第十一章 核酸代谢
三, DNA的生物合成
五, RNA的生物合成
四, DNA的修复
一, 核酸的分解代谢
二, 核苷酸的生物合成
六, 基因工程简介
一, 核酸的分解代谢
1,核酸的酶促降解
2,嘌呤的降解,
3,嘧啶的降解,
1,核酸的酶促降解
核酸
核酸酶
单核苷酸
磷酸单脂酶
核苷
嘧啶(嘌呤) 核糖(脱氧核糖)
核苷酶核苷磷酸化酶
嘧啶(嘌呤)
核糖 -1-磷酸
脱氧核糖 -1-磷酸
核糖 -5-磷酸
磷酸戊糖途径
醛缩酶
乙醛
甘油醛 -3-磷酸
核酸酶,作用于核酸的磷酸二酯酶称为核
酸酶,按其作用位置分为,
A.核酸外切酶,作用于核酸链的末端( 3’ 端
或 5’ 端),逐个水解下核苷酸。
脱氧核糖核酸外切酶:只作用 DNA
核糖核酸外切酶,只作用于 RNA
B.核酸内切酶,从核酸分子内部切断 3’, 5’ -
磷酸二酯键。
限制性内切酶, 在细菌细胞内存在的一类能识别
并水解外源双链 DNA的核酸内切酶,可用于特异
切割 DNA,常作为工具酶。
牛脾磷酸二酯酶
3?-核苷酸
蛇毒磷酸二酯酶
5?-核苷酸
2.嘌呤的降解,
这是一个氧化降解过程,不同生
物降解的产物不同。
腺嘌呤 鸟嘌呤
H2O H2O
NH3 NH3
次黄嘌呤 黄嘌呤
H2O+O2 H2O2 H2O+O2
H2O2
尿囊素 尿酸
H2O CO2+H2O2 2H2O+O2
尿囊酸 尿素 + 乙醛酸
H2O 2H2O
4NH3 + 2CO2
(植物)
腺嘌呤脱氨酶 鸟嘌呤脱氨酶
黄嘌呤氧化酶
黄嘌呤
氧化酶
尿酸氧化酶
尿囊
素酶
尿囊酸酶
脲酶
各种生物嘌呤碱的代谢产物
嘌呤代谢产物 排泄动物
尿酸 人类、灵长类动物、鸟类、昆虫
尿囊素 除灵长类外其它哺乳类动物
尿囊酸 某些硬骨鱼类
尿素、乙醛酸 大多数鱼类、两栖类动物
氨、二氧化碳 甲壳类动物、软体动物
3.嘧啶的降解,
这是一个还原降解过程。
? 胞嘧啶 尿嘧啶 二氢尿嘧啶
H2O NH3 NAD(P)H+H+ NAD(P)+ H2O
β -丙氨酸 β -脲基丙酸
H2O
? 胸腺嘧啶 二氢胸腺嘧啶
NAD(P)H+H+ NAD(P)+ H2O
β -氨基异丁酸 β -脲基异丁酸
H2O
胞嘧啶脱氨酶 二氢尿嘧啶脱氢酶
二氢嘧
啶酶脲基丙酸酶
二氢尿嘧啶脱氢酶
二氢嘧啶酶
脲基丙酸酶
NH3+CO2+
NH3+CO2+
二, 核苷酸的生物合成
P.235 图 11-4 核苷酸合成的两条途径
1.嘌呤核苷酸环上原子来源
四氢叶酸( FH4)是一碳单位的载体
嘌呤核苷酸合成特点 (选讲 )
先形成 IMP(黄嘌呤核苷酸 ),然后在单磷酸
的水平上转变成 AMP,GMP。
IMP合成从 5?-P-核糖开始的,在 ATP参与下先
形成 PRPP(5-磷酸核糖焦磷酸 )
嘌呤的各个原子是在 PRPP的 C1上逐渐加上去的。
由 Asp,Gln,Gly、甲酸,CO2 提供 N和 C,合
成时先形成右环,再形成左环。
? 嘌呤类似物( 6-巯基嘌呤):可抑制
AMP,GMP的生成
? 谷胺酰胺类似物(氮杂丝氨酸):可抑
制 IMP的合成中有谷胺酰胺参与的反应
? 叶酸类似物(氨基蝶呤、氨甲喋呤):
可抑制 IMP合成中有四氢叶酸参与的反应
* 临床上几种治癌药物的作用机理
嘧啶核苷酸的嘧啶环是由氨甲酰磷酸和
天冬氨酸合成的。
氨甲酰磷酸
天冬氨酸
2.嘧啶核苷酸的生物合成
其合成与嘌呤核苷酸的合成不同,先
由氨甲酰磷酸与天冬氨酸形成嘧啶环,再
与核糖磷酸( PRPP)结合形成 UMP,其关
键的中间产物是乳清酸。胞苷酸则由尿苷
酸在三磷酸的水平上转变而来。
嘧啶核苷酸合成特点
P,245 图 11-13核苷酸生物合成 与核酸生物合成的关系
DNA是生物遗传的主要物质基础,生物机体
的遗传信息以密码的形式编码在 DNA分子上,
表现为特定的核苷酸排列顺序,并通过 DNA的
复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过
程中,遗传信息自 DNA转录给 RNA,然后翻译成
特异的蛋白质,以执行各种生命功能,使后代
表现出与亲代相似的遗传性状。
三, DNA的生物合成
复制,亲代 DNA或 RNA在一系列酶的作用下,生
成与亲代相同的子代 DNA或 RNA的过程。
转录,以 DNA为模板,按照碱基配对原则将其所
含的遗传信息传给 RNA,形成一条与 DNA链互补
的 RNA的过程。
翻译,亦叫转译,以 mRNA为模板,将 mRNA的
密码解读成蛋白质的 AA顺序的过程。
逆转录,以 RNA为模板,在逆转录酶的作用下,
生成 DNA的过程。
Reverse
transcription
? 定义,由亲代 DNA生成子代 DNA时,每个新形成
的子代 DNA中,一条链来自亲代 DNA,而另一条
链则是新合成的,这种复制方式叫 半保留复制
? 半保留复制的实验证据,1958年 Meselson和
Stahl用同位素 15N标记大肠杆菌 DNA,首先证明了
DNA的半保留复制。
1,DNA的半保留复制
DNA复
制的可
能方式
全保留与
全新复制 分散复制
半保留
复制
半保留复制的证明:
Meselson 和 Stahl将同位素 15N标记的
15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养 12代,
使大肠杆菌的 DNA都带上 15N的标记,然后
将该大肠杆菌转入 14N的普通培养基中培养
后,分离子一代、子二代、子三代、子四
代 DNA,进行 氯化铯 密度梯度离心,实验
证明了 DNA的半保留复制。
15N-DNA的密度大于 14N-DNA的密度
亲代 DNA( 15N~ 15N)
子一代 DNA( 15N~ 14N)
子二代 DNA (15N~ 14N,14N~ 14N 1:1)
子三代 DNA (15N~ 14N,14N~ 14N 1:3)
子四代 DNA (15N~ 14N,14N~ 14N 1:7 )
亲代 DNA与子二代 DNA的混合物
亲代 DNA与子四代 DNA的混合物
居中


0 1 2 3 4
2,生物中的 DNA聚合酶
在大肠杆菌中发现有三种 DNA聚合酶:
DNA聚合酶 Ⅰ
单体酶,多肽链内含一个锌原子,多功能酶。它具有
5?? 3 ?聚合酶功能(对脱氧核苷酸的选择); 3’
? 5’ 外切酶活性(对双链无作用,校对功能。 但在
正常聚合条件下,此活性不能作用于生长链)及 5’
? 3’ 外切酶活性(双链有效,主要是对 DNA损伤的修
复,以及在 DNA复制时 RNA引物切除及其空隙的填补)
Arthur Kornberg 1918
Stanford University
Stanford,CA,USA
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959
"for their discovery of the mechanisms in the biological
synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid"
DNA聚合酶 Ⅱ,
多亚基酶,聚合作用,但聚合活力很低;具有 3’
? 5’ 外切酶活性。其它生理功能尚不清楚,
可能在修复紫外光引起的 DNA损伤中起作用。
DNA聚合酶 Ⅲ, 是原核生物 DNA复制的主要聚合酶,
该酶由 10种亚基组成,其中 ?,?,?形成全酶的核
心酶 。具有 5’ ?3’DNA 聚合酶活性( ?亚基,速
率高); 具有 3’ ? 5’ 外切酶( ?亚基) 的校对
功能,提高 DNA复制的保真性;还具有 5’ ? 3’
外切酶活性(单链有效,其意义未知)。
DNA聚合酶 IV和 V,1999年发现,当 DNA严重损伤时,
诱导产生。
DNA聚合酶 Ⅰ DNA聚合酶 Ⅱ DNA聚合酶 Ⅲ
结构基因 *
不同种类的亚基
数目
相对分子质量
3’→5 ’外切酶
5’→3 ’外切酶
聚合速度(核苷
酸 /分)
持续合成能力
功能
Pol A
1
103,000


1,000-1,200
3-200
切除引物,修

Pol B
≥7
88,000


2,400
1,500
修复
Pol C
≥10
830,000


15,000-60,000
≥500,000
复制
大肠杆菌三种 DNA聚合酶比较
在真核细胞内有五种 DNA聚合酶
(与细菌 DNA聚合酶的性质基本相同:底物、模板、引物、方向)
α β γ δ ε
定位 细胞核 细胞核 线粒体 细胞核 细胞核
3’ -5’
外切 - - + + +
酶活性
功能 引物
合成
修复
作用
线粒体 DNA
的复制
核 DNA
的复制
修复
作用
真核细胞内有五种 DNA聚合酶
DNA聚合
酶 α
DNA聚合
酶 β
DNA聚
合酶 γ
DNA聚合
酶 δ
DNA聚合
酶 ε
定位
亚基数目
外切酶活性
引物合成酶活

持续合成能力
抑制剂
功能
细胞核
4


中等
蚜肠霉素
引物合成
细胞核
1



双脱氧
TTP
修复
线粒体
2
3’ →5 ’
外切酶


双脱氧
TTP
线粒体
DNA合成
细胞核
2
3’ →5 ’
外切酶

有 PCNA时

蚜肠霉素
核 DNA合成
细胞核
> 1
5’→ 3 ’
外切酶


蚜肠霉素
修复
DNA连接酶( 1967年发现):
若双链 DNA中一条链有切口,一端是 3’ -OH,另一端是
5’ -磷酸基,连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键,
而使切口连接。
但是它不能将两条游离的 DNA单链连接起来。
3’ 5’
3’5’
OH P
拓扑异构酶 ?,使 DNA一条链发生断裂和再连
接。作用是松解负超螺旋,反应不需要能量。
主要集中在活性转录区,同转录有关。
拓扑异构酶
催化 DNA的拓扑连环数发生变化的酶,在 DNA重
组修复和其他转变方面起重要作用。
除连环数不同外其它性质均相同的 DNA分子称
为拓扑异构体,引起拓扑异构体反应的酶称为
拓扑异构酶
拓扑异构酶 Π, 使 DNA两条链发生断裂和再连
接。当引入负超螺旋时需要由 ATP提供能量,
同复制有关。
二者共同控制 DNA的拓扑结构。
解螺旋酶 (解链酶)
通过水解 ATP将 DNA两条链打开。 E.coli中的
rep蛋白就是解螺旋酶,还有解螺旋酶 I,II、
III。每解开一对碱基需要水解 2个 ATP分子。
rep蛋白沿 3 ’ ?5’ 移动,而解螺旋酶 I,II、
III沿 5 ’ ?3’ 移动。
其它蛋白因子:
单链结合蛋白 (SSB-single-strand binding
protein):稳定已被解开的 DNA单链,阻止复性
和保护单链不被核酸酶降解。
引发前体,它由多种蛋白质 dnaA,dnaB,dnaC,n,n’、
n’’和 i组成。 引发前体再与引发酶结合组装成引发体 。
引发体可以沿模板链 5’? 3’方向移动,具有识别
合成起始
位点的功能,移动到一定位置上即可引发 RNA引物
的合成。移动和引发均需要 ATP提供能量
3.DNA的合成方式
? DNA的复制:以 DNA为模板
合成 DNA。
? 逆转录:以 RNA为模板合成 DNA。
? 修复合成 ( DNA聚合酶 I、
连接酶等)
4,DNA的复制过程,(以大肠杆菌为例)
? 双链的解开
? RNA引物的合成
? DNA链的延伸
? 切除 RNA引物,填补缺口,连接相邻的 DNA片

a,双链的解开
DNA的复制有特定的起始位点,叫做 复制原
点 。常用 ori(或 o)表示。许多生物的复
制原点都是富含 A,T的区段。
大肠杆菌染色体 DNA以及真核生物的细胞器
DNA为双链环状,只有一个复制原点,而
真核生物染色体 DNA是线性双链分子,含
有许多复制起点。
从复制原点到终点,组成一个复制单位,叫
复制子(基因组独立进行复制的单位,可
以是一个基因也可以是多个基因)。
复制中的 DNA
复制原点
复制叉
复制原点由 DnaA蛋白识别,在原点由 DnaB
蛋白(解螺旋酶)将双螺旋解开成单链状态,
分别作为模板,合成其互补链 (DNA双链的解
开还需 DNA拓扑异构酶 Π, SSB),在原点处
形成一个眼状结构,叫复制眼。
DNA复制进行时,在眼的两侧出现两个叉子
状的生长点 (growth point),叫 复制叉 。在
复制叉上分布着各种与复制有关的酶和蛋白
因子,它们构成的复合物称为 复制体
( replisome)
复制叉
起点
复制叉
延伸延伸
起点
领头链
领头链
随后链
随后链
3’5’
3’ 5’
DNA的双向复制
b,RNA引物的合成
引发体在复制叉上移动,沿模板链 5’
3’的方向移动,与复制叉移动的方向相同,
识别合成的起始位点,DnaB蛋白活化引物合
成酶。引发 RNA引物的合成。 领头链 先引发开
始合成,以原来一条 DNA单链为模板( 3’ ?
5’),按 5’ ? 3’的方向合成一段 RNA引物链。
领头链开始合成后,随后链也开始合成其引
物。引物长度约为几个至 10个核苷酸,在引
物的 5’端含 3个磷酸残基( 引物酶的底物是核
苷三磷酸 ),3’端为游离的羟基。
三,DNA复制的半不连续性
前导链
滞后链
冈崎片段
前导链,以 3’ → 5 ’ 方向的亲
代链为模板连续合成的子代链。
滞后链,以 5’ →3 ’方向的亲
代链为模板的子代链先逆复制
叉移动方向合成冈崎片段,再
连接成滞后链。
半不连续复制的发现
同位素实验,用含 3H的 dT标记用 T4噬菌体感染的大肠
杆菌 ? 短时间内分离的 DNA均为 DNA小片段 ?一段时间
后 ?检测到 DNA大片段。当用 DNA连接酶的缺失的变异
株时,检测到大量 DNA片段的积累。 → 证明 DNA复制中有
小片段合成。
测定 DNA小片段,远远大于合成 DNA的一半。似乎两条
链都是不连续合成的,后发现是由于 U替代 dT渗入 DNA中,
而被尿嘧啶 -N-糖基酶切除所致。
在缺少尿嘧啶 -N-糖基酶的突变植株中,DNA的 U不再
被切除,则 检测到一半 3H标记出现在小片段(冈崎片段)
中。
? 1968日本学者冈崎:
参与 DNA复
制的酶与
蛋白因子
总览图
c,DNA链的延伸
在 DNA聚合酶 Ш的催化下,以四种脱氧核糖核苷
5’-三磷酸为底物,在 RNA引物的 3’端以磷酸二
酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。
DNA链的延伸同时进行领头链和随后链的合成。
两条链方向相反。
?领头链
? 随后链
? 冈崎片段
? 半不连续复

冈崎模型
领头链 — 在 DNA复制时,合成方向与复制叉移动
的方向一致并连续合成的链。
随后链 — 在 DNA复制时,合成方向与复制叉移动
的方向相反,形成许多不连续的片段,最后再
连成一条完整的 DNA链。
半不连续复制 — 在 DNA复制时,领头链是连续合
成的,而随后链的合成是不连续的,这种复制方
式称为半不连续复制。
?发现( 1968):
同位素实验,3HdT? 短时间内为 DNA小片段 ?一
段时间后 ?检测到 DNA大片段。当用 DNA连接酶的
变异株时,检测到大量 DNA片段的积累。 —— 证明
DNA复制中有小片段合成。
测定 DNA小片段,远远大于合成 DNA的一半。 由于 U
替代 dT,被尿嘧啶 -N-糖基酶切除。
在缺少尿嘧啶 -N-糖基酶的突变植株中,检测到一
半 3H标记出现在小片段(冈崎片段)中。
? 冈崎片段
在 DNA复制过程中,领头链能连续合成,
而随后链只能是断续的合成 5??3 ?的多
个短片段,这些不连续的小片段以其发
现者的名字命名为冈崎片段。
冈崎片段 真核生物中 100-200个核苷酸
(核小体的 DNA单位)。原核生物中
1000-2000个核苷酸(相当于一个顺反
子)。
d,切除 RNA引物,填补缺口,连接相邻的 DNA片段
(复制终止)
当新形成的冈崎片段延长至一定长度,其
3’-OH端遇到上一个冈崎片段时即停止合成。
复制叉移动到终止区即停止复制 (大肠杆菌
有一个终止区) 。
这时会发生一系列变化,在 DNA聚合酶 Ⅰ 催化
下切除 RNA引物 ; 留下的空隙由 DNA聚合酶 Ⅰ 催
化合成一段 DNA填补上 ; 在 DNA连接酶 作用下,
连接相邻的 DNA链; 修复掺入 DNA链的错配碱基 ;
以 修复方式填补 终止区 50-100bp的空缺。这样
以两条亲代 DNA链为模板,各自形成一条新的
DNA互补链。结果是形成了两个 DNA双股螺旋分
子。
5,真核生物中 DNA的复制特点
1、真核生物染色体有多个复制起点,多复制
眼,呈双向复制,多复制子。
2、冈崎片段长约 200bp.
3、真核生物 DNA复制速度比原核慢。
4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不
再重新开始复制;而在快速生长的原核中,
起点可以连续发动复制。真核生物快速生
长时,往往采用更多的复制起点。
5、真核生物有多种 DNA聚合酶。
6、真核生物线性染色体两端有 端粒 结构,防
止染色体间的末端连接。由 端粒酶 负责新
合成链 5?RNA引物切除后的填补,亦保持 端
粒 的一定长度 。
定义,以 RNA为模板,按照 RNA中的核苷酸顺序
合成 DNA称为逆转录,由 逆转录酶 催化进行。
用特异抑制物(放线菌素 D)能抑制致
癌 RNA病毒的复制,而对一般 RNA病毒的复制
无影响。已知放线菌素 D专门抑制以 DNA为模
板的反应,可见致癌 RNA病毒的复制过程必
然涉及到 DNA。
6,逆转录
1970年 Temin和 Baltimore同时分别从劳
氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病 RNA
病毒中分离出逆转录酶,迄今已知的致癌
RNA病毒都含有逆转录酶。
因发现逆转
录病毒的遗传
物质而获 1975
年诺贝尔奖的
三位科学家
+ RNA+DNA- RNA+DNA-
DNA+
病毒 RNA的逆转录过程 (以前病毒形式引起整合到宿主细
胞 DNA中而使细胞恶性转化)
单链病毒 RNA RNA-DNA杂交分子 双链 DNA(前病毒)
逆转录酶 逆转录酶
逆转录酶也和 DNA聚合酶一样,沿
5’ ?3’ 方向合成 DNA,并要求短链
RNA作引物。
逆转录酶是多功能酶,兼有 3种酶的活性:
RNA指导的 DNA聚合酶活性
DNA指导的 DNA聚合酶活性
核糖核酸酶 H的活性,专一水解 RNA-DNA杂交
分子中的 RNA,可沿 5’?3’和 3’ ?5’两个方向
起核酸外切酶的作用。
cDNA(complementary DNA),几乎所有真核生
物 mRNA分子的 3‘ 末端都有一段 polyA,当加入
寡聚 dT作为引物时,mRNA就可作为模板,在
逆转录酶催化下在体外合成与其互补的 DNA,
称为 cDNA。
逆转录酶发现的理论和实践意义:
不能把, 中心法则, 绝对化,遗传信息
也可以从 RNA传递到 DNA。促进了分子生物学、
生物化学和病毒学的研究,为肿瘤的防治提
供了新的线索。目前逆转录酶已经成为研究
这些学科的工具。
1983年,发现人类免疫缺陷病毒( human immune
deficience virus,HIV),感染 T淋巴细胞后即杀
死细胞,造成宿主机体免疫系统损伤,引起艾滋
病( acquired immunodeficiency
syndrome,AIDS)
DNA复制的精确性(高保真复制)
DNA复制必须具有 高度精确性,在大肠杆菌
的细胞 DNA复制中其 错误率约为 1/109~ 1/1010,
即每 109~ 1010个核苷酸才出现一个错误,也就
是大肠杆菌染色体 DNA复制 1000~ 10000次才出
现一个核苷酸的错误。这么高的精确性的保证
主要与下列因素有关:
1、碱基的配对规律,摸板链与新生链之间的碱
基配对保证碱基配错几率约为 1/104~ 1/105。
2,DNA聚合酶的 3’→5 ’外切酶活性的校对功能,
使碱基的错配几率又降低 100~ 1000倍。
3,DNA的损伤修复系统。
? DNA的损伤:
DNA在复制时产生错配、病毒基因整合;
某些物化因子如紫外光、电离辐射和化学诱变
等,破坏 DNA的双螺旋结构。从而影响 DNA的复
制,并使 DNA的转录和翻译也跟着变化,因而
表现出异常的特征(生物突变)。
四, DNA的损伤修复
若 DNA的损伤或错配得不到修复,会导致 DNA突
变。其主要形式:
一个或几个碱基被置换
插入一个或几个碱基
一个或多个碱基对缺失
DNA的损伤修复 —— 四种修复途径,光复活,
切除修复、复组修复和诱导修复(亦称暗
修复)。
光复活
400nm左右的光激活光复活酶,专一分解紫
外光照射引起的同一条链上 TT( CC CT) 二聚
体。(包括从单细胞生物到鸟类,而高等哺乳
动物无)
切除修复
将 DNA分子中的受损伤部分切除,以完整
的那条链为模板再重新合成。特异内切酶、
DNA聚合酶,DNA外切酶,DNA连接酶均参与。
(发生在 DNA复制前)
重组修复 (发生在复制后)
复制时,跳过损伤部位,新链产生缺口由
母链弥补,原损伤部位并没有切除但在后代逐
渐稀释。
诱导修复
造成 DNA损伤或抑制复制的处理均能引起
一系列复杂的诱导效应,称为 应急反应( SOS
response)。 此过程诱导产生切除修复和重组
修复中的关键蛋白和酶,同时产生无校对功能
的 DNA聚合酶。所以会有 2种结果:修复或 变异
(进化) 。
转录 (transcription):以 DNA为模板,根据
碱基配对的原则合成与 DNA互补的 RNA的过程。
a、相同点:
都需要模板
都以三磷酸核苷酸为底物( NTP或 dNTP)
合成方向都是 5→ ’3’
转录与 DNA复制的比较:
b、转录 DNA复制的不同点
模板链,双链 DNA中具有转录活性的的链称为模板链,
又称反义链(或负链)。
编码链,双链 DNA中无转录活性的链称为编码链,又称
有义链(或正链)。
? 转录不需引物;
? 只转录 DNA分子中的一个片段(称为转录单位或操纵
子,operon);
? 双链 DNA中只有一条链具有转录活性(称为模板链);
? 哪个基因被转录与特定的时间、空间、生理状态有关。
? RNA聚合酶无校对功能。
五, RNA的生物合成
1,概念
转录,以 DNA的一条链为模板在 RNA聚合酶催化
下,按照碱基配对原则,合成一条与 DNA链
的一定区段互补的 RNA链的过程称为转录。
以四种核糖核苷三磷酸酸( NTP)为底物,形
成 3?,5? -磷酸二酯键相连接。
转录的不对称性,在 RNA的合成中,DNA的二条链
中仅有一条链可作为转录的模板,称为转录的
不对称性。
反义链(无意义链,负链):在 RNA的转录中,
用作模板的 DNA链称为反义链。
有义链(编码链,正链)在 RNA的转录中,不作
为模板的 DNA链称为有义链。
2,RNA聚合酶, 大肠杆菌的 RNA聚合酶
全酶由 5种亚基 α 2ββ’ ?ζ 组成, ζ 因
子与其它部分的结合不是十
分紧密,它易于与 β ’βα2
分离,没有 ζ, ?亚基的酶
称为核心酶 —— 只催化链的
延长,对起始无作用。
大肠杆菌的 RNA聚合酶
大肠杆菌 RNA聚合酶各亚基的功能
亚基 基因 Mr 亚基 功能
数目
α rpoA 40,OOO 2 酶的装配,与启动子上游
元件和活化因子结合
β rpoB 155,000 1 结合核苷酸底物,催化磷
酸二酯键形成
β ’rpoC 160,000 1 与模板结合
ζ rpoD 32,OOO- 1 识别启动子,促进转录
92,000 的起始
? 9,OOO 1 未知






α -鹅膏蕈

对酶的作用
分子量 反应条件

I

核仁
核质
核质
rRNA
5.8SrRNA
18SrRNA
28SrRNA
mRNAsn
RNA
tRNA
5SrRNA
不抑制
低浓度抑制
高浓度抑制
500000
~700000
~700 000
_
低离子强度,要
求 Mg2+或 Mn2+
高离子强度
高 Mn2+浓度
真核细胞的 RNA聚合酶
同样,真核 RNA聚合酶无校对功能。
RNA聚合酶的特点:
1、反应底物,NTP,DNA为模板,Mg2+促进聚
合反应。
RNA聚合酶不需要引物,合成方向 5??3 ?。
2、真核生物与原核生物的 RNA聚合酶结构不
同(具体
说明)。
3,利福平 抑制原核生物 RNA聚合酶活性;
α -鹅膏蕈碱 抑制真核生物 RNA聚合酶活性。
3,RNA的转录过程,(以大肠杆菌为例)
? 起始位点的识别
? 转录起始
? 链的延伸
? 转录终止
( 1)起始位点的识别
RNA的合成不需要引物 。体外实验证明,
不含 ζ 亚基的核心酶会随机地在一个基因的
两条链上启动,当有 ζ 亚基时就会选择正确
的起点。 ζ 亚基起着识别 DNA分子上的起始
信号( 启动子 —— 指 RNA聚合酶识别、结合
和开始转录的一段 DNA序列)的作用。
启动子的结构至少由三部分组成,-35序列提供
了 RNA聚合酶全酶识别的信号; -10序列是酶的
紧密结合位点(富含 AT碱基,利于双链打开);
第三部分是 RNA合成的起始点。
AACTGT ATATTA
TTGACA TATAAT
+1
转录起始点
5’ 3’
3’ 5’
35序列
Sextama

10序列
Pribnow

( 2)转录起始
RNA聚合酶全酶扫描解链区,找到起始
点,然后结合第一个核苷三磷酸。加入的
第一个核苷三磷酸常是 GTP或 ATP,很少是
CTP,不用 UTP。所形成的 启动子、全酶和
核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物,
第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点,
ζ 亚基就会被释放脱离核心酶。
?因子仅与起始有关,RNA的合成一旦开始,
便被释放
?
E
-35 -10 pppG或 pppA
5’
5’
3’
3’
模板链
( 3) RNA链的延伸
DNA分子和酶分子发生构象的变化,核心酶
与 DNA结合比较松弛,可沿 DNA模板移动,
并按模板顺序选择下一个核苷酸,将核苷
三磷酸加到生长的 RNA链的 3’-OH端,催化形
成磷酸二酯键。转录延伸方向从 5’ ?3’
( 4)转录终止
在 DNA分子上(基因末端)提供
转录停止信号的 DNA序列称为终止
子( terminators),它能使 RNA聚合
酶停止合成 RNA并释放出 RNA。
需要 ρ 因子( 终止因子,协助 RNA聚
合酶识别终止信号)帮助,ρ 因子
能与 RNA聚合酶结合但不是酶的组分,
它的作用是阻止 RNA聚合酶向前移动,
于是转录终止,并释放出已转录完成
的 RNA链。
不依赖于 ρ 因子。强终止子序列有
两个明显的特征:( 1 )在终止点
之前具有一段富含 G-C的回文区域。
( 2)富含 G-C的区域之后是一连串
的 dA碱基序列,它们转录的 RNA链的
末端为一连串 U(连续 6个)。
弱终止子:
缺少回文结构
强终止
子:
有回文
结构
有些终止子的作用可被特异的因子所阻止,
使酶得以越过终止子继续转录,称为通读
( readthrough)
? 能够引起抗终止作用的蛋白质称为抗终
止因子( antitermination factors)
转录泡
恢复螺旋
解螺旋
编码链
模板链
4,RNA的转录后加工
在细胞内,由 RNA聚合酶合成的原初转录
物( primary transcript)往往需要一系列
的变化,包括链的裂解,5?和 3?末端的切除
和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接
和编辑等过程,才转变为成熟的 RNA分子。
此过程总称为 RNA的成熟 或称为 RNA的转录后
加工。
大多真核生物基因是断裂基因,即含有内
含子。断裂基因的转录产物必需通过拼接,
去除插入部分(内含子,intron),使编码区
(外显子,exon)成为连续序列。这是基因表
达的重要环节。内含子的结构多种多样,拼
接机制也是多种多样的。
因发现断裂基因而获 1993年诺
贝尔生理学奖的 Richard J
Robert and Phllip A Sharp
a,mRNA前体的加工
原核生物 的 mRNA转录后 一般 不需要加工,转录
的同时即进行翻译(半寿期短)。亦有少数多
顺反子的 mRNA需要核酸酶切成小单位,然后再
翻译。
真核生物 mRNA(半寿期较长)原初转录物很大,
在加工过程中形成许多分子大小不等的中间物,
它们被称为 核内不均一 RNA( heterogeneous
nuclear RNA,hnRNA),需要进一步进行加工修
饰转化为 mRNA。
加工包括:
( 1) hnRNA被剪接,把内含子( DNA上非编
码序列)转录序列剪掉,把 外显子 ( DNA上
的编码序列)转录序列 拼接 上 (真核生物一
般为不连续基因 )。
( 2) 3’ 端添加 polyA, 尾巴”;
( 3) 5’ 端连接“帽子”结构
( m7G5?ppp5?NmpNp-);
( 4)分子内部的核苷酸甲基化修饰。
b,tRNA前体的加工:
原核与真核生物的 tRNA转录后都需要加工。包括:
( 1)由核酸内切酶切除前体上 3?和 5?端上多余的
核苷酸;
( 2)由核酸外切酶逐个在 3?切去附加序列,进行
修剪。
( 3) 3’ 端添加 CCAOH序列,由核苷酰转移酶催化。
(接受活化 AA)
( 4)核苷的一些特定的碱基和戊糖进行修饰。
原核与真核生物的 rRNA转录后也都需要进行
加工。
原核:刚转录的 rRNA为 30S,先在特定的
碱基上进行甲基化(核糖 2?-羟基)修饰,
后逐步裂解(核酸酶的切割)。
c,rRNA前体的加工
核酶的发现:
1981年 Cech T在研究四膜虫
(Tetrahymena thermophila) rRNA前体拼接
过程中发现,此类的拼接无需蛋白质的酶参
与作用,它可自我催化完成。 Cech称具有催
化功能的 RNA为核酶( ribozyme)。 1989年
cech T和 Altman S共同获诺贝尔化学奖,
Altman S的贡献是发现 Rnase P中的 M1RNA单
独也具有催化功能 。
The M1 RNA
in ribonuclease
P is catalytic
The intron in
the pre-rRNA of
Tetrahemena
is self-spliced
因发现核酶而获诺
贝尔奖的两位科学
家:
真核,45S(哺乳动物),38S(果蝇),37S
(酵母)
P16
P23
P5
16S
23S
5S(一般不含甲基化)
28S
18S
5.8S
45S
或 38S 37S
26S
17S
5.8S
rRNA原初
转录物
两个阶段
( 1)其单链 RNA可充当 mRNA,利用寄主中的核
糖体合成 外壳蛋白 和复制酶的 β 亚基。
( 2)复制酶的 β 亚基可与来自寄主细胞的亚基
α ?δ 自动装配成 RNA复制酶,可进行 RNA的复
制,以分子中单链 RNA为模板(正链),复
制出一条新的 RNA链(负链),再复制出 正
链,与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。
5,RNA的复制(噬菌体 Qβ 和灰质炎病毒)
某些 RNA病毒可以以自身 RNA为模板进行复制。
5 ? RNA-
5 ?
3 ?
3 ?
RNA+
释放 释放
3? 5 ? 3 ?
3 ?
5 ?
5 ?
RNA+ RNA+
RNA-
?RNA-及 RNA+的合成方向均为 5‘ 3’
六, 基因工程简介
DNA重组技术指将不同的 DNA片段按人们的设计
方案定向连接,并在特定受体细胞中与载体一
起得到复制与表达 ( 70年代,基于 DNA限制性
内切酶,DNA连接酶的发现)。
基因工程主要包括两个步骤:
? 获得目的基因,取得基因的载体,使二者进
行体外重组。
? 将重组的 DNA转化到受体的活细胞中去,改变
受体细胞的遗传特性。
1.目的基因的制备
2.基因载体
? 载体必须具备的条件(易于引入受体细胞、
在受体 细胞中可以复制、易于鉴定和筛
选、)
? 目前常用的载体:质粒、噬菌体( ?噬菌体、
噬菌体 M13)
3.DNA的重组
? 重组体 DNA的连接
? 将重组 DNA引入受体细胞(转化)
? 重组体的筛选