第一章 绪论 0 第一节 发酵过程优化在生物工业中的地位及其研究内容 1 一、发酵过程优化在生物工业中的地位 1 二、发酵过程优化的研究内容 1 第二节 发酵过程优化的研究进展 3 一、发酵过程优化是生物反应工程的研究前沿之一 3 二、流加发酵 4 三、高生产率和高细胞密度发酵 8 第一章 绪论 第一节 发酵过程优化在生物工业中的地位及其研究内容 一、发酵过程优化在生物工业中的地位 20世纪70年代以重组DNA技术为标志的现代生物技术的诞生，意味着人们可以直接操纵细胞的遗传机制，使之为人类的需要服务，这就从根本上扩大了生物系统的应用范围。现代生物技术不仅能在生产新型食品、饲料添加剂、药物的过程中发挥重要的作用，还能经济、清洁地生产传统生物技术或一般化学方法很难生产的特殊化学品，在解决人类面临的人口、粮食、健康、环境等重大问题的过程中必将发挥积极的作用。 然而，生物技术要真正造福于人类，必须走产业化的道路，这意味着仅仅依靠重组DNA技术或其它改造生物系统的技术是不够的。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度(便于下游处理)、较高的底物转化率(降低原料成本)和较高的生产强度(缩短发酵周期)。现代生物技术已经把过程优化作为一项重要研究内容来对待。 发酵是生物技术产业化的基础。为了追求经济效益，发酵工厂的规模不断扩大，由于反应器结构不当或控制不合理引起的投资风险也急剧增加。要规避这种风险，就必须首先在实验室中对发酵过程优化进行研究，特别是生物反应宏观动力学和生物反应器的研究。简而言之，生物反应动力学是有关生物的、化学的与物理过程之间的相互作用，诸如生物反应器中发生的细胞生长、产物生成、传递过程等。生物反应动力学研究的目的是为描述细胞动态行为提供数学依据，以便进行数量化处理。生物反应宏观动力学是发酵过程优化的基础。生物反应器则是发酵过程的外部环境，反应器类型对发酵过程的效率及发酵过程优化的难易程度影响很大。发酵过程优化的目标就是使细胞生理调节、细胞环境、反应器特性、工艺操作条件与反应器控制之间这种复杂的相互作用尽可能地简化，并对这些条件和相互关系进行优化，使之最适于特定发酵过程的进行。 二、发酵过程优化的研究内容 发酵过程和化工过程最主要的不同之处在于发酵过程有微生物参与进行。微生物作为有生命的一种物质，其行为与化学催化剂相比更加难以控制，因而导致某些发酵过程参数难以检测，过程可控性也比化工过程有所下降。因此，如何把发酵过程模型化的概念和一些微生物生理学的基本问题结合起来已经成为生化工程学者在进行发酵过程优化研究时的主要问题之一。因为只有了解了微生物的生理生化特性，才能更好地驾驭微生物使之造福于人类。 发酵过程通常在一个特定的反应器中进行，由于微生物反应是自催化反应，故而其自身也是反应器，所有要从细胞这个微反应器中出来的物质都必须通过细胞和环境之间的边界线，使得所有在细胞体内(即生物相)所发生的反应都与环境状况(即非生物相)密切联系在一起。实际的生物反应系统是一个非常复杂的三相系统，即气相、液相和固相的混合体，且三相间的浓度梯度相差很大，达几个数量级。要对如此复杂的系统进行优化研究，必须作大量的假设使问题得以简化，因为有关生物反应的单个步骤、进/出细胞物质的传递以及反应器内的混合等问题的研究已经相当成熟，如果能通过适当的假设使复杂的反应过程简化至能够进行定量讨论的程度，一般来说就能够实现反应过程的优化。 发酵过程优化主要涉及四个方面的研究内容。 第一个方面是细胞生长过程(cell growth reaction)研究。如果不了解微生物的生理特性和胞内的生化反应，研究反应动力学是没有意义的，更谈不上发酵过程优化。因此，细胞生长反应的研究是发酵过程优化的重要基础内容。研究细胞的生长反应，不仅要清楚地了解微生物从非生物培养基中摄取营养物质的情况和营养物质通过代谢途径转化后的去向，还要确定不同环境条件下微生物的代谢产物分布。 第二个方面是微生物反应的化学计量。微生物利用底物进行生长，同时合成代谢产物，底物中的含碳物质作为能源，和氮源一起促进细胞内的合成反应。理论上，所有投入的碳和氮都可以在生物反应器的排出物——菌体细胞、剩余底物以及代谢产物中找到，因此，微生物反应的化学计量似乎是件很容易的事情，然而事实并非如此。缺少传感器，在生化系统中进行连续检测的困难，或者由于对微生物的生理特性缺乏深入的认识而导致遗漏了代谢产物，这些都会使得发酵过程的质量衡算很难进行。而对来自工业研究的动力学数据进行质量衡算则更困难。对微生物反应进行化学计量和质量衡算的优越性在于∶即使没有任何有关该微生物反应动力学的参考资料，运用基于化学计量关系的代谢通量分析方法，仍可以提出该微生物代谢途径的可能改善方向，为过程优化奠定基础。 发酵过程优化涉及的第三个方面的内容是生物反应动力学。生物反应动力学是发酵过程优化研究的核心内容，主要研究生物反应速率及其影响因素。发酵过程的生物反应动力学一般指微生物反应的本征动力学或微观动力学，即在没有反应器结构、形式及传递过程等工程因素的影响时，微生物反应固有的反应速率。除了反应本身的性质外，该反应速率只与各反应组分的浓度、温度及溶剂性质有关。在一定反应器内检测到的反应速率即总反应速率及其影响因素，属于宏观动力学研究范畴。根据宏观动力学及其对反应器空间和反应时间的积分结果，可推算达到预计反应程度(转化率或产物浓度)所需要的反应时间和反应器容积，从而进行反应器设计。建立动力学模型的目的就是为了模拟实验过程，对适用性很强的动力学模型，还可以推测待测数据，进而确定最佳生产条件。 发酵过程优化涉及非结构模型和结构模型的建立。如果把细胞视为单组分，则环境的变化对细胞组成的影响可被忽略，在此基础上建立的模型称为非结构模型。非结构模型是在实验研究的基础上，通过物料衡算建立起经验或半经验的关联模型。它是原始数据的拟合，可以体现主要底物浓度的影响，大多数稳态微生物反应都能用相当简单的非结构模型来描述，但只有当细胞内各种成分均以相同的比例增加，即所谓平衡生长状态时才能这样处理。如果由于细胞内各组分的合成速率不同而使各组分增加的比例不同，即细胞生长处于非均衡状态时，非结构模型对外推范围可能有所出入，此时就必须运用从生物反应机理出发推导得到的结构模型。在考虑细胞组成变化的基础上建立的模型，称为结构模型。在结构模型中，一般选取RNA，DNA，糖类及蛋白质的含量作为过程变量，将其表示为细胞组成的函数。但是，由于细胞反应过程及其复杂，加上检测手段的限制，以至缺乏可直接用于在线确定反应系统状态的传感器，给动力学研究带来了困难，致使结构模型的应用受到了限制。 第四个方面的内容是生物反应器工程，包括生物反应器及参数的检测与控制。生物反应器的形式、结构、操作方式、物料的流动与混合状况、传递过程特征等是影响微生物反应宏观动力学的重要因素。在工程设计中，化学计量式、微生物反应和传递现象都是需要解决的问题。参数检测与控制是发酵过程优化最基本的手段，只有及时检测各种反应组分浓度的变化，才有可能对发酵过程进行优化，使生物反应在最佳状态下进行。限于篇幅，生物反应器工程不是本书讨论的重点，感兴趣的读者可以参考德国学者卡尔(许格尔著的《生物反应工程》一书。 第二节 发酵过程优化的研究进展 一、发酵过程优化是生物反应工程的研究前沿之一 20世纪40年代初抗生素工业的兴起，标志着发酵工业进入了一个新阶段。自此，发酵工业在产品更新、新设备、新技术的应用上都达到了前所未有的水平。一门反映生物和化工相交叉的学科──生化工程也随之在40年代末诞生，并取得了飞速发展。 Hasting指出（1954年），生化工程要解决的十大问题是深层培养、通气、空气除菌、搅拌、结构材料、容器、冷却方式、设备及培养基除菌、过滤、公害。到20世纪60年代中期，生化工程的研究人员在发酵及与之相关的管路网络设计、操作中推行了无菌的概念，建立了无菌操作的一整套技术。1964年Aiba等人认为通气搅拌与放大是生化工程学科的核心，其中放大是生化工程的焦点。由于通气搅拌尤其是发酵罐的放大问题不仅仅与发酵罐的特性、液体的动态有关，而且与微生物的代谢反应紧密相连，因此，1973年Aiba等人进一步指出，在大规模研究方面，仅仅把重点放在无菌操作、通气搅拌等过程的物理现象解析和设备的开发上是不够的，应当进一步开展对微生物反应本质的研究。其后，生化工程的研究重点就逐步从对过程的物理特性研究过渡到对微生物反应进行定量研究上来。 综上所述，自20世纪50年代中后期以来，有关微生物反应动力学的研究已经逐步发展成为生化工程的一个重要分支──生物反应工程(Bioreaction Engineering)。这一名词最早于1971年被英国的阿特金森采用。1974年，他在编著的《生物反应器》一书中指出∶生物反应工程的目的是提供合适的能描述微生物体系的动力学表达式，并通过实验求出半经验常数。1979年，日本学者山根恒夫编著了《生物反应工程》一书，认为生物反应工程是一门以速度为基础，研究酶反应、微生物反应及废水处理过程的合理设计、操作和控制的工程学。1985年，德国学者卡尔(许格尔提出生物反应工程的研究应当包括两个方面的内容∶一是宏观动力学，它涉及生物、化学、物理之间的相互关系；二是生物反应器工程，它主要涉及反应器本身，特别是不同的反应器对生物化学和物理过程的影响。 目前一般认为生物反应工程是一门以生物反应动力学为基础，研究生物反应过程优化和控制以及生物反应器的设计、放大与操作的学科。生物反应工程的研究主要采用化学动力学、传递过程原理、设备工程学、过程动态学及最优化原理等化学工程学原理，也涉及到生物化学、微生物学、微生物生理学和遗传学等许多学科领域，因此是一门综合性很强的边缘学科。它的核心是生物反应过程的数量化处理和动力学模型的建立，实现发酵过程优化则是生物反应工程的研究目标。 美国MIT的Cooney指出，要实现发酵过程的优化与控制，必须解决好5个问题∶(1)生物模型；(2)传感器技术；(3)适用于生物过程的最优化技术；(4)系统动力学；(5)计算机─检测系统─发酵罐之间的接口技术。卡尔·许格尔也强调∶细胞形态、细胞环境、反应器特性及过程操作和控制之间的关系非常复杂(图1-1-1)，由于目前对这种复杂的关系了解还很不充分，因此所掌握的一些观察方法和获得的一些动力学模型还仅仅只是一个起步。  图1-1-1 生物反应器中复杂的相互关系 发酵过程优化的目的是更好的控制发酵过程，然而，由于高效、耐用生物传感器的制造比较困难，再加上对生物反应过程的机理并不是非常清楚，因此，目前真正将生物反应工程原理运用到发酵过程优化和反应器设计中的生产实例还不多见，但其重要性却越来越受到各国学者的重视。此方面的研究工作概括起来大致可分为以下三个方面∶ 针对有关发酵产品的生产过程进行微生物生长和产物形成的动力学研究，提出新的或修正的动力学模型或表达式； 结合现代生物技术产品的开发，进行基因工程菌、哺乳动物细胞或植物细胞的生长动力学和产物形成动力学的研究； 在动力学研究的基础上进行过程优化控制的研究，包括状态观察方程的建立、观察数据的噪声过滤、不可测参数及状态的识别、过程离线或在线的优化控制。其中尤以流加发酵的最优化研究报道居多。 二、流加发酵 (一)概述 所谓流加发酵，即补料分批发酵(Fed-batch fermentation)，有时又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方法。 流加发酵的应用可追溯到很早。20世纪初，人们就知道利用麦芽汁生产酵母时会使酵母生长过旺，造成缺氧的环境，导致乙醇的产生，进而引起酵母减产。于是1915年至1920年间在酵母的工业生产中采用了向初始培养基中补加营养源的方法，抑制乙醇的产生，提高酵母产量。迄今，流加发酵的应用范围已相当广泛，包括∶单细胞蛋白、氨基酸、生长激素、抗生素、维生素、酶制剂、有机酸、高聚物、核苷酸等的生产，几乎遍及整个发酵行业。 在早期的工业生产中，补料方式非常简单，最经常采用的就是在发酵进行到一定时间时，称取一定量的营养物投入到发酵液中。这是一种经验方法，操作比较简单，但对控制发酵不太有效。近年来随着理论研究和应用的不断深入，流加发酵的内容大大丰富了，尽管它属于分批发酵到连续发酵的过渡形式，但在某些情况下，几乎不再含有分批发酵的概念而更接近于连续操作，如多级重复补料分批培养。从物料流入速度和流出速度考虑，流加发酵操作可分为5类（图1-1-2），其中1，2类目前应用最广，通常所指的流加发酵一般都是针对这两类。 图1-1-2：流加发酵的分类图 F，流速；Fin，流入速度；Fex，流出速度 (二)流加发酵和连续发酵、分批发酵的比较 流加发酵介于分批发酵和连续发酵之间，兼有两者的优点，同时又克服了两者的缺点。与传统的分批发酵相比，流加发酵可以解除底物抑制、葡萄糖效应和代谢阻遏等；与连续发酵相比，流加发酵则具有染菌可能性小，菌种不易老化变异等优点。卡尔·许格尔从投资、操作、控制、环境等方面对分批、连续和流加三种操作方式进行了比较(如表1-1-1)，并指出：由于分批发酵一般生产强度较低，而连续操作过程又受到许多限制，故常常采用流加发酵。 表1-1-1 分批、连续、流加操作方式的比较 优点 缺点  分批发酵 1.一般投资较小 1.因放罐、灭菌等原因，非生产时间长   2.易转产、生产灵活 2.经常灭菌会降低仪器寿命   3.分批操作中某一阶段可获得高的转化率 3.前培养和种子的花费大   4.发酵周期短，菌种退化率小 4.需较多的操作人员或较多的自动控制系统  连续发酵 1.可实现有规律的机械、自动化 1.操作不灵活   2.操作人员少 2.因操作条件不易改变，原料质量必须稳定   3.反应器体积小、非生产时间少 3.若采用连续灭菌，加上控制系统和自动化设备，投资较大   4.产品质量稳定 4.必须不断地排除一些非溶性的固型物   5.操作人员接触毒害物质的可能性小 5.易染菌，菌种易退化   6.测量仪器使用寿命长   流加发酵 1.操作灵活 1.非生产时间长   2.染菌、退化的几率小 2.需较多的操作人员或计算机控制系统   3.可获得高的转化率 3.操作人员接触一些病原菌和有毒产品的可能性大   4.对发酵过程可实现优化控制    5.因经常灭菌会降低仪器使用寿命   (三)流加发酵的研究进展 流加发酵的理论研究在20世纪70年代以前几乎是个空白，流加过程控制仅仅以经验为主，流加方式也仅仅局限于间歇或恒速流加，直到1973年日本学者Yoshida等人首次提出了“Fed-Batch Fermention”这个术语，并从理论上建立了第一个数学模型，流加发酵的研究才开始进入理论研究阶段。其后，随着研究的不断深入，流加发酵在以下三个方面取得了重大的进展。 1．20世纪70年代中后期对流加发酵过程的动力学解析 Yoshida最早提出的数学模型相当简单，在计算过程中假定补料过程前后的体积不变。1974年Pirt考虑了体积的变化，在研究恒速流加的补料分批发酵提出了“准稳态”的概念，并认为：假如补料分批培养中所补加的限制性基质仅用于合成细胞，则符合Monod动力学，在dx/dt≈0，ds/dt≈0的情况下，(=D，这个状态称为“准稳态”。Dunn等在进一步的研究中指出，虽然流加发酵的动力学在形式上和连续培养相似，但状态是不一样的，在保持低的流加速度和低的限制性营养基质浓度时，流加过程可以达到准稳态，此时(=D，dx/dt=0，但ds/dt0，s随时间下降。故恒速流加只能出现在(和D相等并同步变化的准稳态。 Keller等人研究发现，当补料速度按指数变化时，可以得到真正的稳态。Yamane等在酵母培养过程中以指数方式进行补料，并以(作为S的函数，研究表明当f(s)’>0时，即可得到稳定的操作。Keller等对流加发酵动态过程进行了计算机模拟，在三种情况下((=0，(=(max，S=0)与恒化器进行了比较，指出流加发酵在某些情况下和连续培养是非常相似的，流加发酵的动力学模型必须考虑体积的变化。 2．结合发酵过程的可测参数对流加过程进行反馈控制 1958年Ohhashill最早将底物的流加和发酵液中的DO值联系起来，通过DO值对流加速度进行反馈控制。在建立反馈控制模型的基础上，利用计算机对流加过程实现自动控制，稳定流加发酵过程操作，避免了发酵过程中不可逆状态的出现。其后随传感器技术的进步，除DO法外陆续发展了CO2法、RQ(呼吸商)法、pH法、代谢物法、萤光法等方法对流加发酵过程进行反馈控制。CO2法指利用尾气中CO2的浓度作为反馈控制参数对底物的流加进行反馈控制的方法；RQ法是指通过测定CO2的生成速度和O2的消耗速度，计算出RQ值，再与设计值进行比较，决定如何控制底物流加速度；代谢物法一般是通过测定副产物的形成速度反馈控制流加速度，如酵母生产中根据乙醇生成最小原则来调节底物的流加速度。 3．流加发酵的最优化研究 图1-1-3为流加发酵反馈控制示意图。一般设定值由实验得出，且在发酵过程中保持不变。然而由于发酵过程中各种状态参数是不断变化的，保持某个恒定的值通常不能使发酵过程始终处于最佳的状态。因而产生了流加发酵最优化的研究，其核心问题即是找出最佳的底物流加方式，以维持发酵过程始终处于最佳状态。这是一个受控系统的最优化问题，其研究内容包括：状态方程的建立，目标泛函的确定和最优化底物流加方式的求解。 图1-1-3 流加发酵反馈抑制示意图 流加发酵的状态方程是以流加发酵动力学为基础，由物料衡算式得出。流加发酵的物料衡算式一般可以表达为：  (1-1-1)  (1-1-2)  (1-1-3)  (1-1-4) 方程组中，(、(、(分别代表菌体、产物生成比速度及基质消耗比速，在等式中是一个相对于X，P，S的函数，它可以是X、P、S中某单一因子的函数，也可以是X、P、S中两个或三个因子的函数。引入状态变量X1，X2，X3，X4分别代表XV、SV、PV、V。另外再加一状态变量X5，并令X5=1，X5(0)=t0，所以Xf=tr，实质上X5代表发酵时间，将X1，X2，X3，X4代入式(1-1-1)～(1-1-4)，并结合X5得出了流加发酵系统的状态方程:  写成向量式为：   最优化问题的求解是针对特定的目标泛函。对于流加发酵这个受控系统，发酵过程的目的不外乎时间最短、产物得率最大、发酵终点产物浓度最高等，因此目标泛函可以用发酵终点状态表示：  最优化流加方式的求解是流加发酵优化研究中的一个关键问题。各国生化工程学者由于背景和研究对象的不同，因此在求解过程中从运用最优化的数学方法到采用同一种数学方法求解不同问题上都存在着差距。从文献报道来看，被应用于流加发酵的最优化理论有：格林原理、庞特里金最小值(最大值)原理等。格林原理最早应用于赖氨酸流加发酵的最优化研究，它的缺点是解决问题的范围有一定的局限性，如物料衡算式最多只能有两个，边界条件(发酵始、终态)要已知等等。最小值原理是最优化控制理论中寻求最佳控制的一个最基本的数学理论方法，50年代苏联数学家庞特里金等在研究当时工程技术中出现的最佳控制问题时提出了最小值原理。同其它寻求最优控制的理论和方法相比(如动态规划)，最小值原理有更为完整和具体的算法，它将问题归结为常微分方程组使求解更为方便。最小值原理最早应用于青霉素的流加发酵中。 由于以底物流加速度为控制变量所决定的受控系统是一个线形系统，直接用最小值原理无法对单一控制阶段的最优化流加方式进行求解。Yamame等以比生长速度代替底物流加速度作为控制变量，将单一控制阶段转变为非单一控制阶段，得出了比生长速度的最优曲线，间接地得到了流加速度最优曲线。Lim等总结了前人的研究，指出：虽然通过简化和改变控制变量可以得出最优化的流加方式，但该流加方式的使用范围很窄。基于此，他们以一般发酵类型为研究对象，针对四个物料衡算式(菌体、产物、基质、体积)、一个控制变量(流加速度)的系统，进行了理论上的分析，得出了单一控制阶段的数学表达式，据此可直接求出底物流加的最优曲线。这是流加发酵最优化研究中的一个重要进展。在随后的研究中，Lim等将求解范围进一步扩大至物料衡算式可以多于四个控制变量可以多维的流加发酵系统。 流加发酵的最优化研究不但有助于提高发酵水平，而且为应用发酵过程计算机控制提供了潜力，体现了现代发酵技术的研究趋势。目前流加发酵最优化研究仍存在着实践上的一些障碍，如合理动力学模型建立的困难、流加发酵的最优化理论有待进一步完善等，但可以设想随着研究的深入，流加发酵最优化研究必将为流加发酵的应用带来广阔的前景。 三、高生产率和高细胞密度发酵 生物技术研究者追求的两个主要目标，一是新型生物产品的开发，另一就是为传统的或新生生物产品，寻求更经济的生产方式。近十年来，利用遗传工程技术来生产一些重要的生物药物，是生物技术领域中迅速发展的一个重要方向。在这一研究领域里，如何创造更经济、更有效的方法，来提高生产过程的经济性和产品的市场竞争力，已经成为生物技术领域的科学家们所关注的焦点问题。 利用重组DNA技术生产重要的生物药物，在人类文明史上具有划时代的意义。由于生产成本和生产率的高低直接影响公司的生存，重组生物药物生产过程的优化已经成为一个重要问题。它包括以下六个方面∶(1)适宜宿主的选择；(2)重组蛋白积累位点(如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累)的确定；(3)重组基因最大表达的分子策略；(4)细胞生长和生产环境的优化；(5)发酵条件的优化；(6)后处理过程的优化。只有这六个方面都以实现高生产率为目标，整个生产过程的最优化才能实现。 (一)细胞生长环境的优化策略 要提高细胞密度和生产率，首先需要对微生物生长的物理和化学环境进行优化，包括生长培养基的组成，培养物理参数(pH、温度和搅拌)及产物诱导条件。优化这些参数的目的在于保证细胞生长处于最适的环境条件之下，避免营养物过量或不足、防止产物降解以及减少有毒产物的形成。 1．培养基组成的优化 培养基中通常含有碳(能)源、氮源，以及微营养物如维生素和微量元素，这些营养物的浓度与比例，对实现生产重组微生物的高密度发酵是很重要的。例如，过量的Fe2+和CaCO3与相对低浓度的磷酸盐可促进黄曲霉生产L-苹果酸；链霉菌在60～80 mmol/L CO32-存在下，其丝氨酸蛋白酶生产能力可提高10倍之多；在重组微生物达到高细胞密度后，限制磷酸盐浓度可使抗生素和异源白介素1(的产率显著提高。此外还发现，限制精氨酸的浓度虽然会抑制细胞的生长，但比起精氨酸充足时细胞生长优良的情况，其重组(-淀粉酶的产量可提高2倍。 培养基中复合氮源的种类对重组大肠杆菌的高密度发酵也非常重要。一般地，当流加培养基中含有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中含有蛋白胨时，大肠杆菌不能再利用其所产生的乙酸。将酵母膏和蛋白胨都加入流加培养基中，不但所生产的重组蛋白非常稳定，细胞还能再利用代谢合成的乙酸，这是一种非常有趣的代谢机制。 恒化技术可用于优化精氨酸营养缺陷型大肠杆菌X90的生长培养基。使该菌株以0.4 h-1的比生长速率在含精氨酸的基本培养基上生长，待培养达到稳定状态后，在恒化器内分别加入氨基酸、维生素和微量元素来考察这些物质对菌体生长和精氨酸合成的影响。结果表明，由于氨基酸生物合成途径的末端产物抑制作用，加入某些氨基酸后，细胞生长反而受到抑制。加入NH4Cl后细胞量则出现了戏剧性的增长。而添加维生素对菌体生长基本上没有任何影响。通过计算生物量对每种基质的产率，最终可以确定高密度发酵培养基的组成，在此优化培养基上，大肠杆菌X90细胞密度可达到92 g/L，同时形成56 mg/L的胞外重组蛋白酶。 2．特殊营养物的添加 在某些情况下，向培养基中添加一些营养物质能提高生产率。这些营养物的作用有可能是作为产物的前体，也有可能是阻止产物的降解，例如，在培养重组大肠杆菌生产氯霉素乙酰转移酶(一种由许多芳香族氨基酸组成的蛋白)时添加苯丙氨酸，可将酶的比活力提高大约2倍；在培养重组枯草芽孢杆菌生产(-内酰胺酶的培养基中添加60 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸钾能使重组蛋白的稳定性显著提高。其原因可能是由于宿主细胞产生的多种胞外蛋白酶的活性被抑制，从而防止了重组蛋白的降解。 在生长培养基中添加特殊物质有时还能以一种未知的机制提高生产率。例如，在摇瓶培养Micromonospora cbersina时添加碘化钠可使dynemicin A的产量提高35倍，但在小型反应器中却无法重复这一结果。 3．限制代谢副产物的积累 培养条件的控制对代谢副产物的形成影响甚大。在分批或流加培养中，某些营养物的浓度过高均会导致Crabtree效应的产生。在这种效应下，酿酒酵母会产生乙醇，大肠杆菌则会产生过量乙酸，一旦生成乙酸，细胞生长及重组蛋白的生产均会受到抑制。大肠杆菌形成乙酸的速度依赖于细胞的生长速度和培养基的组成。业已确证，如果在培养基中添加复合营养物(如大豆水解物)，则会增加乙酸的积累量。针对如何减轻由于乙酸积累而产生的负面影响，众多研究者进行了大量工作，如利用循环发酵技术来限制乙酸在重组大肠杆菌高密度培养中的积累。近来也有研究表明，添加某些氨基酸能减轻乙酸的抑制作用。如在培养基中添加10 mg/L的甘氨酸能显著促进大肠杆菌合成重组(-淀粉酶和(-内酰胺酶，并能刺激酶从周质向培养基中释放，但此时仍有乙酸伴随生成。 (二)培养模式 由于许多营养物在高浓度下对细胞有抑制作用，而为了达到高细胞密度，又必须供给大量的营养物质，因此，浓缩营养物必须以与其消耗速率成比例的速度加入反应器中。为此产生了多种形式的补料策略，它可以简单到线性补料，也可以复杂到利用数学模型计算得出的策略来控制补料速率。具体来说，培养模式的选择主要依赖于以下三个因素∶(1)所培养细胞的具体代谢行为；(2)利用抑制性底物合成目的产物的潜力；(3)诱导条件以及测量细胞培养各项参数的能力。 1．大肠杆菌流加发酵策略 大肠杆菌是迄今为止遗传背景最清楚的菌株，广泛用于基因工程的研究中。大肠杆菌高密度培养时最关键的问题是如何尽量减少乙酸的产生，因为高浓度葡萄糖或高比生长速率带来的高浓度乙酸会严重抑制细胞生长和重组蛋白的生产。研究发现，即使葡萄糖浓度只有0.25～0.5 g/L，大肠杆菌仍会产生乙酸。因此，高细胞密度发酵所采用的流加策略必须按照一定的算法制定，以保持反应器中底物浓度处于较低的水平。营养物最好以它们的消耗速率加入反应器中，这样不仅可以防止底物积累到毒性水平，也不会使细胞处于饥饿状态。 近年来已经报道了多种控制大肠杆菌流加培养中流加速率的方法，其中大多数是将流加速率与一种物理参数间接耦合(如溶氧、pH或CO2释放速率)。有学者将溶氧控制在一个预定值上以保证较低的生长速率，结果乙酸产生很少，最终细胞干重达到110 g/L，并发现较低的比生长速率还有利于重组蛋白的高表达。在另一个控制低比生长速率的高细胞密度培养中，研究者采用先指数流加葡萄糖、铵盐和无机盐，后采用广义线性流加的培养策略，有效地防止了乙酸的积累，重组大肠杆菌的细胞密度达到66 g/L，通过温度诱导可在胞内形成19.2 g/L的活性重组蛋白。 如果将葡萄糖浓度控制在一个不致于产生毒性的足够低的水平上，也可以使细胞在不存在限制性基质的情况下迅速生长到高细胞密度。这种控制策略对仪器的要求较高。Kleman等采用在线葡萄糖分析仪，以微生物对葡萄糖的需求来决定葡萄糖和其它营养物的流加速率，这一算法能够在产物诱导阶段中根据细胞生长的变化自动调整流加速率。培养携带质粒的大肠杆菌 MV1190，其质粒中带有编码1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的基因，最终细胞干重达到39 g/L，产生1.7 g/L可溶的活性蛋白。 2．重组酵母的流加发酵 酵母中广泛用于遗传工程研究的菌株是酿酒酵母。但采用酿酒酵母作为重组宿主也有以下缺点∶(1)重组蛋白生产的水平较低；(2)质粒不稳定；(3)生成乙醇。其中生成乙醇是研究者最不希望出现的，因为这会抑制重组蛋白的形成。近来研究表明，其它酵母，如巴斯德毕赤氏酵母也具有作为重组宿主的潜力。Clare等比较了重组巴斯德毕赤氏酵母和酿酒酵母在高细胞密度状态下表达和分泌鼠表皮生长因子的能力。培养每基因组含有19个拷贝数的巴斯德毕赤氏酵母，最终可获得447 mg/L胞内重组蛋白；而培养酿酒酵母所获得的最高水平仅6～7 mg/L。 通过先指数流加，后采用基于CO2释放和RQ值的线性流加控制方式可使重组巴斯德毕赤氏酵母的细胞干重达到80～90 g/L，并分泌高水平的重组人血清蛋白。而培养酿酒酵母，细胞干重和重组蛋白的产量仅分别为25 g/L和20 mg/L。即使将酿酒酵母的生长速率维持在0.12～0.18 h-1，也将形成10～13 g/L的乙醇，因而导致产率降低。但酿酒酵母产乙醇也并不是不可控制的。Shimizu等采用一个复杂的流加系统，将酵母的生长速率控制在0.3 h-1，可使谷胱甘肽(GSH)的生产最大而乙醇的生成最小。 3．流加培养的控制 一个好的流加控制系统必须避免两种倾向∶一是流加过量，补料组分在反应器中积累从而对细胞生长和产物形成产生抑制；二是流加不足，这可能会导致细胞必需营养物的缺乏。计算机技术的迅猛发展，为流加培养的控制提供了更有效的手段。近年来，应用计算机技术来监测和控制发酵过程的研究屡见报道。由于现代计算机技术的帮助，人们能够采用多种生长参数和数学模型来控制流加培养中营养物的添加，从而使复杂的控制系统得以实现。在各种人工智能技术中，模糊推理(fuzzy reasoning)是应用最广的一种。模糊逻辑控制(fuzzy logic control)部分依赖于数学生长模型，也采用“语言定义的规则系统”(linguistically defined rules system)来帮助系统响应发酵过程的非线性和动态行为。Alfafara等在流加培养酿酒酵母生产谷胱甘肽的研究中，采用一个模糊逻辑控制系统来控制葡萄糖的流加速度，对系统进行优化后谷胱甘肽的比产生速率达到6.2 mg(g-1(h-1。目前，在流加培养中应用模糊逻辑控制技术的最大问题在于如何减少底物和产物浓度振荡所需的调整次数。自适应模糊逻辑控制算法的发展可望对此有所帮助。 (三)诱导策略 对于许多带有诱导型启动子的重组微生物，只有将生长期和产物形成期分开才能获得最大生产率。在流加培养中，这两段时期的分离可以通过延迟诱导直至细胞生长已达到高密度来实现。此外，如果质粒稳定并且产物对培养物无毒，那么可以用重复补料分批培养系统来提高生产率。有学者采用重复补料分批培养技术培养酿酒酵母，每24 h更换50%的培养基，持续30 d，其产物(hirudin)的产量可比连续培养系统提高3倍。 如果诱导物和产物对细胞都有毒性，那么应当人为地将诱导期和生长期分开。对于这种情况，两级连续培养是最适宜的培养方式。控制第一罐的条件，使细胞生长处于最适状态之下，而诱导与产物形成则发生在第二罐中。例如，在恒化器中培养一株能产(-内酰胺酶的重组大肠杆菌，将第一罐的发酵液导入第二罐中，构成一个两级培养系统。第二罐中添加营养物以及IPTG作为诱导物。结果获得300 mg活性(-内酰胺酶(相当于总蛋白的25%)，其中90%分泌至胞外。这一系统至少可以稳定运行50 d。另一相似的系统被用于培养大肠杆菌生产重组蛋白A-EcoRI蛋白融合体。培养在恒浊器中进行，对第二罐进行热诱导，结果获得了比分批发酵高6倍的比生产率。研究者还尝试将生产重组蛋白的两级连续培养系统与亲和色谱柱相组合，试图实现重组蛋白生产和纯化的连续化。但由于技术上的一些原因，这种组合还未得到成功。 比生长速率对细胞生长和产物形成均有重要作用。经常会遇到的情况是，最适于细胞生长的比生长速率却并不适于产物的形成或其它特性的实现。我们在培养面包酵母时发现，比生长速率为0.2 h-1时细胞产率最高，而比生长速率为0.178 h-1时酵母发酵活力最佳。针对这一现象我们提出了一个两阶段控制比生长速率的流加培养策略，结果在一个反应器中实现了高发酵活力与高细胞产率的统一。 (四)细胞循环发酵 从反应器角度来考虑获得高细胞密度，通常采用的是细胞循环生物反应器。这种反应器利用一种切向流或中空纤维过滤器从醪液中分离细胞，细胞返回容器，无细胞醪液则以给定速率连续转移，同时代之以新鲜培养基。利用细胞循环技术，可使细胞保留在反应器中并达到高细胞密度，而毒性废产物和胞外产物则不断转移，这可以延迟或防止由细胞生长或产物形成引起的反馈抑制。细胞循环生物反应器能够适用于多种机体和生产系统，但它的应用也存在许多限制，主要包括∶(1)作用于进入过滤单元的细胞的剪应力太大；(2)系统的放大存在许多实际困难。 操作细胞循环生物反应器时必须考虑两个因素，一是稀释率(流速／体积)；二是循环速率(指通过过滤系统的培养基速率)。稀释率的大小影响细胞的生长速率，不同的实验目的对稀释率的要求也不同；高的循环速率可使组分混合均匀，特别适用于细胞容易凝聚或成团的情况。但循环速率过高会使作用在细胞上的剪切力过高，也会导致过滤单元膜的迅速损坏。因此，很难同时确定合适的稀释率与循环速率，这也是限制细胞循环技术应用的一个重要因素。 细胞循环技术可望获得高的体积生产率，这对产物的提取非常有利。近年来循环发酵技术已广泛用于生产细胞代谢物，如燃料酒精和有机酸(如丁酸)及2,3-丁二醇。Lee和Chang采用细胞循环发酵技术，重组大肠杆菌细胞干重达到145 g/L，其重组青霉素酰化酶生产率比分批培养提高了近10倍。对于活细胞即为所希望的产物的培养，细胞循环发酵也能发挥作用。如在食品工业中，为生产牛奶，奶酪和酸乳酪需培养不同的乳杆菌，采用细胞循环生物反应器可以很容易地提高这些生物体的的密度。 在多种控制手段的帮助下，目前人们已经能很容易地获得超过100 g/L的细胞密度。但已有的研究结果表明，与最适生物量形成所对应的生长条件通常会导致较低的比生产率。例如，用细胞循环反应器生产2,3-丁二醇，生物量提高了大约6倍，但体积生产率只提高了2～3倍。同样，流加培养可以使链霉菌的细胞干重达到43 g/L，但蛋白酶活为零，而当细胞干重为18 g/L时蛋白酶活却高达3500 U/mL。我们在研究中也经常遇到类似问题。要解决这一问题，一方面应当研究如何促进重组蛋白的高效表达和提高重组菌株的稳定性，另一方面要研究与高细胞密度相关联的高水平产物的形成条件。 第一章主要参考文献 Nielsen J, Villadsen J. Bioreaction Engineering Principles. Plenum Press, 1994, New York Cole J. Supply and training of post-graduate microbial physiologists in Europe. EFB Newsletter, 1992, 9:78-81 Bailey JE. Toward a science of metabolic engineering. Science, 1991, 252: 1668-1675 Schügerl K. Bioreaction Engineering. Vol. 1, Fundamentals, thermodynamics formal kinetics, idealized reactor types and operation modes. John Wiley & Sons. 1990, Chichester, New York.