗“O”抗体。
溶血素“S”，无抗原性。对氧稳定，对热和酸敏感。血平板所见透明溶血是由“S”所引起，能破坏白细胞和血小板，给动物静注可迅速致死。注射小鼠腹腔，引起肾小管坏死。
2）、致热外毒素（Pyrogenic extoxin）曾称红疹毒素(Erythrotoxin)或猩红热毒素(Scarletfever toxin)：是人类猩红热的主要致病物质，为外毒素，使病人产生红疹。该毒素是蛋白质，对热稳定，具有抗原性，则产生的毒素能中和该毒素的活性。
3）、另外还可产生：
（1）．M蛋白 是链球菌细胞壁中的蛋白质组份，具有抗吞噬和抗吞噬细胞内的杀菌作用。M蛋白有抗原性，刺激机体产生型特异性抗体，并与变态反应疾病有关。
（2）．脂磷壁酸（LTA） 与细菌粘附于宿主细胞表面有关，大多数LAT位于细胞膜和肽聚糖之间，通过肽聚糖孔伸展至细菌细胞表面，人类口腔粘膜和皮肤上皮细胞、血细胞等细胞膜上均有LAT的结合位点。
（3）．透明质酸酶（Hyaluronidaes），能分解细胞间质的透明质酸，使病菌易于在组织中扩散。又称为扩散因子。
（4）．链激酶(Streptokinase,SK),又称链球菌溶纤维蛋白酶(Streptococcal fibrinolysin)是一种激酶，能激活血液中的血浆蛋白酶原，成为血浆蛋白酶，即可溶解血块或阻止血浆凝固，有利于细菌在组织中的扩散。耐热，100℃50分钟加热仍保持活性。链激酶抗体能中和该酶的活性。
（5）．链道酶（Streptodonase）又名脱氧核糖核酸酶(Streptococcal deoxyribonuclease)：主要由A、C、G族链球菌产生。此酶能分解粘稠脓液中具有高度粘性的DNA，使脓汁稀薄易于扩散。产生的相应抗体有中和该酶的活性。用链激酶、链道酶制剂进行皮肤试验作为测定机体细胞免疫的一种方法。
链球菌的种类繁多，引起人和各种畜禽的疾病各异，主要为各种化脓性炎症、呼吸道感染，如气管炎、咽峡炎、扁桃体炎、肺炎等。扁桃体炎，咽炎，鼻窦炎，中耳炎，肾炎等，猩红热。此外有的还能引起人的食物中毒。
风湿热 由A族链球菌的多种型别引起，临床表现以关节炎、以肌炎为主。致病机理认为两种：一是第Ⅱ型变态反应，链球菌细壁多糖抗原和心肌瓣膜，关节组织糖蛋白有共同抗原性，胞壁蛋白抗原和心肌有共同抗原性。二是第Ⅲ型变态反应，可能是M蛋白的免疫复合物沉积于心瓣膜和关节滑液膜上造成。
急性肾小球肾炎 多见于儿童和少年，大多数由A族12型链球菌引起。临床表现为蛋白尿、浮肿和高血压。也是一种变态反应性疾病。链球菌的某些抗原与肾小球基底膜有共同抗原，机体针对链球菌所产生的抗体与肾小球基底膜发生反应，属第Ⅱ型变态反应。由链球菌的M蛋白所产生的相应抗体形成的免疫复物沉积于肾小球基底膜，造成基底膜损伤，属于第Ⅲ型变态反应。
6．抵抗力
本菌抵抗力不强，60度 30分钟即可死亡。
巴氏灭菌法加热60℃～63C经30分钟，即将牛乳中致病的链球菌群杀死。在渗出液及动物排泄物中可生活数周。D群链球菌抵抗力很强，加热60度30分钟不死。
二、检 验
1．国家标准检验方法 GB4789．11-84，检验程序见图5-10。
1）取样
2）增菌、分离培养
称取检样加入灭菌生理盐水制成混悬液进行增菌和分离培养。增菌培养吸取上述检样混悬液5mi接种于50mi葡萄糖肉浸液肉汤内，如污染严重的检样，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经36+1℃培养24小时，挑取乙型溶血、园形突起的细小菌落接种血平板。在增菌培养的同时用上述检样混悬液直接划线接种于血平板。如为灰白色、半透明或不透明，表面光滑、有浮光、园形突起的细小菌落，周围有2—4mm无色透明的溶血环，可认为是溶血性链球菌。再进行革兰氏染色镜检。
③杆菌肽敏感试验
挑取乙型溶血性链球菌浓菌液，涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0．04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于36~1℃培养18～24小时，如有抑菌带出现即为阳性，可初步鉴定为A群链球菌。同时用已知阳性菌株作为对照。
2．其他辅助检验方法
1）α型溶血性链球菌与肺炎球菌鉴别试验胆汁溶菌试验：取待检菌的18—24小时液体培养管2支，每支约4mi，向其中1管加入无菌胆汁1ml，置37'C60分钟比较两管之浊度，如肺炎球菌，则应变为澄清。
菊糖发酵试验：肺炎球菌可分解菊糖，链球菌则为阴性。
2）肠道链球菌(D群)与其他链球菌的鉴别试验
生长试验：将待检菌接种于宁5％氯化钠葡萄糖肉汤、pH9．6葡萄糖肉汤、40％胆汁葡萄糖肉及0．1％美兰牛乳培养基，置37℃温箱内培养，肠道链球菌均能生长。
耐热试验：将待检菌接种于0，5％葡萄糖肉汤，置60~C水浴中经30分钟取出，置37℃温箱内培养，肠道链球菌仍有活力。
生长温度试验：将待检菌接种于2支0．5％葡萄糖肉汤，分别置于10~C及45℃下培养24小时，肠道链球菌均能发育。
3）动物试验 取分离菌的48小时肉汤培养物0．2ml接于种小鼠腹腔，观察1周，如动物发生死亡，即行解剖，并取其心血培养，以证实之。
4）血清学试验
第八节 肉毒梭菌及其毒素的检验
肉毒梭菌(Clostridium botulinum)是一种腐物寄生菌。肉毒梭菌在自然界分布广泛，土壤中常可检出，江、河、湖、海沉积物，水果，蔬菜，畜、禽、鱼等制品中亦可发现,霉干草和畜禽粪便中均有存在，可分为A至G七个型。
早在18世纪末以前，在欧洲，尤其是在德国就已被人们所认识，由于那时候引起中毒的食品主要是腊肠，所以这种中毒就取自腊肠的拉丁文Botulus，而称为腊肠中毒(Botulism)。在我国过去的一些书中，把本病译为腊肠中毒，把肉毒梭菌译为腊肠(毒)杆菌或腊肠(毒)梭菌。现在改称为肉毒中毒。
引起肉毒中毒主要是食人含有肉毒毒素的食品．这些食品是在调制加工、运输贮存的过程中，污染了肉毒梭菌芽胞，在适宜条件下，发芽、增殖并产生毒素所造成的。
在国外，引起肉毒中毒的食品多为肉类及各种鱼、肉制品、火腿、腊栖，以及豆类、蔬菜和水果罐头。中毒食品种类往往与饮食习惯有关：如欧洲各国主要的中毒食品为火腿，腊肠和其他兽肉、禽肉等。美国主要是家庭制的水果罐头．而火腿、腊肠等畜禽加工食品仅占7．7％。苏联和日本鱼制品中毒者最多，尤其是日本，几乎全部是鱼制品的E型中毒。
在我国也有肉毒中毒的报导，因肉类食品及罐头食品引起的中毒的较少，据新疆肉毒科研协作组的223起肉毒中毒的调查统计，臭豆腐、豆鼓、面酱。红豆腐、烂土豆等植物性食品共204起，占91．48％；其余的19起(占8．52％)是动物性食品，包括熟羊肉、羊油、猪油、臭鸡蛋、臭鱼、咸鱼，腊肉、干牛肉、马肉等。
一、生物学特性
1．形态与染色特性
本菌为革兰氏染色阳性蛇大杆菌,多单在，偶见成双或短链，菌端纯圆。有周身鞭毛，无荚膜，芽胞为椭圆形，A，B型菌的芽胞大于菌体，位于菌体近端，使菌体呈匙形或网球拍状，另外四型菌的芽胞一般不超过菌体宽度。
2．培养特性
1）最严格的厌氧菌
2）对营养要求不高，在普通培养基上都能生长。普通琼脂上形成灰白色，半透明、边缘不整齐。呈绒毛网状、向外扩散的菌落。
3）发育最适温度为28～37度，pH为6.8—7.6，产毒的最适pH为7.8—8.2。
4）血液琼脂：菌落周围有溶血区：
5）肉渣肉汤：呈均匀混蚀生长，肉渣可被A、B和F型菌消化溶解成烂泥状，并发黑，产生腐败恶臭味，从第三天起，菌体下沉，肉汤变清。在肉渣培养基和半固体培养基中，大量产气。
3、生化特性
4．抵抗力
肉毒梭菌的抵抗力一般，但其芽胞的抵抗力很大，可耐煮沸1～6小时之久，于180度干热5—15分钟，120~C高压蒸气下10～20分钟才能杀死。
对于罐头食品的灭菌很重要，若芽胞深藏于食品中，或者数量过多，虽经高温灭菌，有时也不易杀死芽胞，故应特别注意。
肉毒毒素抵抗力也较强，80~C30分钟或100C10分钟才能完全坏。正常胃液和消化酶于24小时不能将其破坏，可被胃肠道吸收而中毒。
5．菌型及毒素
目前已知肉毒梭菌有A、B、C、D、E、F、G等7个菌型。引起人群中毒的主要是A、B、E三型，C、D型主要是畜禽肉毒中毒的病原，F型只见报导发生在个别地区的人，如丹麦和美国各一起。1980年从瑞士五名突然死亡病例中发现G型毒素。
肉毒毒素是在肉毒梭菌胞浆中产生，由菌体释放到培养基中，经滤过除菌所得滤液即为毒素液。毒素形成的最适温度为28~C～37C，温度低于8~C与pH在4．0以下时，则不能形成。
肉毒梭菌产生的毒素是一种神经毒素，是目前已知的化学毒物与生物毒素中毒性最强烈的一种，对人的致死量为10—9mg／Kg体重。其毒力比氰化钾还要大一万倍。
二、致病性
肉毒毒素是一种与神经亲和力较强的毒素，肉毒毒素经肠道吸收后，作用于外周神经肌接头，植物神经末梢以及颅脑神经核，毒素能阻止乙酰胆碱的释放，导致肌肉麻痹和神经功能不全。
三、临床症状在临床上表现以中枢神经系统中毒症状为主。潜伏期长短不一，短者2小时，长者可达数天，一般为12～24小时。
中毒症状，早期为瞳孔放大、明显无力、虚弱，晕眩，继而出现视觉不清和雾视，愈来愈感到说话和吞噬困难，通常还可见到呼吸困难。体温一般正常，胃肠道症状不明显。病程一般为2～3天，也有长达2—3星期之久的。
肉毒中毒死亡率较高，据报道可达30％一50％。死亡主要是由于呼吸麻痹及心肌痪瘫。如早期使用型特异或多价抗血清治疗，死亡率可降至10％一15％。
四、流行病学特点自1896年VanEMengein首次报道荷兰因火腿引起肉毒中毒爆发，并分离出肉毒梭菌后，世界各地陆续报道本病。我国吴朝仁等1958年报告新疆察布查尔县由于食用面酱半成品引起肉霉中毒之后，相继报告该地区由其他谷、豆类发酵食品等引起的肉毒中毒。
1．季节性特点 肉毒梭菌食物中毒主要发生在4～5月。
2．地区分布特点
肉毒梭菌广泛分布于土壤、水及海洋中，且不同的菌型其分布也有差异。A型肉毒梭菌主要分布于山区和未开垦的荒地，如新疆察布查尔地区是我国肉毒梭菌中毒多发地区，未开垦荒地该菌检出率为28．25％，土壤中为22．2％；B型多分布于草原区耕地；E型多分节于土壤、湖海淤泥和鱼类肠道中，我国青海省发生肉毒梭菌中毒主要为E型；F型分布于欧、亚、美洲海洋沿岸及鱼体。
3．食品的种类
引起中毒的食品种类因地区和饮食习惯不同而异。国内以家庭自制植物性发酵品为多见，如臭豆腐、豆酱、面酱等，罐头瓶装食品、腊肉、酱菜和凉拌菜等引起中毒也有报道。在新疆察布查尔地区引起中毒的食品多为家庭自制谷类或豆类发酵食品，在青海主要为越冬密封保存的肉制品。日本90％以上的是由家庭自制鱼和鱼类制品引起；欧洲各国肉毒梭菌中毒的食物多为火腿、腊肠及其他肉类制品；美国主要为家庭自制的蔬菜、水果罐头、水产品及肉、乳制品。
4．食物中肉毒梭菌的来源及食物中毒的原因
食物中肉毒梭菌主要来源于带菌土壤、尘埃又粪便，尤其是带菌土壤可污染各类食品原料。这些被污染的食品原料在家庭自制发酵和罐头食品的生产过程中，加热的温度或压力不足以杀死肉毒梭菌的芽孢，且为肉毒梭菌芽孢的萌发与产生毒素提供了条件，尤其是食品制成后，有不经加热而食用的习惯，更容易引起中毒的发五、检 验
肉毒毒素的检出被看做是肉毒中毒实验室诊断的根本方法。
（一）、国家标准检验方法
检样经均质处理后，及时接种培养，进行增菌、产毒培养，同时进行毒素检测试验。毒素检测试验结果证明检样中有无肉毒毒素及有何型肉毒毒素存在。
1、动物试验肉毒毒素检测以小白鼠腹腔注射为标准方法
1）检出试验：
取离心上清液和胰酶处理液分别注射小白鼠2只，每只0．5mi观察4天。注射液中如有肉毒毒素存在。小白鼠一般注射后24小时内发病、死亡。最快从10分钟开始，
超过％小时者不可能发病：主要症状为竖毛，四肢麻痹，全身瘫痪，呼吸困难，呈现峰腰，最终死于呼吸麻痹：
2）确证试验：
凡能致小鼠发病或死亡者，取上清液3份作确证试验。1份加等量多型混合肉毒抗毒素诊断血清。混匀．37~C作用30分钟； l份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10分钟；1分加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀即可。3份混合液备注小鼠2只，每只0．5mL。观察4天，若含抗血清和加热处理的注射液不致小鼠死亡，未经处理的注射液致小鼠死亡，则可判定食品中含有肉毒毒素的存在，必要时进行毒力测定和定型试验。
3）毒力测定,
4）定型试验,
2、肉毒梭菌检出(增菌产毒培养)试验
增菌培养,
分离培养,
培养特性检查：接种两个卵黄琼脂平板，分别在35亡的需氧和厌氧条件下培养48小时，观察生长情况及菌落特征。肉毒梭菌只在厌氧条件下才能生长，并具上述菌落特征。有氧条件下不生长。
（二）、其他检验方法(毒素检测)
1、禽眼睑试验
2、中和试验
中和反应是毒素与抗毒素之间的一种免疫学反应，即毒素与抗毒素混合后，形成特异性结合，致使毒素作用活性消失。是肉毒毒素鉴定和定型的最标准方法之一。
3、血清反应法
为了寻求简易快速的方法检验肉毒毒素．目前进行了许多血清学试验研究，如补体结合反应、试管沉淀反应、间接血凝试验。免疫电泳、荧光抗体、酶联免疫吸附试验等等，但离实际应用还都有一定的距离．其中间接血疑试验应用的较多。
1）间接血凝试验：本法可将毒素分型。其特异性及敏感性均较高。
2） 酶联免疫吸附测定法(ELISA)
检测A型和E型肉毒毒素，有报道指出不仅敏感性高，重复性好，而且特异性高，与其他毒素型天交叉互应：目前尚处于研究试验中，尚未应用于实际的毒素检测工作。
3）特异型抗血清琼脂扩散法：
即在培养基中加入特异性高的抗毒素，由菌落释放出来的毒素与平板中酡抗毒素发生沉淀反应，在菌落的周围发生乳白色园形晕环。只要所用抗毒素的型特异性很强，就可以鉴定到型。
第九节 蜡样芽胞杆菌及其检验
蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)食物中毒，是一种常见的食物中毒。第一起蜡样芽胞杆菌食物中毒的完整报告在1950年发表于挪威，随后许多国家，特别是北欧和东欧国家也报告有类似的食物中毒爆发。1971年以来英国也报告过多起蜡样芽胞杆菌食物中毒。我国于1973年南京市卫生防疫站，1974年鞍山市卫生防疫站相继报告蜡样芽胞杆菌食物中毒以来，近几年来又有一些单位报告了本菌引起的食物中毒。引起食物中毒的食品范围很广，包括肉类、菜汤、烧鸡、炒菜、鱼、牛奶、点心食品，剩饭等等。
蜡样芽胞杆菌分布比较广泛，在土壤和植物上及许多食物上都能分离到。引起食物中毒的食品必须含有较大量的细菌，每克或每毫升食品中约需含107个以上的蜡样芽胞杆菌。
蜡样芽胞杆菌在食品上，于20度以上的环境中放置，能迅速繁殖并产生肠毒素，同时，由于本菌不分解蛋白质，因此，食品在感官上无明显变化，无异味，很容易误食而发生中毒。
一、生物学特性
1．形态和染色特性
本菌为革兰氏阳性的大杆菌，菌体两端较平整，芽胞呈椭圆形，位于菌体中央稍偏一端，芽胞较菌体小。
2．培养特性
1）需氧菌，生长温度范围在10C一45℃之间。最适生长温度为28—35℃。
2）对营养要求不高，在普通培养基上生长良好。本菌在普通琼脂平板上，生长的菌落呈乳白色，不透明，边缘不整齐，直径为4—6mm，菌落边缘往往呈扩散状，表面稍干燥。
3）在血液琼脂平板上形成浅灰色、不透明、似毛玻璃状的菌落。在菌落周围初呈草绿色溶血，时间稍长即完全透明。
4）在普通肉汤内生长迅速，肉汤混浊，常常有菌膜或壁环，振摇易乳化。
3．生化特性
4．血清学特性
蜡样芽胞杆菌有两种抗原，一种是耐热的，一种是不耐热的。
5．抵抗力
蜡样芽胞杆菌生长型不耐热，100度 20分钟即可被杀死，对酸碱不敏感。pH6—11对本菌基本上不受影响，pH5以下，生长可受到抑制。,
二、致病性
蜡样芽胞杆菌引起食物中毒，除了必须具有大量的细菌外，肠毒素也是重要的致病毒素。
蜡样芽胞杆菌产生的肠毒素有两种
1、耐热性肠毒素：100度30分钟不能被破坏，为引起呕吐型中毒的致病因素，常在米饭中形成。
2、不耐热肠毒素：是引起腹泻型胃肠炎的病因，能在各种食物中形成。
三、临床症状蜡样芽胞杆菌食物中毒，在临床上一般可分为呕吐型和腹泻型两类。
呕吐型中毒多见于过剩米饭和油炒饭，由耐热性肠毒素为致病因素；潜伏期短，一般为2—3小时，最短为30分钟，最长5—6小时；中毒症状：呕吐，腹痉挛，腹泻则少见，一般经过8—10小时而治愈。
腹泻型中毒由各种食品中不耐热肠毒素引起，潜伏期在6小时以上，一般为6—14小时；中毒症状：腹泻，腹痉挛，而呕吐却不常见；病程24-36小时。
两型均少见体温升高，预后良好。
四、流行病学
1、季节性特点
以夏、秋季，尤其是6－10月为多见。
2、食品种类
包括乳及乳制品、肉类食品、蔬菜、米粉、米饭等。
3、食物中腊样芽孢杆菌的来源肉及制品的带菌率为10－26％，乳及制品带菌率为23－77％，食品中该菌的污染源主要是泥土、尘埃、空气，其次是昆虫、苍蝇、不洁的用具等。如果食用前不加热或加热不彻底，即可引起食物中毒。
五、检 验
第十节 平酸菌及其检验
“平酸”菌是一种能使某些罐头酸败而又能形成芽孢的厌氧菌。它们发酵碳水化合物的特点是能产生使食品变酸的低碳脂肪酸，但是不产生气体，也不足以改变罐头两端平面的形状，这类罐头食品的酸败被称为平盖酸败。这类菌习惯上称“平酸”菌。
常见的种类有嗜热脂肪芽胞杆菌，是一种专性嗜热菌；凝结芽胞杆菌，是一种兼性嗜热菌，其耐酸性强，是肉类，蔬菜罐头(番茄汁；番茄浆罐头等)、炼乳、奶油等腐败变质的常见菌。它们引起腐败的罐头，外观正常、不膨胀，其内容物却在平酸菌作用下呈现轻重不同的酸败状态，pH值可降低0．3—0．5。
平酸菌在自然界分布很广泛。炼乳的酸败和随后凝乳的形成常常是凝结芽胞杆菌引起的：嗜热脂肪芽孢杆菌的芽胞具有很强的抗热性，能杀死肉毒梭状芽胞杆菌的杀菌温度并不能杀死嗜热脂肪芽孢杆菌，因此在一般高温杀菌后的罐头食品中，还会有嗜热脂肪芽胞杆菌存在。
一、生物学特性
1．形态及染色特性
嗜热脂肪芽胞杆菌和凝结芽孢杆菌都为革兰氏阳性菌，具有周身鞭毛，能运动
2.培养特性
嗜热脂肪芽胞杆菌的最低生长温度为28℃，最适生长温度为50－65℃，最高生长温度为70℃～77C，在pH6.8－7.2的培养基中生长良好，当pH值接近5时就不能生长。因此，这种菌只能在pH5以上的罐头食品中生长。
凝结芽胞杆菌的最低生长温度为18C，最适生长温度为55－60℃。最高温度为55℃－60℃，能适应较高的酸度，能在pH值4.5以下的酸性罐头食品种生长，所以又称本菌为嗜热酸性芽胞杆菌。
凝结芽胞杆菌在葡萄糖胰胨琼脂培养基表面生长的菌落呈圆形，不透明，淡黄色。生长在培养基深层的菌落带有绒毛状边缘，呈浅黄色至橙色。由于酸的形成菌落周围出现一个黄色晕圈。
嗜热脂肪芽孢杆菌在葡萄糖胰胨琼脂培养基上生长，但只形成针头大小的菌落，通常显示褐色。
3．生化特性
二、检 验
1．成品罐头中平酸菌的检验
罐头平酸腐败必须通过开检查或细菌分离培养等才能确定，具体方法如下,
1）检样的采取
将待检罐头预先经55C培养5—7天，然后开罐，取其内容物1ml（液体)或lg(固体)，以无菌操作接种于葡萄糖胰胨琼脂培养基中，每罐接种2支。未培养的作对照。
2）增菌培养
将接种的上述试管于，55℃培养48小时然后观察．若指示剂由紫变黄即为阳性，同时进行涂片镜检(有时不易检到芽胞)。
3）分离培养
将阳性试管划线接种于葡萄糖胰胨琼脂培养基上，于55度培养48小时后检查有无可疑菌落(菌落黄色，周围有黄色环，中心色深不透明)。如有可疑菌落则接种于普通琼脂斜面和芽胞培养斜面上，55℃培养24小时，涂片镜检芽孢的形态及位置，并同时以普通琼脂斜面培养物进行生化试验。
4）鉴定：
经形态和其他反应两方面鉴定。
菌体形态：取样品直接涂片镜检；平酸菌为革兰氏阳性芽胞F菩生化反应：检查平酸腐败，可将培养过的样品与未培养过的正赏对照样品的pH值进行比较，通常足以显示出平酸腐败的存在。
3．注意事项
样品必须保管好，在采取样品和检验程序开始之间，不要在嗜热菌生长温度范围内存放很长时间，应在不超过约43C的地方贮存。
随机采取库存罐头食品样品，如酸败局限于货架上箱内的外层或外层的产品，则表明是局部受热的缘故，应注意通风散热。如发现酸败局限于货架上的内部箱，则表示生产中冷却不充分，产品继续处于嗜热菌生长温度范围内。
第十一节 黄曲霉菌及其毒素的检验霉菌污染食品后，在适宜条件下会产生毒素。人和动物食用被污染了霉菌毒素的食品后，可产生各种危害，如急性或慢性中毒、肿瘤等。
霉菌产毒的特点：
①霉菌产毒仅限于少数的产毒霉菌。
②产毒菌株的产毒能力具有易变性。
③产毒霉菌产毒不具有一定的严格性。
④产毒霉菌产毒需要一定条件。
如花生、玉米易污染黄曲霉及其毒素，小麦、玉米易污染镰刀菌及其毒素，大米易污染青霉及毒素。
常见的霉菌有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、镰刀菌毒素和青霉菌毒素等。
黄曲霉毒素存在于霉变的花生、谷物、果仁和大米上。肝癌与黄曲霉毒素含量高有直接关系。为了防止产生黄曲霉毒素，最好将桃仁、果仁、谷物贮藏在密封和干燥的地方，不要吃发霉的食品，尤其是发霉的干果、桃仁和粮食。
主要由黄曲霉和寄生曲霉产生，其基本结构中都含有二呋喃环和双香豆素，黄曲霉毒素主要损害肝脏，表现为脂肪变性、出血、坏死及胆管上皮、纤维组织增生。同时肾脏也可受损害。
临床表现
早期有胃部不适、腹胀、厌食、呕吐、一过性发热及黄疸等。2～3周后出现腹水、下肢水肿、脾脏增大变硬、胃肠道出血、昏迷甚至死亡。
诊断
1,有进食可疑黄曲霉菌污染食物史。
2,临床特点①潜伏期较长。②中毒表现：胃部不适、腹胀、厌食、呕吐、肠鸣音亢进、一过性发热及黄疸等。
急救处理
1,护肝。
2,对症支持治疗
一、黄曲霉菌及其毒素的种类
(一)产毒菌及其特性
1．黄曲霉菌
本菌属真菌门、半知菌亚门丛梗孢科曲霉属。本菌为需氧菌，最适温度30～33℃，相对湿度80－90％为最佳条件。花生、玉米、大米和小麦是其较好的生长基质。
2．寄生曲霉
寄生曲霉也是产生AFT的主要菌株，其特性与黄曲霉类似。我国分布较少。
3．其他
青霉、毛霉和根霉等真菌也能产生AFT，但产毒量甚微，其特性与黄曲霉类似。
(二)黄曲霉毒素的种类及对食品的污染黄曲霉毒素（AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。
它们在紫外线照射下能产生荧光，根据荧光颜色不同，将其分为B族和G族两大类及其衍生物。AFT目前已发现20余种。
AFT主要污染粮油食品、动植物食品等；如花生、玉米，大米、小麦、豆类、坚果类、肉类、乳及乳制品、水产品等均有黄曲霉毒素污染。其中以花生和玉米污染最严重。家庭自制发酵食品也能检出黄曲霉毒素，尤其是高温高湿地区的粮油及制品种捡出率更 高。
二、黄曲霉毒素的特性
1、AFT的毒性极强远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性，其中以B1毒性最大。当人摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。当微量持续摄人，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。AFT的致癌力也居首位，是目前已知最强致癌物之一。
2、AFT具耐热性一般烹调加工温度不能将其破坏，裂解温度为280℃。在水中溶解度较低，溶于油及一些有机溶剂，如氯仿和甲醇中，但不溶于乙醚、石油醚及乙烷。
3、食品中所污染的主要是黄曲霉毒素Bl，其毒性目前一般认为有三种临床特征；急性中毒、慢性中毒和致癌性：
(1)急性中毒：
它是一种剧毒物质，毒性比KCN大100倍，仅次肉毒霉素，是目前已知霉菌中毒性最强的。它的毒害作用，无论对任何动物，主要变化是肝脏，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏也有轻度的病变。
(2)慢性中毒：
长期摄入小剂量的黄曲霉毒素则造成慢性中毒。其主要变化特征为肝脏出现慢性损伤，如肝实质细胞变性、肝硬化等。出现动物生长发育迟缓，体重减轻，母畜不孕或产仔少等系列症状
(3)致癌性：
AFT是目前所知致癌性最强的化学物质其致癌特点是：
A 致癌范围广，能诱发鱼类、禽类，各种实验动物、家畜及灵长类等多种动物的实验肿瘤；
B 致癌强度大，其致癌能力比六六六大1万倍；
C 可诱发多种癌，AFT主要诱发肝癌，还可话互胃癌、肾癌、泪腺癌、直肠癌、乳腺癌，卵巢及小肠等部位的肿瘤，还可出现畸胎。,
三、黄曲霉毒素在食品中的允许含量标准黄曲霉毒素具有很强的毒性，特别是它的强致癌性，世界各国对于其污染食品的情况都很重视，并对其在食品中芝全量咋了严格限制。124表四、检验
(一)黄曲霉菌菌落及形态观察
黄曲霉菌菌落生长较快，10～14天直径3～4或6—7cm。菌落正面色泽也随其生长由白色变为黄色及黄绿色，呈半绒毛状。孢子成熟后颜色变为褐色。表面平坦或有放射状沟纹，反面无色或带褐色。
在低倍显微镜下观察可见分生孢子头呈疏松放射状，继而为疏松柱状。
制片镜检观察，可见分生孢子梗很粗糙。顶囊呈烧瓶形或近球形。
分生孢子在小梗上呈链状着生，分生孢子的周围有小突起、球形、粗糙。
（二）黄曲霉毒素检测方法可归纳为化学方法、生物学方法和免疫学方法三大类。
1、生物学方法
1）抑菌试验
AFT有抑制某些微生物生长的作用，故用其抑菌作用来测定AFT的存在和含量。已经发现巨大芽胞杆菌和短芽胞杆菌对AFT最敏感。通过平皿中抑菌圈大小来衡量AFT含量。
2 ）荧光测定法
根据AFT在紫外光照射下可发出荧光的原理，将待检菌株接种于培养基中，28—30~C培养48～72小时，产生的毒素便浸入培养基中，在紫外灯光下照射培养基会呈现出特异的荧光。此法操作简便。对AFT最低检出量为5pg／ml。·
3）大白鼠试验法
AFT对大白鼠毒性最早出现损害的是肝脏，其受损范围广，而幼鼠最敏感，雄性幼鼠比雌性幼鼠敏感性更高，用100－150g大白鼠作急性中毒试验，一般3—4天死亡。
4）鸡胚试验
5）鸭雏试验
鸭雏对AFT非常敏感，致死性强，一般用一次剂量后72小时内死亡。
6）斑点试验本法用于检测真菌毒素致突变试验的一种有意义的方法。主要利用沙门氏菌/微粒体突变性来检测某些样品种AFT的存在与含量。
A先将鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型变种的菌悬液，与一定量肝组织匀浆混合作倾注平板。
B待凝固后，再将一定量被检物(含AFT)加在平板中央待AFT往外围琼脂中扩散时，围绕中心点将出现密布的回复突变的菌落。
本法作为一种生物学检验法广泛应用于开发安全、有用的化学物质和检测食品或农产品中AFT。
2．免疫学方法
AFT是分子量为312～346的二氢呋喃香豆素的衍生物，无免疫原性，不能引起抗体的产生，故必须与大分子化学基团或蛋白质偶联，成为完全抗原，方能引起免疫动物的抗体形成，然后利用血清学方法检测AFT
由于AFT的量一般都较低，因此，检测方法主要是敏感性较高的放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。近几年来，国外已成功制备了测定B1的酶联免疫测定盒及检测乳中Ml含量的RIA检测盒。这两种检测盒都十分方便，而且快速准确。
第十二节 赭曲霉菌及其毒素的检验赭曲霉毒素在自然界中分布广泛，多为重要的贮藏菌，可寄生在食品、粮食及饲料中并产毒。
一、赭曲霉菌及其毒素的种类
1．产毒菌及产毒条件
1）产毒菌：
赭曲霉毒素(Ochratoxin，OTC)的产毒菌有：赭曲霉，硫色曲霉、蜜蜂曲霉及鲜绿青霉、普通青霉等。
2）分离培养常用察氏培养基分离产毒菌；在谷物培养基中，以碎小麦为基质的产毒效果最好。
3）生长条件一般产毒霉菌在25～28℃，高湿度、阴暗静置条件下培养1～2周产毒效果较好。
2．OCT的种类及对食品的污染
1）、种类：赭曲霉毒素包括A、B、C（简称OA、OB、OC)等几种衍生物，其化学结构也类似香豆素。
2）、对食品的污染赭曲霉毒素可污染玉米、大麦、小麦，大米、荞麦、大豆 花生、棉籽等各种食品原料及其制品，火腿、鱼制品以及饲料也有一定程度的污染。
在谷物上20℃－25℃、含水率高于16％时污染更严重。污染饲料中的毒素在动物的肝、肾,脂肪中的蓄积较多，这是肉食污染的重要原因。
二、赭曲霉毒素的特性
1．理化特性
OCT是一种相当稳定的化台物，在乙醇溶液中置冰箱保存一年以上不破坏。
赭曲霉毒素微溶于水，溶于有机溶剂和稀的碳酸氢钵水溶液(如5％碳酸氢钠)中。
在紫外光下OA呈兰绿色荧光，OB呈兰色，OC呈亮绿色。
因OCT的分子量小，故无免疫原性，只有与蛋白质或多肽载体结合后，才能刺激机体产生相应抗体。
2．毒性
OCT中的OA的含量最高，且毒性最强，且主要侵害肾脏，是一种强烈的肾脏毒，当人和畜禽持续摄入含毒食物及饲料时，不仅会出现急性症状，也可形成严重的慢性中毒、致癌、致畸等。
1）急性毒性
OCT主要损害肾脏。病理变化包括肾小管萎缩，肾间质纤维化及肾小球透明样病变等。
2）慢性毒性
症状为肝脏可见实质细胞变性、透明变性、灶性坏死等，脾、淋巴结，扁桃体等组织也可观察到坏死性病变。
3）致癌性和致畸性
Broun等人用妊娠大白鼠作的实验证明有致畸性，蟹译等人用小白鼠作实验证明对肾脏有致癌性，按248～276ug／天持续投毒15周(总量为26—29mgOA)，即有肾细胞癌的发生。另外，给孕期7～12天的小白鼠腹腔注射5mg／kg体重的OA，出现胎鼠死亡率增加，胎鼠重量降低、畸形等。
三、OCT的检验
OCT酌检验方法与AFT基本相似，主要有生物学、化学和免疫学方法。
1．生物学方法
1）鸡胚试验(以OA为例)
将提取的OA用5％碳酸钠水溶液作不同倍数稀释，分别接种于5日龄的健康鸡胚气室内(或卵黄内)0．1ml，接种后每天观察鸡胚死亡情况直至21日龄。根据记录计算出LD50所需毒素量。
2）其它动物试验
用大白鼠，小白鼠。霰子，雏鸡、雏鸭等动物进行饲喂试验，均可检验OCT。
3）其它试验 也可利用抑菌试验、荧光反应、斑点试验等生物学方法检验OCT。
2．免疫学方法
1）抗体的制备(以OA为例)
OA为半抗原物质，必须与大分子载体结合后才具有免疫原性。将偶合抗原透析纯化与福氏完全佐剂乳化，免疫家兔即获得OA抗体。
2）检测
由于OCT在食品中含量都较低，用一般化学和生物学检测方法，常缺乏特异性或灵敏度不高，用免疫学检测法能克服这些缺点。
Michael(1983)利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大麦中的OA。另外，还采用斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)对OA进行了检测，也获得了满意的结果。
第十三节 镰刀菌及其毒素的检验
一、镰刀菌及其毒素的种类镰刀菌属的产毒菌主要有四种
1）第一种为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，此种菌一般侵染大米、麦类、玉米，产生的毒素为玉米赤霉烯酮等。
2）第二种为三线镰刀菌：本菌主要寄生于玉米和小麦上，可产生T-2毒素、玉米赤霉烯酮等；
3）第三种为梨孢镰刀菌：主要寄生于麦类和玉米上，产生T-2毒素，梨孢镰刀菌素等。
4）第四种为串珠镰刀菌：产生串珠镰刀菌素、赤霉菌素等。
由于镰刀菌侵染谷物的广泛性及严重性，以及该茵产生的毒素对人、畜健康的危害性。因此，镰刀菌及其毒素在国内外越来越引起人们的普遍重视。
二、毒素的特性
1、理化特性
玉米赤霉烯酮首先从赤霉病玉米中分离提取的，镰刀菌属的许多菌都产生本毒素，它又名F-2毒素、FES、RAL等。
T-2毒素是食品中酡一种重要的霉菌毒素，它主要由三线镰刀菌产生，梨孢镰刀菌等也可产生。
2．毒性
镰刀菌的毒素对人畜有强的毒害作用。
如玉米赤霉烯酮，随食品摄人机体后靶位点主要是生殖器官，还能通过胎盘屏障作用于胎儿，有此行激素的作用，主要可使畜、禽及啮齿类发生雌性激素亢进症。例如它可引起猪的发情综合症，对于妊娠牛和猪，可出现流产、死胎及畸胎。对锚匍鼠等也有类似的毒性。
T-2毒素随食品摄入机体后，其主要靶器官是消化道、造血系统、心脏、脾脏、子宫、淋巴结等。它能引起人食物中毒性白细胞缺乏症，内脏器官出血和骨髓造盘组织坏死，表现为恶心、腹痛、呕吐和全身无力等。
三．镰刀菌毒素的检验
l、样品的采集与处理
取样时要注意样品的代表性和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶、金属刀或勺等。样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。
粮食样品采集，可根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定点取样，即每屠的四角和中央分别采取部分样品混和后按四分法取样，每份不少于500g。少量存粮可使用金属小勺采取上、中、下各部位的混合样品。进口粮采样应在每一车、船采取表、上,中、下层4个样品。每层从5点取样混合：必要时采取有疑问的样品送检。
粮食加工食品(如面包等)，发酵食品、乳,肉、蛋、鱼及制品用灭菌工具采集可疑霉变食品25g，装入灭菌容器内检验。
2、检样方法
(1)形态学检查与分离鉴定
①镜检
霉变饲料直接涂片镜检阳性率不高，通常用培养在察氏培养基或玻片培养物作镜检。根据大型分生孢子的弯曲度(镰刀形弯曲——新月形)，顶端细胞(宽窄形状等)以及孢子的各种星态（镰刀形、纺锤形、披针形、新月形等)进行判断。
②分离培养将检样接种于察氏平板培养基中，每平皿接种玉米10粒，共种5个平皿。接种时，用镊子夹取玉米将胚部向下，轻轻压种于浅层，然后在22~C～28℃温箱中培养48小时，生长为茂盛的菌丝呈白色绒毛状，基质呈深肉色到红色，取菌丝做压滴标本镜检。
马铃薯培养基：生长茂盛，菌丝白。绒毛状，基质呈深绿色、黄褐色至红褐色。
米饭培养基：菌丝白色，绒毛状、生长茂盛，基质呈黄色到金黄色。
(2)毒素的提取和测定(以T-2毒素为例)
第十四节 青霉菌及其毒素的检样
一、青霉菌及其毒素的特性
青霉菌是属于曲霉科青霉属。
种类很多，分布很广，其中讦多菌株均能引起食品的霉烂，也有不少菌株能产生强烈的毒素。
黄绿青霉、桔青霉、冰岛青霉、扩展青霉、鲜绿青霉等，它们所产生毒素的毒性作用各异。
1．桔青霉素：
是一种能杀灭革兰氏阳性菌的抗生素，因其毒性太强，未能用于治疗。
本毒素主要得之于桔青霉、黄绿毒霉、鲜绿青霉等，它是“黄变米”中的霉菌毒素之一。桔青霉素为黄色针状结晶。
主要污染大米、小麦，大麦、燕麦和黑麦等。桔青霉素对小鼠经口LD50为110mg／kg。具有肾毒性，可使肾脏肿大、肾小管扩张、变性和坏死，有致突变性。
2．冰岛青霉毒素(1slanditoxin)
由冰岛青霉产剩，是“沤黄米”或“黄粒米”的主要原因。
“沤黄米”是稻谷未及时脱粒干燥而堆放，致使霉变．曳杠罕恍粒变黄。该毒素为含氯环状结构的肽类，无色针状结晶。
有快速肝毒性，染毒后短时间内即可引起肝脏空泡变性、坏死和肝小叶出血；小剂量长时间摄人，可使小鼠肝硬变、干纤维化和癌变。
3．黄绿青霉紊(Citreoviridin)
由黄绿青霉等产生，也是“黄变米”中的霉菌毒素之一。它是深黄色针状结晶。
它具有神经毒、肝毒性和血液毒。其神经毒具有嗜中枢性。
其慢性毒性主要表现于肝细胞萎缩和多形性及贫血。
二 检 验
1．样品的收集与处理 同镰刀菌
2．检验方法
(1)形态学鉴定
A桔青霉：
本菌属于不对称青霉菌，绒状青霉亚群，桔青霉系群。
在察氏琼脂培养基上于24－26度培养10－14天，菌落呈天鹅绒状，灰绿色，外缘呈白色，背面有黄色色素。外线照射下，可见黄色荧光。
B冰岛青霉：
属于双轮对称青霉群；
在察氏璋脂培养基上于室温培养两周，菌落通常具有显著的环带及轻微的放射性皱纹。背面溶出红褐色色素，带有色素颗粒。
分生孢于是卵圆形呈链状排列，壁厚、光滑，呈青灰色或灰绿色。
C 黄绿青霉：
属于单轮青霉群，在察氏琼指培养基上于室温培养12—14天，菌落呈天鹅绒状，中部隆起，有放射状大皱纹，灰绿色，最外侧呈白色。菌落上着生有黄色的水珠。背面溶出红黄色色素。在紫外光下照射菌落背面时可见黄色至棣棠花色的荧光。
显微镜下观察青霉菌的菌丝结构、孢子的形态及排列等特征。
(2)．毒素测定
食品卫生检验
第四章 食品中毒性微生物的检验
（8学时）
第一节 食品中毒概述第二节 沙门氏菌及其检验
第三节 致病性大肠杆菌及其检验第四节 变形杆菌及其检测第五节 志贺氏菌及其检测
第六节 葡萄球菌及其检验第七节 链球菌及其检验
适用专业：食品工程与科学
授课班级：食工2003（3）
授课教师,王 长 远
黑龙江八一农垦大学食品学院
2005年2月22日教 学 基 本 信 息教学单位
黑龙江八一农垦大学食品学院
主讲教师
王长远
职 称
助教
说 明
课 程
食品卫生检验
专 业
食品工程与科学
《食品卫生检验学》是食品科学与工程的选修课程。以食品的腐败变质与控制、食品微生物指标、食物中毒微生物的检验、常见病原微生物的检验为主要内容。
年 级
食工2003
班 级
食工2003（3）
学生人数
55
授课时间
2004-2005
第二学期
周 学 时
2
总 学 时
30
理论学时
20
实验学时
10
使用教材
食品微生物检验（刘兴友）
主要参考书
《食品卫生微生物检验标准手册》
《食品安全与卫生学》
第四章 食品中毒性微生物的检验
章节号
名称及内容
重点和难点
第一节 食物中毒概述第二节 沙门氏菌及其检验第三节 致病性大肠埃希氏菌及其检验第四节 变形杆菌类及其检验第五节 志贺氏菌及其检验第六节 葡萄球菌及其检验第七节 链球菌及其检验第八节 肉毒梭菌及其毒素的检验第九节 蜡样芽胞杆菌及其检验第十节 平酸菌及其检验第十一节 黄曲霉菌及其毒素的检验第十二节 赭曲霉菌及其毒素的检验第十三节 镰刀菌及其毒素的检验第十四节 青霉菌及其毒素的检验
常见的细菌性食物中毒的各种有毒细菌的生物学特征及其检测方法
教 学 进 度 计 划周次
学时
教 学 内 容
备 注
1
绪 论
1
微生物检验基本知识、常规鉴定技术
1
食品检验样品的采集与处理
1
食品微生物检验指标
8
食品中毒性微生物的检验
2
常见病原微生物的检验
2
肉与肉制品中的微生物及其检验
2
乳与乳制品中的微生物及其检验
2
罐头食品中的微生物及其检验
2
其它食品中的微生物及其检验
课 堂 教 学 计 划（2学时）
名 称
食物中毒的概述
沙门氏菌及其检验
目 的要 求
食物中毒的概念、分类以及特点，掌握沙门氏菌及其检验方法。
重 点难 点
食物中毒的特点，沙门氏菌的检验。
教 学 内 容 及 教 学 组 织
教学方法、手段及时间安排
第一节 食物中毒概述一、食物中毒的概念和分类
（一）、概念
（二）、食物中毒的分类
（三）、细菌性食物中毒
(四)细菌性食物中毒的临床特征二、微生物性食物中毒的特点
第二节 沙门氏菌及其检验
一、生物学特性二、致病性三、主要症状
四、流行病学特点五、检 验
主要通过讲授和演示等方式进行；采用先提问，引导学生探索，并逐步得出结论，互动式与启发式并用，讲练结合，注重理论与实践的结合。
课 堂 教 学 计 划（2学时）
名 称
致病性大肠埃希氏菌及其检测
变形杆菌及其检测
志贺氏菌及其检测
目 的要 求
掌握致病性大肠埃希氏菌及其检测、变形杆菌及其检测和志贺氏菌及其检测方法。
重 点难 点
致病性大肠埃希氏菌及其检测
教 学 内 容 及 教 学 组 织
教学方法、手段及时间安排
第三节 致病性大肠埃希氏菌及其检验一、生物学特性二、致病性
三、主要症状四、流行病学特点五、检 验第四节 变形杆菌类及其检验
一、生物学特性
二、致病性三、主要症状
四、流行病学特点五、检 验
第五节 志贺氏菌及其检验一、生物学特性
二、致病性
三、主要症状
主要通过讲授和演示等方式进行；采用先提问，引导学生探索，并逐步得出结论，互动式与启发式并用，讲练结合，注重理论与实践的结合。
课 堂 教 学 计 划（2学时）
名 称
葡萄球菌及其检测
链球菌及其检测
肉毒梭菌及其毒素的检验第九节 蜡样芽胞杆菌及其检验
目 的要 求
掌握葡萄球菌及其检测、链球菌、蜡样芽胞杆菌和肉毒梭菌及其毒素的检验。
重 点难 点
葡萄球菌、链球菌和肉毒梭菌的生物学特性及检测方法。
教 学 内 容 及 教 学 组 织
教学方法、手段及时间安排
第六节 葡萄球菌及其检验一、生物学特性二、致病性
三、临床症状：
四、流行病学特点五、检 验
第七节 链球菌及其检验一、生物学特性二、检 验第八节 肉毒梭菌及其毒素的检验一、生物学特性
二、致病性三、临床症状四、流行病学特点五、检 验
第九节 蜡样芽胞杆菌及其检验
主要通过讲授和演示等方式进行，讲练结合，列举事实，注重理论与实践的结合。
充分调动学生的积极性与学习的兴趣。
课 堂 教 学 计 划（2学时）
名 称
第十节 平酸菌及其检验第十一节 黄曲霉菌及其毒素的检验第十二节 赭曲霉菌及其毒素的检验第十三节 镰刀菌及其毒素的检验第十四节 青霉菌及其毒素的检验
目 的要 求
掌握平酸菌、黄曲霉菌及其毒素,赭曲霉菌及其毒素,镰刀菌及其毒素、青霉菌及其毒素的检验
重 点难 点
平酸菌、黄曲霉菌及其毒素、青霉菌及其毒素的检验方法。
教 学 内 容 及 教 学 组 织
教学方法、手段及时间安排
第十节 平酸菌及其检验一、生物学特性
二、检 验
第十一节 黄曲霉菌及其毒素的检验一、黄曲霉菌及其毒素的种类二、黄曲霉毒素的特性
三、黄曲霉毒素在食品中的允许含量标准四、检验第十二节 赭曲霉菌及其毒素的检验一、赭曲霉菌及其毒素的种类二、赭曲霉毒素的特性三、OCT的检验第十三节 镰刀菌及其毒素的检验第十四节 青霉菌及其毒素的检样
根据本节的特点，主要通过讲授等方式进行；采用先回忆提问，互动式与启发式并用。
第四章 食品中毒性微生物的检验第一节 食物中毒概述
一、食物中毒的概念和分类
（一）、概念食源性疾病：指通过摄食进入人体内的各种治病因子引起的、通常具有感染性质或中毒性质的一类疾病。
食物中毒：是指健康人经口摄人正常数量食品后，所引起的以急性病理过程为主的疾病。
微生物性食物中毒：食用被微生物或微生物毒素污染的食品而引起的中毒称为微生物性食物中毒。
发病原因多见于食用了食物中毒性微生物或其毒素，有毒化学物质，有毒生物组织(如甲状腺、脑垂体、肾上腺、毒鱼、有毒食用菌等)以及食品引起的变态反应等。
食物中毒属食源性疾病的范畴，是食源性疾病中最为常见的疾病。食物中毒步不包括因暴饮暴食而引起的急性胃肠炎、食源性肠道传染病(如伤寒)和寄生虫病(如旋毛虫病、囊虫病)，也不包括因一次大量或长期少量多次摄人某些有毒、有害物质而引起的以慢性毒害为主要特征的疾病。
（二）、食物中毒的分类
一般按病原物质，将食物中毒分为五类。
1．细菌性食物中毒 是指摄人含有细菌或细菌毒素的食品而引起的食物中毒。
2．真菌及其毒素食物中毒 是指摄人被真菌及其毒素污染的食物而引起的食物中毒
3．动物性食物中毒 是指摄人动物性中毒食品而引起的食物中毒。
4．有毒植物中毒 是指摄人植物性中毒食品引起的食物中毒。
5．化学性食物中毒 是指摄人化学性中毒食品引起的食物中毒。
（三）、细菌性食物中毒
细菌性食物中毒：
是指人们吃了被大量活的食物c霉些组瀛或绷嘘产生的毒素污染韵食品所引起的中毒现象。
近几年来统计资料表明，我国发生的细菌性食物中毒是食物中毒较为常见，其次为副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌食物中毒。细菌性食物中毒可分为感染型食物中毒、毒素型食物中毒和混合型食物中毒。
1．感染型食物中毒
指食物被污染并繁殖了大量食物中毒性微生物(包括病原菌和条件致病菌)，如沙门氏菌、致病性大肠杆菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、蜡样芽胞杆菌，魏氏梭菌、耶尔森氏菌、嗜盐菌、枯草杆菌及劈球菌等，这种含有大量活菌(一般含菌数在107个／g以上)的食物被摄入机体后，引起一系列消化道症状的现象，称为感染型食物中毒，此类中毒是由细菌本身引起的。
发病机制：病原菌随食物进入肠道，在肠道内继续生长繁殖，靠其侵袭力附于肠黏膜或侵入黏膜及黏膜下层，引起肠黏膜充血、白细胞浸润、水肿、渗出等炎性病理变化。某些病原菌如沙门氏菌进入黏膜固有层后可被吞噬细胞吞噬或杀灭，病原菌菌体裂解后释放出电壹塞，内毒素可作为致热源刺激体温调节中枢引起体温升高，亦可协同致病菌作用于肠黏膜，引起腹泻等胃肠道症状。
2．毒素型食物中毒
食物被能产生毒素的微生物如葡萄球菌、肉毒梭菌、魏氏梭菌等污染，并在适宜的条件下生长繁殖，产生了某种毒素，这种毒素同污染的微生物一起或单独随食物被摄人人体后，所引起的一系列中毒现象，称为毒素型食物中毒。
此种中毒主要是细菌产生的大量毒素所引起的，如葡萄球菌肠毒素，魏氏梭菌毒素引起的食物中毒及肉毒毒素引起的食物中毒等，均属于毒素型食物中毒。
3．混合型食物中毒
有的细菌性食物中毒。聂具有甚染型食物中毒的特征，又具有毒素型食物中毒的特征，称为混合型食物中毒。如魏氏梭菌,蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒。这种中毒在检验时，应特别重视对其毒素的测定。
副溶血性弧菌等病原菌，进入肠道除侵入黏膜引起肠黏膜的炎性反应外，还可以产生肠毒素引起急性胃肠道症状。这类病原菌引起的食物中毒是致病菌对肠道的侵入及其产生的肠毒素的协同作用，因此，其发病机制为混合型。
(四)细菌性食物中毒的临床特征
1．感染型食物中毒的临床特征
1）潜伏期短，一般几小时到24小时，平均为12小时左右，潜伏期长短主要与进入机体的细菌量及个体体质状况有关。
2）病程短，通常为1—3天，个别细菌可长达7～14天，如沙门氏菌3－7天、小肠结肠炎耶尔森氏菌为3—14天，溶血性链球菌为2—7天等。
3）发病症状以急性胃肠炎为主。
表现为恶心、呕吐、腹泻，体温升高、头痛等。从病人和原因食品中均可分离出相同的病原微生物。
2．毒素型食物中毒的临床特征
1）潜伏期长短不一，如金黄色葡萄球菌肠毒素所引起的中毒潜伏期为2—5小时； 肉毒素中毒潜伏期2小时到10天，甚至10天以上。
2）病程长短不一，如金黄色葡萄球菌毒素中毒能够迅速痊愈，而肉毒毒素中毒则恢复很慢，一般为2—3天，长的达2—3周。
3）胃肠型症状不明显．如葡萄球菌肠毒素所引起的中毒虽有频繁的呕吐、腹痛，但腹泻很少见，体温正常或微升高。 肉霉毒素所引起的中毒，虽然初期表现为恶心、呕吐，有时有腹泻，但其主要症状为痉挛 乏却坤经失调、分泌机能失调等神经症状和虚脱，出现不能抬头、瞳孔放大、光反应迟钝，言语困难、吞咽不易、呼吸不畅等。
(三)霉菌毒素性食物中毒
1、是指某些霉菌如黄曲霉菌、赭曲霉菌污染了食品，并在适宜条件下繁殖，同时产生了毒素，这些毒素达到一定量后，随被污染的食品一同摄人人体内而引起的食物中毒。
2、当霉菌毒素的量很小时，则不能引起食物中毒．但长期少量摄入某种霉菌毒素，则可导致癌症或发生“三致”（致癌、致畸、致突变）作用。
要禁止使用发霉的原料生产食品和使用发霉的饲料饲养动物。
二、微生物性食物中毒的特点
1．与饮食有关，不吃者不发病
2．引起中毒的原因食品除掉后，不再有新的患者发生
3．发病呈暴发性：
微生物性食物中毒和其他食物中毒一样，突然发生，根据食用原因食品的人数不同，可有数百人致数千人同时发病，而且表现的临床症状一致。
4．发病季节性强
一般多发生在4—10月份，6～9月进入高峰期，这主要与这段时间气温高、微生物易于生长繁殖和人们的饮食习惯(吃凉食，冷饮较多)有关。
5．中毒症状以急性胃肠炎为主，不具有传染性
微生物性食物中毒中经常发生的是细 菌性食物中毒，因此在症状上多数都具有恶心、呕吐、腹痛、腹泻等急性胃肠炎症状，而且不相互传染。
6．从病人和原因食品中均可检测到同样的病原微生物或微生物毒素
发生微生物性食物中毒时，都能从病人急性发病期的呕吐物、血液及后期的粪便中和引起中毒的食品中分离到同一血清型的微生物或微生物毒素。
三、引起微生物性食物中毒的原因
发生微生物性食物中毒的根本原因是食品受到了某些微生物或微生物毒素的污染，微生物污染的原因有内源性污染和有外源性污染，其中外源性污染是经常性的和主要的，概括起来主要有以下几个方面：
1．食品原料受到了污染
2．生产、加工、运输、销售及食用过程中的污染
3．加工方法不当
主要是某些大块食品在烧煮时时间太短或温度太低，不能足以杀死微生物，或油炸食品时中心未熟透等。
4．交叉污染
在食品制作时，发生了生熟食品交叉污染，如用盛放过生食品的容器、用具、刀板等与熟食品发生接触，而导致生食品中的某些微生物污染到熟食品上，这种熟品在食用前没有经过再加热或加热温度不足以杀灭污染的微生物。
5．工作人员的污染
接触食品的工作人员的个人卫生状况不良，如患有某种肠道传染病或带菌，则可以将这种病原微生物污染到食品上而导致食物中毒或食物感染。
四、微生物性食物中毒的预防
微生物性食物中毒常常给人类带来严重的危害。是食品卫生检验的重要内容之一。
1．严格执行有关法规
严格遵守国家颁布《中华人民共和国食品卫生法》和其他有关的条例、规定，以及各地区制定的各种规定与卫生要求．加强食品卫生的检验与监督工左。
2．严格防止食品污染
3．控制微生物在食品上的繁殖
一般食物中毒性细菌的最适生长温度在35+37℃；绝大部分在低温下即停止繁殖或缓慢繁殖，因此，低温贮存食品是控制污染微生物在食品上繁殖的重要措施。
4．杀灭污染食品中的微生物
杀灭食品中微生物的方法很多，如降低食品pH值、提高食品的渗透压(盐腌、糖溃)、采用紫外线照射或其它辐射线照射和加热灭菌等；其中加热灭菌法对微生物的杀灭最为彻底，这在食品罐头生产中已广泛应用。
5．加强食品卫生检验和宣传工作
第二节 沙门氏菌及其检验
沙门氏菌(Salmonella)可引起混合型的食物中毒。
一是内源性污染；
二是外源性污染。由于沙门氏菌的分布广，如果畜禽粪便污染了食品加工场所的环境或用具，就会造成食品在加工、运输、贮存、销售及动物屠宰等环节受到沙门氏菌的污染。一旦条件适宜，沙门氏菌就会迅速的生长繁殖，当菌数在食品中达到一定数量，被消费者食用后就会造成食物中毒，危害人的身体健康，甚至危及生命。
在微生物分类学中，沙门氏菌属是肠杆菌科的一个大属，包括2000多个血清型，它们在形态结构、培养特性、生化特性和抗原构造方面都非常相似，是一类形态短小的革兰氏阴性杆菌，主要寄居于人和其它温血动物的肠道中，可引起多种性质的疾病，根据沙门氏菌的致病范围，可将其分为三大类群。
第一类群：专门对人致病。如伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌,乙型副伤寒伤门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌。
第二类群：能引起人类食物中毒，称之为食物中毒沙门氏菌群，如鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、纽波特沙门氏菌等。
第三类群：专门对动物致病，很少感染人，如马流产沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌，此类群中尽管很少感染人，但近年也有感染人的报道。
沙门氏菌属（Salmonella）是一大群寄生于人类和动物肠道内生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌统称为沙门氏杆菌。1880年Eberth首先发现伤寒杆菌，1885年Salmon分离到猪霍乱杆菌，由于Salmon发现本属细菌的时间较早，在研究中的贡献较大，遂定名为沙门氏菌属。此菌可引起禽伤寒、鸡白痢、猪霍乱、鼠伤寒沙门氏菌、猪副伤寒、马流产沙门氏菌等疾病。致病性最强的是猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholerae)，其次是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)。
一、生物学特性
1、形态染色特性
革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌（比大肠杆菌细），（0.7～1.5um）×（2～5um）散在，无荚膜和芽胞，（除鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌外）都具有周身鞭毛，能运动，大多数具有菌毛，能吸附于宿主细胞表面或凝集豚鼠红细胞。
2．培养特性
1）需氧及兼性厌氧菌
2）在普通琼脂培养基上生长良好，培养24小时后，形成中等大小、圆形、表面光滑、无色半透明、边缘整齐的菌落，其菌落特征亦与大肠杆菌相似（无粪臭味）。
3）鉴别培养基（麦康凯、SS、伊红美兰）：一般无色菌落
4）三糖铁琼脂斜面：斜面为红色，底部变黑并产气。
3．生化特性
1）发酵葡萄糖，麦芽糖，甘露醇和山梨醇产气；
2）不发酵乳糖、蔗糖和侧金盏花醇；
3）不产吲哚、V-P反应阴性；
4）不水解尿素和对苯丙氨酸不脱氨。
伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌及一部分鸡白痢沙门氏菌发酵糖不产气，大多数鸡白痢沙门氏菌不发酵麦芽糖；除鸡白痢沙门氏菌、猪伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和仙台沙门氏菌等外，均能利用枸橼酸盐。
4．血清学特性
沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般沙门氏菌具有菌体(O)抗原、鞭毛(H)抗原和表面抗原(荚膜或包膜抗原)三种抗原，见表5-3。
1）O抗原（菌体抗原）
a存在于菌体表面，为脂多糖，多糖部分决定其特异性，
b性质稳定，耐热性强，100℃ 2h不破坏。
c一个菌体具有一种或多种不同的O抗原。
d沙门氏菌的O抗原共有65种，以阿拉伯数字1、2、3、4……代表,
2）、H抗原
a、H抗原存在于鞭毛中,不耐热，化学成分蛋白质，其抗原性可以被酒精所破坏。
b、H抗原可分为两相第1相：为特异相，用小写英文字母表示，a～z，Z以后则从z1、z2……，已编到z83。
第2相：为非特异相以阿拉伯数字表示，共7种。
具有第1相和第2相H抗原的细菌称为双相菌，大多数沙门氏菌属于此；仅有一相者称单相菌，如肠炎沙门氏菌。每一组沙门氏杆菌根据H抗原不同，可进一步分种或型。极少数无鞭毛菌两相抗原都不具有，称为无相菌，如鸡白痢沙门氏菌。H抗原刺激机体主要产生lgG抗体。
3） Vi抗原为包膜抗原少数沙门氏菌，如伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌的新分离菌株，常具有这种包膜抗原，经过几次传代、60C热处理或石炭酸处理后容易消失。
5、抵抗力
沙门氏菌属不耐热，55C 1h、60 C 15—30min即被杀死。
沙门氏菌属在外界的生活力较强，在10C～42C的范围内均能生长，最适生长温度为37C。最适生长的pH值为6.8—7.8。
在普通水中虽不易繁殖，但可生存2—3周。在粪便中可存活1—2个月。
在牛乳和肉类食品中，存活数月，在食盐含量为10％－15％的腌肉中亦可存活2—3个月。
烹调大块鱼、肉类食品时，如果食品内部达不到沙门氏菌的致死温度，其中的沙门氏菌仍能存活，食用后可导致食物中毒。冷冻对于沙门氏菌无杀灭作用，即使在-25℃低温环境中仍可存乏10个月左右。
由于沙门氏菌属不分解蛋白质，不产生靛基质，污染食物后无感官性状的变化，易被忽视而引起食物中毒。
6．毒素特性
沙门氏菌不产生外毒素，但菌体裂解时．可产生毒性很强的内毒素，此种毒素为致病的主要因素，可引起人体发冷、发热及白细胞减少等病症。
二、致病性
1、沙门氏菌经口进入人体以后，在肠道内大量繁殖，经淋巴系统进入血液，造成一过性菌血症，即感染过程。
2、随后，沙门氏菌在肠道和血液中受到机体的抵抗而被裂解、破坏，释放大量内毒素，使人体中毒，出现中毒症状。
三、主要症状急性胃肠炎。
潜伏期为6—12小时，最长可达24小时，病人临床表现为恶心、头痛、出冷汗、面色苍白，继而出现呕吐、腹泻、发热，体温高达38~C一40C，大便水样或带有脓血、粘液，中毒严重者出现寒战、惊厥、抽搐和昏迷等，此菌中毒死亡率较低。
四、流行病学特点
1．季节性特点 全年皆可发生，多见于夏、秋两季。5—10月发病起数和发病人数可达全年发病总起数和总人数的80％。
2．食品种类 沙门氏菌食物中毒的食品主要为动物性食品，特别是畜肉类及其制品，其次为禽肉、蛋类、乳类及其制品，由植物性食品引起者很少。
3．食品中沙门氏菌的来源 由于沙门氏菌属广泛分布于自然界，在人及动物，如家畜中猪、牛、马、羊、猫、犬，家禽中鸡、鸭、鹅等均有广泛的宿主，因此，沙门氏菌污染肉类食物的几率很高。
（1）家畜、家禽的生前感染和宰后污染。
(2)乳中沙门氏菌的来源。患沙门氏菌病的奶牛其乳中可能带菌，即使是健康奶牛的乳在挤出后亦容易受到污染。亦容易受到污染。
(3)蛋类沙门氏菌的来源。
蛋类及其制品感染或污染沙门氏菌的机会较多，尤其是鸭、鹅等水禽及其蛋类，其带菌率一般在30％一40％之间。家禽及蛋类沙门氏菌除原发和继发感染使卵巢、卵黄、全身带菌外，禽蛋在经泄殖腔排出时，粪便中的沙门氏菌污染肛门腔内的禽蛋蛋壳，并可通过蛋亮气孔侵入蛋内。
(4)熟制品中沙门氏菌的米源。
烹调后的熟制晶可再次受到带菌容器、烹调工具等污染或食品从业人员带菌者的污染。
(5)发病率及影响因素。
沙门氏菌食物中毒发病率较高，占总食物中毒的40％一60％，最高可达90％。沙门氏菌致病力强弱与菌型有关，致病力越强的菌型越易致病，猪霍乱沙门氏苗致病力最强，其次为鼠伤寒沙门氏菌，鸭沙门氏菌致病力较弱；对于幼儿、停弱老人及其他疾病患者等易感性较商的人群，即便是较少菌量或较弱致病力的菌型仍可引起食物中毒，甚至出现较重的临床症状。
五、检 验
食品中沙门氏菌的检验方法，应按《中华人民共和国国家标准——食品卫生检验方法(微生物学部分)》的沙门氏菌检验方法(GB4789．4-84)进行，其检验程序如图5-1。
（一）、增菌培养
冻肉、蛋品，乳品及其它加工食品首先需要进行前增菌。
1、取样25g (m1)，加入225ml缓冲蛋白胨水中。固体食品可先用均质器以8000～10000转／分打碎1分钟，或用乳钵加灭菌砂磨碎；粉状食品用灭菌匙或玻璃棒研磨使其乳化。
2、36+1℃培养4小时，移取10ml接种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42C培养18～24小时。同时，另取10ml，加入于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36+1℃培养18～24小时。
鲜肉，鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌，各取25g(m1)加入灭菌生理盐水25ml按上述方法做成匀浆，取其半量接种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42C培养18～24小时；另一半量接种于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36+1℃培养18—24小时。
（二）、分离培养
用铂金耳取一环增菌液分别划线接种于：
亚硫酸铋琼脂平板(BS)和DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、SS琼脂平板)各一个，于36+1℃分别培养18—24小时(DHL、HE、SS)或40—48小时(BS)。观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌属亚属工、Ⅱ、Ⅳ、V和Ⅲ型在各个平板上的菌落特征见表5-4。
（三）、生化试验
挑取选择性琼脂平板上的可疑菌落，接种于三糖铁琼脂培养基中。在三糖铁琼脂内，各菌属的主要反应结果如表5—5。
表5—5说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸同时H2S阴性的菌株可排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时均有不是沙门氏菌的可能，都需要作进一步的生化试验，必要时作涂片染色镜检(沙门氏菌为革兰氏阴性短杆菌)。
接种三糖铁琼脂的同时，还要接种蛋白胨水，pH7.2尿素琼脂、KCN培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管，于36+1℃培养18～24小时，必要时可延长至48小时，按表5-6判定结果。沙门氏菌的结果应属于Al、A2和Bl，其他五种反应结果均可以排除。
反应序号Al，典型反应判定为沙门氏菌属。如果尿素、KCN和赖氨酸三项中有一项异常，按表5-7仍可判定为沙门氏菌，如有两项异常，则按A3判定为枸橼酸杆菌。
（四）、血清学分型鉴定用分离出的沙门氏菌与已知A-F多价O血清及H因子进行玻片凝集试验。
1、抗原的准备
2、O抗原的鉴定
用A—F多价O血清做玻片凝集试验，以生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株；不能分型。
3、H抗原的鉴定
4、Vi抗原的鉴定
（五）、菌型的判定和结果报告
综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照常见沙门氏菌抗原表及其补充表判定菌型。并报告结果。
目前，对于沙门氏菌的检验技术已有很大进展．一些快速检验方法已有应用。如荧光抗体技术检验食品中沙门氏菌已在国际二得到公认，其些国家作为商品生产的荧光抗体试剂箱．即可应用于沙门氏菌的快速检验。我匡在这方面也取得一定的进展，如固相载体吸附免疫技术、免疫染色法，酶联A蛋白染色等快速检验方法均具有快速、方便、经济和准确等特点，还有许多新方法、新技术仍处在实验和研究阶段，有待于我们去研究探讨，以便更好服务于实践。
第三节 致病性大肠埃希氏菌及其检验
致病性大肠埃希氏菌是指能使人、动物(尤其是婴儿和幼龄动物)感染及人食物中毒的一群大肠杆菌。
在自然界中本菌分布广泛，主要寄居场所是人和其它温血动物的肠道中，是一类条件性致病菌。致病性大肠埃希氏菌的形态特点、培养特性和生化特性均与非致病性大肠埃希氏菌非常相似，以至难以区分，只能通过血清学的方法，从抗原结构的差异来区别。在致病性大肠埃希氏菌中，有些血清型能够引起人的食物中毒，有些血清型能够引起人的肠道内外感染。还有一些血清型的菌株能够使畜禽发病，危害畜牧业，降低畜产食品的质量。致病性大肠埃希氏菌可从饮用水，未消毒牛乳，病畜脏器、禽类及其人畜粪便污染的各种食品中分离出来。
致病性大肠埃希氏菌属主要分为五大类，首先根据发病机理分为三大类，
1、产毒素型大肠埃希氏菌(ETEC)，
2、侵袭型大肠埃希氏菌(EIEC)
3、肠道致病性大肠埃希氏菌(EPEC)
近来又提出另外两类
4、即出血性大肠埃希氏菌(EHEC)
5、肠粘附性大肠埃希氏菌(EAEC)
但是，致病性大肠埃希氏菌的致病性是一个很复杂的问题，也并非由某一方面的因素所决定。
致病性大肠埃希氏菌中，一般认为能产生耐热{ST)和不耐热(LT)肠毒素的两种菌株均可引起人的食物中毒。引起大肠埃希氏菌币毒的主要是一些动物性食品，如乳与乳制品、肉类、水产品等，牛和猪是传播这种病菌、引起中毒的主要原因。
1996年7月在日本就发生了大肠杆菌0157型引起的食物中毒，造成9017多人中毒，10人死亡，其原因与生食萝卜苗有关，其中92例并发出血性肠炎及出血性尿毒症。2001年，再江苏、安徽等地爆发的肠出血性大肠杆菌0157:H7食物中毒，造成177人死亡，中毒人数超过2万人。
如仔猪黄、白痢、猪水肿病、牛腹泻和败血症等均可由大肠杆菌引起。
一、生物学特性
1．形态与染色特性
菌体两端钝圆、中等大小，杆状(有时呈卵圆形)、1—3um X 0.6um、周生鞭毛，能运动，不产生荚膜，革兰氏阴性，而且一般是对碱性染料着色较好，但有时两端着色较浓，要与巴氏杆菌区分开来。
2．培养特性
1)需氧及兼性厌氧菌
2)对营养的要求不高，在普通琼脂上就生长良好，在15C-45℃范围内均可生长，但最适生长温度为37℃，最适pH为7.2—7.4。
3)在普通琼脂平板上培养24小时，可形成圆形、凸起、光滑、湿润、半透明、边缘整齐、中等大小的菌落．其菌落与沙门氏菌比较相似，但是，大肠杆菌菌落对光(45角折射)观察可见荧光。
4)在肉汤培养基中生长18～24小时变为均匀浑，而后底部出现粘性沉淀物，并伴有 臭味。
5）部分菌落可出现β溶血。
6）在远藤琼脂上长成带金属光泽的红色菌落
7）在S．S琼脂平板上多不生长，少数生长的细菌，也因发酵乳糖产酸而形成红色菌落；
8）在伊红美兰琼脂上形成具有金属光泽的黑色菌落
9）在麦康凯琼脂上培养24小时后孤立菌落呈红色
3．生化特性
1）可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，有些不典型的菌株不发酵或迟缓发酵乳糖；
2）不同菌株对蔗糖，卫矛醇、水杨苷发酵结果不一致。
3）本菌可使赖氨酸脱鞍、不能使苯丙氨酸脱羧。
4）不产生H2S，不液化明胶，不分解尿素，
5）、不能在氰化钾培养基上生长，靛基质试验阳性，V-P试验阴性，不利用枸橼酸盐。后四项生化特性是典型的大肠埃希氏菌，与此不一致的即为非典型大肠埃希氏菌菌。
IMViC试验：如IMViC试验为+、+、-、-，且乳糖发酵，表明被检物已有粪便污染，有发生肠道传染病的危险，这是卫生细菌中常用的检测指标。（I：吲哚形成试验，M：甲基红试验，Vi：V-P试验，C：枸橼酸盐利用试验）
4.血清学特性
大肠埃希氏菌的抗原构造主要由菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)和荚膜抗原(K)三部分组成。
1）O抗原
成分为细胞壁上的糖、类脂和蛋白质复合物，也是细菌的内毒素，热稳定性较强，高压蒸汽处理2小时不被破坏。每一血清型只含有一种O抗原，本菌已发现有167种O抗原，分别以阿拉伯数字表示。
2）H抗原
为蛋白质；一种大肠埃希氏菌只有一种H抗原，无鞭毛则无H抗原，H抗原能在80度被破坏，也能被酒精破坏。H抗原共有64种。
3）K抗原
是细胞外部的荚膜或的表面物质，又称包膜抗原。新分离的大肠埃希氏菌70％具有K抗原。根据K抗原耐热的敏感性．可把K抗原分为A、B、L三类，共有103种，致病性大肠埃希氏菌的抗原主要为B抗原，少数为L抗原，B抗原与L抗原均可在煮沸后被破坏，A抗原耐热性强，可耐受煮沸1小时而不被破坏。,
O抗原可将大肠埃希氏菌分成若干血清群，再根据K抗原和H抗原进一步分为若干个血清型或亚型，根据大肠埃希氏菌抗原的鉴定结果，写出其抗原式如O111：K58(B)H12，一般认为H抗原与致病性无关，因此，一般不需要进行H抗原的鉴定。
5．抵抗力
抵抗力中等，各菌型之间存在差异。此菌对青霉素有中等抵抗力，对一般消毒剂都比较敏感。对氯尤为敏感，水中游离氯达到0．2mg／L时，即可杀死此菌。此菌在土壤中、水中及粪便中可存活数月以上。
6．毒素特性
有些大肠埃希氏菌产生肠毒素，
1）不耐热(LT)肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT）：化学成分为蛋白质，分子量较大，60℃ 30分破坏，具有免疫原性，可引起肠道分泌增加，出现腹泻。
（2）、耐热肠毒素（heat-stable enterotoxin，ST）：分子量较小，无抗原性，100℃ 30分钟，仍有活性，可引起肠分泌增加。
二、致病性
致病性大肠埃希氏菌属引起酌食物中毒主要有两种类型，一种是肠道内感染，另一种是肠道外感染，两者具有不同的机理和症状,
1．肠道内感染
1）、肠毒素型大肠杆菌（ETEC）：主要引起腹泻（幼畜或雏鸡），约有40个血清型。肠毒素型菌株进入肠道后主要在小肠内繁殖，不损害肠上皮细胞。繁殖过程中产生肠毒素。
2）、肠致病型大肠杆菌（EPEC）：是引起婴儿腹泻的主要病原菌，该菌不产肠毒素，也无侵袭力，致病机理不清，约有18个血清型。
3）、肠侵袭型大肠杆菌（EIEC）：较少见，该菌不产肠毒素，但侵袭大肠肠壁上皮细胞，引起炎症反应，形成溃疡，约有8个血清型。引起类似痢疾的症状。
2．肠道外感染
三、主要症状肠道内感染主要造成腹泻与痢疾样疾病；肠道外感染主要引起尿路感染，新生儿脑膜炎、败血症及其他部位的感染。
致病菌引起的食物中毒是感染型和毒素型的综合作用，致病性大肠杆菌引起的食物中毒主要症状为急性肠胃炎，潜伏期为12～24小时，临床出现呕吐、腹泻、发热(体温一般不超过39℃)、头痛、腹痛等，病程一般为1—3天。
四、流行病学特点
1、发病季节 多发生在夏秋季
2、引起中毒的食品种类
与沙门氏菌相同。
3、食品种大肠埃希氏菌的来源
由于大肠杆菌存在于人和动物的肠道中，健康人肠道致病性大肠埃希氏菌率为2—8％，高者达44％，而成人患肠炎、婴儿患腹泻时，致病性大肠埃希氏菌率较健康人高，达29—52％。大肠杆菌随粪便排出而污染水源和土壤，进而直接或间接污染食物。
五、检 验
致病性大肠埃希氏菌的检验应按《中华人民共和国国家标准——食品卫生检验方法(微生物学部分)》(GB489．6-84)的有关内容进行检验。其检验程序如图5－2。 ·
（一）、增菌培养
1、以无菌操作的方法称取样品25g，加入225ml营养肉汤培养基中，可用灭菌砂在研钵中磨碎或以均质器打碎样品。
2、取适量接种于乳糖胆盐培养基中，测定大肠菌群MPN，其余移入500ml三角瓶中于36±1℃培养6小时。挑取一环，接种于一管30ml肠道菌增菌汤中，42℃增菌培养18小时。
（二）、分离培养
1、将乳糖胆盐发酵阳性管液与增菌液分别划线接种于麦康凯或伊红美兰琼脂平板上。
2、于36±1℃培养18—24小时观察菌落对于污染严重的食品可直接按划线法接种，不经过增菌过程。
（三）、生化试验
1、初筛试验
选取在麦康凯或伊红美兰平板上发酵乳糖或不发酵乳糖的菌落5个以上，分别接种于克氏双糖铁、pH7.2尿素和阿拉伯糖中．经36C培养18～24小时，弃去H2S阳性或尿素酶阳性或阿拉伯糖阴性的培养物。
2、复筛试验
把筛留下的培养物分别接种于缓冲葡萄糖蛋白胨和KCN培养基中，经36+1℃培养48小时，观察生长结果并做V-P试验，弃去V-P阳性及KCN阳性的培养物。
3、证实试验
致病性大肠埃希氏菌属除氧化酶阴性，革兰氏阴性的特征以外，还有以下特性：葡萄糖产酸+，葡萄糖产气+／一，乳糖产酸+90％，柠檬酸盐—，尿素酶一，KCN-，V-P-，动力+或—，阿拉伯糖十，靛基质十95％：可按这些主化特性进一步证实其是否为致病性大肠埃希氏菌属。
（四）血清学试验
1、致病性大肠埃希氏菌血清学试验
假定试验：
从平板上选菌落生长稠密处挑取培养物，用致病性大肠埃希氏菌三种OK多价血清做玻片凝集试验。不凝集的培养物可做阴性报告。
证实试验,
2、侵袭性大肠埃希氏菌血清学试验
在平板上菌落生长稠密处挑取培养物，用侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清做玻片凝集试验，侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清包括两种：OK多价血清和9种OK单价血清：
（五）、产肠毒素大肠埃希氏菌毒素试验
1、动物试验
将经过生化证实试验的大肠埃希氏菌培养物接种肉汤管，于36+1℃培养24小时，3000转／分离心30分钟。取上清液用G6滤器过滤后分作两份，一份加热60℃30分钟，供ST测定用，另一份不加热，供LT测定用。
1）家免结轧回肠段试验：
取体重为2kg的家兔，禁食使肠内容物排空。麻醉后剖腹，取出回肠段，按10～15cm为一段，分段结扎，取一段注射肉汤2mL作为阴性对照，另一段注射已知产毒菌肉汤培养物的上清液2ml作为阳性对照。其他各段分别注射待试菌株肉汤培养物的滤液2mL。将腹壁缝合。
测定LT时，于注射后18小时剖腹检查测定ST时，于注射后6—8小时剖腹检查取出肠管分别抽取肠段的积液，测定其容量，并测定肠段的长度。积液量(mL)与肠段长度(cm)之比大于l者为阳性。
2）乳鼠灌胃试验：
2、双向琼脂扩散试验
将被检菌按5点环形接种于Elek氏培养基上，以同样操作共做两份，36±1℃培养48小时，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素纸片，36+1℃经5—6时，使抗生素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的园并用一滴琼脂垫底。在一份平板的孔内滴加LT抗毒素30ul，另一份平板的孔内滴加ST毒素30ul。放于36+1℃经15～20小时观察结果，在菌斑和抗毒素之间出现白色沉淀带为阳性，无沉淀带者为阴性。
（六）豚鼠角膜试验
供测定侵袭性大肠埃希氏菌用，将经过生化证实试验的待试菌株18—20小时琼脂培养物，用肉汤洗下，使成每lml含菌9亿个菌悬液，作为接种材料。
体重400--500g的健康豚鼠(角膜与结膜外观正常，并经细菌培养检查)的角膜上接种待试菌悬液1滴。
48小时后观察结果，结膜充血浮肿、角膜混浊、眼内充盈泪液或浆液性分物者为阳性，自结膜囊取样分离细菌，鉴定应与原接种菌一致。
（七）、结果报告
根据以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验和豚鼠角膜试验的结果出报告，如果是产毒大肠埃希氏菌时应有肠毒素试验的结果；如果是侵袭性大肠埃希氏荫应有豚鼠角膜试验和血清学试验的结果；如果是肠致病性大肠埃希氏菌时应有血清学试验结果。
第四节 变形杆菌类及其检验
变形杆菌类为有动力的革兰氏阴性杆菌，包括变形杆菌属、普罗菲登属和摩根氏菌属。变形杆菌属分为普通变形杆菌(P．vulgaris)、奇异变形菌(P．mirabilis)、产粘液变形杆菌(P．myxofaciens．)和潘氏变形杆菌(P．pennea)。普罗菲登斯菌属共有5个种。摩根氏菌属只有一个种，即摩根氏菌(Morganella morganii)。
变形杆菌类是腐物寄生菌，自然界中广泛分布，水、土壤、腐败有机物中以及动物肠中都有存在，是一种条件致病菌，这种活菌在肉品上大量繁殖，被人摄食后进人人体，在条件适合时，就有可能引起食物中毒。所以只从样品中检出变形杆菌并无实际意义，只有变形杆菌类严重污染的食品被人摄食后，才能引起食物中毒。
检验变形杆菌引起的食物中毒时，不仅要分离鉴定变形杆菌而且还要检验变形杆菌在每克食品中的最近似数。
4起中毒事件概况
1.1 2003年4月18日，康乐县苏集乡古洞沟村一村民在家举行宗教活动，参加活动的66人就餐后发生食物中毒。经及时救治，未发生死亡。对所食鸡肉和烩菜进行检验,检出变形杆菌；
1.2 2003年4月18日，广河县阿里麻土乡古城村一村民在家举行宗教活动，参加活动的90人就餐后有62人发生食物中毒。经及时救治，未发生死亡。对所食羊肉进行检验，检出变形杆菌；
1.3 2003年5月16日，康乐县白王乡老树村一村民宰杀病畜分食，30人发生食物中毒，未发生死亡。经采样检验，检出变形杆菌；
1.4 2003年5月26日，和政县梁家寺乡宋家沟村一清真寺举行宗教活动，参加活动者集体就餐，115人发生食物中毒，无死亡。经采样检验，检出变形杆菌。
一、生物学特性
1．形态与染色特性
变形杆菌是一类大小、形态不一的细菌，有时球形，有时丝状，呈明显的多形性，周身鞭毛，能运动，无芽孢荚膜，革兰氏阴性。
2．培养特性
1）需氧及兼性厌氧
2）对营养要求不高，在普通琼脂上生长良好，
3）在固体培养基上普通和奇异变形杆菌常扩散生长，形成一层波纹薄膜，叫做迁徙生长现象。
4）变形杆菌最适生长温度为20~C，在10C――43~C均可生长
5)在琼脂上形成圆形、扁平，半透明的无色菌落，易与沙氏门菌菌落混淆，本菌有溶血现象，在肉汤中成均匀混浊生长，表面可形成菌膜。
6) 在SS平板上可以形成圆形、扁薄、半透明的菌落，易与其它肠道致病菌混淆。
3．生化特性
本族细菌苯丙氨酸脱羧酶为阳性，它们发酵葡萄糖产酸及少量气体，对果糖、半乳糖与甘油的发酵能力不一致，甲基红试验(MR)阳性。对左旋伯胶糖、糊精、卫矛醇、肝糖，菊糖、乳糖、山梨醇和淀粉无作用。除奇异变形杆菌外，都产生靛基质(引哚)，能在KCN培养基上生长。各种变形杆菌和普罗菲登斯菌的生化特性如表5-12所示。
4．血清学特性
变形杆菌的抗原结构较复杂，均含O抗原和H抗原，所以可根据所含O抗原和H抗原来确定它的菌型。普通变形杆菌和奇变形杆菌分为49个O抗原，19个H抗原；摩根氏变形杆菌分为34个O抗原和25个H抗原；雷极氏变形杆菌分为34个O抗原和26个H抗原。普通变形杆菌和奇异变形杆菌O抗原和H抗原如表5—13。
5．抵抗力
本菌的抵抗力中等，对巴氏灭菌及常用消毒剂敏感。
6．毒素特性
变形杆菌能产生肠毒素，化学成分为蛋白质和碳水化合物的复合物，具有抗原性．引起中毒性胃肠炎。
二、致病性
1、一种是摄入含有大量变形杆菌的食物后，变形杆菌进入人体胃肠道中，先在小肠内生长繁殖，从而引起感染。同时，变形杆菌还能够产生肠毒素，这种肠毒素就会引起人的中毒性胃肠炎；
2、另一种是由于摩根变形杆菌产生很强的脱羧酶，在这种脱羧酶的强力催化下，食品中的组氨酸脱羧生成组胺，从而使人体产生过敏型中毒。
三、主要症状变形杆菌类食物中毒是最常见的一种食物中毒，尤其是熟肉类和凉拌菜，以及因吃病死畜肉而引起的食物中毒的事例更是常有发生。这种食物中毒潜伏期短，一般为3－4小时，主要症状为恶心、呕吐、腹痛剧烈如刀割、腹泻、头疼、发热、全身无力等，腹泻一日数次，多为水样便、有恶臭、少数带粘液。病程较短．一般为1－3天。
摩根氏菌往往能引起过敏反应，潜伏期一般为30—40分钟，也可短至5分钟或长达数小时，主要表现为颜面潮红、酒醉状、头疼、荨麻疹、血压下降、心博过速等，有时也伴有发热、呕吐、腹泻等症状，多在12小时内恢复。水产品引起的中毒多为此类。
四、流行病学特点
1、季节性特点
全年均可发生，大多数发生在5－10月，以7－9月常见。
2、食品的种类
主要是动物性食品，特别是熟肉以及内脏的熟制品。熟制品被变形杆菌污染通常无感观形状的变化，极易引起食物中毒。
3、食物中变形杆菌的来源
广泛存在自然界。生的肉类食品，尤其动物内脏变形杆菌带菌率较高，在食品烹调加工是，处理生、熟食品的工具、容器未严格分开，可污染熟制品。或食用前未加热或加热不彻底，食后即引起食物中毒。
五、检 验
食品中变形杆菌的检验主要分五个步骤即：分离培养、生化鉴定、血清学检查、变形杆菌菌数的测定、动物试验。
1．分离培养
将所取样品分别划线接种于肠道菌选择培养基(S，S琼脂或D·C琼脂)及鉴别培养基(伊红美兰琼脂或麦康凯琼脂)平板各一个，在37~C的条件下培养18—24小时后，观察菌落特征，变形杆菌的菌落特征是：在鉴别培养基上为无色透明，有的蔓延生长，有的不蔓延生长，在选择培养平板上形成单个菌落，有的菌落边缘呈扩散状，对光观察，菌落周围淡蓝色中心稍厚，打开平皿时有臭味，有粘性，选出可疑菌落，在平皿底部做好标记。
2．生化试验
选择可疑菌落接种于苯丙氨酸琼堕斜面(爱德华氏改良培养基)，37~C培养6—8小时后观察结果，如果苯丙氨酸琼脂斜面变为棕黑色，则为苯丙氨酸脱羧酶阳性，经革兰氏染色镜检，如为革兰氏阴性杆菌，可初步判定为变形杆菌。
3．血清学检查
4．变形杆菌菌数的测定
菌数的测定方法是将检样在研钵中研磨制成悬液后，以生理盐水对原样品进行l：100，1：1000，1：10000，l：100000等稀释度的稀释。然后以移液管分别移取每种稀释度的悬液0.1ml接种于琼脂斜面底部的凝结水内，但勿接触培养基斜面表面。在37~C条件下培养24—48小时，观察生长状况。变形杆菌可自下而上弥漫生长，以出现生长的最高稀释度乘以10，则为每克检样中变形杆菌的最近似数。，
5．动物试验
把检样中分离纯化出的变形杆菌培养物，分别饲喂小白鼠或豚鼠、家兔等供试动物，如供试动物出现寒战、竖毛、腹泻等中毒症状则进一步证实为变形杆菌。
第五节 志贺氏菌及其检验
志贺氏菌属即通称的痢疾杆菌，为一类能时人和猿产生痢疾疾病的革兰氏阴性杆菌。志贺通常志贺氏杆菌(Bacillus，shigae)仅指I型痢疾志贺氏菌。志贺氏杆菌是日本志贺诘在1898年首次分离得到的，因此而得名。
志贺氏菌属有四个血清组，即A。 B、C,D。
(1)A群:又称痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae),通称志贺氏痢疾杆菌。不发酵甘露醇。有12个血清型，其中8型又分为三个亚型。
（2）B群：又称福氏志贺氏菌（Sh.flexneri），通称福氏痢疾杆菌。发酵甘露醇。有15个血清型（含亚型及变种），抗原构造复杂，有群抗原和型抗原。根据型抗原的不同，分为6型，又根据群抗原的不同将型分为亚型；X、Y变种没有特异性抗原，仅有不同的群抗原。
（3）C群：又称鲍氏志贺氏菌（Sh.boydii），通称鲍氏痢疾杆菌。发酵甘露醇，有18个血清型，各型间无交叉反应。
（4）D群：又称宋内氏志贺氏菌（Sh.sonnei），通称宋内氏痢疾杆菌。发酵甘露醇，并迟缓发酵乳糖，一般需要3～4天。只有一个血清型。有两个变异相，即Ⅰ相和Ⅱ相；Ⅰ相为S型，Ⅱ相为R型。
一、生物学特性
1．形态与染色特性
本属细菌为两侧平行、末端钝圆的短杆菌,2－3umX0.5—0.7um与其他肠道杆菌相似。无荚膜，无鞭毛，不形成芽孢，革兰氏阴性，个别菌带有菌毛。
2．培养特性
1)需氧或兼性厌氧，但厌氧时生长不很旺盛。
2)对营养要求不高，在普通琼脂培养基上易于生长。
3)在10℃一40℃范围内可生长。最适温度为37℃左右。最适pH值为7．2。
4）在固体培养基上，培养18－24小时后．形成圆形、隆起、透明，直径2—3mm、表面光滑、湿润、边缘整齐的菌落。
3．生化特性
A亚群一般不发酵甘露醇，除少数以外，一般不发酵乳糖、蔗糖和棉子糖。A群从不发酵山梨醇和阿拉伯糖，由此可以与其它血清型相区别。
B亚群细菌发酵甘露醇，不发酵乳糖，偶尔有迟缓发酵蔗糖的菌株。B亚群中的6型又可分成鲍氏—88、曼彻斯特、新城三个生化亚型。
C亚群为发酵甘霹醇产酸但不产气的菌株，不发酵乳糖、蔗糖、棉子糖； ·
D亚群菌迟缓发酵乳糖，迅速发酵甘露醇、阿拉伯糖和鼠李糖，但不发酵卫矛醇和山梨醇。
志贺氏菌的靛基质试验结果及其他生化特性如表5—14。 ；·
4．血清学特性志贺氏菌四个亚群各具有不同的抗原构造，都是由菌体抗原(O)及表面抗原(K)所组成。B亚群细菌的抗原关系比较复杂，根据各血清型的群抗原和型抗原构成的不同，尚可再分为亚型，如1型可分为1a亚型和1b亚型等。B亚群有6个血清型，连同亚型X、Y两个变种共13种不同的抗原构造。
5．抵抗力
抵抗力较弱，在一般情况下。
本属细菌在染菌的衣物中，室温暗处可存活5～46日在泥土中，于室温暗处可存活9—12日，自然污染的粪便，如使之保持碱性并湿润，可在其中存活很多天，但如有大肠杆菌或其它产酸菌活动时，数小时便可死亡，在水里可存活数月，在－2℃的冰块中可存活53日，其中宋内氏志贺氏菌比福氏志贺氏菌2a型存活数多。
在猪肉、米、面等食品中，志贺氏菌的增殖率随温度上升而增加，在37~C比在10℃的增殖数量约高一万倍。
志贺氏菌经55℃加热1小时、或0．5％石炭酸作用6小时或1％石炭酸作用15～30分钟即可杀死。
6．毒素特性
志贺氏菌既可产生内毒素和外毒素。
内毒素是一种耐热性肠毒素，其化学成分为脂多糖和蛋白质复合物，并与菌体的O抗原相当。在实验动物(小自鼠、大白鼠)体内，可引起腹泻,白细胞减少，发热、肝糖原下降等。
外毒素也叫神经毒素，是不耐热的蛋白质，经80~C加热1小时即被破坏。仅痢疾志贺氏菌和部分舒密次杆菌产生此种毒素。以家兔最为敏感，人的中毒剂量为 0．00006mg，外毒素主要作用于小血管，使小白鼠和家兔出现神经症状，使大白鼠和家兔出现肠道水肿和出血，使地鼠出现肺水肿和胸腔出血，而一般豚鼠对其具有抵抗力。
二、致病性
志贺氏杆菌是侵入性细菌，只需千个、百个、甚至几个就可能引起疾病发生，与大肠埃希氏菌不同。后者需要食入大量细菌才会引起中毒。
菌体进入体内后侵入空肠粘膜上皮细胞繁殖，产生外毒素，菌体破坏后产生内毒素作用于肠壁、肠壁粘膜和肠壁植物性神经。
三、主要症状潜伏期一般为10—20h，短者6h，病人会出现剧烈的腹痛、呕吐及频繁的腹泻，并伴有水样便，便中混有血液，发热，体温高者可达40度以上，有的病人出现痉挛。
四、流行病学
1、季节性特点
多发生于7－10月。
2、食品的种类主要是凉拌菜。
3、食品被污染和中毒发生的原因本菌携带者或食品加工、集体食堂、饮食行业的从业人员患有痢疾时，手时污染食品的主要因素。熟食品被污染后，存放在较高的温度下，志贺氏菌大量繁殖，食后引起中毒。
五、检 验志贺氏菌检验程序(GB4789．5-84)如图5-5。
1、临床特点符合志贺氏菌食物中毒流行病学特点，病人有类似痢疾样症状，粪便中有血液等。
2、采样按照采样原则对食品进行采集。如果有食物中毒，可从剩余食物、病人吐泻物分离志贺氏菌。
3、增菌
称取样品25g加入到装有225ml GN增菌液的500mL三角瓶中，如果是固体食品应用均质器以8000~10000转／分打碎1分钟，或用研钵加灭菌砂磨碎。粉状食品用灭 菌金属匙或玻璃棒研磨使其乳化。在36+1℃的条件下培养6～8小时。
4、分离培养
用接种环挑取增菌液1环，划线接种于HE平板或S．S琼脂平伴一个，麦康凯琼脂平板或伊红美兰琼脂平板一个，于36±1℃培养18—24小时。志贺氏菌在这些培养基上出现无色透明不发酵乳糖的菌落。
5、生化试验
挑取平板上的可疑菌落；接种三糖铁和半固体培养基各1管。志贺氏菌在三糖铁培养基中表现为底层产酸、不产气，斜面声碱，不产H2S。无动力，固体管内沿穿刺线生长。
4、血清学试验
挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用四种志贺氏菌多价血清检查。
5、快速诊断法
1．荧光菌球法：适于检查急性菌痢的粪便标本。将标本接种于含有荧光素标记的志贺氏菌免疫血清液体培养基中，37℃培养4～8小时。如标本中有相应型别的痢疾杆菌，繁殖后与荧光素抗体凝集成小菌球，在低倍或高倍荧光显微镜下易于检出。方法简便、快速，有一定的特异性。
2．协同凝集试验：用志贺氏菌的lgG抗体与富含A蛋白的葡萄球菌结合，以此为试剂，测定患者粪便滤液中志贺氏菌的可溶性抗原。
第六节 葡萄球菌及其检验
葡萄球菌在自然界中广泛存在于空气、土壤、水及物品上，特别是人和家畜的体表及外界相通的腔道检出率都相当高。
可分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生性葡萄球菌。葡萄球菌常引起人及动物组织器官脓肿、创伤化脓及败血症、食物中毒。其食物中毒主要是金黄色葡萄球菌引起，是由该菌产生的肠毒素引起的，通常是通过患病的动物产品以及患化脓创的食品加工人员及环境因素引起食品污染，如果条件适宜，就有毒素产生，12小时能产生足以引起中毒的量。这些污染食物被人食用后，则会引起食物中毒。
一、生物学特性
1．形态与染色特性
革兰氏阳性菌，为圆球形，直径为0．4～1。2um，大小不一，无鞭毛、无芽胞，一般不形成荚膜，易被碱性染料着色。致病性的葡萄球菌较非致寄性的葡萄球菌菌体小，在固体培养基上繁殖时堆积成葡萄串状。
但衰老、死亡或被白细胞吞噬的菌体，染色特性发生逆转，革兰氏染色为革兰氏阴性。
2．培养特性
1）为需氧或兼性厌氧菌，在含有二氧化碳20％～30％的环境中有利于毒素的产生。
2）营养要求不高，在普遍培养基上生长良好。培养18～24小时后，可形成圆形、凸起、边缘整齐，表面光滑、湿润有光泽、不透明的中等大菌落；葡萄球菌在固体培养基上生长，不同的菌株产生不同的颜色，据颜色不同而将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌，白色葡萄球菌、柠檬色葡萄球菌。该菌产生的色素为脂溶性的。
在含有血液、血清或葡萄糖的培养基上生长更好。本菌生长的最适温度为37℃．最适pH为7.4。
4）该菌耐盐性强，在含10％一15％氯化钠培养基中亦能生长，故可用高盐培养基分离全黄色葡萄球菌。
5）鲜血琼脂平板形成较大的菌落；多数菌株能产生溶血素而使菌落周围出现溶血环。非致病菌则无此现象。
6）Baird-parker氏琼脂
圆形、光滑、凸起、湿润，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带并在其外层有一透明带。
3．生化特性葡萄球菌的生化反应不规则，大多数菌株能分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖产酸不产气。金黄色葡萄球菌在厌氧条件下分解甘露醇产酸，非致病性菌则无此现象。
根据葡萄球菌的生化特性不同及产生的毒素及细胞结构的差异，可将该菌分为三种，即金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生性葡萄球菌。
4．抗原特性
葡萄球菌的抗原结构较复杂，细胞壁经水解后，用沉淀法可得到两种抗原成份：即蛋白质抗原和多糖类抗原；
1）、蛋白质抗原
(1)、为细胞壁表面上的一种蛋白质，称为葡萄球菌A蛋白(Staphylococcald protein A,SPA)，位于菌体表面，与胞壁的粘肽相结合。
(2)、完全抗原，具有种属特异性，无型特异性。
(3)、所有来自人的菌株均含有SPA，而来自动物的菌株则少见。
(4)、SPA 可与IgG的Fc片段结合。它与人及多种哺乳动物血清中的lgG的 Fc 段结合，因而可用含SPA的葡萄球菌作为载体，结合特异性抗体，进行协同凝集试验，可作快速的诊断方法。
2）、多糖抗原
(1)、半抗原；
(2)、具有型特异性，可用此抗原将葡萄球菌分为三个型(A、B、C型)。金黄色葡萄球菌目前主要采用噬菌体进行分型，共分成5个群(组)23(23)个型。
金黄色葡萄球菌除具有以上特性外，其在生长繁殖过程中还产生很多毒素和酶，其中主要有溶血毒素、肠毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶、DNA酶、耐热性核酸酶和透明质酸酶等。
5．抵抗力
在无芽胞的细菌中，葡萄球菌的抵抗力最强。
在干燥的脓汁中可生存数月，湿热80℃30分钟才能将其杀死。5％石炭酸，0．1％升汞中10～15分钟死亡。耐盐性强。
如培养基中加入龙胆紫液可抑制其生长。在冷藏环境中不易死亡。临床上用1-3%龙胆紫治疗有本菌引起的化脓，效果很好。
对磺胺类药物敏感性较低。对红霉素、链霉素、氯霉素及四环素较敏感。
肠毒素的耐热性强。带有毒素的食物煮沸120分钟方能破坏其毒素。低温下2个月以上方失去毒力。
二、致病性
金黄色葡萄球菌致病的特点是化脓性炎症，产生肠毒素的菌株能引起食物中毒：金黄色葡萄球菌的致病物质主要有毒素和酶。
1、溶血毒素（Staphyolysin）：
外毒素，可使动物红细胞溶解，培养时出现溶血环。按抗原性不同，至少有α、β、γ、δ、ε五种，对人类在致病作用的主要是α溶血素。
它是一种“攻击因子”，化学成分为蛋白质,65℃30分钟即可破坏。如将α-溶血素注入动物皮内，能引起皮肤坏死，如静脉注射，则导致动物迅速死亡。α溶血素还能使小血管收缩，导致局部缺血和坏死，并能引起平滑肌痉挛。α溶血素是一种外毒素，具有良好的抗原性。经甲醛处理可制成类毒素。
2、杀白细胞素（Leukocidin）：使寄主白细胞崩解死亡，是一种毒性蛋白。（能杀死人和兔的多形核粒细胞和巨噬细胞。此毒素有抗原性，不耐热，产生的抗体能阻止葡萄球菌感染的复发。）
3、肠毒素（Enterotoxin）：可溶性蛋白，分A、B、C1、C2、C3、D、E和F八个型，以A型引起的食物中毒最多。（肠毒素可引起急性胃肠炎即食物中毒。）耐热，100℃30分钟不破坏。
与产毒菌株污染了牛奶、肉类、鱼是虾、蛋类等食品有关，在20℃以上经8～10小时即可产生大量的肠毒素。肠毒素是一种可溶性蛋白质，耐热，经100℃煮沸30分钟不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响，故误食污染肠毒素的食物后，在肠道作用于内脂神经受体，传入中枢，刺激呕吐中枢，引起呕吐，并产生急性胃肠炎症状。发病急，病程短，恢复快。一般潜伏期为1～6小时，出现头晕、呕吐、腹泻，发病1～2日可自行恢复，预后良好。
4、血浆凝固酶（Coagulase）,是能使含有枸椽酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类物质，致病菌株多能产生，常作为鉴别葡萄球菌有无致病性的重要标志。使血浆中纤维蛋白凝固在菌体表面，保护细菌。
凝固酶和葡萄球菌的毒力关系密切。凝固酶阳性菌株进入机体后，使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面，阻碍体内吞噬细胞的吞噬，即使被吞噬后，也不易被杀死。同时，凝固酶集聚在菌体四周，亦能保护病菌不受血清中杀菌物质的作用。葡萄球菌引起的感染易于局限化和形成血栓，与凝固酶的生成有关。
凝固酶具有免疫原性，刺激机体产生的抗体对凝固酶阳性的细菌感染有一定的保护作用。慢性感染患者血清可有凝固酶抗体的存在。
是一种能使经过枸橼酸钠或肝素抗凝的家兔或人的血浆凝固的酶。大多数致病性葡萄球菌能产生此酶，而非致病菌不产生此酶。
5、DNA酶、溶纤维蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、透明质酸酶(Hyaluronidase)，脂酶(Lipase)等，使细菌具有侵袭力。
三、临床症状：
潜伏期一般为1—6小时，最短者0.5小时即发病。
症状主要是恶心、呕吐、流涎，胃部不适或疼痛，继之腹泻(但少见)。呕吐为多发症，为喷射状呕吐，一般腹泻后多有腹痛，初为上腹部后成全腹部，呕吐或便中常可见有血和粘液。少数患者有头痛、肌肉痛、心跳减弱、盗汗和虚脱现象。体温不高，不超过38~C，病程1天，呈急性经过，很少有死亡，预后良好。
四、流行病学特点
1．季节性特点
全年皆可发生，但多见于夏秋季。
2．食品的种类
引起中毒的食物种类很多，主要是乳类及乳制品、肉类、剩饭等食品。
3．食品被污染的原因及肠毒素的形成
(1)食物中金黄色葡萄球菌来源金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界，人和动物的鼻腔、咽、消化道带菌率均较高。据报道，上呼吸道被金黄色葡萄球菌感染的患者，其鼻腔带菌率为83．3％，而健康人带菌率也达到20％～30％。人和动物的化脓性感染部位常成为污染源，如奶牛患化脓性乳腺炎时，乳汁中可能带有金黄色葡萄球菌；带菌从业人员直接或间接污染各种食物；畜、禽局部患化脓性感染时，感染部位的金黄色葡萄球菌对体内其他部位的污染。
(2)肠毒素形成肠毒素的形成与温度、食品受污染的程度、食品的种类及性状有密切的关系。一般说，在37℃以下的范围内食物存放的温度越高，产生肠毒素需要的时间越短，在20～37C下经4－8h即可产生毒素，而在5—6℃的温度下需经18d方可产生毒素。食物受金黄鱼葡萄球菌污染的程度越严重，繁殖越快亦越易形成毒素。
五、检 验
1、采样
采集样品首先采取可疑的食物，其次采取病人的呕吐物，剩余的食品，或采取病人的粪便、血液。以及有关食品加工人员的皮肤感染性化脓创的脓汁等。,
2．国家标准检验方法 GB4789．10-84，检验程序如图5-9。
1）增菌和分离培养
将25g检样加于225mL灭菌生理盐水中或吸取液体检样5ml于7．5％氯化钠肉汤50ml进行增菌；同时挑取混悬液接种血平板及Bakd-Rarker氏培养基；取可疑菌落再接种血琼脂平板做纯培养。然后进行革兰氏染色。
2）血浆凝固酶试验
吸取1：4新鲜兔血浆0．5mL于小试管中，再加入培养24小时葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0．5mL振荡混匀，37℃温箱或水浴内每半小时观察一次，观察6小时，如呈现凝块即为阳性，同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉浸液肉汤作为对照。
血浆凝固试验也可采用玻片法。把兔血浆滴加于载玻片的一端，然后用白金耳挑取菌落与血浆充分混匀、在载玻片另一端以生理盐水代替血浆做阴性对照。混合舌立即观察，若出现凝块即为阳性。
病原性葡萄球菌多数产生血浆凝固酶，非病原性的一般不产生。因此，该法是判定葡萄球菌有无致病性的重要指标。
3．肠毒素的测定
动物试验可用检样稀释液直接作动物试验或按以下方法将分离菌株培养制备肠毒素。
①肠毒素的制备：
肠毒素的制备有固体培养法和液体培养法。
②肠毒素测定：
注射前应先喂给幼猫少量的食物，以便观察反应。取上清液按幼猫体重每100g 1mL的剂量腹腔注射或加大2—3倍量口服。然后仔细观察，一般攻毒后0．5～2小时内幼猫发生呕吐、腹泻、体温上升、畏寒等症状，经4～5小时后逐渐恢复。同时实验时用未接种菌的培养基做同样处理的阴性对照。
4、血清学反应
可用于检测食物、培养物或滤液等标本中的细菌或肠毒素。血清学反应不仅简便快捷，而且能对毒素做出最后定型：
①菌体荧光抗体染色法
涂片：食品样品接种于葡萄糖肉汤培养基，37~C培养24～48小时。用接种环取上述增菌液，涂布于载玻片上。
干燥：每一个培养物涂布3～4个点,37度培养箱内干燥。
固定：将干燥好的玻片放在克氏固定液中固定3－5分钟，再将固定的玻片标本放入95％酒精中浸泡1分钟，
加抗血清：然后充分干燥，用接种环取1环荧光抗血清轻轻加于菌膜上．
反应：然后37度培养箱内作用30分钟。
冲洗浸泡：取出作用好的玻片用0.01mol/L PH7.4 PBS液冲洗玻片上荧光血清，最后将标本放于95％酒精液中浸泡1分钟左右取出，用荧光显微镜镜检。
有特异性明亮荧光的为阳性或者菌量在一个视野中有数个或十几个细菌以上者为阳性。
②毒素的检出
金黄色葡萄球菌毒素蛇检出有免疫琼脂扩散法、反向间接血凝法，放射免疫测定法、免疫荧光法、酶联免疫吸附测定法、A蛋白血凝试验、核酸探针检测，乳胶凝集试验等。
5．噬菌体分型试验
第七节 链球菌及其检验
链球菌系指一大类呈链状排列的球菌。本菌广泛分布于自然界，一般存在于水、乳、粪便以及人和动物的病灶内。健康人和动物的皮肤和粘膜上，呼吸道和消化道内往往带菌。有些可引起各种化脓性炎症，猩红热，丹毒，脑膜炎，产褥热以及链球菌变态反应性疾病等，还有马腺疫链球菌，肺炎、乳腺炎、败血症等。
本菌在血液琼脂上培养时，按其对红细胞的落解现象，将其分为三类,；
1）甲型溶血(又称为α溶血),菌落周围呈现弱溶血，并有绿色环，放冰箱一夜后，绿色环周围呈现溶血环，
2）亚甲型溶血(又称为α溶血) 在菌落周围无明显溶血境界，溶血环狭小；镜检时，可见部分残留红细胞。
3）乙型溶血(又称β溶血) 菌落周围红细胞完全溶解，并有明显的溶血境界，出现完全透明的溶直环．本型包括大部分对人畜致病的链球菌。
此外，还有的链球菌无任何溶血现象。
链球菌的检验工作不仅在临床和流行病学上具有重要意义，在食品卫生工作上也具有十分重要的意义，一方面根据食品卫生要求，对食品中(如牛乳及乳制品)的致病性链球菌进行检验；另一方面，在可疑为链球菌引起食物中毒暴发时，应通过检验证实该菌与食物中毒的关系。
链球菌在自然界分布广泛，是食物污染的重要原因。文献报导，许多由食物引起的脓毒性咽喉痛和猩红热，是由A群链球菌引起，近年来，由链球菌引起的食物中毒已逐渐为人们所注意。
链球菌性食物中毒，经常由乳、肉类食品所引起，多为α溶血型。β溶血型链球菌引起食物中毒较少。
一、生物学特性
1、形态与染色特性
本菌为圆形或卵圆形，常排列成链状，链的长短不一。致病性链球菌一般较长，非致病性或毒力弱的菌株菌链较短，在液体培养中易呈长链，在固体培养基上常呈短链。
大多数链球菌无鞭毛，不能运动，但D群中某些菌株具有鞭毛。不能形成芽胞。多数链球菌在血清肉汤幼龄培养物中，易发现荚膜，当培养时间延长，荚膜即逐渐消失。
2、培养特性
1）需氧或兼性厌氧菌。多数菌株的生长温度为20C－42 C，最适温度为37 C 。本菌最适pH为7．4～7．6。
2）多数致病性菌株的营养要求较高，在普通培养基上生长不良，必须加血液、血清、腹水等。
3）血琼脂平板：37℃经18—24小时，形成灰白色、半透明或不透明，表面光滑，有乳光，细小菌落。适菌落周围可有不同的溶血现象，有的完全溶血，有的不完全溶血，形成草绿色溶血环；有的不发生溶血，无溶血环可见。
4）马铃薯培养基：
致病性链球菌发育良好．而致病性链球菌则不生长或生长不良。
3．生化特性
对常用的糖类，发酵后产酸不产气。分解葡萄糖后产生乳酸和少量甲酸、醋酸与乙醇。对乳糖、甘露醇、水杨苷、蔷蓑醇或重糖的发酵能力因菌株不同而异；链球菌一敏不分解菊糖，不被胆汁改10％胆盐所溶解，这点可用来鉴别链球菌和肺炎双球菌·。
肠链球菌可在6．5％氯化钠葡萄糖肉汤、40％胆汁肉汤，pH9．6葡萄糖肉汤和0．1％美兰牛乳培养基中生长，能在10~C和45℃下生长．这几点可作为肠链球菌和其他链球菌的鉴别。
4．抗原构造
1、核蛋白抗原或称P抗原：无群型特异性，各种链球菌均同，与葡萄球菌有交叉，不能用于分类。
2、多糖抗原或称C抗原（群特异性抗原）：具有群特异性，是细菌壁的多糖成份。对人致病的90%属于A族，其次为B族，其它族少见；据此可将链球菌分为20个血清群。
3、型特异性抗原：又称蛋白质抗原或称表面抗原，是链球菌细胞壁的蛋白质抗原（M抗原），是位于多糖抗原之外的蛋白质抗原；具有型特异性，基于M蛋白抗原性的不同，可将A群链球菌区分为100多个不同的血清型。
5．致病性
致病性链球菌常可产生多种酶和外毒素 。
链球菌种类多，致病复杂，毒力强弱决定于分泌的毒素和酶，A族链球菌有较强的侵袭力，可产生多种酶和外毒素。
1）、链球菌溶血素（Streptolysin）：有溶解红细胞，杀死白细胞、血小板及毒害心脏的作用，主要有“溶血素O”和“溶血素S”两种。
链球菌溶血素O能破坏白细胞和血小板。动物试验又证实对心脏有急性毒害作用，使心脏骤停。抗原性强，感染后2～3周，85%以上病上产生抗“O”抗体。
溶血素“S”，无抗原性。对氧稳定，对热和酸敏感。血平板所见透明溶血是由“S”所引起，能破坏白细胞和血小板，给动物静注可迅速致死。注射小鼠腹腔，引起肾小管坏死。
2）、致热外毒素（Pyrogenic extoxin）曾称红疹毒素(Erythrotoxin)或猩红热毒素(Scarletfever toxin)：是人类猩红热的主要致病物质，为外毒素，使病人产生红疹。该毒素是蛋白质，对热稳定，具有抗原性，则产生的毒素能中和该毒素的活性。
3）、另外还可产生：
（1）．M蛋白 是链球菌细胞壁中的蛋白质组份，具有抗吞噬和抗吞噬细胞内的杀菌作用。M蛋白有抗原性，刺激机体产生型特异性抗体，并与变态反应疾病有关。
（2）．脂磷壁酸（LTA） 与细菌粘附于宿主细胞表面有关，大多数LAT位于细胞膜和肽聚糖之间，通过肽聚糖孔伸展至细菌细胞表面，人类口腔粘膜和皮肤上皮细胞、血细胞等细胞膜上均有LAT的结合位点。
（3）．透明质酸酶（Hyaluronidaes），能分解细胞间质的透明质酸，使病菌易于在组织中扩散。又称为扩散因子。
（4）．链激酶(Streptokinase,SK),又称链球菌溶纤维蛋白酶(Streptococcal fibrinolysin)是一种激酶，能激活血液中的血浆蛋白酶原，成为血浆蛋白酶，即可溶解血块或阻止血浆凝固，有利于细菌在组织中的扩散。耐热，100℃50分钟加热仍保持活性。链激酶抗体能中和该酶的活性。
（5）．链道酶（Streptodonase）又名脱氧核糖核酸酶(Streptococcal deoxyribonuclease)：主要由A、C、G族链球菌产生。此酶能分解粘稠脓液中具有高度粘性的DNA，使脓汁稀薄易于扩散。产生的相应抗体有中和该酶的活性。用链激酶、链道酶制剂进行皮肤试验作为测定机体细胞免疫的一种方法。
链球菌的种类繁多，引起人和各种畜禽的疾病各异，主要为各种化脓性炎症、呼吸道感染，如气管炎、咽峡炎、扁桃体炎、肺炎等。扁桃体炎，咽炎，鼻窦炎，中耳炎，肾炎等，猩红热。此外有的还能引起人的食物中毒。
风湿热 由A族链球菌的多种型别引起，临床表现以关节炎、以肌炎为主。致病机理认为两种：一是第Ⅱ型变态反应，链球菌细壁多糖抗原和心肌瓣膜，关节组织糖蛋白有共同抗原性，胞壁蛋白抗原和心肌有共同抗原性。二是第Ⅲ型变态反应，可能是M蛋白的免疫复合物沉积于心瓣膜和关节滑液膜上造成。
急性肾小球肾炎 多见于儿童和少年，大多数由A族12型链球菌引起。临床表现为蛋白尿、浮肿和高血压。也是一种变态反应性疾病。链球菌的某些抗原与肾小球基底膜有共同抗原，机体针对链球菌所产生的抗体与肾小球基底膜发生反应，属第Ⅱ型变态反应。由链球菌的M蛋白所产生的相应抗体形成的免疫复物沉积于肾小球基底膜，造成基底膜损伤，属于第Ⅲ型变态反应。
6．抵抗力
本菌抵抗力不强，60度 30分钟即可死亡。
巴氏灭菌法加热60℃～63C经30分钟，即将牛乳中致病的链球菌群杀死。在渗出液及动物排泄物中可生活数周。D群链球菌抵抗力很强，加热60度30分钟不死。
二、检 验
1．国家标准检验方法 GB4789．11-84，检验程序见图5-10。
1）取样
2）增菌、分离培养
称取检样加入灭菌生理盐水制成混悬液进行增菌和分离培养。增菌培养吸取上述检样混悬液5mi接种于50mi葡萄糖肉浸液肉汤内，如污染严重的检样，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经36+1℃培养24小时，挑取乙型溶血、园形突起的细小菌落接种血平板。在增菌培养的同时用上述检样混悬液直接划线接种于血平板。如为灰白色、半透明或不透明，表面光滑、有浮光、园形突起的细小菌落，周围有2—4mm无色透明的溶血环，可认为是溶血性链球菌。再进行革兰氏染色镜检。
③杆菌肽敏感试验
挑取乙型溶血性链球菌浓菌液，涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0．04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于36~1℃培养18～24小时，如有抑菌带出现即为阳性，可初步鉴定为A群链球菌。同时用已知阳性菌株作为对照。
2．其他辅助检验方法
1）α型溶血性链球菌与肺炎球菌鉴别试验胆汁溶菌试验：取待检菌的18—24小时液体培养管2支，每支约4mi，向其中1管加入无菌胆汁1ml，置37'C60分钟比较两管之浊度，如肺炎球菌，则应变为澄清。
菊糖发酵试验：肺炎球菌可分解菊糖，链球菌则为阴性。
2）肠道链球菌(D群)与其他链球菌的鉴别试验
生长试验：将待检菌接种于宁5％氯化钠葡萄糖肉汤、pH9．6葡萄糖肉汤、40％胆汁葡萄糖肉及0．1％美兰牛乳培养基，置37℃温箱内培养，肠道链球菌均能生长。
耐热试验：将待检菌接种于0，5％葡萄糖肉汤，置60~C水浴中经30分钟取出，置37℃温箱内培养，肠道链球菌仍有活力。
生长温度试验：将待检菌接种于2支0．5％葡萄糖肉汤，分别置于10~C及45℃下培养24小时，肠道链球菌均能发育。
3）动物试验 取分离菌的48小时肉汤培养物0．2ml接于种小鼠腹腔，观察1周，如动物发生死亡，即行解剖，并取其心血培养，以证实之。
4）血清学试验
第八节 肉毒梭菌及其毒素的检验
肉毒梭菌(Clostridium botulinum)是一种腐物寄生菌。肉毒梭菌在自然界分布广泛，土壤中常可检出，江、河、湖、海沉积物，水果，蔬菜，畜、禽、鱼等制品中亦可发现,霉干草和畜禽粪便中均有存在，可分为A至G七个型。
早在18世纪末以前，在欧洲，尤其是在德国就已被人们所认识，由于那时候引起中毒的食品主要是腊肠，所以这种中毒就取自腊肠的拉丁文Botulus，而称为腊肠中毒(Botulism)。在我国过去的一些书中，把本病译为腊肠中毒，把肉毒梭菌译为腊肠(毒)杆菌或腊肠(毒)梭菌。现在改称为肉毒中毒。
引起肉毒中毒主要是食人含有肉毒毒素的食品．这些食品是在调制加工、运输贮存的过程中，污染了肉毒梭菌芽胞，在适宜条件下，发芽、增殖并产生毒素所造成的。
在国外，引起肉毒中毒的食品多为肉类及各种鱼、肉制品、火腿、腊栖，以及豆类、蔬菜和水果罐头。中毒食品种类往往与饮食习惯有关：如欧洲各国主要的中毒食品为火腿，腊肠和其他兽肉、禽肉等。美国主要是家庭制的水果罐头．而火腿、腊肠等畜禽加工食品仅占7．7％。苏联和日本鱼制品中毒者最多，尤其是日本，几乎全部是鱼制品的E型中毒。
在我国也有肉毒中毒的报导，因肉类食品及罐头食品引起的中毒的较少，据新疆肉毒科研协作组的223起肉毒中毒的调查统计，臭豆腐、豆鼓、面酱。红豆腐、烂土豆等植物性食品共204起，占91．48％；其余的19起(占8．52％)是动物性食品，包括熟羊肉、羊油、猪油、臭鸡蛋、臭鱼、咸鱼，腊肉、干牛肉、马肉等。
一、生物学特性
1．形态与染色特性
本菌为革兰氏染色阳性蛇大杆菌,多单在，偶见成双或短链，菌端纯圆。有周身鞭毛，无荚膜，芽胞为椭圆形，A，B型菌的芽胞大于菌体，位于菌体近端，使菌体呈匙形或网球拍状，另外四型菌的芽胞一般不超过菌体宽度。
2．培养特性
1）最严格的厌氧菌
2）对营养要求不高，在普通培养基上都能生长。普通琼脂上形成灰白色，半透明、边缘不整齐。呈绒毛网状、向外扩散的菌落。
3）发育最适温度为28～37度，pH为6.8—7.6，产毒的最适pH为7.8—8.2。
4）血液琼脂：菌落周围有溶血区：
5）肉渣肉汤：呈均匀混蚀生长，肉渣可被A、B和F型菌消化溶解成烂泥状，并发黑，产生腐败恶臭味，从第三天起，菌体下沉，肉汤变清。在肉渣培养基和半固体培养基中，大量产气。
3、生化特性
4．抵抗力
肉毒梭菌的抵抗力一般，但其芽胞的抵抗力很大，可耐煮沸1～6小时之久，于180度干热5—15分钟，120~C高压蒸气下10～20分钟才能杀死。
对于罐头食品的灭菌很重要，若芽胞深藏于食品中，或者数量过多，虽经高温灭菌，有时也不易杀死芽胞，故应特别注意。
肉毒毒素抵抗力也较强，80~C30分钟或100C10分钟才能完全坏。正常胃液和消化酶于24小时不能将其破坏，可被胃肠道吸收而中毒。
5．菌型及毒素
目前已知肉毒梭菌有A、B、C、D、E、F、G等7个菌型。引起人群中毒的主要是A、B、E三型，C、D型主要是畜禽肉毒中毒的病原，F型只见报导发生在个别地区的人，如丹麦和美国各一起。1980年从瑞士五名突然死亡病例中发现G型毒素。
肉毒毒素是在肉毒梭菌胞浆中产生，由菌体释放到培养基中，经滤过除菌所得滤液即为毒素液。毒素形成的最适温度为28~C～37C，温度低于8~C与pH在4．0以下时，则不能形成。
肉毒梭菌产生的毒素是一种神经毒素，是目前已知的化学毒物与生物毒素中毒性最强烈的一种，对人的致死量为10—9mg／Kg体重。其毒力比氰化钾还要大一万倍。
二、致病性
肉毒毒素是一种与神经亲和力较强的毒素，肉毒毒素经肠道吸收后，作用于外周神经肌接头，植物神经末梢以及颅脑神经核，毒素能阻止乙酰胆碱的释放，导致肌肉麻痹和神经功能不全。
三、临床症状在临床上表现以中枢神经系统中毒症状为主。潜伏期长短不一，短者2小时，长者可达数天，一般为12～24小时。
中毒症状，早期为瞳孔放大、明显无力、虚弱，晕眩，继而出现视觉不清和雾视，愈来愈感到说话和吞噬困难，通常还可见到呼吸困难。体温一般正常，胃肠道症状不明显。病程一般为2～3天，也有长达2—3星期之久的。
肉毒中毒死亡率较高，据报道可达30％一50％。死亡主要是由于呼吸麻痹及心肌痪瘫。如早期使用型特异或多价抗血清治疗，死亡率可降至10％一15％。
四、流行病学特点自1896年VanEMengein首次报道荷兰因火腿引起肉毒中毒爆发，并分离出肉毒梭菌后，世界各地陆续报道本病。我国吴朝仁等1958年报告新疆察布查尔县由于食用面酱半成品引起肉霉中毒之后，相继报告该地区由其他谷、豆类发酵食品等引起的肉毒中毒。
1．季节性特点 肉毒梭菌食物中毒主要发生在4～5月。
2．地区分布特点
肉毒梭菌广泛分布于土壤、水及海洋中，且不同的菌型其分布也有差异。A型肉毒梭菌主要分布于山区和未开垦的荒地，如新疆察布查尔地区是我国肉毒梭菌中毒多发地区，未开垦荒地该菌检出率为28．25％，土壤中为22．2％；B型多分布于草原区耕地；E型多分节于土壤、湖海淤泥和鱼类肠道中，我国青海省发生肉毒梭菌中毒主要为E型；F型分布于欧、亚、美洲海洋沿岸及鱼体。
3．食品的种类
引起中毒的食品种类因地区和饮食习惯不同而异。国内以家庭自制植物性发酵品为多见，如臭豆腐、豆酱、面酱等，罐头瓶装食品、腊肉、酱菜和凉拌菜等引起中毒也有报道。在新疆察布查尔地区引起中毒的食品多为家庭自制谷类或豆类发酵食品，在青海主要为越冬密封保存的肉制品。日本90％以上的是由家庭自制鱼和鱼类制品引起；欧洲各国肉毒梭菌中毒的食物多为火腿、腊肠及其他肉类制品；美国主要为家庭自制的蔬菜、水果罐头、水产品及肉、乳制品。
4．食物中肉毒梭菌的来源及食物中毒的原因
食物中肉毒梭菌主要来源于带菌土壤、尘埃又粪便，尤其是带菌土壤可污染各类食品原料。这些被污染的食品原料在家庭自制发酵和罐头食品的生产过程中，加热的温度或压力不足以杀死肉毒梭菌的芽孢，且为肉毒梭菌芽孢的萌发与产生毒素提供了条件，尤其是食品制成后，有不经加热而食用的习惯，更容易引起中毒的发五、检 验
肉毒毒素的检出被看做是肉毒中毒实验室诊断的根本方法。
（一）、国家标准检验方法
检样经均质处理后，及时接种培养，进行增菌、产毒培养，同时进行毒素检测试验。毒素检测试验结果证明检样中有无肉毒毒素及有何型肉毒毒素存在。
1、动物试验肉毒毒素检测以小白鼠腹腔注射为标准方法
1）检出试验：
取离心上清液和胰酶处理液分别注射小白鼠2只，每只0．5mi观察4天。注射液中如有肉毒毒素存在。小白鼠一般注射后24小时内发病、死亡。最快从10分钟开始，
超过％小时者不可能发病：主要症状为竖毛，四肢麻痹，全身瘫痪，呼吸困难，呈现峰腰，最终死于呼吸麻痹：
2）确证试验：
凡能致小鼠发病或死亡者，取上清液3份作确证试验。1份加等量多型混合肉毒抗毒素诊断血清。混匀．37~C作用30分钟； l份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10分钟；1分加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀即可。3份混合液备注小鼠2只，每只0．5mL。观察4天，若含抗血清和加热处理的注射液不致小鼠死亡，未经处理的注射液致小鼠死亡，则可判定食品中含有肉毒毒素的存在，必要时进行毒力测定和定型试验。
3）毒力测定,
4）定型试验,
2、肉毒梭菌检出(增菌产毒培养)试验
增菌培养,
分离培养,
培养特性检查：接种两个卵黄琼脂平板，分别在35亡的需氧和厌氧条件下培养48小时，观察生长情况及菌落特征。肉毒梭菌只在厌氧条件下才能生长，并具上述菌落特征。有氧条件下不生长。
（二）、其他检验方法(毒素检测)
1、禽眼睑试验
2、中和试验
中和反应是毒素与抗毒素之间的一种免疫学反应，即毒素与抗毒素混合后，形成特异性结合，致使毒素作用活性消失。是肉毒毒素鉴定和定型的最标准方法之一。
3、血清反应法
为了寻求简易快速的方法检验肉毒毒素．目前进行了许多血清学试验研究，如补体结合反应、试管沉淀反应、间接血凝试验。免疫电泳、荧光抗体、酶联免疫吸附试验等等，但离实际应用还都有一定的距离．其中间接血疑试验应用的较多。
1）间接血凝试验：本法可将毒素分型。其特异性及敏感性均较高。
2） 酶联免疫吸附测定法(ELISA)
检测A型和E型肉毒毒素，有报道指出不仅敏感性高，重复性好，而且特异性高，与其他毒素型天交叉互应：目前尚处于研究试验中，尚未应用于实际的毒素检测工作。
3）特异型抗血清琼脂扩散法：
即在培养基中加入特异性高的抗毒素，由菌落释放出来的毒素与平板中酡抗毒素发生沉淀反应，在菌落的周围发生乳白色园形晕环。只要所用抗毒素的型特异性很强，就可以鉴定到型。
第九节 蜡样芽胞杆菌及其检验
蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)食物中毒，是一种常见的食物中毒。第一起蜡样芽胞杆菌食物中毒的完整报告在1950年发表于挪威，随后许多国家，特别是北欧和东欧国家也报告有类似的食物中毒爆发。1971年以来英国也报告过多起蜡样芽胞杆菌食物中毒。我国于1973年南京市卫生防疫站，1974年鞍山市卫生防疫站相继报告蜡样芽胞杆菌食物中毒以来，近几年来又有一些单位报告了本菌引起的食物中毒。引起食物中毒的食品范围很广，包括肉类、菜汤、烧鸡、炒菜、鱼、牛奶、点心食品，剩饭等等。
蜡样芽胞杆菌分布比较广泛，在土壤和植物上及许多食物上都能分离到。引起食物中毒的食品必须含有较大量的细菌，每克或每毫升食品中约需含107个以上的蜡样芽胞杆菌。
蜡样芽胞杆菌在食品上，于20度以上的环境中放置，能迅速繁殖并产生肠毒素，同时，由于本菌不分解蛋白质，因此，食品在感官上无明显变化，无异味，很容易误食而发生中毒。
一、生物学特性
1．形态和染色特性
本菌为革兰氏阳性的大杆菌，菌体两端较平整，芽胞呈椭圆形，位于菌体中央稍偏一端，芽胞较菌体小。
2．培养特性
1）需氧菌，生长温度范围在10C一45℃之间。最适生长温度为28—35℃。
2）对营养要求不高，在普通培养基上生长良好。本菌在普通琼脂平板上，生长的菌落呈乳白色，不透明，边缘不整齐，直径为4—6mm，菌落边缘往往呈扩散状，表面稍干燥。
3）在血液琼脂平板上形成浅灰色、不透明、似毛玻璃状的菌落。在菌落周围初呈草绿色溶血，时间稍长即完全透明。
4）在普通肉汤内生长迅速，肉汤混浊，常常有菌膜或壁环，振摇易乳化。
3．生化特性
4．血清学特性
蜡样芽胞杆菌有两种抗原，一种是耐热的，一种是不耐热的。
5．抵抗力
蜡样芽胞杆菌生长型不耐热，100度 20分钟即可被杀死，对酸碱不敏感。pH6—11对本菌基本上不受影响，pH5以下，生长可受到抑制。,
二、致病性
蜡样芽胞杆菌引起食物中毒，除了必须具有大量的细菌外，肠毒素也是重要的致病毒素。
蜡样芽胞杆菌产生的肠毒素有两种
1、耐热性肠毒素：100度30分钟不能被破坏，为引起呕吐型中毒的致病因素，常在米饭中形成。
2、不耐热肠毒素：是引起腹泻型胃肠炎的病因，能在各种食物中形成。
三、临床症状蜡样芽胞杆菌食物中毒，在临床上一般可分为呕吐型和腹泻型两类。
呕吐型中毒多见于过剩米饭和油炒饭，由耐热性肠毒素为致病因素；潜伏期短，一般为2—3小时，最短为30分钟，最长5—6小时；中毒症状：呕吐，腹痉挛，腹泻则少见，一般经过8—10小时而治愈。
腹泻型中毒由各种食品中不耐热肠毒素引起，潜伏期在6小时以上，一般为6—14小时；中毒症状：腹泻，腹痉挛，而呕吐却不常见；病程24-36小时。
两型均少见体温升高，预后良好。
四、流行病学
1、季节性特点
以夏、秋季，尤其是6－10月为多见。
2、食品种类
包括乳及乳制品、肉类食品、蔬菜、米粉、米饭等。
3、食物中腊样芽孢杆菌的来源肉及制品的带菌率为10－26％，乳及制品带菌率为23－77％，食品中该菌的污染源主要是泥土、尘埃、空气，其次是昆虫、苍蝇、不洁的用具等。如果食用前不加热或加热不彻底，即可引起食物中毒。
五、检 验
第十节 平酸菌及其检验
“平酸”菌是一种能使某些罐头酸败而又能形成芽孢的厌氧菌。它们发酵碳水化合物的特点是能产生使食品变酸的低碳脂肪酸，但是不产生气体，也不足以改变罐头两端平面的形状，这类罐头食品的酸败被称为平盖酸败。这类菌习惯上称“平酸”菌。
常见的种类有嗜热脂肪芽胞杆菌，是一种专性嗜热菌；凝结芽胞杆菌，是一种兼性嗜热菌，其耐酸性强，是肉类，蔬菜罐头(番茄汁；番茄浆罐头等)、炼乳、奶油等腐败变质的常见菌。它们引起腐败的罐头，外观正常、不膨胀，其内容物却在平酸菌作用下呈现轻重不同的酸败状态，pH值可降低0．3—0．5。
平酸菌在自然界分布很广泛。炼乳的酸败和随后凝乳的形成常常是凝结芽胞杆菌引起的：嗜热脂肪芽孢杆菌的芽胞具有很强的抗热性，能杀死肉毒梭状芽胞杆菌的杀菌温度并不能杀死嗜热脂肪芽孢杆菌，因此在一般高温杀菌后的罐头食品中，还会有嗜热脂肪芽胞杆菌存在。
一、生物学特性
1．形态及染色特性
嗜热脂肪芽胞杆菌和凝结芽孢杆菌都为革兰氏阳性菌，具有周身鞭毛，能运动
2.培养特性
嗜热脂肪芽胞杆菌的最低生长温度为28℃，最适生长温度为50－65℃，最高生长温度为70℃～77C，在pH6.8－7.2的培养基中生长良好，当pH值接近5时就不能生长。因此，这种菌只能在pH5以上的罐头食品中生长。
凝结芽胞杆菌的最低生长温度为18C，最适生长温度为55－60℃。最高温度为55℃－60℃，能适应较高的酸度，能在pH值4.5以下的酸性罐头食品种生长，所以又称本菌为嗜热酸性芽胞杆菌。
凝结芽胞杆菌在葡萄糖胰胨琼脂培养基表面生长的菌落呈圆形，不透明，淡黄色。生长在培养基深层的菌落带有绒毛状边缘，呈浅黄色至橙色。由于酸的形成菌落周围出现一个黄色晕圈。
嗜热脂肪芽孢杆菌在葡萄糖胰胨琼脂培养基上生长，但只形成针头大小的菌落，通常显示褐色。
3．生化特性
二、检 验
1．成品罐头中平酸菌的检验
罐头平酸腐败必须通过开检查或细菌分离培养等才能确定，具体方法如下,
1）检样的采取
将待检罐头预先经55C培养5—7天，然后开罐，取其内容物1ml（液体)或lg(固体)，以无菌操作接种于葡萄糖胰胨琼脂培养基中，每罐接种2支。未培养的作对照。
2）增菌培养
将接种的上述试管于，55℃培养48小时然后观察．若指示剂由紫变黄即为阳性，同时进行涂片镜检(有时不易检到芽胞)。
3）分离培养
将阳性试管划线接种于葡萄糖胰胨琼脂培养基上，于55度培养48小时后检查有无可疑菌落(菌落黄色，周围有黄色环，中心色深不透明)。如有可疑菌落则接种于普通琼脂斜面和芽胞培养斜面上，55℃培养24小时，涂片镜检芽孢的形态及位置，并同时以普通琼脂斜面培养物进行生化试验。
4）鉴定：
经形态和其他反应两方面鉴定。
菌体形态：取样品直接涂片镜检；平酸菌为革兰氏阳性芽胞F菩生化反应：检查平酸腐败，可将培养过的样品与未培养过的正赏对照样品的pH值进行比较，通常足以显示出平酸腐败的存在。
3．注意事项
样品必须保管好，在采取样品和检验程序开始之间，不要在嗜热菌生长温度范围内存放很长时间，应在不超过约43C的地方贮存。
随机采取库存罐头食品样品，如酸败局限于货架上箱内的外层或外层的产品，则表明是局部受热的缘故，应注意通风散热。如发现酸败局限于货架上的内部箱，则表示生产中冷却不充分，产品继续处于嗜热菌生长温度范围内。
第十一节 黄曲霉菌及其毒素的检验霉菌污染食品后，在适宜条件下会产生毒素。人和动物食用被污染了霉菌毒素的食品后，可产生各种危害，如急性或慢性中毒、肿瘤等。
霉菌产毒的特点：
①霉菌产毒仅限于少数的产毒霉菌。
②产毒菌株的产毒能力具有易变性。
③产毒霉菌产毒不具有一定的严格性。
④产毒霉菌产毒需要一定条件。
如花生、玉米易污染黄曲霉及其毒素，小麦、玉米易污染镰刀菌及其毒素，大米易污染青霉及毒素。
常见的霉菌有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、镰刀菌毒素和青霉菌毒素等。
黄曲霉毒素存在于霉变的花生、谷物、果仁和大米上。肝癌与黄曲霉毒素含量高有直接关系。为了防止产生黄曲霉毒素，最好将桃仁、果仁、谷物贮藏在密封和干燥的地方，不要吃发霉的食品，尤其是发霉的干果、桃仁和粮食。
主要由黄曲霉和寄生曲霉产生，其基本结构中都含有二呋喃环和双香豆素，黄曲霉毒素主要损害肝脏，表现为脂肪变性、出血、坏死及胆管上皮、纤维组织增生。同时肾脏也可受损害。
临床表现
早期有胃部不适、腹胀、厌食、呕吐、一过性发热及黄疸等。2～3周后出现腹水、下肢水肿、脾脏增大变硬、胃肠道出血、昏迷甚至死亡。
诊断
1,有进食可疑黄曲霉菌污染食物史。
2,临床特点①潜伏期较长。②中毒表现：胃部不适、腹胀、厌食、呕吐、肠鸣音亢进、一过性发热及黄疸等。
急救处理
1,护肝。
2,对症支持治疗
一、黄曲霉菌及其毒素的种类
(一)产毒菌及其特性
1．黄曲霉菌
本菌属真菌门、半知菌亚门丛梗孢科曲霉属。本菌为需氧菌，最适温度30～33℃，相对湿度80－90％为最佳条件。花生、玉米、大米和小麦是其较好的生长基质。
2．寄生曲霉
寄生曲霉也是产生AFT的主要菌株，其特性与黄曲霉类似。我国分布较少。
3．其他
青霉、毛霉和根霉等真菌也能产生AFT，但产毒量甚微，其特性与黄曲霉类似。
(二)黄曲霉毒素的种类及对食品的污染黄曲霉毒素（AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。
它们在紫外线照射下能产生荧光，根据荧光颜色不同，将其分为B族和G族两大类及其衍生物。AFT目前已发现20余种。
AFT主要污染粮油食品、动植物食品等；如花生、玉米，大米、小麦、豆类、坚果类、肉类、乳及乳制品、水产品等均有黄曲霉毒素污染。其中以花生和玉米污染最严重。家庭自制发酵食品也能检出黄曲霉毒素，尤其是高温高湿地区的粮油及制品种捡出率更 高。
二、黄曲霉毒素的特性
1、AFT的毒性极强远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性，其中以B1毒性最大。当人摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。当微量持续摄人，可造成慢性中毒，生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。AFT的致癌力也居首位，是目前已知最强致癌物之一。
2、AFT具耐热性一般烹调加工温度不能将其破坏，裂解温度为280℃。在水中溶解度较低，溶于油及一些有机溶剂，如氯仿和甲醇中，但不溶于乙醚、石油醚及乙烷。
3、食品中所污染的主要是黄曲霉毒素Bl，其毒性目前一般认为有三种临床特征；急性中毒、慢性中毒和致癌性：
(1)急性中毒：
它是一种剧毒物质，毒性比KCN大100倍，仅次肉毒霉素，是目前已知霉菌中毒性最强的。它的毒害作用，无论对任何动物，主要变化是肝脏，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏也有轻度的病变。
(2)慢性中毒：
长期摄入小剂量的黄曲霉毒素则造成慢性中毒。其主要变化特征为肝脏出现慢性损伤，如肝实质细胞变性、肝硬化等。出现动物生长发育迟缓，体重减轻，母畜不孕或产仔少等系列症状
(3)致癌性：
AFT是目前所知致癌性最强的化学物质其致癌特点是：
A 致癌范围广，能诱发鱼类、禽类，各种实验动物、家畜及灵长类等多种动物的实验肿瘤；
B 致癌强度大，其致癌能力比六六六大1万倍；
C 可诱发多种癌，AFT主要诱发肝癌，还可话互胃癌、肾癌、泪腺癌、直肠癌、乳腺癌，卵巢及小肠等部位的肿瘤，还可出现畸胎。,
三、黄曲霉毒素在食品中的允许含量标准黄曲霉毒素具有很强的毒性，特别是它的强致癌性，世界各国对于其污染食品的情况都很重视，并对其在食品中芝全量咋了严格限制。124表四、检验
(一)黄曲霉菌菌落及形态观察
黄曲霉菌菌落生长较快，10～14天直径3～4或6—7cm。菌落正面色泽也随其生长由白色变为黄色及黄绿色，呈半绒毛状。孢子成熟后颜色变为褐色。表面平坦或有放射状沟纹，反面无色或带褐色。
在低倍显微镜下观察可见分生孢子头呈疏松放射状，继而为疏松柱状。
制片镜检观察，可见分生孢子梗很粗糙。顶囊呈烧瓶形或近球形。
分生孢子在小梗上呈链状着生，分生孢子的周围有小突起、球形、粗糙。
（二）黄曲霉毒素检测方法可归纳为化学方法、生物学方法和免疫学方法三大类。
1、生物学方法
1）抑菌试验
AFT有抑制某些微生物生长的作用，故用其抑菌作用来测定AFT的存在和含量。已经发现巨大芽胞杆菌和短芽胞杆菌对AFT最敏感。通过平皿中抑菌圈大小来衡量AFT含量。
2 ）荧光测定法
根据AFT在紫外光照射下可发出荧光的原理，将待检菌株接种于培养基中，28—30~C培养48～72小时，产生的毒素便浸入培养基中，在紫外灯光下照射培养基会呈现出特异的荧光。此法操作简便。对AFT最低检出量为5pg／ml。·
3）大白鼠试验法
AFT对大白鼠毒性最早出现损害的是肝脏，其受损范围广，而幼鼠最敏感，雄性幼鼠比雌性幼鼠敏感性更高，用100－150g大白鼠作急性中毒试验，一般3—4天死亡。
4）鸡胚试验
5）鸭雏试验
鸭雏对AFT非常敏感，致死性强，一般用一次剂量后72小时内死亡。
6）斑点试验本法用于检测真菌毒素致突变试验的一种有意义的方法。主要利用沙门氏菌/微粒体突变性来检测某些样品种AFT的存在与含量。
A先将鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型变种的菌悬液，与一定量肝组织匀浆混合作倾注平板。
B待凝固后，再将一定量被检物(含AFT)加在平板中央待AFT往外围琼脂中扩散时，围绕中心点将出现密布的回复突变的菌落。
本法作为一种生物学检验法广泛应用于开发安全、有用的化学物质和检测食品或农产品中AFT。
2．免疫学方法
AFT是分子量为312～346的二氢呋喃香豆素的衍生物，无免疫原性，不能引起抗体的产生，故必须与大分子化学基团或蛋白质偶联，成为完全抗原，方能引起免疫动物的抗体形成，然后利用血清学方法检测AFT
由于AFT的量一般都较低，因此，检测方法主要是敏感性较高的放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。近几年来，国外已成功制备了测定B1的酶联免疫测定盒及检测乳中Ml含量的RIA检测盒。这两种检测盒都十分方便，而且快速准确。
第十二节 赭曲霉菌及其毒素的检验赭曲霉毒素在自然界中分布广泛，多为重要的贮藏菌，可寄生在食品、粮食及饲料中并产毒。
一、赭曲霉菌及其毒素的种类
1．产毒菌及产毒条件
1）产毒菌：
赭曲霉毒素(Ochratoxin，OTC)的产毒菌有：赭曲霉，硫色曲霉、蜜蜂曲霉及鲜绿青霉、普通青霉等。
2）分离培养常用察氏培养基分离产毒菌；在谷物培养基中，以碎小麦为基质的产毒效果最好。
3）生长条件一般产毒霉菌在25～28℃，高湿度、阴暗静置条件下培养1～2周产毒效果较好。
2．OCT的种类及对食品的污染
1）、种类：赭曲霉毒素包括A、B、C（简称OA、OB、OC)等几种衍生物，其化学结构也类似香豆素。
2）、对食品的污染赭曲霉毒素可污染玉米、大麦、小麦，大米、荞麦、大豆 花生、棉籽等各种食品原料及其制品，火腿、鱼制品以及饲料也有一定程度的污染。
在谷物上20℃－25℃、含水率高于16％时污染更严重。污染饲料中的毒素在动物的肝、肾,脂肪中的蓄积较多，这是肉食污染的重要原因。
二、赭曲霉毒素的特性
1．理化特性
OCT是一种相当稳定的化台物，在乙醇溶液中置冰箱保存一年以上不破坏。
赭曲霉毒素微溶于水，溶于有机溶剂和稀的碳酸氢钵水溶液(如5％碳酸氢钠)中。
在紫外光下OA呈兰绿色荧光，OB呈兰色，OC呈亮绿色。
因OCT的分子量小，故无免疫原性，只有与蛋白质或多肽载体结合后，才能刺激机体产生相应抗体。
2．毒性
OCT中的OA的含量最高，且毒性最强，且主要侵害肾脏，是一种强烈的肾脏毒，当人和畜禽持续摄入含毒食物及饲料时，不仅会出现急性症状，也可形成严重的慢性中毒、致癌、致畸等。
1）急性毒性
OCT主要损害肾脏。病理变化包括肾小管萎缩，肾间质纤维化及肾小球透明样病变等。
2）慢性毒性
症状为肝脏可见实质细胞变性、透明变性、灶性坏死等，脾、淋巴结，扁桃体等组织也可观察到坏死性病变。
3）致癌性和致畸性
Broun等人用妊娠大白鼠作的实验证明有致畸性，蟹译等人用小白鼠作实验证明对肾脏有致癌性，按248～276ug／天持续投毒15周(总量为26—29mgOA)，即有肾细胞癌的发生。另外，给孕期7～12天的小白鼠腹腔注射5mg／kg体重的OA，出现胎鼠死亡率增加，胎鼠重量降低、畸形等。
三、OCT的检验
OCT酌检验方法与AFT基本相似，主要有生物学、化学和免疫学方法。
1．生物学方法
1）鸡胚试验(以OA为例)
将提取的OA用5％碳酸钠水溶液作不同倍数稀释，分别接种于5日龄的健康鸡胚气室内(或卵黄内)0．1ml，接种后每天观察鸡胚死亡情况直至21日龄。根据记录计算出LD50所需毒素量。
2）其它动物试验
用大白鼠，小白鼠。霰子，雏鸡、雏鸭等动物进行饲喂试验，均可检验OCT。
3）其它试验 也可利用抑菌试验、荧光反应、斑点试验等生物学方法检验OCT。
2．免疫学方法
1）抗体的制备(以OA为例)
OA为半抗原物质，必须与大分子载体结合后才具有免疫原性。将偶合抗原透析纯化与福氏完全佐剂乳化，免疫家兔即获得OA抗体。
2）检测
由于OCT在食品中含量都较低，用一般化学和生物学检测方法，常缺乏特异性或灵敏度不高，用免疫学检测法能克服这些缺点。
Michael(1983)利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大麦中的OA。另外，还采用斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)对OA进行了检测，也获得了满意的结果。
第十三节 镰刀菌及其毒素的检验
一、镰刀菌及其毒素的种类镰刀菌属的产毒菌主要有四种
1）第一种为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，此种菌一般侵染大米、麦类、玉米，产生的毒素为玉米赤霉烯酮等。
2）第二种为三线镰刀菌：本菌主要寄生于玉米和小麦上，可产生T-2毒素、玉米赤霉烯酮等；
3）第三种为梨孢镰刀菌：主要寄生于麦类和玉米上，产生T-2毒素，梨孢镰刀菌素等。
4）第四种为串珠镰刀菌：产生串珠镰刀菌素、赤霉菌素等。
由于镰刀菌侵染谷物的广泛性及严重性，以及该茵产生的毒素对人、畜健康的危害性。因此，镰刀菌及其毒素在国内外越来越引起人们的普遍重视。
二、毒素的特性
1、理化特性
玉米赤霉烯酮首先从赤霉病玉米中分离提取的，镰刀菌属的许多菌都产生本毒素，它又名F-2毒素、FES、RAL等。
T-2毒素是食品中酡一种重要的霉菌毒素，它主要由三线镰刀菌产生，梨孢镰刀菌等也可产生。
2．毒性
镰刀菌的毒素对人畜有强的毒害作用。
如玉米赤霉烯酮，随食品摄人机体后靶位点主要是生殖器官，还能通过胎盘屏障作用于胎儿，有此行激素的作用，主要可使畜、禽及啮齿类发生雌性激素亢进症。例如它可引起猪的发情综合症，对于妊娠牛和猪，可出现流产、死胎及畸胎。对锚匍鼠等也有类似的毒性。
T-2毒素随食品摄入机体后，其主要靶器官是消化道、造血系统、心脏、脾脏、子宫、淋巴结等。它能引起人食物中毒性白细胞缺乏症，内脏器官出血和骨髓造盘组织坏死，表现为恶心、腹痛、呕吐和全身无力等。
三．镰刀菌毒素的检验
l、样品的采集与处理
取样时要注意样品的代表性和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶、金属刀或勺等。样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。
粮食样品采集，可根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定点取样，即每屠的四角和中央分别采取部分样品混和后按四分法取样，每份不少于500g。少量存粮可使用金属小勺采取上、中、下各部位的混合样品。进口粮采样应在每一车、船采取表、上,中、下层4个样品。每层从5点取样混合：必要时采取有疑问的样品送检。
粮食加工食品(如面包等)，发酵食品、乳,肉、蛋、鱼及制品用灭菌工具采集可疑霉变食品25g，装入灭菌容器内检验。
2、检样方法
(1)形态学检查与分离鉴定
①镜检
霉变饲料直接涂片镜检阳性率不高，通常用培养在察氏培养基或玻片培养物作镜检。根据大型分生孢子的弯曲度(镰刀形弯曲——新月形)，顶端细胞(宽窄形状等)以及孢子的各种星态（镰刀形、纺锤形、披针形、新月形等)进行判断。
②分离培养将检样接种于察氏平板培养基中，每平皿接种玉米10粒，共种5个平皿。接种时，用镊子夹取玉米将胚部向下，轻轻压种于浅层，然后在22~C～28℃温箱中培养48小时，生长为茂盛的菌丝呈白色绒毛状，基质呈深肉色到红色，取菌丝做压滴标本镜检。
马铃薯培养基：生长茂盛，菌丝白。绒毛状，基质呈深绿色、黄褐色至红褐色。
米饭培养基：菌丝白色，绒毛状、生长茂盛，基质呈黄色到金黄色。
(2)毒素的提取和测定(以T-2毒素为例)
第十四节 青霉菌及其毒素的检样
一、青霉菌及其毒素的特性
青霉菌是属于曲霉科青霉属。
种类很多，分布很广，其中讦多菌株均能引起食品的霉烂，也有不少菌株能产生强烈的毒素。
黄绿青霉、桔青霉、冰岛青霉、扩展青霉、鲜绿青霉等，它们所产生毒素的毒性作用各异。
1．桔青霉素：
是一种能杀灭革兰氏阳性菌的抗生素，因其毒性太强，未能用于治疗。
本毒素主要得之于桔青霉、黄绿毒霉、鲜绿青霉等，它是“黄变米”中的霉菌毒素之一。桔青霉素为黄色针状结晶。
主要污染大米、小麦，大麦、燕麦和黑麦等。桔青霉素对小鼠经口LD50为110mg／kg。具有肾毒性，可使肾脏肿大、肾小管扩张、变性和坏死，有致突变性。
2．冰岛青霉毒素(1slanditoxin)
由冰岛青霉产剩，是“沤黄米”或“黄粒米”的主要原因。
“沤黄米”是稻谷未及时脱粒干燥而堆放，致使霉变．曳杠罕恍粒变黄。该毒素为含氯环状结构的肽类，无色针状结晶。
有快速肝毒性，染毒后短时间内即可引起肝脏空泡变性、坏死和肝小叶出血；小剂量长时间摄人，可使小鼠肝硬变、干纤维化和癌变。
3．黄绿青霉紊(Citreoviridin)
由黄绿青霉等产生，也是“黄变米”中的霉菌毒素之一。它是深黄色针状结晶。
它具有神经毒、肝毒性和血液毒。其神经毒具有嗜中枢性。
其慢性毒性主要表现于肝细胞萎缩和多形性及贫血。
二 检 验
1．样品的收集与处理 同镰刀菌
2．检验方法
(1)形态学鉴定
A桔青霉：
本菌属于不对称青霉菌，绒状青霉亚群，桔青霉系群。
在察氏琼脂培养基上于24－26度培养10－14天，菌落呈天鹅绒状，灰绿色，外缘呈白色，背面有黄色色素。外线照射下，可见黄色荧光。
B冰岛青霉：
属于双轮对称青霉群；
在察氏璋脂培养基上于室温培养两周，菌落通常具有显著的环带及轻微的放射性皱纹。背面溶出红褐色色素，带有色素颗粒。
分生孢于是卵圆形呈链状排列，壁厚、光滑，呈青灰色或灰绿色。
C 黄绿青霉：
属于单轮青霉群，在察氏琼指培养基上于室温培养12—14天，菌落呈天鹅绒状，中部隆起，有放射状大皱纹，灰绿色，最外侧呈白色。菌落上着生有黄色的水珠。背面溶出红黄色色素。在紫外光下照射菌落背面时可见黄色至棣棠花色的荧光。
显微镜下观察青霉菌的菌丝结构、孢子的形态及排列等特征。
(2)．毒素测定
