《发酵工程》电子教案：第六章HA

第六章 透明质酸发酵过程优化 第一节 透明质酸发酵概述 一、透明质酸的分布、结构、性质与应用 透明质酸(Hyaluronic acid，简称透明质酸)，又名玻璃酸，是Meyer和Palmer于1934年首先从牛眼玻璃体中分离出的一种高粘性物质。Balazs于1960年将透明质酸用于复杂的视网膜脱离手术取得理想疗效后，透明质酸开始作为生化药物得到应用。透明质酸在日化工业(特别是化妆品工业)中也有广阔的应用前景。据报道，透明质酸在国际市场上的价格为2,000~100,000美元/kg。1985年透明质酸在国际市场上的总销售额为1亿美元，到1990年已达2亿多美元。国外已有多家公司生产透明质酸药品，如美国的Hyvisc，前苏联的Luronitel，澳大利亚的Etamucin及瑞士的Healon等。 (一)透明质酸的分布、结构和性质 透明质酸为白色、无定形固体，是由葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)以(-1,3和(-1,4糖苷键连接成的二糖单元重复构建而成的丝状高分子聚合物，其结构如图6-1-1所示。透明质酸具有许多天然粘多糖共同的物理性质，无嗅无味，溶于水，不溶于有机溶剂，水溶液的比旋光度为-70~ -80(。
n>1000 图6-1-1 透明质酸结构示意图 自然界中，透明质酸广泛地存在于动物的各种组织内，如结缔组织、脐带、皮肤、人血清、鸡冠、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉壁。其中以哺乳动物的玻璃体、脐带和关节滑液中透明质酸产量最高。在这些组织中，透明质酸常与蛋白质结合，并与其它粘多糖共存，以溶解的形式存在于玻璃体和滑液中，而以凝胶形式存在于鸡冠和脐带中。 透明质酸的分子量在数十万到数百万之间。分子量为4(106 Da的分子，链长约为10 (m。由于直链链轴上单糖之间氢键的作用，透明质酸分子在空间上呈刚性的螺旋柱型，半径为200 nm，柱内侧因有大量羟基而产生强亲水性∶透明质酸在溶液中可亲和约为其自身重量1000倍的水分。这些水在螺旋柱内固定不动，不易流失。 透明质酸除具有强烈的亲水性外，其溶液还有着独特的流变学特性。透明质酸水溶液是一种非牛顿流体，有着良好的粘弹性和应变性。这些性质主要取决于其分子量的大小和溶液浓度与酸度的高低。一般来说，浓度高、分子量大，则溶液粘度也高。Gibbs发现低浓度的透明质酸溶液主要表现为粘性，而高浓度溶液则主要显示出弹性。在粘性与弹性之间有一个明确的临界浓度转变点，这个点与溶液的pH值有着很大的关系。 (二)透明质酸的主要用途 透明质酸在有机体内具有多种重要的生理功能，如润滑关节，调节蛋白质、水、电解质的扩散和运转，促进创伤愈合等，因此其在临床医学上有着巨大用途，例如∶透明质酸已成为现代眼科“粘性手术”的必备药物；利用透明质酸独特的流体力学特性可治疗骨关节疾病；促进伤口的愈合；作为易于检测的观察指标辅助诊断某些疾病等。透明质酸目前及潜在的医学医药应用见表6-1-1。 表6-1-1 透明质酸在医学医药上的应用 应用领域 主要功能和作用  眼科 玻璃体的替代品，舒适的滴眼药，眼科手术中的优良粘合剂。  矫型外科 增强骨骼关节间的滑动，用于矫型手术。  外科手术 用于耳鼻喉科手术，用作腹部、手部的抗粘连接剂。  骨关节术 有希望将动物关节术中的成功经验用于人类。  伤口愈合 促进组织再生、重塑和愈合，其银盐可缓慢向伤口释放银离子而促进伤口愈合。  临床诊断 用作肝、肿瘤的诊断指标。  此外，透明质酸具有特殊的保水作用。高分子量的透明质酸最多可以持水6 L/g，因而是一种理想的天然保湿因子(Natural Moisturing Factor，简称NMF)。它可以改善皮肤的营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老。含有透明质酸的化妆品目前被国际上公认为“仿生化妆品”、“第四代化妆品”，许多国家在竞相研究开发。表6-1-2列出透明质酸结构、性能对皮肤的影响。 表6-1-2 透明质酸结构、性能对皮肤的影响
二、透明质酸的生物合成 (一)透明质酸的生物合成途径 1937年，Kendall等发现溶血性链球菌Streptococcus haemolyticus可以合成透明质酸后，陆续报道了许多可产生透明质酸的微生物菌株。虽然到目前为止生物合成透明质酸的详细机制还不是很清楚，但根据现有的工作以及关于透明质酸两种UDP前体的研究，可以确定透明质酸的合成途径如图6-1-2所示。透明质酸是UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)在透明质酸合成酶作用下合成的。UDP-GlcA是糖醛酸途径的中间产物，与UDP-GlcNAc一样，它们的形成都不需破坏葡萄糖骨架。O'regan通过同位素标记实验证实，只有5~7%的葡萄糖能转化成透明质酸，其原因有可能是磷酸葡萄糖变位酶受UDP-GlcNAc反馈抑制。因此，要增加透明质酸的合成，必须克服这种反馈调节机制。
图6-1-2 透明质酸代谢示意图 位于原生质体膜上的透明质酸合成酶(hyaluronan synthase)是透明质酸合成途径中的关键酶，但并不是说在透明质酸合成酶的作用下UDP-GlcA和UDP-GlcNAc就能够合成透明质酸。在真核和原核微生物中都会形成一个与原生质膜相关的蛋白复合物来催化透明质酸的合成和运输。转座子突变实验证实原核细胞的透明质酸合成酶为42 kDa的膜蛋白。Stoolmiller和Dorfman等对A群链球菌的酶制备液进行研究，发现透明质酸分子链的延长是从内源透明质酸的非还原端进行的，在Mg2+存在的条件下，仅以UDP-GlcA和UDP-GlcNAc 为底物即可合成透明质酸。合成时将UDP-GlcA和UDP-GlcNAc交替连接在透明质酸链上，反应进行非常快，每分钟约100个糖单位。Van de Rijn发现链球菌的透明质酸合成酶也与细胞膜有关，在对数生长期可以很高的速率(大约为430~954 nmol/(h(g蛋白))合成透明质酸；但在静止期，其膜上的酶会失去利用前体形成聚合物的能力。Van de Rijn推测这可能是由于膜形态的改变，造成合成机制的改变，或是有关合成的酶被稀释和降解造成的。 Sugahara等用无细胞体系进行研究，发现合成的透明质酸可以分成两部分，即可溶于三氯乙酸的部分和不溶于三氯乙酸的部分。脉冲追踪技术表明，不溶部分是可溶部分的前体，但这两部分在分子大小上没有明显的区别。同时还发现透明质酸分子链的起始不需要酶系统参加。虽然有学者对透明质酸链延长的步骤进行了推测，但详细机制还不很清楚。 细菌在合成透明质酸的同时也伴随着透明质酸的降解。链球菌在胞内合成透明质酸后，在细胞膜上的透明质酸酶的作用下，将胞内透明质酸降解到一定程度后，分泌到胞外。产生透明质酸酶的微生物有很多，不同菌种所产生酶的活力及产生时间是不一样的。Van de Rijn发现C族链球菌D181的胞内透明质酸分子量为10×106 Da，而胞外的仅2×106 Da，约为胞内的20%。细胞在静止期大量合成胞外降解酶，可以将透明质酸彻底降解。 (二)透明质酸合成的分子生物学机制 Dougherty 和Van de Rijn对A群链球菌研究发现，从透明质酸前体的合成到透明质酸的合成所需的酶都与细胞膜有关。有关透明质酸合成的操纵子是包含一个称为hasA的基因，编码着A群Streptococci的透明质酸合成酶。所合成的蛋白显示出膜蛋白的特性，氨基酸序列同系现象表明该蛋白与多糖产生和细胞分化有关。Dougherty等同时确定了其DNA序列和hasA转录起始点。用Tn916作为插入子插入hasA基因中，除透明质酸合成酶失去活性外，UDP-葡萄糖醛酸脱氢酶活力也丧失。这些结果表明，编码透明质酸合成酶基因和UDP-葡萄糖醛酸脱氢酶基因存在于同一个操纵子上。 Crater和Van de Rijn对has操纵子进行了进一步的研究，发现has操纵子上有三个基因hasA、hasB、hasC，分别编码着透明质酸合成酶、UDP-葡萄糖脱氢酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。has操纵子的表达是Streptococci (A群)合成透明质酸荚膜所必须的。Streptococci (A群)荚膜细菌和非荚膜细菌，以及Streptococci (C型)荚膜菌都具有has操纵子。荚膜表型可以说明膜上是否缺少透明质酸合成酶活性或胞外透明质酸酶。RNA分析也表明失去荚膜的Streptococci (A群)菌会失去has操纵子所转录的mRNA，微生物生理状态的变化规律与所获得的has操纵子的启动子所表现的一致，这些都说明A群链球菌透明质酸荚膜的合成是受转录机制所控制的。 三、透明质酸的生产 (一)动物组织提取法生产透明质酸 最初生产透明质酸的途径主要是从动物组织中提取，原料涉及前述的大部分含透明质酸的动物组织，表6-1-3为各种组织中透明质酸的含量。由于来源和成本的原因，鸡冠、牛眼是最常用的提取原料。 表6-1-3 各种组织(液)中透明质酸的含量 原料 浓度 /mg(L-1(mg(kg-1)  原料 浓度 /mg(L-1(/mg(kg-1)  公鸡冠 7500  人玻璃体 140~380  牛鼻软骨 1200  人表皮 200  兔脑 65  人淋巴液 8.5~18  兔肌肉 27  人尿 0.1~0.5  人脐带 4100  人血清 0.01~0.1  人关节滑液 1240~3600      从人和动物体内所得到的透明质酸的分子量一般都大于60万，粘度较高，保湿性能也较好，占据世界眼科主要市场的透明质酸制剂Healon，目前仍然采用这种方法所制得。从动物组织中提取的一般方法如下：先将组织打成匀浆，再用水和稀的盐溶液提取。提取液用季铵盐(如氯化十六烷基吡啶)沉淀。将所得沉淀溶于氯化钠溶液，用三倍乙醇沉淀即得粗品。纯化时，可用乙醇和季铵盐反复沉淀进行处理，也可通过凝胶和/或离子交换色谱的方法精制。1 kg新鲜公鸡冠一般可制得4 g纯透明质酸。 (二)发酵法生产透明质酸 动物组织提取法有着许多不可克服的缺点。首先是原料来源缺乏，无论是鸡冠、还是牛眼都非常稀少，并且各种原料中的透明质酸产量相对比较低(表6-1-3)；其次由于动物组织中透明质酸通常与其它蛋白多糖相结合，使得透明质酸提取和精制的成本很高；再者动物来源的透明质酸可能受到不同程度的污染，因此其使用受到许多严格规定的限制；更为重要的原因是提取法生产的产品难以满足透明质酸市场需求量不断增加的需要。在这种情况下，研究人员积极探索透明质酸生产新途径。 1983年日本资生堂首次报道用链球菌生产透明质酸，随后英美等国相继报道采用微生物发酵生产透明质酸的方法，大大拓宽了透明质酸来源，推动了透明质酸的研究和应用。微生物发酵方法生产透明质酸的实现是透明质酸生产领域在近年来取得的最重大的进展，不仅可以降低透明质酸生产成本，而且透明质酸的质量提高，品质稳定。发酵法生产透明质酸和提取法生产透明质酸的比较如表6-1-4。同其它产物的发酵一样，透明质酸的发酵生产同样也追求高产率和高转化率，同时还要保证透明质酸产品的高分子量，因为其分子量的高低直接影响其质量的高低。此外，透明质酸作为一种医药产品，其安全性也是需要考虑的一个重要问题。 表6-1-4 发酵法生产透明质酸与动物组织提取法生产透明质酸的比较 提取法 发酵法  原料 来源有限 原料很广  提取工艺 透明质酸在原料中与蛋白质和其它多糖形成复合体，分离纯化工艺复杂 透明质酸在发酵液中游离存在，分离纯化容易  分子量 <100万 >180万  性质 不同来源差异较大 分子量高、粘度大、保湿力强  质量与产量 质量不稳定，取决于动物组织来源，产量较小，产品成本高 产品质量稳定，产量大，产品成本明显低于提取法  1．环境条件对透明质酸产量的影响 迄今为止，实验室研究和工业化生产都发现最适合发酵生产透明质酸的微生物是链球菌。影响链球菌合成透明质酸的最主要环境因素是氧。厌氧条件下发酵法生产透明质酸的产量为0.3~1.0 g/L，而在通风搅拌的情况下，可以达到4~6 g/L。Johns等研究了搅拌转速对透明质酸生产的影响，发现在厌氧培养时，较高的搅拌转速下透明质酸产量更高，而菌体的生长速率和转化率不受影响；降低转速会使透明质酸产量降低，同时副产物增加。这是因为透明质酸溶液是一种假塑性流体，高的搅拌(剪切)速率可以降低溶液粘度，增加营养的供给，消除细胞周围富集的副产物对细胞的毒害，同时高的搅拌速率可以将细菌的透明质酸荚膜释放到培养基中。 不同研究关于氧对链球菌生产透明质酸的影响并不一致。Clery和larkin 认为透明质酸可作为一种抵抗O2渗透的屏障，防止分子氧对细胞的毒害，因此通风可以促进透明质酸的产生；Swann等也发现在对数生长期控制相对较高的溶氧浓度，可以获得更高的透明质酸转化率。然而Bracke等发现培养基中丰富的CO2可以促进透明质酸的合成。Johns等发现，与厌氧培养相比，通风培养可以获得更高的透明质酸浓度和转化率。另外，厌氧培养的产物单一，而通风培养时大大增加了其它副产物及CO2的产生。 营养源的浓度对透明质酸产量的影响也很大。宫田俊范发现培养基中葡萄糖浓度过高或过低时都不能得到好的发酵结果，当初始葡萄糖浓度为15 g/L，发酵过程中控制培养液中葡萄糖含量低于15 g/L 可获得最高的透明质酸产量。此外，发酵方式也影响透明质酸的生产。高山健一郎采用半连续和连续培养的方法控制粘度在200 cps以下可使得透明质酸产率、转化率大大提高。也有将培养基中氧化还原电位控制在-100~-400 mV使透明质酸产量提高的报道。 2．环境条件对透明质酸分子量的影响 氧不仅对透明质酸发酵生产的产量有很大影响，而且还影响透明质酸的分子量。厌氧条件下透明质酸的重均分子量为0.7×106 Da或更低，有氧条件下分子量则高于2×106 Da。在一定的条件下，胞外透明质酸酶缺失的链球菌可产生高分子量的透明质酸。控制pH对透明质酸的分子量影响很大。日本资生堂首次报道的用链球菌发酵得到4.0 g/L透明质酸的实验是在通气搅拌、pH 7的情况下进行的。当pH在8.0~8.9的范围内，透明质酸分子量可以达到2.5×106 Da。特殊的添加剂也能提高产物的分子量。如在培养基中添加苯酚等化合物，透明质酸的分子量可以达2.5×106 Da左右；森田裕等通过添加表面活性剂，获得了高纯度高分子量的透明质酸。 产品分子量不仅受发酵条件的影响，也受提取工艺的影响。不恰当的提取方法不仅会使提取得率降低，而且会使透明质酸分子量降低。若存在对聚合链剪切的操作，透明质酸分子可能会发生断裂。目前世界上有4个研究小组对有机溶剂法提取透明质酸进行了研究，发现控制合适的pH、温度，分别将蛋白质、核酸等杂质去除，既能获得高纯度透明质酸产品，又不会在提取过程中降低透明质酸分子量。 3．环境条件对透明质酸安全性的影响 透明质酸生产的安全性包括生产过程的安全性和产品的安全性。不产任何毒素的生产菌株，既可防止生产过程中偶然的泄漏造成对健康的伤害，也可大大降低后提取过程的成本。一般的做法是先采用诱变的方法将菌种产生毒素的性能去除，然后再进行培养研究。Ellwood、高山健一郎等采用连续培养的方法，既可降低提取成本又可减少毒素的产生。菌体生长进入静止期后，细胞开始产生不同的毒素，同时各种降解酶开始作用使菌体发生自溶，各种细胞成分释放到培养基中，使得提取困难。在成分稳定的培养基中进行连续培养，可以大大减少这些酶的表达。连续培养的另一个优点是细胞壁更新率较低，而细胞壁成分与透明质酸分离困难，因此这是一个优点。 四、透明质酸生产中需要解决的问题 透明质酸在医学、医药和化妆品领域具有的广阔应用前景。作为一种商品，透明质酸的质量和成本正成为制约透明质酸广泛应用的一个重要因素。发酵法生产透明质酸的成功是近年来透明质酸生产研究取得的最重大的进展，但由于发酵法生产透明质酸的发展历史较短，尚存在如下不足和需要解决的问题： 1．原料。原料成本是生产成本的重要部分，开发可以利用价格低廉和较粗放原料(包括各级放大的种子所用的原料)的菌种是一个重要的应用研究方向。 2．发酵过程的动力学。动力学是应用现代发酵技术的基础，对其进行研究，可以了解发酵过程的规律，对生产过程进行优化和控制，以获得高底物转化率和高生产强度。但到目前为止，关于透明质酸的发酵过程动力学，还没有相关的研究报道。 3．发酵过程的优化与控制。透明质酸溶液具有极强的粘弹性，其发酵体系有着与一般体系不同的流变学特性。已有的一些关于发酵法生产透明质酸的研究报道，主要集中于研究一些简单的发酵条件，对透明质酸发酵过程中的特殊现象没有进行深入的考察。如，搅拌、溶氧浓度如何影响透明质酸发酵的过程和结果，氧在发酵过程中所起的作用等。 4．工业化生产模式。透明质酸发酵生产的周期较短，仅采用单一的分批操作模式不一定能得到最佳的工艺效果。而现有的研究多集中于分批发酵，虽然已有报道阐述连续培养生产透明质酸的优点，但其能否应用于实际生产还有待于进一步研究。 5．发酵机理的探讨。已有研究表明仅10%左右的底物可以转化为透明质酸，但其原因何在?是否可以采用一定的手段和方法来提高透明质酸生物合成的转化率?虽然有关透明质酸生物合成机制的研究已进行到分子水平，但还没有关于提高透明质酸合成能力的理论和方法的报道。 五、本章主要内容 本章以兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)H23为生产菌株，采用摇瓶和小型发酵罐对该菌株的发酵条件进行研究，并根据该菌株细胞生长和产物合成的动力学特性提出其发酵过程的动力学模型；通过对模拟发酵体系的流变学行为和混合、传质性能进行研究，深入探讨搅拌和溶氧在发酵过程中的作用，提出搅拌溶氧控制策略并实验验证；对多种发酵模式进行研究，采用奇异控制理论对补料发酵过程进行优化，并将多种发酵模式进行组合操作，提高透明质酸生产效率，为工业化生产打下基础；最后对S. zooepidemicus的代谢网络进行了分析，根据理论计算结果，采用营养增强型培养基，实现透明质酸的高效生产。具体内容如下∶ 1．以兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus) H23为生产菌株，采用无血清、无BHI(心脑浸液)的种子培养基及较为简单的发酵培养基，进行菌体生长和透明质酸合成的摇瓶发酵条件研究。在此基础上，采用小型发酵罐进行S. zooepidemicus H23培养的研究，并对过程进行优化。通过对透明质酸发酵过程动力学进行分析，扩展功能单元理论，提出透明质酸分批发酵过程动力学数学模型，为补料培养及其优化控制提供理论基础。 2．采用模拟体系，对透明质酸发酵过程的流变学行为进行研究，建立发酵过程流变学模型。在一定环境条件下，考察透明质酸浓度、控制条件对混合和传质的影响，从流变学角度探讨发酵机制，为反应器设计选型提供依据。以流变学研究为基础，对溶氧和搅拌在透明质酸发酵生产中的作用进行细致的研究和分析，探讨氧的代谢途径及其影响透明质酸合成的作用机理，提出透明质酸发酵生产的搅拌溶氧控制策略。 3．根据分批发酵动力学模型，对简单分批补料培养过程进行分析。采用奇异优化理论，以透明质酸最大产量为目标，对补料分批培养过程进行优化。采用不同的发酵模式对发酵生产透明质酸进行研究，并以最大生产强度为目标研究多种模式的组合操作的可行性，优化操作过程，为工业化生产打下了基础。 4．采用代谢网络分析方法对S. zooepidemicus代谢网络通量进行研究，建立不同发酵条件下的代谢网络模型，确定代谢模型中有关透明质酸合成的关键代谢节点的刚性，并对能量和还原力在代谢过程中的作用进行探讨。以代谢网络分析为基础，通过实验确定S. zooepidemicus H23合成透明质酸的关键因子，并采用营养增强型培养基培养S. zooepidemicus H23，减轻透明质酸合成途径的抑制，提高透明质酸产量和对底物的转化率。 第二节 透明质酸摇瓶发酵条件的研究 一、引言 荚膜是微生物在一定生长阶段合成的胞外覆盖物，以多糖为主要成分。1937年，Kendall等发现溶血性链球菌Streptococcus haemolyticus可以合成透明质酸并分泌到胞外形成荚膜，其后，又陆续有报道发现能合成透明质酸的微生物菌种。许多链球菌都可以合成以透明质酸多糖为唯一成分的荚膜，使得链球菌(特别是对人体危害较小的C型)成为研究得最多的透明质酸生产菌，已报道的有多种溶血性链球菌(A型)、兽疫链球菌(C型)、马链球菌(C型)、粪马链球菌(C型)、缺乳链球菌(C型)以及鸡霍乱杆菌(C型)等。其中A型为人体致病菌，C型则只能感染畜类。许多年来虽然有不少学者研究发酵法生产透明质酸，并且在1983年，日本资生堂率先成功开发出工业化规模发酵生产透明质酸的方法，但由于其具有巨大的商业价值，除专利外，关于发酵法生产透明质酸的报道并不多。 微生物的培养条件，对其生长代谢有着重要的影响。适宜的环境条件不仅有利于菌体的生长，而且可以提高微生物对底物的利用能力，使代谢朝向有利于产物合成的方向进行。由于Streptococcus zooepidemicus对营养要求极为苛刻，已有的报道都表明，对其进行培养需要以血清或BHI(Brain Heart Infusion)为培养基主要成分，特别是在种子培养阶段。为此，本节以一株能产透明质酸的Streptococcus zooepidemicus H23为研究菌株，首先对种子培养基组成进行了考察研究，得到了无血清种子培养基；以此为基础采用摇瓶发酵的方式，对培养条件(培养温度、供氧状况和培养基组成)进行了研究，得到了较好的透明质酸摇瓶发酵条件。 二、种子培养基组成及培养条件对透明质酸发酵的影响 种子是进行发酵的基础，其品质的好坏对发酵生产起着关键的作用。生产中培养出的种子应是：(1)生长活力强，移至发酵罐后能迅速生长，延滞期短；(2)生理状态稳定；(3)生物量浓度能满足大容量发酵罐的要求。 (一)种子培养基中氮源种类及浓度对透明质酸发酵的影响 1．氮源种类的确定 种子培养基中不同氮源对种子液中细胞生长及摇瓶发酵情况的影响见表6-2-1。种子液中细胞生长良好的，发酵培养时不一定能得到好的结果，表明细胞量多、但如果细胞合成透明质酸的能力并未处于较佳的状态，最终不会得到较高的透明质酸产量。采用无机氮源(NH4)2SO4作为种子培养基氮源，接入发酵培养基后透明质酸产量最低，可能是NH4+对菌体有着一定的毒害作用，或者是培养基中缺少一定的生长因子，致使种子生长不好。采用复合有机氮源，接入发酵培养基后其透明质酸产量好于单一的有机氮源，可能是因为不同有机氮源提供的不同生长因子能够进行互补，利于细胞生长。在复合有机氮源中，牛肉膏和酵母粉各占氮源总量50%的种子培养基，接入发酵培养基后透明质酸产量最高；牛肉膏和蛋白胨各占氮源50%的其次；而蛋白胨和酵母粉各占氮源50%的，接入发酵培养基后其发酵结果与采用单一有机氮源的发酵结果几乎相同。 表6-2-1 种子培养基中的不同氮源组成对透明质酸发酵结果的影响(1) 氮源(种子) BE (20g(L-1) Pep (20g(L-1) YE (20g(L-1) BE(10g(L-1) Pep(10g(L-1) BE(10g(L-1) YE(10g(L-1) Pep(10g(L-1) YE(10g(L-1) (NH4)2SO4 (20g(L-1)  种子 生物量 / g(L-1 0.85 0.87 1.10 0.86 1.12 1.06 0.82  发酵 生物量 / g(L-1 1.50 1.00 1.38 0.98 1.33 1.22 1.10   透明质酸 /g(L-1 0.14 0.15 0.14 0.18 0.22 0.16 0.09  注∶BE，牛肉膏(beef extract)；Pep，蛋白胨(peptone)；YE，酵母粉(yeast extract) 在上述实验的基础上，进一步考察了BHI培养基和种子培养基中复合有机氮源的浓度对透明质酸发酵的影响，结果见表6-2-2。以BHI培养基作为种子培养基，接入发酵培养基后透明质酸产量并不高。因此，种子培养基采用牛肉膏和酵母粉为复合氮源。由于牛肉膏和酵母粉复合氮源内含有大量的生长因子，可以推测这种复合氮源能够提供血清或BHI所能提供的生长因子，所以不加血清和BHI的种子同样可以使细胞较好地生长，使得种子培养基的成本有所降低。 表6-2-2 种子培养基中的不同氮源组成对透明质酸发酵结果的影响(2) 氮源 YE (5g(L-1) Pep (5g(L-1) YE (5g(L-1) BE (5g(L-1) Pep (5g(L-1) BE (5g(L-1) BHI  透明质酸 /g(L-1 0.133 0.178 0.153 0.138  注∶BE，牛肉膏(beef extract)；Pep，蛋白胨(peptone)；YE，酵母粉(yeast extract) 2．氮源浓度的确定 考察由牛肉膏和酵母粉组成的复合氮源浓度对透明质酸发酵的影响，结果如表6-2-3所示。随着氮源浓度的升高，种子液中细胞干重随之升高。当氮源浓度达20 g/L时，细胞干重也基本稳定于最大值。此时透明质酸发酵也处于最佳状态。因此，在以后的研究中选用酵母粉和牛肉膏为复合氮源，浓度各为10 g/L。 表6-2-3 种子培养基中氮源的不同浓度对发酵结果的影响 氮源浓度 / g(L-1 10 15 20 25 30  生物量 / g(L-1 0.78 0.92 1.18 1.20 1.18  葡萄糖 / g(L-1 15.7 11.8 5.5 6.2 8.2  透明质酸 / g(L-1 0.16 0.22 0.26 0.24 0.23  透明质酸产率 / g(g-1 0.0067 0.0077 0.0077 0.0071 0.0061  (二)种子培养基中碳源种类及浓度对透明质酸发酵的影响 1．碳源种类的确定 种子培养基中不同碳源对H23菌株发酵生产透明质酸的影响列于表6-2-4。采用葡萄糖为种子培养基的碳源，接入发酵培养基后透明质酸产量最高，其后依次是蔗糖和麦芽糖。而以果糖、木糖、半乳糖为种子的碳源，效果较差。 表6-2-4 种子培养基中的不同碳源组成对透明质酸发酵结果的影响 碳源种类 葡萄糖 果糖 蔗糖 木糖 半乳糖 麦芽糖  透明质酸 / g(L-1 0.22 0.12 0.20 0.11 0.15 0.19  2．葡萄糖浓度的确定 如表6-2-5所示，当葡萄糖的浓度为20 g/L时，种子液中细胞干重最高，但发酵后透明质酸产量也最大。因此，采用葡萄糖为种子碳源，浓度为20 g/L。 表6-2-5 种子培养基中不同葡萄糖浓度对发酵结果的影响 葡萄糖 / g(L-1 14 20 28 35  种子 生物量 / g(L-1 1.00 1.25 1.02 1.15  发酵 剩余葡萄糖 / g(L-1 9.7 6.3 7.8 12.8   透明质酸 / g(L-1 0.19 0.24 0.22 0.18   透明质酸产率 / g(g-1 0.0063 0.0071 0.0069 0.0065  (三)种子培养基中金属离子及浓度对透明质酸发酵的影响 1．Mg2+的影响 对细胞来说，众多的金属离子当中，Mg2+是最为重要的一种，它是许多酶活性中心不可缺少的一部分。在EMP途径之中，磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的催化下形成烯醇式丙酮酸和ATP，是EMP途径的一个限速步骤，而Mg2+对于丙酮酸激酶来说是必不可少的。由于链球菌缺乏一个完整的TCA循环，它的能量主要来自EMP途径，因此需要提供适量的Mg2+，保证H23菌株胞内EMP途径的酶高效运转，使菌体生长良好。 表6-2-6 MgSO4(7H2O浓度对发酵的影响 MgSO4(7H2O /g(L-1 1.0 1.5 2.0 2.5  种子 生物量 /g(L-1 1.02 1.13 1.21 1.15  发酵 剩余葡萄糖 /g(L-1 1.08 0.75 0.62 0.87   透明质酸 /g(L-1 0.22 0.24 0.28 0.24   透明质酸产率 /g(g-1 0.0074 0.0075 0.0083 0.0076   如表6-2-6所示，随着MgSO4(7H2O添加量的增大，种子液中细胞干重逐渐增大，当MgSO4(7H2O为2.0 g/L时，种子液中细胞干重达到最大值，产透明质酸性能也最佳。 2．Mn2+浓度的确定 与Mg2+作用相类似，Mn2+也是一部分酶活性部位的组成成分。如表6-2-7所示，MnSO4(4H2O的浓度为0.10 g/L时，种子液中细胞干重最大，增大浓度，细胞干重下降，说明过高的MnSO4(4H2O浓度会抑制菌体生长。进行发酵试验，发现MnSO4(4H2O浓度为0.1 g/L的种子，其发酵生产性能也达到最佳状态，透明质酸的产量及产率系数也均为最高，无论增加或是降低MnSO4(4H2O的浓度，发酵结果均有较大的下降。 表6-2-7 种子中MnSO4(4H2O浓度对发酵的影响 MnSO4(4H2O /g(L-1 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25  Seed 生物量 /g(L-1 0.918 1.131 0.854 0.849 0.790  发酵 葡萄糖 /g(L-1 1.08 0.75 0.93 1.17 1.45   透明质酸 /g(L-1 0.185 0.271 0.240 0.203 0.162   透明质酸产率 /g(g-1 0.0063 0.0083 0.0078 0.0072 0.0064  三、种子生长过程曲线和种龄的确定 种子质量的优劣不仅与培养基组成有关，还与种子的生理性状有关。当传代菌种接入种子瓶(罐)中，要经过延滞期，对数生长期，静止期和死亡期。种龄太低的种子接入发酵罐中，往往会出现前期生长缓慢、整个发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，甚至造成异常发酵；种龄过长则会引起菌体过早自溶，导致产物生产能力下降。通常，种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期后期，且培养液中细胞干重还未达到最高峰时较为合适，这样既可保持高的细胞活力，又可获得尽可能多的细胞干重。 图6-2-1为S. zooepidemicus H23在种子培养基的生长过程曲线。从图中可以看出，菌种接入种子培养基3～4 h后进入对数生长期，18 h左右细胞干重达到最高峰，在此之后，细胞干重开始下降。因此选择接种种龄为15~16 h。
图6-2-1 透明质酸生产菌株H23的种子生长曲线 四、发酵培养基组成对透明质酸发酵的影响 (一)不同氮源对透明质酸发酵的影响 如表6-2-8所示，当发酵培养基的氮源采用酵母粉时，菌体生长最好，透明质酸产量也最高，接近0.3 g/L。酵母粉和蛋白胨的混合氮源及玉米浆居其次，其余均很低。不加氮源仅利用种子中带入的氮源也可生长一定量菌体和合成一定的透明质酸。而采用无机氮源(NH4)2SO4时，透明质酸产量和细胞干重都是实验组中最低的，说明(NH4)2SO4对菌体的代谢有抑制。表6-2-8还表明采用不同氮源时，细胞干重高，透明质酸产量也高。很多链球菌对营养要求比较高，而酵母粉中还含有大量的生长因子，这也是Streptococcus zooepidemicus H23以酵母粉为氮源时生长和发酵较好的原因之一。但菌株不同，情况可能不一样，如姚敏杰等发现对于马链球菌(Streptococcus equi) N2506，蛋白胨是最好的氮源。 表6-2-8 培养基的不同氮源组成对透明质酸产量的影响 氮源 (10g(L-1) 透明质酸 /g(L-1 生物量 /g(L-1  YE 0.29 0.43  BE 0.09 0.18  Pep 0.05 0.10  Cystine 0.03 0.14  CSL 0.20 0.37  SCHP 0.11 0.14  YE(5g(L-1)+BE(5g(L-1) 0.13 0.26  YE(5g(L-1)+Pep(5g(L-1) 0.23 0.35  BE(5g(L-1)+Pep(5g(L-1) 0.10 0.25  (NH4)2SO4 (2g(L-1) 0.03 0.05  对照 0.06 0.08  注∶YE，酵母膏；BE，牛肉膏；CSL，玉米浆；Pep，蛋白胨；SCHP，豆饼水解液 (二)酵母粉浓度对透明质酸发酵的影响 如表6-2-9所示，酵母粉浓度增加，对细胞生长、葡萄糖消耗和透明质酸生产均有促进作用。当其浓度为20 g/L时，透明质酸的含量、细胞干重、细胞产率均达到最大值，残糖最低。继续提高酵母粉的浓度，残糖升高，细胞干重和透明质酸都逐渐下降，但透明质酸产率反而上升。表明虽然透明质酸产量随酵母粉浓度的继续升高而下降，但却有更大比例的碳源转化为透明质酸。Amstrong等在对一株链球菌进行研究后认为，在菌体生长阶段，生长代谢和产物合成之间对碳源和能量的利用存在着竞争。可以认为酵母粉中含有更有利于透明质酸合成的因子，使得透明质酸产率随酵母粉浓度的增多而不断提高。因此，在以后的实验中选用酵母粉作为氮源，浓度20 g/L。 表6-2-9 酵母粉浓度对发酵结果的影响 酵母粉 /g(L-1 10 15 20 25 30 35  剩余葡萄糖 /g(L-1 24.4 21.2 16.4 18.2 21.4 22.8  生物量 /g(L-1 0.76 0.91 1.35 1.16 1.00 0.90  细胞产率 /g(g-1 0.034 0.036 0.044 0.041 0.10 0.038  透明质酸 /g(L-1 0.30 0.34 0.41 0.40 0.39 0.38  透明质酸产率 /g(g-1 0.014 0.013 0.013 0.014 0.016 0.016  注∶初始葡萄糖浓度为46.8 g/L。 (三)碳源种类对发酵的影响 不同微生物对碳源的利用情况不同。图6-2-2为H23菌株利用几种常见碳源合成透明质酸的情况。以葡萄糖作为碳源，透明质酸产量最高，其后依次是蔗糖和麦芽糖。而果糖、木糖、半乳糖等利用情况不好。考虑到研究的方便，选用葡萄糖作为碳源。
图6-2-2 发酵培养基中不同碳源对透明质酸产量的影响 (四)葡萄糖浓度对发酵的影响 如图6-2-3所示。细胞干重和细胞产率随初糖浓度升高而下降，而透明质酸的产量及产率则呈相反趋势。可以看出较低的初糖浓度有利菌体生长，促进碳源向菌体的转化。虽然随着初糖浓度的升高糖消耗量不断增加(数据未给出)，但细胞干重却不断下降，所以细胞产率也不断下降；透明质酸产量和透明质酸产率随着初糖浓度的升高而升高，表明在较高的初糖浓度下有更多的底物转化为产物。 从代谢流角度来考虑，初糖浓度直接影响着碳源代谢的流向。初糖浓度较高时，碳源更多的流向产物的合成，只有较少比例用于合成菌体。随着发酵的进行，大量副产物的形成抑制了菌体的生长和产物的形成，使得初糖浓度较高的条件下的残糖浓度也较高。根据以上分析，认为采用40 g/L的初糖浓度进行摇瓶发酵较为合适。
图6-2-3 不同初糖浓度对菌体和产物的影响 ◆ 透明质酸；▲ 生物量；■ Yp/s；＊ 细胞产率 (五)Mg2+对发酵的影响 在透明质酸的合成途径中，透明质酸合成酶是一个关键酶，它催化透明质酸的前体转化成透明质酸，Mg2+的浓度对此酶的活性影响很大。表6-2-10列出了不同MgSO4浓度对透明质酸发酵的影响。随着MgSO4浓度的逐步增大，葡萄糖消耗增加。当MgSO4浓度从0.4 g/L升至2.0 g/L时，透明质酸的产量逐渐达到最高，同时，细胞干重也达到最大值；继续增大浓度，透明质酸的产量和细胞干重均开始下降。 表6-2-10 MgSO4对透明质酸发酵的影响 MgSO4(7H2O / g(L-1 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 3.2 3.6  剩余葡萄糖 / g(L-1 16-4-9 11.1 10.4 10.4 8.0 7.4 5.4 6-4-2 3.4  生物量 / g(L-1 1.16 1.20 1.17 1.25 1.33 1.47 1.20 1.32 1.22  透明质酸 / g(L-1 0.15 0.18 0.23 0.27 0.32 0.30 0.28 0.28 0.28  透明质酸产率 / g(g-1 0.010 0.0097 0.012 0.014 0.014 0.013 0.011 0.011 0.011  (六) Streptococcus zooepidemicus H23菌株发酵培养基组成的正交优化 以上考察了单因素对发酵的影响，但由于生化实验的特点，往往各个实验批次之间的差别较大，较优工艺条件的确定需要对各因素进行综合考察。正交试验设计是用正交表来安排少量的试验，从多个因素中分析出主次，以及它们对试验的影响规律，从而找出较优的工艺条件。本实验选择了对菌体生长和产物合成有较大影响的酵母粉、葡萄糖以及Mg2+，安排了三因素三水平的正交实验方案，表6-2-11为正交试验因素水平表，表6-2-12正交实验方案和实验结果的分析，表6-2-13为正交试验方差分析。 由方差分析可知三因素中酵母粉是影响较为显著的因素。从表6-2-12的直观分析中可以看出，三个因素对发酵影响的显著性主次顺序为C→A→B。可以看出最佳配方为A2B2C2，即葡萄糖浓度为40 g/L，MgSO4(7H2O浓度为2.0 g/L，酵母粉浓度为20 g/L。 表6-2-11 正交试验因素水平表 水平 因子 MgSO4(7H2O /g(L-1 葡萄糖 /g(L-1 酵母粉 /g(L-1   1 1.8 30 15   2 2.0 40 20   3 2.2 50 25  表6-2-12 正交实验方案和实验结果的分析 run MgSO4(7H2O 葡萄糖 酵母粉 透明质酸 透明质酸产率  1 1 1 1 0.123 0.0151  2 1 2 2 0.307 0.0942  3 1 3 3 0.241 0.0581  4 2 1 3 0.251 0.0630  5 2 2 1 0.214 0.0456  6 2 3 2 0.236 0.0557  7 3 1 2 0.258 0.0666  8 3 2 3 0.136 0.0185  9 3 3 1 0.172 0.0296  K1 0.671 0.632 0.509 =1.938 =0.4466  K2 0.701 0.657 0.801    K3 0.566 0.649 0.628    K12 0.450 0.399 0.259    K22 0.491 0.432 0.641    K32 0.320 0.421 0.394    Ki2 1.262 1.252 1.295     表6-2-13 正交试验方差分析 误差来源 平方和 自由度 方差 F 显著性  MgSO4(7H2O 0.0034 2 0.0017 0.292   葡萄糖 0.0001 2 0.00005 0.009   酵母粉 0.0144 2 0.0072 1.255 *  误差 0.0114 2 0.0057    总和 0.0293 7     F0.25(2.2)=3.00 五、培养条件对透明质酸发酵的影响 (一)温度对透明质酸发酵的影响 如表6-2-14所示。发酵温度为33℃时，透明质酸产量最高，达0.47 g/L。而细胞干重却在高温下更高，39 ℃时达1.20 g/L。从产率系数上看，33℃时，透明质酸产率最高；相应地，39 ℃时，细胞产率最高。可以看出，高温有利菌体生长，碳源更多地转化为菌体，但不适合透明质酸的形成。 表6-2-14 不同温度对透明质酸发酵的影响 温度 /℃ 30 33 35 37 39  剩余葡萄糖 /g(L-1 9.0 7.7 7.7 8.6 9.5  生物量 /g(L-1 0.49 0.46 0.56 0.76 1.20  透明质酸 /g(L-1 0.29 0.47 0.34 0.31 0.30  透明质酸产率 /g(g-1 0.0137 0.0211 0.0157 0.0146 0.0144  (二)供氧对透明质酸生产的影响 Streptococcus zooepidemicus H23是一株兼性厌氧菌，供氧状况直接影响其生长代谢及代谢调控方式。本实验采用不同的装液量以及厌氧的方式，考察了不同供氧对发酵的影响，结果如表6-2-15所示。实验结果显示，并非是供氧愈充分，菌体生长和产物形成愈好。当500 mL三角瓶装液量为40 mL时，透明质酸的产量出现一个峰值，少于40 mL或多于40 mL，透明质酸的产量均会下降。但对于细胞干重来说，却有一个与透明质酸相反的趋势，即在40 mL时，细胞干重最低。说明控制合适的通风量可以提高透明质酸产量及其产率系数。厌氧发酵时菌体也可大量生长，并合成较多的透明质酸，但与供氧条件合适时的发酵结果相比有一定差距。 表6-2-15 装液量对透明质酸发酵的影响 培养基体积 / mL 20 30 40 50 60 70 厌氧培养  剩余葡萄糖 /g(L-1 26.6 25.1 20.9 22.2 21.6 20.8 22.8  生物量 /g(L-1 0.76 0.71 0.68 0.84 1.08 1.11 0.93  细胞产率 /g(g-1 0.057 0.048 0.036 0.047 0.059 0.058 0.054  透明质酸 /g(L-1 0.18 0.20 0.29 0.23 0.21 0.21 0.22  透明质酸产率 /g(g-1 0.0137 0.0136 0.0150 0.0130 0.0115 0.0107 0.0129   通风发酵能获得较高的透明质酸浓度和产率系数的原因，可能是由于氧的存在，使中间产物丙酮酸更多地被氧化成乙酸，从而得到更多的能量。由于在摇瓶条件下不能对发酵的pH值进行较好的控制，而发酵过程中产生大量乙酸和乳酸，抑制了菌体的生长和代谢，因此产物浓度难以有很大提高。 六、透明质酸摇瓶发酵过程曲线 图6-2-4为典型的摇瓶发酵过程曲线。可以看出，种子接入发酵培养基后约3 h，细胞生长开始进入对数生长期，约13h到达最高点0.9 g/L；透明质酸也表现出相同的趋势，发酵至12h，透明质酸产量达到最高，为0.37 g/L，表明透明质酸的形成与细胞生长是偶联的。此后，菌体浓度和透明质酸的产量略有下降，葡萄糖的利用速度变缓。
图6-2-4 H23菌株的摇瓶发酵过程曲线 七、透明质酸摇瓶补料发酵实验 在分析了透明质酸摇瓶发酵过程曲线的基础上，根据透明质酸的发酵特征，作者采用一定总糖，不同时间分批加入的方法，考察了碳源供给方式的变化对摇瓶发酵的影响，结果见表6-2-16。由表可知，简单的补料方式并不能促进透明质酸的发酵生产。初糖浓度高时，不仅透明质酸最终产量高，而且透明质酸产率也高，但菌体生长却不好，同时细胞产率也比较低。 表6-2-16 摇瓶发酵中分批和补料发酵对结果的影响 补料方式 方式1 方式2 方式3  剩余葡萄糖 /g(L-1 36.3 31.2 26.0  生物量 /g(L-1 0.40 0.65 0.88  细胞产率 /g(g-1 0.038 0.041 0.042  透明质酸 /g(L-1 0.43 0.41 0.35  透明质酸产率 /g(g-1 0.041 0.026 0.017  方式1∶初始葡萄糖 46.8 g/L 方式2∶初始葡萄糖 31.2 g/L，10 h补加15.6 g/L的葡萄糖 方式3∶初始葡萄糖 15.6 g/L ，5 h和10 h分别加入15.6 g/L 的葡萄糖 第三节 分批发酵生产透明质酸条件的研究 一、引言 Streptococcus zooepidemicus在生长过程中，会产生大量的乳酸。在摇瓶发酵过程中，由于不能控制pH，因此发酵液pH会降低至5.0左右，导致菌种的生理特性及代谢机制发生变化，使得摇瓶发酵透明质酸最高产量仅为0.4 g/L左右。小型发酵罐易于操作，可以通过控制溶氧浓度、温度、pH等来控制发酵，为进一步研究Streptococcus zooepidemicus H23菌株的发酵特性和生产性能，采用小型发酵罐，在分批发酵中考察了营养和环境条件对透明质酸产量和分子量的影响，提出了较为适宜的分批发酵培养条件；同时分析了S. zooepidemicus菌体生长、产物形成等动力学参数，对发酵过程动力学进行了研究，为建立透明质酸分批发酵动力学模型，进而对发酵过程的优化和控制打下了基础。 二、初糖浓度对透明质酸发酵的影响 (一)初糖浓度对菌体生长的影响 摇瓶研究发现，葡萄糖是S. zooepidemicus H23发酵的最适碳源，初糖浓度40 g/L最有利于摇瓶发酵，但由于菌体在生长过程中产生大量乳酸，使pH在发酵过程中迅速下降，微生物的生长和代谢规律仅为特定条件下的规律。 首先在控制pH的基础上进一步考察了不同初始葡萄糖浓度下H23菌株的发酵过程，如图6-3-1所示。在较低的初糖浓度下，菌体的生长延迟期较短，而当初糖浓度为93 g/L时则有明显的生长延迟现象。从底物消耗曲线(图6-3-2)同样可以看出，菌体进入快速糖耗阶段的时间随初糖浓度升高而延迟∶初糖浓度为93 g/L时，发酵开始10 h内，几乎没有底物消耗，因此可以认为高初糖浓度对菌体生长有抑制作用。

图6-3-1不同初糖浓度下的菌体生长曲线 图6-3-2不同初糖浓度下葡萄糖消耗曲线 初糖浓度(g/L): ◆ 30；■ 50.5；▲ 64；● 93 (二)初糖浓度对产物生成的影响 图6-3-3为S. zooepidemicus H23在不同初糖浓度下合成透明质酸的过程曲线，发酵结果的比较列于表6-3-1。可以看出，透明质酸合成与菌体生长偶联，透明质酸合成的延迟期与菌体生长的延迟期一致。结合图6-3-1和图6-3-3可知，初糖浓度越高，细胞量越多，发酵结束时所获得的透明质酸产量也越高。但同时也可以看出，虽然细胞干重和透明质酸产量随着初糖浓度的提高而增加，但透明质酸的增加幅度并不与底物浓度的增加成正比。从表6-3-1可以看出，透明质酸对碳源的产率系数(透明质酸产率)在较低的初糖浓度下为0.05 g/g以上，提高初糖浓度，透明质酸产率则迅速下降。此外，从图6-3-3还可以看出，高初糖浓度时，生长后期透明质酸的合成速度明显下降。表明虽然菌体生长可以继续进行，但透明质酸合成在发酵后期受到强烈的抑制。

图6-3-3不同初糖浓度下的透明质酸变化曲线 图6-3-4不同初糖浓度下的乳酸变化曲线 初糖浓度(g/L): ◆ 30；■ 50.5；▲ 64；● 93 表6-3-1 初糖浓度对发酵结果的影响 葡萄糖 /g(L-1 30 50.5 64 93  透明质酸 /g(L-1 1.62 2.71 2.98 3.92  透明质酸产率 /g(g-1 0.054 0.054 0.046 0.042  乳酸 /g(L-1 19.6 41 59.5 81.3  乳酸产率 /g(g-1 0.65 0.81 0.92 0.93  M(((106Da) 1.68 1.71 1.76 1.80  M(: 粘均分子量
图6-3-5 乳酸浓度对透明质酸合成的影响 初糖浓度(g/L): ◆ 50.5；■ 64；▲ 93 许多链球菌的生长都伴随着乳酸的形成，成为工业用乳酸生产菌株。S. zooepidemicus H23菌株在产透明质酸的同时也会产生大量乳酸(图6-3-4)。由图6-3-4及表6-3-1可以看出，微生物将80%左右的底物转化为乳酸，当总糖浓度分别为30 g/L、50.5 g/L，64 g/L和93 g/L时，乳酸相应产量可达19.6 g/L，42.5 g/L，59.5 g/L和81.3 g/L。乳酸的合成同样也是偶联于菌体生长的。将透明质酸浓度对乳酸浓度作图，如图6-3-5，可以发现当乳酸浓度达30g/L以上后，透明质酸合成已基本停止或只有少量的增加。可以认为乳酸浓度为30 g/L是对透明质酸合成抑制作用的转折点，在此浓度以上对透明质酸合成的抑制极为强烈，而在此浓度以下乳酸抑制会大为减轻。 对以上实验结果分析，可以发现初糖浓度对菌种H23的生产性能有很大的影响：高初糖浓度对菌体生长和透明质酸形成产生抑制，而发酵过程中产生的乳酸同样会抑制菌体生长和透明质酸形成。初糖浓度小于50g/L时，细胞干重和透明质酸产量都明显偏少；而当初糖浓度较高时，透明质酸产率系数降低，发酵时间延长，生产强度偏低。综合考虑透明质酸的产量、产率系数、生产强度，分批发酵生产透明质酸采用50 g/L左右的初糖浓度较为适宜。 三、pH对透明质酸发酵的影响 (一)pH值对菌体生长的影响 pH是一项重要的发酵参数，它对菌体的生长和产物的积累有很大的影响，发酵液pH影响微生物细胞原生质的电荷，引起各种酶活力的改变，影响菌体对底物的利用速度和细胞的结构，以致影响菌体的生长和产物的合成。 图6-3-6为不同pH下的菌体生长曲线。由图可以看出，pH7.0时细胞生长最好，表明H23菌株适合在中性条件下生长。摇瓶发酵中如不对pH进行控制，pH将迅速下降到5.0左右，对菌体的生长产生了明显的抑制。可见要使H23菌株进行正常的发酵，须将pH控制在7.0左右。

图6-3-6不同pH下的菌体生长曲线 图6-3-7不同pH下葡萄糖消耗曲线 pH: ◆ 6.0；■ 6.5；▲ 7.0；● 8.0 (二)pH值对产物合成的影响 图6-3-8和6-3-9分别为不同pH下发酵产物透明质酸和乳酸合成的过程曲线。可以看出pH对菌体合成透明质酸和乳酸有不同的影响。pH7.0时透明质酸产量最高(2.6 g/L)，表明pH 7.0不仅是细胞的最适生长pH，也是透明质酸合成的最适pH。

图6-3-8不同pH下的透明质酸变化曲线 图6-3-9不同pH下的乳酸变化曲线 pH: ◆ 6.0；■ 6.5；▲ 7.0；● 8.0 不同pH下乳酸的最终产量是相同的(pH8.0除外)，但在pH6.5时，菌体合成乳酸速度最快(图6-3-7)；葡萄糖消耗速度也最快(图6-3-7)。pH值对透明质酸分子量影响不大，只有在pH6.0时分子量才明显降低(表6-3-2)。 表6-3-2 控制不同pH对透明质酸分批发酵的影响 pH 6.0 6.5 7.0 8.0  初始葡萄糖 /g(L-1 53.8 53.3 50.5 66  剩余葡萄糖 /g(L-1 6-4-3 0.8 1.0 46.3  透明质酸 /g(L-1 2.1 2.4 2.6 0.90  透明质酸产率 /g(g-1 0.039 0.045 0.051 0.048  乳酸 /g(L-1 40.7 40 41 5.4  乳酸产率 /g(g-1 0.76 0.75 0.81 0.27  M( /((106Da) 1.58 1.64 1.71 1.68  四、温度对透明质酸发酵的影响 如图6-3-10、6-3-11及表6-3-3所示。从图6-3-10可以看出，随着温度的升高，细胞生长速度加快。但温度太高不利于透明质酸合成。从图6-3-11可以看出，35℃时透明质酸产量最高为3.9 g/L，而39℃时透明质酸最终浓度仅2.1 g/L。培养温度33℃时，细胞生长速率降低，发酵时间延长，透明质酸合成速度也降低，但透明质酸产量最终也可达到3.4 g/L。

图6-3-10不同温度下的菌体生长曲线 图6-3-11不同温度下的透明质酸变化曲线 温度(℃): ◆ 33；■ 35；▲ 37；● 39 由表6-3-3可以看出，随着培养温度的升高，乳酸产量迅速增加，而透明质酸分子量却反之。Armstrong和Johns也发现低的培养温度可以获得高分子量透明质酸。综合考虑各项指标，可以认为35℃是较为合适的小罐发酵温度。 表6-3-3 温度对发酵结果的影响 温度 /℃ 33 35 37 39  透明质酸 /g(L-1 3.4 3.9 2.6 2.1  透明质酸产率 /g(g-1 0.067 0.074 0.051 0.041  乳酸 /g(L-1 29.7 31.1 40.8 45.7  乳酸产率 /g(g-1 0.58 0.60 0.81 0.89  M( /((106Da) 1.96 1.82 1.71 1.65  五、搅拌转速对透明质酸发酵的影响 搅拌对发酵体系的传质有着重要的作用，但过高的搅拌转速，会产生很大的剪切作用，可能对所培养的菌体细胞造成伤害，影响丝状透明质酸分子的分子量。透明质酸溶液是一种高粘度的非牛顿型流体，具有常见发酵液所没有的流变学特性，使得搅拌在透明质酸发酵过程中具有特殊的作用。 表6-3-4 搅拌速度对透明质酸发酵的影响 搅拌转速 /r(min-1 透明质酸 /g(L-1 透明质酸产率/g(g-1  300 2.7 0.055  450 3.6 0.074  650 6-4-1 0.080  850 2.6 0.051   表6-3-4为不同搅拌转速下的透明质酸发酵结果，可以看出，搅拌转速小于650 r/min时，透明质酸的产量和产率系数随着搅拌转速的增加而增加，这是因为，透明质酸的形成使发酵液的粘度显著增加，而透明质酸溶液是假塑性流体，具有剪切变稀的特性，高搅拌转速时，发酵液传质、传氧性能得到改善，有利于菌体生长和产物合成。同时，由于荚膜会阻止营养物质进入细胞，影响细胞的生长代谢和透明质酸的合成，较高的搅拌转速能使荚膜更快地脱落，解除荚膜对细胞吸收营养物质的阻碍。搅拌转速达850及r/min会使透明质酸产量迅速下降的可能原因是过高的搅拌转速对菌体细胞产生伤害，虽然菌体还能生长，但受损细胞合成透明质酸的能力大大下降；同时高搅拌转速时，溶氧浓度增高，可能对透明质酸合成也产生抑制。 六、通气量对透明质酸发酵的影响 通气量是影响供氧的一个重要因素，增大通气量可以增加罐内截面气速，增加发酵液的气含率，从而使气-液比表面积增大，有利于氧的传递。但是，通过增加通气量以提高氧传递速率的效果是呈递减性的，即当气流速度较大时，再增加其速度对提高氧传质效率的作用变小。从表6-3-5可以看出，相对较低的通气量对合成透明质酸有利。 表6-3-5 不同通气量对发酵结果的影响 通风量 /L(L-1(min-1 透明质酸 /g(L-1 透明质酸产率 /g(L-1 乳酸 /g(L-1 乳酸产率 /g(L-1 M( /106Da 生物量 /g(L-1  2 2.60 0.051 41.0 0.81 1.71 3.30  4 2.41 0.049 36-4-6 0.84 1.97 3.78  七、分批发酵培养条件的优化与控制 根据以上实验结果可确定出较优的分批发酵条件为∶初糖浓度50 g/L，pH7.0，培养温度35℃，搅拌转速650 r/min，通气量2 L/(L(min)。采用这一工艺条件进行实验，结果如表6-3-6中的条件1。从表可以看出，较优条件下虽然透明质酸分子量有所提高，但所得透明质酸产量值大大低于单因素实验的结果，表明优化工艺并不是单因素条件的简单加和。经过进一步的研究，实验确定了较优的工艺条件组合为∶初糖浓度50 g/L，培养温度37 ℃，pH7.0，搅拌转速650 r/min，通气量2 L/(L(min)。在此条件下透明质酸产量达到4.1 g/L。产生这种现象的主要原因在于多种因素间的交互作用，几种培养条件同时影响一种或几种细胞生长代谢的内在因素。在许多发酵的培养基或培养条件优化时都有类似的现象。 表6-3-6 不同发酵条件对发酵结果的影响 发酵条件 结果  搅拌转速 /r(min-1 温度 /℃ 初始葡萄糖 / g(L-1 pH 透明质酸 /g(L-1 透明质酸产率 /g(g-1 M( /((106Da)  650 35 50 7.0 3.3 0.058 1.96  650 37 50 7.0 4.1 0.080 1.90  850 35 50 7.0 3.9 0.074 1.82   第四节 透明质酸分批发酵动力学及分批发酵过程模型化 一、引言 生物反应工程是生化工程的一个重要组成部分，其任务就是以生化反应动力学为基础，进行生物反应过程的工程分析及开发，以及生化反应器的设计、放大、操作及控制等。其研究的基本方法有两种，即数学模型法和经验法。数学模型不但能动态地、从本质上反映出各变量之间的关系，而且是应用现代科学手段于工业生产的必要条件。随着生物技术的深入发展，单凭经验和经典的试验数据已无法满足生产过程优化和控制的要求。生物反应过程的模型化为更好地开发生物技术过程提供了基础。 从分批发酵的研究可以看出，对透明质酸发酵过程进行单一控制难以达到最大生产的目的。透明质酸发酵过程的优化控制能否实现，取决于我们对发酵过程中菌体生长、底物消耗、产物生成的动态平衡及内在规律是否有充分的认识。为此，本节以功能单元假设为前提，以统计热力学为理论基础，结合经典微生物动力学模型建立方法，考虑产物对微生物生长的抑制，在理论推导的基础上提出了关于分批培养的菌体生长、各种产物合成及底物消耗动力学模型，为进一步研究做好理论准备。 二、理论与模型建立 统计热力学是研究微生物宏观行为的一种常用方法。Tan等采用统计热力学手段，提出了描述微生物在单一底物限制条件下生长的功能单元理论。作为一种较为通用的方法，它为许多经验模型，如Monod模型、Moser模型及其修正模型提供了独特的理论基础，并显示出广泛的适用性。方程6-4-1、6-4-2分别为透明质酸ldane-Andrews和Yano等提出的有底物抑制项的细胞生长动力学模型，应用Tan的理论可以对其进行较好地解释。
(6-4-1)
(6-4-2) (一)模型假设 (1)每个微生物细胞都具有一定量的基本功能单元，如连接底物，释放胞内物质等，其中起着重要作用的是酶、酶复合物或其它底物受体，每一个功能单元都有着一整套催化分解和合成反应等细胞所要求的代谢功能，并且有多个底物的连接位点。 (2)抑制物(包括底物和产物)对微生物生长的抑制，即为抑制物对功能单元的抑制，是通过阻碍物质的运输等行为而使得细胞胞内体系发生改变，从而使细胞的生长受到阻碍。例如，产物对细胞生长的抑制，是因为产物与那些负责运输或吸收细胞生长所需底物的功能单元相结合，使该单元对底物的吸收能力降低或消失，造成胞内底物的限制；一种产物对另一种产物的抑制是因为前者与负责传输后者的功能单元结合后，不能将后者正常释放出胞外，从而造成胞内该物质的积累，形成反应途径的反馈抑制效应，表现出细胞合成该产物能力的下降。 (二)统计热力学理论在细胞培养动力学中的应用 根据统计热力学巨正则系综合理论(grand canonical ensemble in statistics thermodynamics )，可以对功能基团所处状态进行定量描述，得到其与i (i=0,1,((((((,n)个底物分子连接的概率，这种概率可用于推导描述微生物过程的数学表达式：
(6-4-3) 其中(为比速率，S为功能单元的作用底物，(、(为底物与功能单元相连接时的能量系数或初始反应速度常数，m表示S与功能基团的连接位点，当S与功能单元的m个连接位点中有x个抑制位点时，方程6-4-3变为：
(6-4-4) 将方程6-4-3，6-4-4扩展到有抑制物存在时的状态：
(6-4-5)
(6-4-6) 其中P为功能单元的抑制物，(为抑制物与功能单元相连接时的能量系数或初始反应速度常数，n表示P与功能基团的连接位点数。 若底物与功能单元有两个连接位点，其中一个为抑制位点，即m=2，x=1，方程6-4-6简化为：
(6-4-7) 当仅有一个抑制物连接位点时，即n=1时，方程可进一步简化为：
(6-4-8) (三)S. zooepidemicus H23发酵过程动力学模型的推导 1、菌体生长模型 从前面的研究可知，streptococcus zooepidemicus H23在合成透明质酸的过程中大部分碳源都转化成乳酸。乳酸发酵是一种典型的产物抑制型生物反应过程，发酵液中乳酸的积累对细胞生长和产物积累都会产生很强的抑制作用。 对于抑制型的微生物生长，已有许多经验模型来描述：
(6-4-9)
(6-4-10)
(6-4-11) 方程6-4-9~6-4-11都为底物抑制型细胞生长动力学方程。其中6-4-10式为Logistic模型的修正形式，当(=1时即为Verhulst-Pearl方程，由于其为典型的S型曲线，所以具有广泛的适用性。Logistic模型曾被用于描述微生物聚合物生产过程的细胞生长动力学。6-4-11式常用来描述乳酸菌生产乳酸、醋酸菌由酒精生产乙酸等微生物反应动力学。但它们并不能很好地描述S. zooepidemicus H23受底物及乳酸产物抑制的动力学行为。本文根据功能单元假设和统计热力学理论的数学表达式6-4-3~6-4-8，提出H23菌株生长的动力学数学模型：
(6-4-12) 其中(max为菌体最大比生长速率(h-1)，Ks为底物半饱和常数(g/L)，KLA为乳酸抑制常数，Ki为底物抑制常数(g/L)，A、B1、B2、C为常数。 2、产物合成模型 H23菌株厌氧发酵过程中，透明质酸和乳酸是仅能检出的胞外产物，而在通风发酵过程中会产生少量的乙酸。由于乙酸的产量较低(正常发酵过程仅为乳酸量的10%)，在本研究中，细胞合成的产物仅考虑透明质酸和乳酸。透明质酸和乳酸的生成与菌体的生长相偶联。但当乳酸积累到一定浓度时，透明质酸合成速度明显变慢，说明乳酸对透明质酸的合成表现出比对菌体的生长更为强烈的抑制作用。同时，乳酸的产生对细胞继续合成乳酸也会产生抑制作用。 Gaden将产物生成与菌体生长及底物消耗相关联，定性地将发酵过程分为三种类型，一型为生长偶联型，比底物消耗速率(、比产物合成速率(、比生长速率(基本同步；二型为生长半偶联型，当(、(降低至一定值后，(开始增加，以后(、(、(同步变化且同期达到最高；三型为生长非偶联型，(、(降至最低后，(开始增加，并逐步至最大。Luedeking 和Piret对产物形成速率与细胞生长速率及细胞浓度的关系进一步研究后，提出了Luedeking-Piret方程，即方程6-4-13：
(6-4-13) 其中(，(为常数。其后Kono 和Asai等对不同生长类型的不同生长期产物、菌体和底物间转化率与Luedeking-Piret方程中的参数间的关系进行了研究，结果如表6-4-1。 表6-4-1 不同发酵类型菌体、产物、底物的相互转化率及Luedeking-Piret方程中(，(值 类型 阶段 


( (  一型  Yx/s Yp/s Yp/x Yp/s 0  二型 生长期 Y'x/s 0 0 0 0   产物合成期 Y''x/s Y''p/s (Y''p/s>>Y''x/s) Y''p/x 
 三型 生长期 Y'x/s 0 0 0 0   产物合成期 Y''x/s Y''p/s Y''p/x 
  根据以上对透明质酸发酵的分析，结合方程(6-4-13)，提出H23菌株发酵过程中透明质酸和乳酸形成的动力学模型如下：
(6-4-14)
(6-4-15) 其中PHA、PLA为透明质酸和乳酸浓度(g/L)，(HA、(LA为偶联常数(g/L)，k1、k2为乳酸对透明质酸和乳酸的抑制常数，('0、('1、(''0、(''1为常数。 3、底物消耗模型 根据物料平衡，限制性底物的消耗通常可以分为三部分，即用于菌体生长的、用于产物合成的和用于细胞内源维持的消耗。综合透明质酸发酵过程，底物消耗动力学可以用下式表示：
(6-4-16) 由于透明质酸只占底物消耗量的小部分，可以将透明质酸项和菌体项合并；若底物对菌体和产物的转化率恒定，则方程6-4-16可以简化为：

(6-4-17) 其中细胞产率、透明质酸产率、乳酸产率为底物对菌体、透明质酸、乳酸的转化率(g/g)，
，
，me为菌体的内源维持常数(h-1)。 三、乳酸对透明质酸发酵的影响 从前面研究可知，乳酸对透明质酸发酵过程有一定的抑制作用，为进一步明确乳酸对发酵的影响，在摇瓶发酵中，采用在初始培养基加一定量乳酸的方法，考察乳酸量与菌体生长和产物形成的关系，结果如图6-4-1所示。可以看出，加入乳酸后细胞生长、透明质酸形成都受到抑制，而乳酸对自身的合成也有强烈的抑制。随着乳酸添加量的增加，其抑制作用越明显。
图6-4-1 发酵液中乳酸的添加量对发酵的影响 ◆ 葡萄糖；■ 生物量；○ 透明质酸 四、动力学模型参数的求解 生物技术过程的数学模型，实际上是过程输入向量、输出向量和状态向量之间的数学表达式。数学模型的建立，通常有理论分析和实验两种方法。对于复杂的生物技术过程而言，其内部规律往往是不太清楚的，因而不能单靠理论分析方法来建立数学模型，必须采用实验的方法，即系统辨识的方法，才能建立。模型参数的估计是系统辨识的核心。 在研究一个被控系统过程时，通常建立的输入输出模型是：
式中：Y为系统的m维输出向量；X为系统的r维输入向量；K为要估计的n维未知参数。按一定的实验方案对被控过程进行一定的观测，取得m组数据
， Y、X及参数之间的关系即由这m组数据决定。Y与X的函数关系，即数学模型，通常可分为三种，线性关系、非线性关系及微分方程型。其中微分方程模型是描述生物技术过程最常用的数学形式。估计微分方程模型中的参数可采用解析法和数值解法。解析法常因积分困难而难于采用，而数值解法不受参数数目多少的限制，不受动力学形式和实验方法的约束，因而具有普遍的适用性。常见的方法有龙格-库特法，鲍威尔法等。在获得模型的数值解，即过程的无噪声输出后，按“离差平方和”最小原则，确定性能指标，求取模型中的K值。常见的方法有单纯形搜索法、最速下降法等数值寻优方法。图6-4-2为系统辨识过程中采用计算机程序进行微分方程模型参数估计的基本框图。
图6-4-2 数值解法求取微分形式动力学数学模型中参数的基本程序框图 前面根据扩展的功能单元理论得到了微分形式的S. zooepidemicus H23生长代谢的动力学模型(6-4-12)、(6-4-14)、(6-4-15)和(6-4-17)式：
(6-4-12)
(6-4-14)
(6-4-15)
(6-4-17) 根据上述参数求解方法，采用龙格库特法求取方程数值解，用单纯形法对初糖浓度为50 g/L时的实验数据(图6-4-3)进行参数拟合，寻出最优参数，如表6-4-2所示。 表6-4-2 透明质酸发酵动力学方程参数 参数 模拟值 参数 模拟值  A 10268.08 (max 1.10  B1 9349.06 Ks 1(10-4  B2 563.76 Ki 16.85  C 9230.8 KLA 1.01  ('0 0.34 (HA 2.94  ('1 0.013 k1 26.15  (''0 0.032463 (LA 30.76  (''1 0.001297 k2 24.67  n1 0.93517 
0.935  n2 0.91 乳酸产率 1.10  me 0.483919 me 0.484  

图6-4-3 初糖浓度为50 g/L时发酵过程实验值与动力学模型拟合曲线 ○ 葡萄糖；△ 细胞干重；＊ 乳酸；■ 透明质酸 五、动力学模型的适用性 为了解模型准确反映过程状况的程度，在不同初糖浓度下对模型的适用性进行了考察，图6-4-4~6-4-6为不同初糖浓度的发酵结果与模型预测曲线图。从图6-4-3及图6-4-4~6-4-6中实验结果的误差线(10%)可以看出，在初糖浓度为40 g/L~60 g/L的范围内除个别实验点外，模型计算值与实验结果的偏差均小于10%。只有初糖浓度为80 g/L时，发酵后半期模型计算值与实验结果出现较大的偏差。由此说明本文所建立的模型可以在较大的范围内准确地预测实验结果，可以用于描述正常实验条件下透明质酸分批发酵过程。

图6-4-4 初糖浓度为40 g/L时动力学模型预测曲线及实验值 ○ 葡萄糖；△ 细胞干重；＊ 乳酸；■ 透明质酸

图6-4-5 初糖浓度为60 g/L时动力学模型预测曲线及实验值 ○ 葡萄糖；△ 细胞干重；＊ 乳酸；■ 透明质酸

图6-4-6 初糖浓度为80 g/L时动力学模型预测曲线及实验值 ○ 葡萄糖；△ 细胞干重；＊ 乳酸；■ 透明质酸 六、功能单元的酶学一致性 对于酶反应方程
(6-4-18) 其中e、s、c、p分别为酶、底物、酶与底物复合物及产物的浓度。 ① 若存在底物抑制反应
(6-4-19) 其中d为复合物ES2的浓度，反应的解离常数为Ks(即k--3/k3)。设K为复合物ES的解离常数(即k--1/k1)，根据反应式6-4-18和6-4-19由物料衡算求出ES的浓度c，进而得到反应速度方程：
(6-4-20) ② 若存在竞争抑制反应
(6-4-21) 其中i、d分别为抑制物浓度。 则反应速率方程为：
(6-4-22) 其中
，
。 综合方程6-4-20、6-4-22，可以看出方程6-4-12是同时存在底物和产物抑制的酶反应方程，是方程6-4-20、6-4-22的一般形式。说明功能单元在一定条件下具有与酶一致的动力学行为。 微生物细胞的培养，就是利用细胞中的酶系，将培养基中的物质通过生物反应转化成新的细胞及其代谢产物。直接以酶学假设为基础，同样可以获得许多适用广泛的微生物生长动力学方程。如Andrews将Haldane提出的具有底物抑制的酶反应动力学方程用于描述微生物生长动力行为，Bailey和Ollis对Haldane-Andrews方程给出了酶学解释等。在细胞培养的动力学研究中，认为细胞是由多个酶单元构成的整体是可行的。但功能单元理论更具有通用性，可以在更广泛的意义上进行使用。 七、讨论 本节以具有酶特性的功能单元理论为基础建立了模型。从菌体生长模型(式6-4-12)可以看出，方程左边分母中有一个关于底物浓度的二次项，分子上有一个底物浓度的一次项，说明功能单元中包含有2个葡萄糖连接位点，其中一个为抑制位点。关于底物抑制型连结位点数目的测定，Wang和Srivatava在研究酶反应动力学时曾提出一种图解测定方法，但由于透明质酸发酵过程既有底物(葡萄糖)的抑制，又有产物(乳酸)的抑制，所以不能简单地直接采用。在方程的求解过程中，采用了逐个替代的方法，先假设一定数目的连结位点，再假设少于这个值的抑制位点数，进行计算，逐步改变连接位点数，最终得到现在的模型形式。本文进一步发展了这个理论，提出其它的物质可以作为抑制物以一定数目与功能单元相连，起到抑制功能单元的作用。从菌体生长模型(式6-4-12)可以看出，方程左边分母中有一个关于底物浓度的一次项，说明功能单元上有一个乳酸抑制位点，这说明对功能单元理论扩展是可行的、合理的。从模型与试验数据的吻合程度可以看出，功能单元理论，可以较好地解释S. zooepidemicus H23发酵生产透明质酸过程中底物葡萄糖和产物乳酸对菌体生长的抑制，以及乳酸对产物透明质酸和细胞继续合成乳酸的进一步抑制作用。 在模型建立过程中，没有考虑传质对发酵过程的影响。由于多糖发酵液的流变学特点，在浓度较高的透明质酸溶液中传质将会较为困难。发酵后期，透明质酸浓度很高，营养物质的供应可能是制约细胞生长、代谢的另一个主要因素，使得在营养物质浓度较高时，也可能出现营养、特别是生长因子限制的情况。从图6-4-6可以看出发酵前期细胞生长和产物形成与模型预测值较为一致，但当透明质酸达到一定浓度后，实验结果和模型预测的偏差就逐渐增大了。 模型给出了一个量化的底物和产物对细胞的抑制程度。在菌体生长模型(式6-4-12)中，表示底物抑制的项是一个二次项(S2/Ki)，可以说明当底物浓度很高时，底物对细胞生长抑制作用很强，随着发酵的进行，底物浓度降低，抑制作用则迅速降低，但同时乳酸抑制项(PLA/KLA)的值迅速增大。这说明发酵初期低底物浓度有利于细胞的生长和产物的合成，但随着过程的进行却需要适当提高底物浓度，使之与乳酸共同产生的抑制效果最弱，以保持菌体生长和产物形成的比速率最大。 本节符号说明： A、B1、B2、C： 方程6-4-12中常数 (HA： 透明质酸合成与细胞生长的偶联常数  k1： 乳酸对透明质酸合成的抑制常数(g/L) (LA： 乳酸合成与细胞生长的偶联常数  k2： 乳酸对乳酸合成的抑制常数(g/L) ('0、('1： 方程6-4-14常数  KI： 底物抑制常数(g/L) (''0、(''1： 方程6-4-15常数  KLA 乳酸对细胞生长抑制常数 (： 底物与功能单元相连的能量系  Ks： 底物半饱和常数(g/L)  数或初始反应速度常数  m： 底物与功能单元的连接位点数 ( ： 细胞比生长速率(h-1)  me： 菌体的内源维持常数(h-1) (max： 细胞最大比生长速率(h-1)  n1、n2： 方程6-4-17中常数 (： 产物比生成速率(h-1)  P： 抑制物浓度(g/L) (： 底物比消耗速率(h-1)  PHA： 透明质酸浓度(g/L)    PLA 乳酸浓度(g/L)    S： 底物浓度(g/L)    X： 细胞干重(g/L)    x： 底物与功能单元的抑制位点数    Yx 底物对菌体的转化率(g/g)    YHA 底物对透明质酸的转化率(g/g)    YLA 底物对乳酸的转化率(g/g)     第五节 高效生产透明质酸的搅拌与溶氧浓度控制策略 一、引言 深层发酵是在水相中进行的微生物反应，当进行通风培养时，整个反应系统则成为非均相系统。透明质酸是一种高分子粘多糖，微生物将其作为荚膜在一定时期分泌到胞外，并覆盖在细胞表面。这样，细胞要获得氧或其它营养物质，则需要经过底物和氧在透明质酸覆盖层中的传递过程。所以透明质酸发酵是一种涉及气—液—固三相传递的生物反应体系。 溶氧浓度(Dissolved Oxygen Tentions，简称DOT)作为通风发酵控制中的一个关键参数，直接影响着生产过程和生产成本，一直受到工业生产和实验室研究的重视。由于Streptococcus zooepidemicus H23属于兼性厌氧微生物，在不同的DOT条件下具有不同的生理特性，虽然也有研究人员对此作了一些工作，但所得结论却不一致。第三节中发现培养条件之间有着交互作用，尤其是搅拌转速对发酵有着极大的影响。其原因可能是透明质酸水溶液具有极高的假塑性，搅拌条件对处于这种非牛顿体系中的相间传递有着密切的关系。因此，需要了解发酵液在反应器中的流体力学行为，以便掌握发酵规律，改进发酵操作。 本节在对透明质酸溶液的流变学行为进行研究的基础上，探讨了发酵体系中多相传质问题；进一步研究了搅拌转速、DOT对透明质酸发酵的影响，试图通过对系统无关的物理参数，以及混合、氧传递等性能的研究，来了解系统内生物学行为的变化规律；最后探讨了氧的代谢途径及其影响透明质酸合成的作用机制。 二、发酵体系的流变学特性与传质性能 对于发酵液具有高拟塑性的生物反应过程来说，其生物反应器的设计一直是生化工程领域最具挑战性的课题，其中包括一些重要的抗生素和多糖发酵所采用的反应器。虽然菌种选育或DNA技术给产物产率系数和浓度的提高增加了一种可能途径，但采用这种途径所做的工作能否成功，仍依赖于反应器的设计、搅拌器类型和流体性质。不仅如此，发酵液的流变特性对从上游到下游整个生产过程都有着重要的影响。图6-5-1为流变学特性对各工艺阶段的影响。可见，了解体系的流变学特性不仅有利提高生产强度，降低生产成本，还可以深入了解微生物的发酵和代谢机制。
图6-5-1 粘度对各工艺阶段的影响 (一)不同浓度透明质酸溶液的流变模型 微生物不同，发酵生产的产品不同，其培养液具有的流变学特性也不同。粘度低的培养液，热、质传递较好；而粘度高的，如含有大量菌丝体的、发酵产物为多糖的，培养液呈非牛顿流动特性，则容易发生混合不匀、热质传递困难的现象。透明质酸是一种高分子粘多糖，即使在浓度很低的溶液中也可以形成相互作用的网状结构，其水溶液具有很强的粘弹性。虽然有研究人员对浓度、分子量、切变速率、粘度间的关系作了一些研究，但却很少有针对发酵过程中透明质酸流变学特性进行研究的报道。
(6-5-1) 方程6-5-1为液体流态的总表达式，其中(0为起始切变值或塑变值(Pa)，K为均匀性系数，n为流态特性指数，
为剪切速率(s-1)。对于不同流变类型的流体，(0、K、n值不同。图6-5-2给出了各种流变学类型的流体及其(0、K、n值。
图6-5-2 各种流变学类型的流体及其K、n值 考察不同浓度透明质酸溶液的流变学特性，结果如图6-5-3，6-5-4所示。从图中可以看出，随着剪切速率增高，剪切强度和粘度的变化经历了两个阶段。在较低的剪切速率下，剪切强度随剪切速率线性变化，而粘度维持不变，这个剪切速率范围比较小，并且浓度越高，范围越小；继续增加剪切强度，进入另一个阶段，粘度迅速下降，出现明显的剪切变稀现象。与各种类型流体的特性(图6-5-2)相比，可以看出浓度为0.02 g/L~5 g/L时的透明质酸溶液在第一阶段内属牛顿型流体，在第二个阶段内具有非牛顿流体特性。
图6-5-3 不同透明质酸浓度下剪切速率与剪切强度的关系
图6-5-4 不同透明质酸浓度下剪切速率与表观粘度的关系 将所测数据采用幂次定律模型(power law model)、凯松模型(Casson model)等进行拟合，结果如表6-5-1所示。可以看出两种模型都能对数据进行较好的拟合，但根据对发酵过程和模拟体系的观察，当体系的透明质酸浓度较高时，发酵罐中存在明显的停滞区(近罐壁处或上部)，表明流体有屈服力存在。由于幂次定律模型中不含有屈服强度项((0)，而凯松模型中有屈服强度常数项，所以后者更为准确地描述了体系的流变学行为。 表6-5-1 不同浓度透明质酸流变模型 透明质酸 /g(L-1 幂次定律模型 相关系数 凯松模型 相关系数  5.0 
0.9934 
0.9842  6-4-0 
0.9773 
0.9596  3.0 
0.9847 
0.9728  2.5 
0.9913 
0.9867  1.0 
0.9760 
0.9992  0.1 
0.9734 
0.9745  0.02 
0.9695 
0.9713  (二)透明质酸发酵体系中搅拌功率的计算 搅拌罐是工业上使用范围最广的发酵罐，保证发酵液能够完全混合是反应器设计的一个重要方面，因为热质传递主要依赖于良好的混合。局部区域内底物、氧、pH的波动会引起细胞生长的环境条件的不平衡，所以发酵液的均一性直接影响生产性能的稳定，发酵液迅速均一的混合同时也是对发酵进行控制的必要条件。 对于高粘度发酵体系来说，良好传质要求高的动力消耗。对于搅拌罐来说，不通风时施于体系的搅拌能(P0)是搅拌速率、搅拌桨(直径、位置、形状)、流体物理性质、反应器的形状、大小、几何构型等的函数。而通风状态下的动力消耗P0g不仅与P0有关，而且还是是雷诺准数(ReM)、通气速率和其它流变学性质(如屈服力，粘弹性)等的复杂函数。对动力需求的合理预测，是反应器设计的一个重要方面，而动力需求的预测，则是建立在对体系流变学性质了解的基础上的。 在搅拌反应器中，非牛顿流体的平均剪切速率一般与搅拌器转速成正比∶
(6-5-2) 式中N为搅拌器转速(r/s)，
为液体的平均剪切速率(s-1)，K'为比例系数，值为10~13之间，一般取11.5，平均误差在16%之内。忽略其它因素，根据图6-5-4，可以得到搅拌转速为650 r/min时分批发酵过程粘度变化曲线，如图6-5-5所示。从图中可以看出，粘度变化过程与透明质酸变化过程一致。发酵后期，透明质酸浓度迅速升高，体系粘度也迅速增大。由前面的研究可知，透明质酸溶液有较强的拟塑性，因此，在发酵后期，搅拌的变化对体系的传质效果影响很大。

图6-5-5 搅拌转速650 r/min时发酵过程中 6-5-6 搅拌转速650 r/min时通气和不通气 粘度的变化 状态下的搅拌功率 搅拌罐中搅拌器转速与液体平均剪应速率之间的关系如下：
(6-5-3)
(6-5-4) 其中Np为功率准数，P0为不通气时搅拌器输入液体的功率(kw)，(为液体密度(kg/m3)，(为液体粘度((N(s)/m2)，D为搅拌器直径(m)，N为搅拌转速(r/s)。 一定的雷诺准数对应一定功率准数，当ReM(104，即流体达到充分湍流后，Np将保持恒定，透平桨、全挡板时其值为6，当ReM(104时，流体流动状态处于过渡区，Np随ReM变化而变化，通过查Np-ReM图可以得到Np。则不通气时搅拌器输入液体的功率为：
(6-5-5) 对于有通气的搅拌功率为：
(6-5-6) 其中Po、Pg为不通气和通气时的搅拌功率(kw)，Q为通气量(m3/min)，N为转速(r/min)。采用以上方法得到发酵过程中搅拌功率变化如图6-5-6所示，其中参数(=1030 kg/m3，Q=0.002 m3/min，N=650r/min(10.83 r/s)，D=0.07 m。计算过程中发现，所采用的发酵体系在650 r/min时流动状态处于过渡区域，ReM低时，Np也低。而随着发酵的进行，体系粘度增大，导致ReM随发酵过程的进行而降低，Np同时也随之降低，使得功率消耗也降低。工业生产中使用大型发酵罐进行发酵，发酵体系的流态常处于湍流区(ReM>104)，则发酵体系的功率消耗就会稳定在一个固定的值。 (三)透明质酸发酵体系的混合与传氧系数 由于气液传质的特殊性，传氧是反应器设计和反应过程控制中需考虑的一个重要参数。氧传递速率常是生物反应系统的一个限制性因素，同时也是反应器放大的一个重要参数。氧在微生物培养体系中的传递速率依赖于体积传氧系数(kLa)和传氧驱动力(C*L-CL)。有关发酵体系(包括非牛顿体系)的传氧效率的研究较多，但还未见有关于透明质酸发酵液传氧性能的报道。图6-5-7和6-5-8为不同搅拌转速和不同透明质酸浓度时模拟体系中的体积传氧系数。 从图6-5-7可以看出，搅拌速率和kLa之间几乎成正比例关系。高的搅拌转速不仅可以将通入培养基的空气分散成细小的气泡，防止小气泡的聚集，增大气液传质面积；还可以使培养液产生涡流，延长气体在液体中的停留时间，提高空气的利用率，并且可以改变气液界面状态，增大传质推动力。此外，在发酵过程中，高搅拌速率还可以保证细胞均匀悬浮，驱散细胞周围由自身产生的有害物质。
图6-5-7 3.9 g/L透明质酸溶液在不同搅拌转速下的体积传氧系数
图6-5-8 650 r/min下时不同浓度透明质酸溶液的体积传氧系数 从图6-5-8可以看出，透明质酸浓度对传氧效率也有很大影响。由前面的研究可知，透明质酸浓度增高，溶液的粘度迅速增大。粘度一方面影响气液传质界面性质，使液体在界面上处于滞流状态，增加了液膜厚度，使传质阻力大大增加；另一方面粘度还影响气体在溶液中的扩散系数。 三、搅拌转速对透明质酸发酵过程的影响 对于透明质酸发酵来说，搅拌在发酵过程中有两个作用：一为混合作用，既维持发酵液中有足够的溶氧，又可使发酵液中的各营养底物混合均匀，有利于细胞的吸收和利用；另一为剪切作用，既影响着细胞的生长，又可加速细胞荚膜从细胞表面脱离，从而影响着透明质酸丝状大分子的分子量。这些作用共同形成了独特的透明质酸发酵特征。 (一)搅拌转速对细胞生长的影响 如图6-5-9和6-5-10所示。搅拌转速越高，菌体生长速率越快，850 r/min时，细胞干重增加速率最快，最终细胞干重也最大，达3.7 g/L，300 r/min时细胞干重最低，仅为1.8 g/L，但整个发酵周期却都在16 h左右。在高搅拌转速下细胞产率也较高，350 r/min时为0.032 g/g，而850 r/min时却达0.07 g/g。

图6-5-9搅拌转速对细胞干重的影响 图6-5-10 搅拌转速对细胞产率系数的影响 发酵法生产多糖时，随着发酵过程的进行，产物浓度不断增加，发酵液粘度也逐渐增高，进而kLa值迅速降低，同时细胞干重增加，体积耗氧速率也增加，当发酵进行到一定程度后，发酵液中的溶氧浓度(DOT)几乎为零，导致微生物代谢机制发生变化。 图6-5-11为典型的发酵过程DOT变化图，可以看出发酵过程中有相当一部分时间是处于DOT为零或接近零的状态。搅拌转速不同时，这个零DOT阶段的长短不同。图6-5-12为发酵过程中停止供气后发酵体系DOT的变化。当DOT低于10%以后，耗氧速率显著降低，获得能量减少，细胞代谢速率减慢，呼吸强度降低。可以认为10%即为细胞生长的临界DOT。高的搅拌转速有利于菌体生长，但高DOT并不意味着可以获得高的透明质酸产量，其中还存在着氧对部分途径的抑制、氧中间代谢产物的毒害等作用。

图6-5-11 发酵过程DOT变化曲线 图6-5-12 停止供氧后发酵体系中DOT的变化 (二)搅拌转速对产物合成的影响 (1)搅拌转速对透明质酸产量和透明质酸产率系数的影响 如图6-5-13和6-5-14所示。从图中可以看出，透明质酸发酵初期合成速率较慢，当发酵进行到7~8 h后，透明质酸迅速增加，这个时期约占发酵期的50%。发酵后期糖浓度比较低时，菌体可以继续生长(图6-5-9中14~16 h)，透明质酸则停止合成。在较低转速时透明质酸终产量随搅拌转速增加而提高，从300 r/min的2.8 g/L增加到650 r/min的4.1 g/L，但继续提高转速到850 r/min时，产量迅速降低，仅2.6 g/L。300~650 r/min搅拌转速下，透明质酸产率与细胞产率变化趋势相一致，从0.055 g/g升高至0.080 g/g，而搅拌转速为850 r/min时则大为下降，仅为0.051 g/g。
图6-5-13 搅拌转速对透明质酸产量的影响
图6-5-14 不同搅拌转速下透明质酸产率系数的变化 图6-5-13表明，单一搅拌转速控制的透明质酸发酵过程存在一个最佳搅拌转速，其原因可能包括两个方面∶其一为前面提到的搅拌有助于透明质酸荚膜脱落，促进营养物质的吸收利用；另一为氧对细胞的毒害作用。透明质酸荚膜多糖是防止氧对细胞毒害的保护膜，由于搅拌加速了氧的溶解，增加了细胞与氧的接触，从而也加速细胞荚膜的合成以抵抗氧的毒害作用，而当搅拌转速超出了一定的限度，使细胞对氧过量摄入，则表现出氧对细胞的毒害作用，而使透明质酸产量大为降低。 (2)搅拌转速对分子量(M()的影响 透明质酸作为一种高分子粘多糖，分子量是影响其粘弹性和持水性的重要内在因素，在发酵生产中，透明质酸的M(同样也是应被考虑的一个主要生产指标。从图6-5-15可以看出，在发酵初期，透明质酸分子量较低，随着发酵的进行，分子量不断提高，发酵终了时M(也达到最大。透明质酸的最终M(则随搅拌速率的提高而不断下降，300 r/min时为2.1(106 Da，升高至850 r/min时，分子量则降至1.4(106 Da。 透明质酸是由透明质酸合成酶在细胞膜上合成并分泌到胞外的。由于搅拌的剪切作用，一方面可能引起透明质酸的非正常合成，使得正在链延长阶段的透明质酸分子提前脱落，未达到一定分子量的透明质酸；另一方面，由于透明质酸是丝状长链分子，在搅拌剪切力作用下可能会发生断裂，从而降低了产品的分子量。
图6-5-15 不同转速下透明质酸分子量随时间变化曲线 (三)搅拌转速对乳酸产量和乳酸产率系数的影响 乳酸是透明质酸发酵过程中另一种主要产物，对其进行考察有助于了解菌种的代谢、发酵机制，以便创造条件使代谢朝着有利于透明质酸合成的方向进行。如图6-5-16所示，大部分碳源都转化成乳酸，搅拌转速越低，表现越为明显。300 r/min时，乳酸产量46.2 g/L、产率系数0.92 g/g，到850 r/min时乳酸产量为41 g/L、产率系数0.81 g/g。
图6-5-16 搅拌转速对乳酸量及产率系数的影响 ◆ 乳酸产率系数；▲ 乳酸 Streptococcus zooepidemicus通风发酵时不仅产乳酸，而且有一定量的乙酸和CO2产生，而厌氧培养时，产物中没有乙酸。从图6-5-16、图6-5-17可以看出，随着搅拌速率的提高，乳酸的产量、产率系数、比合成速率都不断降低，而乙酸的产量、比合成速率却呈相反的趋势(数据未给出)。由于许多链球菌缺乏完整的TCA循环，对于细胞生长来说，细胞内能量处于亚充足状态，DOT的提高使酵解产生的NADH通过呼吸链氧化，从而使得乳酸的产量随转速的增加而不断减少。 (四)搅拌转速对透明质酸和乳酸比生成速率的影响 如图6-5-17所示，透明质酸最大比生成速率((HA max)和乳酸的最大比生成速率((LA max)变化规律略有不同。对于透明质酸来说，300 r/min时(HA最小仅0.11 h-1，在转速为450 r/min~650 r/min范围变化时，发酵具有最大的(HA max =0.22 h-1，继续增高转速，(HA max开始下降，850 r/min时，降为0.17 h-1；对于乳酸，随搅拌转速的增加，其比合成速率呈单一的下降趋势，300 r/min时为3.1 h-1，850 r/min时为2.2 h-1。较低转速时降低速率较快，较高转速时趋于平缓。
图6-5-17 不同搅拌速率下透明质酸及乳酸最大比合成速率 ◆ 透明质酸；▲ 乳酸 (五)透明质酸发酵过程中的搅拌效率 通常，高粘度假塑性发酵液的搅拌比较困难，由于粘度梯度的原因使得远离搅拌器的流体流动性急剧下降，同时粘度也使搅拌器的泵送能力下降，使得混合问题更为复杂。这种效应使得气体在反应器中难以被打碎成细小气泡，并导致搅拌死角的存在。

图6-5-18 搅拌转速和搅拌器直径对有效搅拌体积的影响及圆柱有效搅拌模型 a 搅拌转速的影响(30g/L黄原胶)；b搅拌器大小的影响(15g/L黄原胶)；c有效搅拌圆柱模型示意图 当流体存在屈服力时，还可能产生一种有效搅拌区域(Cavern volume)现象，即在搅拌器附近的圆柱型区域搅拌良好，而其它部分静止不动。在透明质酸发酵过程后期，可以观察到体系中明显存在着这种现象。许多多糖的发酵体系中存在有效搅拌现象，如搅拌器的大小，搅拌转速等因素对CMC、黄原胶等多糖溶液的有效搅拌体积都有很大的影响。图6-5-18为搅拌转速和搅拌器直径对有效搅拌体积的影响及圆柱有效搅拌模型，式6-5-7为有效搅拌模型中有效搅拌直径的数学表达式。
(6-5-7) 其中DC为有效搅拌直径。当有效搅拌区域没有达到罐壁时，其高径比为0.4，当区域达到罐壁后Dc即为定值Df(罐径)，区域高度随着搅拌速率增高继续增大。这里本文继续采用0.4作为高径比，而Dc仅表示理论有效直径。 图6-5-19为采用凯松模型和方程6-5-7对透明质酸发酵过程进行计算后，得到的有效搅拌体积(Tc)占发酵体积(Tv)的百分比随时间变化关系图。
图6-5-19 不同搅拌转速下有效搅拌体积占发酵体积百分比的变化曲线 搅拌转速(r/min)∶◆ 650；■ 450；▲ 300 从图中可以看出，高搅拌转速(650 r/min)时，整个过程的整个发酵体系都处于良好的搅拌状态，最终透明质酸浓度为4.1 g/L。而低搅拌时，随着发酵的进行有效搅拌体积逐渐减小，透明质酸合成量也都相应减少(图6-5-3~6-5-4)，450 r/min、300 r/min时最终透明质酸浓度分别为3.7 g/L、2.8 g/L。因此可以推测，混合是否完全，是否有大量非有效搅拌区域，与透明质酸产量的高低有着密切的关系。 四、溶氧浓度对发酵生产透明质酸的影响 从前面的研究发现，高搅拌转速时不一定能获得高的透明质酸产量。对于发酵液为牛顿流体的发酵过程来说，对kLa值和DOT影响最大的是搅拌，而DOT又是通风发酵的关键控制参数。已有研究人员研究了发酵过程中溶氧状况与Streptococcus合成透明质酸的关系，但对氧在透明质酸合成中的作用有着不同的说法。有学者认为透明质酸荚膜是一道抵抗O2渗透的屏障，可以防止分子氧对细胞的毒害，这样作为一种细胞的保护机制，通风可以促进透明质酸的产生。然而也有学者认为培养液中丰富的CO2可以促进透明质酸的产生。为了对溶氧浓度对透明质酸发酵的影响给出一个较为明确的结论，我们在搅拌转速为650 r/min的条件下(此时发酵罐可被混合均匀)，考察供氧对S. zooepidemicus H23合成透明质酸的影响。 (一)溶氧浓度对菌体生长的影响 图6-5-20为650 r/min时不同DOT及厌氧发酵对菌体生长的影响。从图中可以看出，高的DOT有利于菌体生长，厌氧培养时菌体虽能生长(H23菌株为兼性菌)，但生物量最低。由前面的研究可知，10%为菌体代谢的临界DOT。当DOT低于10%时，菌体的生长将会受到影响，故而在低溶氧时生长较为缓慢。 
图6-5-20 搅拌转速650 r/min时DOT对菌体生长的影响 DOT(%)∶◆ 1；■ 5；▲ 10；● 厌氧 (二)溶氧浓度对产物合成的影响 DOT对产物合成同样有很大影响。表6-5-2列出不同DOT时发酵终了透明质酸和乳酸的有关数据。从表中可以看出，在控制DOT发酵时，透明质酸和乳酸终浓度都随DOT的提高而大幅减小，同时底物对产物的转化率也相应下降。虽然所控制的DOT都处于临界DOT或临界DOT之下，但无论透明质酸产量还是透明质酸产率都相差很大，而当发酵体系处于厌氧状态时，透明质酸的产量则很低，这说明氧在透明质酸合成中起着特殊的作用。控制DOT时透明质酸的分子量都在1.9(106 Da左右，并且与不控制DOT时的接近，仅厌氧发酵时分子量略高，说明DOT对透明质酸分子量的影响不大。 表6-5-2 供氧状态对S. zooepidemicus产物合成的影响 DOT /% 透明质酸 乳酸   透明质酸 /g(L-1 透明质酸产率/g(g-1 M( /((106Da) 乳酸 /g(L-1 乳酸产率 /g(g-1  1 4.3 0.084 1.87 43.5 0.86  5 3.6 0.071 1.84 35.1 0.72  10 3.1 0.060 1.76 29.7 0.61  厌氧培养 1.2 0.026 2.06  4.3 0.94  五、透明质酸发酵的搅拌与溶氧浓度控制策略 从前面的研究可以看出，搅拌转速越高(DOT越高)，菌体生长速率越快；而在低DOT时，透明质酸产量和产率系数较高。据此，采用先控制高搅拌转速(也是高DOT)，再控制低搅拌转速、同时控制低DOT的策略，对发酵操作进行优化，发酵过程曲线如图6-5-21所示。搅拌转速分两阶段控制，在0~8 h采用搅拌转速1000 r/min，不控制DOT，8~16 h降低搅拌转速至650 r/min，此时控制DOT为1%。与图6-5-9、图6-5-13对照，采用分阶段搅拌及溶氧控制策略，发酵前期透明质酸产量没有提高，但细胞干重较高，最终透明质酸产量有了较大的提高，达4.7 g/L，同时保持了较高的分子量，为1.85(106 Da。
图6-5-21 搅拌转速、溶氧浓度控制生产透明质酸的发酵过程曲线 六、氧代谢途径及其影响透明质酸合成的作用机制 许多研究已表明，好氧微生物可以在有氧环境中生存仅仅是因为其有一整套抵御氧的机制，而专性厌氧的微生物缺乏这种机制。作为兼性好氧微生物，Streptococcus zooepidemicus H23则部分地具有这种机制。氧除了参与一些代谢反应外，还可以生成一些中间态的其它产物，这些产物往往对菌体有毒害作用。大量研究已经证实好氧或兼性厌氧微生物细胞具有超氧歧化酶、过氧化物酶或过氧化氢酶中的一种或几种。图6-5-22为氧及其中间代谢产物对各类微生物的作用。 S. zooepidemicus H23是一株兼性厌氧菌，在有氧和无氧状态下均生长良好。图6-5-22中间态氧最后多生成H2O2，但对有氧条件下的发酵液进行检测，没有发现H2O2，说明该菌种具有过氧化氢酶或过氧化物酶，已将H2O2在胞内分解完毕。但是，DOT较高时。细胞摄入过多的氧，氧的中间态产物浓度就会比较高，若各种酶不能迅速作用，这些中间态产物就可能在胞内积累，从而对细胞造成伤害。

图6-5-22 氧对好氧、厌氧、兼性厌氧微生物的影响 S. zooepidemicus是一种营养要求极为严格的微生物，缺乏完整的TCA循环，作为乳酸产生菌，在厌氧条件下可以将90%左右底物葡萄糖同型发酵生成乳酸，并提供菌体生长和代谢所需要的能量，除透明质酸和乳酸外，不分泌其它胞外代谢产物。在有氧条件下，部分丙酮酸被分解生成乙酸和CO2。表6-5-3为不同溶氧条件对乙酸合成的影响，从表中可以看出厌氧培养时，细胞几乎不合成乙酸，进行通风培养时，随着DOT的升高，乙酸产量逐渐增大。 表6-5-3 不同DOT对乙酸合成的影响 DOT /% 1 5 10 厌氧培养  葡萄糖 /C-mol(L-1 1.70 1.65 1.64 1.61  乳酸 /C-mol(L-1 1.45 1.17 0.99 1.48  透明质酸 /C-mol(L-1 0.16 0.13 0.11 0.046  乙酸 /C-mol(L-1 0.058 0.19 0.35 0.004  其它 /C-mol(L-1 (CO2 /C-mol(L-1)① 0.035 (0.029) 0.16 (0.094) 0.19 (0.17) 0.084 (0.002)  ① 根据乙酸C-mol浓度的1/2计算。 由丙酮酸生成乙酸可以通过两种途径进行。通常情况下，由丙酮酸合成乙酸的途径如图6-5-23a所示。另一种途径是丙酮酸氧化酶途径，如图6-5-23b所示。丙酮酸在氧化酶作用下氧化生成乙酰磷酸，同时伴随着H2O2的合成，乙酰磷酸则在激酶作用下生成乙酸。有学者发现L. plantarum在有氧时采用这种方式进一步代谢丙酮酸，生成大量的乙酸，由此认为这可能是糖酵解途径的中间产物诱导了丙酮酸氧化酶的合成。但很少有关于Streptococcus zooepidemicus 生成乙酸代谢途径的报道。
a
b 图6-5-23 丙酮酸合成乙酸途径 表6-5-4列出了分批发酵前期O2的消耗速率与乙酸的生成速率。可以看出，O2的消耗量与乙酸的合成量是一致的。但微生物采用图6-5-23所给出的两种路径中的任一种，均可能得到类似的结果。 表6-5-4 不同发酵阶段氧消耗速率与乙酸合成速率的关系 时间/h 2 4 6  DOT /% 90 85 72  O2 消耗速率 /mmol(h-1(L-1 0.34 1.2 4.2  乙酸产生速率 /mmol(h-1(L-1 0.32 1.3 4.0   荚膜是微生物细胞的一种重要的自我保护方式。对于Streptococcus zooepidemicus，荚膜有阻止氧直接与细胞接触的屏障作用，同时，荚膜的粘性使大量细胞聚集在一起，减少了细胞与发酵液接触的比表面积，使进入细胞的氧大大减少。在低DOT的情况下，由于少量有毒物质生成，促使菌体调动自我保护机制，因而可以促进荚膜的大量合成。而高DOT时，生成的有毒物质更多、毒性更大，细胞的自我保护机制不能抵御毒害，因而表现出氧对菌体的毒害作用，使透明质酸的合成能力降低。厌氧培养虽然不存在氧对细胞的毒害，但由于厌氧培养时，碳源代谢提供的能量较少，所以细胞干重较低，同时也减少了对透明质酸合成的刺激，所以透明质酸合成量也大为降低。至于透明质酸的分子量，由于有氧条件下，其它形态的氧对透明质酸的分子链有降解作用，因而在低DOT或厌氧条件下分子量较高。 符号说明： C*L： 液相饱和溶氧浓度(mol/L) K'： 式6-5-5中比例系数(r-1)  CL： 液相溶氧浓度(mol/L) P0： 不通气时搅拌功率(kW)  D： 搅拌器直径(m) Pg： 通气时搅拌功率(kW)  DC： 有效搅拌直径(m) Q： 通气量(m3/min)  Df： 发酵罐直径(m) ReM： 雷诺准数(无因次)  K： 流体均匀性系数(m2/(N(S) ) 
、
： 剪切速率(s-1)  KLA： 体积传氧系数(h-1) (： 液体粘度( (N(s)/m2 )  M(： 分子量(Da) (： 液体密度(kg/m3)  N： 搅拌器转速(r/min) (： 剪切强度(Pa)  Np： 功率准数(无因次) (0： 起始切变值或塑变值  n： 流态特性指数(无因次)     第六节 不同发酵模式生产透明质酸的组合操作与优化 一、引言 微生物发酵按加料方式可以分为连续发酵、分批发酵和介于两者之间的半连续发酵。分批操作是一种最原始的操作方式，其最大的缺点是不控制培养基组分浓度等环境因素，微生物所处的环境大幅度变化，其活性和机能也随之变化，这样不利于发酵过程的进行。通过改善操作方式，控制发酵体系的条件，尽可能地避免不利的影响，则可以进一步提高产物的得率。但每种操作方式有各自的优缺点，要使生产处于最佳状态，采用好的操作方式以及将各具优点的操作方式进行组合和优化无疑是一个必然的选择。 补料分批发酵从早期的经验操作发展到现代的优化操作方式，其研究核心是底物的补给方式和最佳操作状态的维持。许多研究人员采用不同的方法，包括以数学模型为基础的优化和以生理模型(physiological model，即全部和部分微生物生理过程参数的变化及其之间的联系，如呼吸商和面包酵母生长的关系)为基础的优化。后者虽然已有神经元网络、专家系统、模糊控制以及它们的组合控制系统等多种理论方法，但这类方法往往不能提供最优的控制。对于一个已有较为精确的数学模型描述的过程，可以结合发酵机制采用多种数学方法获得过程的最优操作。 透明质酸发酵同时存在着底物和产物的抑制，发酵周期较短，仅采用分批发酵生产无法得到最高的透明质酸产量和生产强度。本文比较了补料分批发酵与分批发酵的动力学机制，采用Modak等提出的奇异优化方法对补料分批操作进行了优化，结合经验补料法进一步讨论了奇异优化的机理，并采用重复发酵和奇异控制组合发酵模式优化透明质酸的生产 二、补料分批发酵优化理论 利用现代控制理论对发酵过程进行优化和控制是现代发酵工程的一个研究热点，这在氨基酸、抗生素、酶等方面已有许多报道。补料发酵过程中，可以通过控制底物浓度使过程处于最优状态，还可以通过控制补加料液浓度和补料速率使发酵液体积有一定程度的增大，这种操作可以使对过程有抑制作用的产物、副产物浓度得到控制，从而使产物对底物的产率系数提高。 (一)生物过程中哈密尔顿函数和奇异控制 对于连续补料培养，其动力学方程可以用下列方程描述：
V(0)=V0 (6-6-1)
X(0)=X0 (6-6-2)
P(0)=P0 (6-6-3)
S(0)=S0 (6-6-4) 其中V为体积(L)，X为细胞干重(g/L)，P为产物浓度(g/L)，S为底物浓度(g/L)，F为补料速率(L/h)，t为发酵时间(h)，(为比生长速率(h-1)，(为产物比生成速率(h-1)，(为底物比消耗速率(h-1)。 反应器体积和补料速率限制方程为：
(6-6-5)
(6-6-6) 由状态方程构成的目标泛函为：
(6-6-7) 其中h为常数。 反应器中状态方程为：
(6-6-8) 其中x1~x5由方程6.1~6.4和下式确定，
(6-6-9) 使目标泛函值最小，即使式6-6-10构成的哈密尔顿函数值最小：
(6-6-10) 其中∶
(6-6-11)
(6-6-12) 式中(i(i=1~4)是伴随变量，(0是有关限制不等式的拉格朗日常数(当V<Vm时，(0(t)=0，当V=Vm时，(0(t)(0)，则伴随变量对时间的导数如下列方程所示：
(6-6-13)
(6-6-14)
(6-6-15)
(6-6-16)
(6-6-17) 下标X、S、P表示对X、S、P的偏微分。 发酵过程中状态变量x的轨迹包含一个内部弧(V<Vm)和边界弧(V=Vm)，当内部奇异控制和边界控制为一阶时，在边界弧和内部弧的联结点上的伴随变量是光滑改变的。反应体积达到最大时，反应器在边界弧上连续操作至结束(t=tf)。在t=tf时，对于伴随变量应满足
(6-6-18) 由于哈密尔顿函数与F成线性关系，最优补加速率可表述成：
(6-6-19) 当切换函数h1在特定时间段[t1, t2]的值为0时，哈密尔顿函数不能给出Fs的解。此时的控制即称为奇异控制，由于h1中不显含时间t，Fs的解就由dnh1/dtn=0(n(1)给出。 (二)透明质酸发酵过程的奇异控制 不考虑底物浓度的影响，动力学方程
(6-4-14)
(6-4-15) 可写成：
(6-6-20)
(6-6-21) 则：
(6-6-22) 若不考虑乳酸的影响，同样有类似的式子。表明函数：
(6-6-23) 单调递增，即当乳酸量达到最大时，透明质酸浓度相应也达到最大值。对于以透明质酸最大产量为目标的优化，可以将优化目标转化乳酸产量：
(6-6-24) 由于目标泛函与Xf、tf无关，同时h为0，分批和奇异操作时h1F为0，哈密尔顿函数H在优化操作时为0。由方程6-4-14，6-4-15可以看出(、(均为S、P的函数，其对X的导数(x、(x为0。根据方程6-6-14，可得(2在奇异操作时为0。由h0和dh/dt在奇异控制时为0提供了另两个关于(2、(3、(4的线性方程，则可得到奇异控制轨迹为：
(6-6-25) 其中下标S、P分别表示对S、P的偏微分。由d2h/dt2=0以及方程6-6-25可得奇异补料速率为
(6-6-26) 其中：
三、重复分批发酵 重复分批发酵是在分批培养过程进行到某种程度时，不将培养液全部排出，留出一部分作为下批培养的种子，然后加入新鲜的培养基重复进行分批培养的操作方式。这种操作方式弥补了每一次分批培养主反应之前，都要经过几级种子培养的缺点，减少除了大量的辅助生产时间，缩短了生产周期。并且根据生产菌种特性和其它条件，可进行多次反复的操作，大大提高生产强度和设备利用率，节约生产成本。 图6-6-1为重复分批发酵生产透明质酸的过程曲线，从图中可以看出，以发酵液作为种子，对发酵的正常进行丝毫没有不利的影响。由于单罐的生产周期短，发酵结束时细胞的活力没有受到影响。当新鲜发酵液补入后，细胞经过一个短暂的延滞期即开始迅速生长，进入对数生长状态，从而加速了发酵的进行。

图6-6-1 重复分批发酵生产透明质酸的过程曲线 ● 葡萄糖；■ 生物量；▲ 乳酸；◆ 透明质酸 表6-6-1比较了重复发酵与分批发酵的结果。虽然主要指标是一致的，但重复分批发酵时间缩短了25%，因此生产强度有所提高。 表6-6-1 重复分批发酵与分批发酵的比较 发酵方式 总葡萄糖 /g(L-1 生物量 /g(L-1 透明质酸 /g(L-1 乳酸 /g(L-1 发酵时间/h  循环分批发酵 第一次循环 50.8 2.30 4.03 40.48 14   第二次循环① 49.2 2.73 4.48 43.52 10.5  分批发酵 50.5 2.28 4.10 40.12 14  ① 包括了种子中的生物量, 透明质酸和乳酸 四、非优化补料分批发酵与分批发酵的比较研究 (一)碳源添加模式对透明质酸形成的影响 分批发酵和补料分批发酵过程曲线分别示于图6-6-2和图6-6-3。其中，补料分批发酵的初始葡萄糖浓度为30 g/L，到7.5 h葡萄糖浓度降为8 g/L时开始补加底物，其后维持葡萄糖浓度在20 g/L。 在分批发酵过程中，发酵初期透明质酸就迅速积累，10 h后增速减慢。在23 h左右时，透明质酸达最大值3.6 g/L。补料分批发酵中，初始时透明质酸产量增加较为缓慢，5 h后迅速增加，20 h左右达到4.0 g/L后开始下降。分批发酵总糖为70 g/L，最高透明质酸产量为3.6 g/L，底物对透明质酸的产率系数(透明质酸产率)为0.053 g/g。补料分批发酵在15 h左右耗糖70 g/L，而此时透明质酸仅2.9 g/L，透明质酸产率为0.041 g/g。从细胞生长角度来看，分批发酵菌体增殖较慢，最大比生长速率(max=0.5 h-1；而补料分批发酵(max=2.0 h-1，远高于分批发酵。

图6-6-2 分批发酵过程曲线 图6-6-3 补料分批发酵过程曲线 一般地，初始碳源浓度较高的分批发酵，常常有菌体生长和产物合成受抑制的现象，并且其转化率常低于补料分批发酵。但在透明质酸分批发酵中，较高的初始碳源浓度可以促进透明质酸迅速积累。透明质酸合成的前体是尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)，同时UDP-GlcNAc也是菌体合成的前体。外界葡萄糖浓度较高时，细胞内的UDP-GlcNAc浓度升高，使得碳源在满足细胞的基本生长要求后，有更大比例的碳源转化为透明质酸；而在环境葡萄糖浓度较低时，胞内UDP-GlcNAc浓度也较低，此时UDP-GlcNAc主要用于合成菌体。另一方面，由于S. zooepidemicus H23菌株的生长代谢同时受到底物和产物的抑制，如果只是乳酸浓度较高，由乳酸产生的单一抑制作用将更为强烈，使得补料分批发酵虽然保持着较低的底物浓度，但透明质酸的产量反而下降。 (二)碳源添加模式对透明质酸分子量的影响 分子量是衡量透明质酸是否具有良好粘弹性、持水性的关键参数，而这些性能决定着透明质酸的生理功能。两种发酵方式对透明质酸分子量(M()的影响如图6-6-4所示，不同发酵方式对透明质酸分子量的影响趋势没有显著差异。

图6-6-4 发酵方式对透明质酸分子量的影响 图6-6-5 两种发酵方式下乳酸的变化 ◆ 分批发酵；● 补料分批发酵 ○ 分批发酵；□ 补料分批发酵 (三)发酵方式对副产物形成的影响 透明质酸发酵过程中伴随大量的副产物生成，乳酸和乙酸是其中最主要的两种。图6-6-5为分批和补料分批发酵过程中乳酸浓度的变化曲线，可以看出补料分批发酵的乳酸产量明显高于分批发酵。由此可以理解，为什么简单的补料分批发酵方式不能使透明质酸产量显著提高。 五、奇异优化控制的补料发酵 对于产物抑制型发酵，萃取发酵是一种有效的手段，并常用于乳酸的发酵生产。我们曾尝试采用随程提取技术进行透明质酸发酵的研究，但由于透明质酸溶液的流变学特点，这种方法并不适合。对发酵过程进行优化和控制可以减轻不利因素对发酵的影响，奇异控制给出了这样一种减轻底物和产物抑制的方法。 (一)透明质酸发酵过程补料方式的确定 发酵过程可以分为两个阶段，第一阶段是酶系发育阶段，应控制条件适合细胞生长，使酶量最大和活力最高；第二阶段是产物合成阶段，目的是使底物尽可能多地转化为产物。前已述及，发酵过程主要分为三种类型：第一类为比生长速率(和比产物形成速率(均单调变化，第二类为(单调增加，而(为非单调变化；第三种类型为(、(均非单调变化。对于第三种类型的发酵来说，菌体生长最优阶段是处于奇异控制阶段∶① 若初始底物浓度过低，发酵第一阶段应以尽可能高的速率将底物加入，控制添加量，使发酵进入第二阶段即奇异控制段，而奇异控制阶段的任务是∶首先使细胞生长最优化，而后使产物合成最优化，最后再经历一个分批阶段；② 若开始底物浓度较高，则第一阶段是分批发酵阶段，当符合奇异控制条件后进行第二阶段，最后同样是分批阶段；若能控制初始发酵条件，最佳操作应是第③种操作方式，即不经过第一阶段，开始时就能够进入奇异段。透明质酸发酵属于第三种类型发酵，其发酵的三个阶段应根据其自身的动力学特点来确定。 图6-6-6为S. zooepidemicus H23在以不同初始葡萄糖浓度进行发酵时，菌体生长、产物合成、底物消耗在初始阶段的比速率变化图。从图中可以看出，即使在非常低的初始底物浓度下，其菌体生长、产物合成、底物消耗((i, (i, (i)的比速率也随底物浓度增加而下降，从(的模型曲线可以看出，仅当底物浓度小于3g/L时，(i才随底物浓度增加而增加。作者采用如下方式对发酵过程进行优化：第一阶段为较低葡萄糖浓度下进行的分批发酵，当分批发酵进行到一定程度后，进入第二阶段──奇异优化控制阶段，最后是第三阶段，即分批发酵阶段。
图6-6-6 不同初糖浓度下透明质酸发酵的菌体生长、产物合成和底物消耗的比速率 (二)补料控制点和补料流速的确定 在第一阶段的分批发酵过程中，从何时进入奇异控制阶段，即两阶段的切换点的确定是奇异优化的关键。Lim和Hong采用不同的方法来确定奇异切换点，但都涉及较为复杂的数学计算，我们采用自编C语言程序结合图解法，较方便地解决了奇异点的确定问题。 方程6-6-25给出了奇异控制轨迹曲线方程，根据方程可以得到奇异控制轨迹图。图6-6-7为透明质酸发酵补料糖浓为50 g/L~80 g/L的奇异控制轨迹。随着发酵的进行，底物浓度不断降低，产物浓度不断升高，同样也形成了一条底物对产物(P-S)的一条变化曲线，这条分批发酵P-S曲线与奇异轨迹的交点即奇异控制切换点。分批发酵过程的模型曲线可以通过计算机程序对分批发酵动力学模型计算得到。

图6-6-7 不同补料糖浓时的奇异 图6-6-8 补料液糖浓为70g/L时不同初始 控制轨迹图 糖浓的奇异控制起始点 图6-6-8为补料液浓度为70 g/L时的奇异控制轨迹与不同初糖浓度的分批发酵P-S曲线，从图可以看出，三条分批发酵P-S曲线分别与奇异控制轨迹有着三个交点：A、B、C，当分批发酵分别进行到这三个点时即进入奇异控制阶段，开始补料。补料速率由方程6-6-26给出，根据过程状态参数可得出具体的补加速率。 (三)发酵过程的模型分析 对于前面确定的发酵方式，即分批、奇异补料、分批三阶段，给定如表6-6-2所示条件，以第四节确定的分批发酵动力学模型和前面所述方法进行模型计算。 由图6-6-8可以看出采用补料糖浓度为70 g/L时，初糖浓度为36.7 g/L的分批发酵进入奇异控制阶段切换点时糖浓度为25.7 g/L，此时发酵约进行5.6 h。图6-6-9和图6-6-10为进行奇异控制的发酵过程及补料速率、发酵体积变化曲线。根据方程6-6-26计算出的补料速率进行补料，补料从5.6 h到6.7 h，发酵体积由1.2 L增加至2.0 L。由于加入较高糖浓度的补料液，发酵液中糖浓度迅速升高。而由于稀释作用，细胞干重、透明质酸、乳酸都受到一定程度的稀释，但由于细胞干重、透明质酸和乳酸的总量不断增加，综合起来仅表现出在浓度增加过程中略有停顿，整个发酵结束时乳酸和透明质酸产量均得到了提高。 表6-6-2 模型计算的初始条件 初始葡萄糖 S0/g(L-1 初始体积 V0/L 流加葡萄糖 SF/g(L-1 总 葡萄糖 ST/g(L-1 最终体积 VT/L  36.7 1.2 70 50 2.0  

图6-6-9 奇异控制下的发酵过程曲线 图6-6-10 奇异控制过程补料速率与 发酵体积变化过程曲线 图6-6-11为发酵过程中葡萄糖对乳酸的变化曲线。可以看出，第一阶段进行分批发酵，底物浓度降低，产物浓度升高。当发酵状态达到奇异切换点后，开始按一定速率进行补料，发酵沿着奇异轨迹进行，发酵体系中葡萄糖浓度升高而乳酸浓度略有下降，当补料至预定的限制条件(体积)后，补料结束，发酵进入第三阶段分批发酵阶段。
图6-6-11 总糖为50 g/L的分批发酵与奇异控制发酵过程底物～产物图 (四)奇异优化发酵初始条件在控制过程中的地位 从前面的分析可知，透明质酸发酵的奇异优化可以分为三个阶段，但是否只有奇异控制对优化起作用呢？实际上这是相互关联的三个阶段。若总耗糖量一定，不同补料液糖浓下初始体积和糖浓有如下平衡关系：
(6-6-27) 其中S0、V0、SF、VF、ST、VT分别为初始阶段、补料液以及总发酵液的底物浓度和体积。图6-6-12为不同补料糖浓下初始发酵体积和糖浓的关系。可以看出，对于底物总量一定的发酵，不同的补料液浓度下其初始条件的变化关系是一致的，初始体积增大，初始糖浓度也随之增大，并且有一确定的关系。
图6-6-12 不同补料糖浓下初始发酵体积和糖浓的关系 图6-6-13为不同补料糖浓度下，发酵过程第一阶段的初始糖浓度对优化操作后透明质酸发酵结果的影响。不同的补料糖浓对奇异优化结果的影响没有明显差别。但在补料糖浓度一定的条件下，初始条件对最终的结果有着极大的影响，初始糖浓低时可以得到较好优化结果，而高初糖浓度时优化过程几乎没有作用。一方面高初糖浓度对应着初始发酵体积的增大和补料体积的减少，使得优化的空间减少；另一方面，高的初始糖浓对细胞生长和产物形成具有抑制作用。低初糖浓度不但减轻了底物对产物合成的抑制，而且可以迅速进入奇异控制区，使优化后透明质酸产量得到较大幅度的提高。
图6-6-13 不同补料糖浓时初始发酵糖浓对优化结果的影响 补料糖浓度(g/L)∶◆ 60；■ 70；▲ 80 (五)透明质酸发酵奇异控制优化的进一步讨论 从前面的研究结果可知，透明质酸发酵是一种底物、产物抑制型发酵，高浓度的底物和产物会对菌体生长和产物形成具有强烈的抑制作用。但无论采用高的或低的底物浓度进行补料分批发酵都不能得到好的发酵结果，即使与分批发酵相比，产物浓度、产率系数也都大为下降。而应用奇异优化的方法却可以将产物浓度大大提高。这里，利用分批发酵动力学模型来进一步阐述奇异优化的原理。 从动力学角度来说，控制有利于微生物产物合成的发酵条件，就是使得产物的比合成速率(()最大。对于透明质酸发酵，其动力学方程6-4-14，可以写成：
(6-6-28) (HA取得最大值，也就是透明质酸合成处于最佳状态。方程6-6-28可写成下式：
(6-6-29) 其中：
考察方程6-6-29，W若能取得最小值，则(HA为最大。以底物S(葡萄糖浓度)和PLA(乳酸浓度)为自变量结合参数的具体值作W变化的等高线(图6-6-14)，图内的数字和曲线表示不同值的W线。如果发酵过程处于A状态，发酵继续进行，即沿着a方向进行，可以看出即使底物浓度在降低，W值却是增加的。如果不对发酵体系稀释，迅速加入底物，使体系状态沿着b方向(P不变时等高线的切线)至曲线d左侧某一状态，此时虽然S升高，但W值却不断下降，体系状态至d右侧时，W值则又升高；但若在底物浓度增加的同时伴随稀释的过程，即沿着c方向进行，那么即使体系状态处于曲线d的右侧，W值非但可以维持不变，甚至可以一直降低。对于补料发酵这样一个动态的过程，底物消耗、产物增加的同时还存在着底物的补充和发酵体系的稀释，透明质酸发酵奇异优化轨迹正是一个保持W值最小的S-P的曲线。 我们以最大产物浓度为目标函数得到了奇异优化轨迹，进而确定了最优补料速率，使发酵状态尽可能处于奇异轨迹上，保证了发酵过程尽可能长时间以最大比产物合成速率进行，最终使透明质酸产量有较大幅度的提高。所以说奇异优化的本质是维持最大比产物合成速率。
图6-6-14 方程6-6-29中W值变化的等高线图 表6-6-3 奇异优化控制发酵的初始条件 初始葡萄糖 S0/g(L-1 初始体积 V0/L 流加葡萄糖 SF/g(L-1 总葡萄糖 ST/g(L-1 最终体积 VT/L  12.9 0.7 70 50 2.0  (六)奇异优化控制发酵生产透明质酸 根据前面的研究，对总糖为50 g/L的发酵进行了优化，初始条件列于表6-6-3。当发酵进入奇异控制阶段后，补料速率阶梯增加，发酵过程如图6-6-15和6-6-16所示。从图中可以看出，由于在第一阶段的分批发酵采用了低浓度的底物，细胞很快进入快速生长期，相应地，产物也开始迅速合成，当进入奇异控制阶段后开始补料，由于稀释作用的存在，细胞干重和产物浓度的增加速率减慢。根据前述的奇异控制理论，补料阶段是保证菌体生长比速、产物合成比速在瞬时状态时为最大的操作。由于透明质酸发酵过程动力学的特点，补料速率必须逐渐增大，同时发酵体系中的底物浓度也在增大，这样才能保证底物和产物的综合抑制效果最弱。6 h后补料结束，发酵进入第三阶段分批阶段，直至发酵结束。表6-6-4为奇异控制发酵与分批发酵结果的比较，从表可以看出细胞干重、透明质酸的产量都有较大幅度的提高，转化率提高了7%。

图6-6-15 奇异控制策略 图6-6-16 总糖50 g/L时透明质酸奇异优化过程曲线 ■ 葡萄糖；● 生物量；◆ 透明质酸；▲ 乳酸 表6-6-4 奇异优化与分批发酵的比较 批次 总葡萄糖 /g(L-1 生物量 /g(L-1 细胞产率 /g(g-1 透明质酸 /g(L-1 透明质酸产率 /g(g-1 透明质酸产率增幅/%  1 51.3 2.84 0.055 4.44 0.087 6.6  2 52.1 2.81 0.054 4.56 0.086 7.8  分批 50.5 2.63 0.0471 4.10 0.081 —  六、重复操作与优化补料组合发酵模式生产透明质酸 由于重复分批发酵和优化补料发酵各有优缺点，因此我们将重复分批操作与优化补料操作进行组合，采用组合发酵模式生产透明质酸。与重复分批发酵类似，优化补料重复发酵是在第一次奇异控制发酵结束后，留下部分发酵液作为种子，补充部分新鲜培养基，至奇异控制轨迹上，直接进入奇异控制阶段，按奇异控制方式进行补料至终条件，发酵至结束或进入下一重复阶段。从对奇异优化的研究可以看出，奇异控制的关键是起始控制点的确定。组合模式的重复阶段的起始点，也是奇异控制点，可以通过物料平衡方程6-6-30~6-6-31确定的P-S曲线与奇异控制轨迹的交点来确定。
(6-6-30)
(6-6-31) 其中Pf1、Vf1为第一发酵周期留作种子液中乳酸浓度和体积，P、S为加入新鲜培养基后种子液中乳酸浓度和葡萄糖浓度，VA为重复阶段奇异控制起始点的体积，ST、VT分别为总糖浓度和最终发酵液体积。 若第一次发酵终了时乳酸浓度为42.8 g/L，留下种子液体积200 mL，当补料糖浓为70 g/L时，重复发酵的起始状态为葡萄糖22 g/L，乳酸11 g/L，即图6-6-17中的A点，此时体积为780 mL。通过在种子液中补加糖浓为30 g/L的料液580 mL，即可使重复发酵直接进入奇异控制阶段。图6-6-18是以表6-6-3列出的初始条件进行重复操作与优化补料组合发酵生产透明质酸的过程曲线。可以看出当第一次补料发酵结束后，所留的种子液用适当浓度的料液稀释到奇异控制点(A点)，不经过单一补料发酵所要经过的分批发酵阶段，而直接进入奇异控制发酵阶段，4 h后，达到第二次的发酵总糖和体积，进入分批发酵至结束。表6-6-5列出了重复补料发酵的结果，虽然组合操作的两个循环的结果都比分批发酵要好，但重复阶段发酵透明质酸产率系数的增加幅度已有所下降(第一次为7.9%，第二次5.7%)，可以推测随着重复次数的增加，重复阶段的透明质酸产量会逐渐降低，产率系数也会下降。但毫无疑问，适当次数重复，可以大大提高生产强度。
图6-6-17 重复操作中奇异控制起始点的确定

图6-6-18 重复操作与优化补料组合模式发酵生产透明质酸过程曲线 ■ 葡萄糖；● 生物量；◆ 透明质酸；▲ 乳酸 表6-6-5 组合模式发酵与分批发酵的比较  总葡萄糖 /g(L-1 生物量 /g(L-1 细胞产率 /g(g-1 透明质酸 /g(L-1 透明质酸产率 /g(L-1 透明质酸产率增幅/%  组合发酵 第一次循环 51.6 2.90 0.056 4.52 0.088 7.9   第二次循环 50.2 2.92 0.058 4.31 0.086 5.7  分批发酵 50.5 2.28 0.045 4.10 0.081 —    符号说明： F： 补料速率(L/h) 下标   M(： 分子量 0： 初始状态  H： 哈密尔顿函数 A： 重复发酵奇异控制起始点  P： 产物浓度( g/L) F： 补料液  S： 底物浓度( g/L) f： 操作终了状态  X： 细胞干重( g/L) HA： 透明质酸  Y： 产率系数(g/g) i ： 初始状态  V： 体积(L) LA： 乳酸  (0： 有关限制不等式的拉格朗日常数 m： 最大值  (1~(2： 伴随变量 P： 对产物浓度的微分  (： 比生长速率(h-1) S： 对底物浓度的微分  (max： 最大比生长速率(h-1) T： 发酵终了状态  (： 比产物合成速率(h-1) X： 细胞干重或对细胞干重的微分   第七节 应用代谢工程方法高效生产透明质酸 一、引言 发酵过程控制的目的是得到更多的代谢产物，传统的方法是通过环境条件使其适于细胞生长和产物合成，而代谢工程则为人们提供了新的方法：通过基因工程改造等手段改变细胞内部的代谢通量分配，使细胞在一定环境下生产更多产物。而要对细胞内部代谢通量进行控制首先必需了解细胞在一定条件下的代谢通量分布和分布的规则，进行分析的方法就是代谢通量分析(MFA)。在对生化途径全面了解的基础上，MFA可以根据已知代谢网络的输入输出量确定整个代谢网络内各途径的通量。对于一个已知的过程，MFA可以直接用来确定合成产物的代谢流量的比例，考察过程条件对代谢通量改变的影响，可以预测另外增加新的途径对整个系统的影响，如增加一个还原物质供给途径，预测中心代谢途径可能产生的变化。MFA还可以用来确定代谢网络中的刚性节点及控制步骤，计算理论得率，确定代谢路径，从其它代谢物和已确定的代谢模型来确定不能测量的速率等。 代谢工程的研究已有50年的历史，从20世纪70年代后逐步受到重视。1991年Bailey在Science发表了关于代谢工程的一篇综述文节，对代谢工程进行了全面介绍，此后代谢工程迅速发展。作为代谢工程的基础，MFA方法在国际生化工程界受到普遍重视并得到了广泛的应用。国内的有关研究也正在开展之中，1995年以后，出现了少量综述性论文，近几年逐渐有关于MFA的研究报告发表，但也多为对数据进行初步的分析和对现象的解释，鲜有应用MFA取得较大成果的。在本研究中，我们首先构建出Streptococcus zooepidemicus利用葡萄糖进行代谢的网络图谱，采用代谢网络分析的方法，建立了透明质酸发酵不同阶段的代谢网络模型，并对溶氧控制发酵过程的代谢网络进行了比较研究，结合代谢节点理论探讨了透明质酸真实(实际)转化率较低的原因，对能量通量、还原力通量与透明质酸合成、菌体生长的内在联系进行了分析。然后，根据代谢通量分析提出了一些方法促进透明质酸的生物合成。 二、理论 (一)S. zooepidemicus H23代谢网络的构建 S. zooepidemicus是一类营养要求极为严格的微生物，与链球菌属各菌种一样都为化能异养型菌，兼性厌氧，最低营养要求一般是复杂的，并可能需要氨基酸、嘌呤、肽、维生素等，缺乏完整的TCA循环，其构成菌体的C元素，大多为有机氮源提供。S. zooepidemicus中心代谢是EMP途径，因为在正常的发酵条件下，有80%左右的葡萄糖同型发酵生成乳酸。所需能量大部分只能由葡萄糖经EMP途径生成丙酮酸来提供。 透明质酸是UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)和UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)在透明质酸合成酶作用下合成。葡萄糖由EMP途径形成6-磷酸果糖，然后可在两种酶作用下形成6-磷酸葡萄糖胺，进而合成UDP-GlcNAc。虽然详细的机制还不太清楚，但通过糖醛酸途径合成UDP-GlcA已为许多研究所证实。这两种前体的形成都不需破坏葡萄糖骨架。 之所以有许多营养物质需要外源提供，是因为Streptococcus zooepidemicus 的TCA循环是不完全的，不能提供合成诸如氨基酸，核苷酸等的前体物质。发酵过程中所生成的乳酸及透明质酸、乙酸的量同样也证明该菌种TCA循环极其微弱或不能进行。所以在构建代谢网络时，忽略TCA循环，细胞代谢所需的氨基酸、碱基等均来自培养基。 第五节曾讨论了氧的代谢及乙酸的生成途径，这里采用图6-5-23b所示途径，在有氧参与条件下，通过丙酮酸氧化酶的作用，将部分丙酮酸进一步代谢生成乙酸(若采用a途径构建代谢网络，除部分数据外，所得结果类似)。这样就得到本研究中S. zooepidemicus生物合成透明质酸的反应网络，如图6-7-1所示。
图6-7-1 S. zooepidemicus H23合成透明质酸的代谢网络图 (二)代谢网络分析理论 细胞代谢网络是由至少上千种酶、膜传递系统、信号传递系统组成的，是受精密调控又互相协调的复杂体系。代谢通量分析是根据代谢途径中各反应的计量关系以及实验的某些底物、产物的通量及细胞组成等确定整个代谢网络的通量分布。该方法的基础是准稳态假设：假设细胞内的中间代谢物均处于准稳态，即其浓度变化速率为0，这样由m个中间代谢产物即可得到n个关于速率的约束条件(由计量关系确定)，若待定速率的总数目为J，则待解问题的自由度F=J-n。这样通过实验测出F个不相关速率即可确定整个细胞的代谢通量。 对于一个有m种化学物质参与、进行n个化学反应的生化反应网络。参与的化学物质中有p种物质与胞外环境进行交换(如底物，CO2)，其余的m-p个为胞内代谢中间物质(如ATP，NADH)。对代谢网络进行分析时，需要考虑的反应包括与p种物质运输有关的反应，合成代谢反应，分解代谢反应。对于反应网络中的每个组分，都符合质量守衡定律。平衡方程中应包括∶ 所有的反应j，以及反应过程中，组分i的产生和消耗(有一定变化速率(i)； 各组分的化学计量系数(Si)； 净转化速率(ri)。例如，对于NADP，其平衡方程式可表示为：
(6-7-1) 对第i个组分，则有：
(i=1,2, ((((((,m; j=1,2, ((((((,n) 将m个组分的物料平衡式联立，可以得到如下代谢网络平衡矩阵：
(6-7-2) 其中S为系数矩阵，R为速率矩阵，X为净转化速率矩阵，I为反应方向特征矩阵。 对于胞内的m-p个代谢中间产物，没有净转化发生，即相应的转化速率为零。与环境有交换的物质，其净转化速率可以通过测定或可以通过代谢网络计算得到。最后，反应速率(i则可通过约束条件全部得到。但对于矩阵方程，系数矩阵S的秩R(S)决定了能够求解的最大未知速率数。若R(S)小于待定的速率则其余速率需要另外测定，即共需确定x=[n+p-R(S)]个速率，或通过增加线性不相关方程的方法来增加系数矩阵的秩，才能对方程求解。若R(S)值比待定反应速率数大，则矩阵方程为超定方程组(over-determined)。如果S满秩，超定方程组6-7-2的解为∶
(6-7-3) 其中R为速率矩阵，S为系数矩阵，x为净转化速率矩阵，(为所测量的x的测量噪声方差协方差矩阵(measurement noise variance-covariance matrix)。x的元素可以分为两个子阵，xe和xi分别代表胞外和胞内物质。胞外物质的积累速率xe可以通过一系列的测定数据计算得到，通过准稳态假设可以近似地得到xi=0，由于胞内物质的浓度关系，这种近似处理可以适用于大多数胞内物质。 对于透明质酸发酵，x的元素列于表6-7-1，其中可观测的胞外代谢物为底物、菌体、透明质酸、乳酸、乙酸。由于缺少关于S. zooepidemics 细胞组成的数据，作者采用了Verduyn等测定得到的酵母的有关数据。与之相似，蛋白质、RNA和脂类成分参考文献数据，并假设在细胞生长的各个阶段细胞的组成不变。考虑到细胞生命活动需要一定的维持能，网络中包含了ATP分解的途径。整个代谢网络中的反应见表6-7-2。系数矩阵的秩R(S)与待测速率相等。 表6-7-1 代谢积累速率矩阵 x1 Ac 乙酸  x2 AcCoA 乙酰辅酶A  x3 生物量 菌体  x4 F6p 6-磷酸果糖  x5 Pal 棕榈油酸  x6 Ol 油酸  x7 G1P 1-磷酸葡萄糖  x8 G6p 6-磷酸葡萄糖  x9 GA6p 6-磷酸葡萄糖酸  x10 GAP 3-磷酸甘油醛  x11 Glc 葡萄糖  x12 GlcNAc6p N-乙酰6-磷酸葡萄糖  x13 透明质酸 透明质酸  x14 乳酸 乳酸  x15 PEP 磷酸烯醇式丙酮酸  x16 PSACH 细胞多糖  x17 Pyr 丙酮酸  x18 UDP-Glc UDP-葡萄糖  x19 UDP-GlcA UDP-葡萄糖醛酸  x20 UDP-GlcNAc UDP-N-乙酰葡萄糖   表6-7-2 Streptococcus zooepidemicus合成透明质酸的代谢网络 糖酵解途径 1. Glc+1ATP→1G6P+1ADP 2. G6P→1F6P 3. F6P+ATP→2GAP+ADP 6-4- GAP+ADP+NAD→PEP+ATP+NADH 5. PEP+ADP→PYR+ATP 6. PYR+CoA+NAD→AcCoA+NADH 乳酸合成 7. PYR+NADH→LAC 乙酸合成 8 Pyr+1/2 O2+ADP→CO2+Ac+ATP 透明质酸合成 9. G6P→ G1P 10. G1P+ UTP→UDP-Glc 11. UDP-Glc + NAD → UDP-GlcA+NADH 12. F6P→GA6P 13. GA6P+CoCoA→GlcNAc6P 16-4- GlcNAc6P+UTP→UDP-GlcNAc+CoA 15. UDP-GlcNAc+ UDP-GlcA→HA+2UDP 氨基酸聚合 16.amino acid +4ATP→4.8248 Protein +4ADP 核酸合成 17. nucleotide+3.2279ATP+2.2279H2O→9.466RNA+3.2279ADP 脂肪合成 18. 8AcCoA+15ATP+15NADH→Pal(palmitoleate)+8CoA+15ADP+15NAD 19. 9AcCoA+17ATP+17NADH→Ol(Oleate)+9CoA+17ADP+17NAD 细胞多糖 20. 0.1667G6P+0.1667ATP→PSACH(polysaccharide)+0.1667ADP 细胞合成 21. 0.47003Protein +0.35376PSACH+0.05234RNA+0.00344PAL+0.00344OL+0.00266GAP→Biomass ATP消耗 22. ATP→ADP 23. ATP+UDP→ADP+UTP 24*. NADH+H++ ADP+1/2O2→NAD++pATP+H2O  *: p was 3 as ratio of P to O。 三、分批发酵不同阶段的代谢网络模型 从前面的研究可以知道，在通常条件下，S. zooepidemicus 发酵生产透明质酸的分批发酵过程可分为三个阶段。第一个阶段为细胞生长的延滞期(初糖浓度为50 g/L时，0 h~8 h)，这个阶段细胞生长、产物合成和底物消耗速率都较慢；第二个阶段(8 h~13 h)，细胞生长、产物合成和底物消耗的速率都比较快；而第三个阶段(13 h~16 h)，透明质酸合成速率减慢，而菌体生长却还保持较快的生长速率。 图6-7-2~6-7-4为不同的发酵阶段(3 h, 10 h, 14 h)的代谢网络模型。为了便于对不同阶段或条件下计算得到的代谢通量进行比较，图中数据是以底物葡萄糖浓度为基础经标准转换后所得。经过分析比较可以发现，不同阶段代谢流量的变化主要集中在透明质酸合成途径及菌体合成途径。虽然第一阶段中发酵体系中溶氧浓度(DOT)比较高，而第二阶段中DOT较低，但乙酸合成的通量却相差不大。不同阶段细胞代谢活力不同，荚膜合成及细胞对荚膜的维持能力亦不一样，导致抵抗氧的能力也会不同，使得代谢网络在这两阶段对溶氧的应答也不一样。到第二阶段，合成透明质酸的通量增大，合成菌体的通量减小。第三阶段合成乙酸通量减小，合成菌体的通量迅速增加至三个阶段中的最大值，而合成透明质酸前体的通量却有较大幅度减小。在这种发酵条件下，三个阶段中乳酸的通量基本不变。
图6-7-2 分批发酵第一阶段代谢网络模型
图6-7-3 分批发酵第二阶段代谢网络模型
图6-7-4 分批发酵第三阶段代谢网络模型 当初始糖浓度不同时，发酵各阶段所占的时间会略有改变，但不同初始糖浓度对代谢通量并没有显著的影响，这或许暗示着底物对菌体的抑制作用与细胞吸收底物的运输机制的关系更为密切。 四、不同溶氧水平下透明质酸发酵的代谢网络模型 由于细胞代谢是由一个受到精密调控而又彼此协调的代谢网络来完成的，在通常情况下，细胞在代谢过程中会尽可能维持最优的资源配置。细胞对不同的环境条件会作出不同的响应，但所形成的新平衡应该是经过最优化后的平衡。初糖浓度的改变，没有能使代谢通量分布发生较大的变化，这是一种细胞在环境条件改变后对资源重新优化后的结果；但在不同的DOT下，资源重新配置后的结果却是代谢网络发生较大的改变。 图6-7-5~6-7-7为发酵进行到7 h后，即发酵进入第二阶段，控制不同DOT时的代谢通量模型。分析比较后可以发现，不同的DOT下，无论是细胞还是产物的合成通量都产生了极大的变化。溶氧1%时，代谢网络的通量与分批发酵时的较为接近，这可能是因为两种情况下DOT相差不大，氧的摄入量较为接近所致。提高溶氧后，虽然EMP途径的通量改变不大，但丙酮酸之后的流量进行了重新分配，合成乙酸的通量大大增加，CO2胞外通量也加大；相应的，乳酸合成通量减小，合成乙酰辅酶A的通量也略有减小；另外合成透明质酸的通量与合成菌体的通量之比迅速增大。DOT的增加刺激了丙酮酸氧化酶的活力，使得丙酮酸的分配发生了较大的改变。随着这种改变，EMP途径也作了适量的调整，受影响最大的是合成细胞成分的通量和合成透明质酸前体的通量，表现在透明质酸合成通量随DOT增加而降低，而菌体合成通量则随DOT增加而大幅增加。
图6-7-5 分批发酵第二阶段DOT控制在1%时的代谢网络模型
图6-7-6 分批发酵第二阶段DOT控制在5%时的代谢网络模型
图6-7-7 分批发酵第二阶段DOT控制在10%时的代谢网络模型 五、代谢节点对透明质酸合成的影响 (一)透明质酸合成的理论转化率 理论转化率就是假定在没有菌体生长和多余副产物时，碳源以最大可能转化为产物，此时的转化率即成为理论转化率。计算产物合成的理论转化率，通常是结合代谢途径和辅酶再循环，考虑热力学定律，以质量守衡为基础进行的。 透明质酸合成反应为代谢网络中的反应15。从底物葡萄糖开始完成反应15，需包括反应1~6、9~15、22~24，在有氧参与的情况下，将所有反应合并，得下式∶
(6-7-4) 式中透明质酸的系数为透明质酸的C-mol系数，P/O比按3计。根据该反应式进行计算，透明质酸得理论产率为0.93 C-mol/C-mol，或0.84 g/g。而实际上，透明质酸发酵的转化率通常为0.1 g/g或以下，与最大理论转化率0.84 g/g比相差很大。这说明Streptococcus合成透明质酸的代谢网络中另外有着其它因素影响透明质酸的合成。 (二)代谢节点性质与透明质酸合成的关系 代谢网络中联结不同代谢途径的点叫代谢节点，对产物合成量产生较大影响的则称关键节点，通常关键节点仅是所有代谢节点中的一部分。代谢节点分析的主要方法是确定关键节点的通量分配比，如果一个节点在受到扰动时，通量分配比保持不变，则说明这个节点是刚性的，若改变显著则说明其为弹性节点，介于其间的是弱刚性节点。 分析图6-7-1可以发现，G1P和GA6P是合成透明质酸的前体，说明G6P节点和F6P节点是合成透明质酸的关键节点，AcCoA是合成前体GlcNAc-6P的原料，所以丙酮酸节点也是一个关键节点。图6-7-8~6-7-10为这3个节点在发酵第一阶段和控制不同DOT的第二阶段经通量标准转换后的代谢通量图。由于G1P和GA6P都为透明质酸合成的前体，G6P节点和F6P节点为相互依赖的节点，对透明质酸合成所起的作用相同。从图中数据可以看出，在不同情况下，这两个节点沿EMP途径的分量始终占流入量的绝大部分，而合成透明质酸前体的通量仅为流入量的一小部分，不同条件并不能显著改变代谢流的分配流向，同时透明质酸在发酵过程中对细胞代谢没有反馈抑制作用，可以认为这两个节点为弱刚性节点。对于丙酮酸节点来说，虽然不同条件下节点的流量分配产生了很大的变化，并且所产生的分支代谢产物乳酸和乙酸都会有较强的反馈抑制作用，但乙酰辅酶A的分量没有大的变化，同时合成的透明质酸的量也没有表现出反馈抑制作用，所以可以说丙酮酸节点相对乳酸和乙酸合成来说是弹性节点，而对透明质酸来说则更接近刚性节点。



(a) (b) (c) (d) 图6-7-8 不同发酵阶段或条件下G-6-P节点代谢通量分配



(a) (b) (c) (d) 图6-7-9 不同发酵阶段或条件下F-6-P节点代谢通量分配



(a) (b) (c) (d) 图6-7-10 不同发酵阶段或条件下Pyr节点代谢通量分配 不同性质的节点对产物的形成起着不同的作用。对于刚性节点，环境条件的改变不能改变其通量分配比，若其中一个分量改变，其节点流入流出量也会改变，以保证各分量之间稳定的分配比；对于弹性节点，当代谢途径受到扰动时，通量分配比可能会发生大的改变，而流入量却不一定改变，同时出现途径终端产物对节点的反馈抑制现象；而弱刚性节点则是介于其间的一种，受到扰动时，节点通量会作出相应的调整，但调整的幅度不会太大，如条件适宜，产物合成的通量可能会达到最大，在另一条件下也可能会较小。 由于有关合成透明质酸的关键节点均为弱刚性节点，所以控制一定条件可使合成透明质酸的产率系数在一定范围内有所提高。但若仅以条件优化的方法，使得透明质酸的产量、产率系数有大幅度提高，似乎不太可能。可以设想，采用基因工程等手段，同时增强有依赖关系的G1P和F6P节点的弹性(不一定仅由分支点的酶决定)，在热力学允许的范围内，大幅度提高透明质酸的产量和产率系数是完全可能的。 六、透明质酸发酵过程中能量、还原力的需求与供给 能量是物质运动的基础，微生物通过氧化还原反应或光合作用获得能量，然后通过生物合成作用利用这些能量来制造生物体的必需物质。从热力学角度来考虑，反应能否进行，要看是否有足够的能量来推动，代谢网络的正常运转同样符合热力学的定律。 代谢网络中反应22中的ATP为网络中正常进行时过量的ATP值，即用于细胞维持以及无效循环时所用的ATP通量。通常，在快速生长期，无效循环量比较低，反应22中的ATP通量主要用于细胞维持。相对的，在细胞生长后期，维持能下降，无效循环活力增强。所以反应22中的ATP通量并不总等于细胞的维持需求。细胞真实维持能最可能的值是接近于快速生长或产物合成时过量的ATP值。从前面的结果可知，在分批发酵过程中，初期细胞的比生长速率最高，其后几乎一直在下降。所以图6-7-2中的ATP通量最有可能代表着真实的细胞维持能，约43(标准单位)。 表6-7-3为S. zooepidemicus H23在分批发酵各阶段和控制溶氧发酵时，代谢网络中ATP通量与透明质酸合成以及细胞合成通量的关系。可以发现，ATP通量与透明质酸合成和细胞合成有着密切的关系。高的ATP通量伴随着细胞合成通量的增加，但在发酵第二阶段，即使有非常高的ATP通量，其细胞合成通量依然不能达到正常发酵第一阶段时的细胞通量值，同时高ATP通量时，透明质酸合成通量则较低；而前者低时，后者则较高。 表6-7-3 ATP、NADH代谢通量与透明质酸和细胞合成代谢通量的关系 条件 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ  ATP  28.15  28.32  28.51  34.37  42.61  NADH  4.91  4.74  4.40  9.57  16.56  总ATP  42.87  42.55  41.72  63.06  92.28  透明质酸通量  7.97  9.59  9.65  6.92  4.89  生物量通量  3.11  2.29  1.94  2.56  2.57  注∶条件Ⅰ，分批发酵第一阶段；条件Ⅱ，分批发酵第二阶段；条件Ⅲ~Ⅴ，DOT分别为1%、5%、和10%的分批发酵第二阶段；总ATP是指由NADH以 P/O=3氧化得到的通量。 合成一种产物，不仅需要各种前体，而且途径上各种酶都应当保持正常的活力。若某一个酶受到抑制，势必影响整个途径的正常进行。从发酵第二阶段不控制DOT和控制DOT时ATP和NADH通量的变化可以看出，ATP和NADH通量越高，透明质酸合成通量越小。高的ATP和NADH通量必然引起ATP、NADH库容量的升高，这是否意味着透明质酸合成途径受到ATP和NADH的抑制呢？从代谢网络中的反应可以发现，透明质酸的前体UDP-Glc在UDP-Glc脱氢酶作用下生成UDP-GlcA，同时形成一个NADH，若此酶受到NADH的抑制，则透明质酸的合成必然受到抑制。对于细胞合成亦可解释。细胞合成的前体物质都需要ATP和NADH(网络中反应16~20)，可以认为无论是ATP还是NADH都能促进反应的进行。这样，不难理解为什么高ATP和NADH通量会促进细胞生长。 S. zooepidemicus细胞代谢的正常进行需要胞外包含氨基酸在内的多种生长必需物质，若培养基中可直接利用的生长因子处于限制状态，就有可能使细胞合成的通量减小。表6-7-3表明，当发酵进行到第二阶段时，提供的ATP和NADH通量都不能使细胞合成通量达到发酵第一阶段的通量。其原因有可能是∶由于S. zooepidemicus对营养要求极其苛刻，发酵进入第二阶段后，细胞大量生长，对营养因子的需求量也必然增大，培养基中可能会有部分生长必需物质处于限制性状态(缺少或处于结合态)，这必然会限制细胞的生长，导致细胞合成的通量比第一阶段降低。 从以上分析可以发现，细胞生长需要NADH提供还原力，而NADH又可能对透明质酸合成有抑制作用，若细胞合成速率加快，NADH的通量或NADH库浓度则会降低，这样透明质酸合成的通量就可能增大。所以本节以下内容将探讨增大细胞合成通量的方法，并设法降低NADH库的浓度以提高透明质酸合成通量，最终达到提高透明质酸产量和转化率的目的。 七、采用代谢工程方法高效生产透明质酸 S. zooepidemicus是一种营养要求苛刻的微生物，需提供许多生长必需物质才能正常生长。核苷酸是菌体合成细胞遗传物质的重要组分，是菌体生长的必要物质，透明质酸的两种前体物质尿嘧啶核苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和尿嘧啶核苷二磷酸-N-乙酰氨基-葡萄糖(UDP-GlcNAc)中均含有尿嘧啶核苷二磷酸(UDP)。S. zooepidemicus不能完全由自身合成核苷酸，所以只有保证充足的核苷酸、特别是尿嘧啶核苷酸(UMP)的供给，细胞才能进行正常的生长代谢，透明质酸才能正常合成。此外，由于H23菌株缺乏合成多种氨基酸的能力，外源氨基酸必须均衡全面地供给，这样保证细胞正常生长，各种酶系才能发育良好。 (一)核苷酸类物质对发酵生产透明质酸的影响 1、不同碱基对发酵的影响 碱基类物质是菌体生长的必需物质，可以作为前体合成核苷酸，提供菌体生长所需的遗传物质。在摇瓶培养基中考察腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)对透明质酸生产的影响，结果如图6-7-11所示。可以看出，添加尿嘧啶后透明质酸的产量和细胞干重均显著增加，而添加其它碱基对透明质酸的合成没有明显的影响。酵母粉是一种复合有机氮源，其含有的多种生长因子已基本能满足微生物的生长代谢，但其所提供的尿嘧啶显然不能满足要求，所以必须在发酵过程中添加适量的尿嘧啶。
图6-7-11 各种碱基类物质对透明质酸生产的影响 2、采用尿嘧啶增强型培养基发酵生产透明质酸 根据以上实验结果，进一步对尿嘧啶添加量进行研究，结果见表6-7-4。可见，培养基中添加尿嘧啶后，细胞干重、透明质酸的产量比对照均有明显提高。当尿嘧啶的添加量为0.05 g/L时，细胞干重、透明质酸的产量和产率系数都最高，比对照样分别提高了28.0%、31.2%。过高的添加量不利于菌体生长和产物形成。尿嘧啶在发酵过程中主要起了两个作用∶一是促进菌体生长，另一是可用于合成透明质酸的前体物质，从而促进透明质酸的合成。如果尿嘧啶量不足，既限制细胞生长又限制透明质酸合成，会使细胞合成通量和透明质酸合成通量减小，代谢向乳酸等副产物合成的方向进行。从细胞和透明质酸提高的比率来看，适量添加尿嘧啶更有利透明质酸的合成，这可能是尿嘧啶优先用于细胞的生长，从而在尿嘧啶供应不足的情况下，用于透明质酸合成的尿嘧啶会更加缺乏；一旦有充足的尿嘧啶供给，既可以降低NADH库浓度，减轻对透明质酸合成途径抑制，同时又有足够的透明质酸前体物质的合成原料，大大提高了透明质酸的合成通量，使代谢向透明质酸方向进行。此外，从图6-7-1可以看出，合成透明质酸的过程中，UDP是可循环利用的。因此，透明质酸发酵对尿嘧啶的需求量并不是很大，过高的尿嘧啶浓度反而会对透明质酸的合成形成抑制，表明只有将其控制在一个合适的浓度，才能既促进菌体生长又促进透明质酸合成。 表6-7-4 尿嘧啶对透明质酸发酵的影响 尿嘧啶 / g(L-1 0.003 0.005 0.008 对照  生物量 / g(L-1 2.89 3.21 2.91 2.46  透明质酸 / g(L-1 0.40 0.41 0.37 0.31  葡萄糖 / g(L-1 12.25 11.93 12.05 12.5  细胞产率 / g(g -1 0.097 0.106 0.097 0.083  透明质酸产率 / g(g-1 0.013 0.014 0.012 0.010  注∶初始葡萄糖为42 g/L (二)维生素对透明质酸生产的影响 摇瓶培养中八种维生素对透明质酸发酵的影响如表6-7-5所示。可以看出，添加维生素没有使透明质酸的产量有明显的提高，某些维生素添加后，透明质酸的产量反而有所下降。表明细胞在生长代谢过程中对维生素的需求量非常小，而酵母粉中含有的各种维生素已能满足这种需求，另行添加只会造成维生素过量，对菌体生长和透明质酸合成形成抑制。 表6-7-5 维生素对透明质酸生产的影响 微生素 辅酶Q 生物素 烟酰胺 核黄素 泛酸 钴铵素 吡哆醇 硫胺素 对照  添加浓度 / m g/L 0.8 0.01 2.0 0.4 0.8 0.1 1.0 0.4 —  透明质酸 / g/L 0.40 0.37 0.39 0.35 0.39 0.41 0.40 0.46 0.43  (三)氮源中氨基酸对透明质酸发酵的影响 1、透明质酸发酵全过程的氨基酸分析 微生物生长约需20种氨基酸，对于有多种氨基酸缺陷的S. zooepidemicus来说，其生长和代谢需要供给各种氨基酸。若供给均衡，消除少部分氨基酸的限制，减轻过量氨基酸的抑制，可以加速细胞的生长，从而降低NADH库浓度，减轻透明质酸合成途径所受的抑制，进而达到促进底物转化成透明质酸的目的。H23菌株在发酵过程中对各种氨基酸的利用情况如表6-7-6所示。可以看出，在测定的16种常见氨基酸中，精氨酸是明显缺乏的，在整个发酵过程中，几乎都不能检出。 表6-7-6 分批发酵过程中游离态氨基酸的变化 氨基酸 / g(L-1 发酵时间 /h   2 6 8 12 16  Asp 0.34 0.33 0.33 0.42 0.37  Thr 0.34 0.32 0.33 0.31 0.19  Ser 0.32 0.37 0.38 0.22 0.05  Glu 0.86 1.37 1.31 1.51 1.27  Gly 0.26 0.24 0.25 0.16 0.24  Ala 0.71 0.70 0.72 0.67 0.51  Cys 0.06 0.06 0.06 0.11 0.09  Val 0.51 0.48 0.51 0.52 0.37  Met 0.17 0.17 0.17 0.17 0.12  Ile 0.42 0.41 0.43 0.39 0.23  Leu 0.80 0.78 0.81 0.71 0.47  Tyr 0.15 0.14 0.14 0.13 0.09  Phe 0.41 0.40 0.41 0.39 0.30  Lys 0.38 0.34 0.36 0.44 0.37  His 0.10 0.10 0.10 0.12 0.10  Trp 0.10 0.08 0.09 0.09 0.07  Pro 0.18 0.19 0.19 0.23 0.22  Arg 0 0.02 0 0 0  细胞在生长过程中分泌出胞外蛋白酶，将胞外蛋白质降解成氨基酸，以供细胞吸收利用，如果细胞所需氨基酸的比例与所降解得到的氨基酸比例不一致，那么就会有部分氨基酸限制微生物的生长。如图6-7-12所示，虽然发酵体系中总精氨酸的浓度并不低，但游离精氨酸量始终为零，表明细胞对精氨酸需求量比较高，从分解外源蛋白中生成游离态的精氨酸的速率满足不了菌体生长和产物合成的需求。
图6-7-12 分批发酵过程中总精氨酸含量的变化 2、采用精氨酸增强型培养基发酵生产透明质酸 根据以上分析，考察在摇瓶发酵培养基中添加精氨酸对透明质酸发酵的影响，如表6-7-7所示。可以发现，培养基中精氨酸后，不仅细胞干重和透明质酸产量有所提高，而且产率系数也增加。当精氨酸添加量从0.02 g/L增加到0.06 g/L，透明质酸产量和产率系数分别从0.41 g/L、0.013 g/g增加到0.51 g/L、0.016 g/g。继续提高浓度，透明质酸产量和产率系数逐渐降低，说明过高的精氨酸浓度会对透明质酸合成产生抑制。分析数据可以发现，在精氨酸添加量在0.06 g/L时，透明质酸和细胞的产率系数分别提高了19%和45%，说明合成细胞的代谢通量比合成透明质酸的增加得多。其原因可能是精氨酸为合成细胞组分的必要成分，精氨酸限制消除后，细胞首先得以大量生长，使NADH库浓度降低，进而解除了对透明质酸合成途径的抑制，使透明质酸通量得到一定程度的提高。 表6-7-7 精氨酸对透明质酸发酵的影响 精氨酸 / g(L-1 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 Control  剩余葡萄糖 /g(L-1 12.13 11.84 11.52 12.06 12.27 12.6  生物量 /g(L-1 2.58 2.73 2.93 2.68 2.52 2.37  透明质酸 /g(L-1 0.41 0.45 0.51 0.43 0.42 0.33  细胞产率 /g(g-1 0.084 0.088 0.093 0.087 0.082 0.078  透明质酸产率 /g(g-1 0.013 0.014 0.016 0.014 0.014 0.011  注∶初始葡萄糖浓度为43 g/L (四)采用营养强化培养基高效生产透明质酸 根据摇瓶实验得到的结果，在2.5 L小型发酵罐中进一步考察添加精氨酸和尿嘧啶对透明质酸发酵的影响，并与不添加精氨酸和尿嘧啶的小罐实验进行比较，结果如图6-7-3所示。容易看出，添加和不加营养因子的发酵过程有显著差异。添加了营养因子后，菌体延滞期变得不太明显，生长速率明显加快，透明质酸合成速率也大大提高，最终透明质酸浓度由4.1 g/L增加到5.2 g/L，提高了27%；透明质酸的分子量也提高显著，由1.9(106 Da升至2.15(106 Da。相应地，添加了营养因子后，葡萄糖消耗速度明显快于不添加营养因子的情况，整个发酵过程只需12 h左右，仅为不加营养因子时发酵所用时间的3/4，提高生产强度68%。
图6-7-13 营养因子对小罐发酵生产透明质酸影响 ◆ 营养增强培养基；▲ 普通培养基 (五)营养增强培养基中S. zooepidemicus H23代谢网络模型及分析 图6-7-14~6-7-15为采用营养增强培养基后S. zooepidemicus的代谢网络模型。与采用普通培养基进行发酵时的代谢网络模型(图6-7-2、6-7-3)相比，合成副产物的通量变化不大，而细胞和透明质酸的合成通量则有差别。发酵第一阶段，培养基营养增强后，细胞组分合成通量略有增加而透明质酸代谢通量却有显著提高，分别提高了6.2%和24.0%；及至第二阶段，合成细胞组分的通量进一步增加，增加量为34.7%，而透明质酸合成通量的增加量却减小，为10.3%。从图及表6-7-8可以看出，添加营养因子后发酵的两个阶段的ATP、NADH通量都有所减小，进一步验证了前面代谢通量分析的研究结果。关于NADH代谢通量在细胞生长代谢和产物合成中所起的作用已有许多报道，若途径需要NADH提供还原力，则高NADH通量可以促进产物合成。对透明质酸合成而言，其生物合成不仅不需要NADH，合成途径还可以向其它反应提供NADH，因此透明质酸的合成受到高NADH通量的抑制是很自然的，符合细胞经济学原理。
图6-7-14 分批发酵第一阶段代谢网络模型
图6-7-15 分批发酵第二阶段代谢网络模型  表6-7-8 不同培养基对ATP代谢通量与透明质酸和细胞合成代谢通量的影响 普通培养基 营养强化培养基   第一阶段 第二阶段 第一阶段 第二阶段  ATP 28.15 28.32 26.59 25.88  NADH 4.91 4.74 4.86 4.23  总ATP 42.87 42.55 41.18 38.57  透明质酸通量 7.97 9.59 9.88 10.58  生物量通量 3.11 2.29 3.31 3.09   符号说明： I 反应方程特征值矩阵 ( 速率(mol/(L(h))  R 反应物矩阵 ( x的测量噪声方差协方差矩阵  R' 反应方程矩阵    R 矩阵的秩    r 反应组分净转化速率(mol/(L(h))    S 化学计量系数    S 化学计量系数矩阵    x 净转化速率矩阵    xe 胞外物质的积累速率(mol/(L(h))    xi 胞内物质的积累速率(mol/(L(h))     第六章主要参考文献 Armstrong D. C., Johns M. R. Culture conditions affect the molecular weight properties of hyaluronic acid produced by Streptococcus zooepidemicus. Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63: 2759~2764. Bailey J. E. Toward a science of Metabolic engineering. Science. 1991, 252: 1668~1675. Fouissac E., milas M., Rinaudo M.. Shear rate, concentration , molecule weight, and temperature viscosity dependencies of hyaluronate, a wormlike polyelectrolyte. Macromolecules. 1993, 26: 6945~6951. Johns M. R., Goh L.-T., Oeggerli A. Effect of pH, agitation and aeration on hyaluronic acid produced by Streptococcus zooepidemicus. Biotech. Lett. 1994, 15(5): 507-512. Kim J.-H., Yoo S., Oh D., et al. Selection of a Streptococcus equi mutant and optimization of culture conditions for the production of molecular weight hyaluronic acid. Enzyme and Microbial Technol. 1996, 19: 440~445. Milligan T. W., Doran T. I., Straus D. C., Mattingly S. J. Growth and amino acid requirements of various strains strains of group B Streptococci. J Clin. Microbiol. 1978, 7:28~33 Stephanopoulos G., Vallino J. J. Net rigidity and metabolic engineering in metabolic overproduction. Science. 1991, 252: 1675~ 1681. Swann D. A. et al. Biosynthesis of hyaluronic acid. US Patent 4,897,349, 1990. Tribe L. A., Briens C. L., Margaritis A. Determination of the volumetric mass transfer coefficient (kLa) using the dynamic "gas out-gas in" method: analysis of errors caused by dissolved oxygen probes. Biotechnol. Bioeng. 1995, 46: 388~392. Van Dijken W. M., Heijnen J. J. A. metabolic network stoichiometry analysis of microbial growth and product formation. Biotechnol. Bioeng. 1995, 48: 681~698. Yano Y., Nakahara T., Kamiyama S., Yamasa K. kinetic studies on microbial activities in concentrated solutions: Part Ⅰ: effect of excess sugars on oxygen uptake rate of a cell free respiratory system. Agr. Biol. Chem. 1966, 30: 42~48. 陈乌桥，刘祖同，孔金明．透明质酸产生菌的诱变育种及发酵条件．清华大学学报．1994，34(6)：63~67． 赤坂日出道，驹崎久幸，柳光男，株式会社资生堂．アルロン酸の制造方法．日本公开特许公报，昭58-56692，1983． 伦世仪．生化工程．中国轻工出版社，北京，1993． 戚以政，汪叔雄．生化反应动力学与反应器．化学工业出版社，北京，1996． 山根恒夫著，周斌译．生化反应工程．西北大学出版社，西安，1992． 沈同，王镜岩．生物化学．高等教育出版社，北京，1992． 陶文沂．工业微生物生理与遗传育种学．中国轻工出版社，北京，1997． Shi H. Metabolic systems engineering approach for the efficient metabolic production. Ph.D. dissertation. Kyushu institute of technology, 1999 高海军．Streptococcus zooepidemicus生物合成透明质酸的过程优化与代谢网络分析．无锡轻工大学博士学位论文，1999年12月 高海军，陈坚，管轶众，等．不同培养方式下兽疫链球菌发酵生产透明质酸的研究．应用与环境生物学报，1999，5(6): 614-617 高海军，陈坚，章燕芳，堵国成．营养条件对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响，生物工程学报，2000，16(3): 396-399  第六章 透明质酸发酵过程优化 1 第一节 透明质酸发酵概述 1 一、透明质酸的分布、结构、性质与应用 1 二、透明质酸的生物合成 2 三、透明质酸的生产 4 四、透明质酸生产中需要解决的问题 6 五、本章主要内容 6 第二节 透明质酸摇瓶发酵条件的研究 7 一、引言 7 二、种子培养基组成及培养条件对透明质酸发酵的影响 8 三、种子生长过程曲线和种龄的确定 10 四、发酵培养基组成对透明质酸发酵的影响 10 五、培养条件对透明质酸发酵的影响 14 六、透明质酸摇瓶发酵过程曲线 15 七、透明质酸摇瓶补料发酵实验 15 第三节 分批发酵生产透明质酸条件的研究 16 一、引言 16 二、初糖浓度对透明质酸发酵的影响 16 三、pH对透明质酸发酵的影响 18 四、温度对透明质酸发酵的影响 19 五、搅拌转速对透明质酸发酵的影响 19 六、通气量对透明质酸发酵的影响 20 七、分批发酵培养条件的优化与控制 20 第四节 透明质酸分批发酵动力学及分批发酵过程模型化 21 一、引言 21 二、理论与模型建立 21 三、乳酸对透明质酸发酵的影响 24 四、动力学模型参数的求解 25 五、动力学模型的适用性 26 六、功能单元的酶学一致性 27 七、讨论 28 第五节 高效生产透明质酸的搅拌与溶氧浓度控制策略 30 一、引言 30 二、发酵体系的流变学特性与传质性能 30 三、搅拌转速对透明质酸发酵过程的影响 34 四、溶氧浓度对发酵生产透明质酸的影响 39 五、透明质酸发酵的搅拌与溶氧浓度控制策略 40 六、氧代谢途径及其影响透明质酸合成的作用机制 41 第六节 不同发酵模式生产透明质酸的组合操作与优化 43 一、引言 43 二、补料分批发酵优化理论 44 三、重复分批发酵 46 四、非优化补料分批发酵与分批发酵的比较研究 47 五、奇异优化控制的补料发酵 48 六、重复操作与优化补料组合发酵模式生产透明质酸 53 第七节 应用代谢工程方法高效生产透明质酸 55 一、引言 55 二、理论 56 三、分批发酵不同阶段的代谢网络模型 59 四、不同溶氧水平下透明质酸发酵的代谢网络模型 62 五、代谢节点对透明质酸合成的影响 63 六、透明质酸发酵过程中能量、还原力的需求与供给 65 七、采用代谢工程方法高效生产透明质酸 66