第二章 发酵过程优化原理 1 第一节 发酵过程优化的微生物反应原理 1 一、概述 1 二、微生物生长反应 1 第二节 发酵过程数量化方法 11 一、数量化方法的基础 11 二、发酵过程的速度 13 三、化学计量学和热力学 15 第三节 微生物反应动力学 21 一、微生物生长的非结构动力学模型 22 二、微生物产物形成动力学模型 27 三、多底物动力学 28 第四节 微生物反应优化的一般原理 30 一、发酵过程优化的一般步骤 30 二、分批微生物反应过程的优化 30 第二章 发酵过程优化原理 第一节 发酵过程优化的微生物反应原理 一、概述 微生物是发酵工业的灵魂，对微生物控制的发酵过程进行优化，首先要了解微生物的生长反应特性。微生物细胞生长是细胞个体内许多化学反应的综合结果。这些反应包括合成提供其它反应需要的吉布斯自由能；利用底物合成结构单元，再聚合成大分子物质，供合成细胞所需等。正常情况下，微生物细胞为了确保有序和高效生长，必须将这些反应有机地结合在一起，经济地分配胞内各代谢途径的通量。 大肠杆菌是发酵研究中用得最多的微生物。在大肠杆菌生长过程中前人已观察到下列现象∶ (1)在大肠杆菌快速生长期间，生物合成的中间体很少渗漏到胞外培养基中，结构单元(氨基酸、核酸等)的合成速率和聚合形成大分子的速率一致； (2)大肠杆菌胞内的大分子物质随比生长速率而变化。细胞以高比生长速率生长时对蛋白质的需求很高，因此相对于低的比生长速率来说，蛋白质合成系统(PSS)在细胞中占有很大比例。在低比生长速率下，PSS的利用率很低，其合成和维护对微生物来说是无用的代谢负担； (3)一旦生长培养基中的结构单元足够，细胞就不再合成这些物质； (4)特定的代谢途径代谢特定的底物，只有底物存在时，细胞才合成相应的酶。例如，只有当乳糖存在时，大肠杆菌才合成(-半乳糖苷酶将乳糖降解成半乳糖和葡萄糖； (5)若两个不同的底物同时存在于培养基中，细胞先合成能在一种底物上以较高比生长速率生长的酶系，当这种底物消耗完毕，再合成利用另一底物的酶。如大肠杆菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长，首先代谢葡萄糖，此生长阶段不产生(-半乳糖苷酶，不能代谢乳糖。当葡萄糖浓度变得很低时，系统合成(-半乳糖苷酶并利用乳糖继续生长。 以上观测结果对其它微生物也具有一定的适用性。由于微生物胞内代谢途径紧密结合，因此，对全部过程进行建模(如对特定微生物的生长和产物形成)，并不需要描述所有独立的反应。如对微生物生长建模时，可以将所有的代谢途径混合起来用几个单一反应来表示，有时甚至用一个反应式就可描述全部的生长过程。本节主要讨论微生物生长反应的基本原理。 二、微生物生长反应 细胞生长过程可分为三个步骤：(1)底物传递进入细胞；(2)通过胞内反应，将底物转变为细胞质和代谢产物；(3)代谢产物排泄进入非生物相，即胞外培养基。 培养基中存在的底物都是化学物质，可以被细胞摄入并代谢掉，或转化为其它细胞生长所需要的物质。有些代谢产物还可以作为二次底物被细胞利用，所以很难说这些物质到底是底物还是产物。如酿酒酵母的二次生长现象，当酵母以葡萄糖为底物生长的同时会产生乙醇，葡萄糖耗尽后，细胞能继续以乙醇为底物生长。根据在大肠杆菌生长过程中观察到的五种情况类推，当培养基中存在葡萄糖时，细胞不产生代谢乙醇的酶。因此，在利用葡萄糖生长和利用乙醇生长之间有一个滞后的阶段。在本书中，认为底物是最初存在于培养基中的底物。如上所述，葡萄糖是底物，而乙醇则是代谢产物。代谢产物是那些形成于胞内，能够穿过细胞膜的物质，它们可以被排泄进入非生物相。因此，代谢产物既可以是底物经过多步反应形成的小分子物质，也可以是细胞产生的大分子物质，如胞外蛋白酶。细胞质成分则是由底物形成的、不能穿过细胞膜的物质。众所周知的细胞质成分有蛋白质、RNA和DNA，一些小分子如ATP、NADH以及NADPH也可以归为细胞质成分。 基于以上的讨论，本书对底物、代谢产物和细胞质成分的定义为：底物是一种存在于初始非生物相或者摄入物中起作用的可交换的化合物；代谢产物是一种作为代谢物产生于某代谢途径进入非生物相的化合物；细胞质成分是一种细胞利用底物产生的不可交换的化合物。以下分别讨论运输过程(底物的摄入和产物的分泌)和胞内反应过程。 (一)运输过程 大多数细胞的细胞质外有两种结构：细胞壁和细胞膜。这些结构是细胞的屏障，其化学成分决定了物质能否在非生物相和细胞质之间运输。细胞壁是一种由交联肽聚糖构成的坚固结构，其主要功能是为了防止因胞内高的渗透压而引起细胞破裂。细胞膜主要由磷脂组成，在细胞生长过程中，具有变化的流动结构。大部分小分子很容易通过细胞壁，因此运输过程主要决定于细胞膜。大分子物质只有在细胞具有特定的排泄机制时才可以通过细胞壁运输。 革兰氏阳性菌(如乳酸杆菌)的细胞壁厚度大约为35 nm，比革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)薄2 nm左右。但是革兰氏阴性菌具有两层磷脂分子膜，其中一层位于细胞壁外。胞外的膜含有蛋白质，能形成孔径足够大的通道，确保分子量800～900的分子能够自由进出。小的亲水分子可以通过这些充满水的通道快速扩散，而大分子物质只有在一些特殊的情况下，才能由转运蛋白运输到细胞内部。因此对于革兰氏阴性菌来说，其细胞膜的特性决定着物质进出细胞的运输过程。 细胞膜由于胞内的渗透压而紧挨着细胞壁，但是革兰氏阴性菌和酵母细胞的细胞膜和细胞壁之间通常还有一层，即周质空间。该层含有多种蛋白质，如蛋白酶、核酸酶和磷酸酯酶等水解酶，支持着20～40%的细胞质量。在周质空间可发生许多反应，这使得从胞外培养基到细胞质的运输过程变得非常复杂。周质空间最主要的功能就是以所谓的“结合蛋白”的形式富集底物，因此，非生物相和周质体空间的底物浓度不一定相同，在对运输过程建模时必须考虑这些因素。 由于细胞膜是胞内和胞外环境的重要屏障，所以在细胞膜上的运输过程是研究者普遍关心的内容。目前的研究表明在膜上可能存在三种不同的运输机制：(1)自由扩散；(2)协助扩散；(3)主动运输。前两种机制是沿着浓度梯度进行运输，是被动的过程，在运输过程中不需要提供外部能量。而主动过程逆着浓度梯度进行运输，需要输入一定的吉布斯自由能。表2-1-1总结了一些底物和代谢产物在细菌和真菌中的运输过程。可以发现大多数底物在这两种微生物中以相同的方式进行运输。以下分别介绍三种运输过程的特征。 表2-1-1 微生物体内不同底物和代谢产物的扩散过程 化合物 细菌 真菌  氨基酸 葡萄糖 乳糖 甘油 乙醇 乳酸 乙酸 二氧化碳 氧气 水 主动运输 主动运输 主动运输 自由扩散，协助扩散 自由扩散 主动运输和自由扩散 自由扩散 自由扩散 自由扩散 自由扩散 主动运输 协助扩散和主动运输 协助扩散和主动运输 自由扩散，协助扩散 自由扩散 自由扩散 自由扩散 自由扩散 自由扩散 自由扩散  1、自由扩散 底物自由扩散通过脂膜包括三个步骤：(1)底物从胞外培养基运输到膜相；(2)分子在脂膜中扩散；(3)从脂相进入细胞质。一般情况下，细胞质具有和胞外培养基相似的物理和化学性质，因此，步骤(1)和(3)相似。相内的过程可认为处于平衡，也就是说这些过程的特征时间要比分子扩散通过脂膜层的特征时间短得多。界面上脂膜层物质的浓度一般指水相中产物的浓度，分配系数Kpar就是化合物在脂层的溶解速率和在水中溶解速率的比值。分子扩散的质量通量遵守Fick第一定律，化合物通过厚度为dmem的质膜进入细胞的传质速率可以用方程(2-1-1)表示。  (2-1-1) 式中，Dmem为化合物在质膜中的扩散系数，ca和cb分别为非生物相(胞外培养基)和生物相(细胞质)中化合物的浓度。DmemKpar/dmem的比率又称渗透系数P，经常用于传质的计算。如果缺乏渗透系数，可以用式(2-1-2)进行粗略的估计。  (2-1-2) 式中，Mw为化合物的分子量，为化合物在橄榄油～水体系中的分配系数，P的单位为cm/s。通过大量不同化合物的测量，已经得到了它们之间的相互关系式。然而在使用该关系式时，有些化合物的P值可能会偏离方程预测值。 如果定义acell为细胞的比表面积(m2/g干细胞)，那么化合物的比运输速率为  (2-1-3) 对于球形细胞来说，含水率为w(g/g)，细胞密度为((g/m3)，则比表面积为  通过自由扩散进行运输的化学物质主要有氧气、二氧化碳、水、有机酸和乙醇等。在电离状态下，小分子有机酸在脂膜中实际上是不溶的，此时应当用膜两边的非电离有机酸的浓度来代替方程(2-1-1)中的总浓度ca和cb，这些浓度可通过式(2-1-4)计算得到∶  (2-1-4) 式中，Ka为酸的电离常数。可以看到，膜表面水相的pH值对ci,undiss有影响，由于胞内外pH一般不同，尽管ca=cb，理论上仍然有可能有一定流量的酸通过膜。此外，尽管有机酸能迅速达到电离平衡，同时，在水相和脂相中未电离的酸也达到溶解平衡，但水相中靠近脂膜的地方仍然有可能存在一薄膜层。假如胞内的酸浓度比胞外培养基中高得多，未电离的酸就会持续转移入脂膜，促使电离平衡向未电离方向移动，多数酸就溶解在脂膜中。在膜的培养基这边，未电离酸的浓度很高，快速电离促使脂相中的未电离的酸进入水相。这样，我们可以利用方程(2-1-1)模拟小分子有机酸的情况，只有当假设的膜层不合理时，才需要修正膜内的pH差异。 为了更好地理解自由扩散的意义，让我们来看一下乳酸的分泌过程。乳酸菌从葡萄糖转变为乳酸的过程中获得吉布斯自由能。为了保持胞内的pH不变，细胞必须将代谢产物乳酸排泄入非生物相。乳酸的渗透系数大约为1.5×10-4cm/s，乳酸菌是直径约为1 (m的球形细胞，含水量80%，细胞的密度106 g/m3，细胞的比表面积为30 m2/g干重，代入方程(2-1-3)，得到∶ rlac =(1.5×10-6 m(s-1×30 m2/g干重)(ca-cb) =(4.5×10-5 m3(s-1/g干重)(ca-cb) (2-1-5) 在细胞的快速生长阶段，乳酸的产生速度大约为1.4 mg/(g干细胞(s)。由方程(2-1-5)可知，当胞外培养基和细胞质之间的浓度小至31 g/m3时，扩散过程就可以将产生的乳酸转移出细胞。 乳酸通过脂膜的快速扩散还可以解释许多细菌胞内乳酸及其它小分子有机酸的毒性效应。胞外乳酸浓度高时，胞内的浓度也很高。由于乳酸的电离常数很小，细胞很难维持胞内最适pH在7左右。尽管存在乳酸的主动运输系统，但通过细胞膜的快速自由扩散导致乳酸仍然会连续流入细胞。 2、协助扩散 细胞膜中有许多转运蛋白，允许特定的化合物进行被动运输，但比自由扩散通过细胞又快得多，这一过程就是协助扩散。真菌中这种运输机制是很典型的，在细菌中则比较少见，文献报道只有甘油是通过协助扩散进入大肠杆菌细胞的。协助扩散与自由扩散相似，因为只有存在浓度梯度时，由高浓度向低浓度的运输才可能发生。化合物在自由转运物的存在下才能进入细胞，故运输速率遵循典型的饱和型动力学∶如在低浓度下，运输速率与底物浓度呈一级相关，而在高浓度时则呈现零级相关。真菌中通过协助扩散的底物主要有葡萄糖和其它糖类。 离子可以通过细胞特定蛋白(类似于革兰氏阴性菌细胞外膜的porin)形成的孔道而被摄入。当离子进入到孔道，内部就形成一种电荷，可以防止其它离子进入。离子孔道和转运蛋白具有相似的功能，研究发现通过离子孔道的运输也遵循饱和型动力学。 3、主动运输 主动运输与协助扩散的相似之处在于，两者都以特定的膜内蛋白作为运输过程的媒介。与协助扩散相比，主动运输可以逆着浓度梯度的方向进行运输，因此是一个耗能的过程。运输过程中需要的自由能可以靠消耗ATP中的高能磷酸键来维持(一级主动运输)，或者和其它沿着浓度梯度方向的运输过程结合在一起(次级主动运输)。对于有些底物存在一种特别的主动运输过程，即所谓的基团移位，它是指底物在穿过细胞膜时，转变成不可渗透的异构体。 在氧化磷酸化过程中释放质子就是一个重要的一级主动运输过程。原核生物将质子释放到胞外培养基，例如穿过质膜而泵出体外。而在真核生物中，氧化磷酸化发生在线粒体内，质子穿过线粒体内膜而运输到线粒体内膜和外膜之间。在这两种情况下，质子的泵出是通过氧化NADH而释放大量的自由能来推动的。质子穿过膜的过程中会产生电化学势，将质子运输回细胞(或线粒体内)，就可以获得吉布斯自由能。质子的内流是由参与了ATP合成的ATP酶传递的，其运输是可逆的，如ATP酶也可以通过消耗ATP的方式将质子泵出细胞，这也是一个一级主动运输过程。质子的运输过程如图2-1-1所示。 图2-1-1 质子的运输 次级主动运输指的是∶在消耗已经建立的其它物质浓度梯度的基础上运输物质穿过细胞膜。如果这两种底物沿着相同的方向进行运输，称为同向转移；若两种底物沿着相反的方向进行运输，称为反向转移；如果电化学势驱动离子进行运输，则称为单向转移。一般情况下，次级主动运输是和穿过细胞膜的pH梯度相耦合的，为了保持胞内pH稳定，必须用ATP酶将质子泵出细胞。由于该过程需要能量，其宏观表现就是次级主动运输过程需要消耗胞内能量。次级主动运输的例子有：微生物通过透性酶摄入糖类。在这个过程中，糖和一个质子结合在一起运输到细胞质中，即质子同向运输；此外还有大肠杆菌中的乳糖透性酶系统。研究者发现在乳糖—质子运输过程中，两种物质的化学计量比为1:1。在其它运输过程中尚未发现到类似的简单化学计量比。 基团移位是主动运输过程的一种重要类型。在该过程中，运输过程和被运输底物的并发转变耦合在一起。最为人熟知的基团移位的例子是细菌用来摄取糖类的磷酸转移酶系统(PTS)。在这个系统中，糖类在被运输之前先被磷酸化，所需的磷酸基团由EMP途径的中间体磷酸烯醇式丙酮酸提供。参与磷酸基团的转移的蛋白至少有4种(见图2-1-2)，其中反应链的最后一环可作为转运蛋白运输糖类穿过细胞膜。反应链中的后两种蛋白对于特定的糖来说是特异的，而前两种蛋白在不同的PTSs中都是相同的。葡萄糖在PTSs运输下进入细胞时，直接被转化为6-磷酸葡萄糖(G6P)。PEP中的高能磷酸键由此得以保留，因此从能量的角度来看，这种摄入葡萄糖的过程比通过透性酶摄入葡萄糖更经济。此外，和其它摄入系统相比，PTSs对糖类的摄入具有很高的速率。这可以用来解释为什么PTSs主要存在于发酵性细菌中(从糖代谢生成ATP的量比呼吸性细菌少)，如严格好氧菌Azotobacter中不含有PTSs，而厌氧菌和兼性厌氧菌，如乳酸菌属和埃希氏菌属，却拥有针对几种不同糖的PTSs。丝状真菌和酵母也不含PTSs。 图2-1-2 某些细菌中用于摄取糖类的PTS图解 (二)胞内反应 底物运输进入细胞质后，要经过1000多步胞内反应转化为代谢产物和细胞成分，这些成分在大小和功能上存在差异，但是90%以上的细胞物质都是由蛋白质、RNA、DNA、脂类和碳水化合物等大分子组成的。大分子物质是通过底物的合成代谢反应而形成的，在此过程中，底物首先转化为氨基酸和核酸等结构单元，然后这些结构单元聚合成大分子。培养基的成分决定了细胞的合成代谢活力。当细胞在含有所有氨基酸的复杂培养基上生长，正常情况下不会再合成这些化合物。微生物的种不同，其生物合成能力也不同。有些微生物可以在只含有糖、无机氮和少量无机盐的培养基中生长，而有些微生物则需要在含有一些结构单元的复合培养基上生长。合成代谢反应需要消耗吉布斯自由能和还原力，吉布斯自由能主要靠ATP中的高能磷酸键来提供，而还原力则由辅酶NADPH来提供。ATP中的高能磷酸键水解可释放大量的吉布斯自由能： ATP＋H20＝ADP＋～P (G0=-30.5 kJ/摩尔 (2-1-6) 式中，~P表示磷酸基团。ΔG为正的反应，可以通过水解ATP所释放的吉布斯自由能来起动。当NADPH被氧化成NADP+，释放两个电子，转移到细胞内其它化合物上使其还原。ATP和NADPH是在底物转化为能量更低的化合物的分解代谢反应中形成的，下面即对分解代谢和合成代谢作一介绍。 1、分解代谢反应 最常用于细胞生长的能源是糖类，它们在转化为代谢产物(CO2、乳酸、乙酸和乙醇等)的同时，还形成ATP、NADH和NADPH。其中NADH是和NADPH相似的一种辅酶。NADH和NADPH都在分解代谢反应中产生，但NADPH主要消耗于合成代谢中，NADH则主要消耗于分解代谢途径，如氧化磷酸化。 大多数糖类在代谢之前都首先转化为6-磷酸葡萄糖(G6P)或6-磷酸果糖(F6P)。正常情况下，胞内G6P和F6P处于异构平衡。G6P可以作为许多糖代谢反应链的起点，有些微生物在运输葡萄糖的过程中形成G6P，但另一些微生物则通过胞内葡萄糖与ATP水解相耦合的反应形成G6P。一般将糖从G6P开始的代谢分成酵解(EMP)和丙酮酸代谢两个部分。在EMP途径中，G6P转化为丙酮酸，从葡萄糖开始的总的计量式如方程(2-1-7)所示。 Glc＋2ADP＋2～P＋2NAD+　→　2PYR＋2ATP＋2H2O＋2NADH＋2H+=0 (2-1-7) F6P转化为1,6-二磷酸果糖的ΔG为正，需要ATP水解提供能量才能进行。因ATP(或PEP)用于由葡萄糖形成G6P，故ATP的净产率是每摩尔葡萄糖转化为丙酮酸时产生2摩尔ATP。1摩尔葡萄糖经过部分氧化得到2摩尔丙酮酸所释放的四个电子，被2摩尔NAD+俘获形成2摩尔NADH。 磷酸戊糖(PP)途径的主要作用是为合成代谢提供以NADPH为表现形式的还原力和合成核酸的前体物质5-磷酸核糖(R5P)。由于PP途径存在分枝点，对于需要R5P和NADPH的细胞来说，存在4种可能的化学计量式(表2-1-2)。 表2-1-2 4种情况下PP途径的化学计量式 情况 化学计量式  对R5P的需求远大于NADPH 5G6P＋5ATP　→　6R5P＋5ADP＋4H2O＋4～P  对R5P和NADPH的需求平衡 G6P＋2NADP+＋H2O　→　R5P＋2NADPH＋2H+＋CO2  对NADPH的需求远大于R5P，且G6P完全氧化为CO2 G6P＋12NADP+＋7H2O　→　12NADPH＋12H+＋6CO2＋～P  对NADPH的需求远大于R5P，且G6P转化为丙酮酸 3G6P＋6NADP+＋5NAD+＋5～P＋8ADP　→ 5PYR＋3CO2＋6NADPH＋5NADH＋8ATP＋2H2O  EMP途径形成的丙酮酸脱羧形成乙酰CoA后进入三羧酸循环(TCA)，并被完全氧化生成CO2和水。在TCA循环中，1摩尔丙酮酸完全氧化可形成1摩尔ATP，4摩尔NADH和1摩尔FADH2。丙酮酸在TCA循环中被完全转化的先决条件是∶NAD+和FAD可以从NADH和FADH2中再生。该过程在呼吸链中发生，因此只有在好氧微生物中才是可行的。在呼吸链中，NADH脱氢酶将电子从NADH传递到辅酶UQ，再从辅酶UQ经过一系列细胞色素(含有亚铁血红素基团的蛋白)，最后传递给氧形成水。细胞色素或辅酶UQ位于细胞膜上或附近(或真核细胞线粒体的内膜)，当电子经过呼吸链，质子就通过膜层泵出细胞。当质子在ATP酶的作用下再进入细胞(或线粒体)，ADP就被磷酸化形成ATP，因此呼吸链通常也被称为氧化磷酸化。质子可以通过呼吸链上的3个位点泵过细胞膜。根据化学计量式可知，理论上1摩尔NADH氧化可形成3摩尔ATP∶ NADH＋0.5O2＋3ADP＋3～P＋3H+ →　NAD+＋3ATP＋4H2O (2-1-8) 对于NADPH也有相似的反应，但是该辅酶主要用于生物合成。FADH2在辅酶UQ处进入呼吸链，故电子不经过NADH脱氢酶。FADH2的氧化只导致质子在两个位点泵过细胞膜，化学计量式和方程(2-1-8)有所区别。 FADH2＋0.5O2＋2ADP＋2～P＋2H+ →　FAD+＋2ATP＋3H2O (2-1-9) 氧化磷酸化中每个氧原子所形成ATP的摩尔数通常称为磷氧比(P/O)，这个参数经常用于能量的计算，此处不作详细介绍。由方程(2-1-8)可以看出，如果NADH是代谢反应形成的唯一辅酶，理论P/O值即为3，但是FADH2的P/O通常小于3。FADH2和NADH之比会随着操作条件而变化，因此P/O不是一个常数。 真核生物的情况可能更为复杂。NADH在细胞质中形成(酵解)，线粒体中也形成NADH。细胞质中形成的NADH不能穿过线粒体膜，它氧化为NAD+是和线粒体中FAD还原为FADH2的反应耦联进行的。细胞质中NADH在FADH2的位置进入呼吸链，所以细胞质NADH氧化的理论P/O只有2。为了计算总的P/O，有必要将细胞质中发生的反应和线粒体中发生的反应区别开来，由于这两种情况下形成的NADH的比率随操作条件而变，一般不能指定P/O的值，除非知道理论值在2～3之间。在实际情况中，氧化反应和磷酸化过程不可能完全耦合，所以P/O值低于理论值。 当缺乏氧或必需的蛋白质导致氧化磷酸化失活时，丙酮酸不能在TCA循环中氧化，否则将导致NADH在细胞内的积累。这种情况下，NADH被氧化的同时，丙酮酸可被还原为乙酸、乳酸或乙醇。这些过程统称为发酵性代谢。发酵性代谢因微生物种类而异。从图2-1-3(a,b,c)可以看出，一些微生物是如何通过发酵性代谢平衡EMP途径产生的NADH的。如果乳酸是最终的代谢产物，所有EMP途径中利用的NAD+都可以再生；而若乙醇是代谢产物时，NAD+就会过剩，因为从碳元素的角度分析，每摩尔葡萄糖最多只能产生2/3摩尔乙醇，其它的碳转化为CO2或甲酸；形成乙酸时，NADH也过剩，同样可得出类似的结果。大肠杆菌的发酵性代谢中可形成图2-1-3中所示的代谢产物，因此，这种现象通常又称作混合酸发酵。大肠杆菌和乳酸菌的主要区别在于大肠杆菌缺乏在丙酮酸降解为乙酰CoA时生成CO2的能力。 图2-1-3 Escherichia(A)，Lactococci(B)和Saccharomyces(C)在葡萄糖上的发酵性代谢 酵母中丙酮酸的代谢(图2-1-3-C)相对更复杂一些。TCA循环中化合物的代谢与合成是从乙酰CoA开始在线粒体中进行的。为了使发酵代谢过程中细胞的氧化还原水平得以平衡，丙酮酸可转变为乙醛、乙酸和乙醇。值得注意的是，细胞质中乙醛氧化为乙酸时会形成NADPH。乙酸可通过乙酰CoA而被代谢(主要通过好氧生长)。酿酒酵母则既不产生乙酸也不产生甲酸，但可摄入乳酸并转化为丙酮酸。 2、生物合成和聚合反应 为了合成细胞物质，需要合成结构单元并将其聚合。E. coli细胞中大约70%的能量和还原力用于合成蛋白质。深入研究发现，细胞对于吉布斯自由能和还原力的需求取决于培养基中是否存在结构单元。因此，若细胞在只含部分结构单元的复杂培养基中生长，就很难对其进行详细的生理学研究，这正是优化培养基组成的困难所在。 合成蛋白质需要消耗大量的自由能，细胞一般根据其自身需求来调节蛋白质的合成。蛋白质的合成由蛋白质合成系统(PSS)负责，该系统中核糖体是主要部分。细胞通过调节PSS的大小和活性来控制蛋白质的合成，因此需要消耗能量。当细胞从能量充足的环境转移到缺乏能量的环境，1～2 h内细胞就可调节PSS的大小来适应新的环境。考虑到PSS的重要作用，可以考虑将其相对大小(g/g干重)作为结构模型中的关键变量。 细胞合成所需要的结构单元数在75～100之间，这些物质都是从12种前体代谢物合成得到的(表2-1-3)。可以发现，这些前体代谢物就是分解代谢反应的中间产物，因此分解代谢在细胞生长过程中起着双重的作用(为生物合成提供能量和前体代谢物)。 表2-1-3 合成E. coli细胞对前体代谢物的需求 前体代谢物 分子式 摩尔质量(g/mol) 需要量((mol/g细胞)  6-磷酸-葡萄糖 C6H13O9P 260 205  6-磷酸果糖 C6H13O9P 260 71  5-磷酸核糖 C5H11O8P 230 898  4-磷酸赤藓糖 C4H9O7P 200 361  3-磷酸甘油醛 C3H7O6P 170 129  3-磷酸甘油酸 C3H7O7P 186 1496  磷酸烯醇式丙酮酸 C3H5O6P 168 519  丙酮酸 C3H4O3 88 2833  乙酰辅酶A / / 3747  (-酮戊二酸 C5H6O5 146 1079  琥珀酰辅酶A / / /  草酰乙酸 C4H4O5 132 1787   TCA循环的中间体用于生物合成会使TCA循环活性降低，所以有必要补加这些化合物。丙酮酸羧化途径和乙醛酸循环是最重要的两条回补途径。在丙酮酸羧化反应中，草酰乙酸可由磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸合成；在乙醛酸循环中，异柠檬酸可转化为琥珀酸和乙醛酸，而乙醛酸可和乙酰CoA反应生成苹果酸。草酰乙酸和苹果酸的生成可保证TCA循环的持续运转。 氮的同化也是细胞代谢很重要的一部分。在大多数合成培养基中，采用氨作为氮源(氨也常作为复合培养基中的补充物)。氨通过结合进入谷氨酸或谷氨酰胺等氨基酸的方式被同化，如方程(2-1-10)和(2-1-11)所示。 C5H6O5((-酮戊二酸)＋NH4+＋NADH＝C5H9O4N(谷氨酸)＋NAD+＋H2O (2-1-10) C5H9O4N(谷氨酸)＋NH4+＋ATP＝C5H10O3N2＋ADP＋～P＋H+ 3、次级细胞代谢 细胞代谢和生长过程偶联在一起的过程，称之为初级代谢。但许多工业上重要的产品，其合成反应并不与生长过程偶联，我们称之为次级代谢，这些反应合成的产物叫次级代谢产物，就象初级代谢形成的产物叫初级代谢产物一样。次级代谢产物最典型的代表是抗生素。一般来说，所有细胞的初级代谢都是相似的，而次级代谢则随细胞不同而异。定义一个代谢产物是初级代谢物还是次级代谢物并不麻烦，但因为所有胞内反应都紧密相联，所以有时要对特定的代谢产物进行分类是有困难的。 最早人们认为，只有与细胞生长过程中形成的才称之为初级代谢产物。乳酸是初级代谢产物，但它是乳酸菌在非生长条件下形成的，许多其它的初级代谢产物也同样是在非生长条件下产生的，因此初级代谢产物定义为“在细胞生长所需要的反应中形成的产物”可能比较确切一些。与之相应，次级代谢产物就可定义为“在那些对于细胞生长不重要的反应中形成的产物”。根据这一定义，胞外蛋白(由插入的基因编码)也是代谢产物，但由于重组蛋白对于细胞功能不是必需的，因此不能称之为初级代谢产物，应当将这类产物归类为次级代谢产物。表2-1-4列出了一些重要的初级和次级代谢产物，其中大部分次级代谢物为抗生素。 表2-1-4 一些工业上重要的初级和次级代谢产物一览 初级代谢产物 次级代谢产物  乳酸 青霉素  乙醇 头孢菌素  CO2 四环素  乙酸 链霉素  柠檬酸 短菌肽  谷氨酸 氯霉素  赖氨酸 卡那霉素  葡萄糖酸 灰黄霉素  核黄素 赤霉素   第二节 发酵过程数量化方法 一、数量化方法的基础 如果把细胞看作是一个黑箱，忽略细胞内部的各种生化反应，仅考虑微生物和外界的营养和物质交换，可以得到深层发酵过程的宏观模式图，如图2-2-1所示。一般情况下，微生物生活在液相中，营养物Si(包括好氧过程中的氧)和产物Pj、CO2及反应热(Hv=容积反应热，J/L)均通过各相及其界面传递。在发酵过程中，传质限制性步骤可能包括4个方面∶(1)气－液界面上的液膜；(2)液相主体；(3)液－固界面上的液膜；(4)细胞壁和膜或固相细胞物质。 图2-2-1 以液相中可观察的拟均相参数来表示的发酵过程原理 X∶生物量；Si∶底物；O∶氧；Pj、产物；C∶二氧化碳；Hv∶容积产热 发酵过程的数量化处理包括：(1)发酵过程的速度；(2)化学计量学和热力学；(3)生产率、转化率和产率。只有当变量可测量时，才有可能对发酵过程进行数量化处理。因此在实践中，要求方便、可靠和迅速地测量这些变量，特别是对发酵过程影响较大的关键变量进行准确测定。一般实验条件下能够检测的发酵过程参数如表2-2-1所示。 表2-2-1 发酵过程常规的参数及其测量 符号 参数 测量方法  X 生物量 细胞干重，浊度，细胞数  S 底物 酶法分析，化学法，色谱法  P 产物 酶法分析、HPLC或特殊方法  X 氧 PO－专用电极分析  C 二氧化碳 ＰCO２－专用电极分析  Hv 发酵热 温度、热平衡   对这样一个带有6个变量的系统进行数量化处理，可基于带有化学计量系数(i的方程进行：  (2-2-1) 这一方程常用于好氧、并产生CO２的分批发酵过程。当然在有些情况下例外，如藻类生长时，利用CO2而产生O2。原则上讲，所有发酵工艺在较宽范围内都是自催化反应。这种催化由方程2-2-1表达。 对发酵过程进行数量化处理涉及很多数学符号，为便于理解，以下对本章即将出现的各种符号的数学含义进行解释。 比生长速率(()、比合成速率(qp、qc或qＨv)和比消耗速率(qs或qo)，与消耗速率(rs或r０)或形成速率(rx、rp、rc、rＨＶ)的概念是不同的。前者表示细胞的个体行为，反映了细胞的生长和代谢能力，是相对速度；而后者所表示的则是细胞的整体行为，是绝对速度。 省略了表示一阶微商的符号，用ri表示反应的绝对速度(ri)，ni表示物质的传递速度，q表示产热速度。 Y和(i分别表示产率系数和化学计量系数；K专门用于表征动力学方程的平衡、饱和或抑制常数。物质的浓度用小写字母表示，大写字母用于表征物质的量(X=x(V)。 反应速度和传递速度的速度常数均用k来表示。带有n级反应的反应速度通常为：  (2-2-2A) 反应速度常数kr取决于反应级数。传质速度为：  (2-2-2B) 式中(C为浓度梯度。传热速度为：  (2-2-2C) 式中(T为温度梯度。kTR 和kHTR是表观传递系数，可用真传递系数(kL1、kL2、kH)和相应的界面面积(aG/L、aL/S、aH)进一步解释。 表2-2-2和表2-2-3对发酵过程优化所涉及的动力学参数的概念进行了解释。 表2-2-2 发酵过程的速度概念 变量 动力学参数 物质传递 热传递  反应速度 定义式  包括     单位 g(L-1(h-1 g(L-1(h-1 kJ(L-1(h-1  比反应速率 定义式  包括     单位 h-1    速度常数 定义式  包括     表2-2-3 发酵过程的化学计量学概念 概念 表示方法  宏观化学计量学 产率，包括  微观化学计量学   平衡常数 K，包括Km、Ks、Ki  二、发酵过程的速度 以最简单的分批发酵过程为例。当反应器容积VR恒定时，表2-2-1中6种参数随时间的变化曲线如图2-2-2所示。其中可观测的参数有：菌体(X)的生长，底物(Si和O２的消耗，产物(Pi、CO２和Hv)的积累。在研究反应器内部物料平衡和过程动力学时，研究者最感兴趣的是这些参数变化的速度。 图2-2-2 反应器容积恒定的分批培养中，发酵过程典型的浓度～时间变化曲线 S，底物；O，氧；X，菌体；C，二氧化碳；P，产物；Hv，热。 那么，如何构建速度方程呢?一般来说需要用质量守恒方程来进行推导或解释。这一方程主要含二项：(1)组分i被合成或消耗的来源和去向；(2)组分i通过单位表面积的物质流ni’(mol/cm2)。物质的流动ni’=d(N/A)/dt，来自各种传递现象，可用不同的术语来描述，例如流动速度v；通过浓度梯度的传导，即扩散D；分散作用Deff；或界面传递kTR。 方程(2-2-3)表示浓度ci随时间的变化。一般，方程可使用矢量符号写成(梯度=带方向坐标的偏微商)：  (2-2-3A) 将各种传递项(，)分开，此方程可以以矢量的形式写成 　 (2-2-3B) 或以单维形式(如用于管状反应器)写成： 　　　　　　　　　 (2-2-3C) 组分i形成或消耗的速度都是明显的变量(g/(L(h))，形成速度为正，消耗速度为负。对于非连续的搅拌罐反应器中物质形成或消耗的速度，方程(2-2-3C)，可简化为： 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 (2-2-3D) 方程(2-2-3D)只有在T、VR为常数且理想混合条件下才是正确的，该式仅代表一种组分形成或消耗的速度。 对于图2-2-2中T、VR为常数且理想混合的非连续反应器中的典型分批发酵过程，菌体生长速度为∶ 　　　　　　　　　　　　　　　　　 (2-2-4A) 氧和底物利用速度为∶ 和　　　　　　　　　　　 (2-2-4B) P、C和HV生成速度为 ，，　　　　　　　　　　　　　 (2-2-4C) 这些速度的单位是g/(L(h)或kJ/(L(h)，其数值可直接代入质量平衡方程。由于这些速度是绝对速度，不能代表系统的特征，为了对不同生物体或不同生物反应系统进行比较，需要用到物质产生或利用的比速率的概念。比速率是一个相对速度，它与生物量(以细胞干重表示)或有催化活性物质的量(如酶量)有密切的关系，一般用式(2-2-5-A～F)这一组方程来定义发酵过程中的各种比速率，其单位均为h-１。 生长的比速率为(∶  (2-2-5-A) 或  (2-2-5-B) 式中(表示细胞数的比增加速率。 底物消耗的比速率为qs∶  (2-2-5-C) 对氧来说，  (2-2-5-D) 产物形成的比速率为qp  (2-2-5-E) 对CO2，  (2-2-5-F) 对HV，  kJ/(g(h) (2-2-5-G) 以上比速率的定义类似于化学反应动力学中比速率的定义。化学反应动力学中非均相催化时，用活性催化剂的量MC给比速率下定义：  (2-2-5-H) 均相催化时，则多使用反应器容积VR(V)定义比速率  (2-2-5-I) 在某些情况下，也可用其它量，例如催化剂的外表面积或固相的体积。 方程(2-2-5-H)和(2-2-5-I)中的Ｎi代表组分i的摩尔数(ci=Ｎi／V)。将其代入方程(2-2-5-I)，就可将方程(2-2-5-I)和方程(2-2-4)的定义联系起来∶  (2-2-5-K) 当Ｖ=常数时，方程(2-2-5-K)与方程(2-2-3-D)相同。 　 为了完整，方程(2-2-5-I)常被用作化学动力学中反应速度的定义。而真反应速度r则通过化学计量系数(i同上述生长或消耗速度(ri或ri＊)联系起来， 　　　　　　　　　　　　　　　　 (2-2-6) (i的符号遵循“消耗为负、形成为正”的原则。由于生物反应中的化学计量系数具有不确定性，故一般难以得到方程(2-2-6)中严格意义上的反应速度。在进行生物反应动力学研究时，用的最多的是方程(2-2-5-A)～(2-2-5-G)给出的比消耗或比形成速率。 发酵过程的自我催化性质可由方程(2-2-7)表示。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 (2-2-7) 三、化学计量学和热力学 (一)化学计量方程 对发酵过程进行优化研究，需要深入考察不同结构反应器中各种代谢反应的数量关系，研究所有与获取最大转化率(或产率)相关的因素，此时需要用到元素平衡原理。平衡可以分为宏观平衡和微观平衡。对在反应过程不发生改变的守恒物质只使用宏观平衡，而对非守恒物质还可使用微观平衡。化学计量学是关于化合物组成和化学反应转化率的数量化研究，与热力学、动力学一起构成反应工程学的基础。热力学只强调系统的起始态和终止态，能给出关于反应可能进行到最大程度及热释放或吸收的信息；动力学主要涉及变化所需要的时间，可用于预测反应的进程；化学计量学则主要研究有关加工过程中反应组分组成的变化规律。 考虑到碳、氢、氧、氮元素的守恒，生物反应器中微生物细胞的活动可以用化学元素的平衡方程(2-2-8)代替方程(2-2-1)来表示：  (2-2-8) 式中，是通用化了的碳源，是根据元素分析得出的细胞组成，为产物。在特殊情况下，元素硫和磷也可以包括进来。方程(2-2-8)是活细胞内成百个代谢反应综合起来的总方程。不生成新细胞和产物的ATP系统和能量处理系统等代谢网内的许多循环和代谢链，都不影响总反应。因此，在使用总化学计量方程进行宏观处理时，并不需要了解这些循环的详细情况，这样可使发酵过程的分析不太复杂，而又不失去重要的信息。 在生物反应中，原子守恒的一般形式是各反应的总和，由下式表示：  (2-2-9) 式中，(为化学计量系数，(为特定的元素。 然而，由于有数百种组分参与代谢，将方程(2-2-9)直接用于生物工艺的化学计量确实存在困难，但可以只将有限的几种化合物用在总生长化学计量方程中。理论上已证明这种方法是合理的。 当复合反应处于稳态()时，可将方程(2-2-3)同方程(2-2-6)组合起来，写成和的形式：　 　　　　　　　　　　 (2-2-10) 这样，可以通过观察稳态时系统与环境之间的交流()来研究反应的化学计量学。当反应系统中没有产物净生成时，有许多量被称为守恒量。这时的平衡方程没有产物生成项。  (2-2-11) 在稳态情况下，上述论据证实了可根据生长和产物形成的总化学计量方程来对微生物代谢进行处理。除了非开放反应器系统的定量化之外，把化学计量学用于发酵过程的主要问题来自代谢反应是个复杂的反应网络。对于简单反应，化学计量学价值不大；而要处理复杂反应，只能借助于用于复杂化学反应的数学方法。在这种情况下，必须建立元素平衡方程。由于这种方法太复杂，人们首先在生物工艺的定量化中使用了一种简单得多的方法──使用产率系数Ｙ的概念。 (二)产率系数的概念 宏观产率系数(或称得率系数)Yi/j是化学计量学中一种非常重要的参数，常用于对碳源等底物形成菌体或产物的潜力进行评价，其中i表示菌体或产物，j表示底物。Yi/j最初是由Ｍonod以质量单位和商的形式定义的： = (2-2-12) 根据这一定义，可以将消耗的量同形成的量关联起来，定量表示细胞或产物甚至热量的产率。产率的概念同样也能用于定量地表示不同消耗量之间或形成量之间的相互关系。表2-2-4对产率系数的定义进行了总结。表中质量组分的单位为(g组分i/g组分j)，有热量时的单位为(kJ/g组分j)。 表2-2-4 生物反应过程中宏观产率系数的定义总览 产率系数 组分间的反应或关系 定义  YX/S S→X YX/S=-rX/rS  YX/O O2→X YX/O=-rX/rO  YP/S S→P YP/S=-rP/rS  YC/S S→CO2 YC/S= -rC/rS  YP/O O2→P YP/O= -rP/rO  YHv/S S→Hv YHv/S=-rHv/rs  YC/O O2→CO2 YC/O=-rC/rO  YHv/O O2→Hv YHv/O=-rHv/rO   有时，以摩尔为单位表示产率系数更有利：  (2-2-13) 异化过程中生成每摩尔ATP时增加的菌体质量，即对ATP生成的菌体产率YATP是研究生化途径分子能量学时的重要参数。微生物通过氧化底物，获得菌体合成、物质代谢、物质传递等生命活动所需的能量，但只有氧化反应中以生成ATP的形式获得的自由能，才能被微生物所利用，其余能量作为代谢反应热释放到环境中。根据这一观点，Bauchop以异化代谢中ATP的生长两作为菌体产率的基准，定义∶  (2-2-14) 式中Ms为底物的分子量，YATP/S为相对于能源底物消耗的ATP产率，即每消耗1摩尔能源底物生成ATP的摩尔数。计算YATP，需要知道作为能源的底物的准确消耗量。在复合培养基上进行的厌氧培养，若培养基中所有碳源几乎都作为能源被分解，不转化为菌体成分，且只限于在底物分解过程中生成ATP时，ATP的生成、利用与菌体合成之间的关系如图2-2-3所示。 图2-2-3 复合培养基厌氧培养过程中细胞的生物合成步骤及ATP的生成和利用 YATP与微生物及底物种类无关，基本为一常数。在复合培养基的厌氧培养实验中观察到，不管微生物和环境的性质如何，YATP总是约为10.5。但该值对微生物生长具有普遍性。在基本培养基中无论是厌氧还是需氧培养，单一碳源中一部分作为能源通过异化代谢分解，其余部分用于同化构成菌体。假设用于同化的这部分碳源与ATP生成无关，则对于异化代谢的碳源亦服从YATP≈10。 把相似的概念用于重要的常数和，可表达为  (2-2-15)  (2-2-16) 值在实践中对推导元素平衡方程很重要，对与氧化磷酸化有关的理论问题也有重要意义。碳摩尔的概念可使产率以摩尔为单位来表达∶  (2-2-17) 根据(2-2-17)的定义，可表示除了碳源和氧以外的底物的细胞产率。 (三)产率系数与化学计量系数的关系 　 在方程(2-2-8)给出的通用化学计量方程的基础上，每种主要元素(C、H、O、N，省略S、P和灰分)都可写成下列平衡方程 摩尔C∶  (2-2-18-A) 摩尔H∶  (2-2-18-B) 摩尔O∶  (2-2-18-C) 摩尔N∶  (2-2-18-D) 在方程(2-2-18-A～D)中，生成碳摩尔细胞的底物()和NH3()的量可以直接测出。通过元素分析能测定细胞和产物的组成，得出(、(、(、(和(’、(’、(’、(’。当底物和产物中没有氮时，，此时测定NH3不是必需的，但有助于检查总精确度。O2和CO2可用气体分析仪测定，求得和。唯一无法方便测定的量是，但可以从方程(2-2-18-B)和(2-2-18-C)的差求得此值。 由方程(2-2-8)和(2-2-18)，能推导出一些重要的产率常数，例如 　 (2-2-19)  其中，r为细胞物质中灰分的分数(r=0.07～0.10)。 依相似的方式，产物的产率为  (2-2-20) 在实践中，通常能方便地由实验数据算出这些产率系数值，并用它们去求出细胞平衡方程中的 、和值。 (四)理论代谢产物产率 假设发酵过程中完全没有菌体生成，则YP/S可达到理论最高值，称之为理论代谢产物产率。可根据以下两种方法进行计算。 1、根据化学计量关系计算。 若完全不考虑反应过程中NADH及ATP等辅助底物的生成和消耗，可纯粹由化学计量关系计算。例如，由葡萄糖、氨和氧生成谷氨酸的化学计量方程为∶  依此计算，=147/180=0.82 2、由生物化学计量关系计算 根据由底物生成目标代谢产物的代谢途径，进行代谢过程中有关NAD(P)+和ATP等辅底物的物料衡算，结合化学计量关系可求出。由于NAD(P)H及ADP的再生过程要消耗底物，故依这种方法求得的要小于单纯依据化学计量关系求得的结果。仍以谷氨酸发酵为例，若(-酮戊二酸的氨基化还原反应中所需要的NADPH由异柠檬酸脱氢反应供给，两个反应构成偶联反应系统，此时由生化计量关系得到的与由化学计量关系得到的一致。如果NADPH由磷酸戊糖途径提供，则反应总方程式变为∶  由该反应式得∶=(147×13)/(12×180)=0.75 如果要用生化计量式求时，必须清楚有关的代谢途径，但这是很困难的，特别是对于抗生素、核酸、维生素及酶等产量小的代谢产物。此时，一般重视产量，而不重视产率。就是计算得到了产率，也是一个非常小的值。 (五)实际发酵过程中的产率系数 在实际发酵中，产率是变化的，所以必须对产率系数的概念进行修正。产率的值明显地取决于各种生物和物理参数。虽然产率因子是限定于特定菌株及特定物质的，但它并不仅是底物的函数。通常产率取决于下列因素： Y=f(菌株、底物、(、m、Ｓ；、tm、OTR、C/N，P/O) (2-2-21) 式中m为混合度，S为底物浓度，为平均滞留时间，tm为混合时间，OTR为氧传递速度，C/N为碳氮比，P/O为磷氧比。 Pirt提出了下列函数式来论证Y与比生长速率((在CSTR操作中以不同的稀释率D来实现，D=()及维持系数ms的关系∶  (2-2-22) 是(接近极限时的Ｙx/s值。方程(2-2-23)可用于计算(和ms对Ｙx/s的影响。  (2-2-23) 方程(2-2-22)不能解释为什么当分批培养的指数生长期中(为常数时，产率仍有变化。另外，对C１利用菌来说，YX/S仅随((或稳态CSTR的D)增加而增加，故这一方程也不适用。Papoutsakis和Lim(1981)用碳流分支的概念来解释菌体产率变化的原因：  (2-2-24) 其中r1和r２分别为碳源分支代谢途径1和途径2的反应速度，MX和MS为菌体和底物的分子量，(x是S→X反应的化学计量系数。在甲基营养菌中存在两种不同的碳代谢流：同化(r2)和氧化(r1)。在适宜条件下，细胞通过反应间的精细调节可导致生成最大的菌体量。根据方程(2-2-24)，产率只随r２或r１变化。而碳源和其它营养物的浓度或温度、pH等培养条件的任何变化都可能引起r２或r１变化。这一概念表明，甲基营养菌菌体产率的变化是一个动力学问题，而不是生物合成问题。 第三节 微生物反应动力学 在微生物反应中，底物消耗和产物生成受微生物生长状态及代谢途径的影响很大。被摄入到微生物细胞内的底物中，一部分转化为代谢产物，还有一部分则转化为新生细胞的组成物质。因此，对微生物反应动力学进行研究，至少要对底物、菌体和产物3个状态变量进行数学描述。当然，有些时候只要能表示出3个变量中的2个，另一个可通过计量关系推导得出。对于仅以培养菌体为目标的微生物反应(如生产面包酵母)和废水的生物处理过程，无须考虑代谢产物的生成速率。 在推导这3个状态变量的变化速率方程时，依据普通化学反应的简单质量作用定律很难解决问题，因为微生物反应是很多种物质参与的复杂代谢过程的综合结果。因此，微生物反应的动力学方程只能通过数学模拟得到。进行数学模拟的难点在于细胞的生长、繁殖代谢是一个复杂的生物化学过程，该过程既包括细胞内的生化反应，也包括胞内与胞外的物质交换，还包括胞外的物质传递及反应。该体系具有多相、多组分、非线性的特点。同时，细胞的培养和代谢还是一个复杂的群体的生命活动，通常每1 mL培养液中含有104～108个细胞，每个细胞都经历着生长、成熟直至衰老的过程，同时还伴有退化、变异。要对这样一个复杂的体系进行精确的描述几乎是不可能的。为了优化反应过程，首先要进行合理的简化，在简化的基础上建立过程的物理模型，再据此推导得出数学模型。 迄今为止，微生物生理学家和生化工程学家关于微生物反应动力学提出了许多数学模型，其中有些是经验模型，也有些是机理模型。这些模型可分为概率论模型和决定论模型两大类，其中决定论模型又可分为均相模型和生物相分离模型，或结构模型与非结构模型，如表2-3-1所示。 表2-3-1 微生物反应动力学模型的分类 模型类型 着眼点 说明  概率论模型 微生物个体 必须考虑每个细胞的差异，以说明某一特定现象；或用以说明平均值附近的波动情况  决定论模型 微生物群体 不考虑每个细胞的差异，而是取菌体性质及数量的平均值进行数学处理  均相模型 微生物群体 是一种认为菌体均匀分散于培养液中，可作为均相处理的决定论模型。  生物相分离模型 微生物群体 是将菌体作为与培养液(连续相)分离的生物相处理所建立的决定论模型。这种模型需要说明培养液与菌体间的物质传递及分配效应。在高菌体浓度时，考虑微生物所占的体积分率，以及解析废水生物处理过程中洒水滤床和旋转圆盘的微生物膜，都是利用生物相分离模型。  结构模型 微生物群体 考虑菌体组成的变化，将活菌体和死菌体分别处理从而建立的模型。在单一菌体的结构模型中，将整个菌体分为两种或两种以上成分，并认为代谢过程是各种成分共同作用的结果。均相模型和生物相分离模型都可分别构成结构模型  非结构模型 微生物群体 与结构模型的主要区别在于它不考虑细胞组成的变化。  一、微生物生长的非结构动力学模型 一般情况下，当菌体细胞组成不随时间而变，即达到平衡生长，或在工业规模操作时细胞组成的影响不大时，适合用非结构模型描述反应过程，但在使用非结构模型时必须注意具体的使用条件，不能任意推广。不同情况下生长与底物消耗随着底物浓度增加而变化的函数关系如图2-3-1所示。 图2-3-1 比生长速率(或底物比消耗速率qs)与限制性底物浓度之间的关系 1∶Monod动力学；2∶带底物抑制的Monod动力学；3∶高浓度菌体下带有底物抑制的Monod动力学；4∶高浓度菌体下带有底物抑制和产物抑制的Monod动力学；5∶高浓度菌体下带有底物抑制、产物抑制和内源代谢的Monod动力学；6∶高浓度菌体下带有底物抑制、产物抑制、双底物顺序利用或生物吸附的Monod动力学；7∶过渡现象，如延迟期。 (一)无抑制作用的细胞生长动力学 温度和pH恒定时，(随培养基组分浓度变化而变化。若着眼于某一特定培养基组分的浓度s，并假设其它培养基组分浓度不变，Monod方程为∶ 微生物生长的速率为∶  (2-3-1) 式中(max称为最大比生长速率(h-1)，Ks称为半饱和常数(g/L)，其值等于比生长速率恰为最大比生长速率一半时的限制性底物浓度。S为限制性底物浓度(g/L)，底物消耗速率方程对应为∶  (2-3-2) 这两个方程间可以通过产率系数关联起来。 现代微生物生长动力学理论起源于Monod方程，到目前为止，该方程仍在理论上占有重要地位。只要满足∶(1)菌体生长为均衡型非结构生长；(2)培养基中只有一种底物是生长限制性底物；(3)菌体产率系数恒定，使(2-3-1)式成立的培养系统称为简单Monod型培养系统。Monod方程形式上与酶动力学米氏方程一致，但微生物生长是细胞群体生命活动的综合表现，机理非常复杂，故很难象米氏常数Km一样，明确Monod方程中参数Ks的确切含义。根据Monod方程，比生长速率和限制性底物浓度的关系如图2-3-2所示。 图2-3-2 细胞的比生长速率与限制性底物浓度的关系 当限制性底物浓度很低时，S<<KS，此时若提高限制性底物浓度，可以明显提高细胞的比生长速率。此时细胞比生长速率与底物浓度为一级动力学关系∶  (2-3-3) 当S>>KS时，，若继续提高底物浓度，细胞比生长速率基本不变。此时细胞比生长速率与底物浓度为零级动力学关系。 Monod方程比较简单，但它不足以完整地说明复杂的生化反应过程，并且已发现Monod方程在某些情况下与实验结果不符合，因此研究者又提出了许多改进形式，有兴趣的读者可参阅相应的生化工程专著或教材。 (二)细胞生长稳定期和延迟期的Monod型动力学 简单的Monod型动力学函数只在微生物生长的指数期和减速生长期适用，经过扩展，可用于延迟期、稳定期和死亡期。图2-3-3给出了分批培养过程的时间曲线。当生长过程出现异常的延迟期时，简单的生长动力学((s)就应当扩展为((s, t) 图2-3-3 微生物分批培养各个生长时期的浓度～时间图 (1)延迟期，tL=延迟时间，(=0；(2)指数期，(=(max；(3)减速期，(=f(s)；(4)稳定期，(=-kd；(5)死亡期(内源代谢期)，kd>0。 1、延迟期动力学模型的建立 微生物生长延迟期可定量表示为∶  (2-3-4) 式中(max和tL可根据图2-3-3确定得出。 2、生长稳定期动力学模型的建立 微生物生长的对数或指数定律，即方程rx=(max (x，经改进后即可用于生长的稳定期。 改进后的形式为∶  (2-3-5) 式中(和(是经验常数。取(=(max和(=xmax，Motta已将此逻辑方程应用于连续生长的培养物的定量研究中。尽管这一改进可以成功地拟合生长曲线，但其缺点比生长速率和底物浓度没有明显的关系。不过，在微生物生长停止时才出现产物形成的情况下，例如抗生素生产过程，方程(2-3-5)具有较好的适用性。 (三)微生物死亡期和内源代谢 1、微生物死亡期的动力学模型 在废物(水)生物处理过程中，微生物随着接触废物时间的延长，死亡机会也会增加，Monod方程就需扩展，方法是在衡算式中引入比死亡速率Kd(h-1)。Kd由下式定义∶  (2-3-6) 这样，对应于由底物生成菌体的一级反应速率为∶  (2-3-7) 这一模型曾成功地用于描述活性污泥处理废水的过程。 从图2-3-4可以看出忽略Kd对线性化作图求解Monod方程参数的影响∶Ks甚至出现了负值。 图2-3-4 使用双倒数作图法表示的内源代谢对估算微生物生长动力学参数的影响 显然，已知Kd值，只有按式(2-3-8)作图，方可求出正确的(max和Ks。  (2-3-8) 活细胞由于内源代谢逐渐丧失内源物质而变为死细胞，因此需要用结构模型来描述这一现象。Sinclair和Topiwala将活细胞死亡速率和内源代谢速率分别假设为Kd0和Ke。图3-2-5表示在CSTR中，细胞量(X)与稀释率(D)的关系，其中∶  (2-3-9) 可以看出，真实死亡速率对细胞产率系数的影响仅在稀释率很低时才显著，这表明只有在接种物的活性非常低的分批培养中才会出现明显的延迟期长的现象。 图2-3-5 CSTR中考虑活细胞死亡速率和内源代谢速率时生物量浓度与稀释率的关系 2、内源代谢的动力学模型 在热力学上远离平衡态为特征的活细胞，为了维持其生命活动，必须获取高能物质并将化学能转变为热能，用于维持渗透压，修复DNA、RNA及其它大分子。因此，能量不仅消耗于象细胞生长这样的宏观反应上，也要消耗在维持细胞结构中。考虑到这一因素，物料平衡方程中就必须引入描述维持概念的ms∶  (2-3-10) 其中  (2-3-11) 式中∶Y*X/S为最大细胞产率，是细胞干重与完全消耗于细胞生长的底物的质量浓度之比，它表示在没有维持代谢时的细胞产率；ms为细胞的维持系数，单位为s-1。 式(2-3-10)两边同除X，得到∶  (2-3-12) 由于，故式(2-3-12)可以变形为∶  (2-3-13) 式中，YX/S是相对底物总消耗而言的细胞产率；而Y*X/S则是相对用于细胞生长所消耗的底物而言的细胞产率。 以式(2-3-12)的qs对(或以式(2-3-13)的1/YX/S对1/(作图，均可求出Y*X/S和ms值。 (四)底物和产物抑制的动力学模型 在大多数抑制情况下，Monod型的动力学方程是从简单的酶抑制机制理论引申得出的。这些方程仅仅是人为假设的，因此也可用其它合适形式的模型来代替。 1、底物抑制动力学。 同酶催化反应类似，当培养基中某种底物浓度高到一定程度后，细胞的比生长速率随该底物浓度的升高反而下降，表现出底物抑制作用。最常用的描述底物抑制的模型是Andrew根据连续培养中底物的抑制情况提出的普遍化底物抑制模型∶  (2-3-14) 式中KIS是底物抑制常数。方程式(2-3-14)的函数曲线见图2-3-6所示。 图2-3-6 有底物抑制情况的动力学曲线之一 可根据该图估计方程中的参数值。当S>>KS时，方程(2-3-14)可以变为∶  (2-3-15) 由该式可求得KIS值。 2、产物抑制动力学 细胞的一些代谢产物有时会影响细胞的生长，如酵母在厌氧环境下产生的乙醇积累到一定浓度后会抑制酵母的生长，乳酸菌产生的乳酸会抑制乳酸的生长等等。Hinshelwood研究了产物浓度对细胞比生长速率的影响，对几种可能的影响形式进行了分类，认为有线性下降式、指数下降式或分段函数式，如图2-3-7所示。 图2-3-7 几种产物抑制的模型曲线 1，线性；1a，一级下降；2和2a，先不影响后下降；3，突然中止 当不存在临界浓度时，一般的线性关系为∶  (2-3-16) 式中，P为产物浓度，k为动力学常数。该式也可通过类似于酶动力学的方式进行摹拟∶  (2-3-17) 式中KIP为产物抑制常数。这个模型曾被用于计算机模拟非连续培养中的生长，是最常被使用的模型方程。 二、微生物产物形成动力学模型 微生物反应生成的代谢产物非常复杂，涉及范围很广，包括醇类、有机酸、氨基酸、酶、核酸类物质、抗生素、维生素、生理活性物质等，并且由于细胞内生物合成的途径十分复杂，其生物合成途径和代谢调节机制也各具特点，因此，至今为止还没有统一的模型可用来描述产物形成动力学。 Gaden根据产物生成速率和细胞生长速率之间的关系，将产物形成区分为三种类型。 类型Ⅰ∶也称为偶联模型。是指产物的生成与细胞的生长偶联的过程，这类代谢产物通常是主要能源分解代谢的直接结果，因此代谢产物的生成与微生物生长是完全同步的，例如生产醇类、葡萄糖酸、乳酸等产品。其动力学方程可表示为∶  (2-3-18)  (2-3-19) 式中，YP/X为单位质量细胞生成的产物量。 类型Ⅱ∶也称部分偶联模型。是指反应产物的生长与底物消耗存在部分偶联的过程，这类代谢产物通常是在能源代谢中间接生成的，代谢途径较为复杂，例如柠檬酸、氨基酸的生产。此类反应中代谢产物的生成速率与底物的消耗速率之间虽然存在一定关系，但比Ⅰ型要复杂得多。其动力学方程可表示为∶  (2-3-20) 式中，(、(为常数，等号右边第一项与细胞生长有关，第二项仅与细胞浓度有关。  (2-3-21) 式(2-3-21)称为Luedeking-Piret方程。服从该方程的微生物反应系统有∶葡萄糖转化为乳酸；葡萄糖转化为乙醇；乙醇转化为乙酸；山梨糖醇转化为D-乳糖；萘转化为水杨酸等。 类型Ⅲ∶也称为非偶联模型。指产物的生成与细胞的生长没有直接关系，当细胞处于生长阶段时，并没有产物积累，而当细胞生长停止后，产物却大量生成，例如抗生素、酶、维生素、多糖等次级代谢产物的生产。其动力学方程可表示为∶  (2-3-22)  (2-3-23) 从图2-3-8和图 2-3-9中我们可以对这三种类型的动力学特征有一个比较清楚的认识。 图2-3-8 三种微生物反应类型中产物、菌体、底物浓度随时间的变化曲线 Ⅰ，生长偶联模型；Ⅱ，部分生长偶联模型；Ⅲ，非生长偶联模型 图2-3-9 三种微生物反应类型中产物形成、菌体生长和底物消耗比速率随时间变化曲线 Ⅰ，生长偶联模型；Ⅱ，部分生长偶联模型；Ⅲ，非生长偶联模型 除了上述三种类型外还有两种模型，一种是qP与(负偶联的模型，例如黑曲霉生产黑色素，其qP与(的关系可表示为∶  (2-3-24) 另外一种是qP与(没有关系的模型，这种类型一般情况下比较少，只适用于休眠细胞中。细胞本身代谢仅利用少量底物，只起到酶载体的作用。如利用酿酒酵母进行甾体转化和生物合成维生物E的过程。 当考虑到产物可能存在分解时，则方程(2-3-20)可改写为；  (2-3-25) 式中，kd为产物分解常数。此外还有细胞活性分布模型，细胞成熟模型，细胞年龄分布模型和细胞成熟时间模型等等。 三、多底物动力学 实际的生物过程，像废水生物处理和以多碳源复合培养基为底物时，由于存在多种底物，因此不能用简单模型方程来描述。微生物在多底物的培养基中生长时，容易利用的底物在短时间内先被耗尽，为了利用剩余的成分，微生物必须先合成相应的酶。在整个过程中，细胞将产生一系列生长期，每个生长期的生长速率都会逐步下降。图2-3-10描述了双底物反应的动力学曲线，可区分为依次利用、同时利用和两者交叉过渡的几种情形。 图2-3-10 双底物反应的动力学过程 底物严格依次利用(二次生长)；b，底物部分交叉利用；c，底物同时利用 以下仅对底物依次利用动力学进行简单阐述。底物依次利用的一般化方程可用下列关系式来表示∶  (2-3-26) 式中，fr是只要培养基中还存在S1时，S2的利用就受到分解代谢阻遏控制的一个形式表达式。对于遵循式(2-3-26)的二次生长，Imanaka和Moser分别提出了一个相似的方程，用简单关系∶  (2-3-27) 及  (2-3-28) 来表示调节作用。KR为分解代谢阻遏常数。 在啤酒酿造工艺中，葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖依次被利用。Fidgett曾用一个简单的糖利用动力学模型来描述啤酒酵母在发酵过程中对麦芽汁的利用情况，其中使用了一个临界浓度的概念。这个临界浓度可被看作从利用第一种限制性底物到利用第二种限制性底物的启动开关。依次利用现象在一个时期内基本上仅采用一种限制性底物，用一个带有附加项的方程来表示(式2-3-26)，有时候，最终的方程也会出现许多项。 Moser在带有部分交叉利用的双底物动力学中使用了另一个临界底物浓度的概念。这个浓度可以直接测量。S1,crit值是短时间内S1和S2同时利用的浓度，因此下式  (2-3-29) 可用于代替方程(2-3-26)的fr。 第四节 微生物反应优化的一般原理 一、发酵过程优化的一般步骤 在对发酵过程进行优化时，应遵循的基本原理和步骤包括：简化、定量化、分离、建模型，最后把分离开的现象重新组合起来，以下分别阐述。 (一)反应过程的简化 微生物反应是一个复杂的过程，不简化不可能对其进行研究。发酵过程的简化是指把工艺过程的复杂结构压缩为少数系统，这些系统可以用关键变量来表示。由于生物系统含有生物学和物理学两方面的属性，因此，进行简化必须不损失基本信息。这样，才能保证实验和理论研究在实现目标的同时确保对系统描述的精确性。 如图2-2-1所示，悬浮在生物反应器液相中的微生物细胞被当作黑匣子，这就是一种简化。简化的结果是从宏观上通过分析、计算液相中各种浓度的变化来间接地反映细胞中发生的代谢反应，如代谢通量分析方法可以通过胞外浓度的变化计算得出胞内各条代谢途径的通量变化。简化对构建生物工艺过程动力学模型也是很重要的。 (二)定量化 对发酵过程进行定量分析需要系统、准确地检测各种参数。因此，在对发酵过程进行研究时，能否获得比较准确的过程参数对优化策略的适用性是非常重要的一个环节。然而，由于生物系统的复杂性，特别是可能发生在生物、物理、化学现象间的相互作用，再加上检测方法的不完善，往往会使实际的分析结果出现很大的偏差。所以，对分析方法的选择很重要，以保证测定结果的可用性和代表性能够满足优化的要求。 (三)分离 分离是指在生物过程和物理过程的各种速度相互不影响的情况下，精心设计实验以获得关于生物和物理现象的数据。细胞在反应体系中以固相存在，很明显，现在的技术还不能直接检测到发生在固相内部的反应。因此，只能通过计算机模拟的方式，通过检测液体培养基中的外部变化，来反映代谢反应的内部变化。分离原理是合理应用数学模型的一个重要的前提条件 (四)数学建模 数学模型是能以简化的形式表征过程行为，并实现特定目的的数学公式。数学模型可将特定结果通用化，并为推论系统的其它性质提供基础。建立数学模型的主要目标是：(1)为了预见任何系统的转化率或生产率；(2)用以检查在各种操作条件下工厂操作的性质和行为，检查模型适用的范围(包括外推性)；(3)用于进行工艺优化和计算机模拟；(4)用于检测出可能重要但被忽视了的参数；(5)检查是否已有效地区分生物现象和物理现象；(6)有助于阐明反应机理。 二、分批微生物反应过程的优化 分批微生物反应也和一般的分批化学反应相同，总希望以最小费用获得最大产量。使用现有反应装置，且只限于反应操作而言，生产成本主要来源于原料费和操作费，其中操作费主要包括通气和搅拌所需的能耗费用。作为最优化的目标函数，可以取产量、生产率、纯利润等，有时也对这些指标的其中2个以上进行多目标函数优化。 最优化的操作变量有反应时间、培养基组成、温度、pH、溶氧等，下面以培养基组成、温度和酶催化反应为例对最优化方法作简单介绍。 (一)培养基组成的优化 微生物生长需要许多营养物质，这些营养物质共同影响着菌体生长和代谢产物的形成。微生物培养基的配方，疫是参考以往的报道或根据经验确定的，因此在每一个研究刚开始时，有必要考察所用培养基的各组分含量是否必要或是否被微生物充分利用。在分批培养中，所有的培养基组分一次性投入，不在中途调节和控制其浓度，因而底物浓度一直下降，变化幅度很大。无论rX、rS、rP等速率参数在反应中与底物浓度有怎样的对应关系，仅根据化学计量关系确定营养物的初始浓度，也是比较合理的。即预先设定XT为最大菌体浓度，则由可得到底物Si的初始浓度为∶  (2-4-1) 无机离子或生长因子等一旦被细胞吸收，在细胞内保持原化学状态，且含量恒定不变。这类营养物质称为储存性底物。可根据这些物质在菌体内的实际含量，用类似于式(2-4-1)的方法确定其需要量。 当代谢产物的产量与培养基组成之间的关系很复杂，不能用解析函数的方式表示时，可采用实验设计法确定最优初始浓度。以下简要说明其原理。 设产量Pf与各培养基组分初浓度()之间存在一定相关关系，表示为∶  (2-4-2) 但是没有具体的函数形式。因此在所涉及的浓度范围内，可对如下线性或二次函数模拟回归，以此作为响应函数∶ 线性模型∶  (2-4-3) 二次函数模型∶  (2-4-4) 在的某一点P1附近根据实验设计法适当地改变各种培养基组分的初始浓度进行实验，从而推算系数。然后沿着式(2-4-3)或式(2-4-4)所表示的响应曲面的一个最大倾斜方向即Pf的梯度方向选取下一个实验点P2，根据由P1的实验求取的响应曲线，预测P2点的响应值Pf。同时在P2点作实验并测定Pf，若P2的实验值与预测值不一致，再在P2点附近进行第二次实验设计。按照这种方法反复进行实验，寻找直到找到Pf最大时的培养基配方。这种最优化方法称为梯度法，或称最快下降法或登山法。对于二元变量最优化的梯度法的原理如图2-4-1所示，可见这种方法在每次迭代中总是沿着一条与等高线垂直的方向前进的。推算系数(i或(ij可采用Box-Wilson法和单纯形法等实验设计方法。 图2-4-1 用梯度法进行二元变量最优实验设计的原理 利用最优实验设计法，即使不能提高产量，也可探索培养基组分的最小需用量，从而避免不必要的浪费。 (二)反应温度的最优化 分批微生物反应过程中，并非一定要一直保持恒温，因为微生物生长的最适温度并不一定与生成代谢产物的最适温度相等。例如生产青霉素的Penicillium菌的生长速率在30℃时最大，而青霉素合成速率却在较低温度(15～20℃)时最大。一般在二者的中间值(25℃)进行定值恒温控制，但若采用适当的方法对反应温度进行优化则有可能进一步提高青霉素产量。 为了运用最优控制理论，需要建立描述对象系统状态特征的数学模型。若数学模型不能正确表达系统的特征，得到的最优解是不可靠的，因此，数学模型必须尽可能正确。检验模型可靠性的过程称为模型辨识。运用统计方法比较了青霉素发酵的几种模型的适用性后，可提出以下模型∶  (2-4-5)  (2-4-6) 式中，X、P和(分别为菌体浓度、产物浓度和时间的无因次量，从延迟期后开始计时和测定。式(2-4-5)为青霉素生产菌株的生长方程，式(2-4-6)右边第二项则表示生成的青霉素的自发分解。在不同温度下通过实验可以研究系数k1～k4与温度的关系。使青霉素产量最大的最优化问题在数学上意味着∶在X和P的初值条件下根据状态方程(2-4-5)、(2-4-6)及系数k1～k4与温度的关系，在时间(=0到(=(f的范围内，求满足目标函数P((f)最大时，各个不同时间(时的温度T(()，即确定函数T(()的具体形式。这是一个最优规划问题，求解的数学方法有许多种，其中最常用的是有庞特里金完善的最大(小)值原理和贝尔曼提出的动态规划法。对于上述问题，宜采用最大值原理求解，结果如图2-4-2所示。 图2-4-2 青霉素分批发酵过程的最优化温度控制 可见在发酵过程中，培养初期为了在短时间内获得一定量的菌体，故保持较高温度；为了使青霉素生成速率最大，降低了温度。采用这样的控制策略进行最优化控制，青霉素产量比恒温控制可提高76%。 (三)酶催化反应优化 对简单的酶催化反应，在进行分批反应时，考虑的变量主要是时间Tf，因此在分批操作中，每一操作周期都包括反应时间和辅助时间。对一定的反应和反应器，其辅助时间是一定值。在反应过程中，反应底物浓度是逐渐下降的；反应产物的生成速率则随着底物浓度的降低而下降。随着反应时间的延长，底物的转化率会逐渐提高，产品的产量亦会增加，但以单位操作时间计算的产物产量(即生产率)并不一定增加，若以生产率为目标函数，就必然存在一个最优反应时间，使该函数值最大。 对一定反应∶S→P 若产物浓度为P，则生产率(PO)为  (2-4-7) 式中，VR为反应器体积，TR为反应时间，TB为操作时间。为使PO最大，对反应时间TR求导并令其为零，得到∶  (2-4-8) 求解得到∶  (2-4-9) 式中，TR,opt为最优反应时间。此式为单位时间产物产量为最大所必需满足的条件，并由此可用图解法求出最优反应时间。首先作出底物浓度、产物浓度随反应时间的变化曲线，然后过原点沿横轴负方向截取OA，A点坐标为(-TR，0)，然后从A点作产物浓度～反应时间曲线的切线AB，则B点所对应的反应时间即为最佳反应时间。最佳反应时间对应的产物浓度为最优产量Popt，切线AB的斜率也等于dP/dTR。 需要指出的是，上述结果是以单位时间产物产量最大为目标函数计算得到的，如果以消耗原料最少为目标函数，则反应时间愈长，原料消耗愈少。因此，优化目标函数不同，结果就不相同，这一点在进行具体优化时特别重要。综合考虑各方面的因素，应当以生产费用最低作为目标函数较为适宜。 本章介绍了发酵过程的数量化方法、模型建立和一般性的优化原理，从第三章开始，作者将结合研究实例，从系统优化和过程优化两个方面出发，对发酵过程优化作更深入、更具体的阐述，其中包括系统组合操作优化、分批发酵过程优化、流加发酵过程优化、代谢网络构建和代谢通量分析、各种参数(温度、pH、溶氧、搅拌转速等)的优化控制策略等。 第二章主要参考文献 Delgado J, Meruane J, Liao JC. 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