实验一 血糖的斐林法测定 一、实验目的 掌握Folin-Wu法测定血糖含量的原理和方法。 二、实验原理 1.血糖指的是血液中哪一种糖？ 葡萄糖是血液主要的糖类，因此测血糖含量就是测血液中葡萄糖的含量。 2.用什么方法测定？ 测定血液中葡萄糖的含量，即测复杂组分中一种物质的量，根据生化实验基本技术的原理，可采用分光光度法（比色法）进行测定。 3.葡萄糖可以用比色法直接测定吗？ 不行，可以用间接的方法。血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）。血糖的含量与产生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合物的量成正比，可以用比色的方法进行测定。 三、材料、仪器与试剂 （一）、材料：动物血液 （二）、仪器（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定） 分光光度计、血糖管、奥氏吸管、水浴锅、表面皿 （三）、药品（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制） 标准葡萄糖溶液、碱性硫酸铜溶液（A、B液）、酸性钼酸盐溶液、10％钨酸钠溶液、0.33mol/L硫酸溶液 四、实验操作： 1.无蛋白血滤液的制备 用奥氏吸管吸取已加抗凝剂的全血1ml，缓缓放入20ml锥形瓶中，加水7ml，摇匀，血液变成红色透明时加10％钨酸钠1ml， 摇匀，再加 0.33mol /L 硫酸，随加随摇，加完放置5～15min，至沉淀由鲜红变为暗棕色，滤纸过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于0.1ml全血。 2.血糖的测定 取具25ml刻度的血糖管3只，编号，用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第一只血糖管中，于第二只血糖管中加2ml标准葡萄糖溶液。第三只血糖管中加2ml蒸馏水。然后各加2ml新配置的碱性硫酸铜溶液，同时置沸水浴内煮6min，取出，在流水中迅速冷却，各加入4ml酸性钼酸盐溶液，1min后以蒸馏水稀释至25ml，混匀，倒入比色杯，用722型风光光度计于420～440nm波长比色（先以空白管调节零点，然后测标准管和样品管）。 五、计算 按下式计算100ml全血中所含的血糖质量（mg）。 m＝ A1C0 A0 / 0.1 x100 式中：m：100ml血中所含的糖质量 C0：标准葡萄糖溶液浓度 A1：样品溶液吸光度 A0：标准溶液吸光度 六、注意事项 1.欲得准确结果，所取血液的量必须准确。如果由吸管中放出血液的速度太快，会有大量血液粘在吸管内壁，容量不准，所以一般放出1ml血液所用的时间不应少于1min。 2.沉淀由鲜红变为暗棕色，是因钨酸钠与硫酸作用生成钨酸，在适当酸度时，使血红蛋白变性、沉淀。如血沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊，可在钨酸与血混合液中加入10％硫酸1～2滴，待变为暗棕色后再滤。 实验二 种子粗脂肪的提取 一、实验目的 脂肪广泛存在于油料植物种子和果实中，测定脂肪的含量，可以鉴别其品质的优劣，也是油料作物选种和种质资源调查的常规测定项目。 二、实验原理 在了解了实验目的之后，关于这个实验有以下几个问题需要大家思考： 1.种子成分很复杂，脂肪的提取如何进行？ 2.什么是粗脂肪？ （答：脂肪不溶于水，易溶于有机溶剂（如石油醚）。利用这一特性，选用有机溶剂直接浸提出样品中的脂肪进行测定。提取物中除脂肪之外，还有游离脂肪酸、石蜡、磷脂、固醇、色素、有机酸等物质，故浸提物称粗脂肪。）通过以上问题的思考，我们知道了脂肪的提取主要是利用其易溶于有机溶剂的特性。具体的实验操作粗脂肪的提取，一般采用索氏脂肪提取器。 利用脂类物质溶于有机溶剂的特性。在索氏提取器中用有机溶剂（本实验用石油醚，沸程为 30 ～ 60 ℃）对样品中的脂类物质进行提取。  图 索氏脂肪提取器 1. 浸提管 2. 通气管 3. 虹吸管 4. 小烧瓶 5. 冷凝管 索氏提取器是由提取瓶、提取管、冷凝器三部分组成的，提取管两侧分别有虹吸管和连接管。各部分连接处要严密不能漏气。提取时，将待测样品包在脱脂滤纸包内，放入提取管内。提取瓶内加入石油醚，加热提取瓶，石油醚气化，由连接管上升进入冷凝器，凝成液体滴入提取管内，浸提样品中的脂类物质。待提取管内石油醚液面达到一定高度，溶有粗脂肪的石油醚经虹吸管流入提取瓶。流入提取瓶内的石油醚继续被加热气化、上升、冷凝，滴入提取管内，如此循环往复，直到抽提完全为止。 三、材料、仪器与试剂 （一）实验材料 大豆、花生、蓖麻、向日葵、芝麻等油料种子。 （二）仪器设备 索氏提取器（ 50 mL ），烧杯，干燥器，脱脂滤纸，镊子，分析天平，烘箱，恒温水浴，脱脂棉。 （三）试剂 石油醚（化学纯，沸程 30 ～ 60 ℃）。 四、实验操作 1.将洗净、晾干的芝麻种籽放在 80 ～ 100 ℃烘箱中烘 4 小时。待冷却后，准确地称取 2 ～ 4 g ，置于研钵中研磨细，将研碎的样品及擦净研钵的脱脂棉一并用脱脂滤纸包住用丝线扎好，勿让样品漏出。或用特制的滤纸斗装样品后，斗口用脱脂棉塞好。放入索氏提取器的提取管内，最后再用石油醚洗净研钵后倒入提取管内。 2. 洗净索氏提取瓶，在 105 ℃烘箱内烘干至恒重，记录重量。将石油醚加到提取瓶内约为瓶容积的 1/2 ～ 2/3 。把提取器各部分连接后，接口处不能漏气。用 70 ～ 80 ℃恒温水浴加热提取瓶，使抽提进行 16 小时左右，直至抽提管内的石油醚用滤纸检验无油迹为止。此时表示提取完全。 3. 提取完毕，取出滤纸包，再回馏一次，洗涤提取管。再继续蒸馏，当提取管中的石油醚液面接近虹吸管口而未流入提取瓶时，倒出石油醚。若提取瓶中仍有石油醚，继续蒸馏，直至提取瓶中石油醚完全蒸完。取下提取瓶，洗净瓶的外壁，放入 105 ℃烘箱中烘干至恒重，记录重量。 五、注意事项 1.本法采用沸点低于 60 ℃的有机溶剂，不能提取出样品中结合状态的脂类，故此法又称为游离脂类定量测定法。 2.待测样品若是液体，应将一定体积的样品滴在脱脂滤纸上在60～80℃烘箱中烘干后放入提取管内。 3.本法使用有机溶剂石油醚（沸程 30 ～ 60 ℃）故加热时不能用明火。 六、思考题 1. 索氏提取法提取的为什么是粗脂肪 ? 2. 做好本实验应注意哪些事项 ? 实验三 氨基酸分离——双向层析法 一、实验目的 学习双向纸层析的原理和操作方法，进行混合氨基酸的分离分析。 二、实验原理 纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分离分析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后其一物质在纸层析谱上的位置常用比移值Rf来表示。 Rf = 纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽提，由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系数，因而在恒定条件（液剂、PH、温度）下，各物质有固定的Rf值，据此可达到分析鉴定的目的。 由于滤纸纤维可吸收20～25%的水分；且其中6～7%以氢键形式与纤维素上羟基结合，一般条件下难脱去；所以纸层析实际上是以水相作固定相，展开的溶剂作流动相。 纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般用上行法。上行法又分单向（成分较为简单的样品）和双向（单向时斑点重叠分离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）。双相层析谱可分辨十几种以上的样品。 层析滤纸要求： （1）质地均匀，平整无折痕，厚薄适当，溶剂能匀速展开。 （2）机械强度好，溶剂展开后能保持原状，不易折到。 （3）有一定纯度而少杂质，以免影响层析图谱背景。 （4）纤维松紧适宜，一般选用中速滤纸，或根据溶剂选择。如丁醇类粘度大，宜用快速滤纸；而氯仿、石油醚展开快，宜用慢速滤纸。 层析溶剂要求： （1）被分离物质在该溶剂系统中Rf在0.05～0.8之间，各组分之Rf值相差最好能大于0.05，以免斑点重叠。 （2）溶剂系统中任一组分与分离物之间不能起化学反应。 （3）分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达到平衡，这样所得斑点较圆整。 本实验采用八种混合氨基酸为样品，用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析，以茚三酮为显色剂，可获得分离清晰的层析图谱。图谱示意如下：  三、材料、仪器与试剂 （一）实验材料 标准氨基酸混合溶液：亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、组氨酸、丝氨酸各100mg溶于50ml 0.01M盐酸中。 （二）仪器设备 层析缸25×40cm（×2）；培养皿15cm（×2）；喷雾器；毛细管内径0.1cm；电吹风；烘箱。层析滤纸14×11cm；铅笔，尺。 （三）试剂 0.1%（W/V）茚三酮溶丙酮液; 溶剂系统：第一相：正丁醇∶88%甲酸∶水＝15∶3∶2（V/V）； 第二相：正丁醇∶吡啶∶95%乙醇∶水＝5∶1∶1∶1（V/V）。 四、实验操作 1.点样 取层析滤纸一张（14×11cm），在距纸边1.2cm处划一基线；再将纸转90°，距纸边1.2cm处作一线与上线垂直。以毛细管吸取混合氨基酸溶液，点与二线交点处（见图4-1），点的直径控制在2mm左右，不可过大。待样品干燥后再点一次。滤纸上点样斑点干燥后，把滤纸卷成圆筒形，纸的两边以铬丝相连，但不可重叠相碰。 2.展层 在层析缸中平稳的放入装有第一相层析溶剂的培养皿。将圆筒形滤纸放入，点样一段接触溶剂，以点样处不浸入溶剂为准。待溶剂自下而上均匀展开，约2小时后溶剂到达距纸边0.5cm处取出滤纸，悬挂于室温中，以电吹风充分吹尽溶剂。然后裁去未走过溶剂的滤纸边缘，将滤纸转90°，卷成如前圆筒状，放入盛第二相溶剂的层析缸内展开（操作同上），约1小时后溶剂展开到距纸边0.5cm时取出，以电吹风吹尽溶剂使其干燥。 ?  3.显色 以喷雾器将茚三酮均匀地喷在滤纸上，然后悬滤纸于65℃烘箱内加热20分钟，即可看到紫红色氨基酸斑点，将图谱上的斑点用铅笔圈出。 五、注意事项 （1）烘箱加热温度不可过高，且不可有氨的干扰，否则图谱背景会泛红。 （2）第一相溶剂最好在使用前再按比例混合，否则会引起酯化影响层析效果。 （3）接触滤纸时，要戴手套。 六、思考题： 1．酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响？ 2．为什么展层时要用两种溶剂系统？ 实验四 样品中总氮量的测定——微量凯氏定氮法 一、实验目的 1.掌握凯氏定氮仪的使用方法； 2.掌握凯氏定氮法测定样品总氮量的原理。 二、实验原理 1.什么是凯氏定氮法？有什么意义？ 大多数蛋白质中氮的含量较恒定，平均为16％，即每100g蛋白质中含16g氮，因此可通过测定生物样品中的氮来测定蛋白质的含量（每测得1g氮即相当于6.25g蛋白质）。这是定氮法测定蛋白质含量的计算基础，即用定氮法测得的样品含氮量乘以6.25，即可算出样品中蛋白质的含量。蛋白质含量＝含氮量×6.25，测定蛋白质含量的方法很多，其中最基本和常用的方法就是测定含氮量的方法。测定含氮量一般都采用微量凯氏定氮法。 2.该方法原理？ 蛋白质样品先经浓硫酸加热消化，使蛋白质中的有机氮转变成为无机氮，然后经碱化蒸馏，放出的氨气用标准酸吸收，再用标准碱来滴定剩余的酸，计算出的含氮量乘以6.25即是该样品中的蛋白质含量。 三、材料、仪器与试剂 （一）实验材料：市售面粉 （二）仪器设备 （仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定） 凯氏烧瓶；凯氏定氮蒸馏装置；容量瓶；微量滴定管；烘箱；电炉；1000毫升蒸馏烧瓶；小玻璃珠或毛细管；电子天平。 （三）试剂 （试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制） 浓硫酸（AR）；硫酸铜；硫酸钾混；甲基红乙醇；溴甲酚绿乙醇；棚酸；乙醇；氢氧化钠； 四、实验操作： 1．凯氏定氮仪的构造和安装： 凯氏定氮仪主要由蒸汽发生器，反应管及冷凝器三部分组成： 蒸汽发生器包括电炉及一个1~2升容积的烧瓶。蒸汽发生器借橡皮管与反应管相连，反应管上端有一个小漏斗，样品和碱液可由此加入到反应室，反应室中心有一长玻璃管，与蒸汽发生器相连，下端靠近反应室的底部。反应产生的氨可通过反应室上安全管及冷凝器通过吸收瓶中。安装时各连接处不能漏气，且安装好的不可轻易移动，以免仪器损坏。 2．样品处理： 某一固体样品中的含氮量是用100克该物质（干重）中所含氮的克数来表示（%）。因此在定氮前，应先将固体样品中的水份除掉。一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离的水，都不能在100℃以下烘干。 在称量瓶中称入一定量磨细的样品，然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称量，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。 若样品为液体（如血清等），可取一定体积样品直接消化测定。 精确称取0.1克左右的干燥面粉作为实验的样品。 3．消化： 取四个100ml凯氏烧瓶并标号。各加1颗玻璃珠，在1及2号瓶中各加样品0.1克，催化剂200毫克，浓硫酸5毫升，注意加样品时应直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3及4号瓶中各加0.1毫升蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。加完后，将这四个烧瓶放在通风橱内的电炉上消化。 在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止①。消化完毕，等烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10毫升（注意慢加，随加随摇）。冷却后将瓶中内容物倾入50毫升的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并入溶量瓶。用水稀释到刻度，混匀备用②。 4．蒸馏： （1）蒸馏器的洗涤：在蒸汽发生瓶中加入三分之二体积的蒸馏水，加浓硫酸数滴及毛细管或玻珠若干，关闭甲乙，将蒸汽发生器中的水烧开，让蒸汽通过整个仪器。并检查有无漏气，5分钟后，打开活塞乙，使蒸汽洗涤漏斗5分钟，复将乙关闭，继续蒸馏约5分钟，然后在冷凝器下端放一个盛有5毫升2%硼酸溶液和1—2滴指示剂混合液的锥形瓶。位置倾斜如图，冷凝器下端应完全浸没在液体中，继续蒸汽洗涤1—2分钟，观察锥形瓶内的溶液是否变色，如不变色则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。向下移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1厘米，继续通蒸汽1分钟，最后用水冲洗冷凝管口。然后移去或关掉电炉，由于蒸汽发生器内蒸气冷缩，压力减低，反应室内的水可自动吸出进入废液管中（图中3），打开甲，将废液排出。 （2）蒸馏：取50毫升锥形瓶数个，各加5毫升硼酸和1—2滴指示剂，溶液呈紫红色，用表面皿覆盖备用。关掉电炉，打开活塞甲、乙，再将事先准备好的盛有5ml2%硼酸及指示剂的锥形瓶放在冷凝管中下，使管口浸入液面以下。用吸管取10ml消化液，细心地由小漏斗处注入反应室，用2—3ml蒸馏水洗涤小漏斗，待消化液全部进入反应室后关闭活塞甲。然后再由小漏斗处加30%NaOH10ml（用小量筒量取），让NaOH缓缓流入反应室，当小漏斗内仍有少量NaOH时，即关闭乙，再用约3ml蒸馏水于小漏斗内，同样放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封，关闭乙，立即加热蒸汽发生器，并使沸腾，开始蒸馏。待三角烧瓶中液体由紫红色变成蓝绿色时再继续蒸馏3分钟，将三角烧瓶下降，使冷凝管口离开液面约1cm，继续蒸1分钟，用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口，洗液直接流入锥开瓶内，然后，先移去锥形瓶，关掉电炉，使反应室内废液倒吸进入废液管内，打开甲而放出。整个蒸馏装置立即洗涤（包括水洗及蒸汽洗）备用。待样品和空白消化液均蒸馏完毕后，同时进行滴定。 （3）滴定：全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示溶液由蓝绿变淡紫红色为滴定终点。 五、结果与讨论： 1．计算： 总氮量=××% C：标准盐酸溶液摩尔浓度。 V1：滴定样品用去的盐酸溶液平均毫升数。 V2：滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均毫升数。 W：样品重量（克）。 14：氮的原子量。 若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则样品中蛋白质含量（%）=总氮量×6.25，若样品中除有蛋白质外，尚有其它含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸的样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而教育处出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。 蛋白氮=总氮—非蛋白氮 蛋白质含量（克%）=蛋白氮×6.25 六、思考题 1.写出实验中应注意的主要事项。 2.指出该法测定蛋白质含量的局限性。 3.指出其它测定蛋白质含量的方法。 实验五 蛋白质的性质实验——蛋白质及氨基酸的 呈色反应 一、实验目的 1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。 2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 双缩脲反应 二、实验原理 尿素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个—CS—NH2，—CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH或—CHOHCH2NH2等基团 NH2 NH2 的物质以及乙二酰二胺（O＝C——C＝O）等物质也有此反应。NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。 三、材料、仪器与试剂 尿素；10%氢氧化钠溶液；1%硫酸铜溶液；2%卵清蛋白溶液 四、实验操作 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10%氢氧化钠溶液约1ml，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液约2ml，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。 茚三酮反应 二、实验原理 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。 β—丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。 该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。 此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。 三、材料、仪器与试剂 蛋白质溶液；2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；0.5%甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；0.1%茚三酮-乙醇溶液 四、实验操作 ①取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。 ②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。 黄色反应 二、实验原理 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。 三、材料、仪器与试剂 鸡蛋清溶液；大豆提取液；头发；指甲；0.5%苯酚溶液；浓硝酸；0.3%色氨酸溶液；0.3%酪氨酸溶液；10%氢氧化钠溶液 四、实验操作 向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。 管 号 1 2 3 4 5 6 7  材 料 （滴） 鸡蛋清 溶液 4 大豆 提取液 4 指甲 少许 头发 少许 0.5% 苯酚 4 0.3% 色氨酸 4 0.3% 酪氨酸 4  浓硝酸/（滴） 2 4 40 40 4 4 4  现象          考马斯亮蓝反应 二、实验原理 考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。 它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。在0.01~1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度A595nm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。 三、材料、仪器与试剂 蛋白质溶液（鸡蛋清∶水=1∶20）；考马斯亮蓝染液 四、实验操作 取2支试管，按下表操作 试剂 管号 蛋白质溶液 （ml） 蒸馏水 （ml） 考马斯亮蓝染液 （ml）  1 0 1 5  2 0.1 0.9 5  五、思考题 1．茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？并说明原因。 2．你能区分蛋白质茚三酮反应及其他氨基化合物茚三酮反应的结果吗？试解释之。 3．能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？ 4．哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？ 实验六 蛋白质的性质实验——蛋白质的沉淀反应 一、实验目的 1．加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 2．了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 3．了解蛋白质变性与沉淀的关系。 二、实验原理 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 （1）可逆的沉淀的反应 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。 （2）不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 三、材料、仪器与试剂 （一）实验材料：鸡蛋清 （二）仪器设备：试管 （三）试剂 pH4.7 醋酸-醋酸钠的缓冲溶液；3%硝酸银溶液；5%三氯乙酸溶液；95%乙醇；饱和硫酸铵溶液；硫酸铵结晶粉末；0.1 mol·L-1盐酸溶液；0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液；0.05 mol·L-1碳酸钠溶液；0.1 mol·L-1醋酸溶液；甲基红溶液；2%氯化钡溶液 四、实验操作 1．蛋白质的盐析：无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。 如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。 由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。 加5%卵清蛋白溶液5 ml于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管中内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。 取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。 2．重金属离子沉淀蛋白质：重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。 取1支试管，加入蛋白质溶液2 ml，再加3%硝酸银溶液1~2滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？ 3．某些有机酸沉淀蛋白质：取1支试管，加入蛋白质溶液2 ml，再加1 ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。 4．有机溶剂沉淀蛋白质：取1支试管，加入2 ml蛋白质溶液，再加入2 ml95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。 5．乙醇引起的变性与沉淀：取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂： 试剂（ml） 管号 5%卵清 蛋白溶液 0.1 mol·L-1 氢氧化钠 溶 液 0.1 mol·L-1 盐酸溶液 95%乙醇 pH4.7 缓冲溶液  1 2 3 1 1 1 — 1 — — — 1 1 1 1 1 — —  振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水8 ml，然后在第2、3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1 mol·L-1醋酸溶液及0.05 mol·L-1碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1 mol·L-1盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。 五、思考题 1鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？ 2．氯化汞为何能做为杀菌剂？ 实验七 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳 一、实验目的 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作技术，了解电泳技术的基本原理，测定人血清中各种蛋白质的相对含量。 二、实验原理 醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术。醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮，氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动阻力小，厚度为120。 醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体有以下优点：①电泳后区带界限清晰；②通电时间较短（二十分钟至一小时）；③它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；④对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素薄膜吸水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。 本实验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物，分离人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、 －球蛋白、－球蛋白、－球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及行状不同（见下表），在电场中的迁移速度不同。分子量小、等电点低的，在相同碱性PH缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如人血清蛋白在PH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次是球蛋白（如图1）。 醋酸纤维薄膜电泳已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。根据样品理化性质，从提高电泳速度和分辨力出发选择缓冲液的种类，pH和离子强度。选择好的缓冲液最好是挥发性强，对显色或紫外光等观察区带没有影响，若样品含盐量较高时，宜采用含盐缓冲液。例如血清蛋白电泳可选用pH8.6的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液；氨基酸的分离则可选用pH7.2的磷酸 盐缓冲液等。电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽度的纸条。在欲点样的位置用铅笔做上记号，点上样品，在一定的电压，电流下电泳一定时间，取下滤膜，进行染色。不同物质需采用不同的显色方法，如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位，但许多物质必须经染色剂显色。 醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下，溶于一定的溶剂中进行光密度测定。也可以浸于折射率为1.474的油中或其他透明液中使之透明，然后直接用光密度计测定。它的缺点是厚度小，样品用量很小，不适于制备。将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。电泳后，CAM经染色和漂洗，可清晰呈现清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白5条区带，比色即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。 人血清中5种蛋白质的等电点及分子量 蛋白质名称 等电点（pI） 分子量  清蛋白 －球蛋白 －球蛋白 －球蛋白 4.88 5.06 5.12 6.85～7.50 6900 ～200 000 ～300 000 90 000～150 000 156 000～300 000  三、材料、仪器与试剂 （一）、材料：人血清 （二）、仪器 醋酸纤维薄膜(8X2mm)；点样器；染色皿，漂洗器，镊子；玻璃板；常压电泳仪；直流电源整流器；水平电泳槽；粗滤纸；直尺和铅笔 （三）、药品 巴比妥缓冲液(pH8.6 I=0.06)；氨基黑10B染色液；漂洗液；95％乙醇45ml、冰醋酸5ml；蒸馏水50ml；洗脱液 0.4mol／LnaOH；透明液；无水乙醇：冰醋酸＝7：3 四、操作步骤 仪器与薄膜的准备 （1）醋酸纤维薄膜的选择与润湿 用镊子取一片薄膜，在距醋纤膜一端1.5cm用铅笔作好标记，然后将薄膜放进缓冲液中，小心放在盛有缓冲液的培养皿中。若漂浮在液面的薄膜在15～30秒内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此薄膜均匀可以用于电泳；若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹或斑点，则表示薄膜不均匀应弃去，以免影响电泳结果。浸泡于缓冲液中约30分钟，当完全浸透后，用镊子轻轻取出，夹在两层滤纸内吸干，方可用于电泳。 （2）电泳槽的准备（如下图） 将电泳槽置于水平平台上，将缓冲液注入电泳槽中，两边的电极槽缓冲液的高度要 在同一平面。根据电泳槽支架的宽度，裁剪尺寸合适的滤纸条。在电泳槽的两个膜支架上,各放2～４层滤纸条,使滤纸一端的长边与支架前沿对齐,另一端浸入电极缓冲液中。当滤纸条全部润湿后,用玻璃棒轻轻挤压膜支架上的滤纸以驱赶气泡,使滤纸的一端紧贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。 点样 将点样器先在白瓷反应砖上的血清中沾一下，点样前应在滤纸上反复练习，此步是实验的关键，掌握点样技术后再正式点样是获得清晰区带的电泳图谱的重要环节。薄膜浸泡于缓冲液中约30分钟后，用镊子轻轻取出，夹在两层滤纸内吸干，平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）， 再在膜条一端2～3厘米处轻轻水平落下并随即提起，使血清完全深透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。 电泳 用镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸上，点样面朝下，另一端平贴在阳极端支架上。若膜条与电泳方向不平行,则图谱不整。膜条与滤纸桥之间压严,使膜条绷直,中间不下垂。如有很多膜条同时电泳时,膜条间应相距1～3mm ,使之不互相接触,以免相互干扰。盖严电泳室,平衡10分钟后方可通电,否则分离不好。正确连接电泳槽与电泳仪对应的正负极，开启电源通电。电压160V，电流强度0.4—0.7mA/cm膜总宽。电泳时间约为25分钟。 4、染色 电泳完毕后断电，用镊子取出薄膜条投入染液5～10分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。 5、漂洗 从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入盛有漂洗液的培养皿中反复漂洗，直至背景漂净为止。此时清晰可见5条色带，待干。 6、透明 将脱色后干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2～3分钟后取出平铺在玻璃板上,用一直径0.5cm 的玻璃棒将其间的气泡赶出,两者之间不能有气泡。干燥后此透明薄膜,区带着色清晰,可用于光吸收扫描,长期保存不褪色。 7、定量 洗脱比色法 将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0．4mol／lNaOH4ml,于37℃水浴20分钟(不时振荡)，待颜色脱净即用波长620nm比色，以空白管调零，读各管吸光度。计算： 吸光度总和(T)=++++(吸光度) 血清蛋白组分的相对百分数： 　正常值 清蛋白% = /T×100% 54％～73％ α1 球蛋白％ = /T×100% 2.78％～5.1% α2 球蛋白％= /T×100% 6.3％～10.6% β球蛋白% = %/T×100% 5.2%～11% γ球蛋白% = %/T×100% 12.5%～20% 光吸收扫描法 将染色干燥的血清蛋白醋纤维素薄膜电泳图谱放入自动光吸收扫描仪（或色谱扫描仪）内，未透明的薄膜通过反射，透明的薄膜通过透射方式进行扫描。在记录仪上自动绘出各组分的曲线图：横坐标为膜的长度，纵坐标为光吸收值；每个峰代表一种蛋白组分，下图为扫描模式图。同时可进行数据处理，以打字的方式显示各组分的相对百分含量。目前，临床检验多采用此法从处理数据。 实验八 酶的特性 一、实验目的 酶是生物催化剂，生物体内化学反应基本上都是在酶的催化下进行的。通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。 二、内容 本实验由温度对酶活力的影响，；PH对酶活力的影响；酶的激活剂及抑制剂；酶的专一性4组实验组成。 （一）酶的专一性 1、实验原理 酶与一般催化剂最主要的区别之一是酶具有高度特异（专一）性，即一种酶只能对一种底物或一类底物（此类底物在结构上通常具有相同的化学键）起催化作用，对其他底物无催化反应。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。 淀粉和蔗糖无还原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性二糖的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能蔗糖水解产生还原性单糖葡萄糖和果糖，但能催化淀粉的水解。用Benedict试剂检查糖的还原性。Benedict试剂为碱性硫酸铜，能氧化具还原性的单糖，生成砖红色沉淀氧化亚铜。 2、材料、仪器与试剂（仪器和试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定） (1)材料：新鲜配制稀释200倍的新鲜唾液； (2)仪器：恒温水浴；沸水浴；试管及试管架； (3)试剂：2%蔗糖溶液；溶于0.3% NaCl的1%淀粉溶液；蔗糖酶溶液；Benedict试剂。 3、实验操作 (1)淀粉酶的专一性 表1 淀粉酶专一性加样顺序 管号 1 2 3 4 5 6  1%淀粉溶液（滴） 4 － 4 － 4 －  2%蔗糖溶液（滴） － 4 － 4 － 4  唾液稀释唾液（ml） － － 1 1 ―― ?  煮沸过的稀释唾液（ml） － － － － 1 1  蒸馏水（ml） 1 1 － － － －  37℃恒温水浴中保温5分钟  Benedict氏试剂（ml） 1 1 1 1 1 1  沸水浴2～3分钟  (2)蔗糖酶的专一性 表2 蔗糖酶专一性加样顺序 管号 1 2 3 4 5 6  1%淀粉溶液（滴） 4 － 4 － 4 －  2%蔗糖溶液（滴） － 4 － 4 － 4  蔗糖酶溶液（ml） － － 1 1 ― ?  煮沸过的蔗糖酶溶液（ml） － － － － 1 1  蒸馏水（ml） 1 1 － － － －  37℃恒温水浴中保温5分钟  Benedict氏试剂（ml） 1 1 1 1 1 1  沸水浴2～3分钟  （二）温度对酶活力的影响 1、实验原理 酶的催化作用受温度的影响。在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度为37-40℃，植物酶的最适温度为50-60℃。 酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100℃，其活性并无明显的改变，但在100℃的溶液中却很快地完全失去活性。低温能降低酶或抑制酶的活性，但不能使酶失活。 淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色，糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色，在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。 2、材料、仪器与试剂（仪器和试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定） （1）材料：新鲜配制稀释200倍的新鲜唾液； （2）仪器：试管及试管架；恒温水浴；冰浴；沸水浴； （3）试剂：0.2%淀粉；0.3%NaCl溶液；KI－I2碘溶液； 3、实验操作 取3支干燥的试管，编号后按下表加入试剂： 表3 　温度对酶活力影响实验加样顺序 管号 1 2 3  淀粉溶液（ml） 1.5 1.5 1.5  稀释唾液（ml） 1 1 ?  煮沸过的稀释唾液（ml） ? ? 1  摇匀后，将1、3号试管放入37℃恒温水浴中，2号试管放入冰水中。10分钟后取出（将2号内液体分两半），用KI－I2溶液来检验1、2、3号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果。将2号管剩下的一半溶液放入37℃水浴中继续保温10分钟后，再用KI－I2液实验，记录实验结果。 （三）PH对酶活力的影响 1、实验原理 酶的活力受环境PH值的影响极为显著。不同酶的最适PH不同。本实验观察PH对唾液淀粉酶活性的影响。唾液淀粉酶的最适PH约为6.8。 2、材料、仪器与试剂（仪器和试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定） （1）材料：新配制的溶于0.3%NaCl的0.5%淀粉溶液 （2）仪器：试管及试管架；吸管；滴管；锥形瓶；恒温水浴 （3）试剂：0.2M Na2HPO3溶液；0.1M柠檬酸溶液；KI－I2碘溶液；PH试纸 3、实验操作 取4标有号码的5.ml锥形瓶。用吸管按下表添加　0.2%mol/L磷酸氢二钠溶液和　0.1mol/L柠檬酸溶液以制备pH＝5.0～8.0的四种缓冲液。? 表4 　pH＝5.0～8.0的四种缓冲液配制方法 锥形瓶号 0.2M Na2HPO3溶液（ml） 　0.1mol/L柠檬酸溶液（ml） pH  1 5.15 4.85 5.0  2 6.05 3.95 5.8  3 7.72 2.28 6.8  4 9.72 0.28 8.0   表5 操作步骤 PH 5 5．8 6．8 8.0  缓冲液（ml） 3 3 3 3  0.5%淀粉溶液（ml） 2 2 2 2    向各个试管加入稀释唾液的时间间隔为1min，混匀后依 次置于37℃的恒温水浴中2min  稀释200倍唾液 2 2 2 2  检查淀粉水解程度  待向第四只试管加入唾液2min后，每隔1分钟从第3管中取出1滴反应液于白瓷板上，加碘液检查反应进行情况，直至反应液变为棕黄色，即可停止反应，取出所有试管。从第一只试管依次添加碘液，时间间隔也为1min。  碘液(滴) 1～２ 1～２ 1～２ 1～2  现象 ?     从4个锥形瓶中各取缓冲液3ml，分别注入4支带有号码的试管，随后于各个试管中添加0.5%淀粉溶液2ml和稀释200倍的新鲜唾液2ml。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔为1分钟。将各试管中物质混匀，，并依次置于37℃恒温水浴中保温。 待向第4管加入唾液2ml后，每隔1分钟由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴KI－I2溶液。添加KI－I2溶液，检验淀粉的水解程度。待混合变为棕黄色后，向所有试管依次添加1-2滴KI－I2溶液。添加滴KI－I2溶液的时间间隔，从第1管起，亦均为1分钟。 观察各试管中物质呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。 （四）唾液淀粉酶的活化及抑制 1、实验原理 酶的活性受活化剂或抑制剂的影响，氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。 2、材料、仪器与试剂（仪器和试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定） （1）材料：0.1%淀粉溶液；稀释200倍的新鲜唾液 （2）仪器：试管及试管架；恒温水浴 （3）试剂：1% NaCl溶液；1% CuSO4溶液；KI－I2碘溶液；1%Na2SO4溶液 3、实验操作 表 唾液淀粉酶活化及抑制实验加样顺序 管号 1 2 3 4  0.1%淀粉溶液（ml） 1.5 1.5 1.5 1.5  稀释的新鲜唾液（ml） 0.5 0.5 0.5 0.5  1% NaCl溶液（ml） 0.5 － － －  1% CuSO4溶液（ml） － 0.5 － －  1% Na2SO4溶液（ml） － － 0.5 －  蒸馏水（ml） － － － 0.5  37℃恒温水浴中保温10分钟  KI－I2溶液（滴） 2～3 2～3 2～3 2～3  现 象       注意事项 （1）各人唾液中淀粉酶活力不同，因此实验2、3、4应随时检查反应进行情况。如反应进行得太快，应适当稀释唾液；反之，则应减少唾液淀粉酶稀释倍数。 （2）酶的抑制与激活最好用经透析的唾液，因为唾液中含有少量Cl－。另外，注意不要在检查反应程度时使各管溶液混杂。 思考题： 何谓酶的最适pH和最适温度？ 说明底物浓度、酶浓度、温度和pH对酶反应速度的影响。 3、作为一种生物催化剂，有哪些催化特点？ 实验九 植物组织中过氧化氢酶活力测定 一、实验目的 1.掌握酶活力测定的方法 2.了解过氧化氢酶在生物体中的作用原理 二、实验原理 1.什么是过氧化氢酶？在生物体内的作用原理？ 植物在逆境下或衰老时，由于体内活力氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活力与植物的抗逆性密切相关。 2.如何测定过氧化氢酶活力？ 通过测定过氧化氢含量来反映过氧化氢酶活力。具体的方法可以有两种 方法一 过氧化氢酶的活力测定——高锰酸钾滴定法 过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。 R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－) ? ? R(Fe+3OH－)2+H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2 据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2 5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 即可求出消耗的H2O2的量。 三、材料、仪器与试剂 （一）、材料：小麦叶片 （二）、仪器（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定） 研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。 （三）、试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制） 10% H2SO4；0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4 ·2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。 四、实验操作： 1.酶液提取 取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将缓冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。 3.用0.1mol/L KMnＯ4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。 五、计算 酶活力用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示： 酶活(mgH2O2/gFW·min)= 式中 A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数； VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）; W—样品鲜重（g）； 1.7—1ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2。 六、注意事项 所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。 方法二 过氧化氢酶的活力测定——紫外吸收法 H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。 三、材料、仪器与试剂 （一）、材料：小麦叶片 （二）、仪器（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定） 紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴； （三）、试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制） 0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。 四、实验操作： 1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。 2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。 表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表 管 号 S0 S1 S2  粗酶液(ml) 0.2（煮死酶液） 0.2 0.2  pH7.8磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5  蒸馏水(ml) 1.0 1.0 1.0  25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活力。 五、计算 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。 过氧化氢酶活力(u/gFW/min)= 式中 A240 = AS0－ AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值； AS1, AS2—样品管吸光值； Vt—粗酶提取液总体积（ml）； V1—测定用粗酶液体积（ml）； FW—样品鲜重（g）； 0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。 六、注意事项 凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。 七、思考题 1.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些? 2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关? 实验十 底物浓度对酶促反应速度的影响 ──米氏常数的测定 一、实验目的 （1）了解底物浓度对酶促反应的影响。 （2）掌握测定米氏常数Km的原理和方法。 二、实验原理 早在1931年，Michealis和Menten首先提出酶促反应速度和底物浓度的关系可用米氏方程来表示：  式中： v──反应初速度（微摩尔浓度变化/min）； V──最大反应速度（微摩尔浓度变化/min）； ［S］──底物浓度（mol/L）； Km──米氏常数（mol/L）。 这个方程表明当已知Km及V时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同，Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。测Km值是酶学研究的一个重要方法。大多数纯酶的Km值在0.01～100mmol/L。 Linewaeaver―Burk作图法（双倒数作图法）是用实验方法测Km值的最常用的简便方法：  于是实验时可选择不同的［S］，测对应的v；求出两者的倒数，以对作图，得到一个斜率为的直线。将直线外推与横坐标轴相交，其截距为，由此求出值。 本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例。以蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时有自由氨基生成，可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量而跟踪反应，求得初速度。 图 测定Km值图解 三、材料、仪器与试剂 （一）、材料：酪蛋白溶液 （二）、仪器 50ml三角烧瓶（×12）；150ml三角烧瓶（×4）；吸管5ml（×1），10ml（×5）；量筒100ml（×4）；25ml碱式滴定管及滴定台；蝴蝶夹；滴定管；恒温水浴。 （三）、试剂 中性甲醛溶液；酚酞溶液；0.1M NaOH溶液；胰蛋白酶溶液 四、实验操作 取50ml三角瓶6个，编号0，1，2，3，4，5，6。分别加入5ml甲醛与1滴酚酞，以0.1M标准NaOH滴定至微红色，6个瓶颜色应当一致。 量取40g/L酪蛋白溶液100ml，加入一个250ml三角瓶，37℃保温10分钟，同时胰蛋白酶液也在37℃保温10分钟。然后吸取10ml酶液加到酪蛋白液中。（同时计时！）充分混合后立即取出10ml反应液（定为0时样品）加入一含甲醛的小三角瓶中（0号）加10滴酚酞；以0.1M NaOH滴定至微弱而持续的微红色。在接近终点时，按耗去的NaOHml数，每ml加一滴酚酞，在继续滴至终点，记下耗去的0.1M标准NaOH ml数。 在2、4、6、8和10分钟时，分别取出10ml反应液，加入1、2、3、4、5号小三角瓶，同上操作。在每个样品中滴定终点的颜色应当是一致的。以滴定度（即耗去的NaOH ml数）对时间作图得一直线，其斜率即初速度为V40（相对于40g/L的酪蛋白浓度）。 然后分别量取30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋白溶液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。 利用上述结果，以对作图，即求出V与Km值。 五、注意事项 （1）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。 （2）本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间。 六、思考题： 试述底物浓度对酶促反应速度的影响 在什么条件下，测定酶的Km值可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？ 米氏方程中的Km值有何实际应用？ 实验十一 酶的提取、分离、纯化及其活力测定 一、实验目的 酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。 二、实验原理 （一）酶的提取 1.酶的存在位置？ 存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位。 2.如何将酶从细胞中分离？ 从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。如果酶仅存在于细胞质中，只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时如仅仅破碎细胞还不够，还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。其次，细胞中存在抑制物质，如酚，酸，离子等，它们通常在液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。酚易氧化产生醌，醌为一种强氧化剂，会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合，使蛋白质上的反应基团，如—SH，—NH2，通过1，4—加成反应而发生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物组织和提取液产生棕色，以致影响酶活性的测定。因此如果没有特殊需要，一般常选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗，在这些组织中一般酚类化合物含量较低。在提取过程中为了尽量减少酚类的影响，一般提取液常选用高pH值的缓冲溶液，因为在高pH值时，酚类大部游离而不与蛋白质形成强的氢键，但高pH值促进酚类氧化，同时降低酚类吸附剂（如PVP）的有效性，通常采用pH6.7梍7.2。已经知道PVP能与游离酚羟基形成强的氢键复合物，是酚类化合物的有效结合剂。在提取线粒体时加入可溶性PVP，提取可溶性酶时加入不溶性交联PVP（Polyvinyl polypyrrolidone，简称PVPP，或Polyclar AT），能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金属元素及PVP单体，可加10% HCl煮沸10分钟，用NaOH中和，再用水洗几次，直至中性，纯化后的PVPP不必干燥就可直接应用。 植物细胞有坚韧的细胞壁，需要强烈的方法去破碎，少量样品可用研钵加石英砂研磨，或用玻璃匀浆器。大量样品则需用电动匀浆器。为减低研磨或匀浆过程中发热，所用器皿和溶液需要预冷，提取液的用量一般为组织的1梍5倍，用量大些有利于提高得率，但工作量大，一般宁可用量小些，将残渣再提取一次。提取匀浆时加入酚类结合剂PVPP，金属螯合剂Na2─EDTA，以及─SH化合物以保护蛋白质，或加入非离子型去垢剂如Triton X─100，以增加蛋白质的可溶度，常用于与膜脂结合的酶。总之，可以通过试验以确定提取蛋白质的最佳条件。 （二）分离和纯化 1.酶的粗提液是否只有酶，有没有其它物质？ 上面制备得到的提取液中，除含有所需要的酶外，还含有其他蛋白质，以及其他大分子和小分子化合物杂质。 2.如何将酶从粗提液只分离纯化？ 要在许多蛋白质的混合物中分离出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有盐析法，往层析法，薄膜超滤法，亲和层析法，电泳法等。在大体积的提取液中一般先采用硫酸铵分级盐析沉淀。盐析法是提纯酶使用最早的方法之一，迄今仍广泛使用，而且在高浓度的盐溶液中酶蛋白不易变性而失去活性，利于工作在室温中进行。不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度有不同程度的降低，盐析法就是利用这一性质，将不同性质的蛋白质分离，选择合适饱和度的硫酸铵，使沉淀的蛋白质的酶活性最大。大多数酶的活性存在于35梍45%和45梍55%饱和度硫酸铵沉淀的部分，但也有存在于65梍80%饱和度的（如花椰菜根的过氧化物酶）。沉淀的蛋白质经离心后收集之，再溶于少量缓冲溶液中，经透析或凝胶柱过滤，以除去硫酸铵及其他小分子杂质，然后再经过柱层析分离。由于吸附剂的不同，又有吸附柱层析、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等。对于不同的支持物采用的洗脱方法也不同，分子筛类型凝胶过滤柱层析，洗脱液只要用一定浓度的缓冲液就可以了，亦即等浓度洗脱。对于吸附柱和离子交换柱层析，往往要采用浓度梯度溶液进行洗脱，最方便的是线性梯度浓度，当然用非线性梯度会得到更好的分离效果。柱层析一般都需要自动收集仪，如果能配用蛋白质检测仪就更好了。目前柱层析和硫酸铵分级沉淀一样，已经成为一种常规的酶的分离提纯的步骤之一了。 近年来纯化酶常用的一种有效方法为亲和层析。主要利用酶和底物、抑制剂或辅酶具有一定的结合能力，这一性质即可用来分离、提纯酶。首先选择一支持物，如琼脂糖（Sepharose）将底物、竞争性抑制剂或辅酶，以共价键的形式连接到支持物上，然后把含有酶的溶液，流过装有专一性底物、竞争抑制剂或辅酶的层析柱，酶即被保留在支持物上，再经过充分洗涤除去未被吸附的杂质，然后用含有一定浓度的底物或竞争性抑制剂或辅酶的缓冲液，进行竞争性洗脱。如果亲和剂选择合适，往往能得到较高纯度的酶，是酶分离、纯化中既方便又最有效的一种方法。 （三）酶活力的测定 酶的活力表现为催化某一反应的速度，反应速度越大，酶的活力也越大，酶催化的反应速度可以用单位时间内底物的消耗量或产物的积累量来表示。由于酶的催化作用和周围环境的关系十分密切，环境的温度、pH、离子强度等都对酶的活力有很大的影响，因此测定酶活力时应该使这些条件保持恒定。 酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分钟所分解的底物量（或生成的产物量）μmol数表示之。测定酶活性的方法很多，常因反应的底物和产物的性质不同可选用不同的方法，应用最广泛的是比色法或分光光度法。凡反应系统中的化合物在紫外区或可见光区有吸收峰的都可以用这种方法进行测定。如果酶催化的是一需氧反应，如氧化酶，则可用测压法或氧电极法。如果催化的反应系统中需要ATP或产生ATP，如一些激酶；或是有NAD存在，如一些脱氢酶和氧化还原酶；或者反应产生H2O2，如一些氧化酶，这些酶的活性可以用生物发光或化学发光方法进行测定。总之，测定酶活性的方法很多，应根据具体情况选择合适的方法。 三、材料、仪器与试剂 要求用硫酸铵分级沉淀部分纯化过氧化物酶。 （一）、材料：花椰菜根 （二）、仪器（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定） 冰冻离心机；751型分光光度计；电磁搅拌器；组织捣碎机；天平；量筒；移液管；烧杯；透析袋。 （三）、试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制） PVPP；硫酸铵；0.02mol/L KH2PO4溶液；0.lmol/L 磷酸钾缓冲液，PH6.0。 四、实验操作 (1)酶的提取：取花椰菜根（或其他植物材料）用自来水洗净，吸干水分，称得鲜重，按每g5ml提取溶液，加入预冷的0.02mol/L KH2PO4溶液，加入材料鲜重10%PVPP（预先经过纯化，用蒸馏水吸胀）。在预冷的组织捣碎机中搅成匀浆。匀浆倒在烧杯中，于冰箱中浸提1小时，用4层纱布或尼龙布袋过滤，滤液于18000r/min冷冻离心15分钟，弃去沉淀，上清液即为酶的粗提取液。 (2)硫酸铵分级沉淀：用量筒量得酶液的体积，吸取5ml留作酶活性及蛋白质含量分析，保存在冰箱中，其余酶液加入固体硫酸铵，使达35%饱和度（参阅附表8），加硫酸铵时要缓慢，以避免造成局部浓度过高，在电磁搅拌器上边搅拌边加入。然后置冰箱中半小时，离心如上。分别收集上清液和沉淀，上清液中再加入硫酸铵使达65%饱和度，再离心，收集沉淀和上清液。按这样的方法分别收集0梍35%、35梍65%、65梍80%、80梍100%饱和度硫酸铵沉淀。每部分沉淀分别复溶于1/20原始提取液体积的0.02mol/L KH2PO4溶液中，装入透析袋中，用大量KH2PO4溶液（2000ml）在冰箱中进行透析过夜，其间更换KH2PO4溶液约4次，直至无SO42-析出为止（用BaCl2溶液检查）。透析完毕后，分别量得适量体积，保存于冰箱中备用。 (3)蛋白质含量的测定：将原提取液及经硫酸铵分级沉淀得到的各分部溶液，用Folin试剂或考玛斯蓝G—250（参阅实验56）测定蛋白质含量，以牛血清蛋白作标准。 (4)酶活性的测定：以愈创木酚为底物测定酶活性（参阅实验49）。 (5)将结果填入下表中。  五、思考题 1.你如何分析所得到的结果，从结果你能得出什么结论。 2.硫酸铵分级沉淀提纯酶是根据什么原理？它有什么优点？ 实验十二 核酸浓度测定----紫外线（UV）吸收法 一、实验目的 （1）通过实验，了解紫外线（UV）测定核酸浓度的原理。 （2）进一步熟悉紫外分光光度计的使用方法。 二、实验原理 1.实验手段的选择？ 核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。 核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用ε(P)来表示。ε(P)为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。 2.样品体系中其它物质是否对实验结果有干扰？ 蛋白质和核苷酸也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的1∕10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值.在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混杂有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法事先除去。 三、材料、仪器与试剂 （一）材料：RNA或DNA干粉。 （二）仪器：（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定） 分析天平，离心机，离心管，紫外分光光度计，烧杯，冰浴，容量瓶（50），吸量管，试管及试管架。 （三）试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制） 钼酸铵—过氯酸沉淀剂；2.5—6％氨水； 四、实验操作 （1）准确称取核酸样品若干，加少量0.01mol ∕ L NaOH 调成糊状，再加适量水，用5—6％氨水调至pH7.0，最后加水配制成每毫升含5-50ug核酸的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm光吸收值，计算核酸浓度： （2）如果待测的核酸样品中含有酸溶性和核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则在测定时需加钼酸铵—过氯酸沉淀剂，除去大分子核酸，测定上清夜260nm波长处A值作为对照。 准确称取待测的核酸样品0.5g，加少量0.01 mol ∕ L NaOH 调成糊状，再加适量水，用5—6％氨水调至pH7.0，定容至50 mL. 取两只离心管，甲管加入2 mL样品溶液和2mL蒸馏水，乙管加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂。混匀，在冰浴上放置30min，在3000 r ∕min下离心10min，从甲、乙两管中分别吸取0.5mL上清夜，用蒸馏水定容至50mL，选择厚度为1cm的石英比色杯，在260nm波长处测定A值. （3）计算： 五、思考题 1.干扰本实验的物质有哪些？ 2.设计排除这些干扰物的实验。 实验十三 植物DNA的提取 一、实验目的 学习从新鲜的叶片中提取植物总DNA的方法。 二、实验原理 1.DNA在细胞中所处的位置？ DNA位于细胞核中，在它的外面包裹着细胞核膜和细胞膜以及细胞壁。要提取DNA必须先破坏细胞壁、细胞膜和细胞核膜。 2．细胞中除了核酸还有哪几种主要物质？ 蛋白质和多糖，在提DNA的过程中应该有去蛋白和多糖的步骤，尤其是蛋白质，由于组蛋白和DNA紧密结合在一起形成染色体，在提取过程中，去组蛋白这一步是关键。 3.针对以上问题具体采用什么方法? 随着植物基因工程的迅速发展，人们经常需要提取一些适合用限制性内切酶降解的高分子量植物的DNA（如构件植物的基因文库）。本实验介绍的就是一种快速简便提取植物总DNA的方法：先将新鲜的叶片在液氮中研磨，以机械力破碎细胞壁，然后加入十六烷三甲基溴化铵分离缓冲液，使细胞膜破裂，同时将核酸与植物多糖等杂质分开（十六烷三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonnium bromide,简称CTAB，是一种阳离子去污剂）。再经氯仿-异戊醇抽提去除蛋白，即可得到适合于酶切的DNA。 三、材料、仪器与试剂 （一）材料：新鲜的植物叶片 （二）仪器：（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定） 研钵，恒温水浴（37-100OC），离心机，离心管。 （三）试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制） 1. CTAB分离缓冲液 2%W/VCTAB，1.4mol/L NaCl,20m mol/L EDTA,100m mol/L Tris-HCl(pH8.0),0.2%V/V巯基乙醇共100mL：称取2g CTAB，8.18g NaCl,0.74g EDTA Na2?H2O,加入10mL 1 mol/L Tris-HCl(Ph8.0),0.2mol 巯基乙醇,加水定容至100 mL 2. 洗涤缓冲液 76%V/V 乙醇,10m mol/L乙醇铵共100 ml : 76mL无水乙醇，0.077g乙酸铵，加水至100ml。 TE(10m mol/L Tris-HCl(pH4.0) 1m mol/LEDTA),氯仿-异戊醇（24：1，V/V），液氮。 四、实验操作 （1）将10mL分离缓冲液加入30mL的玻璃离心管中，置于60OC水浴中预热。 （2）称取1.0——1.5g新鲜叶片，置于预冷的研钵中，到入液氮，将叶片研碎。可重复数次，直至叶片成为很细的粉末，称重。 （3）将叶片粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动离心管使之混匀。 （4）样品于60OC保温30min （5）加等体积的氯仿-异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀， （6）室温下4000r/min离心8min （7）用一开口较大的滴管将上层水相取入另一干净的离心管中，加入2/3体积预冷的异丙醇，轻轻混匀使核酸沉淀下来（有些情况下，在这一步会产生可以用玻璃棒搅起来的长链DNA，或者是云雾状的沉淀。如果观察不到沉淀现象，样品则可以在室温下放置数小时甚至过夜）。 （8）用下述方法收集核酸； 如果呈可见的丝状DNA，可用玻璃棒搅起，转移至10——20mL的洗涤缓冲液中； 如果DNA呈云雾状，可在2000r/min离心1——2min，小心地到去上清夜，在松散的沉淀物上加10——20mL洗涤缓冲液，轻轻转动离心管使核酸悬浮起来； 如果DNA沉淀不可见，则可在更高转速下离心，但这可能回形成更坚实的沉淀，并且含有更多的杂质。这种沉淀较难洗涤，加入洗涤缓冲液后。常需要用玻璃棒搅动，可能将长链DNA打断。 （9）洗涤至少20min后，4000r/min离心10min，或用玻璃棒搅出沉淀。 （10）小心到出上清夜，在室温下，使DNA沉淀，空气干燥，称重，计算产率。 （11）将DNA沉淀溶于1mLTE中。 （12）取15——20uLDNA溶液（如有条件，可取同样量的DNA溶液做Hind Ш或EcoR ?酶切）做0.7%的琼脂糖凝胶电泳（具体操作过程见实验34），以λDNA和用Hind Ш酶切的λDNA做分子量标准，检查DNA的大小和质量。 五、注意事项 提取过程中的机械力可能使大分子DNA断裂成小片段，所以为保证DNA的完整性，各步操作均应较温和，避免剧烈震荡。 六、思考题 为保证植物DNA的完整性，在吸取样品，抽提及电泳时应注意什么？ 实验十四 从肝脏中提取DNA 一、实验目的 学习提取动物总DNA的方法。 二、实验原理 1.DNA在细胞中所处的位置？ DNA位于细胞核中，在它的外面包裹着细胞核膜和细胞膜。要提取DNA必须先破坏细胞膜和细胞核膜。 2．细胞中除了核酸还有哪几种主要物质？ 蛋白质和多糖，在提DNA的过程中应该有去蛋白和多糖的步骤，尤其是蛋白质，由于组蛋白和DNA紧密结合在一起形成染色体，在提取过程中，去组蛋白这一步是关键。 3.针对以上问题具体采用什么方法? 在浓氯化钠（1～2mol∕L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度大，核糖核蛋白的溶解度小。在稀氯化钠（0.14 mol∕L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度小，核糖核蛋白的溶解度大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。将抽提得到的核蛋白用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，DNA(或RNA)即与蛋白质分开，可用氯仿--异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量乙醇，DNA即析出。为了防止DNA(或RNA)酶解，提取时加入EDTA（ethylenediamine tetracetic acid, 乙二胺四乙酸），抑制DNase和RNase。 三、材料、仪器与试剂 （一）材料：动物（鼠，兔，鸡，猪均可）新鲜肝脏 （二）仪器：（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定） 匀浆器，恒温水浴（37-100OC），离心机，离心管。 （三）试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制） （1）5 mol∕L NaCL溶液:将292.3g NaCL溶于水，稀释至1L； （2）0.14 mol∕L NaCL -0.15 mol∕L EDTA –Na溶液：溶8.18g NaCL及37.2g EDTA –Na于蒸馏水，稀释至1L； （3）25％SDS溶液：溶25g十二烷基硫酸钠于100 mL45％乙醇； （4）0.015 mol∕L NaCL-0.0015 mol∕L柠檬酸三钠溶液：0. 828g氯化钠及0.341g柠檬酸三钠溶于蒸馏水，稀释至1L； （5）氯仿--异戊醇混合液：氯仿：异戊醇=24：1（V∕V）; （6）1.5 mol∕L NaCL-0.15 mol∕L柠檬酸三钠溶液：氯化钠82.8g及柠檬酸三钠34.1g溶于蒸馏水，稀释至1L; （7）3mol∕L 乙酸钠-0.001 mol∕L EDTA –Na溶液：称取乙酸钠408g 、EDTA –Na 0.372g溶于蒸馏水，稀释至1L； （8）70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇； （9）二苯胺试剂：使用前称取1g重结晶二苯胺，溶于100 mL分析纯的冰乙酸中，再加入10mL过氯酸（60％以上），混匀待用。临用前加入1mL1.6％乙醛溶液。所配得试剂应为五色。 （10）1 mol∕L 过氯酸溶液：将10 mL过氯酸（70％）用蒸馏水稀释至110 mL 四、实验操作 1. DNA的分离纯化 （1）取动物（鼠，兔，鸡，猪均可）新鲜肝脏4g，.用0.14 mol∕L NaCL -0.15 mol∕L EDTA –Na溶液洗去血液，剪碎，加入10mL 0.14 mol∕LNaCL -0.15 mol∕L EDTA –Na溶液，置匀浆器中研磨。将糊状物离心10 min（4000r∕min），弃去上清夜，沉淀用0.14 mol∕L NaCL -0.15 mol∕L EDTA –Na溶液洗二、三次。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。 （2）向上述沉淀物中加入0.14 mol∕L NaCL -0.15 mol∕L EDTA –Na溶液5 mL，然后滴加25％SDS溶液0.5mL，边加边搅拌. 加闭，置60OC水浴保温10min(不停搅拌)溶液变得粘稠并略透明，取出冷至室温。此步操作系统使核酸与蛋白质分离。 （3）加入5mol∕L NaCL溶液2 mL，使NaCL最终浓度超过1mol∕L，搅拌10min, 加入约一倍体积的氯仿--异戊醇混合液，振摇20 min，离心10min（4000r∕min）。去掉沉淀，上层清夜徐徐加入1.5～2倍95％乙醇，沉淀析出，用玻棒慢慢搅拌，将丝状物缠在玻棒上。 （4）将粗品置于4.5 mL 0.015 mol∕L NaCL-0.0015mol∕L柠檬酸三钠溶液，搅匀，加入一倍体积氯仿--异戊醇混合液，振摇10min，离心(4000r∕min，10min),清出上层液（沉淀弃去），加入1.5倍体积95％乙醇，沉淀析出。离心，弃取上清夜，沉淀（粗DNA）按本操作步重复处理一次。 （5）将上步所得沉淀溶于4.5 mL 0.015 mol∕L NaCL-0.0015mol∕L柠檬酸三钠溶液中，然后徐徐加入2倍体积95％乙醇，边加边搅，取出丝状DNA，依次用70％、80％、95％及无水乙醇各洗一次，自然干燥。 2.鉴定 用二苯胺法测定DNA。 用紫外分光光度法定量测定DNA。 五、思考题 结合本人实验操作的体会，试述在提取过程中应如何避免大分子DNA的降解和断裂？ 实验十五 氨基移换反应——血液中转氨酶活力的测定 （分光光度法） 一、实验目的 1.验证氨基转移反应——谷丙转氨酶作用原理 2.了解转氨酶在代射过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义,正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎、心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。 3.掌握酶活力测定的方法 二、实验原理 1.什么是酶活力？ 酶活力是指酶促进反应进行能力的大小，酶活力越大则反应物消耗得越多、产物生成的越多。 2.如何测酶活力？ 酶活力不能直接用仪器检测，只有通过反应物或生成物在反应前后量的变化来反映，一般用生成物反应前后量的变化来表示酶活力。 3.具体到这个实验中，酶活力大小指得是什么? 生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化a-氨基酸的a-氨基与a-酮酸的a-酮基互换，在氨基酸的合成和分解，尿素和瞟呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨梅）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）的活力最强。 谷丙转氨酶可将血液中的丙氨酸的氨基转移给a-酮戊二酸，生成谷氨酸，同时丙氨酸变为丙酮酸，即 丙氨酸 + a-酮戊二酸 → 谷氨酸 + 丙酮酸 因此只要检测反应后体系中谷氨酸或丙酮酸的量即可得到酶活力。 4.采用什么方法？ 测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸和a-酮二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。 丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，可用分光光度法测定。从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可以计算酶的活力。 三、材料、仪器与试剂 （一）材料：人血清。 （二）仪器：（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定） 试管、试管架、吸管、恒温水浴、分光光度计 （三）试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制） 1、0.1mo1/L磷酸缓冲液（pH7.4） 250mL 2、2.0丙酮酸钠标准溶液 40~50mL 取分析纯丙酮酸钠11mg 溶解于50mL磷酸缓冲液内（当日配制） 3、谷丙转氨酶底物 取分析纯a-酮戊二酸29.2mg,DL-丙氨酸1.78g置于小烧杯内，加1mol/L氢氧化钠溶液约10mL使完全溶解。用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸调整pH至7.4后，加磷酸缓冲液至100mL。然后加氯仿数滴防腐。此溶液每mL含a-酮戊二酸2.0mol，丙氨酸200mol。在冰箱内可保存一周。 4、2，4-二硝基苯肼溶液 在200mL锥形瓶内放入分析纯2，4-二硝基苯肼19.8mg,加100mL 1 mol/L盐酸。把锥形瓶放在暗处并不时摇动，待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，滤入棕色玻璃瓶内，置冰箱内保存。 5、0.4mol/L氢氧化钠溶液 1 200mL 四、实验操作 1、标准曲线的绘制：取6支试管，分别标上0，1，2，3，4，5六个号。按下表所列的次序添加各试剂。 试剂（mL） 试 管 号   0 1 2 3 4 5  丙酮酸钠标准液 谷丙转氨酶底物 磷酸缓冲液 一 0.50 0.10 0.05 0.45 0.10 0.10 0.40 0.10 0.15 0.35 0.10 0.20 0.30 0.10 0.25 0.25 0.10  2，4-二硝苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的a-酮戊二酸与2，4-二硝基苯肼反应，生成a-酮戊二酸苯腙。因此，在制作标准曲线时，须加入一定量的底物（内含a-酮戊二酸）以抵消由a-酮戊二酸产生的消光影响。 先将试管置于370C恒温水中保温10分钟以平衡内外温度。向各管内加入0.5 mL2，4-二硝基苯肼溶液后再保温20分钟，最后，分别向各管内加入0.4 mol/L氢氧化钠溶液5 mL。在室温下静置30分钟，以0号管作空白，测定A520nm吸光度。用丙酮酸的mol数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。 2、酶活力的测定：取2支试管并标号，用第1号试管做未知管，第2号试管做为空白对照管。各加入谷丙转氨酶底物0.5 mL，置于370C水浴内10分钟，使管内外温度平衡。取血清0.1mL加入第1号试管内，继续保温60分钟。到60分钟时，向2支试管内各加入2，4-二硝基苯肼试剂0.5mL，向第2号试管中补加0.1mL血清，再向1、2号试管内各加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5mL。在室温下静置30分钟后，测定未知管的A520nm波长吸光吸收值（显色后30分钟至2小时内其色度稳定）。在标准曲线上查出丙酮酸的mol数（1mol丙酮酸代表1.0单位酶活力），计算第100mL血清中转氨酶的活力单位数。 五、思考题 1.转氨酶底物在本实验中起的作用？ 2.转氨酶在代谢过程中的重要作用及临床诊断中的意义？ 3.如果提供的药品中没有丙氨酸和a-酮戊二酸，只有谷氨酸和丙酮酸，实验能否进行？如何进行？ 实验十六 维生素C含量的测定 一、实验目的 维生素C是人体必需的营养元素，它广泛存在于各种蔬菜和水果中，但在不同的材料中Vc的含量是不同的，因此Vc含量的测定对于营养膳食是非常重要的。 二、实验原理 1.要测定水果或蔬菜中的维生素C，这属于测复杂组分中的一种物质，应该用什么方法呢？ 根据生化基本实验技术的实验原理可知，可以采用分光光度法，维生素C具有对紫外产生吸收和对碱不稳定的特性，因此可采取紫外快速测定法，于243nm处测定样品液与碱处理样品液两者消光值之差，通过查标准曲线，即可计算样品中维生素C的含量。 2.标准曲线是什么？ 我们用分光光度法测出的仅是消光值，必须通过维生素C的标准溶液做出曲线，通过查标准曲线即可知道待测溶液中维生素C的量。 三、材料、仪器与试剂 （一）材料：各种水果蔬菜、果汁及饮料。 （二）仪器：（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定） 紫外分光光度计、离心机、分析天平、容量瓶（10ml, 25ml）、移液管（0.5ml，1.0ml）、吸管、研钵。 （三）试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制） 1．10%盐酸：取浓盐酸133ml，加水稀释至500ml。 2．1%盐酸：取浓盐酸22ml，加水稀释至100ml。 3．1mol/L氢氧化钠溶液：称取40gNaOH，加蒸馏水，不断搅拌至溶解，然后定容至1000ml。 四、实验操作 （一）标准曲线的制作 1．抗坏血酸标准溶液的配制：用分析天平准确称取抗坏血酸10mg，加2ml 10%盐酸，加蒸馏水定容至100ml，混匀。此抗坏血酸溶液的浓度为100ug/ml。 2．取带塞刻度试管8支并编号，分别按表内所规定的量加入抗坏血酸标准溶液和蒸馏水。 ? 1 2 3 4 5 6 7 8  标准抗坏血酸溶液加入体积（ml） 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.8 1.0  蒸馏水加入体积（ml） 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.2 9.0  总体积（ml） 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0  抗坏血酸溶液浓度（ug/ml） 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0 10.0  3．消光值的测定：以蒸馏水为空的，在243nm处测定标准系列抗坏血酸溶液的消光值，以抗坏血酸的含量（ug）为横坐标，以相应的消光值为纵坐标作标准曲线。 （二）样品的测定 1．样品的提取：将果蔬样品洗净、擦干、切碎、混匀。称取5.00g于研体中，加入2-5ml 1%盐酸，匀浆，转移到25ml容量瓶中，稀释至刻度。若提取液澄清透明，则可直接取样测定，若有浑浊现象，可通过离心（1 0000g, 10min）来消除。 2．样品的测定：取0.1-0.2ml提取液，放入盛有0.2-0.4ml 10%盐酸的10ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为空白，在243nm处测定其消光值。 3．待测碱处理液的制备：分别吸取0.1-0.2ml提取液，2ml蒸馏水和0.6-0.8ml 1mol/L氢氧化钠溶液依次放入10ml容量瓶中，混匀，15min后加入0.6-0.8ml 10%盐酸，混匀，并定容至刻度。以蒸馏水为空白。在243nm处测定其消光值。 4．由待测样品与待测碱处理样品的消光值之差和标准曲线，即可计算出样品中VC的含量。 5．也可直接以待测碱处理液为空白，测出待测液的消光值，通过查标准曲线，计算出样品的维生素C的含量。 五、计算 μ×V总 Vc的含量（μg/g）= —————— V1×W总 式中：μ——从标准曲线上查得的抗坏血酸的含量（μg） V1——测消光值时吸取样品溶液的体积（ml） V总——样品定容体积（ml） W总——称样重量（g） 六、思考题 对维生素C含量的测定，除了分光光度法外，还有没有其它方法？ 科实验报告纸 年级 姓名 学号 成绩 实验目的要求：  实验原理：  主要仪器材料和试剂：  实验步骤与结果： 各步骤现象记录：  结果计算与分析：  注意事项与建议：  *开放性与设计性实验请自行撰写实验报告 *第一次使用的仪器工作原理及使用规程请另纸描述