Chapter7 Protein的分离、纯化和表征
一,Protein的酸碱性质
（一） Protein的两性解离 ★
1、主链上两个末端 α— NH2和 α— COOH的解离
2、侧链上基团的解离
（二） Protein的等电点（ PI）
1、定义：使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等，即净电
荷为零时的溶液的 pH值称为 PI(isoelectric point),
2、当 pH值 > PI 时，蛋白质带负电荷
当 pH值 <PI 时，蛋白质带正电荷
当 pH值 =PI 时，蛋白质带净电荷为零
3、等电点沉淀法用于分离纯化蛋白质
电泳分离
正极移动
负极移动
不移动
电泳
二,Protein的高分子性质
1、稳定性因素（ 299页）,（ 1）胶体性质（ 丁达尔现象、布郎运动） ；
（ 2）形 成水化膜；（ 3）双电离层
2、通透性：不易透过半透膜，可用透析的方法将蛋白质分子与其它
小分子物质分离，纯化蛋白质。
3、沉降系数（ S）：蛋白质在一定的溶剂中，经超速离心沉降，单
位力场中的沉降速度即该蛋白质的沉降系数,它表示沉
降分子的大小特性 。
三,Protein的变性与复性
1、定义：蛋白质在一定的理化因素的影响下，三维构象破坏，理化
性质发生改变和生物学活性丧失，叫变性作用（ denaturation)。其本质是
高级结构破坏、一级结构不变。
蛋白质的复性：消除理化因素的影响，生物活性恢复或部分恢复。
加热凝固变性不可逆。
2、意义：生产和保存蛋白制品；消毒；提纯等应用。
四,Protein的沉淀（ precipitation)
沉淀蛋白质的方法有
（一）盐溶盐析：中式盐，如硫酸铵,（ 降低蛋白质与水的亲和力 ）；
（二）有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等 （ 破坏蛋白质胶粒上的水化层 ）；
（三）重金属盐沉淀法,产生 重金属蛋白盐沉淀；
（四）生物碱试剂和某些酸类沉淀法：鞣酸、苦味酸、硝酸等
（五）加热变性沉淀法
五,Protein的颜色反应
（一）茚三酮反应：在 pH5~7的溶液中，与茚三酮共热可产生蓝紫色物
质，用于蛋白质的定性和定量。
（二）双缩脲反应：与双缩脲试剂（即碱性铜溶液）反应生成紫红色络
合物，只与两个以上肽键化合物的特征反应。可用于蛋白质定性、定量或
蛋白质水解程度的测定。
（三）酚试剂反应：与酚试剂（磷钼酸 — 磷钨酸化合物）作用生成蓝
色物质，再用比色法定性和定量，其灵敏度比双缩脲反应高 100倍。
六,Protein吸收光谱的特点
Phe,Tyr,Trp 具有吸收紫外光的能力，最大的吸收峰为 280nm处，
此外，蛋白质分子中的肽键可引起 200~220nm的最大光吸收，可用于蛋
白质的定性和定量。
七,Protein分子的免疫学特性
免疫球蛋白的结构和功能 ◆
八,Protein的分离纯化及鉴定
（一） Protein的提取 （ 300页）
1、选材,
2、破碎,常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等 机械破碎法 。
3、提取,
（二） Protein的分离纯化
1、盐析法,中性盐分级沉淀法,常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由
于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以
将不同的蛋白质加以分离。
2、等电点沉淀法,净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集
形成沉淀。 该法适用于在等电点 pH稳定的蛋白质。
3、有机溶剂沉淀法,甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温）, 破坏蛋白质
的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀 。
4、凝胶过滤（ 303页）（ 凝胶层析 ） (gel filtration chromatography):又
叫分子筛层析，常用的凝胶有交联葡聚糖 (sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶
(Bio-gel P)和琼脂糖凝胶 (Bio-gel A)等。常用于大分子物质的分离纯化，
以及蛋白质样品的脱盐和蛋白质分子量的测定等。
5,离子交换层析,
6、密度梯度（区带）离心：常用蔗糖密度梯度。
此外，有透析法、超过滤法、萃取法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 和
等电聚焦电泳,超速离心、亲和层析等。
The End
蛋白质与 氨基酸,多肽一
样，能够发生两性解离
（两性电解质），也有等
电点（ PI）。
阳离子交换剂本身带负
电荷，阴离子交换剂本
身带正电荷。（ 221页）
?此法又称为分子筛层析。凝胶过滤
所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖
或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠
的内部是多孔的网状结构。
?Sephadex-葡聚糖凝胶 G10-G200
?Sepharose-琼脂糖凝胶 2B,4B,6B
?Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶
S100,S200,S300,S400
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
（ SDS学名为十二烷基磺酸钠）
SDS（十二烷基磺酸钠）
是一种阴离子型表面活
性剂，它能够与蛋白质
多肽链中的氨基酸残基
按大约 1 ? 2比例结合。
这样，每一个蛋白质分
子都因为结合了许多的
SDS而带有大量的负电
荷，而蛋白质分子原有
的电荷则可以忽略。由
于所有的蛋白质颗粒都
带有大量的负电荷，而
且它们的电荷密度也大
体相同，因此,E?q值接
近一个常数。所以该法
主要利用了蛋白质分子
量大小不同而分离蛋白
质。
等电聚焦电泳：两性电解质载体由多烯多胺与丙烯酸加合得
到，在电场作用下能形成连续的梯度。
电 泳 在等电点时蛋白质比较稳定，其物理性质如 导电性、溶解度、粘度、渗透压 等皆
最小。因此可利用蛋白质在
等电点时溶解度最小的特性
来制备或沉淀蛋白质。
在不同的 pH环境下，
蛋白质的电学性质不同。
在等电点偏酸性溶液中，
蛋白质粒子带正电荷，
在电场中向负极移动；
在等电点偏碱性溶液中，
蛋白质粒子带负电荷，
在电场中向正极移动。
这种现象称为蛋白质电
泳。
一,Protein的酸碱性质
（一） Protein的两性解离 ★
1、主链上两个末端 α— NH2和 α— COOH的解离
2、侧链上基团的解离
（二） Protein的等电点（ PI）
1、定义：使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等，即净电
荷为零时的溶液的 pH值称为 PI(isoelectric point),
2、当 pH值 > PI 时，蛋白质带负电荷
当 pH值 <PI 时，蛋白质带正电荷
当 pH值 =PI 时，蛋白质带净电荷为零
3、等电点沉淀法用于分离纯化蛋白质
电泳分离
正极移动
负极移动
不移动
电泳
二,Protein的高分子性质
1、稳定性因素（ 299页）,（ 1）胶体性质（ 丁达尔现象、布郎运动） ；
（ 2）形 成水化膜；（ 3）双电离层
2、通透性：不易透过半透膜，可用透析的方法将蛋白质分子与其它
小分子物质分离，纯化蛋白质。
3、沉降系数（ S）：蛋白质在一定的溶剂中，经超速离心沉降，单
位力场中的沉降速度即该蛋白质的沉降系数,它表示沉
降分子的大小特性 。
三,Protein的变性与复性
1、定义：蛋白质在一定的理化因素的影响下，三维构象破坏，理化
性质发生改变和生物学活性丧失，叫变性作用（ denaturation)。其本质是
高级结构破坏、一级结构不变。
蛋白质的复性：消除理化因素的影响，生物活性恢复或部分恢复。
加热凝固变性不可逆。
2、意义：生产和保存蛋白制品；消毒；提纯等应用。
四,Protein的沉淀（ precipitation)
沉淀蛋白质的方法有
（一）盐溶盐析：中式盐，如硫酸铵,（ 降低蛋白质与水的亲和力 ）；
（二）有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等 （ 破坏蛋白质胶粒上的水化层 ）；
（三）重金属盐沉淀法,产生 重金属蛋白盐沉淀；
（四）生物碱试剂和某些酸类沉淀法：鞣酸、苦味酸、硝酸等
（五）加热变性沉淀法
五,Protein的颜色反应
（一）茚三酮反应：在 pH5~7的溶液中，与茚三酮共热可产生蓝紫色物
质，用于蛋白质的定性和定量。
（二）双缩脲反应：与双缩脲试剂（即碱性铜溶液）反应生成紫红色络
合物，只与两个以上肽键化合物的特征反应。可用于蛋白质定性、定量或
蛋白质水解程度的测定。
（三）酚试剂反应：与酚试剂（磷钼酸 — 磷钨酸化合物）作用生成蓝
色物质，再用比色法定性和定量，其灵敏度比双缩脲反应高 100倍。
六,Protein吸收光谱的特点
Phe,Tyr,Trp 具有吸收紫外光的能力，最大的吸收峰为 280nm处，
此外，蛋白质分子中的肽键可引起 200~220nm的最大光吸收，可用于蛋
白质的定性和定量。
七,Protein分子的免疫学特性
免疫球蛋白的结构和功能 ◆
八,Protein的分离纯化及鉴定
（一） Protein的提取 （ 300页）
1、选材,
2、破碎,常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等 机械破碎法 。
3、提取,
（二） Protein的分离纯化
1、盐析法,中性盐分级沉淀法,常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由
于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以
将不同的蛋白质加以分离。
2、等电点沉淀法,净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集
形成沉淀。 该法适用于在等电点 pH稳定的蛋白质。
3、有机溶剂沉淀法,甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温）, 破坏蛋白质
的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀 。
4、凝胶过滤（ 303页）（ 凝胶层析 ） (gel filtration chromatography):又
叫分子筛层析，常用的凝胶有交联葡聚糖 (sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶
(Bio-gel P)和琼脂糖凝胶 (Bio-gel A)等。常用于大分子物质的分离纯化，
以及蛋白质样品的脱盐和蛋白质分子量的测定等。
5,离子交换层析,
6、密度梯度（区带）离心：常用蔗糖密度梯度。
此外，有透析法、超过滤法、萃取法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 和
等电聚焦电泳,超速离心、亲和层析等。
The End
蛋白质与 氨基酸,多肽一
样，能够发生两性解离
（两性电解质），也有等
电点（ PI）。
阳离子交换剂本身带负
电荷，阴离子交换剂本
身带正电荷。（ 221页）
?此法又称为分子筛层析。凝胶过滤
所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖
或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠
的内部是多孔的网状结构。
?Sephadex-葡聚糖凝胶 G10-G200
?Sepharose-琼脂糖凝胶 2B,4B,6B
?Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶
S100,S200,S300,S400
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
（ SDS学名为十二烷基磺酸钠）
SDS（十二烷基磺酸钠）
是一种阴离子型表面活
性剂，它能够与蛋白质
多肽链中的氨基酸残基
按大约 1 ? 2比例结合。
这样，每一个蛋白质分
子都因为结合了许多的
SDS而带有大量的负电
荷，而蛋白质分子原有
的电荷则可以忽略。由
于所有的蛋白质颗粒都
带有大量的负电荷，而
且它们的电荷密度也大
体相同，因此,E?q值接
近一个常数。所以该法
主要利用了蛋白质分子
量大小不同而分离蛋白
质。
等电聚焦电泳：两性电解质载体由多烯多胺与丙烯酸加合得
到，在电场作用下能形成连续的梯度。
电 泳 在等电点时蛋白质比较稳定，其物理性质如 导电性、溶解度、粘度、渗透压 等皆
最小。因此可利用蛋白质在
等电点时溶解度最小的特性
来制备或沉淀蛋白质。
在不同的 pH环境下，
蛋白质的电学性质不同。
在等电点偏酸性溶液中，
蛋白质粒子带正电荷，
在电场中向负极移动；
在等电点偏碱性溶液中，
蛋白质粒子带负电荷，
在电场中向正极移动。
这种现象称为蛋白质电
泳。
