1
第 8章 紫外可见吸光光度法
及分子荧光分析法
8.1 吸光光度法的基本原理
8.2 光度分析的方法和仪器
8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度
8.4 显色反应与分析条件的选择
8.5 吸光光度法的应用
8.6 紫外可见分光光度法在有机
定性分析中的应用
8.7 分子荧光与分子磷光 分析法
2
化学分析,常量组分 (>1%),Er, 0.1%～ 0.2%
依据化学反应,使用玻璃仪器
化学分析与仪器分析方法比较
仪器分析,微量组分 (<1%),Er, 1%～ 5%
依据物理或物理化学性质,需要特殊的仪器
例, 含 Fe约 0.05%的样品,称 0.2 g,则 m(Fe)≈0.1 mg
重量法 m(Fe2O3)≈0.14 mg,称不准
容量法 V(K2Cr2O7)≈0.02 mL,测不准
光度法 结果 0.048%～ 0.052%,满足要求
准确度高
灵敏度高
3
仪器分析方法分类
2.电化学分析法, 依据物质的电化学性质及其变化
3.色谱法, 气相色谱,液相色谱
4.质谱法、热分析法、放射化学法等
非光谱法 （折射法，浊度法，旋光法）
（不以光的波长为特征讯号）
光谱法
分子光谱法 UV/Vis,IR,MFS,MPS
原子光谱法 AAS,AES,AFS
（以光的吸收、发射等作用而建立的分析方法，通过
检测光谱的波长和强度来进行定性和定量的方法）
光
学
分
析
法
1,光学分析法, 基于电磁辐射与物质的相互作用,
6
8.1 吸光光度法的基本原理
特点
– 灵敏度高,测定下限可达 10-5～ 10 -6mol·L-1,
10-4%～ 10-5%
– 准确度 能够满足微量组分的测定要求：
相对误差 2～ 5％ （ 1～ 2％）
– 操作 简便快速
– 应用广泛
吸光光度法是基于被测物质的分子对光具
有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。
8
8.1.1 光的基本性质 (电磁波的波粒二象性 )
c －真空中光速 2.99792458× 108m/s
~3.0 × 108m/s
?－波长，单位,m,cm,mm,?m,nm,?
1?m=10-6m,1nm=10-9m,1?=10-10m
?－频率，单位：赫芝 (周 )Hz 次 /秒
n －折射率，真空中为 1
???==
c
V
n
光的传播速度,
波动性
9
X
Y
Z
x
电场向量
10
h－普朗克 (Planck)常数 6.626× 10-34J·s
?－ 频率
E－光量子具有的能量
单位,J(焦耳 ),eV(电子伏特 )
1eV=1.602× 10－ 19 J
微粒性
光量子，具有能量 。
Eh ???
11
结论,一定波长的光具有一定的能量，波长越
长 (频率越低 )，光量子的能量越低,
单色光,具有相同能量 (相同波长 )的光,
混合光,具有不同能量 (不同波长 )的光复合在
一起, 例如白光,
= = =cVE h h h
n
?
??
波粒二象性
真空中,
c
Eh
?
?
13
光学光谱区
远紫外 近紫外 可见 近红外 中红外 远红外
（真空紫外）
10nm~200nm 200nm
~380nm
380nm
~ 780nm
780 nm
~ 2.5 ?m
2.5 ?m
~ 50 ?m
50 ?m
~300 ?m
14
8.1.2 物质对光的吸收与发射
1,电子相对于原子核的运动 --电子能级 ;
单重态：激发态与基态中的电子自旋方向相反,
三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同,
2,原子核在其平衡位置附近的相对振动
--振动能级 ;
3,分子本身绕其重心的转动 --转动能级,
物质分子内部 3 种运动形式及其对应能级：
15
S2
分子吸光与发光示意图
?Ee
振
动
能
级
v3
v2
v1
转动 r3r2r
1
S1
S0
紫外
荧光 磷光
T2
T1可见
?Ev
?Er红外
单重态 三重态
16
光谱种类
原子光谱：吸收、发射、荧光
线状光谱
?
黑体辐射：白炽灯、液、固灼热发光
连续光谱
?
分子光谱：紫外、可见、红外等吸收光谱
带状光谱
?
I
17
?/nm 颜色 互补光
400 ～ 450 紫 黄绿
450 ～ 480 蓝 黄
480 ～ 490 绿蓝 橙
490 ～ 500 蓝绿 红
500 ～ 560 绿 红紫
560 ～ 580 黄绿 紫
580 ～ 610 黄 蓝
610 ～ 650 橙 绿蓝
650 ～ 760 红
分子对光的吸收与吸收光谱
不同颜色的可见光波长及其互补光
蓝绿
19
Cr2O72-,MnO4-的 吸收光谱
300 400 500 600 700 ?/nm350
525 545
Cr2O72- MnO4
-
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
Ab
so
rb
an
ce
350
20
苯 和 甲苯 在环己烷中的吸收光谱
苯
(254nm)
甲苯
(262nm)
A
?230 250 270
21
?不同物质吸收光谱的形状以及 ?max 不同
—— 定性分析的基础
?同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形
状相同, Amax 不同
—— 定量分析的基础
22
8.1.3 光吸收基本定律,朗伯 -比尔定律
朗伯定律,(1760) A=lg(I0/It)=k1b
当入射光的 ?,吸光物质的 c 一定时,溶
液的吸光度 A与液层厚度 b成正比,
比尔定律 (1852) A=lg(I0/It)=k2c
当入射光的 ?,液层厚度 b 一定时,溶液
的吸光度 A与吸光物质的 c成正比,
23
朗伯 -比尔定律
意义,
当一束平行单色光通过均匀、透明
的吸光介质时，其吸光度与吸光质点
的浓度和吸收层厚度的乘积成正比,
A=lg(I0/It)=kbc
24
透光率 (透射比） T（ Transmittance）
t
0
=
I
T
I
A = lg(I0/It) = lg(1/T) = — lgT = Kbc
吸光度 A (Absorbance）
--= 1 0 = 1 0K b c AT
I0 It
入射光 透过光
25
吸光度 A、透射比 T与浓度 c的关系
A T (%)
c
A=kbc
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
- k b cT = 1 0
100
80
60
40
20
26
K 吸光系数 Absorptivity
a 的单位, L·g-1·cm-1
当 c的单位用 g·L-1表示时，用 a 表示，
A＝ a b c
? 的单位, L·mol-1·cm-1
当 c的单位用 mol·L-1表示时，用 ?表示,
? －摩尔吸光系数 Molar Absorptivity
A＝ ? b c
1%
1cmE
当 c的单位用 g·100mL-1表示时，用 表示,
A＝ bc,叫做比吸光系数,1%
1cmE
1%
1cmE
27
吸光度与光程的关系 A = abc
0.10
b
0.20
2b
0.00 光源检测器
显示器
参
比
28
吸光度与浓度的关系 A = abc
0.10
c
0.20
2c
0.00 光源检测器
显示器
参
比
29
吸光度与波长的关系 A = abc
0.00
红
0.10
红
0.00 光源检测器
显示器
参
比
蓝绿光
红光
30
朗伯 -比尔定律的适用条件
1,单色光
应选用 ?max处或肩峰处测定,
3,稀溶液
浓度增大，分子之间作用增强,
2,吸光质点形式不变
离解、络合、缔合会破坏线性关系,
应控制条件 (酸度、浓度、介质等 ).
31
溶液浓度的测定
A＝ ? b c
工作曲线法
(校准曲线 )
朗伯 -比尔定律的分析应用
0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)
A
*
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
Ax
cx
32
8.1.4 吸光度的加和性与吸光度的测量
A = A1 + A2 + … +An
用参比溶液调 T=100%（ A=0），再测样品溶
液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，
溶剂、试剂对光的吸收等 。
00
1 2 2 1= l g = l g = - = l g
II I
A A A A A
I I I
参
参比 液
比
试 试液
33
8.2 光度分析的方法和仪器
方便、灵敏，准确度差, 常用于限界分析,
8.2.1 光度分析的几种方法
1.目视比色法 观察方向
空白 c1 c2 c3 c4
34
2,光电比色法
光电比色计结构示意图
通过滤光片得一窄范围的光 (几十 nm)
36
3,吸光光度法和分光光度计
光源 单色器 吸收池 检测系统
分光光度计的基本组成
通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光,
波长可调,故选择性好,准确度高,
37
分光光度计的主要部件
光源,发出所需波长范围内的连续光谱，有足够
的光强度,稳定。
可见光区,钨灯，碘钨灯 (320～ 2500nm)
紫外区,氢灯，氘灯 (180～ 375nm)
氙灯, 紫外、可见光区 均可用作光源
?/nm
钨灯（ 热辐射光源 ）
400 600 800 1000
氙灯 （ 气体放电光源 ）
氢灯
强
度
38
氙灯 氢灯
钨灯
39
单色器,将光源发出的连续光谱分解为单色光的
装置。
棱镜,依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,
玻璃 350～ 3200nm,石英 185～ 4000 nm
入射狭缝 准直透镜 棱镜 聚焦透镜 出射狭缝
白光
λ 1
λ 2
800
600
500
400
40
光栅,在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的 等宽度等
间距 条 痕 (600,1200,2400条 /mm )。
利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。
波长范围宽,色散均匀,
分辨性能好,使用方便,
－平面透射光栅
－反射光栅（广泛使用）
光栅衍射示意图
M1
M2
出
射
狭
缝
光屏
透
镜
平面透
射光栅
41
吸收池 (比色皿 )：用于盛待测及参比溶液。
可见光区：光学玻璃池
紫外区：石英池
检流计 （指示器）：
低档仪器：刻度显示
中高档仪器：数字显示，自动扫描记录
检测器,利用光电效应，将光能转换成
电流讯号。
光电池，光电管，光电倍增管
42
硒光电池（ Barrier-layer photocell）
适用于 300-800 nm,在 500-600 nm范围最灵敏。
Se
阴极 Au,Ag
半导体
h?
阳极
43
光电管 (Phototube)
h?
（片）
红敏管 625-1000 nm
蓝敏管 200-625 nm
44
光电倍增管 (Photomultiplier Tube,PMT)
1个光子可产生 106～ 107个电子160-700 nm
46
吸光光度法仪器主要差异比较
可见光
（ 380～
780nm）
紫外光
（ 200～
380nm)
中红外
（ 2.5～
50 ?m )
光源 钨灯碘钨灯
320～ 2500
氢灯
氘灯
180～ 375
硅碳棒
（红外线）
吸收池
材料
玻璃
（ 350～ 3200）
石英
（ 185～ 4000） NaCl晶体
47
1,单光束分光光度计
可变波长单光束紫外 -可见分光光度计示意图
8.2.2 分光光度计的基本类型
48
2,双光束分光光度计
参比池 检测器
滤光片或
单色器
放大器
样品池
光源 hv 光子检测器
反光镜
反光镜
透明部分扇形镜
正面图
扇形镜
反光镜
栅镜
双光束型可以消除光源强度变化的影响,
49
多通道仪器 （ Multichannel Instruments）
光电二极管阵列 (通常具有 316个硅二极管 )
photodiode arrays (PDAs)
同时测量 200～ 820nm范围内的整个光谱,比单个
检测器快 316倍,信噪比增加 3161/2 倍,
3,其他类型分光光度计
纤维光度计
将光度计放入样品中,原位测量, 对环境和过
程监测非常重要,
50
HP 8452A多通道二极管阵列分光光度计
51
镀铝反射镜
纤维光度计示意图
52
纤维光度计
53
习 题
8.1 ～ 8.4
第 8章 紫外可见吸光光度法
及分子荧光分析法
8.1 吸光光度法的基本原理
8.2 光度分析的方法和仪器
8.3 吸光光度法的灵敏度与准确度
8.4 显色反应与分析条件的选择
8.5 吸光光度法的应用
8.6 紫外可见分光光度法在有机
定性分析中的应用
8.7 分子荧光与分子磷光 分析法
2
化学分析,常量组分 (>1%),Er, 0.1%～ 0.2%
依据化学反应,使用玻璃仪器
化学分析与仪器分析方法比较
仪器分析,微量组分 (<1%),Er, 1%～ 5%
依据物理或物理化学性质,需要特殊的仪器
例, 含 Fe约 0.05%的样品,称 0.2 g,则 m(Fe)≈0.1 mg
重量法 m(Fe2O3)≈0.14 mg,称不准
容量法 V(K2Cr2O7)≈0.02 mL,测不准
光度法 结果 0.048%～ 0.052%,满足要求
准确度高
灵敏度高
3
仪器分析方法分类
2.电化学分析法, 依据物质的电化学性质及其变化
3.色谱法, 气相色谱,液相色谱
4.质谱法、热分析法、放射化学法等
非光谱法 （折射法，浊度法，旋光法）
（不以光的波长为特征讯号）
光谱法
分子光谱法 UV/Vis,IR,MFS,MPS
原子光谱法 AAS,AES,AFS
（以光的吸收、发射等作用而建立的分析方法，通过
检测光谱的波长和强度来进行定性和定量的方法）
光
学
分
析
法
1,光学分析法, 基于电磁辐射与物质的相互作用,
6
8.1 吸光光度法的基本原理
特点
– 灵敏度高,测定下限可达 10-5～ 10 -6mol·L-1,
10-4%～ 10-5%
– 准确度 能够满足微量组分的测定要求：
相对误差 2～ 5％ （ 1～ 2％）
– 操作 简便快速
– 应用广泛
吸光光度法是基于被测物质的分子对光具
有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。
8
8.1.1 光的基本性质 (电磁波的波粒二象性 )
c －真空中光速 2.99792458× 108m/s
~3.0 × 108m/s
?－波长，单位,m,cm,mm,?m,nm,?
1?m=10-6m,1nm=10-9m,1?=10-10m
?－频率，单位：赫芝 (周 )Hz 次 /秒
n －折射率，真空中为 1
???==
c
V
n
光的传播速度,
波动性
9
X
Y
Z
x
电场向量
10
h－普朗克 (Planck)常数 6.626× 10-34J·s
?－ 频率
E－光量子具有的能量
单位,J(焦耳 ),eV(电子伏特 )
1eV=1.602× 10－ 19 J
微粒性
光量子，具有能量 。
Eh ???
11
结论,一定波长的光具有一定的能量，波长越
长 (频率越低 )，光量子的能量越低,
单色光,具有相同能量 (相同波长 )的光,
混合光,具有不同能量 (不同波长 )的光复合在
一起, 例如白光,
= = =cVE h h h
n
?
??
波粒二象性
真空中,
c
Eh
?
?
13
光学光谱区
远紫外 近紫外 可见 近红外 中红外 远红外
（真空紫外）
10nm~200nm 200nm
~380nm
380nm
~ 780nm
780 nm
~ 2.5 ?m
2.5 ?m
~ 50 ?m
50 ?m
~300 ?m
14
8.1.2 物质对光的吸收与发射
1,电子相对于原子核的运动 --电子能级 ;
单重态：激发态与基态中的电子自旋方向相反,
三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同,
2,原子核在其平衡位置附近的相对振动
--振动能级 ;
3,分子本身绕其重心的转动 --转动能级,
物质分子内部 3 种运动形式及其对应能级：
15
S2
分子吸光与发光示意图
?Ee
振
动
能
级
v3
v2
v1
转动 r3r2r
1
S1
S0
紫外
荧光 磷光
T2
T1可见
?Ev
?Er红外
单重态 三重态
16
光谱种类
原子光谱：吸收、发射、荧光
线状光谱
?
黑体辐射：白炽灯、液、固灼热发光
连续光谱
?
分子光谱：紫外、可见、红外等吸收光谱
带状光谱
?
I
17
?/nm 颜色 互补光
400 ～ 450 紫 黄绿
450 ～ 480 蓝 黄
480 ～ 490 绿蓝 橙
490 ～ 500 蓝绿 红
500 ～ 560 绿 红紫
560 ～ 580 黄绿 紫
580 ～ 610 黄 蓝
610 ～ 650 橙 绿蓝
650 ～ 760 红
分子对光的吸收与吸收光谱
不同颜色的可见光波长及其互补光
蓝绿
19
Cr2O72-,MnO4-的 吸收光谱
300 400 500 600 700 ?/nm350
525 545
Cr2O72- MnO4
-
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
Ab
so
rb
an
ce
350
20
苯 和 甲苯 在环己烷中的吸收光谱
苯
(254nm)
甲苯
(262nm)
A
?230 250 270
21
?不同物质吸收光谱的形状以及 ?max 不同
—— 定性分析的基础
?同一物质，浓度不同时，吸收光谱的形
状相同, Amax 不同
—— 定量分析的基础
22
8.1.3 光吸收基本定律,朗伯 -比尔定律
朗伯定律,(1760) A=lg(I0/It)=k1b
当入射光的 ?,吸光物质的 c 一定时,溶
液的吸光度 A与液层厚度 b成正比,
比尔定律 (1852) A=lg(I0/It)=k2c
当入射光的 ?,液层厚度 b 一定时,溶液
的吸光度 A与吸光物质的 c成正比,
23
朗伯 -比尔定律
意义,
当一束平行单色光通过均匀、透明
的吸光介质时，其吸光度与吸光质点
的浓度和吸收层厚度的乘积成正比,
A=lg(I0/It)=kbc
24
透光率 (透射比） T（ Transmittance）
t
0
=
I
T
I
A = lg(I0/It) = lg(1/T) = — lgT = Kbc
吸光度 A (Absorbance）
--= 1 0 = 1 0K b c AT
I0 It
入射光 透过光
25
吸光度 A、透射比 T与浓度 c的关系
A T (%)
c
A=kbc
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
- k b cT = 1 0
100
80
60
40
20
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K 吸光系数 Absorptivity
a 的单位, L·g-1·cm-1
当 c的单位用 g·L-1表示时，用 a 表示，
A＝ a b c
? 的单位, L·mol-1·cm-1
当 c的单位用 mol·L-1表示时，用 ?表示,
? －摩尔吸光系数 Molar Absorptivity
A＝ ? b c
1%
1cmE
当 c的单位用 g·100mL-1表示时，用 表示,
A＝ bc,叫做比吸光系数,1%
1cmE
1%
1cmE
27
吸光度与光程的关系 A = abc
0.10
b
0.20
2b
0.00 光源检测器
显示器
参
比
28
吸光度与浓度的关系 A = abc
0.10
c
0.20
2c
0.00 光源检测器
显示器
参
比
29
吸光度与波长的关系 A = abc
0.00
红
0.10
红
0.00 光源检测器
显示器
参
比
蓝绿光
红光
30
朗伯 -比尔定律的适用条件
1,单色光
应选用 ?max处或肩峰处测定,
3,稀溶液
浓度增大，分子之间作用增强,
2,吸光质点形式不变
离解、络合、缔合会破坏线性关系,
应控制条件 (酸度、浓度、介质等 ).
31
溶液浓度的测定
A＝ ? b c
工作曲线法
(校准曲线 )
朗伯 -比尔定律的分析应用
0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL)
A
*
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
Ax
cx
32
8.1.4 吸光度的加和性与吸光度的测量
A = A1 + A2 + … +An
用参比溶液调 T=100%（ A=0），再测样品溶
液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，
溶剂、试剂对光的吸收等 。
00
1 2 2 1= l g = l g = - = l g
II I
A A A A A
I I I
参
参比 液
比
试 试液
33
8.2 光度分析的方法和仪器
方便、灵敏，准确度差, 常用于限界分析,
8.2.1 光度分析的几种方法
1.目视比色法 观察方向
空白 c1 c2 c3 c4
34
2,光电比色法
光电比色计结构示意图
通过滤光片得一窄范围的光 (几十 nm)
36
3,吸光光度法和分光光度计
光源 单色器 吸收池 检测系统
分光光度计的基本组成
通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光,
波长可调,故选择性好,准确度高,
37
分光光度计的主要部件
光源,发出所需波长范围内的连续光谱，有足够
的光强度,稳定。
可见光区,钨灯，碘钨灯 (320～ 2500nm)
紫外区,氢灯，氘灯 (180～ 375nm)
氙灯, 紫外、可见光区 均可用作光源
?/nm
钨灯（ 热辐射光源 ）
400 600 800 1000
氙灯 （ 气体放电光源 ）
氢灯
强
度
38
氙灯 氢灯
钨灯
39
单色器,将光源发出的连续光谱分解为单色光的
装置。
棱镜,依据不同波长光通过棱镜时折射率不同,
玻璃 350～ 3200nm,石英 185～ 4000 nm
入射狭缝 准直透镜 棱镜 聚焦透镜 出射狭缝
白光
λ 1
λ 2
800
600
500
400
40
光栅,在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的 等宽度等
间距 条 痕 (600,1200,2400条 /mm )。
利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。
波长范围宽,色散均匀,
分辨性能好,使用方便,
－平面透射光栅
－反射光栅（广泛使用）
光栅衍射示意图
M1
M2
出
射
狭
缝
光屏
透
镜
平面透
射光栅
41
吸收池 (比色皿 )：用于盛待测及参比溶液。
可见光区：光学玻璃池
紫外区：石英池
检流计 （指示器）：
低档仪器：刻度显示
中高档仪器：数字显示，自动扫描记录
检测器,利用光电效应，将光能转换成
电流讯号。
光电池，光电管，光电倍增管
42
硒光电池（ Barrier-layer photocell）
适用于 300-800 nm,在 500-600 nm范围最灵敏。
Se
阴极 Au,Ag
半导体
h?
阳极
43
光电管 (Phototube)
h?
（片）
红敏管 625-1000 nm
蓝敏管 200-625 nm
44
光电倍增管 (Photomultiplier Tube,PMT)
1个光子可产生 106～ 107个电子160-700 nm
46
吸光光度法仪器主要差异比较
可见光
（ 380～
780nm）
紫外光
（ 200～
380nm)
中红外
（ 2.5～
50 ?m )
光源 钨灯碘钨灯
320～ 2500
氢灯
氘灯
180～ 375
硅碳棒
（红外线）
吸收池
材料
玻璃
（ 350～ 3200）
石英
（ 185～ 4000） NaCl晶体
47
1,单光束分光光度计
可变波长单光束紫外 -可见分光光度计示意图
8.2.2 分光光度计的基本类型
48
2,双光束分光光度计
参比池 检测器
滤光片或
单色器
放大器
样品池
光源 hv 光子检测器
反光镜
反光镜
透明部分扇形镜
正面图
扇形镜
反光镜
栅镜
双光束型可以消除光源强度变化的影响,
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多通道仪器 （ Multichannel Instruments）
光电二极管阵列 (通常具有 316个硅二极管 )
photodiode arrays (PDAs)
同时测量 200～ 820nm范围内的整个光谱,比单个
检测器快 316倍,信噪比增加 3161/2 倍,
3,其他类型分光光度计
纤维光度计
将光度计放入样品中,原位测量, 对环境和过
程监测非常重要,
50
HP 8452A多通道二极管阵列分光光度计
51
镀铝反射镜
纤维光度计示意图
52
纤维光度计
53
习 题
8.1 ～ 8.4
