Chapter7 Protein的分离、纯化和表征
一,Protein的酸碱性质
(一) Protein的两性解离 ★
1、主链上两个末端 α— NH2和 α— COOH的解离
2、侧链上基团的解离
(二) Protein的等电点( PI)
1、定义:使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等,即净电
荷为零时的溶液的 pH值称为 PI(isoelectric point),
2、当 pH值 > PI 时,蛋白质带负电荷
当 pH值 <PI 时,蛋白质带正电荷
当 pH值 =PI 时,蛋白质带净电荷为零
3、等电点沉淀法用于分离纯化蛋白质
电泳分离
正极移动
负极移动
不移动
电泳
二,Protein的高分子性质
1、稳定性因素( 299页),( 1)胶体性质( 丁达尔现象、布郎运动) ;
( 2)形 成水化膜;( 3)双电离层
2、通透性:不易透过半透膜,可用透析的方法将蛋白质分子与其它
小分子物质分离,纯化蛋白质。
3、沉降系数( S):蛋白质在一定的溶剂中,经超速离心沉降,单
位力场中的沉降速度即该蛋白质的沉降系数,它表示沉
降分子的大小特性 。
三,Protein的变性与复性
1、定义:蛋白质在一定的理化因素的影响下,三维构象破坏,理化
性质发生改变和生物学活性丧失,叫变性作用( denaturation)。其本质是
高级结构破坏、一级结构不变。
蛋白质的复性:消除理化因素的影响,生物活性恢复或部分恢复。
加热凝固变性不可逆。
2、意义:生产和保存蛋白制品;消毒;提纯等应用。
四,Protein的沉淀( precipitation)
沉淀蛋白质的方法有
(一)盐溶盐析:中式盐,如硫酸铵,( 降低蛋白质与水的亲和力 );
(二)有机溶剂沉淀法:甲醇、乙醇、丙酮等 ( 破坏蛋白质胶粒上的水化层 );
(三)重金属盐沉淀法,产生 重金属蛋白盐沉淀;
(四)生物碱试剂和某些酸类沉淀法:鞣酸、苦味酸、硝酸等
(五)加热变性沉淀法
五,Protein的颜色反应
(一)茚三酮反应:在 pH5~7的溶液中,与茚三酮共热可产生蓝紫色物
质,用于蛋白质的定性和定量。
(二)双缩脲反应:与双缩脲试剂(即碱性铜溶液)反应生成紫红色络
合物,只与两个以上肽键化合物的特征反应。可用于蛋白质定性、定量或
蛋白质水解程度的测定。
(三)酚试剂反应:与酚试剂(磷钼酸 — 磷钨酸化合物)作用生成蓝
色物质,再用比色法定性和定量,其灵敏度比双缩脲反应高 100倍。
六,Protein吸收光谱的特点
Phe,Tyr,Trp 具有吸收紫外光的能力,最大的吸收峰为 280nm处,
此外,蛋白质分子中的肽键可引起 200~220nm的最大光吸收,可用于蛋
白质的定性和定量。
七,Protein分子的免疫学特性
免疫球蛋白的结构和功能 ◆
八,Protein的分离纯化及鉴定
(一) Protein的提取 ( 300页)
1、选材,
2、破碎,常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等 机械破碎法 。
3、提取,
(二) Protein的分离纯化
1、盐析法,中性盐分级沉淀法,常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由
于所带的电荷和水化程度不同,盐析时所需的盐的浓度也不相同,因而可以
将不同的蛋白质加以分离。
2、等电点沉淀法,净电荷为零,分子之间的静电排斥力最小,因而容易聚集
形成沉淀。 该法适用于在等电点 pH稳定的蛋白质。
3、有机溶剂沉淀法,甲醇、乙醇、丙酮等(保持低温), 破坏蛋白质
的水化层,使蛋白质的溶解度降低而沉淀 。
4、凝胶过滤( 303页)( 凝胶层析 ) (gel filtration chromatography):又
叫分子筛层析,常用的凝胶有交联葡聚糖 (sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶
(Bio-gel P)和琼脂糖凝胶 (Bio-gel A)等。常用于大分子物质的分离纯化,
以及蛋白质样品的脱盐和蛋白质分子量的测定等。
5,离子交换层析,
6、密度梯度(区带)离心:常用蔗糖密度梯度。
此外,有透析法、超过滤法、萃取法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 和
等电聚焦电泳,超速离心、亲和层析等。
The End
蛋白质与 氨基酸,多肽一
样,能够发生两性解离
(两性电解质),也有等
电点( PI)。
阳离子交换剂本身带负
电荷,阴离子交换剂本
身带正电荷。( 221页)
?此法又称为分子筛层析。凝胶过滤
所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖
或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠
的内部是多孔的网状结构。
?Sephadex-葡聚糖凝胶 G10-G200
?Sepharose-琼脂糖凝胶 2B,4B,6B
?Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶
S100,S200,S300,S400
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
( SDS学名为十二烷基磺酸钠)
SDS(十二烷基磺酸钠)
是一种阴离子型表面活
性剂,它能够与蛋白质
多肽链中的氨基酸残基
按大约 1 ? 2比例结合。
这样,每一个蛋白质分
子都因为结合了许多的
SDS而带有大量的负电
荷,而蛋白质分子原有
的电荷则可以忽略。由
于所有的蛋白质颗粒都
带有大量的负电荷,而
且它们的电荷密度也大
体相同,因此,E?q值接
近一个常数。所以该法
主要利用了蛋白质分子
量大小不同而分离蛋白
质。
等电聚焦电泳:两性电解质载体由多烯多胺与丙烯酸加合得
到,在电场作用下能形成连续的梯度。
电 泳 在等电点时蛋白质比较稳定,其物理性质如 导电性、溶解度、粘度、渗透压 等皆
最小。因此可利用蛋白质在
等电点时溶解度最小的特性
来制备或沉淀蛋白质。
在不同的 pH环境下,
蛋白质的电学性质不同。
在等电点偏酸性溶液中,
蛋白质粒子带正电荷,
在电场中向负极移动;
在等电点偏碱性溶液中,
蛋白质粒子带负电荷,
在电场中向正极移动。
这种现象称为蛋白质电
泳。
一,Protein的酸碱性质
(一) Protein的两性解离 ★
1、主链上两个末端 α— NH2和 α— COOH的解离
2、侧链上基团的解离
(二) Protein的等电点( PI)
1、定义:使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等,即净电
荷为零时的溶液的 pH值称为 PI(isoelectric point),
2、当 pH值 > PI 时,蛋白质带负电荷
当 pH值 <PI 时,蛋白质带正电荷
当 pH值 =PI 时,蛋白质带净电荷为零
3、等电点沉淀法用于分离纯化蛋白质
电泳分离
正极移动
负极移动
不移动
电泳
二,Protein的高分子性质
1、稳定性因素( 299页),( 1)胶体性质( 丁达尔现象、布郎运动) ;
( 2)形 成水化膜;( 3)双电离层
2、通透性:不易透过半透膜,可用透析的方法将蛋白质分子与其它
小分子物质分离,纯化蛋白质。
3、沉降系数( S):蛋白质在一定的溶剂中,经超速离心沉降,单
位力场中的沉降速度即该蛋白质的沉降系数,它表示沉
降分子的大小特性 。
三,Protein的变性与复性
1、定义:蛋白质在一定的理化因素的影响下,三维构象破坏,理化
性质发生改变和生物学活性丧失,叫变性作用( denaturation)。其本质是
高级结构破坏、一级结构不变。
蛋白质的复性:消除理化因素的影响,生物活性恢复或部分恢复。
加热凝固变性不可逆。
2、意义:生产和保存蛋白制品;消毒;提纯等应用。
四,Protein的沉淀( precipitation)
沉淀蛋白质的方法有
(一)盐溶盐析:中式盐,如硫酸铵,( 降低蛋白质与水的亲和力 );
(二)有机溶剂沉淀法:甲醇、乙醇、丙酮等 ( 破坏蛋白质胶粒上的水化层 );
(三)重金属盐沉淀法,产生 重金属蛋白盐沉淀;
(四)生物碱试剂和某些酸类沉淀法:鞣酸、苦味酸、硝酸等
(五)加热变性沉淀法
五,Protein的颜色反应
(一)茚三酮反应:在 pH5~7的溶液中,与茚三酮共热可产生蓝紫色物
质,用于蛋白质的定性和定量。
(二)双缩脲反应:与双缩脲试剂(即碱性铜溶液)反应生成紫红色络
合物,只与两个以上肽键化合物的特征反应。可用于蛋白质定性、定量或
蛋白质水解程度的测定。
(三)酚试剂反应:与酚试剂(磷钼酸 — 磷钨酸化合物)作用生成蓝
色物质,再用比色法定性和定量,其灵敏度比双缩脲反应高 100倍。
六,Protein吸收光谱的特点
Phe,Tyr,Trp 具有吸收紫外光的能力,最大的吸收峰为 280nm处,
此外,蛋白质分子中的肽键可引起 200~220nm的最大光吸收,可用于蛋
白质的定性和定量。
七,Protein分子的免疫学特性
免疫球蛋白的结构和功能 ◆
八,Protein的分离纯化及鉴定
(一) Protein的提取 ( 300页)
1、选材,
2、破碎,常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等 机械破碎法 。
3、提取,
(二) Protein的分离纯化
1、盐析法,中性盐分级沉淀法,常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由
于所带的电荷和水化程度不同,盐析时所需的盐的浓度也不相同,因而可以
将不同的蛋白质加以分离。
2、等电点沉淀法,净电荷为零,分子之间的静电排斥力最小,因而容易聚集
形成沉淀。 该法适用于在等电点 pH稳定的蛋白质。
3、有机溶剂沉淀法,甲醇、乙醇、丙酮等(保持低温), 破坏蛋白质
的水化层,使蛋白质的溶解度降低而沉淀 。
4、凝胶过滤( 303页)( 凝胶层析 ) (gel filtration chromatography):又
叫分子筛层析,常用的凝胶有交联葡聚糖 (sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶
(Bio-gel P)和琼脂糖凝胶 (Bio-gel A)等。常用于大分子物质的分离纯化,
以及蛋白质样品的脱盐和蛋白质分子量的测定等。
5,离子交换层析,
6、密度梯度(区带)离心:常用蔗糖密度梯度。
此外,有透析法、超过滤法、萃取法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 和
等电聚焦电泳,超速离心、亲和层析等。
The End
蛋白质与 氨基酸,多肽一
样,能够发生两性解离
(两性电解质),也有等
电点( PI)。
阳离子交换剂本身带负
电荷,阴离子交换剂本
身带正电荷。( 221页)
?此法又称为分子筛层析。凝胶过滤
所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖
或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠
的内部是多孔的网状结构。
?Sephadex-葡聚糖凝胶 G10-G200
?Sepharose-琼脂糖凝胶 2B,4B,6B
?Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶
S100,S200,S300,S400
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
( SDS学名为十二烷基磺酸钠)
SDS(十二烷基磺酸钠)
是一种阴离子型表面活
性剂,它能够与蛋白质
多肽链中的氨基酸残基
按大约 1 ? 2比例结合。
这样,每一个蛋白质分
子都因为结合了许多的
SDS而带有大量的负电
荷,而蛋白质分子原有
的电荷则可以忽略。由
于所有的蛋白质颗粒都
带有大量的负电荷,而
且它们的电荷密度也大
体相同,因此,E?q值接
近一个常数。所以该法
主要利用了蛋白质分子
量大小不同而分离蛋白
质。
等电聚焦电泳:两性电解质载体由多烯多胺与丙烯酸加合得
到,在电场作用下能形成连续的梯度。
电 泳 在等电点时蛋白质比较稳定,其物理性质如 导电性、溶解度、粘度、渗透压 等皆
最小。因此可利用蛋白质在
等电点时溶解度最小的特性
来制备或沉淀蛋白质。
在不同的 pH环境下,
蛋白质的电学性质不同。
在等电点偏酸性溶液中,
蛋白质粒子带正电荷,
在电场中向负极移动;
在等电点偏碱性溶液中,
蛋白质粒子带负电荷,
在电场中向正极移动。
这种现象称为蛋白质电
泳。