Chapter35 DNA的重组与基因工程
基因重组与基因工程？
Genetic recombination
Chapter35 DNA的重组与基因工程
一,DNA的重组的分类
同源重组、特异位点重组和转座重组等类型
二、自然界的基因转移和重组
自然界的基因转移和重组是无目的
基因工程有目的
基因重组 (genetic recombination)— — 整段
DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进
行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译。
Chapter35 DNA的重组与基因工程
二、自然界的基因转移和重组
1、结合作用
结合作用 —— 质粒 DNA从一个细胞（细菌）转移至另一
个细胞（细菌）
2、转化及转导作用
（ 1）转化作用 transformation
通过自动获取或人为地供给外源 DNA，使细胞或培养
的受体细胞获得新的遗传表型的过程
（ 2）转导作用 transduction
病毒、噬菌体介导
溶菌途径 溶原菌途径
3、转 座
（ 2）转导作用 transduction
病毒、噬菌体介导
溶菌途径 溶原菌途径
溶原
裂解
2、转化及转导作用
3、转 座
转 座
反向重复序列
由可移动的 DNA序列（插入序列和转
座子）介导的基因移位或重排
①插入序列转座
保守性转座 复制性转座
反向重复序列 转座酶
②转座子转座
转座子 — 可以从一个染色体位点转
移至另一位点的分散的重复序列
Chapter35 DNA的重组与基因工程
二、自然界的基因转移和重组
4、基因重组
不同 DNA 分子间发生的共价连接称重组
（一）位点特异的重组
特异位点
（二）同源重组
同源序列间的重组
Chapter35 DNA的重组与基因工程
三、重组 DNA技术
1973 Cohen第一例成功的克隆实验
1978 Genentech公司 人胰岛素 世界
上第一种基因工程蛋白药物
1982 第一个基因工程药物 --重组人胰岛素在
英、美获准使用
1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），
中国 转基因鱼
? 1993 基因工程西红柿在美国上市
? 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊
? 1999.9 中国获准加入人类基因组计划,负责
测定人类基因组全部序列的 1%
? 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图
? 2001.2.11 公布人类基因组基本信息
? 生物技术工程,基因工程、蛋白质工程、酶工
程、细胞工程
Chapter35 DNA的重组与基因工程
三、重组 DNA技术
? 胰岛素
? 人生长激素
? 干扰素
? 白细胞介素 2
? 粒细胞集落刺激因子
? 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
? 红细胞生成素 EPO
? 组织纤溶酶原激活剂
? 生长激素
? 促生长素
? 抗血友病因子 Ⅷ
? 脱氧核糖核酸酶
? 葡糖脑苷脂酶
? 鼠单克隆抗体
Chapter35 DNA的重组与基因工程
三、重组 DNA技术
（一）重组 DNA技术的相关概念
1,DNA克隆
克隆（ clone） 无性繁殖
分子克隆 (DNA克隆 )— 应用酶学的方法，在体外将 目的基
因 与 载体 DNA结合成一具有自我复制能力的 DNA分子
（ 复制子、重组体 ），继而通过转化或转染宿主细胞、
筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提
取获得大量同一 DNA分子拷贝，或其 表达产物 。
基因克隆,DNA重组,
基因工程 (genetic engineering)
? 基因克隆示意图
目的基因
载体 DNA
( 限制性内切酶切开 )
宿主细胞
重组体
已转化的宿主细胞
繁殖
阳性克隆株
表达
2、工具酶
常用的工具酶
限制性核酸内切酶 切割 DNA
DNA连接酶 生成 3′- 5′磷酸二酯键
DNA聚合酶 Ⅰ 探针标记、补平 3′末端
反转录酶 cDNA合成
多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记
末端转移酶 3′末端多聚尾
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
（一）重组 DNA技术的相关概念
限制性核酸内切酶
细菌限制修饰体系
限制性核酸内切酶 甲基化酶
识别特异的位点 — 酶切位点
回文结构 4～ 6 bp
出现两种末端
粘性末端 粘端
平头末端 平端
配伍末端
G A A T T C
C T T A A G
E c o R Ⅰ
C C C G G G
G G G C C C
S m a l Ⅰ
（一）重组 DNA技术的相关概念
目的基因（外源基因）
cDNA 逆转录
基因组 DNA
基因工程的目的
目的基因拷贝 克隆载体
基因表达产物 表达载体
3、目的基因 target DNA
（一）重组 DNA技术的相关概念
自我复制
克隆载体、表达载体
原核载体,质粒 (pBR322,pUC… ）噬菌体（ λ,M13）
真核载体,动物病毒载体 pLXSN
质粒 — 存在于细菌染色体外的小型环状双链 DNA分子
理想的质粒
1.拷贝数多 ;
2.两三个抗药性基因 terr ampr
筛选标志
3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一）
（一）重组 DNA技术的相关概念
4、基因载体 vector
p B R 3 2 2
E c o R Ⅰ
Hi n d Ⅲ
B a m H Ⅰ
Av a Ⅰ
P v u Ⅱ
S a l Ⅰ
P s t Ⅰ
O r i
氨苄青霉素
抗性基因
四环素
抗性基因
Chapter35 DNA的重组与基因工程
三、重组 DNA技术基本原理
（一）目的基因获得
1、化学合成法
2、基因组 DNA
基因组 DNA文库 — 存在于转化细菌中、克隆
载体携带的所有基因组 DNA的集合
3,cDNA
cDNA文库
4、聚合酶链式反应 PCR
(二 )克隆载体的选择和构建
(三 )外源基因与载体的连接（ DNA连接酶）
连接方式
1,粘性末端连接 连接效率高
相同酶切末端
配伍末端
2.平端连接 连接效率低
3.同聚物接尾法
4.人工接头法
Chapter35 DNA的重组与基因工程
三、重组 DNA技术基本原理
目的基因载体 DNA
+d G T P
+d C T P
P o ly G
P o ly C
3′
3′
3′
3′
重组 DNA技术简图
(四 ) 重组 DNA导入受体菌
基因工程菌 HB101,JM109
转化
制备感受态细胞 冷的氯化钙处理
细胞处于最适摄取和容忍外来 DNA的生理状态
Chapter35 DNA的重组与基因工程
三、重组 DNA技术基本原理
(五 )重组体的筛选 screening/selection
1,直接选择法
抗药性标志选择
标志补救 表达产物与营养缺陷互补
α— 互补 蓝白斑筛选
分子杂交 探针
原位杂交 /Southern印迹法
限制性酶切图谱 /PCR
2.非直接选择法 免疫学方法
Chapter35 DNA的重组与基因工程
三、重组 DNA技术基本原理
(六 )克隆基因的表达
载体有转录、翻译的元件
密码子通用
1, 原核表达体系
原核表达载体的标准
? 合适的筛选标志
? 强启动子
? 翻译控制序列
? 多克隆位点
Chapter35 DNA的重组与基因工程
三、重组 DNA技术基本原理
Chapter35 DNA的重组与基因工程
四、重组 DNA技术与医学的关系
分子医学 molecular medicine
（一）疾病基因的发现
（二）发展生物制药
基因工程药物
基因工程疫苗
（三） DNA诊断 基因诊断
基因诊断 — 用分子生物学的技术对引起疾病
的原因 --遗传基因,致病微生物和寄生虫,以及
某些恶性肿瘤在基因水平上进行病原学和细胞
遗传基因的检测和分析, DNA/RNA
Chapter35 DNA的重组与基因工程
四、重组 DNA技术与医学的关系
（四）基因治疗 gene therapy
基因治疗 — 就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能
基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治
疗的目的。
1、基因置换
2、基因修正
3、基因修饰 产物补偿缺陷细胞
4、基因失活 反义技术封闭基因,抑制有害基因
对象 体细胞 生殖细胞 本章完
基因重组与基因工程？
Genetic recombination
Chapter35 DNA的重组与基因工程
一,DNA的重组的分类
同源重组、特异位点重组和转座重组等类型
二、自然界的基因转移和重组
自然界的基因转移和重组是无目的
基因工程有目的
基因重组 (genetic recombination)— — 整段
DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进
行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译。
Chapter35 DNA的重组与基因工程
二、自然界的基因转移和重组
1、结合作用
结合作用 —— 质粒 DNA从一个细胞（细菌）转移至另一
个细胞（细菌）
2、转化及转导作用
（ 1）转化作用 transformation
通过自动获取或人为地供给外源 DNA，使细胞或培养
的受体细胞获得新的遗传表型的过程
（ 2）转导作用 transduction
病毒、噬菌体介导
溶菌途径 溶原菌途径
3、转 座
（ 2）转导作用 transduction
病毒、噬菌体介导
溶菌途径 溶原菌途径
溶原
裂解
2、转化及转导作用
3、转 座
转 座
反向重复序列
由可移动的 DNA序列（插入序列和转
座子）介导的基因移位或重排
①插入序列转座
保守性转座 复制性转座
反向重复序列 转座酶
②转座子转座
转座子 — 可以从一个染色体位点转
移至另一位点的分散的重复序列
Chapter35 DNA的重组与基因工程
二、自然界的基因转移和重组
4、基因重组
不同 DNA 分子间发生的共价连接称重组
（一）位点特异的重组
特异位点
（二）同源重组
同源序列间的重组
Chapter35 DNA的重组与基因工程
三、重组 DNA技术
1973 Cohen第一例成功的克隆实验
1978 Genentech公司 人胰岛素 世界
上第一种基因工程蛋白药物
1982 第一个基因工程药物 --重组人胰岛素在
英、美获准使用
1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），
中国 转基因鱼
? 1993 基因工程西红柿在美国上市
? 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊
? 1999.9 中国获准加入人类基因组计划,负责
测定人类基因组全部序列的 1%
? 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图
? 2001.2.11 公布人类基因组基本信息
? 生物技术工程,基因工程、蛋白质工程、酶工
程、细胞工程
Chapter35 DNA的重组与基因工程
三、重组 DNA技术
? 胰岛素
? 人生长激素
? 干扰素
? 白细胞介素 2
? 粒细胞集落刺激因子
? 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
? 红细胞生成素 EPO
? 组织纤溶酶原激活剂
? 生长激素
? 促生长素
? 抗血友病因子 Ⅷ
? 脱氧核糖核酸酶
? 葡糖脑苷脂酶
? 鼠单克隆抗体
Chapter35 DNA的重组与基因工程
三、重组 DNA技术
（一）重组 DNA技术的相关概念
1,DNA克隆
克隆（ clone） 无性繁殖
分子克隆 (DNA克隆 )— 应用酶学的方法，在体外将 目的基
因 与 载体 DNA结合成一具有自我复制能力的 DNA分子
（ 复制子、重组体 ），继而通过转化或转染宿主细胞、
筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提
取获得大量同一 DNA分子拷贝，或其 表达产物 。
基因克隆,DNA重组,
基因工程 (genetic engineering)
? 基因克隆示意图
目的基因
载体 DNA
( 限制性内切酶切开 )
宿主细胞
重组体
已转化的宿主细胞
繁殖
阳性克隆株
表达
2、工具酶
常用的工具酶
限制性核酸内切酶 切割 DNA
DNA连接酶 生成 3′- 5′磷酸二酯键
DNA聚合酶 Ⅰ 探针标记、补平 3′末端
反转录酶 cDNA合成
多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记
末端转移酶 3′末端多聚尾
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
（一）重组 DNA技术的相关概念
限制性核酸内切酶
细菌限制修饰体系
限制性核酸内切酶 甲基化酶
识别特异的位点 — 酶切位点
回文结构 4～ 6 bp
出现两种末端
粘性末端 粘端
平头末端 平端
配伍末端
G A A T T C
C T T A A G
E c o R Ⅰ
C C C G G G
G G G C C C
S m a l Ⅰ
（一）重组 DNA技术的相关概念
目的基因（外源基因）
cDNA 逆转录
基因组 DNA
基因工程的目的
目的基因拷贝 克隆载体
基因表达产物 表达载体
3、目的基因 target DNA
（一）重组 DNA技术的相关概念
自我复制
克隆载体、表达载体
原核载体,质粒 (pBR322,pUC… ）噬菌体（ λ,M13）
真核载体,动物病毒载体 pLXSN
质粒 — 存在于细菌染色体外的小型环状双链 DNA分子
理想的质粒
1.拷贝数多 ;
2.两三个抗药性基因 terr ampr
筛选标志
3.合适的限制性内切酶酶切位点（单一）
（一）重组 DNA技术的相关概念
4、基因载体 vector
p B R 3 2 2
E c o R Ⅰ
Hi n d Ⅲ
B a m H Ⅰ
Av a Ⅰ
P v u Ⅱ
S a l Ⅰ
P s t Ⅰ
O r i
氨苄青霉素
抗性基因
四环素
抗性基因
Chapter35 DNA的重组与基因工程
三、重组 DNA技术基本原理
（一）目的基因获得
1、化学合成法
2、基因组 DNA
基因组 DNA文库 — 存在于转化细菌中、克隆
载体携带的所有基因组 DNA的集合
3,cDNA
cDNA文库
4、聚合酶链式反应 PCR
(二 )克隆载体的选择和构建
(三 )外源基因与载体的连接（ DNA连接酶）
连接方式
1,粘性末端连接 连接效率高
相同酶切末端
配伍末端
2.平端连接 连接效率低
3.同聚物接尾法
4.人工接头法
Chapter35 DNA的重组与基因工程
三、重组 DNA技术基本原理
目的基因载体 DNA
+d G T P
+d C T P
P o ly G
P o ly C
3′
3′
3′
3′
重组 DNA技术简图
(四 ) 重组 DNA导入受体菌
基因工程菌 HB101,JM109
转化
制备感受态细胞 冷的氯化钙处理
细胞处于最适摄取和容忍外来 DNA的生理状态
Chapter35 DNA的重组与基因工程
三、重组 DNA技术基本原理
(五 )重组体的筛选 screening/selection
1,直接选择法
抗药性标志选择
标志补救 表达产物与营养缺陷互补
α— 互补 蓝白斑筛选
分子杂交 探针
原位杂交 /Southern印迹法
限制性酶切图谱 /PCR
2.非直接选择法 免疫学方法
Chapter35 DNA的重组与基因工程
三、重组 DNA技术基本原理
(六 )克隆基因的表达
载体有转录、翻译的元件
密码子通用
1, 原核表达体系
原核表达载体的标准
? 合适的筛选标志
? 强启动子
? 翻译控制序列
? 多克隆位点
Chapter35 DNA的重组与基因工程
三、重组 DNA技术基本原理
Chapter35 DNA的重组与基因工程
四、重组 DNA技术与医学的关系
分子医学 molecular medicine
（一）疾病基因的发现
（二）发展生物制药
基因工程药物
基因工程疫苗
（三） DNA诊断 基因诊断
基因诊断 — 用分子生物学的技术对引起疾病
的原因 --遗传基因,致病微生物和寄生虫,以及
某些恶性肿瘤在基因水平上进行病原学和细胞
遗传基因的检测和分析, DNA/RNA
Chapter35 DNA的重组与基因工程
四、重组 DNA技术与医学的关系
（四）基因治疗 gene therapy
基因治疗 — 就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能
基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治
疗的目的。
1、基因置换
2、基因修正
3、基因修饰 产物补偿缺陷细胞
4、基因失活 反义技术封闭基因,抑制有害基因
对象 体细胞 生殖细胞 本章完
