1
?1575年，西班牙医生 N.Monardes发现。
?1852年,Sir George Stokes对荧光产生的机
理作了解释，并提出了“荧光”。
?1867年，首次用于分析测定。
?1928年,Jette和 West提出第一台光电荧光计。
?1952年，商品荧光分光光度计出现。
8.7 分子荧光与分子磷光 分析法
2
8.7.1 发光机理 (Jablonski Diagram)
荧光寿命,
10－ 9～ 10－ 7 s
磷光寿命,
10－ 4～ 10 s
分子吸光与发光示意图
3
吸收光谱
发射光谱
蒽的 激发光谱（吸收光谱） 和 发射光谱（荧光光谱）
激发光谱,Excitation Spectrum,激发波长,?ex
发射光谱 Emission Spectrum,发射波长,?em
5
荧光光谱的特点
?Stokes位移：分子荧光的发射峰相对于吸收
峰位移到较长的波长,
?荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关,
?镜像规则：荧光发射光谱和它的吸收光谱呈
镜像对称关系,
6
8.7.2 定量分析的基础
—荧光强度 (F )与物质浓度 (c)的关系
在 稀溶液 中：
F＝ 2.3Kφεb cI0＝ 2.3KφAI0
φ — 荧光物质的荧光效率 (量子产率 )：
ε— 荧光物质的吸光系数
b— 液层厚度
I0— 入射光强度
K— 检测效率（由仪器决定）
? ? 发射荧光的量子数吸收激发光的量子数
当 b,I0一定时,F＝ Kc
7
F
c
一般当 εb c ? 0.05 时,F 与 c呈线性关系
高浓度 时，荧光物质发生 自熄灭 和
自吸收 现象,使 F与 c不呈线性关系
F
c
8
8.7.3 荧光与分子结构的关系
1.共轭效应 ? → ?* 跃迁
芳香族化合物、五元杂环上取代苯基,
共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大,
─(CH=CH)3─ φ=0.68
─(CH=CH)2─ φ=0.28
9
2,刚性结构和共平面效应
酚酞 (无荧光 )
8－羟基喹啉 (弱荧光 ) 红色荧光
C
O-O O
COO-
C
O
COO-
-O
N
O- N
O
Mg
N
O
荧光黄
10
联二苯 φ=0.2
芴 φ= 1.0
3,4-苯并芘
( 强荧光物质 )
CH
2
11
3,取代基的作用
给电子基增强荧光,
－ OH,－ OR,－ NH2,－ NHR,－ NR2,－ C≡N
吸电子基减弱荧光：
－ COOH,－ C=O,－ NO2,－ N＝ N,－ Cl,－ Br,－ I
与 ?体系作用小的取代基影响不明显,
－ SO3R,－ NH3＋,－ SH,－ F,－ R。
COOH NO2 I 无荧光
NH2 OH
比 荧光强 50倍
12
取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚
性会加强荧光,
碱性
有荧光
COOH
OH
无荧光
OH
COOH 水杨酸
中性、碱性
均有荧光
OH
OH
C
O
13
8.7.4 影响荧光强度的主要因素
1,浓度,稀溶液,F∝ c (?bc≤0.05)
2,光源, F∝ I0, 应强度大，稳定。
3,温度, T 低,φ增加。
荧光素钠的乙醇溶液,T<0℃ 时,每降低
10℃,φ增加 3%,-80 ℃ 时 φ=100%,
4,酸度,
有荧光无荧光
OH O—
14
8.7.5 荧光光度计及荧光测定方法
I0 It
F
氙灯 (或高压汞灯）
（ 200-800 nm)
光电倍增管
荧光光度计示意图
15
荧光仪部件
激发光源,能够在紫外 -可见光区连续发光,
常用 氙灯, 高压汞灯 或 激光光源,
样品池, 石英池,四壁透明,
单色器, 两个 光栅单色器,分置于样品池前后,
检测器,光电池或 光电倍增管,与激发光 成直角的
方向 检测荧光,
16
荧光光度计光路图
电源 光度计 记录仪
光电倍增管
试样液池
光源
17
测定方法 — 标准曲线法
1,确定 ?ex和 ?em (激发光谱和发射光谱 )；
2,确定适宜的 条件, 试剂浓度,pH,T,t
等；
3,以标准溶液做 工作曲线 ；
4,测未知样 的荧光强度 (F),根据工作曲线
计算荧光物质的浓度,
18
8.7.6 荧光分析法的特点和应用
? 灵敏度高,测定下限 0.1～ 0.001 μg/mL,
比分光光度法高 2～ 4个数量级。
（在黑背景下检测；光源的强度大）
? 选择性高：
适当选择激发光的波长和荧光测定的波 长；
应用荧光寿命的差别 –时间分辨技术。
19
荧光测定的选择性
蒽的激发和发射光谱
菲 和 蒽 的荧光光谱
（激发波长 265 nm)
蒽 菲
? 菲在 360 nm以上无吸收，用
365 nm激发光时，菲无荧光，
可以在 400 nm测定蒽的荧光。
? 在 265 nm,蒽和菲均有吸收，
以此波长的光激发，在 350 nm
只有菲有荧光，故可测定菲。
20
MFS与 UV/Vis 法比较：
原理
UV/Vis 吸收
MFS 发射
测定方法
I0 It
F
灵敏度,选择性
10-5～ 10-6mol·L-1
10-7～ 10-9 mol·L-1
I0 F
21
荧光光度法的应用
生物化学分析，生理医学研究，临床检测,
? 直接测定能产生荧光的物质,
带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸,
? 测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质,
荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构；
致癌物同核酸结合常引起显著的荧光；
无机离子（ Mg2+,Al3+,Zn2+,Be+等）可同试剂形成荧
光络合物。
? 荧光熄灭法测定猝灭剂
Ni2+对 Al-PAN络合物有荧光猝灭作用，可测 Ni2+（ 6× 10-
5 ～ 6× 10-3 ?g·mL-1）
22
N
OH
HO
OH
N=N
HO
SO3Na8－羟基喹啉 (Al,Be等 ) 茜素紫酱 R(Al,F-等 )
用于测定无机离子的有机试剂
C C
O OH
H
安息香 (B,Zn,Ge,Si等 )黄酮醇 (Zr,Sn等 )
O
OH
O
23
举例 — 痕量 3,4-苯并芘的测定,
苯并芘
萃取（环己酮或石油醚） → 浓缩 → 层析
→ 以 H2SO4 溶解苯并芘 → 荧光分析
荧光测定：
?ex = 520 nm
?em= 545 nm
24
8.7.7 磷光分析法
? 获得较强磷光应采取的措施,
1,低温,
禁阻跃迁,几率小 ;
系间窜跃,寿命长,S1 T1 S0无辐射 辐射
? 磷光分析仪器
液槽,石英液槽放入盛液氮的石英杜瓦瓶,
斩波片,在激发光单色器与液槽之间以及在发射光
单色器与液槽之间各装一个斩波片,
? 应用, 主要用于有机分析,与荧光法互补,
室
温
2,固体磷光，吸附在滤纸或纤维素上,
3,加表面活性剂,形成胶束缔合物,增强刚性,
4,重原子效应 (Ag+,Pb2+,Tl+…… 盐类 ),利于系间跨越,
25
?室温磷光
--固体样品
?低温磷光
--液体样品
样品管
镀银
未镀银Io
液氮
低温磷光的样品装置
26
转筒式磷光镜（ a）和转盘式磷光镜（ b）
27
第 4章
1,平衡常数,各级形成常数 Ki,不稳定常数 K不, 酸
的质子化常数 K H,累积形成常数 ?i ；分布系数 。
络合反应的副反应系数 （ ?Y, ?M, ?MY） 与条
件常数 （ K?） 的计算 。
2,络合滴定基本原理：金属指示剂的作用原理 ; 滴
定曲线, 终点误差, 误差公式, 可以准确滴定的
条件 （ lgcK ?≥6） ；单一离子滴定时最高酸度与
最低酸度的限制及酸度控制 。
28
3,混合离子的选择性滴定, 可控制酸度分步滴定
的条件 (?lgcK≥6),适宜酸度 ; 络合掩蔽 及解蔽的
应用 ; 氧化还原掩蔽法及沉淀掩蔽法的应用示例 。
会设计分析方案 。
4,络合滴定的方式和应用,
直接滴定, 返滴定, 析出法, 置换滴定, 间接滴
定法 应用示例 ；
EDTA标准溶液的配制和标定, 水质对测定结果
的影响 。
29
第 5章
反应完全程度, 不同类型的反应对 要求不同
2,影响反应速度的因素, 浓度、温度、催化剂、诱导
反应
3,滴定曲线, 与 有关,与浓度无关
4,指示剂, 氧还、自身、专用
5,各种方法的特点、应用条件、测定事例
6,计算, 等物质的量规则 (基本单元 ),换算因数法
? ?12''
lg
0, 0 5 9
p
K
?????
? ?
? ???
? ???
1,条件电位, 离子强度、沉淀、络合、酸度的影响
反应平衡常数,
30
第 6,7章
1,掌握莫尔法, 佛尔哈德法, 法扬司法中所用的
指示剂, 方法特点, 应用条件 。
2,掌握溶解度与溶度积, 条件溶度积 的换算关系 ;
4,了解重量法的特点,沉淀重量法的分析过程及
对沉淀形, 称量形的要求；
5,一般了解沉淀的形成过程和影响沉淀纯度的因
素；
6,掌握晶形沉淀的条件和称量形的获得。
31
1,分子对光的吸收 — 吸收曲线 。
2,掌握光吸收基本定律 — 朗伯 -比尔定律：
A=lgI0/I = － lgT=Kbc,摩尔吸光系数 ?,比吸光系数 。 式
中各参数的物理意义, 定量计算 。
3,方法和仪器：基本部件, 分光光度计的类型, 测量误差
(准确度 ),灵敏度 (?,S,） 。
4,显色反应及条件的确定, 显色剂用量, 酸度, 时间, 温度,
干扰及消除 。
5,应用, 单一组分测定示例, 多组分测定, 光度滴定, 络合
物组成的测定, 酸碱离解常数的测定 。
6,紫外 -可见光度法在定性分析中的应用, 了解能级跃迁的基
本类型,共轭烯烃键数与能量的关系,溶剂极性对吸收光
谱的影响,
7,分子荧光与分子磷光的产生及特点,仪器比较,
第 8章
32
1,沉淀分离类型,提高选择性的方法
2,溶剂萃取分离, KD,D,E 的定义与计算
3,离子交换分离,树脂的种类和性质、应
用。
4,色谱法：柱、纸、薄层色谱的定性定量
应用,比移值 。
第 9章
33
中文系程玉缀教授于 96年 1月所作, 考
场歌,
燕园学子, 人中龙凤；身经百战, 从从容容 。
笔走龙蛇, 文思泉涌；寥寥数题, 笑谈之中 。
遵守考纪, 严肃校风；因小失大, 徒然无功 。
临场赋诗, 肺腑相送：瓜田李下, 请君自重 ！
春华秋实, 来自劳动；有限人生, 无上光荣 ！
34
?1575年，西班牙医生 N.Monardes发现。
?1852年,Sir George Stokes对荧光产生的机
理作了解释，并提出了“荧光”。
?1867年，首次用于分析测定。
?1928年,Jette和 West提出第一台光电荧光计。
?1952年，商品荧光分光光度计出现。
8.7 分子荧光与分子磷光 分析法
2
8.7.1 发光机理 (Jablonski Diagram)
荧光寿命,
10－ 9～ 10－ 7 s
磷光寿命,
10－ 4～ 10 s
分子吸光与发光示意图
3
吸收光谱
发射光谱
蒽的 激发光谱（吸收光谱） 和 发射光谱（荧光光谱）
激发光谱,Excitation Spectrum,激发波长,?ex
发射光谱 Emission Spectrum,发射波长,?em
5
荧光光谱的特点
?Stokes位移：分子荧光的发射峰相对于吸收
峰位移到较长的波长,
?荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关,
?镜像规则：荧光发射光谱和它的吸收光谱呈
镜像对称关系,
6
8.7.2 定量分析的基础
—荧光强度 (F )与物质浓度 (c)的关系
在 稀溶液 中：
F＝ 2.3Kφεb cI0＝ 2.3KφAI0
φ — 荧光物质的荧光效率 (量子产率 )：
ε— 荧光物质的吸光系数
b— 液层厚度
I0— 入射光强度
K— 检测效率（由仪器决定）
? ? 发射荧光的量子数吸收激发光的量子数
当 b,I0一定时,F＝ Kc
7
F
c
一般当 εb c ? 0.05 时,F 与 c呈线性关系
高浓度 时，荧光物质发生 自熄灭 和
自吸收 现象,使 F与 c不呈线性关系
F
c
8
8.7.3 荧光与分子结构的关系
1.共轭效应 ? → ?* 跃迁
芳香族化合物、五元杂环上取代苯基,
共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大,
─(CH=CH)3─ φ=0.68
─(CH=CH)2─ φ=0.28
9
2,刚性结构和共平面效应
酚酞 (无荧光 )
8－羟基喹啉 (弱荧光 ) 红色荧光
C
O-O O
COO-
C
O
COO-
-O
N
O- N
O
Mg
N
O
荧光黄
10
联二苯 φ=0.2
芴 φ= 1.0
3,4-苯并芘
( 强荧光物质 )
CH
2
11
3,取代基的作用
给电子基增强荧光,
－ OH,－ OR,－ NH2,－ NHR,－ NR2,－ C≡N
吸电子基减弱荧光：
－ COOH,－ C=O,－ NO2,－ N＝ N,－ Cl,－ Br,－ I
与 ?体系作用小的取代基影响不明显,
－ SO3R,－ NH3＋,－ SH,－ F,－ R。
COOH NO2 I 无荧光
NH2 OH
比 荧光强 50倍
12
取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚
性会加强荧光,
碱性
有荧光
COOH
OH
无荧光
OH
COOH 水杨酸
中性、碱性
均有荧光
OH
OH
C
O
13
8.7.4 影响荧光强度的主要因素
1,浓度,稀溶液,F∝ c (?bc≤0.05)
2,光源, F∝ I0, 应强度大，稳定。
3,温度, T 低,φ增加。
荧光素钠的乙醇溶液,T<0℃ 时,每降低
10℃,φ增加 3%,-80 ℃ 时 φ=100%,
4,酸度,
有荧光无荧光
OH O—
14
8.7.5 荧光光度计及荧光测定方法
I0 It
F
氙灯 (或高压汞灯）
（ 200-800 nm)
光电倍增管
荧光光度计示意图
15
荧光仪部件
激发光源,能够在紫外 -可见光区连续发光,
常用 氙灯, 高压汞灯 或 激光光源,
样品池, 石英池,四壁透明,
单色器, 两个 光栅单色器,分置于样品池前后,
检测器,光电池或 光电倍增管,与激发光 成直角的
方向 检测荧光,
16
荧光光度计光路图
电源 光度计 记录仪
光电倍增管
试样液池
光源
17
测定方法 — 标准曲线法
1,确定 ?ex和 ?em (激发光谱和发射光谱 )；
2,确定适宜的 条件, 试剂浓度,pH,T,t
等；
3,以标准溶液做 工作曲线 ；
4,测未知样 的荧光强度 (F),根据工作曲线
计算荧光物质的浓度,
18
8.7.6 荧光分析法的特点和应用
? 灵敏度高,测定下限 0.1～ 0.001 μg/mL,
比分光光度法高 2～ 4个数量级。
（在黑背景下检测；光源的强度大）
? 选择性高：
适当选择激发光的波长和荧光测定的波 长；
应用荧光寿命的差别 –时间分辨技术。
19
荧光测定的选择性
蒽的激发和发射光谱
菲 和 蒽 的荧光光谱
（激发波长 265 nm)
蒽 菲
? 菲在 360 nm以上无吸收，用
365 nm激发光时，菲无荧光，
可以在 400 nm测定蒽的荧光。
? 在 265 nm,蒽和菲均有吸收，
以此波长的光激发，在 350 nm
只有菲有荧光，故可测定菲。
20
MFS与 UV/Vis 法比较：
原理
UV/Vis 吸收
MFS 发射
测定方法
I0 It
F
灵敏度,选择性
10-5～ 10-6mol·L-1
10-7～ 10-9 mol·L-1
I0 F
21
荧光光度法的应用
生物化学分析，生理医学研究，临床检测,
? 直接测定能产生荧光的物质,
带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸,
? 测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质,
荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构；
致癌物同核酸结合常引起显著的荧光；
无机离子（ Mg2+,Al3+,Zn2+,Be+等）可同试剂形成荧
光络合物。
? 荧光熄灭法测定猝灭剂
Ni2+对 Al-PAN络合物有荧光猝灭作用，可测 Ni2+（ 6× 10-
5 ～ 6× 10-3 ?g·mL-1）
22
N
OH
HO
OH
N=N
HO
SO3Na8－羟基喹啉 (Al,Be等 ) 茜素紫酱 R(Al,F-等 )
用于测定无机离子的有机试剂
C C
O OH
H
安息香 (B,Zn,Ge,Si等 )黄酮醇 (Zr,Sn等 )
O
OH
O
23
举例 — 痕量 3,4-苯并芘的测定,
苯并芘
萃取（环己酮或石油醚） → 浓缩 → 层析
→ 以 H2SO4 溶解苯并芘 → 荧光分析
荧光测定：
?ex = 520 nm
?em= 545 nm
24
8.7.7 磷光分析法
? 获得较强磷光应采取的措施,
1,低温,
禁阻跃迁,几率小 ;
系间窜跃,寿命长,S1 T1 S0无辐射 辐射
? 磷光分析仪器
液槽,石英液槽放入盛液氮的石英杜瓦瓶,
斩波片,在激发光单色器与液槽之间以及在发射光
单色器与液槽之间各装一个斩波片,
? 应用, 主要用于有机分析,与荧光法互补,
室
温
2,固体磷光，吸附在滤纸或纤维素上,
3,加表面活性剂,形成胶束缔合物,增强刚性,
4,重原子效应 (Ag+,Pb2+,Tl+…… 盐类 ),利于系间跨越,
25
?室温磷光
--固体样品
?低温磷光
--液体样品
样品管
镀银
未镀银Io
液氮
低温磷光的样品装置
26
转筒式磷光镜（ a）和转盘式磷光镜（ b）
27
第 4章
1,平衡常数,各级形成常数 Ki,不稳定常数 K不, 酸
的质子化常数 K H,累积形成常数 ?i ；分布系数 。
络合反应的副反应系数 （ ?Y, ?M, ?MY） 与条
件常数 （ K?） 的计算 。
2,络合滴定基本原理：金属指示剂的作用原理 ; 滴
定曲线, 终点误差, 误差公式, 可以准确滴定的
条件 （ lgcK ?≥6） ；单一离子滴定时最高酸度与
最低酸度的限制及酸度控制 。
28
3,混合离子的选择性滴定, 可控制酸度分步滴定
的条件 (?lgcK≥6),适宜酸度 ; 络合掩蔽 及解蔽的
应用 ; 氧化还原掩蔽法及沉淀掩蔽法的应用示例 。
会设计分析方案 。
4,络合滴定的方式和应用,
直接滴定, 返滴定, 析出法, 置换滴定, 间接滴
定法 应用示例 ；
EDTA标准溶液的配制和标定, 水质对测定结果
的影响 。
29
第 5章
反应完全程度, 不同类型的反应对 要求不同
2,影响反应速度的因素, 浓度、温度、催化剂、诱导
反应
3,滴定曲线, 与 有关,与浓度无关
4,指示剂, 氧还、自身、专用
5,各种方法的特点、应用条件、测定事例
6,计算, 等物质的量规则 (基本单元 ),换算因数法
? ?12''
lg
0, 0 5 9
p
K
?????
? ?
? ???
? ???
1,条件电位, 离子强度、沉淀、络合、酸度的影响
反应平衡常数,
30
第 6,7章
1,掌握莫尔法, 佛尔哈德法, 法扬司法中所用的
指示剂, 方法特点, 应用条件 。
2,掌握溶解度与溶度积, 条件溶度积 的换算关系 ;
4,了解重量法的特点,沉淀重量法的分析过程及
对沉淀形, 称量形的要求；
5,一般了解沉淀的形成过程和影响沉淀纯度的因
素；
6,掌握晶形沉淀的条件和称量形的获得。
31
1,分子对光的吸收 — 吸收曲线 。
2,掌握光吸收基本定律 — 朗伯 -比尔定律：
A=lgI0/I = － lgT=Kbc,摩尔吸光系数 ?,比吸光系数 。 式
中各参数的物理意义, 定量计算 。
3,方法和仪器：基本部件, 分光光度计的类型, 测量误差
(准确度 ),灵敏度 (?,S,） 。
4,显色反应及条件的确定, 显色剂用量, 酸度, 时间, 温度,
干扰及消除 。
5,应用, 单一组分测定示例, 多组分测定, 光度滴定, 络合
物组成的测定, 酸碱离解常数的测定 。
6,紫外 -可见光度法在定性分析中的应用, 了解能级跃迁的基
本类型,共轭烯烃键数与能量的关系,溶剂极性对吸收光
谱的影响,
7,分子荧光与分子磷光的产生及特点,仪器比较,
第 8章
32
1,沉淀分离类型,提高选择性的方法
2,溶剂萃取分离, KD,D,E 的定义与计算
3,离子交换分离,树脂的种类和性质、应
用。
4,色谱法：柱、纸、薄层色谱的定性定量
应用,比移值 。
第 9章
33
中文系程玉缀教授于 96年 1月所作, 考
场歌,
燕园学子, 人中龙凤；身经百战, 从从容容 。
笔走龙蛇, 文思泉涌；寥寥数题, 笑谈之中 。
遵守考纪, 严肃校风；因小失大, 徒然无功 。
临场赋诗, 肺腑相送：瓜田李下, 请君自重 ！
春华秋实, 来自劳动；有限人生, 无上光荣 ！
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