《发酵工程》电子教案：第八章PHA

第八章 聚羟基烷酸酯发酵过程优化 1 第一节 聚羟基烷酸酯发酵概述 1 一、PHAs的结构、物理化学性质和应用 1 二、PHAs的生物合成 2 三、本章主要内容 8 第二节 真养产碱杆菌生产PHB摇瓶发酵条件的研究 9 一、引言 9 二、PHB摇瓶发酵条件研究与补料优化 9 三、PHB发酵过程中理论产率的计算 14 第三节 真氧产碱杆菌连续培养动力学及二级连续培养系统生产聚羟基丁酸 17 一、引言 17 二、真养产碱杆菌一级连续培养动力学 17 三、二级连续培养生产PHB的动力学研究 22 四、二级连续培养系统中PHB的生产强度和PHB对葡萄糖的产率系数 26 第四节 聚羟基丁酸分批发酵过程动力学模型及优化 27 一、前言 27 二、不同供氧水平对PHB发酵过程的影响 27 三、不同初糖浓度对PHB发酵过程的影响 29 四、PHB分批发酵过程分析和控制 33 五、PHB分批发酵动力学 34 六、PHB分批发酵过程动力学的分析 38 第五节 聚羟基丁酸流加发酵条件研究 40 一、前言 40 二、氮源的限制、缺乏和恢复氮源供应对R. eutrophus菌体生长和PHB合成的影响 40 三、葡萄糖的限制、缺乏和恢复供应对R. eutrophus菌体生长和PHB合成的影响 43 四、限氧和恢复氧供应对生长和PHB合成的影响 44 五、培养过程中的不同停氮时间对PHB形成的影响 46 六、PHB合成期不同的氮源流加速率对PHB合成的影响 48 第六节 聚羟基丁酸双底物流加发酵准优化控制策略 54 一、引言 54 二、PHB流加发酵过程的准优化控制研究 54 第七节 羟基丁酸与羟基戊酸共聚物发酵条件的优化 67 一、引言 67 二、PHBV摇瓶发酵条件研究 67 三、2 L罐中PHBV流加发酵过程的准优化控制 73 第八章 聚羟基烷酸酯发酵过程优化 第一节 聚羟基烷酸酯发酵概述 一、PHAs的结构、物理化学性质和应用 聚羟基烷酸酯(Polyhydroxyalkoates，简称PHAs)是生物可降解材料的一个研究热点。其中聚-(-羟基丁酸(简称PHB)及3-羟基丁酸与3-羟基戊酸的共聚物(简称P(3HB-co-3HV)或PHBV)是PHAs族中研究和应用最广泛的两种多聚体。PHAs作为一种有光学活性的聚酯，除具有高分子化合物的基本特性，如质轻、弹性、可塑性、耐磨性、抗射线等外，更重要的是其还具有生物可降解性和生物可相容性。已有研究表明，采用PHAs制作的香波瓶，在自然环境中9个月后，可基本上被完全降解，而用合成塑料制作的同样物品，完全降解的时间约需100年。因此研究和开发PHAs作为各种容器、瓶、袋和薄膜等包装材料，使之成为同类用途的石化合成塑料最有潜力的替代品，对避免或减少塑料废物对环境的污染，具有深远的环境意义。 多种微生物在一定条件下能在胞内积累PHAs作为碳源和能源的贮存物。由于PHAs具有低溶解性和高分子量，它在胞内的积累不会引起渗透压的增加，因而，它们是一类理想的胞内贮藏物，比糖原、多聚磷酸或脂肪更加普遍地存在于微生物中。PHAs的通式可写成：
式中R多为不同链长的正烷基，也可以是支链的、不饱和的或带取代基的烷基。R为甲基时，其聚合物为聚-(-羟基丁酸(PHB)，R为乙基时，其聚合物为聚-(-羟基戊酸(PHV)，其它依此类推。此外，在一定条件下两种或两种以上的单体还能形成共聚物，其典型代表是3HB和3HV组成的共聚物P(3HB-co-3HV)。 至今为止发现的PHAs几乎都是线状的(-羟基烷酸的聚酯。(-碳原子的手性决定了这些多聚物具有光学活性，所有的组成单位仅以R型存在。采用溶剂法从不同细菌中提取的多聚物，有些多聚物的分子量可高达2×106，对应聚合度约为20,000，其理化性质和机械性能(如韧度、脆性、熔点、玻璃态温度和抗溶剂性等)与单体的组成有密切的关系。例如，在PHBV共聚物中增加(-羟基戊酸的组分可使熔点从180 ℃(PHB均聚物)降至75 ℃(PHBV共聚物中HV组分为30-40 mol %)。再如，从食油假单孢菌(P. oleovorans)中提取的中长链PHAs可溶于丙酮或乙醚，而PHB不能溶解。 目前大多数关于PHAs理化性质的研究是针对PHB和PHBV两种聚合物进行的。PHB是100 %立体专一性的，所有的不对称碳原子都是D-(-)构型，因而PHB是高度结晶的晶体，结晶度的范围在55～80 %，其在物理性质甚至分子结构上与聚丙烯(PP)很相似，例如熔点、玻璃态温度、结晶度、抗张强度等，而比重大、透氧率低和抗紫外线照射以及具有光学活性、阻湿性和压电性等则是PHB的优点(表8-1-1)。 表8-1-1 PHAs和聚丙烯(PP)的性质比较 性 质 PP PHB P(3HB-co-3HV) P(3HB-co-4HB) P(4HB)     9mol%HV 25mol%HV 10mol%HB 64mol%HB   熔 点 Tm / ℃ 171～186 171～182 162 137 159 50 53  玻璃态温度Tg / ℃ -15 5～10 / / / / /  结晶度 / % 65～70 65～80 / / / / /  比重/ g(cm-3 0.905 1.24 / / / / /  分子量Mw / 105 2.2～7 1-8 / / / / /  分子量分布 5～12 2.2～3 / / / / /  弯曲模量/ GPa 1.7 3.5～4 1.9 0.7 / 30 149  抗张强度/ MPa 39 40 37 30 24 17 104  断裂伸长/ % 400 6-8 / / 242 591 1000  抗紫外线照射 差 好 / / / / /  抗溶剂 好 差 / / / / /  透氧率/cm3m-2atm-1d-1 1700 45 / / / / /  生物降解性 不可降解 可降解 可降解 可降解 可降解 可降解 可降解  从表8-1-1中可见，PHB的机械性能包括弯曲模量(3.5～4 GPa)和抗张强度(40 MPa)与聚丙烯相仿，但其断裂伸长仅为5 %，比聚丙烯的值(400 %)要低得多，因而PHB较脆和发硬，但这可通过与适量HV共聚而补偿。随着PHBV中HV组分的增加，聚合物的脆度降低而韧性增加，且共聚物的熔点随着HV组分的增加而降低，热加工性能提高。此外，单体4HB的聚合物或3HB与4HB的共聚物P(3HB-co-4HB)则是高弹体，且其生物降解的速度比均聚PHB或PHBV更快。 PHB的工业化应用主要存在两个缺点：一是PHB的熔化稳定性较差。其分解温度约为200 ℃，与其熔点相近(约175 ℃)；二是在环境条件下贮存数日后，PHB易发脆。对第一个缺点，可通过在发酵过程中加入3HV的前体合成PHBV共聚体或将PHB与其它多聚物相混合使用来解决；而对于第二个缺点，最近的研究发现，可通过简单的退火处理来改善PHB的脆性问题。 PHAs的生物降解性和生物相容性是许多化学合成塑料所不具备的。PHAs这类热塑性聚酯能纺丝、压膜或注塑，在工业上可用作各类包装材料等。在医药方面，由于其生物相容性，PHAs可作外科缝线、伤口敷料、血管替代品、长效药物的生物降解载体，骨骼代用品或骨板等。农药工业上，PHAs可用于合成长效除莠剂、抗真菌剂或杀虫剂。PHAs还可作为合成手性化合物的前体原料，用于合成药物和昆虫信息素等物质。 二、PHAs的生物合成 (一)合成PHAs的主要微生物和基质 PHB最初是由Lemoigne于1925年首先发现的，随后他从巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中分离并鉴定了该物质，并阐明了该菌形成孢子时形成PHB。20世纪50年代末研究了生长条件对PHB代谢的影响，发现PHB生成的量随着生长培养基中糖铵比的增加而增加，即PHB的积累是在某种营养物受限制的不平衡生长条件下发生的，这是一个重要的发现。1974年，Wallen和Rohwedder报道了从活性污泥的氯仿萃取液中测定到含3HB和其他3-羟酰基单体的杂聚物的存在，使研究领域由PHB扩展到PHAs。1983年有专利报道了微生物合成PHBV共聚物，而且它较PHB均聚物有某些更好的特性。此后，有关PHAs的研究报道越来越多。 能产生PHAs的微生物分布极广，包括光能和化能自养及异养菌计65个属中的近300种微生物。积累有PHAs的微生物能很容易通过用苏丹黑或尼罗蓝染色来鉴别。目前研究较多的有：产碱杆菌属(Ralstonia)，假单胞菌属(Pseudonomas)，甲基营养菌(Methylotrophs)，固氮菌属(Azotobacter)和红螺菌属(Rhodospirilum)等，它们能分别利用不同的碳源产生不同的PHAs。 早期研究真养产碱杆菌(R. eutrophus)中PHB代谢的主要目的在于将PHB消除以便利用该菌生产单细胞蛋白，后来才转向PHAs的生物合成和积累的研究。兼性化能自养型细菌在一定的条件下积累PHB可达细胞干重的90%以上，也能利用糖加丙酸或戊酸产生P(3HB-co-3HV)。近来的研究发现改变基质该菌还能将4HB和5HV结合到3HB的结构中去，形成4HB或5HV单体与3HB的共聚物。 在多数情况下微生物是利用糖加丙酸或戊酸产生PHBV的，并可通过改变二者的配比控制共聚物中HB和HV的比例。但丙酸或戊酸价格较高，且对细菌有毒，因而在培养液中的浓度必须控制很低，导致产率及转化率都不高，这些都是生产上的不利因素。90年代后发现，在分类上属于红球菌属(Rhodococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)和棒杆菌属(Corynebacterium)中的一些菌能利用葡萄糖或其它单一碳源产生含HV和HB的PHAs。例如红球菌NCIMB40126以葡萄糖为碳源时，PHAs积累量可达31%，其HV与HB的摩尔比为76:24；极端嗜盐菌Haloferax mediteerranei 利用淀粉为唯一碳源可产生含7.5～17.7%HV的PHBV。此外，真养产碱杆菌H16的异亮氨酸缺陷型突变株R8能从果糖或葡萄糖酸等碳源产生PHBV，以果糖为碳源时，共聚物占细胞干重的47%，HV与HB的摩尔比为7:93。这些发现不仅给PHAs生物合成和调节机制的研究增加新的内容，而且开辟了一条探索从廉价的单一碳源生产PHBV的新路。 各种微生物利用不同碳源产生PHAs的发酵水平比较见表8-1-2。 表8-1-2 各种微生物利用不同碳源合成PHVs的情况及水平比较 使用菌种 碳源 规模 时间/ h 菌浓 / g(L-1 PHB含量 / % 备注  Ralstonia eutrophus N9A 果糖 摇瓶 70  96   Azotobacter beijerinckii 葡萄糖 摇瓶   70.4   Methylocystis parvas OBBP 甲烷 摇瓶 170-180  70   Rhodobacter sphaeroides 17023 乙酸 摇瓶 36  69.9   Thiocystis violacea 2311 乙酸 摇瓶 36  83.0   Haloferax mediterranei 淀粉 摇瓶   67 7.5～17 %HV  Rhodococcus sp. NCIMB 40126 葡萄糖 摇瓶 24  31 含76 %HV  Pseudomonas acidovorans 1,4-丁二酸 摇瓶 96 4.3 18 含99 %4HB  Chromobacterium violaceum 戊酸 摇瓶 72 1.2-1.4 45-65 HV同聚物  E. coli 重组菌XL1 Blue 葡萄糖  2.5 L 42 116.6 76   Pseudomonas oleovorans 辛酸 12 L 48 1.5 41   Azotobacter vinelandii UWD 葡萄糖+戊酸 糖蜜+戊酸  2.5 L 2.5 L 38-40 38-40 6.8 19-22 78 59-71 16 mol%HV 8.5～23 mol%HV  Protomonas extorquens 甲醇  0.75L 170 223 64 通纯氧  Ralstonia eutrophus 变异株 葡萄糖 35 m3 220m3 110-120 大于100 70-80 气升罐 通用搅拌罐  Ralstonia latus 变异株 蔗糖 15 m3   76 PHB＞60 g/L  Erwinia sp. 重组菌 蔗糖  5 L 35 28 68   Hyphomicrobium zavarzinii subsp. chengduense nov.  甲醇  10 L    40-59 PHB生产强度 0.64 g/(L(h)  (二)PHAs的代谢途径与调控 研究表明，许多微生物在碳源过量而其它某种营养成份如氮、磷、镁或氧不足时，能在胞内大量积累PHAs以作为碳源和能源的贮存物。当限制性营养物再次被提供时，PHAs能被胞内酶降解后作为碳源和能源利用。由于所用微生物种类和生长条件不同，多聚体的分子量一般在2×105～3×106之间。细胞中积累的PHAs以单个粒子的形态存在，在R. eutrophus中，每个细胞含有8-10个颗粒，每个颗粒直径大小为0.2至0.5 (m，这些颗粒在活细胞体内以非晶体形式存在。在电子或相差显微镜中观察到这些内含物具有高度的折光性。颗粒外面包裹着一层膜，该膜没有通常的生物膜那样的典型双层结构，膜中含有PHAs合成酶的降解酶系统。有关真养产碱杆菌中可溶性PHAs聚合酶的研究表明，当培养状态过渡到限氮条件时该酶与PHAs颗粒相连。 不同微生物合成PHAs的途径不同，基质不同其合成途径也有差异，这正是微生物代谢多样性的一种表现。图8-1-1为一些微生物利用不同基质合成PHAs的主要代谢途径。
图8-1-1 不同微生物中从不同基质合成PHAs的主要途径 (1)真养产碱杆菌及多数细菌从糖合成PHB (2)深红红螺菌从糖合成PHB (3)食油假单胞菌等从中链烃、醇及酸合成具有与基质链长有关的HA单位的PHAs (4)一株产碱杆菌从长链偶碳数脂肪酸合成PHB (5)铜绿假单胞菌等从糖质碳源(如葡萄糖酸)合成具中链HA单位的PHAs (6)真养产碱杆菌等利用糖加丙酸合成PHBV 在真养产碱杆菌、拜氏固氮菌以及许多微生物中，PHB是从乙酰辅酶A通过三步反应合成的。一是由生物合成的(-酮基硫酯酶(乙酰辅酶A乙酰转移酶，EC2.3.1.9)催化两个乙酰辅酶A的C-C结合；二是由依赖NADPH的乙酰乙酰辅酶A还原酶(羟基丁酰辅酶A脱氢酶，EC1.1.1.36)催化立体选择性的反应，从乙酰乙酰辅酶A产生D-(-)-3-羟基丁酰辅酶A；三是由PHB聚合酶将D-(-)-3-羟基丁酰辅酶A连接到PHB正在增长的链上。 PHB生物合成途径中的前两个酶，即(-酮基硫酯酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶，已被在数种细菌中进行了详细的研究。在真养产碱杆菌中，(-酮基硫酯酶作为PHB生物合成途径中的第一个酶，以辅酶A为关键调节因子来控制PHB的合成。在该菌中检测到两个具有不同基质专一性的(-酮基硫酯酶，任一个酶在PHB合成中都可起作用。在真养产碱杆菌中还检测到两个不同的乙酰乙酰辅酶A还原酶，它们在基质和辅酶的专一性方面不同，依赖于NADPH的还原酶才参与PHB的生物合成。由于纯化方面的困难，直到最近才对PHAs聚合酶进行详细的研究。在真养产碱杆菌中，PHAs聚合酶仅对含C3-C5单位的D-(-)-羟基烷酰辅酶A具有专一性。PHAs聚合酶催化的聚合系统类似于脂肪酸合成系统，即增长链在一个半胱氨酸硫醇和一个磷酸泛酰巯基乙胺之间进行填充和伸长的交替循环。 在微生物体内，PHAs的生物合成和降解是同时存在的，图8-1-2是真养产碱杆菌中典型的PHB生物合成和降解途径。近来的研究表明，用作真养产碱杆菌这三个酶的基质不仅有乙酰辅酶A、乙酰乙酰辅酶A或D-(-)-3-羟基丁酰辅酶A，而且还有丙酰辅酶A、D-(-)-3-酮基戊酰辅酶A或D-(-)-3-羟基戊酰辅酶A。
图8-1-2 真养产碱杆菌中PHB的生物合成和降解的代谢途径 在属于rRNA同源组Ⅰ的大多数假单胞菌中，存在着利用中等链长的烷烃、烷醇和烷酸合成由中等链长的3-羟基烷酸组成的聚酯的途径。例如，食油假单胞菌用烷烃或烷酸作碳源培养时，存在着由脂肪酸(-氧化的中间产物3-羟基烷酰辅酶A至PHAs的合成途径，这一途径称为P. oleovorans PHAs生物合成途径；另外，这一组中除食油假单胞菌以外的几乎所有成员还存在另一条从乙酰辅酶A经脂肪酸的生物合成途径，这一途径称为Pseudomonas aeruginosa的PHAs生物合成途径。然而PHAs合成酶的合成产物的步骤还不很清楚。最近有关P. putida 脂肪酸代谢途径的13C-NMR研究表明，在PHAs生物合成中(-氧化和do novo 脂肪酸生物作用无关。此外，一株产碱杆菌能从长链偶碳数脂肪酸(≤C22)合成PHB，而从奇碳数酸(≤C19)合成PHBV。应当说明，目前对不同途径了解的程度还很不一样。例如在从脂肪酸合成PHAs的过程中如何从(-氧化的中间产物L-(+)-3-羟基脂酰辅酶A转变成PHA的D-(-)型前体就需进一步探索。 20世纪80年代后期开始将重组DNA技术应用于生物合成PHB。来自于多种细菌的PHAs生物合成酶-PHAs生物合成途径的关键酶，已被在分子水平进行了详细的研究，它们的PHAs生物合成酶基因已被克隆成功。三个实验室独立地将真养产碱杆菌H16的PHB生物合成基因phbA、phbB和phbC克隆并在大肠杆菌中表达，研究发现，在真养产碱杆菌中，PHAs合成酶的结构基因排列在称为phbC-A-B的一个操纵子上，分别编码PHAs合成酶、(-ketothiolase 和依赖于NADPH的乙酰乙酰辅酶A还原酶(图8-1-3)。
图8-1-3 真养产碱杆菌中聚羟基烷酸生物合成操纵子的排列顺序 从分子水平上来分析PHAs的生物合成途径，最令人感兴趣的是PHAs合成酶。细菌利用不同代谢途径将中心代谢中间产物转变成羟基脂酰辅酶A，它可能是所有PHAs合成酶的底物，在不同的细菌中通过不同的途径合成D-(-)-羟基丁酰辅酶A或其他的羟基脂酰辅酶A。 前面介绍过，食油假单胞菌可利用烷烃或烷酸产生中等链长的羟基烷酸多聚物。近来已将真养产碱杆菌的PHB生物合成基因在其中克隆，得到的重组菌株能表达真养产碱杆菌的PHB合成基因，因而体内具有两种PHAs生物合成体系：一是外来的、从乙酰辅酶A合成PHB的体系；二是自身的从脂肪酸(-氧化的中间产物合成PHAs的体系。例如重组食油假单胞菌pVK101:pp1可利用葡萄糖合成并积累PHB。如果用中等链长的烷酸作碳源，在生长受到限制的条件下，除形成能直接反映所利用的碳源种类的那些聚羟基烷酸外，羟基丁酸也可被结合到聚酯中。用辛酸培养时积累PHAs达细胞干重的76.5 %，该聚合物由46.8 mol % 3-HB，4.5 mol % 3-羟基已酸(3HHx)，48.2 mol % 3-HO以及0.7 mol % 3HD组成，而亲株在同样的条件下只积累了3-HHx(6.2 mol %)、3-HO(93.0 mol %)和3HD-(0.3 mol %)的聚酯。 通过对PHAs产生菌的生物学和遗传学的研究和探讨，有助于进一步了解PHAs的代谢途径，可为更好地控制PHAs的生物合成过程打下良好的基础。 (三)PHAs的发酵生产 阻碍PHAs实现大规模工业化生产的主要障碍是生产成本问题。英国帝国化学公司(ICI)曾就工业规模生产PHB的技术和经济问题进行了评估，考虑的因素包括产物的产率、技术的复杂性、投资以及产物分离的难易程度等。影响PHAs生产成本的主要因素有：菌种、原料、操作方式以及提取方法等。因而要降低PHAs的生产成本主要可从以下几个方面来进行：①采用廉价基质(如CO2、H2和O2，甲醇，乙醇，葡萄糖及来自农业废物的有机酸等)，提高产物对基质的产率系数，以降低发酵原材料的成本；②提高生产强度(如选育高产菌株、采用合适的发酵生产方式等)，以降低操作成本；③改进提取、纯化技术(如不采用价格昂贵的有机溶剂、简化操作等)，以降低提取成本。 选择什么样的菌种和原材料对PHAs的生产成本影响很大。考虑的因素主要包括∶细胞利用廉价碳源的能力、生长速率、多聚物合成速率和能在胞内最大积累多聚物的程度。ICI公司分别对固氮菌、甲基营养菌和真养产碱杆菌进行了考察。他们放弃了固氮菌，因为它还会产生多糖，从而降低了PHB的比产率并会带来一些技术问题；他们也否定了甲基营养菌，主要因为该菌的PHB产率不高，最终胞内PHB含量仅约65 %左右，会增加提取费用。尽管甲醇的价格仅为葡萄糖的45 %，但其转化系数却很低，因而ICI虽然具有以甲醇为唯一碳源、在1500 m3反应器规模上生产单细胞蛋白的丰富经验，但该公司最终选择了真养产碱杆菌(R. eutrophus)作为PHAs的生产菌株，因为该菌生长快、易培养、胞内PHB含量高、聚合物的分子量大以及能利用各种较经济的碳源。 确定了合适的生产菌种，要进一步降低PHAs的生产成本，关键在于采用合适的发酵方式，以获得高的产物对基质的转化率、高的PHAs生产强度和高的产物浓度(产物浓度的提高同时也可相应降低提取成本)。 在PHAs的生产中，通常所采用的发酵方式有分批发酵法和流加发酵法，有时还可采用连续培养法来获得高的生产强度。由于R. eutrophus只有在某种营养成份缺乏而碳源过量的不平衡生长条件下才能大量积累PHAs，因而在PHAs的发酵生产中，一般可将发酵过程分成两个阶段来进行控制。第一阶段为菌体细胞的形成阶段。在此阶段微生物利用基质形成大量菌体，而PHAs的积累量很少；第二阶段为多聚体形成阶段。当培养基中某种营养耗尽时，细胞进入PHAs形成阶段，在此阶段PHAs大量形成而菌体细胞基本上不繁殖。 在简单分批培养过程中，由于微生物菌体的生长受到所用培养基中营养物质初始浓度的限制，当菌体生长进行到一定浓度时，培养基中一种或几种营养物质的浓度可能成为菌体细胞进一步繁殖的限制因素，而简单地增加该种营养物质的初始浓度，不一定能导致菌生长量的相应增加，相反某些成份在较高浓度时还会对细胞产生毒害作用，或者可能形成沉淀，因此，采用分批发酵不可能获得很高的细胞干重以及高的产物浓度和生产强度。 采用流加发酵法进行PHAs的生产时，可以在某些必需的营养成份成为生长限制因素之前，对其进行定量流加，延长细胞的对数生长期，从而获得较高的菌体浓度，另外，为了避免菌体细胞在生长阶段积累多聚体，也需通过流加法来控制培养液中铵离子浓度不低于200 mg/L，否则会降低共聚体的最终产率。在多聚体形成阶段，尽管限制氮源能刺激细胞积累PHAs，但氮源的完全缺乏又会极大地损害微生物细胞的合成活性，所以将在PHAs合成阶段以较低的速率限量流加氮源的情况与分批发酵中氮源完全缺乏的情况相比较，可以看出，前者胞内PHB含量增加更快，表明采用流加发酵法不仅可以得到高的产物浓度和生产强度，通过控制发酵过程中PHB合成所需基质的浓度，还可以提高产品的质量。 从文献报道的研究结果来看，采用分批发酵所能获得的细胞干重和PHAs浓度都比较低(细胞干重大多小于20 g/L)；而采用流加发酵法，往往可以达到很高的细胞干重和PHAs浓度。Suzuki等人以甲醇为碳源，培养甲基营养型菌Protomonas extorquens合成PHB，在0.75 L的反应器中，通过在线检测并控制甲醇的浓度在0.5 g/L左右，在通纯氧条件下培养170 h，细胞密度达到233 g/L，PHB浓度达149 g/L，这是到目前为止所获得的最高细胞干重和PHB浓度，但由于发酵时间较长，所以PHB的生产强度仅为0.88 g/(L(h)，最终胞内PHB含量(64 %)也较低。Kim报道了克隆了真养产碱杆菌PHB生物合成基因的重组大肠杆菌xL1Blue在2.5 L罐中发酵的结果。该重组菌流加培养42 h后，细胞干重达116.6 g/L，PHB浓度为88.8 g/L，生产强度可达2.11 g/(L(h)，充分显示了重组DNA技术应用于生物合成PHB领域的潜力，但该菌的所需的培养基成份复杂，且在培养过程中需通纯氧才能满足菌体生长和产物合成对氧的需求，成本较高，不易放大。 在共聚物PHBV的生产过程中，流加发酵法也比分批发酵法具有明显优势。丙酸或戊酸是合成PHBV中HV组分所必需的前体物质，由于这些有机酸对菌体细胞具有一定的毒性(0.1 %的丙酸浓度就会对产生抑制作用)，故采用简单分批发酵不可能获得高产。采用流加发酵法，可避免由于培养基中一次加入的有机酸过高而使细胞活力受到的损害，从而达到提高PHBV产率的目的。 尽管有关PHB或PHBV生产的流加发酵技术的报道很多，但对底物流加方式的控制大多是凭经验来实施的。而在PHB或PHBV的发酵过程中，根据菌体生长和产物合成阶段的不同特点来控制基质适宜的流加速率相当重要。例如在PHB或PHBV合成阶段，只有进行氮源的限量流加，才能促使细胞有效地积累多聚物；氮源的过量流加不仅会导致已积累的PHB降解，还会降低微生物细胞的PHB合成能力。对于在多聚物合成阶段采用何种流加方式来控制氮源浓度在有利于多聚物大量积累的范围内，还未见报道。另外，对于在流加发酵中如何采取适当的控制策略来获得高的产物对基质的转化率这一问题，相关文献提及很少。因而为了在多聚物发酵过程中获得高的生产强度、高的转化率和高的产物浓度，必须对其流加发酵过程实行优化控制。实现PHB或PHBV流加发酵的优化控制，必须建立在对发酵过程的菌体生长和产物形成的动力学充分研究和了解的基础上，应根据发酵过程中不同阶段的特点，优化底物的流加方式，提高多聚物的生产强度、转化率和产物浓度，降低生产成本，为最终实现其工业化生产打下良好的基础。 PHAs作为一种生物可降解的热塑性材料，早在六十年代就已引起了人们的广泛关注，在过去几十年中，有数家公司一直在探索PHB工业生产的可能性。80年代初，ICI和奥地利生物技术有限公司等将微生物合成PHAs的研究推向试生产阶段。1982年，ICI使用真养产碱杆菌突变株为生产菌种，以葡萄糖为唯一碳源，在35 m3气升环流反应器及200 m3机械搅拌反应罐内试生产PHB成功，并以葡萄糖加丙酸为碳源生产出力学性能更好的PHBV，当时的年产量为1000吨，计划在九十年代末达到数千吨。用该产品做成的瓶子进入欧洲市场，当时的售价为＄15/lb，但ICI宣称扩大投产量后的售价预计下降到＄1/lb。经过许多研究者的不断努力与探索，PHB的价格已从最初的＄15/lb下降至＄5.58/kg左右，但与聚丙烯的价格(＄1/kg)相比仍高出许多，缺乏市场竞争力。由此可见，PHAs若要作为塑料部分替代化工合成塑料，不仅需要政府环保立法的支持，在技术方面还有许多工作尚待开展。 20世纪90年代以来，见诸报道的文献多系涉及寻求生产PHAs的新方法和开发其新的应用领域。由于商业竞争的原因，有关PHAs发酵生产的关键技术的研究报道非常少见。1990年，Bital等人预言，只有发酵时间小于70 h，PHAs含量大于80%的生产工艺，在商业上才是可以接受的。迄今为止的文献中，以葡萄糖为碳源培养R. eutrophus所得的PHAs含量最高为77%。 国内对于采用微生物发酵法生产生物可降解塑料的研究起步于80年代的中后期，我国政府对PHAs的研究和开发工作很重视，已在“九五”期间完成中试。从所报道的资料来看，国内目前从事PHAs研究的单位主要有中科院微生物研究所、清华大学、山东大学、北京农业大学等高校，研究水平见表8-1-3。总的说来，国内对PHAs的研究起步较迟，研究水平与国外相比也有较大的差距，对PHAs产生菌的细胞生长和产物合成的动力学还缺乏全面的研究，对PHAs的发酵过程还缺乏有效的控制策略。 表8-1-3 国内进行PHAs研究的水平 菌种 碳源 发酵时间 / h 规模 细胞干重 / g(L-1 PHAs含量 / % 备注  R. eutrophus R. eutrophus 葡萄糖 葡萄糖+丙酸 72 65 2 L罐 2 L罐 50 35 77 60以上  6.2%HV  R. eutrophus 丁酸 43 3 L罐 7.5 54.1   R. eutrophus 高果糖浆(HFS) 42 2 L罐 16.4 46.3   自养黄杆菌 葡萄糖 42 5 L罐 34.9 73.0 24%HV  三、本章主要内容 本章选择真养产碱杆菌作为PHB和PHBV的生产菌株，在摇瓶和小型发酵罐上对该菌的细胞生长和产物合成的动力学特性进行详细的研究，在此基础上，提出以最大化PHB生产强度和PHB对葡萄糖的产率系数为目标函数的PHB流加发酵优化策略，以及以PHBV的最大生产强度和较适宜HV组分含量为目标函数的PHBV流加优化策略，具体研究内容包括： (1)以葡萄糖为碳源，进行R. eutrophus菌体生长和PHB积累的摇瓶发酵条件研究。然后根据PHB的合成途径，通过定量的质、能衡算和解析，得出PHB的理论转化率，并与R. eutrophus的真实转化率比较，进行R. eutrophus的代谢流分析，得出对工艺有指导作用的一些理论依据。 (2)在连续培养中对R. eutrophus的菌体生长、产物形成、基质消耗进行研究，得到一些重要的动力学参数；并对采用二级连续培养法进行PHB的生产的可行性进行研究。 (3)基于摇瓶发酵的研究结果，在小型发酵罐中对影响菌体生长和PHB合成的一些重要的环境因子进行定量的考察，在对PHB发酵过程动力学进行分析的基础上，建立较为合理的PHB发酵过程动力学模型。 (4)研究氮源、碳源和氧的限制、缺乏和恢复供应对PHB发酵过程的影响，确定目的微生物的生理生化特性、营养源供给与发酵特性之间的内在联系；对PHB发酵过程中不同的停氮时间和PHB合成期不同的硫酸铵流速对PHB发酵的影响进行研究，得出适宜的PHB流加发酵条件，为PHB的流加发酵准优化研究创造条件。在PHB流加发酵过程动力学研究的基础上，分别建立R. eutrophus菌体生长期和PHB合成期基质流加的准优化控制策略，确定由指数速率流加和变速流加组成的基质流加操作方式，得到以PHB的最大生产强度和产率系数为目标的PHB流加发酵准优化策略。 (5)以葡萄糖为碳源，丙酸或戊酸为PHBV中HV组分合成的前体生产PHBV，对前体的不同流加时间和流加浓度进行研究，在得出前体丙酸适宜流加时间和浓度的基础上，提出以PHBV的最大生产强度和较适宜HV组分含量为目标函数的PHBV发酵准优化流加策略。 第二节 真养产碱杆菌生产PHB摇瓶发酵条件的研究 一、引言 真养产碱杆菌在不平衡的生长条件(碳源过量而其他营养成份如氮、磷或氧等限制)下，能在胞内积累聚羟基烷酸作碳源和能源的贮藏物。研究表明，培养条件会对PHB发酵的菌体生长和产物合成过程产生重大的影响，适宜的环境条件不仅有利于菌体的快速生长，还可促进胞内PHB的大量积累，可以提高包括产物浓度、胞内聚合物的百分含量、生产强度和产率系数在内的各项发酵指标，实现PHB的高效生产。在摇瓶条件下，易于考察各种营养因素对PHB发酵过程的影响，选择出适宜的培养基组成和发酵条件，为以后的研究打下良好的基础。为此，本节研究了摇瓶条件下，接种量、pH值、碳氮源浓度和补料操作等因素对PHB发酵过程的影响，得出了较佳的PHB摇瓶发酵条件，并结合PHB的代谢途径对其发酵过程的控制进行了初步分析。 二、PHB摇瓶发酵条件研究与补料优化 (一)种子生长过程曲线和种龄的确定 真养产碱杆菌 WSH 3 在种子培养基中的生长情况如表8-2-1。可以看出，培养25 h以后，菌体的比生长速率开始下降。因而可以确定，取20～25 h的培养物接入发酵液为好。 表8-2-1 菌株WSH3的种子生长过程 时间 / h 9 12 14 22 25 29 32 36  细胞干重 / g(L-1 1.51 2.17 3.33 6.00 8.40 11.17 12.40 12.73   lnX 0.41 0.77 1.20 1.79 2.23 2.41 2.52 2.54  (二)不同的接种量对PHB合成的影响 适宜的接种量可以缩短发酵阶段的菌体生长的延滞期，从而缩短发酵周期，最终提高发酵产物的生产强度。将培养至20～25 h之间种子培养物按不同的接种量接入发酵培养基中，实验结果见表8-2-2。可以看出，在接种量为8～10 %的情况下，可以得到最大的细胞干重和PHB浓度。 表8-2-2 不同的接种量对PHB发酵的影响 接种量 / %(v/v) 1 3 5 8 10  细胞干重 / g(L-1 8.7 10.4 12.1 13.9 14.3  PHB含量 / %(w/w) 57.3 65.8 70.2 77.1 76.2  PHB浓度 / g(L-1 5.0 6.8 8.5 10.7 10.9   注:初糖浓度为3 %, 初始硫酸铵浓度为0.2 %, 发酵时间为40 h. (三)不同初始pH对菌体生长和PHB合成的影响 如图8-2-1所示。可以看出，pH值在6.6～7.2的范围内，对菌体细胞的生长影响不很明显，而当pH值大于7.2时，细胞的生长明显受到影响。pH的变化对胞内PHB的积累影响较大。在pH值为7.0时，细胞干重和PHB的含量均达到最大值，在pH值偏高或偏低时，胞内PHB含量明显下降。因而，如能在发酵过程中控制较佳的pH值，可使细胞干重和胞内PHB含量都达到较高水平。
图8-2-1 不同初始pH对菌体生长和PHB合成的影响 注：初始葡萄糖浓度为4 %，硫酸铵浓度为0.25 %，发酵时间为40 h。 (四)不同氮源浓度对菌体生长和产物合成的影响 见表8-2-3。在一定初始葡萄糖浓度下，过高的初始硫酸铵浓度不仅会抑制菌体细胞的生长，还会使最终PHB含量下降。硫酸铵浓度分别为0.2 %和0.3 %时，两者所得到的细胞干重和PHB浓度都比较接近，但硫酸铵浓度为0.3 %时，胞内PHB含量相对较低。初糖浓度为4 %时，选择初始硫酸铵浓度为0.2 %可以获得较高的PHB浓度和PHB含量。若为提高产物浓度而增加硫酸铵浓度时，初始葡萄糖浓度也应相应提高，否则会导致最终PHB含量的下降。 表8-2-3 初始硫酸铵浓度对菌体生长和PHB积累的影响 硫酸铵浓度 / % 细胞干重 / g(L-1 PHB浓度/ g(L-1 PHB含量 / %  0.1 12.1 9.6 79.6  0.2 16.7 13.4 80.3  0.3 19.5 13.7 70.2  0.4 18.1 11.3 61.5  0.5 16.6 8.9 53.7   注∶发酵时间为40 h，初糖浓度为4 %。 从真养产碱杆菌形成PHB的机制可知，菌体细胞的生长和PHB的积累对氮源浓度的要求不一样。细胞的生长需要有丰富的氮源存在，相反只有当培养基中氮源浓度很低或缺乏时，才能刺激细胞大量积累PHB。这样，为了提高最终细胞干重和产物浓度，必须采用较高的初始硫酸铵浓度，以便获得较多的细胞物质来合成PHB，但其初始浓度必须控制在生长抑制范围内；另一方面，为了使细胞生长停止后培养基中有足够的碳源来合成PHB，因而在增加氮源的同时也要增加碳源的浓度，但过高的碳源浓度不仅会对菌体的生长产生抑制作用，还有可能会使产物对基质的产率系数下降，造成发酵原料成本的上升，因而有必要确定适宜的碳源浓度。 (五)不同葡萄糖浓度对菌体生长和产物形成的影响 由于细胞只有在氮源缺乏而碳源过量的条件下才能大量积累PHB，所以还必须同时确定相应的葡萄糖浓度。初始硫酸铵浓度为0.3 %时，葡萄糖浓度变化对发酵的影响结果见表8-2-4。可以看出，当葡萄糖浓度为1 %～6 %时，细胞干重随着初糖浓度的增加而不断增加，至糖浓度为6 %时，细胞干重达到最大值22.2 g/L，至初糖浓度为10 %时，其值下降为17.7 g/L，比最大值时分别下降了21.4 %；胞内PHB含量在初糖浓度为5 %至7 %时达到最大值，随后随初糖浓度的增加又不断下降，表明初糖浓度过高会影响菌体细胞的生长和产物PHB的合成；PHB对葡萄糖的产率系数在初糖浓度为4 %时达到最大值0.34 g/g，较高或较低的初糖浓度都会导致PHB对葡萄糖的产率系数下降；在初糖浓度为6 %时可获得最大的PHB浓度，但PHB对葡萄糖的产率系数下降为0.31 g/L。从残糖浓度变化可以看出，当硫酸铵浓度为0.3 %，初糖为6 %以上时，发酵结束就会有较多的残糖积累。可见，在一定的硫酸铵浓度下，初糖浓度的提高可以得到较高的PHB浓度，但却会使PHB对葡萄糖的产率系数下降，因而采用分批摇瓶发酵法不可能同时获得高的PHB浓度和PHB对葡萄糖的产率系数。 表8-2-4 不同的糖浓度对菌体生长和PHB积累的影响 初糖浓度 / % 菌体干重 / g(L-1 PHB含量 / % PHB浓度 / g(L-1 残糖浓度 / % PHB对葡萄糖的产率系数/ g(g-1  1 6.7 21.7 1.5 0 0.15  2 10.6 54.9 5.8 0 0.29  3 14.5 67.8 9.8 0 0.33  4 18.9 73.3 13.8 0 0.34  5 21.0 78.3 16.4 0 0.33  6 22.2 78.6 17.3 0.55 0.31  7 20.8 78.0 16.2 1.60 0.30  8 18.9 73.1 13.8 2.89 0.27  9 18.4 67.3 12.4 4.05 0.25  10 17.7 65.6 11.6 4.72 0.22   注:发酵时间为40 h，初始硫酸铵浓度0.3 % (六)糖铵比对PHB发酵过程影响的分析 从前面的研究结果可以发现，在PHB的发酵中，碳源和氮源是影响PHB发酵指标的两种最主要的基质，碳源浓度过高时，不仅会影响菌体的生长，还会降低PHB对葡萄糖的产率系数，导致PHB发酵过程原材料成本的增加；氮源浓度过高时，不仅也会影响菌体的生长，还会降低最终胞内PHB的含量，增加后提取过程的难度和成本。因而有必要综合考虑PHB分批发酵中碳氮源对PHB发酵指标的影响。将表8-2-4中的数据以葡萄糖和硫酸铵之比(简称糖铵比)分别对PHB含量和PHB对葡萄糖的产率系数作图，结果见图8-2-2。 图8-2-3为不同糖铵比下PHB含量和PHB对葡萄糖的产率系数的变化关系。从糖铵比与PHB含量的变化关系可以看出，细胞的最终PHB含量与糖铵比密切相关，当糖铵比较小时，PHB含量随着糖铵比的增加而增加，并在糖铵比为20左右时达到最大值，随后又随C/N的增大而有所下降。 从糖铵比与PHB对葡萄糖的产率系数变化曲线可以看出，在糖铵比较小时，PHB对葡萄糖的产率系数随着糖铵比的增加而增加，并在糖铵比为13.3时达到最大值，随后又随糖铵比的增大而降低，糖铵比过高或过低时都会影响PHB对葡萄糖的产率系数。由此可见，在PHB的摇瓶分批发酵中，在PHB含量达到最大值处，不可能得到最大的PHB对葡萄糖的产率系数，反之亦然。
图8-2-2 糖铵比与PHB含量和PHB对葡萄糖的产率系数之间的关系 (七)PHB摇瓶发酵过程的分析 PHB摇瓶发酵过程曲线如图8-2-3和8-2-4所示。从图中可以看出：(1) 在发酵前期氮源较丰富的情况下，胞内PHB积累较少，当硫酸铵浓度接近零时，胞内PHB含量迅速增加，PHB浓度也不断上升；(2)当培养基中氮源浓度在21 h左右降为零时，细胞物质的生长停止，残留菌体浓度开始下降，表明在氮源完全缺乏的PHB合成阶段会有少量细胞发生自溶；(3) 34 h左右葡萄糖浓度降低为零，此时细胞干重和胞内PHB浓度分别达到最大值18.7 g/L和14.0 g/L，随后细胞干重和PHB浓度不再增加。由此分析可以得出，如能在发酵前期补加适量的氮源，增加残留菌体的生长量；在发酵后期流加一定量的碳源，延长中后期PHB积累阶段的时间，就可以进一步提高最终PHB的产量。
图8-2-3 WSH3菌株的摇瓶发酵过程曲线之一
图8-2-4 WSH3的摇瓶发酵过程曲线之二 (八)PHB摇瓶发酵的补料研究 在分析了PHB摇瓶发酵过程曲线基础上，根据PHB发酵中菌体生长和PHB合成阶段基质的消耗情况，作者进行一系列不同总糖浓度条件下，PHB摇瓶发酵定时补料试验，结果见表8-2-5。 表8-2-5 PHB摇瓶发酵定时补料试验 补料方案 细胞干重 / g(L-1 PHB浓度 / g(L-1 PHB含量 / % PHB产率 / g(g-1  (Ⅰ) 总糖 4 % 一次投入 18.9 13.8 73.3 0.34  总硫酸铵0.3 % 12 h流加一次糖 18.7 13.9 74.1 0.35  (Ⅱ) 总糖 6 % 一次投入 22.2 17.3 78.6 0.31  总硫酸铵0.4 % 12 h、24 h流加二次糖 27.3 21.8 79.7 0.36  (Ⅲ) 总糖7.5 % 一次投入 21.7 16.7 76.9 0.30  总硫酸铵0.4 % 12 h、24 h和36 h流加三次糖 35.1 28.3 80.5 0.36  注: 初始硫酸铵浓度均为0.3 %, 第Ⅱ、第Ⅲ组第12 h流加0.1 %硫酸铵; 流加组的初糖浓度均为3 %。第Ⅰ组和第Ⅱ组的发酵时间为40 h, 第Ⅲ组的发酵时间为50 h。 可以看出，在较低总糖浓度的情况下，定时补料操作效果不明显，但当葡萄糖和硫酸铵总浓度较高时，采用定时补料操作方式有利于提高细胞干重和PHB浓度，与对照相比，胞内PHB含量和PHB对葡萄糖的产率系数也有明显的提高，这可能是由于较高的硫酸铵或葡萄糖浓度对菌体的生长或PHB的合成过程存在一定的抑制作用，而定时补料操作能在一定程度上改善这种抑制作用，因而能取得较好的发酵结果。由此可见，在PHB的发酵过程中，采用定时补料操作可明显提高PHB浓度、胞内PHB含量和PHB对葡萄糖的产率系数。另外，PHB含量和PHB对葡萄糖的产率系数的提高，可分别降低PHB的提取成本和发酵原料成本，有利于降低总的PHB发酵生产成本。 (九)菌体细胞积累PHB前后的透射电镜照片 为了考察PHB积累前后菌体细胞的结构形态，对发酵前、后期的细胞分别拍摄了透射电镜照片，见图8-2-5。从图8-2-5A中可以看出，在氮源丰富的发酵前期，细胞基本上不积累PHB；而在发酵后期，培养基中氮源耗尽，细胞大量积累PHB，从图8-2-6B中可见，几乎所有的细胞都充满了PHB颗粒。 A：发酵前期 B：发酵后期 图8-2-5 菌体细胞积累PHB前后的透射电镜照片 三、PHB发酵过程中理论产率的计算 阻碍PHB大规模工业化生产的一个主要障碍就是其相对高的生产成本。PHB是仅有C、H和O元素组成的多聚物，在合成PHB所需的基质中，碳源的消耗量最大，所占发酵原料成本的比例也最大，因而，产物PHB对碳源的产率(YP/C)，是影响PHB工业化规模生产的重要因素。 (一)PHB发酵过程的理论产率和总产率 从简单的数学角度考虑很容易推断，在假定没有非PHB部分的残留菌体合成时，产物PHB对碳源的产率YP/C，可达到最大值，该最大值被命名为PHB对碳源的理论产率
；当考虑到在平衡生长阶段形成菌体所消耗的碳源时，该实际产率
称为总产率。 通常有两种不同的方法来计算理论产率的值，即化学计量法和生化计量法。在后一种方法中，必须考虑合成PHB过程的代谢途径和辅酶的再循环过程。 在非生长条件下，PHB形成的产率集中于辅酶的质量平衡，如NADP+、NAD+、ATP和辅酶A，这些辅酶包含在PHB生物合成的代谢途径中。在大多数细菌中，PHB是从乙酰辅酶A经三个连续的反应而形成的，这三个反应分别被3-酮基硫解酶、依赖于NADPH的乙酰乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶所催化。必须注意到乙酰乙酰辅酶A还原酶是与NADPH相联的，即该酶仅催化下列反应： 乙酰辅酶A + NADPH + H+
D(-)-3-羟基丁基-辅酶A+NADP+ (8-2-1) 在一些微生物如Zoogloea ramigera 和R. eutrophus中已检测到另一个与NADH相关联的还原酶，但其产物为L(+)-3-羟基丁基-辅酶A，该产物不能作为PHB合成酶的基质。在一个由纯化的3-酮基硫解酶、依赖于NADPH的乙酰乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶所组成的系统中，发现仅有与NADPH相关联的还原酶参与从乙酰辅酶A至PHB的合成过程。因而从该反应中所产生的NADP+须从另一个生化反应中得到再生，以便使PHB的生物合成能继续进行，该事实迫使我们去寻找一个PHB合成途径以外的NADPH再生反应。通过分析几种PHB产生菌的生物合成系统，可以认为有三个酶能作为参与NADPH再生反应的成员，它们分别是：(1) 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，(2) 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶，(3) 三羧酸循环中的异柠檬酸脱氢酶。通常，在ED途径中，第一个酶很活跃，而第一个和第二个酶常存在于戊糖循环途径中，当碳源为碳水化合物时，第一个酶或第一个酶加第二个酶是常常会碰到的，但当所提供的碳源为乙醇、有机酸、烷烃或其它基质时，微生物常回复到利用第三个酶参与NADPH再生反应。在三个连续的反应中所包含的另一个辅助基质为辅酶A，该辅酶在三个反应中为平衡自循环，如图8-2-6所示。
图8-2-6 PHB生物合成过程中CoASH的循环 E1∶3-酮硫解酶；E2∶乙酰乙酰辅酶A还原酶；E3∶P(3HA)合成酶 尽管在PHB合成途径的三个反应中，既不需要NAD+也不需要ATP，但必须考虑包括PHB生物合成途径在内的所有途径中NAD+/NADH和ATP/ADP的再生循环，这些辅助基质的缺乏不可能使代谢中间产物顺利流动。在R. eutrophus中，包括ATP和NAD+的形成及NADP+/NADPH再循环的从葡萄糖通过ED途径转变成乙酰辅酶A，再形成PHB的生物合成途径见图8-2-7。
图8-2-7 R. eutrophus以葡萄糖为碳源通过ED途径合成PHB的代谢过程 从该途径中可以很清楚地看出，NADP+通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶再生，细胞内PHB合成的净反应如下： Glucose+(3p+1)ADP+(3p+1)Pi+(3/2)O2
(1/n)PHB+2CO2+3H2O+(3p+1)ATP (8-2-2) 式中p是P/O比率，从该反应式中可以计算出PHB对基质葡萄糖的理论产率为：
=86/180=0.48 (g/g)。 总产率是从实际发酵过程中计算出来的，PHB在细胞生长停止后积累或部分在细胞生长的同时积累。假定所消耗的总碳量，(-△Stotal)，分成两部分，合成PHB所耗部分为(-△S1)，合成非PHB的菌体所消耗的部分为(-△S2)，则有： (-△Stotal )=(-△S1)＋(-△S2) (8-2-3) 因为PHB积累于细胞内部，因而总的菌体干重△Xtotal由两部分组成：即PHB部分(△P)和非PHB的残留菌体部分(△XR)，则有： △Xtotal ＝△P＋△XR (8-2-4) 因而，PHB的理论产率和总产率可分别定义为：
=△P/(-△S1) (8-2-5)
=△P/(-△Stotal ) (8-2-6) 同样，由基质(-△S2)所形成的残留菌体部分的产率YX/C，可表示为：
(8-2-7) 式中CP为菌体中PHB占细胞干重的百分含量。 将(8-2-7)式和(8-2-6)代入(2-3)中可得：
(8-2-8) 根据式(8-2-8)可作出
～CP的图，见图8-2-8。
图8-2-8
与
、YX/C和CP的关系 从图8-2-8中可以看出，CP值越高，则
越大，当然
总是比
小。真养产碱杆菌在以葡萄糖、丁酸或H2、O2和CO2为基质时，胞内PHB含量为CP一般不超过0.81，图中CP为0.81以上以虚线表示之。从图中还可以看出，
与YX/C有关，在前期的菌体生长阶段，如果可获得较高的YX/C值，则细胞最终达到某一PHB含量时，就可相应得到较高的
值。 (二)提高摇瓶发酵过程中PHB对葡萄糖的产率系数 从式(8-2-8)和上述的讨论中已经可以很清楚地看出，PHB发酵中产物对基质的产率系数
主要与残留菌体对基质的产率系数YX/C和最终胞内PHB含量CP有密切的关系，通过分别提高YX/C和CP的值，就可以提高
。 在PHB发酵过程中，前期主要为菌体繁殖阶段，如果在此阶段内细胞的比生长速率较小，则细胞用于维持消耗所需的能量的比例增加，YX/C值就相应较小，导致最终的
值变小。因而，在菌体生长阶段，可采用定时补料的方式来降低某些高浓度基质可能造成的对菌体生长的抑制作用，提高菌体的比生长速率，可获得较高的YX/C值，以提高产物PHB对基质的产率系数
。从表8-2-5中可以清楚地看到，当总糖浓度较低(4 %)时，定时补料方式对提高糖对PHB的产率系数不明显，随着总糖浓度的提高，定时补料方式可明显提高糖对PHB的产率系数，这可能是因为在总糖浓度较高的情况下，采用一次投料操作时，高的初糖浓度会对菌体的生长产生明显的抑制作用，使菌体的比生长速率下降，导致YX/C降低，而采用定时补料操作时，可以降低初糖浓度，减少高糖浓度对菌体生长的抑制作用，提高YX/C的值；且采用定时补料操作方式时，胞内PHB的含量也可相应提高，从而提高了最终PHB对葡萄糖的产率系数
。另外，菌体比生长速率的提高，可缩短前期菌体生长阶段所需的时间，有利于提高PHB的生产强度；而胞内PHB含量的提高，也有利于PHB的后处理过程。 第三节 真氧产碱杆菌连续培养动力学及二级连续培养系统生产聚羟基丁酸 一、引言 真养产碱杆菌由于具有生长快、易培养和胞内多聚物含量高的特点，已被ICI公司用于PHB和PHBV的工业化生产。早在20世纪60年代，已有学者对R. eutrophus利用H2、O2和CO2为基质的连续培养动力学进行了研究，但以葡萄糖为基质所进行的相关研究报道几乎没有。此外，采用分批培养法和流加发酵法来生产PHB的报道很多，而采用连续培养法生产PHB的报道却很少。我们以葡萄糖为限制性基质，对稳态条件下R. eutrophus WSH3的各种动力学特征进行了研究，考察了该菌株的生长和PHB生产性能。在此基础上，针对PHB的形成特点，建立了一个二级连续培养系统用于生产PHB，并优化了系统运行的工艺条件。 二、真养产碱杆菌一级连续培养动力学 (一)真养产碱杆菌在连续培养中的操作特征 从图8-3-1、8-3-2中可以看出，在稀释率为0.075 h-1和0.15 h-1时，细胞培养经过约3-5个停留时间可达到稳态。其中残留菌体浓度是指菌体总干重中除去PHB含量后的剩余部分，这一参数可真正反映菌体的生长变化情况。

图8-3-1 稀释率为0.075 h-1的过程曲线 图8-3-2 稀释率为0.15 h-1的过程曲线 ○ 细胞干重 □ 残留菌体浓度 ◇ PHB含量 △ 葡萄糖浓度 (二)残留菌体浓度、基质浓度与稀释率的关系 如图8-3-3所示，当D在0.05 h-1至0.21 h-1之间时，残留菌体浓大于0度随着D的增加而增加，在D为0.21 h-1 时，残留菌体浓度达到最大值为26.2 g/L，当D.21 h-1时，残留菌体浓度随D的增加而快速下降，至D为0.4 h-1时，残留菌体浓度仅为8.6 g/L，比D为0.21h-1时的残留菌体浓度下降了67.2 % 当D小于0.15 h-1时，葡萄糖浓度未检出，当D大于0.40 h-1时，葡萄糖浓度急剧上升，此时残留菌体浓度的下降也很快，说明该点已接近洗出点。
图8-3-3 残留菌体浓度、基质浓度与稀释率的变化关系 ■ 残留菌体浓度 ＋ 葡萄糖浓度 (三)胞内PHB含量、PHB浓度与稀释率的关系 如图8-3-4所示，随着D的增加，胞内PHB含量和PHB浓度均不断下降，胞内PHB含量从D为0.05 h-1时的9.5 %下降至D为0.4 h-1时的2.7 %；PHB浓度也从2.17 g/L下降至0.20 g/L。Morinaga利用H2、O2和CO2为基质连续培养R. eutrophus 时，发现在溶氧限制的稳态条件下，随着D的增加，胞内PHB含量不断下降，认为这是由于较高的菌体比生长速率下，NAD(P)H被迅速氧化所致。我们则认为在较高的比生长速率下，三羧酸循环途径中各个酶的活性很高，乙酰辅酶A有效地进入三羧酸循环进行氧化，形成各种合成菌体所需的氨基酸等中间代谢产物，使得用于合成PHB的中间产物─乙酰辅酶A的浓度很低，同时三羧酸循环所产生的高浓度CoASH强烈抑制了PHB合成途径中(-酮基硫解酶的活性，因而使PHB的合成途径受阻，造成所合成的PHB量减少。
图8-3-4 胞内PHB含量、PHB浓度与稀释率的关系 ＊ PHB含量 ■ PHB浓度 (四)残留菌体的生产强度、PHB的生产强度与稀释率的变化关系 如图8-3-5所示，当D为0.05 h-1至0.225 h-1时，随着D的增加，残留菌体的生产强度(PRB)不断增加，至D为0.225 h-1 时，PRB达到最大值为 5.69 g/(L(h)。D继续增加时，其值不断下降，至D为0.4 h-1时，PRB仅为3.44 g/(L(h)，比最大时下降了39.5%。当D为0.05 h-1至0.21 h-1时，PHB的生产强度(PPHB)也随着D的增加而增加，至D为0.21 h-1时达到最大为0.19 g/(L(h)，随后不断下降，至D为0.4 h-1时，下降至0.08 g/(L(h)。
图8-3-5 残留菌体的生产强度、PHB的生产强度与稀释率的变化关系 ◆ 残留菌体生产强度 × PHB生产强度 (五)残留菌体对底物的产率系数、产物对残留菌体的产率系数与稀释率的关系 如图8-3-6所示，当D在0.05 h-1至0.21 h-1的范围内，随着D的增加，YRB/S不断增加，YRB/S从D为0.05 h-1时的0.40 g/g，增至D为0.21 h-1时的最大值为0.53 g/g。当D继续增加时，YRB/S开始下降，当D为0.30 h-1和0.40 h-1时，YRB/S仅分别为0.37 g/g和0.36 g/g。可见在D较小和较大的情况下，YRB/S会随着D的减小或增大而大幅度下降，这是因为当D较小时，菌体的比生长速率较小，此时，维持代谢所消耗底物的比例增加，达到不可忽略的程度；而当D较大时，在供氧速率不足的情况下，可能会有某些其它代谢产物产生和积累，使得转化率下降。
图8-3-6 残留菌体对底物的产率系数和产物对残留菌体的产率系数与稀释率的关系
从图8-3-6中还可以看出，随着D的增大，YP/RB不断下降，即当菌体的比生长速率不断增大时，单位菌体合成PHB的能力却不断下降。Senior在研究氮源限制下的R. eutrophus 的连续培养时也发现，单位细胞物质所产生的聚合物(PHB)的量随生长速率的增加而减少。 (六)基质消耗比速与稀释率的关系 如图8-3-7所示，基质消耗比速随着D的增加而不断增加，(从D为0.05 h-1时的0.13 h-1增至D为0.4 h-1时的0.71 h-1。当D处于0.05 h-1至0.225 h-1之间，(几乎呈线性增加，经回归发现两者之间的变化关系符合下列方程： (＝1.77D+0.042=1.77(+0.042 (8-3-1)
图8-3-7 基质消耗比速与稀释率的关系 (七)残留菌体对底物的理论转化率和细胞维持系数的确定 从图8-3-4可以看出，R. eutrophus在连续培养过程中，由于培养基中的氮源浓度较高，细胞内所积累的PHB量很低，且随着D的增大，胞内的PHB含量不断下降，因而可以认为在D较大的情况下，基质的消耗主要用于细胞的生长，而用于产物合成的量很少。据此得到基质消耗的物料衡算方程：
(8-3-2) 式中xR即为残留菌体浓度(RB)。当代谢产物的积累忽略不计时，从式(8-3-2)可得:
(8-3-3) 将实验结果换算为
～1/(作图，结果如图8-3-8所示。可以看出，
与1/(呈线性相关，计算得到残留菌体的维持系数m为0.059 h-1，残留菌体对基质葡萄糖的理论转化率YG为0.60 g/g。
图8-3-8
～1/μ的关系 (八)连续培养条件下R. eutrophus WSH3的菌体生长的动力学 在单底物作为限制性基质且产物抑制不明显的连续培养中，Monod方程具有广泛的适用性，其方程为：
(8-3-4) 对Monod 方程取倒数得：
(8-3-5) 将实验结果以1/s～1/(作图，结果如图8-3-9所示。
图8-3-9 1/s～1/(关系图 从图中可见，1/s 与1/(呈线性相关，解得(max＝0.41 h-1，Ks＝0.57 g/L。 因此，在连续培养中，WSH3以葡萄糖为限制性基质的生长动力学方程为： ( =0.41S／(0.57+S ) (8-3-6) R. eutrophusWSH3一级连续培养动力学方程的建立，为进一步利用该菌进行PHB的发酵生产研究打下良好的基础。 三、二级连续培养生产PHB的动力学研究 在R. eutrophus一级连续培养过程中，葡萄糖为菌体生长的限制性基质，且氮源很丰富，所以菌体中PHB含量很低。为了获得高PHB含量的菌体，必须为菌体创造大量积累PHB的外部条件。由于菌体在氮源缺乏而碳源丰富的不平衡条件下可在胞内大量合成PHB，为此我们建立了一个二级连续培养系统，即将二个发酵罐串联，第一个发酵罐中流出的培养液再流入第二个罐中，在第二个罐中只流加PHB合成所需的碳源，而不补加氮源，当由第一级罐带入的氮源耗尽时，细胞就会在第二个罐中大量积累PHB。 二级连续培养系统的实验装置如图8-3-10所示，恒化器采用美国VIRTIS 2.5 L台式发酵罐。一级培养罐中的发酵液通过恒流泵流入二级培养罐中，并向其中流加50 %的葡萄糖液，控制二级罐中葡萄糖浓度在1～2 %之间。通气速率为1.2～1.5 L/(L(min)，转速为600～1000 r/min，温度控制 30±0.5 ℃，pH值通过自动流加3 mol/L的NaOH溶液控制在7.0±0.1。控制适当的罐体积，以维持一定的稀释率大小。
图8-3-10 二级连续培养系统的实验装置 F1∶5 %葡萄糖，F02∶50 %葡萄糖，F2∶二级罐发酵液出口 (一)一级罐与二级罐稀释率之间的对应关系 一级罐中的发酵液经恒流泵流入二级罐中，两罐之间稀释率的对应关系见表8-3-1。图8-3-11为一级罐中细胞干重和PHB含量与稀释率之间的关系，结合表8-3-1和图8-3-11可以判断出进入二级罐时的细胞干重和PHB含量(或PHB浓度)。 表8-3-1 一级罐与二级罐稀释率之间的对应关系 一级罐中稀释率/ h-1 0.05 0.075 0.10 0.125 0.15 0.188 0.21 0.225 0.3 0.40  二级罐中稀释率/ h-1 0.054 0.075 0.10 0.12 0.14 0.173 0.20 0.22 0.275 0.35  
图8-3-11 一级罐中细胞干重和PHB含量与稀释率之间的关系
(二)二级罐中细胞干重、PHB浓度和葡萄糖浓度与稀释率的关系 如图8-3-12所示，D在0.054 h-1至0.14 h-1之间时，细胞干重随稀释率的增大而增加，细胞干重从D为0.054 h-1时的40.1 g/L增至D为0.14 h-1时的最大值47.6 g/L，随后随着稀释率的进一步增大而下降，至稀释率为0.35 h-1时细胞干重下降为16.8 g/L，比最大值下降了64.7%。PHB浓度在稀释率为0.075 h-1时达到最大值30.5 g/L，当稀释率继续增大时，其值不断下降，至稀释率为0.35 h-1时，其值仅为0.59 g/L。在二级罐中，通过调节流加糖液的流量来控制葡萄糖浓度。由于细胞只有在氮源缺乏而碳源丰富的条件下才能在胞内大量积累PHB，因而二级罐中的葡萄糖浓度必须控制在既有利于PHB合成，又不影响后处理的较适宜范围内，其浓度变化见图8-3-12。
图8-3-12 二级罐中细胞干重、PHB浓度和葡萄糖浓度与稀释率之间的关系 ■ 细胞干重 ＊ PHB浓度 ● 葡萄糖浓度 (三)二级罐中残留菌体浓度、铵离子浓度、PHB含量与稀释率的关系 如图8-3-13所示，二级罐中残留铵离子浓度随着稀释率的增大而增大，在较低的稀释率时其浓度很低，基本接近为零，氮源成为生长限制性基质，有利于细胞大量积累PHB。从PHB含量变化曲线可以看出，在低稀释率时胞内PHB含量很高，随着稀释率的增大，由于培养液中铵离子的持续积累，细胞合成PHB的能力也在不断下降。 从图8-3-13中残留菌体浓度(RB)的变化曲线可以看出，在稀释率为0.054 h-1至0.173 h-1的范围内，RB浓度随稀释率的增大而增加，至稀释率为0.173 h-1时达最大值32.6 g/L，随后随稀释率的增大而不断下降，稀释率为0.35 h-1时下降至16.0 g/L。比较一级培养罐与二级培养罐中RB的浓度变化还可以发现，当二级罐中稀释率较低(约小于0.12 h-1)时，此时培养液中铵离子浓度很低，二级罐中的残留菌体浓度小于从一级罐中流入的残留菌体浓度，表明细胞在二级罐中有相当一部分产生了自溶，随着稀释率的增大，铵离子在二级罐中逐渐积累，使二级罐中的RB浓度大于一级罐中的RB浓度，这是由于当二级罐中的碳、氮源均较丰富时，有利于菌体的生长而不利于细胞积累PHB之故。
图8-3-13 残留菌体浓度、铵离子浓度和PHB含量与稀释率的关系 ▲ 一级罐中的残留菌体 ■ 二级罐中的残留菌体 ◆ NH+4 ＋ PHB含量 关于氮源浓度与细胞合成PHB的关系，Ahrens观察到R. eutrophus在生长过程中氮源缺乏的情况下，胞内丙酮酸浓度是正常生长条件下的5倍，由此导致乙酰辅酶A的浓度相应升高，同时由于高浓度的NADPH抑制了TCA循环中柠檬酸合成酶和异柠檬酸脱氢酶的活性，使得辅酶A的浓度降低，因而解除了高浓度的辅酶A对PHB合成途径中(-酮基硫解酶的抑制作用，导致大量乙酰乙酰辅酶A的形成，有利于PHB的积累。相反，根据PHB在胞内的代谢途径可以分析(图8-3-14)，随着培养基中氮源浓度的升高，乙酰辅酶A浓度降低，TCA循环产生的辅酶A增加，抑制了PHB合成途径中酶的活力，有利于细胞生长而不利于其积累PHB。作者在以葡萄糖为基质培养R. eutrophus生产PHB的流加发酵过程中，也发现在细胞生长的中后期限氮供应有利于PHB的大量积累。
图8-3-14 R. eutrophus 中PHB合成的代谢调节过程
表示抑制作用 (四)产物对残留菌体的产率系数和PHB生产强度与稀释率之间的关系 如图8-3-15所示，二级罐中PHB的生产强度从稀释率为0.054 h-1时的1.50 g/(L(h)增至稀释率为0.12 h-1时的最大值2.50 g/(L(h)。当稀释率继续增大时，PHB的生产强度随稀释率的增大而减小，至稀释率为0.35 h-1时，PHB生产强度下降至0.2 g/(L(h)。在PHB生产强度取得最大值的稀释率处(0.12 h-1)，胞内PHB含量仅为47.6 %(细胞干重为46.5 g/L)。由于过低的PHB含量会大大增加PHB提取过程的难度和成本，因此这一稀释率不宜作为最佳工作点。稀释率为0.075 h-1时，PHB生产强度为2.14 g/(L(h)，胞内PHB含量达72.1%，也就是说，在此稀释率下，二级罐中不仅PHB生产强度较高，细胞内PHB含量也较高。
图8-3-15 产物对残留菌体的产率系数和PHB的生产强度与稀释率之间的关系 ▲ PHB对残留菌体的产率系数 × PHB生产强度 从产物对残留菌体的产率系数(YP/RB)的变化中可以看出，YP/RB随着稀释率的增加而不断下降，说明随着比生长速率的增加，单位残留菌体合成PHB的能力不断下降，这与在一级连续培养中所得的结果相类似。 (五)二级罐中产物生成比速((PHB)与稀释率及铵离子浓度之间的关系 从图8-3-16可知，随着稀释率D的增加，由于二级罐中的铵离子浓度逐渐积累，该条件有利于菌体的生长而不利于细胞积累PHB，(PHB在D为0.054 h-1时达到最大值为0.145 h-1，然后随D的增大迅速减小，至D为0.35 h-1时，(PHB仅为0.014 h-1。从图中看出，(PHB基本上随D的增大而呈指数变化下降，对图中曲线进行回归，可得出(PHB与D之间的关系： (PHB=0.25×(2.65×10-4)D (8-3-7) 另一方面，如图8-3-17所示，(PHB与培养基中铵离子浓度密切相关，在铵离子浓度基本接近为零时，(PHB最大。铵离子浓度升高时，(PHB几乎呈线性下降趋势，表明菌体细胞只有生长完全受抑制的条件下才能大量合成PHB，当培养基中铵离子浓度升高时，PHB合成酶活性会受到严重抑制，(PHB减小。此外还可看出，当铵离子浓度很高时，(PHB也不会完全降为零，说明在氮源很丰富的菌体生长阶段，细胞内也会积累一定量的PHB。其原因有可能是因为尽管细胞生长阶段胞内辅酶ASH的浓度很高，但PHB合成途径中的关键酶─3-酮基硫解酶的活性不可能完全被抑制。Oeding和Schlegel在胞外对3-酮基硫解酶的研究表明，当CoASH的浓度达到0.5 mmol/L这样一个很高的水平时，该酶仍保持初始活性的5 %。

图8-3-16 产物生成比速与稀释率的关系 图8-3-17 产物生成比速与铵离子浓度的关系 由此可见，在PHB的发酵中，氮源的控制是其合成的关键，只要控制适宜的氮源浓度，就可以得到最大的产物生成比速，提高PHB的生产强度。 四、二级连续培养系统中PHB的生产强度和PHB对葡萄糖的产率系数 利用R. eutrophus来进行PHB的发酵生产，可以根据PHB的特点将生产过程分为两个阶段来进行，即菌体生长阶段和PHB合成阶段。R. eutrophus的连续培养过程中，在碳源为生长限制性基质而氮源丰富的条件下，菌体细胞大量繁殖而胞内积累的PHB量很少，此连续培养过程可看作是菌体的生长阶段；当细胞大量形成以后，只要在下一阶段中创造碳源过量而氮源缺乏的条件，就可促使细胞大量积累PHB。PHB发酵的二级连续培养系统正是根据这一思路构建的。 对一级连续系统中R. eutrophus的菌体生长和二级连续系统的PHB生产的研究表明，在一定的稀释率下，可将该系统作为PHB发酵生产的一种方式。由于PHB发酵系统的生产强度和产物对基质(葡萄糖)的产率系数是影响PHB生产成本的两个重要指标，因而还必须综合考虑整个系统的PHB生产强度和产物的产率系数。 如图8-3-18所示，在稀释率为0.054 h-1至0.12 h-1之间，PHB的生产强度随稀释率的增大而增加，其值从稀释率为0.054 h-1时的0.78 g/L/h增至稀释率为0.12 h-1时的最大值1.35 g/L/h。当稀释率继续增大时，PHB的生产强度随稀释率的增大而减小，至稀释率为0.35 h-1时，PHB生产强度下降至0.15 g/L/h。 PHB对葡萄糖的产率系数在稀释率为0.075 h-1时达到最大值0.38 g/g，随后随稀释率的增大而不断降低。由于在PHB最大生产强度处(D为0.12 h-1)，PHB对葡萄糖的产率系数仅为0.31 g/g，所获得的细胞胞内的PHB含量也较低(47.6 %)，不利于后处理过程，而在D为0.075 h-1时，PHB对基质的产率系数最大，PHB的生产强度可达1.14 g/L/h，胞内PHB含量为72.1 %，故此处可看作为该二级连续系统的较佳工作点。
图8-3-18 二级连续培养系统中PHB生产强度和产率系数与稀释率的关系 ○ PHB生产强度 ◇ PHB对葡萄糖的产率系数 综上所述，采用二级发酵连续培养系统生产PHB时，当稀释率较小时，二级罐发酵液中氮源浓度很低，细胞中PHB含量较高，但PHB的生产强度小。随着稀释率的增大，由一级培养系统中带入的氮源会在二级培养罐中逐渐积累，高浓度的氮源不利于细胞积累PHB，故胞内PHB含量低。稀释率为0.075 h-1是一关键点，此时不仅PHB的生产强度和胞内PHB含量较高，而且产物对基质的产率系数也最大，这一结果具有相当的实际应用价值。进一步地，如果要在较大的稀释率下进行培养，可考虑采用三级连续培养系统，以提高PHB的含量和产物对基质的转化率，但这会加大过程控制的难度和增加系统染菌的可能性。 第四节 聚羟基丁酸分批发酵过程动力学模型及优化 一、前言 PHB摇瓶发酵结果表明，R. eutrophus在适宜的摇瓶发酵条件下，细胞干重、PHB浓度及PHB含量最大可分别达22.2 g/L、17.3 g/L和78.3％，并发现采用中间补料的方式可以明显提高PHB的各项发酵指标。由于在小罐上可以对发酵过程中的某些参数(如溶氧、pH等)进行在线检测和控制，且对有些基质可以进行连续流加，避免一次投料过多对菌体生长和产物形成产生抑制作用，因而，在小罐发酵中，便于通过对发酵条件的有效控制来提高PHB的发酵指标。目前有关发酵过程控制的研究多集中于流加发酵的优化控制，进行流加发酵的优化研究，必须以分批发酵过程研究和确立合理的分批发酵动力学模型为基础。另外，对分批发酵过程动力学的研究和分批发酵模型的建立，将有助于更好地认识PHB发酵过程中菌体生长和产物形成的机制，以及影响这些机制的一些重要环境因素，最终实现对PHB发酵过程的有效控制，达到提高PHB发酵指标的目的。 我们研究了分批发酵中不同供氧水平对菌体生长和产物形成过程的影响，并对不同初始葡萄糖浓度下PHB的分批发酵动力学进行了研究。然后，对R. eutrophus菌体生长和产物形成不同阶段动力学和发酵数据进行了解析，在此基础上，建立了较为合理的PHB分批发酵动力学模型。 二、不同供氧水平对PHB发酵过程的影响 在通风发酵过程中，微生物的生长和产物的形成需要大量氧的参与，只要停止供氧几十秒钟，培养基中的溶解氧就会被耗完，因而如何控制培养过程中的溶氧水平是获得高发酵水平的关键之一。在反应器放大过程中，体积传氧系数(kLa)值是一个重要的参数，目前kLa 放大准则已成为生化工程界一个广泛接受的观点。可见在小型反应器中研究溶氧水平对发酵过程的影响，寻求最适的kLa值不仅是发酵工艺研究的关键之一，也是反应器放大研究的重要基础。 在PHB发酵过程中，前期主要为菌体生长阶段，需要大量氧的参与，若氧的供应受到限制，就会限制菌体的生长，并影响最终PHB产量；在PHB合成阶段，氧也是必不可少的基质，供氧的限制也会影响PHB的形成。在PHB发酵过程中，如果氧过量供应，不但会由于能耗的增加而使产品的生产成本增加，还会导致菌体生长的延滞期增长，降低PHB的生产强度。Sonnleitner等报道了以乳酸为碳源培养R. eutrophus H16时，当溶氧浓度为2.5～3.0 mg/L时，其比生长速率最大，当溶氧浓度超过3 mg/L以上时，会导致菌体比生长速率的下降，延滞期增长，A. eutrophu明显表现出一定程度的氧敏感性。Moore等认为培养基中的高氧浓度会抑制或延滞许多好氧或兼性厌氧菌的生长，但高氧浓度对菌体生长产生毒性的机理在很大程度上还很模糊。因而有必要研究PHB发酵中，不同的供氧水平对R. eutrophus的菌体生长和PHB合成过程的影响。 (一)2.5 L罐中搅拌转速与kLa 的关系 为了解PHB发酵过程中所采用的2.5 L发酵罐的供氧情况，采用亚硫酸盐法测定了在一定通气量条件下，搅拌转速与kLa之间的对应关系，见图8-4-1。从图中可以看出，当通气量为1.2 L/(L(min)，kLa 随着搅拌转速的增加而迅速增加，其值从搅拌转速为200 r/min时的87.5 h-1增至搅拌转速为1200 r/min时的759.9 h-1。
图8-4-1 2.5 L罐中搅拌转速与体积传氧系数(kLa )的关系 (二)不同kLa下细胞干重和残留菌体浓度的变化 为了考察PHB发酵中不同的供氧水平对菌体生长和产物合成的影响，研究了一定初始葡萄糖(5 %)和硫酸铵(0.25 %)浓度下，四种不同的供氧水平对PHB发酵的影响。 如图8-4-2所示，发酵过程中控制不同的kLa对细胞干重有很大的影响。当kLa很小时，细胞干重始终缓慢增加；而当kLa较大时，细胞干重增加较快，特别是在氮源缺乏的PHB合成期，细胞干重迅速增加。当kLa 为120.3 h-1、217.5 h-1、385.4 h-1和556.6 h-1时，最终细胞干重分别达到11.3 g/L、18.7 g/L、22.0 g/L和20.9 g/L，可见发酵过程中供氧受到限制时会对最终的细胞干重产生较大的影响。分析残留菌体变化曲线可知，当kLa 为120.3 h-1时，残留菌体浓度增加很慢，到27 h时才达到最大值6.2 g/L；而当kLa为217.5 h-1时，残留菌体浓度的增加最快，18 h即达到最大值6.6 g/L；当kLa为385.4 h-1时，残留菌体浓度在21 h达到最大值6.5 g/L；kLa为556.6 h-1时，残留菌体浓度在24 h达到最大值6.4 g/L。同时可以看出，培养基中氮源耗尽的时间分别相对应为27 h、18 h、21 h和24 h。另外，当kLa较大时，尽管残留菌体浓度达到最大值的时间不同，但最大残留菌体浓度的值非常接近，表明在一定的生长条件下，残留菌体对硫酸铵的产率系数相对较稳定。

图8-4-2 不同kLa下细胞干重和残留菌体浓度随时间的变化关系 综上所述，在菌体生长阶段，供氧不足会严重限制细胞的繁殖，使细胞生长的延滞期加长，但氧供应过量又会对细胞的生长产生一定的抑制作用，因而在菌体生长阶段控制适宜的溶氧水平，有利于细胞的快速生长繁殖，可缩短PHB发酵过程中菌体生长所需的时间，提高PHB的生产强度。 (三)不同kLa下PHB含量和PHB浓度的变化 如图8-4-3所示。从PHB含量的变化可知，在kLa为120.3 h-1的条件下，氮源在27 h才消耗完，而胞内PHB含量从氮源耗尽前就开始相对较快地增加，这可能是在菌体生长阶段，供氧的限制刺激了细胞内PHB的积累，但最终PHB含量相对较低，仅为45.9 %；当kLa为217.5 h-1时，尽管在细胞生长阶段，菌体的生长很快，但在PHB合成阶段由于氧的供应受到限制，影响了PHB的积累，最终胞内PHB含量仅为68.9 %；当kLa为385.4 h-1和556.6 h-1时，培养基中氮源耗尽时，PHB含量即开始迅速增加，最终分别达到79.3 %和77.1 %。 从PHB浓度变化曲线可以看出，kLa为120.3 h-1时，氮源耗尽前PHB浓度相对比其它kLa情况要高些，但在整个发酵过程中PHB浓度增加一直很慢；当kLa分别为217.5 h-1、385.4 h-1和556.6 h-1时，PHB浓度分别从18 h、21 h和24 h起迅速增加，但当kLa为217.5 h-1时，发酵后期PHB浓度增加相对减慢，表明在氮源缺乏的PHB合成阶段，如果氧的供应同时受到限制，则会影响PHB的积累。不同kLa下发酵结束时PHB浓度分别达到5.2 g/L、12.9 g/L、17.2 g/L和16.1 g/L。由此可见，在PHB合成阶段，只有将供氧维持在一定水平以上，才能促使细胞大量积累PHB。考虑到能耗问题，PHB合成期的kLa 值也不宜过高。 因此，在PHB分批发酵中，可根据菌体生长阶段和PHB合成阶段的不同需氧特点来进行发酵过程的控制，在发酵前期的菌体生长阶段可控制kLa 值为217.5 h-1左右，使残留菌体的比生长速率最大；进入PHB积累阶段，可通过适当提高搅拌转速来增加发酵罐的供氧水平，维持一定的溶氧浓度，促使细胞大量积累PHB。

图8-4-3 不同kLa下PHB含量和PHB浓度随时间的变化关系 三、不同初糖浓度对PHB发酵过程的影响 从上述研究结果可知，在PHB发酵过程的不同阶段，控制kLa处于不同的水平有利于提高PHB的发酵生产指标，故而在以下研究中均按上述所确定的最佳方式来控制发酵过程中氧的供应。 (一)不同初糖浓度下发酵过程中菌体总干重的变化 如图8-4-4所示。不同的初糖浓度最终所能达到的细胞干重不同，当初糖浓度为1%、2%、3%、4%、5%和6%时，最大的细胞干重分别达到6.9 g/L、11.2 g/L、16.9 g/L、19.6 g/L、22.3 g/L和22.5 g/L。初糖浓度在5 %以上时，细胞干重几乎不再增加。所以在PHB的分批发酵中，当硫酸铵浓度为0.25 %时，初糖浓度为5 %左右比较适宜。
图8-4-4 不同初糖浓度下菌体总干重的变化 (二)不同初糖浓度下葡萄糖和硫酸铵浓度的变化 如图8-4-5所示。研究表明，当初糖浓度为1 %至6 %时，培养基中硫酸铵浓度降为零的时间分别为11 h、13 h、15 h、18 h、18 h和21 h，此时，培养基中的残留葡萄糖浓度分别为0.09 %、0.70 %、1.49 %、2.37 %、3.34 %和4.08 %。图8-4-5中仅给出了初糖浓度为3 %时硫酸铵浓度的变化情况。从图中可以看出，当初糖浓度为1 %至5 %时，葡萄糖浓度降至零的时间分别为15 h、21 h、24 h、34 h和37 h，初糖浓度为6 %时，发酵40 h残留葡萄糖浓度为0.59 %。
图8-4-5 不同初糖浓度下葡萄糖和硫酸铵浓度随时间的变化 (三)不同初糖浓度下发酵过程中PHB浓度的变化 如图8-4-6所示。当葡萄糖浓度为1 %至6 %时，最大PHB浓度分别达到1.6 g/L、5.8 g/L、10.3 g/L、14.5 g/L、17.9 g/L和17.6 g/L。由前面研究结果可知，氮源缺乏的不平衡生长条件能刺激细胞大量积累PHB，当初糖为1 %时，由于氮源耗尽时碳源浓度也已很低，在此条件下细胞不能有效地积累PHB，因而最终胞内PHB浓度很低；而当初糖为2 %以上时，氮源耗尽时碳源浓度还比较高，有利于细胞合成PHB。可见，氮源缺乏而碳源过量的环境条件有利于胞内PHB的大量积累。因此，在PHB的分批发酵中，当硫酸铵浓度为0.25 %时，初糖浓度为5 %左右比较适宜。
图8-4-6 不同初糖浓度下产物PHB浓度的变化 (四)PHB合成速率与合成期葡萄糖浓度的关系 结合图8-4-5中PHB浓度随时间的变化关系，可以得到PHB合成期其合成速率与残留葡萄糖浓度的变化关系，如图8-4-7所示。从图中可以看出，当残留葡萄糖浓度很低时，会限制胞内PHB的形成；当葡萄糖浓度在0.7 %以上时，PHB的合成速率随葡萄糖浓度的增加而略有增加。由此可见，在PHB合成阶段必须保持葡萄糖浓度在一定水平以上，才能有利于细胞大量积累PHB。
图8-4-7 PHB合成速率与糖浓度的关系 (五)不同初糖浓度下发酵过程中胞内PHB含量的变化 如图8-4-8所示。从图中可以看出，当培养基中的氮源耗尽时，细胞开始大量积累PHB，胞内PHB含量迅速增加；当培养基中的葡萄糖与硫酸铵之比(简称糖铵比)增加时，最终胞内PHB含量也不断增加，糖铵比从4∶1提高至24∶1的过程中，PHB含量分别达到23.3 %、51.1 %、64.7 %、74.0 %、78.3 %和78.1 %。糖铵比较低时，由于氮源耗尽时，培养基中的残留葡萄糖浓度很低，故最终的PHB含量也较低，当糖铵比为20时，最终胞内PHB含量可以达到很高的水平。糖铵比继续增加PHB含量几乎维持不变，表明在一定的糖铵比条件下，最终PHB含量一定，并且最终胞内的PHB含量还存在某一最大值。
图8-4-8 不同初糖浓度(或糖铵比)下胞内PHB含量随时间的变化 (六)不同初糖浓度下残留菌体浓度的变化 如图8-4-9所示。当初糖浓度为1 %至6 %时，最大残留菌体浓度分别为5.74 g/L、6.31 g/L、6.50 g/L、6.52 g/L、6.40 g/L和6.34 g/L，达到最大残留菌体浓度的时间分别为11 h、13 h、15 h、18 h、18 h和21 h，可见不同初糖浓度下，菌体的比生长速率不同，初糖浓度较高时会对菌体的生长产生抑制作用。另外，从图中可以看出，在PHB积累阶段，残留菌体浓度有所下降，表明在氮源完全缺乏的PHB合成阶段，细胞会发生自溶。
图8-4-9 不同初糖浓度下残留菌体浓度的变化 (七)初糖浓度与残留菌体对葡萄糖产率系数及PHB生产强度和PHB对葡萄糖产率系数的关系 不同初糖浓度下残留菌体对葡萄糖的产率系数的变化关系如图8-4-10所示。从图中可见，随着初糖浓度的提高，残留菌体对葡萄糖的产率系数会不断下降，而该值与最终PHB对葡萄糖的产率系数成正比关系(见式8-2-8)，所以在PHB的分批发酵中，初糖浓度的提高可能会导致PHB对葡萄糖的产率系数下降。
图8-4-10 不同初糖浓度与残留菌体对葡萄糖的产率系数的关系 图8-4-11为不同初糖浓度与PHB生产强度和PHB对葡萄糖产率系数的变化关系。在初糖浓度为较低的范围内，随着初糖浓度的升高，PHB对葡萄糖的产率系数不断增加，随后随初糖浓度的增加又有所下降，至初糖为6 %时，产率系数下降为0.32 g/g。分析式(8-2-8)可知，当初糖浓度较低时，尽管残留菌体对葡萄糖的产率系数较高，但由于最终胞内的PHB含量较低，导致PHB对葡萄糖的产率系数下降；而在初糖浓度很高的情况下，尽管胞内PHB含量可以达到较高的值，但残留菌体对葡萄糖的产率系数却有所降低，这也会使PHB对葡萄糖的产率系数下降。 PHB的生产强度随初糖浓度的增加而不断增加，其值由初糖为1%时的0.11 g/(L(h)增至初糖为5 %时的最大值0.48 g/(L(h)，随后随初糖浓度的增加而有所下降。可见当初始硫酸铵浓度为0.25 %时，葡萄糖浓度为5 %左右时，可使PHB的生产强度和PHB对葡萄糖的产率系数都取得较大的值。
图8-4-11 不同初糖浓度与PHB生产强度和产率系数的关系 ○ PHB对葡萄糖的产率系数；□ PHB生产强度 综上所述，在PHB的发酵生产中，如果要获得较高的PHB产量，必须同时提高葡萄糖和硫酸铵的浓度，但较高的初始葡萄糖浓度会对菌体的生长产生抑制作用，使得菌体生长阶段的时间延长或残留菌体对葡萄糖的产率系数下降，可见采用分批发酵法难以同时得到很高的PHB浓度、PHB生产强度和PHB对葡萄糖的产率系数。 四、PHB分批发酵过程分析和控制 为了更全面地了解PHB分批发酵过程中的菌体生长和产物合成过程，有必要对发酵过程中各参数的变化进行进一步的分析。由不同初糖浓度下的PHB分批发酵结果可知，初糖为5 %时可以取得较好的发酵指标，以下将对这一条件下的发酵过程参数变化进行分析。 图8-4-12为初糖5 %和初始硫酸铵浓度0.25 %条件下的PHB分批发酵过程参数变化。PHB的分批发酵过程可分为两个阶段，第一个阶段为氮源丰富的菌体生长期，第二个阶段为氮源缺乏的PHB合成期。在菌体生长阶段，虽然氮源丰富，细胞内也有少量PHB积累，此阶段内PHB浓度和含量缓慢增加，至生长阶段结束时，胞内PHB含量达到近20 %；氮源耗尽后，菌体生长停止，开始大量积累PHB，PHB浓度和含量迅速增加，至发酵结束时，胞内PHB含量达78.3 %。在PHB合成期内，残留菌体浓度有所下降，表明在氮源完全缺乏的条件下会使细胞产生自溶。

图8-4-12 初糖5 %和初始硫酸铵0.25 %时的分批发酵过程参数 根据以上分析，可将PHB发酵中产物的形成看作部分偶联型∶发酵前期以菌体的生长为主，发酵中后期菌体的生长停止，主要进行产物PHB的合成。在PHB合成阶段，PHB形成速率与残留菌体浓度有关。在最短的时间内获得最大量的产物，是PHB发酵过程的目的，因而可以结合PHB分批发酵过程中菌体生长阶段和产物形成阶段的不同特点，对其发酵过程进行分段控制：在菌体生长阶段控制适宜的条件使细胞以最大的比生长速率进行繁殖，以便在最短的时间内获得最大的菌体量；在PHB合成阶段控制较佳的条件使产物迅速合成。 前面的研究表明，在碳氮源浓度一定时，控制适宜的供氧条件，可以缩短细胞生长的延滞期，提高菌体的比生长速率，减少菌体生长阶段所需的时间；在氮源缺乏的PHB合成期，氧的供应必须充分，否则会降低细胞的合成活性，影响最终PHB的产量。另外，由于在适宜的生长条件下，残留菌体对氮源硫酸铵的产率系数一定，要提高残留菌体浓度似乎可以通过增加初始硫酸铵浓度来实现，但如果仍保持葡萄糖浓度不变的话，则糖铵比的下降会使最终的PHB含量及浓度降低，且较低的PHB含量会使后处理成本增加；但如葡萄糖浓度随氮源浓度的增加而增加(维持糖铵比不变)，则较高的初始葡萄浓度会对菌体的生长产生抑制作用，使生长阶段延长，导致PHB生产强度降低，高的葡萄糖浓度还会使残留菌体对葡萄糖的产率系数下降，造成最终产物PHB对葡萄糖的产率系数下降，使发酵原料的成本增加。另外，在分批发酵过程中的PHB合成阶段，培养基中氮源的完全缺乏会导致有关PHB合成酶的活性不断下降，影响胞内PHB的快速积累，因而也难以得到很高的PHB生产强度。可见，采用分批发酵法，不可能同时得到高的PHB浓度(含量)、PHB生产强度和PHB对葡萄糖的产率系数。 五、PHB分批发酵动力学 (一)菌体生长动力学模型 在R. eutrophus生产PHB过程中，PHB为胞内产物，细胞由两部分组成：即残留菌体(xR)部分和PHB(P)部分，其中残留菌体是细胞内具有催化活性的组分，负责进行细胞内的各种代谢活动。因而PHB发酵过程中的细胞生长可表示为：
(8-4-1) 由连续培养动力学的研究结果可知，在以葡萄糖为限制性基质时，R. eutrophus的生长符合Monod方程，但在分批发酵过程中，为了获得较高的产物浓度，基质的浓度一般都维持在较高的水平，高浓度的葡萄糖会抑制菌体的生长，可见不宜直接用Monod方程来描述分批发酵的菌体生长行为。 对于R. eutrophus的菌体生长过程，Heinle、Belfares和Yoo等分别采用了式8-4-2、8-4-3和8-4-4来描述：
(8-4-2)
(8-4-3)
(8-4-4) 采用式(8-4-2)能较好地预测R. eutrophus以H2、O2和CO2为基质条件下的菌体生长行为；式(8-4-3)是以葡萄糖为碳源，硫酸铵为氮源条件下R. eutrophus的菌体生长模型，式中第一项和第二项分别表示该菌的生长受高浓度葡萄和硫酸铵的抑制，第三项表示高的菌体浓度对生长的抑制作用，该模型能较好地描述发酵过程中高细胞浓度下菌体的生长行为；式(8-4-4)采用压力诱导机制下酶的调控作用来预测菌体生长行为，通过对酶合成(诱导/阻遏)和酶活性(抑制/激活)机制的描述，该模型能较好地预测PHB的发酵过程，但需要确定一些实验过程中难以测量的参数，如初始酶水平和与菌体生长相偶联的酶比产生饱和常数等。 对于本文中所采用的R. eutrophus，前面的结果研究表明：(1)高浓度的葡萄糖对菌体的生长有抑制作用；(2)硫酸铵浓度在0.4 %以上时会对菌体的生长产生抑制作用(数据未列出)，而实际发酵过程中硫酸铵的浓度不会超过0.4 %，所以可以不考虑硫酸铵的抑制作用；(3)即使在氮源丰富的菌体生长阶段，胞内所积累的PHB含量也能达15～20 %，综合考虑上述因素，并假定产物和基质对菌体生长抑制的机制相似，根据Luong所提出的生长抑制模型，本文提出一个描述分批发酵中菌体生长的动力学模型：
(8-4-5) 式中∶
为菌体的最大比生长速率；
为葡萄糖与硫酸铵浓度之比；KS为基质半饱和常数；
为菌体生长完全受抑制时葡萄糖与硫酸铵之比；n为匹配参数，没有任何物理意义。 (二)产物形成模型 在PHB发酵中，产物形成与菌体生长部分偶联，最终所形成的产物PHB由两部分组成，包括菌体生长阶段合成的PHB(P1)和氮源耗尽后的PHB合成期所合成的PHB(P2)，因而两阶段中PHB的合成速率可分别表示为
(菌体生长阶段的PHB合成速率)和
(PHB合成期的PHB合成比速)。菌体生长阶段产物的形成与细胞的生长相偶联，因而此阶段产物PHB的合成速率
可表示为：
(8-4-6) 菌体生长停止后，PHB开始大量合成，此阶段的PHB合成速率与碳源浓度、氮源浓度、残留菌体量和胞内的PHB含量有关。分批发酵过程中，由于在菌体生长停止后的PHB合成阶段没有进行氮源的限量补加，因而氮源对PHB合成速率的影响可以不考虑；在PHB合成阶段，低浓度的葡萄糖会限制PHB的合成，而只有葡萄浓度过量时才能刺激细胞大量合成PHB；在PHB积累过程中，随着胞内PHB含量的增加，PHB的合成速率会逐渐下降至零，这可能是当培养基中的氮源完全缺乏时，胞内蛋白质合成所需的氨基酸资源不能及时得到补充，从而会导致有关PHB合成酶的活性逐渐下降。综合上述各种因素，提出此阶段PHB合成速率
的表达式为：
(8-4-7) 式中∶
为PHB的最大合成比速，
为最大残留菌体浓度，
为PHB合成阶段的基质半饱和常数，
为有关PHB合成酶的失活常数，
为氮源耗尽时的葡萄糖浓度，t1为氮源耗尽时的发酵时间。 (三)基质消耗模型 在PHB分批发酵过程中，氮源的消耗主要用于细胞物质的合成，氮源耗尽后，细胞的生长即停止，硫酸铵的消耗与残留菌体的生长相对应，因而，硫酸铵的消耗速率可以表示为：
(8-4-8) 葡萄糖的消耗由三部分组成，即形成细胞物质、合成产物PHB和维持细胞活性。与产物形成相对应，葡萄糖的消耗速率也可分为两部分来表示。 菌体生长阶段的葡萄糖消耗速率
为：
(8-4-9) 或表示为：
(8-4-10) 其中：
(8-4-11)
(8-4-12) PHB合成阶段的葡萄糖消耗速率
可表示为：
(8-4-13) (四)PHB分批发酵动力学模型 综上所述，可以得出PHB分批发酵的动力学模型为：
(8-4-5)
(8-4-6)
(8-4-7)
(8-4-8)
(8-4-10)
(8-4-13) 分别用式8-4-5至8-4-13对不同
条件下的PHB分批发酵的实验数据进行拟合，计算出的模型参数见表8-4-1。 表8-4-1 分批发酵过程模型的参数值 参数 
/ h-1 
/ g(L-1 
n 
/ h-1 K1 / g(L-1  数值 0.34 0.51 60.2 0.96 0.21 0.0081   参数 K2 / g(g-1(h-1 K3 / h-1 K4 / g(g-1 K7 / g(g-1 K8 / g(g-1(h-1 K9 / g(g-1 Me / g(g-1(h-1  数值 0.0063 0.024 0.39 2.15 0.069 2.44 0.059  表8-4-2为模型计算值与实验值的比较。采用上述模型对PHB分批发酵的过程进行拟合，所有点的误差都小于10 %，表明采用该组模型能较好来描述PHB的分批发酵过程。 表8-4-2 模型计算值与实验值的比较 发 酵 残留菌体浓度 / g(L-1 PHB 浓度 / g(L-1 葡萄糖浓度 / g(L-1 硫酸铵浓度 / g(L-1  时 间 (h) 实 验 值 计 算 值 误 差 (%) 实 验 值 计 算 值 误 差 (%) 实 验 值 计 算 值 误 差 (%) 实 验 值 计 算 值 误 差 (%)  0 0.96 0.96 0 0.036 0.036 0 50 50 0 2.5 2.5 0  3 1.69 1.85 9.4 0.085 0.08 5.9 49.3 49.1 0.4 2.42 2.40 0.8  5 2.75 2.83 2.9 0.26 0.24 7.7 48.1 48.5 0.8 2.34 2.32 0.9  7 3.93 4.01 2.0 0.47 0.45 4.3 46.1 47.0 2.0 2.15 2.21 5.1  9 4.77 4.79 0.4 0.73 0.67 8.2 44.5 45.3 0.5 1.85 1.94 4.9  11 5.3 5.32 0.4 0.89 0.82 7.9 44.1 44.7 1.4 1.54 1.58 2.6  13 5.75 5.91 2.8 1.13 1.07 5.3 42.4 42.3 0.2 1.04 1.14 9.6  15 6.2 6.31 1.7 1.58 1.51 4.4 39.2 39.7 1.3 0.60 0.63 5  18 6.3 6.43 2.1 4.13 4.10 0.7 33.4 33.4 0 0 0 0  21 6.28 6.40 1.9 6.15 6.25 1.6 31.5 31.2 0.9     24    9.24 9.32 0.9 26.0 27.3 5     27    12.81 12.51 2.3 20.3 21.5 5.9     30    15.41 14.82 3.8 15.5 16.8 8.4     34    16.72 16.94 1.3 8.2 7.8 4.9     37    17.9 17.60 1.7 0 0 0     六、PHB分批发酵过程动力学的分析 (一)模型的适用范围 从PHB的摇瓶培养和分批发酵结果可知，最终胞内PHB的含量与培养基中初始葡萄糖和硫酸铵浓度之间的比例(即SC /SN)有密切的关系，PHB含量随其SC /SN 值的增加而增加，当SC /SN 值为20左右时，PHB含量可以达到很高的值，SC /SN 继续增大时，PHB含量几乎不再增加，因而在考察PHB分批模型的适用范围时，选择了SC /SN 不超过24的发酵条件。

图8-4-13 SC /SN为8时的PHB发酵过程参数变化

图8-4-14 SC /SN为16时的PHB发酵过程参数变化

图8-4-15 SC /SN为24时的PHB发酵过程参数变化 图8-4-13至8-4-15分别是SC /SN为8、16和24条件下的实验值与模型计算值的比较(图中点表示实验值，线表示模型计算值)。从图中可以看出，在所选择的试验范围内，模型计算值与实验值拟合得很好，而且将菌体生长阶段和PHB合成阶段的产物形成及葡萄糖消耗分开来表达，更能描述实际过程的变化情况。因此，该组模型可以较好地用于描述正常实验条件下的PHB分批发酵过程。 (二)PHB分批发酵模型分析 以葡萄糖为R. eutrophus的菌体生长和PHB合成的碳源时，低浓度的葡萄糖会限制菌体的生长，高浓度的葡萄糖会抑制菌体的生长，为了有足够的葡萄糖促使细胞形成产物PHB，因而在分批发酵中葡萄糖的浓度一般都比较高，所以Monod方程不适合分批条件下的菌体生长行为。采用8-4-5式所表达的菌体生长动力学对PHB的分批发酵过程数据进行拟合，计算出菌体的最大比生长速率为0.34 h-1，微生物对底物的半饱和常数Ks为0.51 g/L。R. eutrophus的连续培养动力学研究结果表明，以葡萄糖为限制性基质时，该菌的最大比生长速率为0.41 h-1，Ks为0.57 g/L，可见两种条件下所得出的数值比较接近。 R. eutrophus细胞只有在氮源缺乏而碳源过量的不平衡生长条件下，才能在胞内大量积累PHB。前面的研究结果表明，在氮源丰富的菌体生长阶段，伴随着细胞繁殖的同时胞内也会积累一定量的PHB，以式8-4-6对分批发酵数据进行拟合，得出的K1和K2的值都很小(见表8-4-1)，表明在菌体生长阶段，胞内所积累的PHB量很少，氮源耗尽后细胞才开始大量合成PHB，因而在本研究中将菌体生长阶段的产物形成过程与PHB大量合成阶段的产物形成过程分开表达，将更有助于对PHB发酵过程中产物积累机制的理解。 在PHB分批发酵过程中的产物积累阶段，由于培养基中氮源完全缺乏，随着发酵的进行，有关PHB合成酶的酶活性会逐渐下降，部分细胞还会发生自溶，从而导致PHB的合成速率不断下降，因而在式8-4-7中采用了“[1-K3(t-t1)]”这一项来表示产物合成阶段PHB合成速率随时间下降的关系。假定PHB合成速率降为零，由[1-K3(t-t1)]＝0可得，发酵时间为t=41.7+t1，表明此时即使有葡萄糖存在，细胞也不能继续积累PHB。可见，在PHB分批发酵中，一方面由于高糖浓度会对菌体生长产生抑制作用，另一方面由于在氮源完全缺乏的PHB合成期，有关PHB合成酶的活性会不断下降，因而采用分批发酵法不可能得到很高的PHB浓度。 第五节 聚羟基丁酸流加发酵条件研究 一、前言 与石油化工塑料相比，PHB发酵过程较高的生产成本阻碍了PHB在日常生活中的广泛应用，因此，研究人员不断去寻找具有较高PHB合成能力、能从廉价基质合成PHB的优良的微生物菌种；开发以提高PHB生产强度、降低生产成本为目标的培养策略。提高PHB的生产强度，不仅要缩短培养时间，还要考虑增加细胞浓度和胞内PHB的含量，以降低下游工艺和废水处理的费用。流加培养技术是获得高细胞密度和高PHB含量最有效的手段，从第二节中的摇瓶分批定时补料发酵结果可以看出，采用补料措施后，细胞干重、PHB浓度和PHB对葡萄糖的转化率可分别达到35.1 g/L、28.3 g/L和0.36 g/g，比补料前分别提高了58.1 %、63.6 %和16.1 %。 在PHB的流加发酵生产过程中，碳源、氮源和氧浓度是R. eutrophus菌体生长和PHB合成的三个最重要的因素，控制其值在适当的范围内，可使细胞的生长和产物的合成朝着预期的方向发展，因而研究氮源、碳源和氧的控制过程对R. eutrophus代谢的影响，有助于进一步了解其菌体生长和产物合成过程的代谢调节规律，对提高PHB流加发酵过程的控制水平具有相当重要的意义。 氮源作为细胞内氨基酸、DNA和其它生物分子形成的必需组成，对细胞的生长和复制所起的作用十分关键，氮源的供给与缺乏会影响细胞物质的生物合成过程。前面的研究结果表明，R. eutrophus培养过程中氮源的限制或缺乏，可以激发细胞在其胞内大量积累PHB，因而控制培养过程中氮源的供给，就能起到调控细胞内部生物合成过程的作用；碳源作为细胞物质、能源和PHB碳架的来源，其供给的水平将会直接影响细胞的生长和PHB的合成；R. eutrophus的分批发酵研究结果表明，氧的供应对菌体生长和PHB的合成也有很大的关系，在菌体生长前期，氧的缺乏会使菌体生长的延滞期加长，而在氮源缺乏的PHB合成期，氧的供应不足还会导致菌体发生自溶，从而严重影响最终PHB的产量。 本节首先研究了R. eutrophus培养过程中，氮源、碳源和氧的供给情况对菌体生长和PHB合成的影响，然后探讨了PHB流加发酵过程中不同的停氮时间和PHB合成期氮源的不同流加速率对PHB发酵结果的影响，以期为PHB流加发酵优化控制打下良好的基础。 二、氮源的限制、缺乏和恢复氮源供应对R. eutrophus菌体生长和PHB合成的影响 根据前面的研究结果和对实验过程的分析可以看出，当培养基中的葡萄糖浓度为0.2%～4 %和硫酸铵浓度为0.05%～0.4 %时，R. eutrophus处于生长平衡状态。 图8-5-1为氮源控制条件下各参数的变化情况。第15 h限制氮源的供给后，从残留菌体浓度变化曲线和残留菌体的比生长速率曲线可以看出，细胞继续生长，但其生长速率比平衡状态时的生长速率有所下降；从PHB浓度和含量变化曲线可以看出，细胞在限氮条件下开始大量合成PHB，胞内PHB含量和PHB的浓度迅速上升，另外，从PHB的比合成速率可以看出，细胞限氮后，其生成比速从平衡生长条件下的0.022 h-1上升至0.053 h-1 ，增加了140.1 %，表明细胞在氮源限制的情况下，其胞内的代谢途径发生了很大的变化，细胞物质的生物合成过程受到一定程度的抑制，代谢的中间产物乙酰辅酶A由原来主要流向TCA循环以形成合成菌体所需的物质转为流向PHB的合成途径而形成PHB。Oeding在培养R. eutrophus ATCC17699合成PHB的研究过程中发现，当氮源的供应受到限制时，细胞中氨基酸和DNA的合成受到抑制，使细胞的生长受到抑制，由此引起胞内ATP水平的升高，高水平的ATP首先抑制细胞的呼吸活性，使得氧化作用下降，导致NAD(P)H的积累，从而抑制了TCA循环中异柠檬酸脱氢酶的活性，TCA循环活性减小，致使乙酰辅酶A积累和乙酰辅酶A/辅酶ASH比例的增加，由于辅酶ASH的水平下降，解除了其对(-酮基硫解酶的抑制作用，使PHB合成途径的活力增强，导致胞内PHB的大量积累。从图中细胞干重变化曲线可以看出，由于在氮源限制条件下PHB量迅速增加，残留菌体浓度也不断增加，使得细胞干重的量增加很快；此过程中溶氧百分比浓度仍呈线性下降趋势，说明细胞在PHB合成过程中对氧的消耗很大。 在培养第25 h后，培养条件由限氮状态转为缺氮状态时，残留菌体浓度开始下降，残留菌体的比生长速率接近为零，PHB的浓度和其胞内含量仍继续增加，PHB的生成比速上升至最高点(0.086 h-1)后开始不断下降。对R. eutrophusPHB代谢途径的化学计量式的分析显示，聚合物PHB中每增加一个HB单体可净产3个NAD(P)H，因而由于胞内PHB的不断合成，导致NAD(P)H的不断积累，从对R. eutrophus的代谢途径分析可以看出，胞内NAD(P)H的积累会使糖酵解途径受到抑制，由此可能会引起PHB合成过程对乙酰辅酶A的需求速率超过糖酵解途径对乙酰辅酶A的供应速率，造成乙酰辅酶A/辅酶A的比率下降，使得(-酮基硫解酶受到胞内逐渐积累的辅酶ASH的抑制，导致PHB合成速率减慢。另外，在缺氮条件下，细胞合成PHB能力的逐渐下降，还可能与PHB合成酶的活力逐渐降低有关。 



图8-5-1 氮源限制、缺乏和解除氮源缺乏过程中细胞干重、残留菌体量、PHB浓度、PHB含量、溶氧浓度、氮源浓度、(RB和(PHB随时间的变化情况. 方法∶培养基中葡萄糖和硫酸铵的初始浓度分别为2%和0.2%，在第15 h氮源浓度降至生长限制浓度以下时，开始以1.0 g/(L(h)的速率连续流加硫酸铵溶液，使细胞生长处于氮源限制状态；第25 h时停止硫酸铵的流加，使细胞处于氮源缺乏状态，第35 h时向发酵罐中一次加入0.2 %的硫酸铵；整个发酵过程中维持葡萄糖浓度在1-2 %之间。 从图8-5-1中可以看出，第35 h恢复供氮后，残留菌体的比生长速率开始上升，说明部分细胞在有氮源存在时开始生长繁殖，但其比生长速率和限氮前平衡生长阶段的值相比要小得多。James的研究发现，在R. eutrophus的PHB合成过程中，当氮源的供应恢复时，细胞的生长没有恢复到平衡生长时的水平，同时发现细胞的呼吸作用加强了，这对细胞克服非生长期所造成的细胞生物合成机制的延滞是必需的。在恢复供氮时，胞内PHB的含量已达细胞干重的59.3 %，电子显微镜下观察到PHB在细胞内呈大的颗粒状，其出现可能会对细胞的生长产生一种生理性障碍，从而降低细胞的比生长速率。从PHB比生成速率的变化曲线可以看出，其值小于零。PHB的浓度和其胞内含量也不断下降，分别从恢复氮源供应前的14.1 g/L和59.3 %下降至13.0 g/L和47.1 %，PHB的浓度和其胞内含量分别下降了7.1 %和20.6 %，表明在此阶段胞内部分PHB发生了降解作用。从溶氧变化曲线可以看出，此阶段溶氧百分浓度的下降速率增大，表明细胞的生长对氧需求的增加。在整个发酵阶段，细胞干重不断增加。 由以上分析可知，在PHB的发酵过程中，为了使胞内PHB大量积累，只能限氮而不能缺氮，完全缺氮会造成菌体细胞的自溶和PHB合成比速的迅速下降，这一点与前面分批发酵中所得出的结论相同；此外，如在PHB合成阶段缺氮一段时间后再大量补氮，则会导致胞内PHB的降解。可见，培养过程中氮源浓度的变化能直接对细胞物质的生物合成过程产生影响，并通过反馈抑制作用间接地对其它途径产生作用。 三、葡萄糖的限制、缺乏和恢复供应对R. eutrophus菌体生长和PHB合成的影响 如图8-5-2所示。可以看出，第18 h葡萄糖浓度成为生长限制因素后，细胞干重和残留菌体浓度仍均继续增长，残留菌体的比生长速率由0.16 h-1下降至0.071 h-1后继续缓慢下降。PHB浓度和胞内PHB的含量略有增加；PHB的生成比速不断下降但仍然大于零，表明细胞在葡萄糖限制的生长状态仍能在其胞内缓慢积累少量PHB。从细胞代谢调节的角度考虑，可能是在葡萄糖受到限制的条件下，细胞内各代谢途径的活性都相对较低，胞内的NAD(P)H、ATP和碳源中间代谢产物的水平随着它们的不断消耗而下降，因而，使AMP、ADP和NAD(P)的浓度相对较高，磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)水平也较低，由此激活了丙酮酸激酶(PK)的活性，受ATP、NAD(P)H和PEP抑制的异柠檬酸脱氢酶(ICDH)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的抑制作用被解除，糖酵解途径较畅通，乙酰辅酶A的浓度相对升高，致使细胞能缓慢积累PHB。 第32 h后，当培养过程处于葡萄糖缺乏状态时，残留菌体的比生长速率迅速降为零；PHB的浓度和胞内含量迅速下降，PHB生成比速为负值，说明细胞在有氮源存在而碳源缺乏时，会降解其胞内所积累的部分PHB作为生物合成的前体和维持细胞活性的能量来源。分析R. eutrophus的代谢途径可以看出，停止葡萄糖的供应后，糖酵解途径和TCA循环过程中间产物的浓度下降，乙酰辅酶A/辅酶ASH和NADH/NAD的比例也都下降，相对较高水平的辅酶ASH抑制了由β-酮基硫解酶所催化的乙酰辅酶A的缩化反应，乙酰乙酰辅酶A还原酶和PHB聚合酶活性也受到抑制，同时又使乙酰乙酰辅酶A裂解反应的抑制作用解除，低水平的NAD(P)也解除了(-羟基丁酸脱氢酶所催化的(-羟基丁酸裂解反应的抑制作用，因此胞内PHB的降解反应能进行。从图中的细胞干重和溶氧百分比浓度的变化曲线还可以看出，由于胞内部分PHB的降解，细胞干重略有所下降，溶氧百分比浓度升高，表明细胞对氧的需求量比生长阶段有所下降。 第45 h恢复葡萄糖的供应后，细胞又开始生长，残留菌体的比生长速率上升，细胞干重和残留菌体量迅速增加。PHB生成比速大于零，PHB浓度和PHB含量开始增加，表明在恢复葡萄糖供应的情况下，细胞又开始积累PHB，但其生成比速在突然增大后又逐渐下降。从图中可以看出，恢复葡萄糖供应后，最终PHB含量能恢复到葡萄糖缺乏前的水平，但由于培养基中的铵离子始终在生长限制浓度以上，因而PHB浓度和胞内含量均在很低的水平。 



图8-5-2 葡萄糖限制、缺乏和恢复葡萄糖缺乏过程中细胞干重、RB、PHB浓度、PHB含量、溶氧浓度、葡萄糖浓度、(RB和(PHB随时间的变化情况 方法∶初始葡萄糖浓度2 %、硫酸铵0.2 %。培养过程中硫酸铵浓度控制在细胞平衡生长范围内，第18 h葡萄糖浓度成为生长限制性基质后，开始限量流加葡萄糖(浓度50 %)，控制流速为3 g/(L(h)，维持葡萄糖浓度在生长限制水平，第32 h停止葡萄糖的流加，使细胞生长处于葡萄糖缺乏状态，第45 h时一次性补糖 2%。用3 mol/L NaOH和3 mol/L H2SO4控制pH为7.0。 可见，当葡萄糖的供应受限制时，细胞能通过内部调节的方式控制葡萄糖在细胞物质的生物合成、能量产生和PHB合成三个部分中的合理分配；而当葡萄糖缺乏时，细胞可能选择代谢胞内的PHB聚合物以满足生物合成和/或能量产生的目的。 培养过程中葡萄糖浓度变化与氮源浓度变化对细胞的代谢过程所产生的影响不同。由于葡萄糖在R. eutrophus的代谢过程中可作为细胞物质、能源和PHB碳架合成的来源，因而培养过程中葡萄糖浓度的变化将会直接影响糖酵解过程、细胞物质的合成和PHB的形成过程，并通过对这些途径的作用间接影响其它代谢途径。 四、限氧和恢复氧供应对生长和PHB合成的影响 多种细胞的生命活动过程需要氧的参与，氧在细胞的生物合成过程中起着十分重要的作用。有关研究报道，有些细菌如Azotobacter beijerinchii在氧供应缺乏的条件下能在胞内大量积累PHB。R. eutrophus分批培养的研究结果表明，在生长前期，氧供应的限制会使细胞生长缓慢，延滞期加长；在氮源缺乏的PHB合成期同时限制氧的供应，将会使细胞的PHB合成能力大大下降。为了进一步了解氧的控制对细胞代谢过程的影响，更好地控制PHB的流加发酵过程，研究了氧的限制和恢复氧供应过程对R. eutrophus菌体生长和PHB合成的影响。 图8-5-3为限氧和恢复氧正常供应对生长和PHB合成中各参数的影响。可以看出，当细胞处于溶氧限制状态时，(RB在2 h内从0.15 h-1下降至0.03 h-1，表明细胞生长在限氧条件下受到严重限制。(PHB则迅速增加，其值在2 h内从0.022 h-1增至0.058 h-1，表明与细胞的限氮情况相似，处于限氧条件下细胞也会在其胞内大量积累PHB。从代谢途径的分析可以看出，当细胞的供氧受到限制时，其呼吸活性降低，胞内NAD(P)H浓度增加，抑制了TCA循环中异柠檬酸脱氢酶的活性，导致TCA循环活性下降，对乙酰辅酶A的消耗减少。另外，由于细胞呼吸作用下降，胞内ATP浓度下降，AMP浓度升高，活化了丙酮酸激酶的活性，将导致PEP水平的降低，可以解除其对G6PDH的抑制作用，糖酵解途径活性增加，使乙酰辅酶A/辅酶ASH的比例增加，部分解除了辅酶ASH对(-酮基硫解酶的抑制作用，有利于PHB的合成。限氧初期胞内PHB含量和PHB浓度迅速增加，至第40 h 时PHB含量增至45.3 %，随后其增加趋势趋于平缓，而细胞在氮源限制和缺乏情况下胞内PHB含量可达到80 %的水平。若细胞处于氧完全缺乏的条件下，菌体会大量自溶，也不能积累PHB。可能表明氧限制条件也可以激发R. eutrophus合成PHB，但胞内PHB的积累量难以达到象细胞处于氮源限制和缺乏下的水平。由于胞内PHB的积累，此阶段细胞干重不断增加。 当培养过程在第40 h 解除供氧限制后，从图中可以看出，(RB迅速增加，但其所达到的最大值(0.074 h-1)远小于氧限制以前的生长水平，可能是长时间的限氧过程损害了细胞的活性，或是由于胞内PHB大颗粒的存在从生理上妨碍了细胞的生长和分裂。(PHB降为负值，表明细胞处于平衡生长条件下，胞内所积累的PHB部分开始降解，PHB浓度和PHB含量减少。由于细胞的生长，使细胞干重和RB不断增加。至第60 h时，胞内PHB含量降为20.5 %。James在R. eutrophus的培养过程中发现，处于一定条件下的细胞其胞内的PHB含量为一确定值，因而胞内的PHB含量也是细胞所处的环境状态的一种指示，当细胞所处的环境条件改变时，其生理状态也会发生相应的变化。作者在连续培养过程中亦发现，细胞在一定的比生长速率下，其胞内PHB含量为一定值。 



图8-5-3 溶解氧的限制和恢复溶氧限制过程中细胞干重、RB、PHB浓度、PHB含量、溶氧浓度、(RB和(PHB随时间的变化情况 方法∶培养过程中初糖浓度为2 %，初始硫酸铵浓度为0.2 %，发酵第12 h后开始连续流加葡萄糖和硫酸铵使两者的浓度维持在平衡生长条件下；发酵第20 h，将搅拌转速由800 r/min降至600 r/min，通气速率不变，溶氧百分比浓度为0-5 %(处于临界百分溶氧以下)，使细胞的生长处于溶氧限制状态；发酵第40 h，将搅拌转速增至800 r/min，解除溶氧的限制作用。 通过上述对氮源、碳源和氧控制过程的研究，可以看出：(1) 对氮源的控制作用将直接作用于细胞物质的合成过程，从而再间接地影响其它代谢途径，氮源的限制和缺乏可刺激细胞大量积累PHB；(2) 对碳源的控制作用能直接影响细胞的糖酵解过程、细胞物质的生物合成和PHB的形成过程，并通过对这些途径的作用间接影响其它代谢途径；(3) 氧的限制也可刺激R. eutrophus积累PHB，但胞内PHB的积累量远小于氮源限制下的情况。当培养过程由PHB积累状态转向细胞平衡生长条件时，会引起胞内所积累的PHB的降解，胞内高含量的PHB会抑制细胞的生长繁殖。 五、培养过程中的不同停氮时间对PHB形成的影响 真养产碱杆菌培养过程中氮或氧的缺乏会刺激细胞积累PHB。当培养基中磷或镁缺乏时，细胞也会积累PHB，但通常选择氮源缺乏作为刺激细胞积累PHB的手段，这是因为：(1)微生物的生长对氮源的要求比对其它元素更强，且细胞对氮源的吸收比对其它元素更快，因而更易创造培养过程中的氮源缺乏的条件；(2)当氮源的流加和矿物元素的流加同时停止时，铵离子可被迅速消耗而其它元素下降很少，因而，铵离子的流加停止后，能更快地刺激细胞积累PHB，这一点从前面实验中已可以看出。 为研究在不同的细胞生长期停止氮源供给对PHB合成的影响，在发酵分别进行至第15 h、23 h、26 h和32 h时，停止氨水的流加，此时细胞干重分别达到15.1 g/L、20.6 g/L、29.3 g/L和39.6 g/L，培养过程中各种参数的变化结果见图8-5-4和8-5-5。从图中可以看出，在不同的生长阶段停止流加氨水，发酵液中铵离子浓度分别为0.53 g/L、0.69 g/L、0.91 g/L 和1.37 g/L。当停氨水时间控制在第20 h、23 h、26 h时，培养基中的铵离子很快被细胞消耗，当铵离子浓度基本接近为零时，残留菌体的生长停止，细胞开始大量积累PHB，PHB含量和PHB浓度的增加很快，最终PHB含量分别达到80.7 %、81.1 %和80.5 %，PHB浓度分别达到32 g/L、46.2 g/L和49.0 g/L；而当停加氨水时间控制较迟时，培养基中的铵离子消耗较慢，PHB含量和PHB浓度的增加较慢，最终PHB含量和PHB浓度分别达48.9 %和29.9 g/L；在四种情况下，细胞干重分别达到39.6 g/L、57.0 g/L、61.9 g/L和61.3 g/L。 从上述结果可以看出，如在细胞生长早期即停止流加氨水，尽管最终的PHB含量很高，但由于停氨水时的残留菌体量相对较少，因而最终所获得的细胞干重和PHB浓度将受到影响。如果在细胞生长的后期才停止氨水流加，尽管此时的残留菌体量很高，但由于停氨后培养基中残留的铵离子浓度较高及生长后期细胞积累PHB的活力降低，最终PHB含量和PHB浓度很低。残留菌体浓度达到20 g/L至30 g/L时，停止流加氨水可获得较高的PHB含量和PHB浓度。
图8-5-4 在不同生长阶段停加氨水的情况下，细胞干重和PHB浓度随时间的变化 ○ 细胞干重；◇ PHB浓度
图8-5-5 不同生长阶段停加氨水时, PHB含量、铵离子浓度和残留菌体量随时间的变化
方法∶初糖2 %、初硫酸铵0.2 %，以28 %的氨水作为调节pH值和菌体生长阶段中间补氮的手段，pH控制7.0，发酵温度30 ℃。中间补加50 %的葡萄糖溶液，控制适宜的流速，维持葡萄糖浓度在1 %左右，停止氨水流加后，以3 mol/L NaOH代替氨水调节pH值。在PHB合成期进行限氮流加的试验中，停止氨水流加后，采用不同硫酸铵流速进行氮源的流加。 图8-5-6为停止氨水流加后，PHB的生成比速随时间的变化关系。可以看出，由于停加氨水后，培养基中铵离子被很快消耗，导致PHB的生成比速迅速增加，并很快上升至最大值。不同的停氨水时间所达到的PHB最大生成比速不同，在四种情况下，所达到的PHB最大生成比速分别为0.18 h-1，0.195 h-1，0.20 h-1和0.076 h-1。PHB生成比速达到最大值后，又迅速下降，表明随着发酵的进行，菌体合成PHB的能力会不断下降。Sonnleitner等在以H2、O2和CO2为基质培养R. eutrophus 过程中发现，当培养基中铵离子浓度低于检测限时，PHB的生成速率达到最大值，并随着发酵的继续进行很快下降至零。
图8-5-6 不同停加氨水时间下，PHB生成比速随时间的变化 停止流加氨水时间∶○ 20 h; ◇ 23 h; □ 26 h; △ 32 h 六、PHB合成期不同的氮源流加速率对PHB合成的影响 (一)PHB生成比速和铵离子浓度随时间的变化关系 图8-5-7为26 h停加氨水时的PHB生成比速和铵离子浓度随时间的变化关系。从图中可以看出，在菌体生长的最初阶段，PHB生成比速随氮源浓度的下降而增大，随着氨水的加入，培养基中的铵离子浓度迅速增加，导致PHB的合成比速逐渐下降，停加氨水后，培养基中的铵离子浓度消耗很快，停加氨水后2 h，培养基中的铵离子浓度下降至细胞生长限制浓度以下(铵离子浓度小于0.14 g/L)，与此同时，PHB生成比速迅速增加，当铵离子浓度接近为零时，PHB的生成比速上升至最大值，随后很快地呈线性下降，这可能是随着时间的进行，由于培养基中氮源的完全缺乏，菌体活力下降，细胞中有关PHB合成的酶不断失活，使得细胞合成PHB的能力下降。据此，作者推测，如果能在停止氨水流加后，限量地补加氮源，使得有关PHB的合成酶能较长时间地保持高活性，以延缓PHB生成比速下降的速率，可望缩短达到较高胞内PHB含量所需的时间，提高PHB的生产强度。
图8-5-7 26 h停止流加氨水时，PHB生成比速和铵离子浓度随时间的变化关系 (二)PHB合成期不同的硫酸铵流加速率对PHB形成的影响 从前面的研究结果可知，在PHB合成阶段，如果培养基中的氮源完全缺乏，PHB合成比速达到最大值后会迅速下降，而限氮流加则可减缓PHB合成比速下降的速率。为了研究PHB合成过程中控制不同氮源流速对PHB发酵的影响，在停止氨水流加后的PHB合成阶段，采用一系列不同的硫酸铵流加速率进行限氮流加试验，结果见图8-5-8和8-5-9。可以看出，当硫酸铵的流加速率分别为0 g/h、0.25 g/h、0.50 g/h、0.75 g/h、1.0 g/h和1.25 g/h时，最终的细胞干重可分别达到58.5 g/L、62.5 g/L、66.1 g/L、68.6 g/L、66.3 g/L和67.1 g/L，可见在硫酸铵的流加速率为0.75 g/h时可得到最大细胞干重；PHB含量则可分别达到79.3 %、78.1 %、75.0 %、72.6 %、67.1 %和55.2 %，PHB含量随硫酸铵流加速率的增加而减小，可见在PHB积累阶段所流加的硫酸铵的量越小，最终菌体中PHB的含量就越高；PHB浓度分别可达到46.4 g/L、48.8 g/L、49.2 g/L、49.8 g/L、44.5 g/L和36.9 g/L，当硫酸铵的流加速率分别为0.25 g/h、0.50 g/h和0.75 g/h时，所获得PHB浓度相差无几。 .

图8-5-8 停止流加氨水后，不同的硫酸铵流加速率对细胞干重和PHB含量的影响. 硫酸铵流加速率分别为(g/h)∶○ 0；◇ 0.25；□ 0.5；△ 0.75；
1.0；● 1.25
图8-5-9 不同硫酸铵流加速率对PHB浓度的影响. 硫酸铵流加速率分别为(g/h)∶○ 0；◇ 0.25；□ 0.5；△ 0.75；
1.0；● 1.25 图8-5-10为不同硫酸铵流加速率下铵离子浓度的变化。从图中可以看出，当硫酸铵的流加速率很小时，在整个PHB积累阶段，铵离子浓度几乎接近为零，随着硫酸铵流加速率的增加，发酵液中的铵离子浓度也逐渐增大。当硫酸铵的流加速率高于1.0 g/h时，发酵液中铵离子的积累很明显，导致最终PHB含量较低。
图8-5-10 停加氨水后，不同硫酸铵流加速率下铵离子浓度的变化关系 硫酸铵流加速率分别为(g/h)∶○ 0；◇ 0.25；□ 0.5；△ 0.75；
1.0；● 1.25 (三)PHB生成比速与硫酸铵流加速率的关系 停止流加氨水后，不同硫酸铵的流加速率对PHB合成比速的影响如图8-5-11所示。停止流加氨水后，PHB的生成比速在4 h左右即达到最大值，硫酸铵的流加速率不同，PHB生成比速所达到的最大值也不相同，硫酸铵的流加速率越小，(PHB的最大值越大，其值分别为0.2 h-1、0.176 h-1、0.15 h-1、0.144 h-1、0.12 h-1和0.084 h-1；(PHB达到最大值后，呈线性下降趋势，且下降的快慢程度与硫酸铵的流加速率有关，其流加速率越大，(PHB下降的速率越慢。由此可见，当硫酸铵的流加速率较小时，尽管可以得到较大的(PHB值，但其随后的下降速度很快；当硫酸铵的流加速率较大时，尽管(PHB下降速度较慢，但(PHB所能达到的最大值却相对较小；另外，从图中还可以看出，当硫酸铵的流加速率为1.0 g/h和1.25 g/h时，由于发酵液中铵离子的逐渐积累，使(PHB在PHB的合成后期下降较快。因此，在PHB合成前期采用较大的硫酸铵流速有利于胞内PHB的快速积累，而在中后期应降低硫酸铵的流加速率，防止培养液铵离子的积累，以提高最终细胞内的PHB含量。
图8-5-11 不同的硫酸铵流加速率对PHB生成比速的影响. 硫酸铵流加速率分别为(g/h)∶○ 0；◇ 0.25；□ 0.5；△ 0.75；
1.0；● 1.25 由此可见，在PHB积累阶段，控制适宜的硫酸铵流加速率非常重要，并且在停加氨水后至(PHB达到最大值期间，硫酸铵的流加速率应为零，这样可获得最大的(PHB，随后应控制某一恰当的硫酸铵流加速率，使(PHB缓慢下降，这样就有可能在同样的时间内获得较高的PHB含量、PHB浓度和PHB生产强度。 从图8-5-10中可以看出，尽管PHB合成阶段硫酸铵的流加速率不同，但μPHB达到最大值后均呈线性下降趋势，因而可以用式(8-5-1)来表示其变化： (PHB=((PHB)max - kd·t (8-5-1) 式中∶kd为PHB降解比速 (h-1)，即在不同硫酸铵流加速率下，(PHB从最大值处下降的斜率；t为(PHB达到最大值后所计的发酵时间 (h)。 由于在不同的硫酸铵流加速率下，PHB的降解比速kd不同，由此可以得出kd随硫酸铵流加速率(FN)变化的关系，见图8-5-12，从图中可见，PHB降解比速kd 随硫酸铵流加速率的增加而下降，表明在PHB合成期，以一定速率进行氮源的限量流加，能有效地维持PHB合成酶的活性。 kd 与FN之间的关系可以用(8-5-2)式来表示：
(8-5-2)
图8-5-12 不同硫酸铵流加速率与PHB降解比速的关系 (四)PHB生成比速和最终胞内PHB含量的关系 图8-5-13为不同硫酸铵流加速率下PHB合成比速与PHB含量的关系图。从图中可看出，停止流加氨水后，细胞很快进入PHB合成期，PHB形成比速迅速达到最大值后又不断下降，随着PHB合成比速的下降，R. eutrophus培养过程中，胞内PHB含量与培养条件有密切的关系。Sonnleitner在化能自养条件下培养R. eutrophus的研究中发现，一定培养条件下，胞内PHB含量最终所能达到的一定值； Suzuki在以甲醇为碳源培养Pseudomonas sp.合成PHB的过程中也证明，在PHB合成阶段流加一定比例的碳氮源混合液，最终胞内的PHB含量为一定值。
图8-5-13 不同的硫酸铵流加速率下PHB合成比速与PHB含量的关系 硫酸铵流加速率分别为(g/h)∶○ 0；◇ 0.25；□ 0.5；△ 0.75；
1.0；● 1.25 图8-5-13显示，胞内最终PHB含量与硫酸铵流加速率有关，硫酸铵的流加速率越小，最终PHB含量越高，反之，PHB含量越低。将PHB含量与不同的硫酸铵流加速率作图，得图8-5-14。
图8-5-14 PHB含量与硫酸铵流加速率之间的关系 从图中可以看出，两者呈线性相关性，以式(8-5-3)来表示： CP=81-15.84·FN (8-5-3) 式(8-5-3)中CP为PHB含量(%)，FN为停加氨水后硫酸铵的流加速率(g/h)。 (五)不同硫酸铵流加速率对PHB生产强度和产率系数的影响 图8-5-15为停止加氨水后，不同的硫酸铵流加速率与最终PHB生产强度和PHB对葡萄糖的产率系数之间的关系。从图8-5-15中可以看出，在PHB积累阶段，当硫酸铵的流加速率分别为0 g/h、0.25 g/h、0.50 g/h、0.75 g/h、1.0 g/h和1.25 g/h时，PHB的生产强度分别可达到0.71 g/(L(h)、0.75 g/(L(h)、0.82 g/(L(h)、0.83 g/(L(h)、0.80 g/(L(h)和0.67 g/(L(h)。PHB的生产强度随硫酸铵流加速率的增加而增加，在其流加率速为0.75 g/h时，可获得最大的PHB生产强度，随后又随着其流加速率的增加而减小。
图8-5-15 不同的硫酸铵流加速率与PHB生产强度和PHB对葡萄糖产率系数的影响 在PHB积累阶段，当硫酸铵的流加速率分别为0 g/h、0.25 g/h、0.50 g/h、0.75 g/h、1.0 g/h和1.25 g/h时，所获得的PHB对葡萄糖的产率系数分别为0.33 g/g 、0.35 g/g、0.37 g/g、0.36 g/g、0.32 g/g 和0.28 g/g。当硫酸铵流加速率较小时，PHB对葡萄糖的产率系数随其流加速率的增加而增加，在硫酸铵流加速率为0.50 g/h时产率系数达到最大值，随后又随着其流加速率的增加而下降。 从上述分析可以看出，在PHB合成过程中，控制适宜的氮源流加速率相当重要。一方面，为了有效地使细胞积累PHB，必须采用较高的硫酸铵流加速率，使kd值降低，以便长时间地保持较高的PHB合成比速，缩短PHB合成阶段所需的时间，提高PHB的生产强度；另一方面，为了得到较高的PHB含量，提高PHB浓度，硫酸铵的流加速率又必须设置在较小的值。因而，在PHB合成期，硫酸铵的流加速率须随时间而不断变化∶在PHB合成初期，为保证获得较高的PHB合成比速，应采用较大的硫酸铵流加速率，而在PHB合成阶段的中后期，为了获得较高的胞内PHB含量，应采用较小的硫酸铵流加速率，这样才能在最短的时间内得到最大的PHB浓度。 第六节 聚羟基丁酸双底物流加发酵准优化控制策略 一、引言 有关非反馈控制操作的最优化，早期主要是以经验为基础的，自从Yoshida于1973年建立了第一个数学模型，开始出现严格的数学方法。流加发酵最优化的核心问题是找出最佳的底物流加方式，以维持发酵过程始终处于最佳状态，其主要研究内容包括状态方程的建立、目标函数的确定和最优化底物流加方式的求解。随着对微生物发酵过程机制和动力学研究的不断深入，不少学者进行了这方面的研究。1974年，Fishman在青霉素补料分批发酵中，以产物浓度为目的函数，研究了葡萄糖流加的最优化方法，运用庞特里金连续最大原理，得到一个包含流加速率连续增加阶段在内的最优操作曲线。1976年，Ohno在赖氨酸的补料分批发酵中，以产率为目的函数，研究了流加速率的优化问题。Yamane等从实用的观点出发，将理论模式加以简化，也同样简化了运用连续最大原理的计算程序，以产量作为目的函数，以生长速率代替流加速率作为控制变量，获得了比生长速率的最优曲线，间接地得到了流加的最优曲线。在最优化理论方面，Lim等人对各种形式的补料分批培养的总的特点作了概括，认为最优化的补料程序依赖于比生长曲线形态、产物生成速率及发酵的初始条件等。通过四个参量，即生物量、营养物、产物及体积的平衡方程式，得出了一个最通用的最佳控制程序，其中包括一个最大速率补料培养阶段、一个最低速率补料培养阶段(分批培养阶段)、一个独特的所谓"单一控制"补料速率阶段和一个短时间的分批培养阶段。对于某一系列特定的初始条件来说，其最优控制过程可以缺少其中某个环节。在确定了最优化控制的方案后，只要确定不同阶段的转换时间就可以把最优化问题解决了。 最优化流加方式的求解是流加发酵优化研究中的一个关键问题。从文献报道来看，被应用于流加发酵最优化求解的理论主要有：格林原理和庞特里金的最小值(最大值)原理等。其中最小值原理是最优化控制理论中寻求最佳控制的一个最基本的数学理论方法，同其它寻求最佳控制的理论和方法相比，最小值原理有更为完整和具体的算法，它将问题归结为常微分方程组使求解更为方便。 流加发酵最优化的研究不但有助于提高发酵水平，而且为应用计算机实现发酵过程的最优化自动控制提供了潜力，体现了现代发酵技术的研究趋势。相信随着计算机、传感器等的发展和应用，将有可能用离线方式计算或模拟复杂的数学模型，用在线方式实现最优化控制。流加发酵最优化控制的实现必须以发酵过程的数学模型为基础，但在实际的运用中，由于计算手段和工具的限制，直接采用数学模型进行计算会使计算量非常大。因此，在本节中，我们根据PHB发酵过程中菌体生长和产物合成的不同特点，采用物料衡算方程来代替复杂的数学模型，对基质流加优化过程的计算进行了简化处理，将由此而得到的基质流加策略称为准优化控制策略。 二、PHB流加发酵过程的准优化控制研究 在PHB的发酵生产过程中，PHB的生产强度与其生产成本有密切的关系，提高PHB的生产强度就可以达到降低PHB生产成本的目的。对于PHB的发酵生产，PHB生产强度的提高可以通过下列方式来获得：(1)最大的细胞量；(2)最高的胞内PHB含量；(3)最短的发酵时间。故发酵过程PHB的生产强度(PPHB)可用式(8-6-1)来表示：
(8-6-1) 式中tg和(P)g分别表示细胞生长阶段的时间和所合成的PHB量，tP和(P)P分别为PHB合成阶段所需的时间和合成的PHB量，tf为总发酵时间。在菌体生长阶段，由于胞内PHB含量很低，(P)g很小，对总的PHB生产强度的影响很小，因而此阶段主要可通过缩短菌体生长阶段所需的时间tg来实现PHB生产强度的提高；而在PHB合成阶段，胞内PHB大量积累，此阶段PHB生产强度的提高可通过提高(P)P和缩短tP来实现。 由于在PHB发酵生产所需的基质中，碳源是PHB生产中最显著的原材料成本，因而在PHB的流加发酵过程中还必须考虑PHB对碳源的产率系数。对PHB发酵过程控制水平的高低，会直接影响PHB对葡萄糖的产率系数。从第二节中可以看出，产物PHB对葡萄糖的产率系数与YXR/C和最终胞内的PHB含量呈正比关系，因而提高菌体生长阶段的YXR/C和PHB含量，就可提高PHB对葡萄糖的产率系数；另外，从细胞生长的连续培养动力学研究中可以知道，在一定的稀释率范围内(0.05 h-1至0.21 h-1)，残留菌体对葡萄糖的产率系数(YXR/C)随菌体比生长速率的增加而增加，故在菌体生长阶段，可通过适当的流加方式，控制菌体的比生长速率，获得较高的YXR/C，以提高最终PHB对葡萄糖的产率系数。 在PHB的流加发酵中，由于菌体生长和产物PHB形成所需的条件不同，可根据菌体生长阶段和PHB合成阶段各自不同的特点来选择适宜的基质流加方式，实现以提高PHB对葡萄糖产率系数和PHB的生产强度为目标的PHB发酵过程的准优化控制。 (一)菌体生长阶段的准优化研究 从第五节可知，在碳源较丰富的细胞繁殖阶段，即使在氮源浓度较高的情况下，伴随着菌体的生长，细胞胞内积累的PHB含量也会达到20 %左右。PHB的积累会抑制细胞的繁殖，降低菌体的比生长速率，从而延长了达到一定菌体浓度所需的时间，导致PHB生产强度下降，又由于碳源供应受到限制，因此胞内所积累的PHB量很少。基于此，在前期的细胞生长阶段，可采用指数速率流加方式进行葡萄糖的流加控制，保持发酵液中葡萄糖的浓度在某一很低的水平，在此条件下，胞内PHB的积累量很少，可使所消耗的葡萄糖基本都用于菌体的生长，这样可在较短的时间内获得较高的菌体浓度，并且在指数速率流加法中，可将细胞的生长速率设定在能使YXR/C取得较大值的范围内，获得较高的YXR/C。 在菌体生长阶段采用指数速率流加法有以下五点假设： (1) 发酵罐内为理想混合； (2) 葡萄糖为唯一限制性碳源； (3) 生长平衡； (4) 残留菌体对葡萄糖的产率系数为常数； (5) 菌体生长遵循Monod方程； 对底物葡萄糖进行衡算，则：
(8-6-2) F1为体积流加速率(L/h)，sf为流加液中基质浓度(g/L)，YxR/c为残留菌体对葡萄糖的产率系数(g/g)，m为细胞比维持系数(g/g/h)，xR为残留菌体浓度(g/L)，V1为培养体积(L)，μ为菌体比生长速率(h-1)。 对菌体量的变化进行物料衡算，则：
(8-6-3) 假定(为常数，则式(8-6-3)积分可得：
(8-6-4) 其中∶tF为开始指数速率流加的时间，t≥tF，xR(tF)和VtF分别为tF时刻的残留菌体浓度和发酵液的体积。 由式(8-6-2)可得：
(8-6-5) 由于生长符合Monod方程(
)，(是s1的函数，要使μ恒定，s1必须恒定，则有：
，又因为
由式(8-6-5)得：
(8-6-6) 将式(8-6-4)代入(8-6-6)中得:
(8-6-7) 通常由于sf》s1，所以
(8-6-8) 则tF至t的时间间隔内所加入的葡萄糖液体积为：
(8-6-9) 在实际发酵过程中，为简化数据处理，考虑取样及排气的体积消耗与调节pH值所加入的液体体积量相当，则t时刻发酵液体积的静增量为Va1，由此可得此时的残留菌体浓度xR为：
(8-6-10) 取初糖浓度为1 %，初始硫酸铵浓度为0.3 %，以28 %(v/v)的氨水溶液来调节pH值，发酵第10 h(即tF为10 h)，残糖浓度降至0.1 %以下，开始以指数速率方式流加50 %的糖液，此时的细胞干重可通过测定发酵液的光密度值来确定，得细胞干重为8.73 g/L；根据前面分批培养的结果，此时细胞的PHB含量为10 %左右，则残留菌体浓度为7.86 g/L，发酵液体积为1.1 L，参照第三节中菌体连续培养动力学的数据，取(为0.15 h-1，YXR/C为0.50 g/g，m为0.059 g/g/h，则指数速率流加起始时的流加速率F1(10)为5.3 mL/h。 由第五节中不同停氨水时间的研究结果可知，当细胞干重达到25 g/L左右时，停止氨水流加最有利于后续阶段细胞中PHB的积累。取几个不同的时间点分别代入式(8-6-8)，(8-6-9)和(8-6-10)中计算，可得到发酵时间为18 h时，F1(18)为17.6 mL/h，加入的葡萄糖体积Val为80 mL，xR为24.35 g/L，此时细胞的PHB含量为9 %左右，则细胞干重为26.76 g/L，因而菌体生长阶段的葡萄糖指数速率流加应在第18 h停止较为适宜。另外，从Monod方程中还可以计算出指数速率流加阶段的葡萄糖浓度s1为0.32 g/L。从第五节中的研究结果可知，停止氨水流加后2 h左右，发酵液中的残留铵离子浓度可降至菌体生长限制浓度以下，随后细胞进入PHB大量合成阶段，因此，停止氨水流加的时间应设定在葡萄糖的指数速率流加结束前两小时，即在发酵第16 h时就应该停止氨水的流加，而改用NaOH来调节pH值。 发酵第18 h是细胞由氮源丰富的生长阶段转入氮源缺乏的PHB积累阶段转折期，该转折期很短。Sonnleitner等在研究R. eutrophus合成PHB的过程中发现，在菌体的对数生长期和PHB合成期之间存在一极短的转折期，该转折期与培养基中的氮源缺乏同时发生，仅持续不到一个世代的时间，此时残留菌体和蛋白质合成速率降为零，而PHB合成比速迅速增加。由于发酵过程中缺乏直接测量铵离子浓度和胞内PHB水平的手段，尽管每间隔20 min进行取样测定，但仍没有能得到足够的数据来详细描述这一转折期。 (二)PHB合成阶段的准优化研究 细胞只有在碳源过量而氮源缺乏的条件下才能在胞内大量积累PHB。由于在细胞生长阶段所采用的指数速率流加方式中，葡萄糖作为菌体生长的限制性基质，其浓度很低，而葡萄糖在作为PHB合成的碳源时，其浓度必须过量才有利于胞内PHB的大量积累。Doi和Alistair的研究结果表明，PHB的分子量与碳源浓度有关，PHB合成阶段的碳源浓度越高，所合成的PHB的分子量越小。因而，为了得到具有较高分子量的PHB，即质量较好的PHB，葡萄糖浓度又不能控制得太高。可见，在PHB的合成阶段，控制适当的葡萄糖浓度相当重要。从前面的研究结果可知，在PHB合成阶段，氮源的完全缺乏并不能使细胞最有效地积累PHB，因而必须进行氮源的限量流加，而且氮源硫酸铵的流加速率还必须随时间而变化。迄今为止有关PHB发酵生产的研究报道中，还没有学者对PHB合成期碳氮源的流加策略进行详细的研究，特别是对于氮源，其流加主要凭经验进行，或根本不流加，因而不可能同时得到很高的PHB产量、胞内PHB含量和PHB生产强度。为了获得较好的PHB发酵结果，须对PHB的合成期葡萄糖和硫酸铵的流加方式实行优化控制。 1、流加发酵系统的优化问题 在流加发酵中，基质不断地流入了发酵罐而没有发酵液流出，流加发酵的优化问题就是确定最佳的基质流加速率。发酵过程物料平衡的微分方程为：
(8-6-11)
(8-6-12)
(8-6-13)
(8-6-14) 上式中x，s和p分别代表菌体，基质和产物PHB的浓度，F表示基质流加速率，μ，σ和π分别为菌体比生长速率、基质比消耗速率和PHB合成比速。对于最终发酵液体积和基质流加速率的限制条件为： V(tf)=Vf (8-6-15) 0=Fmin≤F(t)≤Fmax (8-6-16) 流加发酵优化的目标就是要确定F(t)的最优流加方式，使得依赖于最终发酵结果的目标函数I[F]=g(xf,pf,sf,Vf,tf)取得最小值，式中下标f用来发酵终点时的各参数值，tf可以是一个定值，也可以是一个不确定的值。将总的菌体量，基质量和产物量分别表示为X，S和P，则有：X=xV，S=sV，P=pV，此处可以引入另外一个状态变量x5来表示发酵时间。则状态变量可表示为：x1=X，x2=S，x3=P，x4=V和x5=t。根据这些状态变量，式(8-6-11)至(8-6-14)可被写成：

(8-6-17) 或
(8-6-18)
(8-6-19) 和
(8-6-20) 由此可见，所优化的系统采用式(8-6-18)和(8-6-19)表示，其限制条件为(8-5-15)和(8-5-16)，最优化问题就是确定控制变量F(t)，使式(8-6-20)给出的目标函数取得最小值。 2、流加发酵优化控制的求解 流加发酵优化系统中控制变量F(t)的确定是一个标准的变量问题，采用最小值原理使哈密顿函数达到最小值：
(8-6-21) 式中协变向量，λ(t)，必须满足下列条件：
(8-6-22) 特定的终点条件由下式给出：
(8-6-23) 沿着最佳轨迹，哈密顿函数恒取常数，将此常数值命名为H*。 式(8-5-21)哈密顿函数可被重写为：
(8-6-24) 从式(8-6-24)中可以看出，最优控制F与哈密顿函数呈线性关系，使哈密顿函数取得最小值的最优控制F可通过判别
的符号来确定：即如果
小于零，F取最大值；
大于零，F取最小值；但在时间间隔(tj, tj+1)上
为零时，最小值原理没有显示F取何值，这一阶段称为单一控制阶段，最佳流加速率称为单一流速Fs，因而流加发酵的最优控制可用下式来表示：
(8-6-25) 从上面的分析我们可以得出流加发酵系统最优控制F的具体表达式，即最优控制F包含Fmax、Fs和Fmin三种方式。因而只要知道: (1)FS的表达式；(2) Fmax、Fs和Fmin三种方式在流加发酵过程中的排列顺序；(3) 各种流加方式在发酵过程中被分配的时间，就可以根据发酵过程所要达到的目标函数I[F]和相应的边界条件，求出最优控制F。 Modak等给出了流加发酵过程中具体发酵条件下的目标函数I[F]和相应的边界条件，见表8-6-1。 表8-6-1 流加发酵中的各种目标函数和相应的边界条件 1 最大化发酵终点产值 (由菌体和产物所组成) 1) 终点时间未知 2) 终点时间已知 g=-((Xf+(Pf) tf未知 tf已知 (1(tf)=-( (2(tf)=0 (3(tf)=-( (5=0，H*=0 (5=0 H*=-(((X+((PHBX) f 未知  2 最大化生产强度 终点时间未知 g=-Pf/tf tf未知 (1(tf)=0，(2(tf)=0 (3(tf)=-1/tf (未知) (5(tf)=Pf/tf2(未知)，H*=0  3 对于一定的产物浓度， 要求发酵时间最短 g=tf Pf已知 (1(tf)=0，(2(tf)=0 (3(tf) 未知，(5(tf)=1，H*=0  4 最大化包括菌体、产物 和过程消耗在内的产值 g=-((Xf+(Pf-(tf) tf未知 (1(tf)=-(，(2(tf)=0， (3(tf)=-(，(5(tf)= ( (未知) H*=0   由上述可知，在单一控制阶段有：
(8-6-26) 由于在单一控制阶段，
与t无关，且恒等于零，所以在单一控制阶段
对时间t的任意阶导数均为零，则有：
(8-6-27)
代表
的k次微分。可以用式(8-6-27)来确定单一控制阶段的流加速率Fs的表达式，具体方法就是不断对
求t的微分，直至表达式中显含F。
(8-6-28) 式(8-6-28)中还没有显含F，有必要对式(8-6-28)继续作时间t的微分，有：
(8-6-29) 从式(8-6-29)中可以得到单一控制阶段的流加速率为：
(8-6-30) 由于在单一控制阶段，满足
=0和
=0，并且哈密顿函数为常数，所以，在最优控制阶段，可以得出代表包括五个协变向量和H*在内的三个线性关系式：
(8-6-31) 而H*与终点的状态变量有关：
(8-6-32) 式(8-6-32)中的(f由式(8-6-23)给出。 单一控制阶段的一个附加条件为：
(8-6-33) 在上述所给出的一系列条件的基础上可进行最优控制问题的求解了，式(8-6-24)哈密顿函数中有：
(8-6-34) 和
(8-6-35) 从式(8-6-22)求解λ，可得：
(8-6-36)
(8-6-37)
(8-6-38)
(8-6-39)
(8-6-40) 由式(8-6-34)和(8-6-36)可得：
(8-6-41) 由式(8-6-31)中
代入6-41可得：
(8-6-42) 式(8-6-31)可写为：
(8-6-43)
(8-6-44)
(8-6-45) 将式(8-6-45)分别代入式(8-6-37)和(8-6-39)得：
(8-6-46) 在式(8-6-34)至(8-6-46)所给出条件的基础上，式(8-6-29)可变化为：
(8-6-47) 则由式(8-6-47)可得：
(8-6-48) 式(8-6-48)中s表示单一控制阶段的基质浓度，上标 ' 代表对s的一阶微分，上标 '' 表示对s的二阶微分。 在PHB合成阶段，由于氮源限制或缺乏，因而残留菌体的比生长速率为零，即(=0，则('＝0，所以在单一控制阶段
＝0，即在单一控制阶段，当基质葡萄糖的流加速率为Fs时，发酵液中的葡萄糖浓度维持恒定。 由式(8-6-12)可得：
(8-6-49) 则单一控制阶段的流加速率Fs为：
(8-6-50) 在知道了Fs的表达式后，只要确定Fmax、Fs和Fmin三种方式在流加发酵过程中的排列顺序和相应的分配时间。 要确定Fmax、Fs和Fmin之间合乎逻辑的排列顺序，必须建立在对发酵过程分析的基础上。流加发酵中的最优控制方式依赖于菌体比生长速率和产物比合成速率的形式以及发酵的初始条件。Lim等依据菌体生长和产物合成的特点，将一般发酵过程分为三类，类型1：细胞生长无抑制和阻遏，产物形成受抑制和阻遏；类型2：细胞生长受抑制和阻遏，产物形成无抑制和阻遏；类型3：细胞生长和产物形成同时受抑制和阻遏。知道了发酵的类型后，就可以根据所给定的初始条件确定最优控制的方式了。 在PHB发酵过程中的产物形成阶段，细胞物质已大量形成，菌体的生长停止，并且在细胞的生长阶段葡萄糖浓度一直维持在很低的水平，但细胞只有在培养基中氮源缺乏和碳源过量的条件下才能大量积累产物PHB；另外，从第五节可知，在PHB合成阶段，当葡萄糖的浓度控制在一定水平以上时，PHB的合成比速主要受氮源硫酸铵的流加速率的影响，PHB合成阶段的起始条件为高的菌体浓度和低的基质浓度，因而参照Lim所给出的特定条件下Fmax、Fs和Fmin 之间的排列顺序，结合PHB合成阶段的特点，可以得出：在PHB合成阶段开始，应先以最大速率Fmax流加一段时间，使用于PHB合成的葡萄糖过量，当葡萄糖浓度达到一定水平时，流加发酵进入单一控制阶段，在此单一控制阶段，葡萄糖的流加速率为Fs，单一控制阶段结束后，为一最小流速阶段(即分批发酵阶段)。 那么，最大流速Fmax和相应的流加时间如何确定呢？ 从前面的结果可知，PHB发酵过程经过氮源成为生长限制因素的转折期后，细胞的生长停止而进入PHB合成阶段，转折期后的PHB的合成比速迅速增加，并在2 h左右达到最大值，这里将转折期至PHB合成比速达到最大值的这一段时间称为过渡期，在此过渡期内PHB合成比速呈线性增加。由于在PHB合成比速达到最大值前的过渡期内不需要进行氮源的流加，在PHB的合成比速达到最大值后，才开始限氮流加，因而在过渡期内只需进行碳源的流加，过渡期后的单一控制阶段需同时进行碳源和氮源的流加，以下将分别对过渡期内和单一控制阶段的基质流加方式进行讨论。 3、过渡期内碳源的流加方式 由于在菌体生长阶段，葡萄糖的流加采用了指数速率流加方式，其浓度一直维持在一个很低的恒定水平，为了不使低浓度的葡萄糖水平成为PHB合成的限制因素，因而葡萄糖的指数速率流加结束后，必须以一最大流速Fmax进行葡萄糖的流加，以便在较短的时间内使发酵液中葡萄糖的浓度达到某一水平s2，这样才有利于细胞大量积累PHB。可见，在过渡期内，应以Fmax进行葡萄糖的流加，但这一最大流速的值是多少呢？ 氮源浓度降至生长限制水平后，残留菌体的生长停止，基质葡萄糖的消耗主要用于产物PHB的形成，细胞维持消耗所占葡萄糖的比例很小，因而在PHB合成阶段的过渡期内，对葡萄糖进行物料衡算可得：
(8-6-51) 假如要使过渡期内的葡萄糖浓度保持不变，则此阶段葡萄糖的流加速率应为：
(8-6-52) 从式(8-6-52)可见，由于菌体的比生长速率为零，所以残留菌体总量(V·xR)保持不变，s恒定，Yp/s一定，因而在过渡期内，葡萄糖的流加速率F与PHB合成比速(PHB成正比关系，即葡萄糖的流加速率应随PHB合成比速的增加而呈线性增加。分批发酵的研究结果表明，停止流加氨水后，在一定时间内，PHB的合成比速能达到的最大值一定，由此可以得出PHB合成比速达到最大值期间的过渡期内葡萄糖的流加速率。从第五节中可知，在过渡期起始时，PHB合成比速为0.08 h-1，而在过渡期末，PHB合成比速的最大值可达0.20 h-1，指数速率流加结束时的葡萄糖残留浓度s1为0.32 g/L，在PHB合成阶段，基质葡萄糖的消耗主要用于积累PHB，因而将PHB对葡萄糖的产率系数看作近似于其理论值0.48 g/g，结合式(8-6-52)，可以得出，假如要使过渡期内葡萄糖浓度仍保持在s1水平时，葡萄糖的平均流速率应为：
(8-6-53) 为了保证过渡期内葡萄糖的积累并达到某一水平s2，因而过渡期内葡萄糖的流加速率Fmax应大于
。分批培养动力学结果表明，在PHB合成阶段，当葡萄糖浓度在一定水平(7.0 g/L)以上时，PHB的合成比速基本不受葡萄糖浓度的影响，但PHB合成阶段过高的葡萄糖浓度会使最终产物PHB的分子量下降，且流加结束后要经过较长的一段分批培养过程，才能使最终残糖浓度降至接近零，否则会影响成本和后处理过程，综合考虑各种因素，希望在过渡期未葡萄糖浓度s2达到7 g/L。为使过渡期末s2达7 g/L的水平，过渡期内葡萄糖的流加速率Fmax应满足：
(8-6-54) 式中t1为过渡期起始点时间，t2为过渡期结束时间。 求解式(8-6-54)得Fmax=0.0244 L/h，可见在t1至t2这一段时间内，当葡萄糖的流加速率Fmax为0.0244 L/h时，则至t2时刻时，发酵液中的葡萄糖浓度可达7 g/L。 4、过渡期后的PHB合成阶段碳源和氮源的流加控制 在PHB合成阶段，菌体的生长停止，葡萄糖的消耗用于PHB的形成，因而有
，则由式(8-6-50)可得在t2时刻后葡萄糖的流加速率为：
(8-6-55) 由于：
(8-5-1)
(8-5-2) 由式(8-6-13)可得，
(8-6-56) 则在t2至ts的单一控制阶段细胞所合成的PHB量Ps为：
(8-6-57) 式中t2为20 h，XR为28.72 g。 根据第五节研究结果，在单一控制阶段，硫酸铵的流加速率应不断下降，此处假定硫酸铵的流速呈线性下降，有FN=at+b，从式5-2可知，kd为零时，FN等于1.646 g/h，因而式FN=a t+b应满足的边界条件为：a t2+b=1.646和 a ts+b=0，由此可得到：
(8-6-58) 将式(8-5-2)和式(8-6-58)代入(8-6-57)，得：
(8-6-59) 由式(8-6-1)可知，当PHB的发酵过程所优化的目标函数为PHB生产强度时，要求PPHB能取得最大值。
(8-6-1) 式(8-6-1)中(P)p包括过渡期所合成的PHB的量P1和单一控制阶段所合成的PHB量Ps及单一控制阶段后的分批培养阶段所合成的PHB量P2。通过计算可得，细胞生长期内所合成的PHB量(P)g为2.5 g，过渡期内所合成的PHB量P1为8.04 g。由于PHB的大量合成主要是在单一控制阶段，且单一控制阶段结束时，发酵液中残留葡萄糖浓度很低(7 g/L)，所以最后分批阶段所能合成的PHB量相对较少，该阶段的时间也较短，因而，可将求取PPHB最大值这一问题，转化为求取至单一控制阶段结束时的最大PHB生产强度P'PHB。对式(8-6-1)进行简化并将式(8-6-59)代入可得：
(8-6-60) 取不同的ts值代入式(8-6-60)中，当取ts为46 h时，
可取得最大值为2.243 g/h，则可得至单一控制阶段结束时细胞所合成的PHB的量为：(P)g+P1+Ps=103.2 (g)，将ts＝46 h代入式(8-6-58)可得a=-0.633，b=2.91，则单一控制阶段硫酸铵的流加速率为：
(8-6-61) 将式(8-5-2)和(8-6-61)代入式(8-5-1)可得：
(8-6-62) 将式(8-6-62)代入式(8-6-55)中，可以得到单一控制阶段葡萄糖的流加速率为：
(8-6-63) 在单一控制阶段所加入的葡萄糖溶液的体积Vs为：
(8-6-64) 将式(8-6-63)代入式(8-6-64)，得Vs为0.4099 L。因而可以得出在整个PHB发酵过程中所加入的葡萄糖溶液的体积为：80+24.4×2+409.9=538.7 mL。 由式(8-6-61)可以得出所加入的硫酸铵的量MN为：
由式(8-6-15)可知，流加发酵过程中满足V(tf)=Vf，此处设定Vf＝1700 mL，则硫酸铵溶液的加入体积应为61.3 mL，所流加的硫酸铵溶液的浓度应为35 %。 采用式(8-6-62)可以得出单一控制阶段结束时，PHB的合成比速为0.114 h-1，此时氮源已停止流加，kd为3.31×10-3，则分批阶段PHB的合成比速
为：
(8-6-65) 单一控制阶段结束时的残留葡萄糖浓度为7 g/L，发酵液体积为1.7 L，葡萄糖量为11.9 g，假如在分批培养阶段，残留的葡萄糖完全用于PHB的合成，可合成PHB的量P2为5.71 g，则可计算出整个发酵时间tf：
(8-6-66) 将式(8-6-65)代入(8-6-66)中可以计算出tf为47.8 h。可知最后分批阶段的发酵时间为1.8 h，由于葡萄糖浓度降至很低时，会使PHB合成比速有所下降，因而实际上分批阶段所需的时间会大于1.8 h。 通过分别对PHB发酵过程中菌体生长阶段和PHB合成阶段的流加准优化，可以得出发酵时间为47.8 h，合成的PHB总量达108.9 g，流加结束时发酵液的体积为1700 mL，PHB浓度为64.1 g/L，细胞干重为81.0 g/L，胞内PHB含量为79.1 %，残留菌体浓度为16.9 g/L，PHB的生产强度为1.34 g/(L(h)，PHB对葡萄糖的产率系数为0.39 g/g。图8-6-1为流加准优化方式下，PHB发酵过程中各参数模型计算值的变化关系。 





图8-6-1 流加准优化方式下发酵过程中各参数的变化(模型计算) 由此可以得出PHB流加发酵的准优化策略为： 1) 在一定的初糖浓度和初氮浓度下，细胞的培养先经过一个分批培养过程； 2) 当残糖浓度降至生长限制水平以下时，开始以指数速率方式控制葡萄糖的流加，当菌体干重达到25 g/L左右时，结束葡萄糖的指数流加方式，并在指数流加结束前2 h，停止作为补充氮源和pH控制手段的氨水的流加，而改用3 mol/L的NaOH调节pH； 3) 由于葡萄糖的指数流加方式结束时，培养基中的氮源已成为生长的限制性基质，此时PHB的合成比速迅速增加，为了有利于细胞大量积累PHB，在指数流加方式结束至PHB合成比速达到最大值之间的过渡期内应采用最大流速Fmax进行葡萄糖的流加，使葡萄糖的浓度达到7 g/L以上； 4) 在单一控制阶段，应同时进行葡萄糖和硫酸铵的流加，此阶段内葡萄糖浓度维持恒定，硫酸铵流加速率的变化按线性下降的方式进行； 5) 流加结束后，为了降低发酵液中的残糖浓度，还要经过一个分批培养阶段，直至发酵结束。 5、准优化控制策略在PHB流加发酵中的应用 通过上面的分析，我们根据PHB发酵过程中菌体生长阶段和产物合成阶段的不同特点，得到了底物流加的准优化控制策略，但在实际的发酵过程中，由于流加控制手段的限制，对底物的流加方式进行适当的简化处理，得出如下的PHB流加发酵的准优化控制策略： 1) 在指数速率流加阶段，葡萄糖的流加可根据式(8-6-8)简化成阶梯递增的方式进行，每一小时调整一次流速，以维持葡萄糖浓度在生长限制水平以下。 2) 在单一控制阶段，葡萄糖和硫酸铵的流加可分别根据式(8-6-63)和(8-6-61)均简化成阶梯递减的方式进行，葡萄糖的浓度可粗略地控制在1 %左右。 按照次优化策略进行PHB的流加发酵控制，发酵结果见图8-6-2。

图8-6-2 准优化流加策略下的PHB发酵过程曲线 PHB的流加发酵过程具体控制如下：初糖浓度为10 g/L，第10 h开始按指数速率方式进行葡萄糖的流加，实际操作中采用阶梯递增的方式进行流加，第18 h停止氨水的流加，第20 h停止葡萄糖的指数方式流加，第20 h至22 h采用最大速率(25 mL/h)进行葡萄糖的流加，22 h后进入单一控制阶段，葡萄糖和硫酸铵的流加采用阶梯递减的方式进行，以保持葡萄糖的浓度在10 g/L左右，50 h单一控制阶段结束，随后为一个2 h的分批培养阶段，使残糖浓度基本降为零。发酵结束时，细胞干重达71.0 g/L，胞内PHB含量为79.4 %，PHB浓度为56.4 g/L，PHB的生产强度为1.08 g/(L(h)，PHB对葡萄糖的产率系数为0.38 g/g。尽管准优化控制下的实验结果与理论计算值之间还存在一定的差距，但和优化前的结果相比有明显的提高，见表8-6-2。从表中可以看出，采用以提高PHB生产强度为目标的次优化流加控制策略后，PHB的生产强度和PHB浓度的提高非常明显，其它各项指标也都有了较大的提高，这将大大有利于降低PHB的发酵生产成本，为PHB的扩大生产打下了良好的基础。 表8-6-2 流加准优化前后的PHB发酵结果比较 结果 发酵时间 / h 细胞干重 / g(L-1 PHB含量 / % PHB浓度 / g(L-1 PHB生产强度 / g(L-1(h-1 产率系数 / g(g-1  准优化前 60 66.1 75.0 49.2 0.82 0.37  准优化后 52 71.0 79.4 56.4 1.08 0.38  提高量/ % 减少8 h 7.1 5.9 14.6 31.7 2.7  注：表中准优化前的数据取自第五节流加发酵中PHB合成阶段硫酸铵流加速率为0.5 g/h时的发酵结果。 在PHB流加发酵准优化策略的研究过程中，如能结合第四节中所得到的PHB分批发酵动力学模型进行基质流加优化控制过程的计算，得到真正的优化控制策略，可对PHB的发酵过程可实现更为精确的控制，有望进一步提高PHB的发酵指标。 第七节 羟基丁酸与羟基戊酸共聚物发酵条件的优化 一、引言 PHB作为一种最早发现和研究的生物可降解材料还存在以下两个明显缺点：(1)熔融稳定性差，熔化温度为200℃，非常接近于它的分解温度；(2)易老化，放置几天后会发脆，这些缺陷在一定程度上限制了PHB的应用范围。研究表明，当PHB中掺入HV组分形成共聚物PHBV后，其物化性能比均聚物PHB有了很大的改善，如脆性降低，韧性增强。PHBV的获得也相对较容易，R. eutrophus在以葡萄糖为碳源合成PHB的过程中，向其中加入丙酸或戊酸，就能在胞内积累PHBV，而且PHBV中HV组分含量的高低可通过调节葡萄糖与有机酸之间的比例来控制，由此可以获得HV组分含量不同的、性能各异的共聚物。 和PHB相似，PHBV的工业化生产及广泛应用所面临的最大问题也是生产成本过高。作为PHBV中HV组分合成前体的有机酸，不仅价格较高，在较低浓度时就会对菌体生长和产物合成产生抑制作用。因此，要对PHBV发酵条件进行优化，必须综合考虑包括最终PHBV浓度、PHBV质量分数、PHBV中HV组分的摩尔分率以及HV组分对丙酸的产率系数等在内的多种指标。本节首先考察了前体丙酸的加入量和加入时间对PHBV发酵的影响，比较了丙酸和戊酸作为前体对PHBV发酵的影响，然后采用响应面分析法，优化了PHBV的摇瓶发酵条件。在此基础上，研究了2 L罐中流加不同糖酸比的混合液对PHBV发酵各种指标的影响，提出了PHBV流加发酵的准优化控制策略。 二、PHBV摇瓶发酵条件研究 (一)丙酸为辅助碳源时初始加入时间和每次加入量的研究 PHBV是在PHB合成过程中嵌入HV单体而形成的。作为HV组分合成前体的有机酸，如果加入过早，由于菌体正处于生长繁殖阶段，有机酸的毒性将使菌体生长受到抑制；如果加入太迟，PHB已大量形成，所形成的共聚物PHBV中HV组分含量将偏低。因此确定有机酸的适宜加入时间和加入量对提高PHBV产量和HV组分的摩尔分率相当重要。 从表8-7-1可以看出：(1)在发酵前期加入丙酸，由于细胞正处于生长繁殖阶段，此时加入丙酸会使菌体生长和PHBV合成活性都受到较大抑制，严重影响最终菌体干重和PHBV产量，抑制作用随着丙酸加入浓度的增大而增大；(2)在发酵中期(约第19 h)加入丙酸，由于此时发酵液中氮源耗尽，细胞正处于多聚物合成阶段，这时加入丙酸就可以在PHB片段合成的同时嵌入HV组分，可使最终产物PHBV中HV组分分率较高；(3)在发酵后期(第25 h左右)加入丙酸，由于细胞已大量合成PHB，此时加入丙酸，菌体对丙酸的利用率很低，最终产物PHBV中HV含量很低。另外，可以想象，如果丙酸加入时胞内已形成了大量的PHBV均聚物，最终产物PHBV中HV单体可能会积聚在丙酸加入后所合成的单链的某一区域中，这必定会影响产物PHBV的材料性能。 由此可见，丙酸初始加入时间和每次加入量是影响PHBV合成的两个重要因素。丙酸初始加入时间越早，尽管可以得到含有较高HV组分的产物，但由于丙酸对菌体的生长具有明显的抑制作用，最终细胞干重和PHBV浓度会明显下降；如丙酸加入过迟，产物PHBV中HV组分含量必定很低；丙酸的适宜加入时间为多聚物开始大量合成阶段。丙酸的间歇式加入对菌体细胞的生长和聚合物的形成都具有一定抑制作用，采用流加的方式有可能降低这种抑制作用。 表8-7-1 丙酸不同加入时间和加入量对PHBV发酵的影响 加入时间 /h 每次加入丙酸浓度/ g(L-1 细胞干重 / g(L-1 PHBV质量分数 /% PHBV质量浓度 / g(L-1 HV摩尔分数 /% 残留丙酸浓度 / g(L-1  13 1.0 21.4 80.7 17.3 10.9 0   2.0 21.0 76.5 16.1 13.6 0   3.0 15.5 63.1 9.8 23.4 0   4.0 11.2 37.9 4.2 28.5 1.3  19 1.0 25.9 78.0 20.2 10.5 0   2.0 24.2 80.1 19.4 13.2 0   3.0 17.9 72.5 13.0 15.3 1.0   4.0 13.6 53.3 7.3 25.6 2.2  25 1.0 27.0 79.3 21.4 8.3 0   2.0 24.0 76.3 18.4 10.3 2.9   3.0 23.9 70.9 16.9 11.5 3.6   4.0 17.8 67.4 12.0 13.8 5.3  (二)PHBV发酵中适宜的HV组分合成前体的确定 丙酸和戊酸是最常用的生产PHBV中HV组分的前体物质，但WSH3菌株对两种有机酸的利用情况不同。从表8-7-2中可以看出，分别以丙酸和戊酸为合成前体时：(1)当两者浓度相同时，以丙酸为前体最终所得的细胞干重略高，但PHBV浓度比较接近；(2)在相同浓度条件下，以丙酸为前体时最终产物PHBV中HV组分的摩尔分率略低；(3)当有机酸浓度较低时，以戊酸为前体比以丙酸为前体所得到的HV组分对底物的转化率高，但当浓度较高时，戊酸为前体时的转化率很低；(4)不管是以丙酸还是以戊酸为前体，随着加入量的增加，产物中HV组分含量增加，但细胞干重和PHBV浓度下降很大。从两种前体的价格看，戊酸的价格是丙酸的近3倍，因而综合考虑各种因素之后，选择丙酸作为合成PHBV的前体。 表8-7-2 WSH3菌株利用丙酸和戊酸能力的比较 前体种类 加入浓度 / g(L-1 细胞干重 / g(L-1 PHBV质量分数 /% PHBV质量浓度 / g(L-1 HV摩尔分数 /% YHV/酸 / g(g-1  丙酸 1.0×3 25.9 78.0 20.2 10.5 0.41   2.0×3 24.2 80.1 19.4 13.2 0.42   3.0×3 17.9 72.5 13.0 15.3 0.38   4.0×3 13.6 63.3 8.6 25.6 0.35  戊酸 1.0×3 25.6 80.5 20.6 11.7 0.68   2.0×3 23.9 78.9 18.9 14.3 0.51   3.0×3 17.3 72.9 13.3 16.5 0.26   4.0×3 12.8 65.6 8.39 28.2 0.23  注∶(1)硫酸铵浓度为3g/L。初始葡萄糖浓度为30g/L，在12 h、24 h和36 h分别补加10 g/L葡萄糖；(2)1.0×3表示每次加入1.0 g/L的酸，共加3次；初始加酸时间为接种后19 h，以后每隔8 h加1次。 (三)PHBV摇瓶发酵过程 如图8-7-1所示，发酵结束时，细胞干重、PHBV质量分数和HV组分的摩尔分率分别达到23.1 g/L、78.7 %和12.4 %。分析图8-7-1可知：(1)聚合物的大量合成是在氮源浓度成为生长限制性基质的时候开始的。发酵第19 h时，培养基中硫酸铵已降为零，丙酸加入后，HV的摩尔分率不断增加。从图中可知，在氮源成为生长限制性基质之前，胞内多聚物已开始大量合成，若将流加丙酸的时间提前，会更有利于PHBV中HV组分的形成；(2)从丙酸变化曲线可以看出，每间隔8 h补加2 g/L的丙酸，在下一次补加前丙酸已经全部耗完，表明可相应缩短每次补加丙酸的时间间隔或适当加大每次加入丙酸的浓度，但每次加入浓度不宜过高，否则会对细胞产生毒性。 图8-7-1 PHBV摇瓶发酵过程曲线 从图8-7-1可以看出，丙酸加入时间，加入量和初糖浓度等发酵条件对最终细胞干重、PHBV浓度、PHB含量和HV组分的摩尔分率有较大影响，如能对这些发酵条件进行优化处理，可使PHBV的摇瓶发酵水平得到进一步提高。 (四)摇瓶发酵条件的响应面分析 响应面分析(RSA)是数学与统计学相结合的产物，以回归方法作为函数估算的工具，将众多因子实验中，因子与实验结果的相互关系用多项式近似。把因子与实验结果(响应值)的关系函数化，依次对函数的面进行分析，可研究因子与响应值之间，因子与因子之间的相互关系。采用RSA方法对PHBV摇瓶发酵条件进行优化，因素与水平的安排见表8-7-3。在实验中选择初始丙酸加入时间，每次加入丙酸浓度，初糖浓度三个因素为自变量，设计了三因素三水平的实验。对响应值的选取，我们考虑到∶如果只以PHBV浓度为响应值，得出的优化条件将仅有利于菌体生长和含有HV组分的多聚物的形成，而多聚物中HV组分必然很低；而如果仅以HV组分的含量为响应值，所得到的优化条件又必然不利于菌体生长和共聚物的合成，且丙酸的价格比葡萄糖要贵得多，产物PHBV中HV组分的增加，必然会使其成本相应上升。因此，以PHBV浓度与HV摩尔分率的乘积这一综合指标为响应值，希望在获得较高的PHBV浓度的同时，能获得具有较适宜的HV组分含量的PHBV。 表8-7-3 响应面分析法分析因素与水平安排 因素 \ 水平 -1 0 1  初始丙酸加入时间(X1) / h 13 19 25  每次加入丙酸浓度(X2) / g(L-1 1.0 2.0 3.0  初始葡萄糖浓度(X3) / g(L-1 40 50 60   关于HV组分的较适含量是一个较难衡量的指标，因为PHBV中HV组分含量不同，对其材料性能的影响不同，且不同的用途对HV组分含量和要求也不同。如表7-4所示，随着PHBV中HV摩尔分率的增加，其杨氏模量和抗张强度逐渐降低，材料的劲度降低而韧度增强；冲击强度增加，表明PHBV更有弹性；PHBV的降解温度不变，而熔点不断降低，意味着材料的热加工性能提高。当HV摩尔分率为9～14 %时，其杨氏模量和抗张强度与聚丙烯相似，大大克服了PHB较脆和发硬这一缺陷，再考虑的过高的HV摩尔分率会使生产成本大大增加，因而认为HV摩尔分率控制在9～14 %较为适宜。 表8-7-4 PHB、不同HV摩尔分率的PHBV及聚丙烯的某些性质比较 聚合物 熔点 / ℃ 杨氏模量 / GPa 抗张强度 / MPa 冲击强度 / J(m-1  P(3HB) 179 3.5 40 50  P(3HB-co-3HV) 3 mol% 3HV 170 2.9 38 60   9 mol% 3HV 162 1.9 37 95   14 mol% 3HV 150 1.5 35 120   20 mol% 3HV 145 1.2 32 200   25 mol% 3HV 137 0.7 30 400  聚丙烯 170 1.7 34.5 45  表8-7-5为响应面分析的实验安排及结果，表中15个试验点分为两类，一类是析因点，共有12个，取值在X1、X2和X3所构成的三维顶点；另一类为零点，为区域的中心点。整个试验重复三次以估计误差。 表8-7-5 RSA实验安排及实验结果 实验号 初始加酸时间X1 每次加酸浓度X2 初糖浓度X3 PHBV质量浓度/ g(L-1 HV摩尔分数/% PHBV×HV  1 -1 -1 0 16.3 10.0 163.0  2 -1 0 -1 14.2 15.4 218.7  3 -1 0 1 15.9 14.5 230.6  4 -1 1 0 8.3 25.4 210.8  5 0 -1 -1 15.6 10.8 168.5  6 0 -1 1 19.7 9.1 179.3  7 0 1 -1 13.0 16.2 210.6  8 0 1 1 12.1 14.4 174.2  9 1 -1 0 19.4 8.3 160.1  10 1 0 -1 17.5 11.0 192.5  11 1 0 1 17.4 8.8 153.1  12 1 1 0 15.9 11.5 182.9  13 0 0 0 18.9 12.6 238.1  14 0 0 0 19.4 12.2 236.7  15 0 0 0 19.6 12.1 237.2  以PHBV浓度与HV摩尔分率的乘积为响应值，经回归拟合后，各因子对响应值的影响可用下列函数来表示∶
(8-7-1) 表8-7-6 回归系数取值 系数 









 取值 257.1 -2.18 1.68 -3.74 -22.8 -52.7 -19.4 -8.06 -6.96 -2.80  表8-7-7 回归方程各项的方差分析表 方差来源 自由度 平方和 均方 F值 相关系数r2  回归 9 12948.72 1438.75    残差 5 29.91 5.982 240.53 r2=0.997  总离差 14 12978.63     f0.01(9,5)=10.95 表8-7-8 回归方程各项的方差分析 方差来源 自由度 均方 F值 显著性  一次项 3 57.33 63.49 *  二次项 3 4097.18 4535.66 ***  交互项 3 161.72 179.03 **  失拟项 3 9.367 10.37   误差 2 0.9033    f0.01(3,2)=99.2 f0.05(3,2)=19.2 f0.1(3,2)=9.16 从方差分析表8-7-7和8-7-8中可以看出，用回归方程(8-7-1)来描述各因子与响应值之间的关系时，方程的因变量和全体自变量之间的线性关系是显著的(F>f0.01(9.5))，线性相关系数r=0.997。此外，从对回归方程各项方差的进一步检验中也可看出，方程的失拟项很小，因此可以用该回归方程来代替试验真实点对试验结果进行分析。回归方程各项 的方差分析结果还表明，方程二次项影响的显著性最大，一次项和交互项影响也较显著，因此各个具体试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。

图8-7-2 Y=f(X1,X2)的RSA分析平面图 图8-7-3 Y=f(X1,X2)的RSA分析立体图

图8-7-4 Y=f(X1,X3)的RSA分析立体图 图8-7-5 Y=f(X1,X3)的RSA分析平面图

图8-7-6 Y=f(X2,X3)的RSA分析立体图 图8-7-7 Y=f(X2,X3)的RSA分析平面图 从图8-7-2至图8-7-7可以看出，较适宜的PHBV摇瓶发酵条件为：初糖浓度为5 %左右，丙酸初始加入时间为第14 h至17 h，每次加入丙酸浓度为2.0 g/L左右。为了更进一步确定最佳点的值，对回归方程取一阶偏导等于零并整理: -20.79-30.76X1-7.81X2-11.49X3=0 6.30－87.42X2－7.81X1－19.80X3=0 -9.72－56.48X3－11.49X1－19.80X2=0 解得∶X1=-0.68，X2=0.15，X3=-0.087。 由此可得，丙酸的初始加入时间为第15 h，每次加入丙酸的浓度0.22 %，葡萄糖浓度为4.91 %。考虑到实际操作的方便，较适宜的PHBV摇瓶发酵条件为：初始硫酸铵浓度为0.3 %时，初糖浓度为5 %，丙酸总量为0.6 %，丙酸初始加入时间为第15 h，每次加入浓度为2.2 g/L，每次间隔时间为6 h。结合RSA分析中得出的结论可以更清楚地看出，丙酸的适宜加入时间并不是在氮源完全消耗的时刻(约第19 h)，而是在发酵液中氮源成为生长限制性因素、胞内多聚物开始大量合成的时刻。利用RSA分析中得到的较适宜的条件，摇瓶发酵47 h，细胞干重达到21.8 g/L，PHBV浓度为17.0 g/L，PHBV中HV摩尔分率为14.2 %，PHBV浓度与HV组分摩尔分率的乘积为241.4，达到了优化的目的。 (五)摇瓶补料合成PHBV的研究 由前面的研究可知：(1)葡萄糖糖主要用于细胞生长和积累PHBV，但是过高的初糖浓度会对菌体的生长产生抑制作用，在总糖浓度相同的情况下，采用降低初糖浓度和中间补料的方法可以减少葡萄糖对菌体生长的抑制作用；(2)发酵过程中氮源的限制或缺乏可刺激细胞大量合成多聚体，但在多聚体的合成期，氮源完全缺乏，会降低细胞合成多聚体的活性，所以，如在多聚体合成期补加少量氮源，将有利于PHBV的合成和产量的提高。在PHBV发酵过程曲线分析和响应面分析研究的基础上，进行了PHBV摇瓶发酵的补料实验，结果见表7-9。 表8-7-9 PHBV摇瓶发酵补料实验 组号  对照 1 2 3   葡萄糖 / % 6% 3%+1%×3 3%+1%×3 3%+1%×4   补糖时间 发酵第12 h起，每次间隔8 h  实验处理 硫酸铵 / % 0.3% 0.3% 0.3%+0.1% 0.3%+0.1% +0.05%   补氮时间 第12 h 第12和24 h   加酸量 0.2%×4 0.2%×4 0.2%×4 0.2%×4   加酸时间 发酵第15 h起，每隔6 h补加一次   细胞干重 / g(L-1 21 23.1 25.5 27.7   PHBV质量分数/% 78.3 78.0 79.6 80.7  发酵结果 PHBV浓度 / g(L-1 16.4 18.0 20.3 22.4   HV摩尔分率 / % 15.3 15.8 16.6 16.1   YHV/丙酸 / g(g-1 0.45 0.47 0.52 0.50  注：表中3%+1%×3表示初糖浓度为3%，流加三次，每次1%，其余类推；发酵时间48 h。 从表8-7-9可以看出，PHBV摇瓶补料发酵的较佳条件为：初糖浓度3%，流加4次，每次1%，间隔时间为8 h；初氮浓度0.3 %，并在第12和24 h分别流加0.1 %和0.05 %的硫酸铵；总酸浓度0.8 %，初始加酸时间为第15 h，分4次加入，每次间隔6 h。补料发酵试验结果表明，补料发酵有利于PHBV合成，细胞干重、PHBV浓度、HV组分含量和HV对丙酸的转化率分别比不补料时提高了31.9 %、36.6 %、5.2 %和11.1%。 补料操作虽然可以提高PHBV摇瓶发酵的各项指标，但由于丙酸在很低的浓度(大于0.1 %)时就会对细胞产生毒性，因而间歇补加丙酸的方式难以达到很好的发酵效果；为了防止PHBV合成阶段细胞大量自溶，还必须控制一个很低的氮源浓度，间歇补加法也难以达到这一目的。故以下在2 L罐中进行PHBV流加发酵条件的研究。 三、2 L罐中PHBV流加发酵过程的准优化控制 利用微生物生产PHBV，一方面希望得到HV摩尔分率较大、机械性能较好的共聚物，另一方面又希望获得较高的PHBV生产强度和较低的生产成本。从摇瓶实验结果可知，丙酸的初始加入时间和加入量会严重影响PHBV的各项发酵指标，丙酸的最佳加入时间为细胞生长阶段结束后多聚物开始大量合成的时刻；在确定了丙酸的加入时间后，共聚物中HV组分含量的高低主要与所加入的丙酸量有关，加入的丙酸量大，所合成的PHBV中HV组分含量也会相应提高，但高浓度丙酸会抑制菌体合成共聚物的活性，导致最终PHBV产量的下降。为了确定合适的丙酸流加速率，我们在PHBV发酵过程中的多聚物大量合成阶段，流加含有不同葡萄糖与丙酸比例(糖酸比)的混合液，研究不同糖酸比对细胞干重、PHBV 含量、PHBV浓度和PHBV中HV摩尔分率的影响。 (一)不同糖与丙酸比率对PHBV流加发酵过程的影响 与前面PHB发酵过程的流加优化控制相类似，这里也可将PHBV的发酵过程分为菌体生长和PHBV积累两个阶段来控制：(1)菌体生长阶段。在此阶段葡萄糖作为菌体生长的限制性基质，可采用指数速率方式进行流加，使菌体生长阶段积累的PHB量很少，以提高菌体的比生长速率和糖对残留菌体的产率系数。(2)PHBV积累阶段。葡萄糖的指数速率流加在第20 h结束(氨水的流加在第18 h停止)，此时培养基中的氮源成为菌体生长的限制性因素，开始流加不同比例的葡萄糖与丙酸的混合液，以促使细胞合成PHBV。在PHBV合成阶段，葡萄糖的浓度控制在1 %左右，硫酸铵的流加采用阶梯递减速率的方式进行，第52 h左右停止葡萄糖丙酸混合液以及硫酸铵的流加，再经过2～3 h的分批培养过程，以降低发酵液中的残留基质浓度。 在PHBV合成阶段，分别采用了糖酸比为10:1、6.7:1和5:1的糖酸混合液进行流加试验，结果见图8-7-8～图8-7-11。

图8-7-8 PHBV发酵过程中糖酸比为10:1时各参数的变化曲线

图8-7-9 PHBV发酵过程中糖酸比为6.7:1时各参数的变化曲线

图8-7-10 PHBV发酵过程中糖酸比为5:1时各参数的变化曲线 图8-7-11为不同的糖酸比下丙酸的残留浓度变化曲线。从图中可以看出，不同的糖酸比下，培养基中丙酸浓度的变化情况不同，当糖酸比为10:1时，发酵液中几乎无丙酸积累，所加入的丙酸被细胞完全利用；当糖酸比为6.7:1时，加入丙酸22 h后，发酵液中丙酸开始积累；而当糖酸比为5:1时，加入丙酸12 h后，发酵液中丙酸就开始积累，表明随着发酵的进行，细胞的活性不断降低，细胞对丙酸的利用能力也不断下降。
图8-7-11 不同的糖酸比下丙酸的残留浓度变化曲线 不同糖酸比下发酵结果比较见表8-7-10。可以看出，PHBV中HV组分的摩尔分率随流加液中糖酸比不同而变化，改变糖酸比就可以获得具有不同HV组分分率的共聚物，这为生产性能各异的共聚物提供了依据。要获得高HV组分的共聚物PHBV，必定要以较高的发酵生产成本为代价，因为随着流加液中糖酸比的下降，尽管HV组分的平均合成速率增加了，但PHBV的平均合成速率明显下降，这会导致最终产物PHBV的浓度和含量都明显降低。另外，从表中还可以看出，随着流加液中糖酸比的下降，PHBV的生产强度和HV组分对丙酸的产率系数明显下降。从R. eutrophus以葡萄糖为碳源、丙酸为前体合成PHBV的途径(图8-7-12)可以推测，发酵液中丙酸的积累，会使细胞中丙酰辅酶A的浓度增加，使丙酰辅酶A流向乙酰辅酶A部分的比例相应增加，由此导致HV组分对丙酸的产率系数下降。如果发酵过程中价格比葡萄糖贵的丙酸转向HB组分的合成，必然会引起PHBV的生产成本上升。因而必须综合考虑包括生产成本在内的各项指标，既要获得较高的PHBV浓度，又要使PHBV中HV组分的含量适宜。 表8-7-10 不同糖酸比下的PHBV发酵结果 糖酸比 参数 10:1 6.7:1 5:1  细胞干重 / g(L-1 55.0 46.4 38.6  PHBV浓度 / g(L-1 44.1 33.2 25.7  PHBV质量分数 / % 80.2 71.6 66.5  HV组分摩尔分率 / % 10.1 19.0 29.8  PHBV平均合成速率 / g(L-1(h-1 1.24 0.92 0.68  HV组分的平均合成速率 / g(L-1(h-1 0.15 0.21 0.24  HV组分对丙酸的产率系数 / g(g-1 0.54 0.36 0.3  PHBV生产强度 / g(L-1(h-1 0.82 0.61 0.47  残留丙酸浓度 / % 0 0.1 0.19  
图8-7-12 R. eutrophus中以葡萄糖为碳源、丙酸为前体合成PHBV的途径 (二)PHBV流加发酵过程的准优化 从不同糖酸比对PHBV发酵过程的影响可以看出，在PHBV合成期，菌体对丙酸的利用能力不断下降，而发酵过程中丙酸的积累不仅会降低细胞的PHBV合成活力，还会导致PHBV生产成本的增加，因而在PHBV合成阶段流加液的糖酸比应随发酵过程中菌体对丙酸利用能力的下降而不断提高，即在PHBV合成前期，由于菌体活性较高，可以采用较低的糖酸比进行流加；在PHBV合成中后期，应逐渐提高流加液的糖酸比，才能避免由于丙酸在发酵液中的积累而对菌体产生的毒害作用。结合PHBV发酵过程的特点，我们提出PHBV的流加发酵准优化控制策略如下： 在菌体生长阶段，葡萄糖的流加采用指数速率方式进行，并在葡萄糖的指数速率流加结束前2 h左右停止氨水的流加； 在PHBV合成期，所流加的糖酸混合液中的葡萄糖与丙酸的比例由低至高进行变化。即当氮源浓度成为生长限制的因素后，先流加糖酸比为5:1的混合液，流加方式可参照式(8-6-54)和式(8-6-63)，流加10 h后切换为流加糖酸比为6.7:1的混合液，再流加10 h后切换为流加糖酸比为10:1的混合液直至流加过程结束。PHBV合成期硫酸铵的流加方式可参照式(8-6-61)； 流加结束后，为了充分利用发酵液中的残留基质，还必须经过一小段时间的分批培养过程。 采用上述准优化策略对PHBV的发酵过程进行控制，PHBV发酵过程中各参数的变化见图8-7-13和8-7-14。

图8-7-13 PHBV发酵准优化控制中各指标的变化情况
图8-7-14 PHBV发酵准优化控制中糖、铵离子和丙酸浓度的变化 从图8-7-13中可以看出，在PHBV合成阶段，PHBV浓度和PHBV质量分数迅速增加，随着胞内PHBV的积累，细胞干重也迅速增加；丙酸加入后，PHBV中HV组分开始形成，HV组分的浓度和摩尔分率迅速增加。从图8-7-14中可以看出，在PHBV合成阶段，当流加混合液中糖酸比按菌体活性的降低而不断提高时，发酵液中丙酸的积累量很小，第20 h至第32 h之间，发酵液中丙酸浓度为零，第32 h后，丙酸浓度在0.04 %以下，由此可以避免或降低高浓度丙酸对细胞活性的抑制作用。发酵结束时，细胞干重、PHBV浓度、PHBV质量分数和HV组分的摩尔分率分别达到52.1 g/L、40.8g/L、78.3 %和16.2 %，HV组分对丙酸的产率系数YHV/丙酸为0.50 g/g，PHBV的生产强度为0.74 g(L-1(h-1。 可以看出，采用准优化流加策略后，由于较好地避免了发酵过程中丙酸的大量积累，尽管细胞干重和PHBV浓度比糖酸比为10:1时略低，但PHBV中HV组分摩尔分率却有了较大的提高；与糖酸比为6.7:1和5:1时的发酵结果相比，PHBV浓度、PHBV的生产强度及HV组分对丙酸的产率系数都有了较大的提高，表明所采取的准优化流加策略能使前体丙酸比较有效地转化为PHBV中的HV组分，既可获得较高的PHBV浓度和HV组分摩尔分率，又可得到较高的HV组分对丙酸的产率系数和PHBV的生产强度，不失为降低PHBV生产成本的可选择的方法之一。 第八章主要参考文献 Leaf TA, Srience F. Metabolic Modelling of polyhydroxybutyrate biosynthsis. Biotechnol. Bioeng. 1998, 57(5): 557~ 570. 堵国成．真氧产碱杆菌生物合成聚-(-羟基烷酸的研究．无锡轻工大学博士学位论文，1997年12月 陈坚，堵国成，李寅，等．细菌合成生物可降解塑料聚羟基烷酸(PHAs)的研究现状和未来．中国科学基金，1999，13(2): 73-76 Du G, Chen J, Lun S. Continuous production of poly-3-hydroxybutyrate by Ralstonia eutropha in a two-stage culture system. J. Biotechnol., 2001, 88: 69-76 Du G, Chen J, Gao H et al. Effects of environmental conditions on cell growth and poly-(-hydroxybutyrate accumulation in Alcaligenes eutrophus. World J. Microbiol. Biotechnol., 2000, 16: 9-13 堵国成，陈坚，陈银广，等．真养产碱杆菌二级连续培养系统中稀释率对聚(-羟基丁酸合成的影响．生物工程学报，1998，14(2): 187-192 堵国成，陈坚，郁明，等．真养产碱杆菌合成3-羟基丁酸与3-羟基戊酸共聚物发酵条件研究．微生物学报，1999，39(3): 247-254 堵国成，陈坚，高海军，等．真养产碱杆菌积累聚(-羟基丁酸发酵条件的研究．生物工程学报，2000，16(1): 103-107 堵国成，陈坚，尹洪波，等．氮源流加对Alcaligenes eutrophus积累聚(-羟基丁酸的影响．微生物学报，2000，40(3): 290-295