第四章 赖氨酸发酵过程优化 1 第一节 赖氨酸发酵概述 1 一、研究背景 1 二、发酵法生产赖氨酸技术的发展 1 三、本章研究的目的和主要内容 3 第二节 赖氨酸生产菌FB42的获得 5 一、引言 5 二、出发菌株FB21的遗传特性 5 三、FB31菌株摇瓶发酵性能的初步研究 6 四、赖氨酸产生菌FB42的获得 8 五、环境因子对FB42分泌赖氨酸的影响 10 六、响应面分析法优化FB42菌株发酵培养基 12 第三节 连续培养中FB42菌株的动力学特性及其代谢流分析 15 一、引言 15 二、连续培养中的操作特性 15 三、连续培养中赖氨酸发酵的动力学特性 17 四、FB42的真实转化率 19 五、赖氨酸发酵的最大理论转化率 19 六、黄色短杆菌 FB42的代谢流分析 23 第四节 分批发酵过程的控制及分批发酵动力学 25 一、引言 25 二、初糖浓度对发酵的影响 25 三、溶氧对发酵的影响 26 四、pH对发酵的影响 28 五、发酵过程的溶氧与pH控制 28 六、赖氨酸分批发酵动力学 30 七、分批发酵动力学模型的评价 34 八、分批发酵的模型分析 35 第五节 赖氨酸流加发酵的最优控制 37 一、引言 37 二、最小值原理简介 37 三、连续系统的最小值原理 38 四、流加发酵系统的最优化问题 40 五、流加发酵最优控制的算法 41 六、赖氨酸流加发酵的优化控制 45 第四章 赖氨酸发酵过程优化 第一节 赖氨酸发酵概述 一、研究背景 1889年Drechsel用酸水解干酪素，经分离谷氨酸后在不含氯化物的水解液中加入硝酸银得到一种碱性物质，其组成为(C6H13N2O2(AgNO3(HNO3)，后来被证实为赖氨酸和精氨酸的混合物。1891年Fisher和Drechsel 分别从干酪素的水解液中得到纯的赖氨酸(C6H13N2O2OHPtC15)。此后，Fisher于1902年确证了赖氨酸的化学组成。赖氨酸的分子结构中含两个氨基和一个羧基，是一种碱性氨基酸。 赖氨酸名列八种必需氨基酸之首，被认为是谷物蛋白的第一限制性氨基酸，在谷物食料中添加适量的赖氨酸，其蛋白质的功效大大提高。如玉米中添加0.4%的赖氨酸，玉米蛋白的功效提高2.1倍；大米中添加0.2%的赖氨酸，大米蛋白的功效提高1.7倍等。赖氨酸的应用范围很广：作为食品强化剂，对儿童的发育、智力，妇女妊娠期的保健、病人的治疗及病后的恢复都有明显的效果；作为药物可用作肝细胞再生剂，对改善肝功能，治疗肝硬化、高氨症，增进食欲、改善营养状况有明显的疗效；作为饲料添加剂，在畜、禽类的饲料中添加少许的赖氨酸，对家禽、家畜的日增重、料肉比、家禽的产卵量等方面效果尤为显著。 赖氨酸是仅次于谷氨酸的第二大氨基酸产品。按配合饲料中0.1%的平均添加量计，仅饲料用赖氨酸，国内需求量2000年和2010年将分别达到8万吨和10万吨。但我国赖氨酸工业发展缓慢。1992年年产饲料用赖氨酸4959吨，到1994年约6000吨，1997年接近2万吨，但仍远不能满足市场需求，需要大量进口。所以，从供需情况来看，我国赖氨酸市场前景看好。也正如此，近年来，赖氨酸工业化生产成了国内一些投资者的兴趣之一。国内需求增加而供应不足是导致赖氨酸市场大起大落的内因，国际市场的冲击则是外因。在我国赖氨酸工业薄弱的情况下，国内赖氨酸市场乃至整个赖氨酸工业易受国外大集团的控制。因此，迅速提高我国的赖氨酸生产水平，发展赖氨酸生产能力意义重大。 二、发酵法生产赖氨酸技术的发展 (一)赖氨酸的生产方法概述 赖氨酸的生产方法有：水解法、合成法、酶法和直接发酵法。赖氨酸最早由蛋白质的水解而制成，目前在赖氨酸的工业化生产中水解法已经淘汰。以己内酰胺、二氢吡喃、环己酮、呱啶为原料合成L-赖氨酸已有报道。但因合成法制成的中间体为D，L-赖氨酸，进一步的分离工艺很复杂，美国Allied和联邦德国Deguess公司多年来从事L-赖氨酸合成法的研究，至今未见大规模的生产报道。 见诸报道的酶法生产赖氨酸工艺有∶(1)合成(-苯甲酰-(-乙酰-DL-赖氨酸，采用消旋酶处理制成(-苯甲酰-L-赖氨酸，经酸水解得产品；合成DL-4-氨基丁基乙内酰脲，采用微生物酶使其转变为L-赖氨酸；由环乙烯合成DL-氨基己内酰胺采用水解酶和消旋酶共同作用使其变成L-赖氨酸。其中，第三种工艺已用于赖氨酸的工业化生产。该法的发明者富村隆最初找到了可水解L-氨基己内酰胺的罗伦隐球酵母(Cryptococcus Laurenti)，然后又发现具有DL-氨基己内酰胺消旋酶活性的新细菌──无色杆菌(Achomobater obeaa)，通过这两细菌的共同作用，DL-氨基己内酰胺可被转化为L-赖氨酸，该法得率高，适于大规模生产。富村隆研究的酶法生产赖氨酸工艺，在学术和工业上都得到了较高的评价，1980年曾获日本科学技术奖。日本东丽株式会社1976年使用上述合成酶法生产工艺制造赖氨酸，至今已形成年产8000吨规模。但总的来说，酶法对原料成本的依赖性很大。发酵法生产赖氨酸原料来源广泛，且生产的赖氨酸均为L-型，因此在赖氨酸的生产中发酵法占据主导地位。目前世界上赖氨酸的年产量已突破20万吨，主要厂家列于表4-1-1，其中90%以上的企业采用发酵法。 表4-1-1 世界主要赖氨酸生产厂家 公司 厂址 规模(万吨/年) 制法  味之素 日本，九州佐贺县 2.0 发酵法  协和发酵 日本，山口县防府 1.5 发酵法  哈特兰德赖氨酸公司 美国，依阿华州 2.0 发酵法  生物协和发酵 美国，蜜苏里州开普吉拉多 1.36 发酵法  ADM公司 美国，依利诺斯州迪凯特 4.7 发酵法  亚吉诺莫托公司 美国，北卡罗来纳州罗利 不详 发酵法  欧洲赖氨酸公司 法国，亚眠 2.0 发酵法  日本味之素泰国公司 泰国，曼谷 0.2 发酵法  东丽公司 日本，名古屋 0.8 酶法  费埃尔麦克斯 墨西哥 0.6 发酵法  协和与匈联营公司 匈牙利，布达佩斯东 0.5 发酵法  塔拉戈纳化工公司 西班牙，巴伦西亚得塘湖安 0.6 发酵法  台湾糖业公司 台南市 0.4 发酵法   南斯拉夫，伏伊伏丁那日蒂什泰 2.6 发酵法   拉托维亚，利瓦尔 1.32 发酵法  合计  21.58   (二)发酵法生产赖氨酸 微生物的赖氨酸合成途径1950年以后逐渐被阐明。Cilvery等首先报道了肠杆菌属的一株代表菌结肠芽胞杆菌赖氨酸的合成途径，随后椎尾男等研究了黄色短杆菌赖氨酸的合成途径，Tosaka等对乳糖发酵短杆菌的赖氨酸合成途径进行了研究。对生物赖氨酸的合成途径解析后发现：赖氨酸的合成与其它氨基酸不同，存在两条途径即二氨基二酸途径和(-氨基乙二酸途径，前者存在于细菌、绿藻、原生质、高等植物中，后者存在于酵母霉菌中。 1957年，日本开始采用野生菌株发酵生产谷氨酸，1960年用谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型变异株生产赖氨酸。60年代中期，我国开始赖氨酸发酵菌株和工艺条件研究。1974年中科院微生物研究所诱变谷氨酸生产菌北京棒杆菌AS 1.229得到营养缺陷型变异株AS 1.563，产酸17.9 g/L，进一步诱变得到AECr变异株，产酸达50 g/L。70年代后期，上海、黑龙江、广西和江苏等地积极开展赖氨酸菌种筛选工作，如上海天厨味精厂得到AECr和高丝氨酸缺陷双突变株，产酸36～37 g/L；中科院微生物研究所和常州味精厂合作筛选到产酸48～53 g/L的钝齿棒杆菌，通过发酵中试技术鉴定。上海工业微生物研究所从黄色短杆菌2030出发经一系列诱变筛选得到抗性和营养缺陷型双突变株，其中的FH(128菌株在16 L小罐发酵70 h产酸130 g/L以上，5 m3罐中试发酵65～69 h，产酸92.2～95 g/L，转化率为40.2 %左右，达到国际先进水平，但至今未有工业化报道。 广西南宁赖氨酸厂于80年代投产后，与广西生物化工研究所协作一直进行赖氨酸生产菌改良和发酵工艺改进，得到分别以糖蜜和淀粉糖为原料的高产菌株，以淀粉糖为原料30 L罐发酵产酸120～130 g/L左右，该厂还获得了可耐高温生产菌，37 ℃下发酵，赖氨酸产量基本不受影响。无锡轻工大学80年代初就开始赖氨酸生产菌选育和发酵工艺研究，从谷氨酸产生菌AS 1.495诱变得赖氨酸产生菌F11(519，产酸57.4 g/L。再经原生质体融合和化学、物理诱变等手段得到多重变异株FB21，摇瓶产酸70 g/L，这在80年代末为国内领先水平，但未进行发酵中试和工业化。 总之，国内赖氨酸发酵研究起步较早，实验室研究水平也不低，但高产菌实现工业化比例较低；另外，研究多局限于菌种改良和优化发酵的环境条件，对各种培养条件下的优化控制研究不多，或与实际生产脱节。 (三)我国赖氨酸发酵工业现状 20世纪80年代初，国内开始进行赖氨酸发酵中试，并兴建赖氨酸发酵厂，特点是产酸水平和转化率低、规模小。“七五”期间，国家在广西南宁、福建泉州、湖北武汉及吉林九站建了四套年产1000吨的赖氨酸生产装置。武汉制药厂因无原料早已改产，吉林九站的装置长期生产不正常，已停产。广西南宁赖氨酸厂于1987年投产，现增至6000吨/年的生产能力，并计划于“九五”期间扩大到1万吨/年的生产能力，但在近期赖氨酸销售价格大幅度回落的情况下，其扩建计划受到了影响。福建泉州赖氨酸厂1989年与正大集团合资后改名为“泉州大泉赖氨酸有限公司”，生产能力为5000吨/年左右，使用国外菌种和技术。四川川化味之素公司是中日合资企业，赖氨酸生产能力为6000吨/年，使用日本菌种和技术。 以上三家企业为我国最主要的饲料用赖氨酸生产厂家，其总生产能力也不过略高于1.5万吨/年，而仅美国ADM公司年产赖氨酸就达12万吨以上；而且，其中只有广西一家是拥有自己的菌种和技术的国内赖氨酸生产企业，该厂主要以糖蜜为生产原料，产酸达到80 g/L以上，对糖转化率38%左右，在国内属先进水平，但跟日本等国的赖氨酸生产水平(日本味之素公司发酵法生产赖氨酸盐酸盐浓度为120 g/L左右，转化率可达50 %)相比尚有很大差距。年产赖氨酸千吨以上规模的还有上海天厨味精厂，其产品主要作药用，但目前已停产。 我国赖氨酸行业的特点是∶总生产能力小、企业规模小、生产水平低，因而发展困难。在这样的情况下，国内赖氨酸市场难免易受国际市场冲击，而且将来可能受外国企业的控制，目前国内主要赖氨酸生产厂家中合资企业占很大比例即是一个信号。所以应尽快发展我国的特别是我国自己掌握全套生产技术的赖氨酸生产能力，使赖氨酸产品最终能象谷氨酸那样具有完整、强大的工业生产体系。 三、本章研究的目的和主要内容 1987年以前，我国饲料用赖氨酸全部进口，主要来自日本味之素公司。1987年8月，广西赖氨酸厂的产品投放市场，但不能满足国内的需求。90年代以后，世界上赖氨酸产量最大的美国ADM 公司的产品进入中国市场，1992年我国进口赖氨酸9672吨。根据我国饲料工业的发展计划，1995年需求赖氨酸1.2~1.3万吨，到2000年增加至2.5万吨。这样一个广阔的市场，其技术、产品一旦掌握在他人手里，对国家未来的发展极为不利。我国赖氨酸生产技术虽然取得了长足的进步，但与国外先进水平相比仍有差距(表4-1-2)。因此实现我国赖氨酸工业化生产的低消耗、低生产成本、高效率，建立起具有竞争力的生产体系是一个迫切需要解决的问题。 发酵是赖氨酸工业的心脏，发酵水平的高低是工厂的命脉。提高发酵水平有两条途径：一是筛选出优良的菌株，二是得出与目的菌株相匹配的最佳培养条件、控制手段。前者是建立在代谢控制发酵研究上的菌种选育技术，后者是建立在生化反应工程基础上的发酵过程控制技术。只有两者紧密地结合才能最终实现发酵的高水平，而后者正占据着越来越重要的地位。例如，味之素公司的研究人员曾报道，乳糖发酵短杆菌变异株AJ11204在摇瓶条件下48 h产赖氨酸为4.3%，但在小型发酵罐中，通过控制培养条件，48 h产酸水平可提高到7%。如此类似的结果不仅在赖氨酸研究中，而且在其它发酵产品的研究中也时有报道。 表4-1-2 我国与日本发酵法赖氨酸生产(商业规模)技术指标对照 生产技术指标 日本 我国  产酸水平 / % 10 4.5~6.5  转化率 / % 50 35  提取率 / % 86~95 71~90  工厂最大规模 / 万吨(年-1 1.5 0.3  生产成本比值 1 2  电耗 / kwh(t-1 1600~2200 9117   我国学者对赖氨酸的研究长期以来都把工作重点放在高产菌株的选育上，有关如何对发酵过程进行优化与控制的研究较少。实际生产中所需的一些培养控制条件、技术指标往往在摇瓶条件下获得，这种低水平的研究方法客观上制约了菌种潜力的进一步发挥。不仅如此，由于在摇瓶条件下无法对目的微生物生理生化特性、营养供给及操作、发酵设备三者之间建立起有机的联系，当反应器规模发生变化时发酵结果常常不能重复。而这一点正是国内发酵法生产赖氨酸从60年代中期开始研究至今，多次出现随生产规模扩大(从摇瓶到中试至大生产)过程中发酵水平降低的根本原因所在。 实现发酵过程的最优化，使菌种的潜力充分发挥，是发酵技术的一个最高境界。国外有关发酵过程最优化的研究非常活跃，这在我国还几乎是一个空白，不能不说是一个遗憾。在赖氨酸发酵的最优化研究方面，虽然1973年就有了关于流加发酵最优化的研究报道，1985年Lim等进一步完善了最优化理论，并针对赖氨酸发酵进行了讨论，但所有这些研究所讨论的问题仅仅是最优控制的数学求解，而对赖氨酸发酵过程的动力学解析相对缺乏，由此所得出的控制方法的适用性值得怀疑。发酵过程的最优化的研究。必须从微生物反应过程的定量解析入手，由于其中所涉及的理论问题非常广泛，从文献资料报道来看，目前真正针对某一具体发酵产品进行过程控制最优化的研究，并成功用于指导实践的报道几乎没有。 考虑到国内赖氨酸的高产菌株多集中于黄色短杆菌，我们选用黄色短杆菌作为研究菌株，在小型反应器上对黄色短杆菌发酵生产赖氨酸的过程进行定量的解析，以实现流加发酵的最优化为目的展开研究，具体分为以下几部分： (1)在所提供出发菌株的基础上，通过常规诱变获得一株赖氨酸产生菌FB42，并在摇瓶条件下对可能影响起代谢的环境因子进行了考察，对发酵条件进行了优化。 (2)以连续培养作为研究手段，考察了微生物的菌体生长、产物形成及基质消耗特性。通过对代谢途径进行定量的质、能衡算，得出了赖氨酸的理论转化率。进一步比较理论转化率和FB42真实转化率之间的差异，对FB42的代谢流进行分析，据此得出对工艺研究有指导的一些理论依据。 (3)在小型反应器中对影响赖氨酸形成的一些重要环境因子进行定量的考察，找出目的微生物的生理生化特性、营养源供给与反应器特性之间的内在联系，得出最适的操作条件。在此基础上进一步对发酵过程的动力学进行研究，建立出合理的动力学模型，为流加发酵的最优化研究打下基础。 (4)在动力学研究的基础上对发酵进行最优化操作。包括：状态方程的建立、目标泛函的确定、最优化流加方式的求解。并通过实验对最优化操作进行检验，达到理论和实践的统一。 第二节 赖氨酸生产菌FB42的获得 一、引言 20世纪50年代以后赖氨酸的微生物合成途径逐步被阐明，在此基础上的代谢控制发酵的研究非常活跃，以选育营养缺陷型及多重结构类似物抗性突变株为主的常规育种技术，给赖氨酸发酵工业奠定了基础。我们曾于1988年选育出一株赖氨酸产生菌FB21，该菌株的产酸当时为国内领先水平，后研究工作一度中断，菌种退化很多，因此有必要对其遗传标记进行检查，并进一步提高其产酸能力。另一方面，在摇瓶条件下，易于考察各营养因子对微生物代谢的影响，选择出合适的培养基组成，同时可进行一些初步的优化工作，为以后的研究打下基础。 二、出发菌株FB21的遗传特性 赖氨酸产生菌黄色短杆菌(Bervibacterium flavum)FB21是由无锡轻工大学经多年筛选于1988年获得，诱变谱系见图4-2-1，其中FB16到FB21是经原生质体诱变。据报道，FB21菌株在糖浓度为18%下发酵88 h，产酸达到7%，为当时国内领先水平。  图4-2-1 黄色短杆菌FB21的诱变谱系 本研究出发菌株FB31是由FB21的保藏斜面中接出，经复壮、分离、纯化后获得。由于FB21保藏时间过长，所获得的FB31其遗传特性极有可能发生改变，FB21的主要遗传标记为Leu-Thr-AECrAHVr，对这四种标记进行鉴定，发现FB31菌株的生长需要Thr和Leu 。在不含Leu 的培养基中FB31菌株完全不生长，表现为Leu 缺陷型；在不含Thr的培养基中，FB31菌株能微弱生长，但生长不充分，表现为Thr生长需求型(也可称为代谢渗透缺陷型)。在AEC浓度为10 mg/L时，FB31菌株的生长几乎不受影响；在AHV浓度为2 mg/L时，FB31的相对生长为50%，这些均和FB21的报道相一致。通过遗传特性的鉴别可以看出，FB31基本上保留了FB21的遗传标记，但Th标记发生了改变，由缺陷型变为需求型，FB31的主要遗传标记为Thr-、AECr、AHVr。 三、FB31菌株摇瓶发酵性能的初步研究 (一)种龄的确定 适宜的种龄应是菌体处于对数生长的中后期。这是因为处于对数生长期的菌体接种进行发酵是能迅速生长，有利于缩短发酵周期。而且对数生长期末菌体浓度相对较高，更有利于保持高的接种量。图4-2-2为FB31种子培养的生长曲线，从图中可以看出培养进行到17~19 h时，FB31菌株处于对数生长期末，所以选择种龄为17~19 h。 图4-2-2 FB31菌株在种子培养基中的生长曲线 (二)接种量对发酵的影响 培养17~19 h的新鲜种子按不同的接种量接入发酵培养基中，实验结果如表4-2-1所示，表明接种量以5%为好。 表4-2-1 不同接种量对发酵的影响 接种量/% 1 3 5 8 10  产酸/g(L-1 34.5 38.8 41.8 36.0 34.4   进一步研究发现最适的接种量很大程度上与种子的生长情况有关，实验结果如表4-2-2所示。当种子OD值为0.18~0.20时接种量以5%为好；当种子OD值较低，如OD值为0.085时，接种量则以8%为宜。 表4-2-2 种子OD值不同时接种量对发酵的影响 17~19 h种子OD值 0.085 0.185 0.20  接种量/% 5 8 5 8 5 8  产量/ g(L-1 34.6 41.1 41.3 35.0 42.0 35.1   事实上由于温差、斜面接种量波动或其它因素的影响，种子培养17~19 h后OD值的发生改变是很难免的，而且有时会相差很大，这时可以通过改变接种量，或延长种子培养时间来调整，以获得最佳的接种效果，保证发酵的稳产高产。 (三)初糖浓度对发酵的影响 如表4-2-3所示。当初糖浓度为13%时发酵的转化率最高，初糖浓度进一步提高时对发酵不利，特别当初糖浓度为18%时FB31几乎不产酸，可见菌株不具备耐高糖的特性。 表4-2-3 初糖浓度对发酵的影响 初糖浓度/ g(L-1 105.0 128.0 148.0 178.0  产酸/ g(L-1 32.6 41.6 42.0 17.2  转化率/% 31.0 32.5 28.3 9.6  (四)发酵培养基的优化 FB 31的发酵培养基成分包括碳源、氮源、无机盐等。碳源主要由葡萄糖提供；玉米浆、豆饼水解液、(NH4)2SO4用以提供氮源；无机盐有磷酸氢二钾、七水合硫酸镁和碳酸钙，其中碳酸钙除用作钙盐外主要是起pH缓冲作用，使得发酵过程pH不致过低。固定培养基组成为葡萄糖13%、磷酸氢二钾0.1%、七水合硫酸镁0.05%、碳酸钙4.5%，考察了玉米浆、豆饼水解液和硫酸铵对发酵影响，选用L34正交表，结果如表4-2-4。 表4-2-4 正交实验结果 实验号 豆饼水解液 玉米浆 (NH4)2SO4 产酸(g/L)  1 1(0.5%) 1(2.5%) 1(3%) 21.0  2 2(1.0%) 2(3.0%) 2(4%) 42.0  3 3(1.5%) 3(3.5%) 3(5%) 31.0  4 1 2 2 38.0  5 2 3 1 22.0  6 3 2 1 33.0  7 1 3 2 24.0  8 2 1 3 36.0  9 3 2 1 30.0  K1 28.0 30.0 24.0   K2 33.0 37.0 33.0   K3 31.0 26.0 35.0   极差 5.0 11.0 11.0   表4-2-5 方差分析表 方差来源 偏差平方和 自由度 均方 F值 显著性  豆饼水解液 5.51 2 2.76 23.0 (  玉米浆 20.47 2 10.24 85.3 (  硫酸铵 21.43 2 10.72 89.3 (  误差 0.32 2 0.12    总和 47.73 8     F0.01(2,2)=99.0 F0.05(2,2)=19.0 从正交实验结果可以看出，豆饼水解液、玉米浆、硫酸铵浓度的变化对发酵都有显著的影响。豆饼水解液和玉米浆用以提供有机氮和FB31生长所必需的氨基酸，因此添加量过少对发酵不利，但过高的添加量也会使产酸下降，这可能是因为在过多的添加量下发酵液中其它氨基酸浓度的增大对FB31菌株合成赖氨酸有抑制作用。此外，从实验结果来看，玉米浆浓度过高对发酵尤为不利，这可能是因为玉米浆除用以提供有机氮外，还含有大量菌体生长所必需的因子，在过高的玉米浆浓度下，菌体生长过旺不利产酸。对黄色短杆菌的赖氨酸发酵，硫酸铵是最好的无机氮源，有结果表明提高硫酸铵的浓度有刺激产酸的作用。本实验结果表明对于FB31的赖氨酸发酵，硫酸铵浓度有一最佳值为4%，当硫酸铵进一步提高对发酵影响不大。 实验得出FB31菌株发酵培养基的最适组成为(g/L )：葡萄糖130、玉米浆30、豆饼水解液10、硫酸铵40、磷酸氢二钾1、七水合硫酸镁0.5、碳酸钙45。用该培养基发酵72 h，产酸为42 g/L，和菌株FB 21相比其产酸性能下降很多。 保持高产菌株遗传性能的稳定，防止回复突变，是发酵工业生产中一个非常重要的问题，目前通常采用的一些方法有： (1)选育遗传性能稳定的菌株：经诱变处理后，在易出现回复突变株的培养基中反复传代，选出不发生回复突变的菌株。 (2)定向赋加生产菌的遗传标记：如选育双缺菌株，增加抗回复突变性能；对于抗性株，尽量选育多重抗性突变株。 (3)在保藏过程中除选择合理的保藏方法外，对于营养缺陷型菌株要提供足够的营养物，抗性株可添加适量的抗性物质。 (4)必须定期进行分离、纯化工作，保持其遗传性能的稳定。 通过前面的研究可以发现，虽然FB31是从FB21的保藏斜面中接出，但其遗传标记发生了改变，比较FB31和FB21的发酵性能来看，FB31退化较为明显，主要表现在两方面：一是产酸水平的降低，二是耐高糖性能的降低，表明菌株发生了回复突变。为此对FB31菌株进行了诱变，希望提高其产酸性能。 四、赖氨酸产生菌FB42的获得 (一)黄色短杆菌产赖氨酸的合成途径与调控机制 根据文献报道，黄色短杆菌产12种氨基酸的合成代谢途径如图4-2-3所示。氨基酸的代谢途径主要有三条：(1)从葡萄糖经丙酮酸到丙氨酸、缬氨酸；(2)从葡萄糖经草酰乙酸和(-酮戊二酸到谷氨酸；(3)从葡萄糖经天门冬氨酸、天门冬氨酸半醛到赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸。 图4-2-3 黄色短杆菌氨基酸合成示意图 ①丙酮酸羧化酶；②磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；③天门冬氨酸激酶；④二氢吡啶二羧酸合成酶；⑤丙酮酸-L-丙氨酸转移酶；⑥(-酮戊二酸脱羧酶；⑦天门冬氨酸-(-脱羧酶；⑧高丝氨酸脱羧酶 反馈抑制； 反馈阻遏 黄色短杆菌的赖氨酸合成途径，即上述第三条途径，存在着严格的调节机制，正常的细胞几乎不积累赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸。该调节机制由下面几种作用共同完成。 谷氨酸优先合成，谷氨酸合成过剩就会抑制谷氨酸脱氢酶(GD)的活性，使得生物合成的代谢流转向天门冬氨酸。天门冬氨酸的过剩也会抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，使得天门冬氨酸不致大量积累。 赖氨酸的前体物天门冬氨酸与乙酰CoA的生成形成平衡合成(Balance Sythesis)。乙酰CoA的增加能逆转天门冬氨酸对其自身合成的反馈抑制。 天门冬氨酸激酶(Aspartic acid Kinase, AK)受赖氨酸与苏氨酸的协同反馈。研究表明天门冬氨酸激酶是一个变构酶，该酶催化天门冬氨酸和ATP形成(-天门冬氨酸磷酸，有两个变构位置可以接受末端产物。AK受赖氨酸与苏氨酸的协同抑制，当只有赖氨酸或苏氨酸与变构位置结合时，酶活影响不大，当赖氨酸与苏氨酸同时结合到两个变构位置上时，酶活受到强烈抑制。此外AK在赖氨酸合成调节中有着重要的意义，研究表明AK是赖氨酸合成途径中唯一的反馈调节点。赖氨酸分支途径的其它酶，如第一个专一性酶──二氢吡啶二羧酸合成酶，末端产物如赖氨酸或其它氨基酸单独或组合对该酶无抑制作用，且该酶也不受赖氨酸的反馈阻遏。 赖氨酸与亮氨酸的生物合成之间存在着代谢互锁(Metabolic Interlock)，赖氨酸分支途径的初始酶二氢吡啶二羧酸合成酶为亮氨酸所阻遏。 蛋氨酸比苏氨酸优先合成，蛋氨酸合成的过剩就会阻遏高丝氨酸-O-转乙酰酶，使得生物合成的代谢流转向苏氨酸。苏氨酸比赖氨酸优先合成，苏氨酸的过剩会反馈抑制高丝氨酸脱羧酶的活性，使得生物合成转向赖氨酸。 (二)赖氨酸产生菌的育种策略 长期自然选择的结果，使得生存下来的微生物具有严格的代谢调控机制，其胞内的每一步反应速度，以及通过各种途径的代谢流基本平衡，从而能以最经济、有效的方式合成氨基酸、核酸、脂肪酸、维生素等基础物质，这些物质在体内几乎不积累。发酵工程要求微生物大量地合成特定的代谢产物，这一目的只有当微生物的部分代谢调控机制遭到破坏时才能达到。用人工诱变的方法有目的地改变微生物固有的调节机制，使合成产物的途径畅通无阻，最大限度地积累特定产物，这种发酵称为代谢控制发酵。 结合黄色短杆菌的赖氨酸合成途径和代谢调控机制，相应的育种策略可归纳为： (1)切断代谢支路：选育和应用营养缺陷型菌株，切断丙氨酸、苏氨酸和蛋氨酸的分支途径是积累赖氨酸的有效手段。 (2)解除反馈抑制：选育抗结构类似物的突变株，可以得到对天门冬氨酸激酶反馈抑制脱敏的菌株，代谢调节被遗传性地解除，这是赖氨酸发酵育种的重要手段。特别是选育营养缺陷型兼具结构类似物抗性的突变株，极有希望获得高产菌株。表4-2-6列举了赖氨酸发酵育种中曾用过的结构类似物，其中以AEC效果佳、应用广。 表4-2-6 赖氨酸发酵育种中曾使用过的一些结构类似物 类别 结构类似物名称 使用缩写  赖氨酸结构类似物 S-(2-氨基乙基)-L-半光氨酸 AEC   (-甲基赖氨酸 ML   苯酯基赖氨酸 CBL   (-氯乙内酰氨 CCL   (-氟乙内酰氨 FCL   (-氨基月桂基内酯氨 ALL   L-赖氨酸氧肟酸 LysHx  苏氨酸结构类似物 (-氨基-(-羟基戊酸 AHV   邻甲基苏氨酸 OMT   苏氨酸氧肟酸 ThHx  亮氨酸结构类似物 (-噻唑丙氨酸 (-TA   亮氨酸氧肟酸 LeuHx   (-噻唑亮氨酸 (-TL   (-羟基亮氨酸 (-HL  天门冬氨酸结构类似物 天门冬氨酸氧肟酸 AspHx   磺氨二甲嘧啶    磺氨胍 SG  (3)增加前体物的生物合成：关键酶AK所催化的底物是天门冬氨酸，AK的反应速度与底物天门冬氨酸浓度之间的关系呈S型，随着天门冬氨酸浓度的增加，AK与天门冬氨酸的亲和协同性增大。根据变构酶的S型动力学特性，为了提高赖氨酸的产量，应设法增加前体物质天门冬氨酸的浓度，以抵消变构抑制剂的影响。应此可以考虑选育丙氨酸缺陷型，抗天门冬氨酸结构类似物的突变株。 (4)解除代谢互锁：赖氨酸与亮氨酸的生物合成之间存在着代谢互锁，应此可以考虑选育亮氨酸缺陷型，抗亮氨酸结构类似物的突变株。 (三)赖氨酸产生菌FB42的获得 在不含苏氨酸的选择性培养基上得到50株苏氨酸完全缺陷的突变株，在抗性平板上得到200株LysHx抗性突变株，经初筛、复筛后得到FB41和FB42。同出发菌株FB31相比，FB41和FB42产酸分别提高23%和19%。诱变谱系见图4-2-4。 图4-2-4 FB 42菌株的诱变谱系 (四)FB42菌株对LysHx和AHV的抗性检验 FB42是在添加AHV和LysHx的筛选平板上获得，因此具有对AHV和LysHx的抗性，在LysHx为4mg/L时，FB42的相对生长仍为80%，而此时FB31几乎不生长；此外FB42对HV的抗性也有所增加。 (五)FB41和FB42的传代实验 对FB41和FB42进行反复传代，测定其赖氨酸合成能力，结果发现(表4-2-7)，FB42遗传、发酵性能稳定，是一支较好的赖氨酸产生菌，因此进一步对影响FB42产酸的环境因子和发酵条件进行了研究。 表4-2-7 FB41和FB42菌株的传代实验 代数 1 2 3 4 5 6 7 8  菌株FB41产酸/ g(L-1 52 50 51 49 45 43 43 42  菌株FB42产酸/ g(L-1 50 49 51 49 48 50 48 50  五、环境因子对FB42分泌赖氨酸的影响 (一)苏氨酸和亮氨酸对产酸的影响 FB42菌株为亮氨酸缺陷型和苏氨酸需求型，所以发酵过程中必须添加苏氨酸和亮氨酸，图4-2-5和4-2-6反映了苏氨酸和亮氨酸对FB42菌株生长和产酸的影响。 实验培养基为(/L)：葡萄糖100 g、硫酸铵35 g、尿素2.5 g、磷酸氢二钾1 g、七水合硫酸镁0.4 g、七水合硫酸铁10 mg、一水合硫酸锰8 mg、D-生物素 50 ug、硫胺素200 ug、碳酸钙 40 g，亮氨酸和苏氨酸的浓度按实验要求定。 图4-2-5 苏氨酸对菌体生长和产酸的影响 图4-2-6 亮氨酸对菌体和产酸的影响 从图4-2-5中可以看出当苏氨酸浓度>150 mg/L 时，就能满足菌体生长的要求，实验范围内未发现过高的苏氨酸浓度对菌体生长有抑制作用。对产酸而言，苏氨酸浓度有一合适的值，其范围在100~350 mg/L之间，苏氨酸浓度过高对FB42产赖氨酸有抑制作用。对比一下本文的结果可以发现，FB42和FB21菌株相比∶(1)菌体生长所需的苏氨酸浓度降低了；(2)苏氨酸对产酸的抑制作用也有所减小。这从一个侧面也说明：(1)由于FB42菌株为苏氨酸需求型但不是完全缺陷，其自身可合成少量的苏氨酸，因而对苏氨酸的需求要比FB21(苏氨酸缺陷型)少；(2)FB42对苏氨酸结构类似物AHV的抗性较FB21有所增加，故而苏氨酸对菌体赖氨酸合成的抑制作用得到缓解。 图4-2-6反映了亮氨酸对FB42菌体生长和产酸的影响，可以看出亮氨酸对菌体生长和产酸的影响是相似的，最适生长和产酸浓度为400~600 mg/L。 (二)生物素的浓度对产酸的影响 生物素影响到细胞内细胞膜的合成，生物素过量的情况下会导致细胞中更多磷脂分子的合成。对于谷氨酸发酵，这种作用会影响Glu-Asp运输系统向胞外运送谷氨酸，因而在谷氨酸发酵中控制亚适量的生物素浓度被作为一种提高产酸的重要策略。对于赖氨酸发酵而言，抑制谷氨酸的分泌可以使得代谢流转向赖氨酸的合成，且赖氨酸的分泌与Glu-Asp运输系统无关，因此高的生物素浓度应该是有利的。实验发现生物素浓度必须大于250 ug/L。在发酵培养基中添加生物素对产酸影响不大，分析可知：发酵培养基中含有3%的玉米浆(玉米浆中生物素的浓度为150ug/L)，折算成生物素的含量为450ug/L，满足了菌体大量分泌赖氨酸的要求，因此玉米浆在发酵培养基中除作为有机氮源外，还提供发酵所需的生物素。 图4-2-7 生物素对产酸的影响 (三)金属离子对产酸的影响 许多金属离子都是微生物代谢途径上酶的激活剂或是辅助因子。如Mn2+是许多酶的激活剂；Fe2+是细胞色素氧化酶和过氧化氢酶中活性基因的辅助因子；Mg2+是糖酵解途径中许多酶的激活剂。此外钾离子对产酸的影响也很大，据文献报道，钾离子对保持菌体活力，防止菌体衰老，提高产酸能力起着相当重要的作用。也有文献报道铜离子浓度为50 mg/L时，可以提高产酸。 实验考察了镁、钾、锰、铁、铜离子对产酸的影响(表4-2-8)，发现：钾离子和镁离子对产酸有促进作用，最适的添加量分别为1 g/L和0.5 g/L(以磷酸氢二钾和七水合硫酸镁计)；铁离子和镁离子对产酸影响不大；而铜离子对产酸有抑制作用，尤其当铜离子大于20 mg/L 时几乎不产赖氨酸。 表4-2-8 金属离子对产酸的影响 离子 浓度/ g(L-1 产酸/ g(L-1 离子 浓度/ mg(L-1 产酸/ g(L-1  K+ 以K2HPO4计 0.5 25.2 Fe2+ 1 31.2   1.0 32.1  2 32.1   1.5 31.1  4 30.4   2.0 30.1  8 31.1  Mg2+以MgSO4(7H2O计 0.2 26.3 Cu2+ 20 30.2   0.5 32.0  40 未检出   1.0 31.5  60 未检出   1.5 29.2  80 未检出  Mn2+ 1 mg/L 31.2      2 mg/L 30.1      4 mg/L 32.0      8 mg/L 30.2      注：发酵培养基除实验离子外其它为(/L)：葡萄糖100 g、硫酸铵35 g、尿素2.5 g、磷酸氢二钾1 g、七水合硫酸镁0.4 g、七水合硫酸铁10 mg、一水合硫酸锰8 mg、D-生物素500 ug、硫胺素 200 ug、Thr 200 mg、Leu 400 mg、碳酸钙 40 g。 六、响应面分析法优化FB42菌株发酵培养基 响应面分析(Response Surface Analysis，RSA)方法是数学与统计学相结合的产物，和其它统计方法一样，由于采用了合理的实验设计，能以最经济的方式，用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究，科学地提供局部与整体的关系，从而取得明确的、有目的的结论。它与过去推广的“正交设计法”不同。响应面分析方法以回归方法作为函数估算的工具，将多因子实验中，因子与实验结果的相互关系，用多项式近似，把因子与实验结果(响应面)的关系函数化，依此可对函数的面进行分析，研究因子与响应面之间、因子与因子之间的相互关系，并进行优化。 Box及其合作者于20世纪50年代完善了响应面方法学，后广泛应用于化学、化工、农业、机械工业等领域。本研究采用响应面分析方法对FB42的发酵培养基的组成进行了优化，以玉米浆、豆饼水解液、硫酸铵三个因素为自变量，以赖氨酸产量为响应值，设计了三因素三水平的实验。发酵培养基中其它组成为(g/L)：葡萄糖150、磷酸氢二钾1、七水合硫酸镁0.5、碳酸钙45。 实验因素与水平选取如下： 豆饼水解液 (X1) -1： 1% 0：2% 1：3% 玉米浆 (X2) -1：2% 0：3% 1：4% 硫酸铵 (X3) -1：4% 0：5% 1：6% 15个实验点可分为两类：一是析因点，自变量取值在X1 、X2、X3所构成的三维顶点，共有12个析因点；二是零点，为区域的中心点，零点实验重复三次，用以估计实验误差。以产酸(Y)为响应值，经回归拟合后，各实验因子对响应值的影响可用下列函数表示： Y=a0+a1x1+a2x2+a3x3+a11x12+a22x22+a33x32+a12x1x2+a13x1x3+a23x2x3 表4-2-9 响应面实验设计安排及实验结果 试验号 豆饼水解液x1 玉米浆x2 硫酸铵x3 产酸/ g(L-1  1 -1 -1 0 45.44  2 -1 0 -1 49.01  3 -1 0 1 48.20  4 -1 1 0 44.70  5 0 -1 -1 43.20  6 0 -1 1 42.21  7 0 1 -1 39.96  8 0 1 1 40.22  9 1 -1 0 39.14  10 1 0 -1 40.45  11 1 0 1 39.80  12 1 1 0 35.02  13 0 0 0 54.20  14 0 0 0 54.45  15 0 0 0 53.54  表4-2-10 回归系数取值 系数 a0 a1 a2 a3 a11 a22 a33 a12 a13 a23  取值 54.06 -4.117 -1.299 -0.2362 -4.973 -8.015 -4.725 -0.8450 0.0399 0.3875  表4-2-11 回归方程的方差分析表 方差来源 自由度 平方和 均方 F值 相关系数r2  回归 9 514.6 57.17 380.7 r2=514.6/515.3  残差 5 0.751 0.150  =0.998  总离差 14 515.3      F0.01(9, 5)=10.2 表4-2-12 回归方程各项的方差分析表 方差来源 自由度 均方 F值 显著性  一次项 3 49.86 225.6 ((  二次项 3 120.5 545.2 ((  交互项 3 1.154 5.222   失拟项 3 0.103 0.466   误差 2 0.221     F0.01(3, 2)=99.2 F0.05(3, 2)=19.2 F0.1(3, 2)=9.16 从方差分析表可以看出，用上述回归方程描述各因子与响应面之间的关系时，其因变量与全体自变量之间的线性关系是显著的(F>f0.05(9, 5))，方程的失拟项很小，因此可以用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。回归方程各项的方差分析结果还表明，方程一次项、二次项的影响都是高度显著的，因此各个具体实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，各因子之间的交互作用影响不显著。 图4-2-8 Y=f(X1, X2)响应面分析平面图 图4-2-9 Y=f(X1, X3)响应面分析平面图 (硫酸铵X3=5%) (玉米浆X2=3%) 图4-2-10 Y=f(X1, X2)响应面分析立体图 图4-2-11 Y=f(X1, X3)响应面分析立体图 (硫酸铵X3=5%) (玉米浆X2=3%) 从响应面分析图中可以看出，硫酸铵浓度的变化对产酸的影响不显著，其最佳值在5%左右；玉米浆和豆饼水解液浓度的变化对产酸有较大的影响，二者相比玉米浆浓度的变化对产酸的影响更为明显，从图中可以看出玉米浆的最适值在3%左右，豆饼水解液的最适值在1.5~2%之间。为了更进一步确证最佳点的值，对回归方程取一阶偏导，令其等于零并整理得： -4.177 - 9.946 X1 + 0.0399 X3 - 0.845 X2=0 -1.299 - 16.03 X2 + 0.3875 X3 - 0.845 X1=0 -0.2362 - 9.450 X3 + 0.0399 X1 - 0.388 X2=0 解得：x1=-0.41 x2=-0.08 x3=-0.02 即：豆饼水解液为1.59% 、玉米浆为2.92%、硫酸铵4.98%。考虑到实际配制的方便，得到较佳的发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖150、玉米浆30、豆饼水解液20、硫酸铵50、磷酸氢二钾1、七水合硫酸镁 0.5、碳酸钙 45，FB 42菌株在此培养基中摇瓶发酵72 h，赖氨酸产量为54.1 g/L，转化率为0.36 g/g。 第三节 连续培养中FB42菌株的动力学特性及其代谢流分析 一、引言 连续培养的起源可以追溯到20世纪初。1942年Monod发表了一篇关于细菌连续培养的文章，随后于1949年提出了著名的Monod方程。经过半个世纪的研究，人们对连续培养操作的特性已有了较为深入的了解。连续培养技术除了在发酵生产中被用来提高生产强度外，在理论研究方面也作为一种重要的研究手段而被广泛应用。这是因为在连续培养中各种条件相对稳定，可以有目的、定量地调查各种变量之间的相互关系，并可较为精确地求出一些发酵过程的重要动力学参数，这些动力学参数不依赖于培养条件，通常在分批发酵和流加发酵中很难得出的。 有关赖氨酸发酵的研究，以往的工作主要着重于通过诱变和筛选的方法，获得高产菌种，提高发酵单位，但对菌种特性的进一步研究甚少。对发酵过程的考察指标仅仅局限于产酸和表观总转化率，对一些重要的动力学数据如基质消耗比速、产物形成比速、菌体生长比速及其它们之间的相互关系缺乏了解，因此很难对发酵过程进行精确控制，不利于进一步发挥菌种的潜能。要想发挥菌种的潜能必须了解菌种的潜能到底有多大，即菌种真实转化率的值等于多大？这个值对发酵过程优化与控制的研究是非常重要的。发酵过程优化的目的是使发酵水平接近真实转化率，如果对不能确定该值，发酵过程的优化就具有很大的盲目性。 此外，发酵过程的理论转化率是一个重要的物理参数。理论转化率和真实转化率是两个不同的概念，理论转化率代表了菌体最有效地利用外界物质和能量的过程，是热力学意义上的最大可能性，是一个确定的值，而真实转化率则具有菌体的特异性，根据两者的差异可对目的菌株的代谢流进行分析，用以指导生产和菌株的改造。但是由于微生物代谢途径的复杂性，而且理论转化率往往无法通过实验直接得出，因此目前有关赖氨酸理论转化率的报道众说纷纭，有必要进行更加深入的研究。本节即以连续培养方法作为研究手段，对上述问题进行了研究，为下一步对发酵过程优化控制的研究打下了基础。 二、连续培养中的操作特性 营养缺陷型菌株，特别是基因工程菌，在连续传代过程中存在着自然回复突变和质粒脱落现象，因此在连续培养中稳态操作可分为两个过程：开始的一段亚稳态和回复突变后达到的另一个最终稳态点。为了能真实反映菌体大量分泌赖氨酸的生长、代谢特性，这里仅仅讨论开始的一段亚稳态。 图4-3-1和图4-3-2为稀释率0.155 h-1和0.18 h-1时，实验操作过程中各参数的变化图，可以看出，当经过3~5个停留时间后能得到稳定的操作。 图4-3-1 实验操作过程中各参数的变化 图4-3-2 实验操作过程中各参数的变化 (D=0.155 h-1) (D=0.181 h-1) (一)菌体浓度、产物浓度、基质浓度与稀释率的关系 如图4-3-3所示。总的来说，随着稀释率的增加，菌体浓度呈下降的趋势，特别是当D>0.15 h-1后菌体浓度下降很快。在D<0.15 h-1时产物的浓度几乎保持不变，但当D>0.15 h-1后，随着菌体浓度的下降，产物浓度也迅速下降。与D=0.05 h-1时相比，D=0.22 h-1时的菌体浓度值下降了39%，产物浓度值降低了52%，可见过高的稀释率对产物的形成的负面影响更大。 图4-3-3 菌体浓度、产物浓度、基质浓度与稀释率的关系 当D<0.11 h-1时，限制性基质葡萄糖的浓度未检出(<10 mg/L)。Linton等在以葡萄糖为限制性基质研究Penicillim stipitatum青霉素发酵动力学特性时，实验数据表明在很宽的稀释率范围内葡萄糖浓度均在检测限以下(<5 mg/L)，和本研究在较低稀释率下出现的现象相似。其原因可能是，在较低的稀释率下，葡萄糖很快被转化为代谢过程中的中间产物，这时葡萄糖的限制作用，可能有其代谢途径上的某一中间产物表现出来。当D>0.11 h-1时，葡萄糖浓度开始增加，当D=0.22 h-1时葡萄糖浓度急剧升高，此时菌体浓度、产物的下降也很快，说明该点已很接近洗出点。 (二)产物生成比速、基质消耗比速与稀释率的变化关系 如图4-3-4所示。产物形成比速和稀释率之间存在着一个函数关系。当D<0.15 h-1时，产物形成比速随D增加呈线性增大；当D处于0.15 h-1~0.18 h-1之间时，产物形成比速虽然继续增加，但趋势变得缓慢；产物形成比速的最大值出现在D=0.18h-1附近，当D>0.18 h-1后，产物形成比速呈下降的趋势。 图4-3-4 产物生成比速、基质消耗比速与稀释率的变化关系 葡萄糖的消耗比速和产物形成比速有一对应关系。在产物形成比速线性增加的区域内，葡萄糖的消耗比速也呈线性增加；当产物形成比速呈下降趋势后，葡萄糖消耗比速增加的幅度变慢。这是因为葡萄糖不但用作菌体的生长，还用于产物的形成。 (三)菌体和产物表观转化率与稀释率的变化关系 如图4-3-5所示。D在0.05 h-1～0.15 h-1之间变化时，菌体的表观转化率似有下降；当D进一步增大时，菌体的表观转化率略有提高，但总的来说菌体的表观转化率的随着稀释率的变化不很明显。 产物表观转化率的变化和菌体表观转化率的变化呈相反的趋势。D从0.05 h-1增加到0.15 h-1时产物的表观转化率略有提高，D>0.15 h-1后产物的表观转化率大幅度下降。造成产物转化率急剧的下降的原因还不很清楚，但极有可能是在很高的稀释率下，菌体浓度和产物浓度很小，发酵液中培养基的利用不很充分，这样对产酸有抑制的物质如苏氨酸、亮氨酸的浓度相对较高，影响到赖氨酸的大量分泌。 通过前面的分析可以看出，对于产物的形成，稀释率有一个较适的值，当D=0.15 h-1左右时，发酵液中产物的浓度较高，产物的形成比速也较大，此时也对应着产物的最大表观率。实验发现过高的稀释率对产物的形成尤为不利。 图4-3-5 菌体和产物表观转化率与稀释率的变化关系 □ Yx；＊Yp 三、连续培养中赖氨酸发酵的动力学特性 (一)菌体生长动力学 1949年Monod 在研究细菌连续培养时根据如下假定：(1)生长为平衡式的非结构生长(为了描述菌体成分，采用菌体浓度作为唯一变量)；(2)只着眼于培养基中一种成分──生长限制性底物，其它成分的含量都充分，达到不致影响生长的程度；(3)认为生长是个单一反应，菌体得率一定，不存在动态的滞后现象。据此得出了著名的Monod的方程：  (4-3-1) 式中：(：菌体的比生长速率 (max：菌体的最大比生长速率 Ks：半饱和常数 S：限制性基质浓度 由此揭开了对微生物生长乃至发酵动力学研究的序幕。尽管某些生长过程中，尚有可能存在多个限制生长因素，或高浓度底物抑制、或产物抑制、或多底物竞争、或多种微生物间的竞争等许多问题，但在一般条件下，特别是在产物抑制不明显的连续培养中，Monod方程表现出广泛的适用性。 对于一个单级全混反应器(CSTR)，有关菌体(不计死亡)的物料衡算式为： V(dX/dt)=FX0-FX + (XV (4-3-2) 式中： V：反应器中培养液的体积 F：培养液流入(出)的速度 X0：流入培养液中的菌体浓度 X：反应器内的菌体浓度 一般X0=0，所以式(4-3-2)整理得: dX/dt=(-F/V)X +(X =((-D)X (4-3-3) 式中：D：稀释率 在连续培养达到稳态时dX/dt=0，所以(=D。 依Linrweaver-Burk方法对Monod方程取倒数得： 1/( =(1/(max)+(Ks/(max)·(1/s) (4-3-4) 将实验数据作1/S～1/(图，结果见图4-3-6。 图4-3-6 1/S～1/(关系图 可见1/S与1/(呈线性相关。解得(max=0.24 h-1，Ks=0.88 g/L。因此FB42菌株在连续培养中以葡萄糖为基质的生长动力学为： (=0.24S/(0.88+S) (4-3-5) 方程(4-3-5)中半饱和常数为0.88 g/L，这表明葡萄糖浓度只在较低的情况下才表现出限制菌体生长的作用，如果培养液中葡萄糖的浓度>10g/L时，葡萄糖对菌体生长的限制作用可以不考虑。 (二)产物形成动力学 产物的形成过程非常复杂，为了便于研究，一般都将产物的形成与菌体的生长结合起来进行讨论，并将产物形成动力学建立成菌体生长比速(的函数。 图4-3-7 产物形成比速(()与菌体生长比速(()的函数关系 图4-3-7中(和(的关系较为复杂，不是简单的线性关系，用1个二次曲线进行拟合，得到产物形成的动力学表达式为： (=-0.0316 + 1.257 ( - 3.09 (2 (4-3-6) 从图4-3-7中可以看出，当(<0.16 h-1时，(和(几乎呈线性关系，实验数据经回归分析得： (=0.57 ( ((<0.16 h-1) (4-3-7) 从(4-3-7)式可以看出，在较低的稀释率下，产物的形成表现为生长偶联。 目前有关赖氨酸发酵动力学的研究，普遍的观点均认为，赖氨酸为Ⅱ类发酵，产物的形成为生长部分偶联。但从本节的研究结果来看，在某些特定的条件下，赖氨酸的产物形成会表现出生长偶联型的特征。 四、FB42的真实转化率 假定碳源主要由葡萄糖提供，培养基中其它成分所提供的碳源和葡萄糖相比可忽略不计。这样稳态操作中碳源的物料平衡式为： D(Cg1-Cg0)=DCx/Yx + DCp/Yp + mCx (4-3-8) 式中：D为稀释率，Cg1、Cg0分别代表流加液中葡萄糖的浓度和恒化器中葡萄糖的浓度，Cx、Cp分别代表恒化器中菌体和产物的浓度，Yx 、Yp则为发酵过程中菌体和产物的真实转化率，m为维持消耗常数。 若真实转化率Yx 、Yp及维持消耗常数m在各稳态操作中保持不变，式(4-3-8)可以转化为如下的线性等式： 1/Y0=(1/YP) + Cx/(CPYx) + mCx/(DCP) (4-3-9) 式(4-3-9)中Y0表示产物对葡萄糖的表观转化率。从式(4-3-9)中可以看出，若在一个三维空间作1/Y0关于Cx/CP与Cx/DCP 的图(图4-3-8)，能求出真实转化率与维持消耗常数的值。事实上由于在D适中的条件下建立稳态时，m很小，这一点从图4-3-8中可以直观地看出，所以式(4-3-9)可以转化为： 1/Y0=1/YP+Cx/(CPYx) (4-3-10) 将实验数据作1/Y0～Cx/CP图，如图4-3-9所示。可以看出1/Y0与Cx/CP呈很明显的线性关系，经回归可得： 1/Y0=1.466 + 1.771(Cx/CP) (4-3-11) 相关系数R=0.97 图4-3-8 1/Y0关于Cx/CP与Cx/DCP 的图 图4-3-9 1/Y0～Cx/Cp图 计算得菌体和产物的真实转化率分别为0.56 g/g与0.68 g/g。由于培养基中除葡萄糖外尚有玉米浆和几种必需氨基酸提供部分碳源，共可折算成2g/L的葡萄糖。这样对上述得到的数据进一步修正得： 菌体的真实转化率(YX)为：0.51 g/g 产物的真实转化率(YP)为：0.62 g/g(产物以赖氨酸盐酸盐计) 五、赖氨酸发酵的最大理论转化率 式(4-3-12)～(4-3-15)为文献中发表的赖氨酸发酵的定量反应方程式。Shvinka等指出赖氨酸合成的中间产物草酰乙酸可由TCA循环或磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化途径获得。当草酰乙酸通过TCA循环合成时，赖氨酸合成的理论转化率为0.51 (式4-3-12)；当草酰乙酸通过PEP合成时，赖氨酸合成的理论转化率为0.86(式4-3-15)。式(4-3-13)是张克旭给出的一个发酵反应方程式，按此式赖氨酸的理论转化率为0.68 g/g。J.Simon 研究后指出赖氨酸发酵的理论转化率为0.76 g/g(式4-3-14)。 综上可以看出，赖氨酸发酵理论转化率的研究很多，但结果不一，目前较为广泛接受的是J.Shinka的观点，即赖氨酸合成的中间产物草酰乙酸由PEP合成时，赖氨酸发酵的最大理论转化率为0.86 g/g。 2C6H12O6 + 2NH3 + 5O2 C6H14N2 + 8H2O + 6CO2 (4-3-12) 3C6H12O6 + 4NH3 + 4O2 2C6H14N2 + 10H2O + 6CO2 (4-3-13) 4C6H12O6 + 6NH3 + 3O2 3C6H14N2 + 12H2O + 6CO2 (4-3-14) 1.18C6H12O6 + 2NH3 +0.08O2 C6H14N2 + 3.08H2O + 1.08CO2 (4-3-15) 分析式(4-3-15)，可以看出反应方程的系数很复杂，不可能全部化为整数。从宏观原理出发对微生物反应过程的理论转化率进行讨论，可以发现，对于一个给定的生物化学反应，参与反应的分子也随之给定，一个非整数分子不再是原来给定的分子(如葡萄糖分子的二分之一C3H6O3，已不再是葡萄糖分子)，故在生物化学反应中各反应物的系数应为整数。式(4-3-15)不满足这一条件，因此对赖氨酸发酵的最大理论转化率问题有必要更加深入地进行讨论。以下通过对黄色短杆菌赖氨酸合成途径进行定量的质、能衡算，就赖氨酸发酵过程的最大理论转化率问题作了进一步的研究。 (一)黄色短杆菌中赖氨酸的合成途径 在短杆菌属的细菌中，赖氨酸是由天门冬氨酸经(,(-二氨基二酸途径合成。中间代谢产物丙酮酸、草酰乙酸、天门冬氨酸产生途径如图4-3-10所示。 图4-3-10 中间代谢产物的形成图 可见：(1)草酰乙酸的合成可以有三条途径：①由乙酰CoA经三羧酸、乙醛酸循环产生；②由磷酸烯醇式丙酮酸经磷酸丙酮酸羧化酶(PEPC)催化产生；③由丙酮酸经丙酮酸羧化酶催化产生。(2)天门冬氨酸的合成可以有两条途径：①天门冬氨酸转氨基酶催化草酰乙酸而产生；②由延胡索酸经天门冬氨酸酶催化产生。 在黄色短杆菌中缺乏天门冬氨酸酶和丙酮酸羧化酶，因此对于黄色短杆菌由葡萄糖合成赖氨酸途径为： (1)通过三羧酸(TCA)循环；  (2)由磷酸烯醇式丙酮酸经PEPC催化  (二)赖氨酸合成的最大理论转化率 图4-3-11为黄色短杆菌中赖氨酸合成示意图，图中圆圈数字表示能量偶联点。按照以上两条途径对赖氨酸的合成进行分析，可以写出反应的物质与能量平衡式。 图4-3-11 黄色短杆菌生物合成赖氨酸的物质能量代谢图 在途径A中，2 mol葡萄糖生成4 mol丙酮酸。其中1 mol丙酮酸直接用于赖氨酸的合成，1 mol丙酮酸在TCA循环中被完全氧化，另外2 mol丙酮酸经乙醛酸循环合成草酰乙酸。这样2mol的葡萄糖合成1mol的赖氨酸。 在途径B中，1 mol葡萄糖生成2 mol磷酸烯醇式丙酮酸。其中1 mol磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，用于赖氨酸的合成；另1 mol磷酸烯醇式丙酮酸羧化形成草酰乙酸，用于赖氨酸的合成。这样1mol的葡萄糖生成1mol的赖氨酸。 表4-3-1 图4-3-11中各代谢途径的能量平衡 反应 反应号 A B  ADP/ATP偶联 主动运输 -2 -1   1 -2 -1   2 -2 -1   4 4 2   5 4 1   7  1   10 -1    14 -1 -1   17 -1 -1   共计 1 -1  NAD/NADH偶联 3 4 2   6 3    9 1    12 3    共计 11 2  FAD/FADH2偶联 11 2    共计 2 0  NADP/NADPH偶联 9 1    15 -1 -1   16 -1 -1   NH3固定 -2 -2   共计 -3 -4   表4-3-1反映了两条途径中的能量平衡。在计算能量平衡时采用下列几个设定： (1)葡萄糖通过主动运输进入细胞内，每输送1 mol基质消耗1 molATP； (2)呼吸链中NAD(P)H氧化磷酸化的效率是P/O=3，FADH2氧化磷酸化的效率是P/O=2； (3)赖氨酸形成期，菌体的浓度和组成不变； (4)葡萄糖的氧化和能量的释放按以下方程式进行(HMP途径)： C6H12O6 + 6H2O + ATP + 12NADP+ 6CO2+ADP+12NADPH+12H+ (4-3-16) C6H12O6 + 6O2 + 35ADP 6CO2+6H2O+35ATP (4-3-17) 途径A和B的质、能平衡式为： 途径A： 2C6H12O6 + 2NH3 + 2H2O + ADP + 11NAD+ + 2FAD + 3NADPH2 C6H14O2N2 + 6CO2 + ATP + 11NADPH + 11H+ + 2FADH2 + 3NADP+ (4-3-18) 2C6H12O6 + 2NH3 + 2H2O + ADP + 8NADP+ + 2FAD C6H14O2N2 + 6CO2 + ATP + 8NADPH + 8H+ + 2FADH2 (4-3-19) 途径B： C6H12O6 + 2NH3 + ATP + 2NAD+ + 4NADPH + 4H+ C6H14O2N2+6CO2+4H2O+ADP+2NADH + 2H+ + 4NADP+ (4-3-20) C6H12O6 + 2NH3 + ATP + 2NADPH + 2H+ C6H14O2N2 + 6CO2 + 4H2O + ADP + 2NADP+ (4-3-21) 从式(4-3-19)、(4-3-21)可以看出，以途径A合成赖氨酸是产生NADH和ATP的过程，因此该途径的能量是充分的。以途径B合成赖氨酸是消耗NADPH和ATP的过程，因此需要继续消耗一部分基质用于提供必须的能量和NADPH。 以式(4-3-21)、(4-3-16)、(4-3-17)进行NADH和ATP的平衡，最后得途径B的总反应式为(4-3-23)。 途径A和B的总反应式： 途径A：2C6H12O6 + 2NH3 + 5O2 + 29ADP C6H14O2N2 + 6CO2 + 8H2O + 29ATP (4-3-22) 途径B： 6C6H12O6 + 10NH3 + O2 5C6H14O2N2 + 6CO2 + 16H2O (4-3-23) 根据式(4-3-22)和(4-3-23)式进行计算可得，微生物以途径A合成赖氨酸的理论转化率为0.51 g/g；微生物以途径B合成赖氨酸时，物质和能量的利用最有效，转化率达到其最大值，为0.85 g/g。 六、黄色短杆菌 FB42的代谢流分析 黄色短杆菌FB42产赖氨酸的真实转化率为0.62 g/g，和最大理论转化率0.85 g/g相比差距很大，说明FB42菌株中合成赖氨酸的代谢途径有其特异性。 赖氨酸合成途径中至少存在35个节点(或称代谢流交叉点)，在进行理论转化率分析时往往归结于极少数的几个节点，称其为中心点。在赖氨酸合成的代谢途径中代谢中心点为磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)节点。在PEP节点代谢流有两个去向，一是在PEP羧化酶的催化下形成草酰乙酸，另一是在丙酮酸合成酶的催化下形成丙酮酸。Ozaki和Shiio曾报道过，黄色短杆菌中丙酮酸合成酶对PEP的亲和力是PEP羧化酶的10倍，并指出丙酮酸合成酶是一个变构酶，受天门冬氨酸的抑制，而乙酰CoA对该酶有强烈的激活作用。Vallion研究了不同的操作条件下PEP节点的代谢流分配关系，结果表明，PEP节点的代谢流分配是相当稳定的，几乎不受操作条件的影响，只和菌种本身有关。 从前面的研究可以看出，只有当所有的草酰乙酸都是由PEP羧化而形成时，赖氨酸的合成才能达到最大的理论转化率，这是一种理想的情况。事实上由于PEP节点具有很强的菌种特异性，因此对于某一具体的菌种其真实转化率很难达到理论的最大值，其值在0.51~0.85 g/g之间波动。 按FB 42的真实转化率为0.62 g/g，对PEP节点的代谢流进行计算，结果见图4-3-12，图4-3-12中同时计算出了理想状态下草酰乙酸(OAA)节点的代谢流分配。 图4-3-12 FB42菌株的代谢流分析图 从图4-3-12中的计算结果可以看出∶(1)FB42菌株中PEP节点的代谢流分配为：草酰乙酸∶丙酮酸=0.14；(2)合成赖氨酸的前体草酰乙酸主要由TCA循环获得；(3)草酰乙酸进入TCA循环的比例大于合成天门冬氨酸，表明草酰乙酸优先进入TCA循环。 由此可以得到下面的一些启示： (1)由于大部分的草酰乙酸都是由TCA循环获得，因此在发酵过程中必须保持TCA循环酶系的活力，过低的溶氧和高浓度的初糖都会对TCA循环的酶系产生抑制作用，有可能造成转化率的下降。 (2)由于草酰乙酸优先进入TCA循环，如果在实际发酵中溶氧过高，TCA循环活性过于旺盛，大量的草酰乙酸进入TCA循环将造成天门冬氨酸形成的减少，也有可能造成转化率的下降。 (3)FB42菌株中PEP节点的代谢流分配为：草酰乙酸：丙酮酸=0.14，表明即使在最理想的状态下，FB42菌株中赖氨酸不可能全部由PEP羧化途径获得，FB42所能达到的最大转化率为0.62 g/g。从这个意义来说，发酵控制所要解决的问题是如何优化操作过程，使发酵过程的表观转化率尽可能接近FB42菌株的真实转化率。但若要进一步提高菌种的真实转化率，则需要通过诱变育种或基因工程的手段，对菌种进行改造，筛选出PEP羧化酶活性高的变异株。 第四节 分批发酵过程的控制及分批发酵动力学 一、引言 FB42菌株在较适的摇瓶条件下，产酸为54.1 g/L，转化率为0.36 g/g。由前面研究结果可知FB42的真实转化率为0.62 g/g，因此通过改善操作方式和控制条件，有可能进一步提高发酵转化率。在小型发酵罐上，寻求这些最优适的操作方式和控制条件是本文的重要研究内容。 目前有关发酵过程优化与控制的研究，其热点多集中于流加发酵的最优控制。进行流加发酵的最优化研究，首先要获得较为合理的动力学模型。由于流加发酵建立在分批发酵的基础上，因此流加发酵动力学模型可以在分批发酵动力学模型的基础上获得。这样，要研究流加发酵，必须从分批发酵的研究入手。此外，分批发酵过程中一些参数(如溶氧、pH等)往往是不断变化的，这些参数可作为控制发酵的手段。研究这些参数的变化规律，对其进行有目的地控制，是提高发酵过程转化率的一种重要措施。本节对赖氨酸的分批发酵过程进行了研究，探讨了分批发酵中提高转化率的可能性，同时在数据分析的基础上，力求建立出较为合理的赖氨酸分批发酵动力学模型。 二、初糖浓度对发酵的影响 从表4-4-1可以看出，FB42菌株具有一定的耐高糖性能，在初糖浓度为18%时，发酵可正常进行，只是发酵过程的转化率和生产强度都有所下降。当初糖浓度介于11%～15%之间时，转化率可达到0.33 g/g；当初糖浓度为10%时，生产强度最大，为0.85 g/L/h。综合考虑选择初糖浓度为15%进行分批发酵，此时，发酵过程的转化率最大，生产强度也较大。 表4-4-1 初糖浓度对发酵的影响 初糖浓度 / g(L-1 残糖浓度 / g(L-1 发酵时间 / h 产酸 / g(L-1 转化率 / g(g-1 生产强度 / g(L-1(h-1  38.2 3.0 16 9.36 0.25 0.585  80.3 4.2 28 22.6 0.28 0.807  99.1 5.1 36 30.7 0.31 0.850  117.8 5.4 48 38.9 0.33 0.810  150.1 8.0 62 50.1 0.33 0.808  178.2 10.2 78 56.9 0.31 0.729   图4-4-1是不同初糖浓度下菌体生长曲线，可以看出，菌体浓度有一个饱和值，只要满足一定的初糖浓度，菌体的生长都能达到这个饱和值。在不同初糖浓度下，菌体浓度达到饱和值的时间是不一样的，图4-4-1中反映出，随着初糖浓度的升高，菌体浓度达到饱和值的时间将延长，可见初糖浓度的提高对菌体的生长有抑制作用。 图4-4-1 不同初糖浓度下发酵过程中菌体浓度的变化 三、溶氧对发酵的影响 在反应器中氧参与菌体的生长、产物的形成和维持细胞的代谢。氧是难溶于水的气体，在室温及常压条件下，纯氧的溶解度仅为36 mg/L，空气中氧的溶解度仅为8 mg/L。当水中溶有糖或其它盐类时，氧的溶解度则更低。以谷氨酸发酵为例，同化100 g葡萄糖需耗氧41.4 g，而培养基中溶解氧只够菌体生长14 s的消耗，供氧不足将严重影响谷氨酸合成，所以在通风发酵中如何控制培养基中的溶氧水平，对好氧氨基酸发酵非常关键。尤其在放大过程中，因反应器规模不同，造成溶氧水平的差异，是导致发酵结果不能重复的一个重要原因。在反应器放大的研究中，kLa (体积传氧系数)是一个重要的参数。Hixson等首先用亚硫酸盐法研究了发酵系统的体积氧传递系数。随后的一些研究纷纷证实了不同规模的反应器中，氧传递系数与发酵结果之间存在着对应的关系，目前kLa 放大准则已成为生化工程界一个广泛接受的观点。可见在小型反应器中研究溶氧对发酵的影响，寻求最适的kLa 值不但是发酵工业研究的关键之一，而且是反应器放大研究的重要基础。 FB42菌株生产赖氨酸过程中kLa 值与反应器中溶氧的关系如图4-4-2所示。 图4-4-2 不同kLa 值反应器中溶解氧的变化 不同kLa对赖氨酸发酵的影响见表4-4-2。实验中通过改变搅拌转速控制不同的kLa 值，从而达到控制反应器的溶氧水平。结果发现，过高、过低的溶氧对发酵均不利；溶氧很低时(kLa =295.1 h-1)对发酵尤为不利，表现为菌体浓度下降、产酸降低、发酵时间延长；kLa 在400~500 h-1之间，发酵较佳，赖氨酸产量可达到50 g/L左右。 表4-4-2 不同kLa 对发酵的影响 kLa(h-1) 初糖(g/L) 菌浓(g/L) 产酸(g/L) 发酵时间(h) 残糖(g/L)  295.1 150.8 15.66 38.04 84 8.0  406.2 152.1 17.54 51.02 62 4.0  531.8 149.3 17.74 50.26 62 4.88  825.2 150.10 17.59 41.09 60 3.5   图4-4-3为发酵过程的菌体生长曲线，在不同的溶氧水平下(除非kLa 很低)，菌体的生长量都能达到一个相同的饱和值，但菌体的生长速度不同。当kLa为531.8 h-1时，菌体的生长比速最大，过高的kLa 反而对菌体的生长有抑制作用(图4-4-4)。图4-4-5为不同kLa条件下产物形成比速(随时间的变化关系，从图中可以看出kLa为406.2 h-1时，产物的生成比速最大。结合溶氧对菌体生长的影响来看，溶氧过低不但菌体的生长最不利，而且此时产物的形成比速也最小，所以对发酵影响最大；对于产物形成最适的kLa 值和对于菌体生长最适的kLa值是不一样的，因此对于kLa恒定的操作，不能同时使菌体生长和产物形成处于最适的环境中。 图4-4-3 控制不同kLa 对菌体生长的影响 图4-4-4 控制不同kLa对菌体比生长速率的影响 图4-4-5 控制不同kLa对产物比生成速率的影响 四、pH对发酵的影响 pH对许多酶的催化过程有很大的影响，pH的变化能改变体系酶的环境和营养物质的代谢流，使得诱导物和生长因子在活性和非活性之间变化。表4-4-3表明， pH的变化对赖氨酸的发酵影响很大：当pH 7.0时产酸最高，pH值偏高或偏低，产酸均降低；菌体的生长量在pH 9.0时略有降低，但总的说来pH值对菌体生长量的影响不大。 表4-4-3 pH对发酵的影响 pH 初糖/ g(L-1 菌浓/ g(L-1 产酸/ g(L-1 发酵时间/ h 残糖/ g(L-1  6.0 150.8 17.74 48.35 62 8.0  7.0 149.3 17.72 50.26 62 4.88  8.0 150.1 16.63 42.30 68 5.0   图4-4-6 不同pH对菌体比生长速率的影响 进一步研究发现pH值同时影响了菌体的生长比速和产物的形成比速，偏低的pH对菌体的生长是有利的，实验范围内pH 6.0时菌体的生长比速最高；产物形成比速在pH 7.0时最大(图4-4-6和图4-4-7)。 图4-4-7 不同pH对产物比生成速率的影响 五、发酵过程的溶氧与pH控制 通过前面的研究可以得出结论：初糖以15%为好，对于溶氧和pH恒定的操作，kLa 在400~550 h-1之间，发酵较佳，pH应为7.0。在此较适的条件下发酵的转化率为0.33 g/g左右。由于溶氧和pH对发酵的影响是不完全相同的，如能对溶氧和pH进行更好的控制，有希望提高发酵过程的转化率，因此我们本文在动力学分析的基础上对溶氧和pH的控制模式进行了研究。 (一)发酵过程的动力学分析 图4-4-8为控制pH 7.0、kLa 为531.8 h-1时发酵过程的动力学分析。可以看出，菌体的生长比速μ开始较大，随后明显下降；产物生成比速π开始随μ的变化而有一定的降低，但当μ很低时，π仍很大，符合GadenⅡ类发酵特征: 在发酵前期以细胞生长为主；中后期以产物形成为主，产物的形成和菌体的生长仅有一定程度的相关性。 图4-4-8 赖氨酸发酵过程的动力学分析 所形成的赖氨酸包括两个来源∶(1)随着菌体生长而产生；(2)由已完成生长的细胞转化底物为赖氨酸。据此，赖氨酸的形成动力学可以描述为：  (4-4-1) 式(4-4-1)中(为赖氨酸的生长比速；(为相关系数；f1为菌体动力学(的函数表达式，与各影响因子如基质浓度、产物浓度、溶氧水平、pH有关；f2的实质为具有活性的细胞催化底物合成赖氨酸的酶反应动力学，也是各影响因子如基质浓度、产物浓度、溶氧水平、pH的函数。当发酵处于中、后期时，f1→0，式(4-4-1)可以简化为：  (4-4-2) (二)分批发酵过程的控制 使基质的消耗较多地转化成产物，是分批发酵过程控制的目的。由于产物的形成速度不但和π有关、还和菌体浓度有关，结合式(4-4-1)分析，我们可以看出：控制的首先必须控制条件使得菌体在较佳的环境中得到生长，即控制条件，使f1取最大值；随即必须控制条件使得菌体在较佳的环境中最大限度的合成底物，即控制条件，使f2取最大值。往往某一影响因素满足f1和f 2的最佳值是不一样的，这就必须对发酵过程进行分段控制。 前面的研究结果已表明溶氧、pH对菌体生长和产物形成的影响是不一样的。对溶氧而言，kLa =531.8 h-1对菌体生长有利，但kLa=406.2 h-1对产物的形成有利；对pH而言，pH=6.0对菌体生长有利，pH=7.0对产物的形成有利。从发酵过程来看，进行到24 h后，菌体生长基本完成，由此得到针对赖氨酸分批发酵溶氧和pH的控制模式为：(1)溶氧控制模式∶0~24 h，控制kLa为531.8 h-1；24 h后，控制kLa为406.2 h-1；(2)pH控制模式∶0~24 h，控制pH恒定为6.0；24 h后，控制pH为7.0。从表4-4-4可以看出，在优化的控制模式下赖氨酸的发酵水平得到了提高。 表4-4-4 不同控制方式对赖氨酸发酵的影响 控制方式 初糖/ g(L-1 菌浓/ g(L-1 产酸/ g(L-1 发酵时间/ h 残糖/ g(L-1 转化率/ g(g-1  方式Ⅰ 149.3 17.74 50.26 62 4.88 0.336  方式Ⅱ 147.3 17.73 56.12 62 4.0 0.381  方式Ⅲ 152.1 17.66 51.12 56 4.1 0.336  方式Ⅳ 149.5 17.69 52.09 58 3.5 0.348  方式Ⅰ：溶氧、pH恒定(kLa =531.8h-1，pH=7.0)； 方式Ⅱ：溶氧分段控制(0~24 h, kLa =531.8h-1; 24 h后kLa =406.2h-1)； 方式Ⅲ：pH分段控制(0~24 h, pH=6.0; 24 h后pH=7.0)； 方式Ⅳ：溶氧结合pH分段控制(0~24 h, kLa =531.8h-1, pH=6.0; 24 h后kLa =406.2 h-1, pH=7.0) (三)溶氧控制方式与pH控制方式的比较 在两种控制方式下，赖氨酸的发酵水平都得到了提高，但两种控制所得到的结果是不一样的：溶氧控制方式提高了发酵过程的转化率，从表4-4-4中可以看出：同方式Ⅰ相比，发酵的转化率从0.336 g/g提高到0.381 g/g ；pH控制方式缩短了发酵周期，提高了发酵的生产强度。这与pH和溶氧各自对菌体生长和产物形成调节的特异性与敏感性有关，对于赖氨酸发酵，两种控制方式中以溶氧控制为好。进一步的实验发现，当同时使用溶氧和pH分段控制，所得的结果并不很理想，说明这两种控制方式的结合所产生的效果并不简单地表现出加和性。 六、赖氨酸分批发酵动力学 从前面对分批发酵的研究，可以看出，虽然通过控制反应器中的溶氧水平，可以在一定程度上提高发酵过程的转化率，但同真实转化率相比，仍有较大的差距，必须开展流加发酵研究。而要使流加发酵最优化，必须首先在分批发酵的基础上建立出较为合理的动力学模型。 Moser曾对分批发酵动力学进行了较为详细的论述，按建模方式将动力学模型分为三类：(1)机制模型；(2)数学拟合模型；(3)正规模型(Formal Kenitics)。微生物的反应过程非常复杂，特别是在分批发酵过程中，建立机制模型几乎不可能。目前各国生化工程学者所提出的模型大都属于后两类，这些模型从本质上来讲都是对分批发酵过程总体现象和行为的描述，是一种现象模型。从工程角度出发，建立模型是为了更深刻地了解微生物复杂的反应本质，更确切地说是在于使用模型，寻找最优的操作条件，并为反应器的优化和控制服务。要实现这一目的，一个好的现象模型必须具备两个特征：(1)模型能够定量地描述发酵过程的变化；(2)主要影响因子的作用能够在模型中反映出来。 以此为出发点，我们对已报道的赖氨酸分批发酵动力学模型进行了评价，结合FB42菌株的特点，在着重考虑了基质浓度对菌体生长和产物形成影响的基础上，建立了FB42菌株分批发酵的动力学模型。 (一)赖氨酸分批发酵动力学模型的建立 式(4-4-3)、(4-4-4)、(4-4-5)都曾用于描述过赖氨酸的分批发酵过程∶ (=0.125S S(2.8% (4-4-3)  (4-4-4)  (4-4-5) 式(4-4-3)为经验模型，使用范围很窄。式(4-4-4)为Logistic模型，能很好地反映分批发酵过程中因菌体浓度的增加对自身生长的抑制作用，这在分批发酵中是普遍存在的，但Logistic模型很特别，是一个典型的S型曲线，用于拟合分批发酵的菌体生长过程有广泛的适用性。(4-4-5)为Monod方程。 我们在第三节中曾对FB42菌株的动力学特性进行了考察，结果表明在基质限制的条件下，菌体的生长符合Monod方程，并计算出KS=0.8 g/L。在分批发酵过程中基质的浓度均维持在较高的水平，当残糖<1%时意味着发酵终点的到来，可见在分批发酵中葡萄糖对菌体的抑制作用可以不计，不宜用Monod方程来描述分批发酵的菌体生长行为。 在对FB42分批发酵的研究中发现：(1)菌体的生长有一最大饱和浓度，(2)提高初糖浓度菌体的生长速度下降，底物浓度对菌体生长有抑制作用。Logistic模型可以很好地解释第一个现象，但底物对(的抑制作用在Logistic模型没有反映。考虑底物的抑制作用，本文提出一个描述分批发酵菌体生长的动力学模型：  (4-4-6) 模型(4-4-6)的推导过程如下： 假设分批发酵中菌体的生长比速主要受两个方面的影响：基质的浓度和发酵过程中其它抑制物的积累，关于基质对菌体生长的影响可用Andrews模型表达：  (4-4-7) 一般在分批发酵中S》KS，式(4-4-7)可以简化为：  (4-4-8) 关于抑制的积累而引起生长比速的减少可以用下列模型表示：  (4-4-9) 式(4-4-9)中i代表抑制物的浓度。结合式(4-4-8)和(4-4-9)，菌体的生长模型为：  (4-4-10) 假定抑制物的浓度与生长比速的减小呈线性关系，即a(常数。又若假定抑制物的生成速度与菌体的生成速度呈比例，则：  (4-4-11) 若以t=0，i=0为式(4-4-11)的初始条件进行积分，得i=b(X-X0)，代入(4-4-10)式得：  (4-4-12) 设(max(1+abx0)(K’，(1+abX0)/ab(Xmax，则(4-4-12)式变为：  (4-4-13) 从(4-4-13)式中可以看出K’的含义已经不是菌体的最大生长比速，其值要比(max大。但由于分批发酵中，X0一般很小，而Xmax相对较高。若设X0=2 g/L ，Xmax=20 g/L，计算可得1+abX0=1.1(1，所以K’((max代入(4-4-13)得(4-4-6)式。 用(4-4-6)式对分批发酵的实验数据进行拟合。模型参数的求解用单纯形法，计算程序自编，计算结果见表4-4-5。 表4-4-5 菌体生长模型的参数值 参数 (max/ h-1 Xmax/ g(L-1 KI/ g(L-1  数值 0.28 17.75 102.1   图4-4-9为模型计算值与实验值的比较，可见该模型能很好地描述分批发酵过程的菌体生长情况。 图4-4-9 模型计算值与实验值的比较 (二)产物形成模型 微生物的产物形成过程非常复杂，为了便于研究，一些定性的描述被提出，其中Gaden的观点最为广泛接受，从产物形成与能量代谢的内在联系出发，Gaden将产物形成的类型分为三类：(1)产物的形成与能量代谢相偶联，(2)产物的形成和能量代谢部分偶联，(3)产物的形成和能量代谢没有联系。  (4-4-14) (4-4-14)式为Luedeking-Piret’s方程，式中((0、(=0可表示Ⅰ类发酵， ((0、( (0可表示Ⅱ类发酵， (=0、( (0可表示Ⅲ类发酵。由于Piret’s方程既能反映出伴随着菌体生长产物的形成速度，也能反映出独立于菌体生长之外，细胞催化底物形成产物的速度，因此，Piret’s方程原则上都能适用于一般的发酵过程。曾用该模型描述过赖氨酸发酵，能较好地拟合发酵过程，结果表明赖氨酸发酵为Ⅱ类发酵。 但Piret’s方程仅仅是一个总体描述，从Piret’s方程中反映不出基质浓度的变化对产物形成的影响。Bajpai曾提出了一个基质非竞争抑制模型(4-4-15式)用来描述青霉素发酵的产物形成过程，模型计算值与实验值吻合极好，很好地解释了高浓度碳源对青霉素形成的抑制作用。  (4-4-15) 赖氨酸发酵不同于青霉素发酵，前者属于Ⅱ类发酵，后者是一个典型的Ⅲ类发酵。但高浓度基质对产物形成的抑制作用在赖氨酸发酵中是存在的，研究表明，维持较低的糖浓度有利于赖氨酸的形成。为了能反映出这种现象，我们结合Bajpai方程和Piret’s方程，建立出如下的产物形成动力学模型：  (4-4-16) 用(4-4-16)式对分批发酵的数据进行拟合，模型参数的求解用单纯形法，计算结果见表4-4-6。图4-4-10为模型计算值与实验值的比较，可见该模型能很好地描述发酵中赖氨酸的形成过程。 表4-4-6 产物形成模型的参数值 参数 K1 K2 Ksp/ g(L-1 Kip/ g(L-1  数值 0.46 0.18 12.2 41.5   图4-4-10：产物形成模型的计算值与实验值比较 (三)基质消耗模型 常用的基质消耗模型是基于发酵过程中底物消耗的物料平衡而建立的方程式：  即：  (4-4-17) 以(4-4-17)式作为描述赖氨酸发酵的基质消耗模型，Yx 、Yp为基质转化为菌体和产物的真实转化率，对于FB42其值为0.52 g/g和0.61 g/g(见第三节)，经拟合计算出m的值为0.04。图4-4-11为模型计算值与实验值的比较，结果表明该模型能很好地描述赖氨酸发酵过程的基质浓度变化。 图4-4-11 基质消耗模型的计算值与实验值比较 (四)赖氨酸分批发酵动力学模型 综上所述，得出赖氨酸分批发酵的动力学模型为：  (4-4-6)  (4-4-16)  (4-4-17) 表4-4-7为模型参数值，表4-4-8为模型计算值与实验值的比较，从表4-4-8中可以看出用该组模型拟合赖氨酸分批发酵过程，除极个别点外，误差均小于10%。 表4-4-7 模型参数取值汇总 参数 (max Xmax Kt K1 K2 Ksp Kip Yx Yp m  数值 0.28 17.75 102.1 0.46 0.18 12.2 41.5 0.51 0.61 0.04  表4-4-8 模型计算值与实验值的比较 时间/ h 菌体浓度/ g(L-1 产物浓度/ g(L-1 基质浓度/ g(L-1   实验值 计算值 实验值 计算值 实验值 计算值  0 1.18 1.20 0 0 150.1 150.0  8 2.80 2.70 1.09 1.21 148.0 144.5  16 5.73 5.56 3.63 3.70 139.0 133.5  24 9.90 9.81 7.80 8.08 120.1 115.6  32 14.2 13.9 14.2 14.3 95.5 93.3  40 16.3 16.5 22.1 21.9 70.3 71.4  48 17.3 17.4 31.2 30.8 47.2 49.2  56 17.5 17.7 42.1 41.2 25.0 26.0  62 17.6 17.7 50.1 49.4 6.0 8.1  七、分批发酵动力学模型的评价 (一)模型合理性的几个验证 模型(4-4-6)在推导过程中(max是有严格物理意义的，表示菌体的最大生长比速，在第三节中已得出菌体的最大生长比速为0.24 h-1，以(4-4-6)式利用对分批发酵数据进行拟合，计算出(max为0.28 h-1，与连续培养所得的结果极为吻合。 赖氨酸发酵属于Ⅱ类发酵，但第三节的研究结果表明，连续培养时，当(<0.17 h-1时，产物的形成表现为生长偶联(Q(0.57()，运用(4-4-16)式可以解释其原因。分析连续培养的数据可知，(较小时，培养基中底物S的浓度极低，从(4-4-14)式中可以看出，当S极低时，(4-4-16)式可以简化为：  (4-4-18) 这时产物的形成表现为生长偶联。将连续培养所得数据S和(代入(4-4-16)式，(的计算结果和实验值见表4-4-9，二者的最大误差为16%。可见以(4-4-16)式对连续培养的实验数据进行分析，不但可从理论上解释原因，而且模型计算结果和实验值在数值上也极为相近。 表4-4-9 产物生成模型对连续培养中所得数据的分析 基质浓度/ g(L-1 / / 1.50 2.00  菌体生长比速/ h-1 0.051 0.110 0.155 0.166  (/ h-1 实验值 0.027 0.062 0.090 0.093  (/ h-1 计算值 0.024 0.052 0.091 0.102  (二)模型适用范围的评价 在建立分批发酵动力学模型的过程中，模型参数的求解和模型的验证是基于初糖为15%条件下的发酵数据。为了对模型适用范围进行评价，分别对初糖为4%、8%、12%和18%发酵的实验值和模型计算值进行了比较，结果见图4-4-12~图4-4-15(线表示模型计算值，点表示实验值)。从图中可以看出该组模型对初糖4%、8%、12%的发酵拟合较好，在初糖浓度为18%时基质浓度的模型计算值与实验值有较大的偏差，表明该组模型在描述赖氨酸分批发酵时在较广的范围内均表现出适用性。 图4-4-12 初糖4%的发酵过程 图4-4-13 初糖8%的发酵过程 图4-4-14 初糖12%的发酵过程 图4-4-15初糖18%的发酵过程 八、分批发酵的模型分析 (一)初糖浓度对产物形成速度的影响 结合(4-4-6)，(4-4-16)式，产物的形成速度为：  (4-4-19) 从(4-4-19)式中可以看出，维持高的菌体浓度对产物的形成是有利的。菌体的合成需要消耗碳源(以Xmax=17.75 g/L，YX=0.51 g/g计，大约需要34 g/L的碳源，实际发酵中，由于产物的合成和细胞的维持消耗，获得高浓度菌体的初糖浓度要大于这个值)，初糖浓度过低，会造成X的下降，使得产物的形成速度下降；但初糖浓度过高又会造成A的下降，使得产物的生成比速下降。所以要获得高的产物形成速度，初糖浓度有一最佳值，实际发酵中也证实如此，当初糖浓度为10%时，产物的形成速度最大，表现为生产强度最高。 (二)初糖浓度对产物表观转化率(Y)的影响 将式(4-4-17)积分可得：  (4-4-20) 由于在分批发酵中S0》St，Xt》X0，P0=0，并令，则由(4-4-20)式得：  (4-4-21)  (4-4-22) 通过前面的分析可知，赖氨酸的合成速度和菌体的浓度是紧密相关的，所以保持高浓度菌体是获得高转化率的首要条件，将代入(4-4-22)式，并进一步化简得：  (4-4-23) 从(4-4-23)式可以看出，Y与S0和有关：S0 增大，Y增大；增大，Y减小。事实上是随S0变化的：S0增大，使dX/dt减小、dP/dt减小，综合表现出dS/dt减小，造成t增大，因而大大增加。因此S0的增加对Y的影响可能表现出两种情况： (1)因S0的增加，Y增加，这种正效应大。这时提高S0对提高转化率有利。 (2)因S0的增加，随之增大，Y减小，这种负效应大。这时提高S0对提高转化率不利。 所以要使分批发酵过程获得最高的转化率，有一最适的初糖浓度，实际发酵中也证明如此，当初糖浓度为15%时，发酵过程的转化率最高。 通过分批发酵操作模型的研究，可以得到如下结论： (1)分批发酵要获得最高的生产强度，有一最适的初糖浓度，其值为10%。 (2)分批发酵要获得最高的转化率，也有一最适的初糖浓度，其值为15%。 可见在分批发酵操作中不能同时获得最高的生产强度和转化率，当试图用分批发酵获得更高的产物浓度时，必然意味着转化率和生产强度的进一步下降。但是我们从(4-4-19)式中不难看出若在一定的初糖浓度下发酵，通过流加方式提高总糖浓度，并维持发酵过程的糖浓度处于合适的水平，就有可能同时获得高的转化率、高的生产强度和高的产物浓度。 第五节 赖氨酸流加发酵的最优控制 一、引言 20世纪50年代以来，由于宇宙航行、火箭制导等空间技术的飞速发展，以及工程控制、工业生产中一系列最优化问题的出现，对被控系统实现最优化控制的要求日渐迫切。这些提出的问题，不仅要求被控系统完成指定的动作，而且要求在使某种指标达到“最佳”的前提下完成。 数学上一些新概念和方法的创立，为解决最优化控制问题提供了必要的工具。动态规划和最小值原理是寻求最佳控制的两个基本方法。20世纪50年代初期，美国数学家贝尔曼首先提出了动态规划，并在解决具体问题的过程中显示了其方法的独创性和应用的普遍性。几乎同时，苏联数学家庞特里金等人在研究当时工程技术中出现的最佳控制问题时，提出了较之动态规划有更为完备和具体的算法的最小值原理，它将问题归结为常微分方程组，使求解更为方便。以后，特别是高速电子计算机的发展，使得由动态规划或最小值原理推出的方程式得到满意的数值解，从而使生产过程或系统运行过程的在线控制成为切实可行。50多年来，最优控制的理论得到了迅速的发展，充分显示了它在控制理论中的重要性。 近年来发酵行业中有关流加发酵研究的文献报道不断增多，其中一个主要的研究热点就是发酵过程的最优化。可以说流加发酵最优化的研究，为人们更为理性地认识发酵过程的本质，提高生产水平提供了可能的途径，体现了现代发酵工业的研究趋势。前已述及，目前在流加发酵最优化的理论研究方面，国外虽已取得一些进展，但是由于微生物反应过程的复杂性，真正能成功地应用与生产的实例还不多见，国内这方面的研究几乎为空白。 我们在前面几节中对赖氨酸产生菌FB42的特性、发酵动力学行为进行了系统深入的研究，为流加发酵最优化的研究打下了的基础。通过第四节的分析，可以看出高水平的发酵必须通过流加方式来实现。为此，本节先从优化控制的一般理论入手，对流加发酵优化控制的数学理论和算法进行了详细的论述，然后并对赖氨酸流加发酵过程的优化控制进行了研究。 二、最小值原理简介 最小值原理的研究对象是一个受控系统，所解决的是受控系统的最佳化问题。与受控系统相应的几个概念为状态向量、控制向量和目标泛函。 (一)状态和状态方程 系统的状态简言之就是任何时刻都能用来描述系统性态的一组变量，这组变量依赖于时间，是时间的函数。如果只有一个变量称为状态变量，如果多于一个则称为状态向量。 因此系统的状态可以用下列一组状态方程来表示：  (4-5-1)   写成向量式为：  (4-5-2)  其中是状态向量。 (二)控制向量 按一定目的给系统的输入称为控制，控制也是随时间而变化的一组变量，称为控制向量，以表示。 在受控系统中，系统的状态方程含有控制变量：  (4-5-3)   写成向量式为：  (4-5-4)  此处表示控制向量。 (三)目标泛函 由于受控系统的控制目的是多种多样的，一般用下列形式来表示控制系统的性能指标：  (4-5-5) J称为最佳控制问题的目标泛函或实现准则，它可以表示系统由开始控制到结束所消耗的时间，或表示在这一段时间内系统的消耗、误差、受益等等 (四)受控系统的最佳化问题 为了便于说明问题，假定终止状态给定。 对于一个受控系统，如果终止状态给定，若在时间区间[t0，t1]上存在控制向量，把系统状态由转移到。则相应于此，方程(4-5-3)和(4-5-4)有解，代入目标泛函(4-5-5)后得到一个值。所谓最佳控制问题，就是在所有能把系统状态从转移到的控制中，找出一种使相应目标泛函J取最小值，这是的控制称为最佳控制，而相应的(4-5-3)的解称为最佳轨迹。 在具体问题中，t1可以是不确定的，也不完全已知。庞特里金的最小值原理，就是应如何求解受控系统的最优化，特别是控制向量受约束的受控系统的最优化问题的需要而提出的一种数学方法。 三、连续系统的最小值原理 (一)协变向量((t)和哈密顿函数( 协变向量((t)的引入具有严格的数学含义，它和状态向量维数相等，都是n维，且和状态向量满足下列正则方程组：  (4-5-6)  (4-5-7) 式中H为哈密顿函数：  正则方程组或哈密顿方程组，有2n个微分方程，含有2n+r个未知数。 (二)最小值原理 协变向量和状态向量的最优轨迹分别以((和(表示，最佳控制轨迹以表示。 最小值原理为：哈密顿函数作为的函数，在时达到最小值，即：  (4-5-8) (三)正则方程组的求解 ，，(都包含在正则方程组中，因此最佳控制的求解就转化为正则方程组的求解。 (1)正则方程组的边界条件 a) 在t0处，这是n个边界条件。 b) 在t1处对于已指定的分量就可取作边界条件； 对于没有任何条件的分量取边界条件为：  (4-5-9) 所以t1处同样可得n个边界条件。 c)若终止时间t1未确定，则增加条件：  (4-5-10) (2)正则方程组的求解 从前面的分析可知，正则方程组或哈密顿方程组，有2n个微分方程，含有2n+r个未知函数。不等式(4-5-8)中隐含着关于的r个方程，它是，(和应满足的r个条件，所以当正则方程组的2n个边界条件给定后，连同式(4-5-8)可以完全确定出最佳控制，最佳轨迹和相应的协变向量((t)。 由于这些边界条件给定在区间[t0，t1]的两个端点上，故这类问题称为两点边值问题。如果构成两点边值问题的微分方程组是线性的，我们称之为线性两点边值问题，反之就称之为非线性两点边值问题。对于线性两点边值问题，可以用解析法化为边值问题，对于非线性两点边值问题可以用数值法进行试探迭代，使其逼近最优解，步骤如下： 给出初始的((t0)； 对正值方程组积分，的关系式应用最小值原理， 检查终点时刻积分出的((t1)是否和边界条件吻合，满足要求的话，所得的轨迹即为最佳轨迹，否则按牛顿-拉普顺迭代公式重新选择((t0)，重复步骤①。 (四)哈密顿函数的一个重要特性 最佳控制，最佳轨迹和相应的协变向量((t)代入哈密顿函数，则在t0≤t≤t1上，H可看作t的函数，沿着最佳轨迹有：  当H不是t的显函数时(这时系统称为自制系统)，有，即沿着最佳轨迹，哈密顿函数恒取常数，如果(4-5-5)中也不明显含t，且终止时间未指定，则由(4-5-10)知该常数值为零。 四、流加发酵系统的最优化问题 对于流加发酵系统，控制变量在状态方程中呈线性。这类系统，终点最优化问题数学模型可以表达为： 目标泛函：  (4-5-11) 状态方程： , 0≤t≤tf (4-5-12) 式(4-5-11)，(4-5-12)中表示控制向量，表示n维的状态量，tf表示终点的时间，、和分别为3个n维的函数，且对于所有的有：   (4-5-13) 应用庞特里金的最小值原理，当H函数取最小值时，目标泛函J 取最小值，H 函数为：  (4-5-14) 式(4-5-14)中(可以下式求解：  (4-5-15)  (4-5-16) 式(4-5-15)中(表示对时间t的微分。从式(4-5-14)中可见，与H呈线性关系，所以最佳控制可以通过分析的符号来决定：若为正，则=min；若为负，则=max；但当时间间隔[ti，ti-1] 为零，最小值原理没有显示应取何值，这一阶段称为单一阶段(singular interval)，相应的控制称为单一控制(singular control)。 单一控制阶段，最优控制的求解可引用文献上介绍的方法。对上述最优化问题有：  (4-5-17) 在单一控制阶段有：  (4-5-18) 由于在单一控制阶段上，与t无关，且恒等于零，所以在单一控制阶段对时间t的任意阶导数均为零，有：  (4-5-19) 应用(4-5-19)式可得出的表达式，即不断对求t的微分，直至表达式中显含。Gabasov等对单一控制阶段的必要条件进行了补充，指出(4-5-19)式求出的最佳控制还必须满足：  (4-5-20) 五、流加发酵最优控制的算法 考虑产物的形成，、、的具体表达式为：  (4-5-21)  (4-5-22)  Fmin( F ( Fmax (4-5-23) 式(4-5-23)中F表示底物的流加速度，最佳控制的F为：   (4-5-24) Fs 的求解应用(4-5-19)式得：  (4-5-25) 式(4-5-25)中fx表示f对x的微分，q=fxg。由于式(4-5-25)中不显含F，有必要对(4-5-25)式继续作时间t的微分：  (4-5-26) 式(4-5-26)中qx为q对x的微分，由于其中显含F，所以可以求解出单一控制阶段的流加速度Fs：  (4-5-27) 由式(4-5-14)可以看出，对于流加发酵系统，哈密顿函数H不显含t，所以沿最优轨迹哈密顿函数恒等于常数H* ，如果终点时间不确定，则H*=0。这样由(4-5-14)、(4-5-18)、(4-5-25)式可以得到单一控制阶段，在最佳控制下关于(的三个关系式：  (4-5-28) 表4-5-1给出了具体条件下的目标泛函和边界条件。通过上面的分析我们得出流加发酵系统最佳控制F的具体表达式，即最优控制F包含Fmin、Fmax、Fs三种方式。因此如能知道∶(1)Fmin、Fmax、Fs三种方式在发酵过程中的排列顺序；(2)当排列顺序知道后，再确定各种流加方式在最优控制过程中被分配的时间，则运用给定的目标泛函和边界条件，就可以用数值解进行试探迭代，求出最优控制F。 表4-5-1 目标泛函及其相应的((tf)和H* 1.最优化发酵终点的产值 (包括菌体和产物) J=-((Xf+(Pf) ((1tf)=-( (2(tf)=0 (3(tf)=-(  a.终点时间未知 tf未知 (5=0 H*=0  b.终点时间已知 tf已知 (5=0 H*=未知  2.最优化生产强度 终点时间未知 J=-Pftf tf未知 (1(tf)=0 (2(tf)=0 (3(tf)=-1/tf(未知) (5(tf)= Pftf2(未知) H*=0  3.对于一定的产物浓度 要求发酵时间最短 J=tf Pf已知 (1(tf)=0 (2(tf)=0 (3(tf)未知 (5(tf)=1 H*=0  4.最优化发酵终点的产物 (考虑菌体、产物和过程消耗) J=-((Xf+(Pf-(tr) tf未知 (1(tf)=-( (2(tf)=0 (3(tf)=-( (5(tf)=((未知) H*=0   得出Fmin、Fmax、Fs合乎逻辑的排列顺序，必须建立在对发酵过程分析的基础上。对于流加发酵过程，不论流加速度取何种方式──最大、最小或单一速度，必须首先使得菌体生长处于最佳状态，然后促使菌体在最佳的条件下形成目的产物。根据这一论点，以下我们将一般的发酵过程分为三类，分别对上面提出的两个问题进行具体的讨论。类型Ⅰ：细胞生长无抑制和阻遏，产物形成受抑制和组遏；类型Ⅱ：细胞生长受抑制和阻遏，产物形成无抑制和阻遏；类型Ⅲ：细胞生长和产物的形成同时受到抑制和阻遏。 (一)细胞生长无抑制和阻遏，产物形成受抑制和阻遏 由于菌体生长抑制和阻遏，所以当限制性基质浓度最高时，菌体的生长处于最佳。流加过程为：发酵开始时，F必须取Fmax，当菌体达到一定浓度后(相应的时间为t1)，停止流加，经一段时间，反应器中限制性基质、菌体、产物的浓度达到单一阶段的要求(相应的时间为t2)，进入单一阶段，开始流加，流加速度为Fs，单一阶段一直维持至发酵体积达到极限(相应的时间为t3)后，停止流加，发酵继续进行，当最终要求满足后发酵结束(相应的时间为tr)。过程见图4-5-1(I-A)。 图4-5-1 流加操作方式示意图 上述为类型Ⅰ的一般结论，在不同的发酵起始条件下流加方式会有所改变。如果发酵起始条件可以任意选定，流加发酵可能一开始就处于单一阶段，这时的流加方式见图4-5-1 (Ⅰ-C)，Ⅰ-C中t1=t2=0；同样，发酵一开始限制性基质浓度可能很高，这时流加发酵一开始为分批发酵过程，随着发酵进入单一状态(t2)后，开始流加，流加速度为单一流加速度Fs，直至反应体积达到饱和(t3)停止流加，当最终状态到来时(tc)，发酵结束，见图4-5-1(Ⅰ-B)；发酵起始时限制性基质浓度低而菌体浓度高时，其流加方式见图4-5-1(Ⅰ-D)。 从图4-5-1中可以看出，发酵的起始条件对流加方式的影响很大，具体的起始条件可以使流加方式简单化。类型Ⅰ中Ⅰ-C最为理想，Ⅰ-B次之，Ⅰ-A最差。由前面分析可知，有四个时间需要求解，即t1、t2、t3和发酵终点时刻tf。由于发酵体积最大为vf ，所以t3为单一流加阶段当反应体积达到vf 的值；而tf可以通过发酵最终条件是否满足来确定；因此较难求解的仅仅是t1和t2。 (1) t1和t2已知，如何求解最佳轨迹 由于Fmin、Fmax、Fs的排列顺序以及各段在最优化过程中被分配的已知，而且单一控制流速由(4-5-24)给出，所以最佳控制F的求解变成了一个标准的两点边值问题，可以用试探迭代法求解，结合流加发酵的具体情况进行了简化。 简化(1)：在单一阶段存在着关于(的三个关系式(4-5-28)，H*在最佳轨迹下是一个常数，可以用终点的Hf表示，特别当终点时间不确定时，H=0，因此单一阶段只要知道协变量(中的两个，其它就可以由(4-5-28)求出，这样单一阶段正则方程组中(4-5-12、4-5-15式)的微分方程由10个减少到7个 。 简化(2)：(的初值假定从单一阶段开始，而不是从发酵开始时间，且只要假定5个(中的两个。 t1和t2未知 和t1、t2已知的情况一样处理，只是增加了几个步骤，以表4-5-1中“最优化生产强度，自由时间问题”为例，具体运算步骤如下： 取t1和t2，t1< t2； 积分状态方程，取F=Fmax； 当t=t1时，取F=Fmin，对状态方程继续积分； 当t=t2时，取(3、(5的初值(30、(50； 继续积分正则方程组，并应用式(4-5-27)和(4-5-28) ； 当V=Vf时，取F =Fmin ，继续积分直至满足终点条件，得t=tf； 比较(3、(5积分值与边界条件(3(tf)=-1/tf、(5(tf)=-1/tf2是否吻合； 如果相差较大则应用牛顿--拉普逊迭代公重取(3、(5的初始值，回到⑷； 如果满足要求，将t1、t2和相应的目标泛函存盘； 取t2=t2+(t，如果没有超出t2的范围，回到⑵； 取t1=t1+(t，如果没有超出t1的范围，回到⑵； 计算结束后，比较所有的目标泛函，其中最小值所对应的t1、t2即为求解结果，该轨迹为最佳轨迹。 上述运算实现的前提是t1、t2的范围已知，这一点不难做到。对于t1，其最大值t1≤Vmax/Fmax，当停止流加后，随着菌体的生长，底物浓度不断减少，最后达到饥饿状态，所以t2也有一定范围。 (二)细胞生长受抑制和阻遏，产物形成无抑制和阻遏 由于细胞生长受抑制和阻遏，最优化菌体生长处于单一控制阶段。假定初始时基质浓度很低，流加过程为：发酵开始时，F必须取Fmax，当达到单一控制的条件时(此时为t1)，进入单一控制阶段，流加速度为Fs，直到菌体生长满足一定的要求(对应的时间为t2)；随后必须使得产物的形成处于最优，因产物形成无抑制和阻遏，所以F应取Fmax，这样一直维持到流加结束(相应的时间为t3)，停止流加后，发酵继续进行，当终点条件满足后发酵结束(相应的时间为tf)。过程如图4-5-1(Ⅱ-A)所示。 同样，类型Ⅱ的流加方式，也会因发酵起始条件的不同而有所变化。发酵开始时基质浓度较高，流加过程如Ⅱ-B所示；当发酵的起始条件满足单一阶段的要求时，流加过程如Ⅱ-C；特别地，当发酵开始的菌体浓度就很高，这样流加过程控制的目的就简单地变为最优化目标产物的形成，流加过程如图4-5-1(Ⅱ-D)所示。 下面是针对图4-5-1(IIA)，以表1中“最优化生产强度，自由时间问题”为例，给出了类型Ⅱ求解的具体运算步骤： ⑴ 取t1和t2，t1< t2； ⑵ 积分状态方程，取F=Fmax； ⑶ 当t=t1时，取F=Fmin，对状态方程继续积分； ⑷ 当t=t2时，取(3、(5的初值(30、(50； ⑸ 继续积分正则方程组，并应用(4-5-27)、(4-5-28)； ⑹ 当V=Vf时，取F =Fmin ，继续积分直至满足终点条件，得t=tf； ⑺ 比较(3、(5积分值与边界条件(3(tf)=-1/tf、(5(tf)=-1/tf2是否吻合； ⑻ 如果相差较大则应用牛顿--拉普逊迭代公重取(3、(5的初始值，回到⑷； ⑼ 如果满足要求，将t1、t2和相应的目标泛函存盘； ⑽ 取t2=t2+(t，如果没有超出t2的范围，回到⑵； ⑾ 取t1=t1+(t，如果没有超出t1的范围，回到⑵； ⑿ 计算结束后，比较所有的目标泛函，其中最小值所对应的t1、t2即为求解结果，该轨迹为最佳轨迹。 (三)细胞生长和产物形成同时受抑制和阻遏。 由于细胞生长受抑制和阻遏，最优化菌体生长处于单一控制阶段。假定初始时基质浓度很低，流加过程为：发酵开始时，F必须取Fmax，当达到单一控制的条件时(此时为t1)，进入单一控制阶段；因产物的形成也受抑制和阻遏，因此单一控制阶段必须控制底物的浓度使得开始时是最优化菌体的生长，随后转变为最优化产物的形成，这样一直维持到发酵体积为Vf，流加结束(相应的时间为t2)。整个发酵过程如图4-5-1(Ⅲ-A)所示。图5-1中Ⅲ-B为发酵开始时基质浓度较高，Ⅲ-C为发酵初始条件刚好满足单一控制阶段的要求。 下面是针对图4-5-1(Ⅲ-A)，以表1中“最优化生产强度，自由时间问题”为例，给出了类型Ⅲ求解的具体运算步骤： 取t1； 积分状态方程，取F=Fmax； 当t=t2时，取(3、(5的初值(30、(50； 继续积分正则方程组，并应用(4-5-27)和(4-5-28) ； 当V=Vf时，取F =Fmin ，继续积分直至满足终点条件，得t=tf； 比较(3、(5积分值与边界条件(3(tf)=-1/tf、(5(tf)=-1/tf2是否吻合； 如果相差较大则应用牛顿--拉普逊迭代公重取(3、(5的初始值，回到(4) ； 如果满足要求，将t1和相应的目标泛函存盘； 取t1=t1+(t，如果没有超出t1的范围，回到(2) ； 计算结束后，比较所有的目标泛函，其中最小值所对应的t1、t2即为求解结果，该轨迹为最佳轨迹。 六、赖氨酸流加发酵的优化控制 (一)最优流加方式的模型计算 赖氨酸发酵的动力学模型为：  (4-5-29)  (4-5-30)  (4-5-31) 表4-5-2 模型参数的取值 参数 (max Xmax KI K1 K2 Ksp Kip Yx YP m  取值 0.28 17.75 102.1 0.46 0.18 12.2 41.5 0.51 0.61 0.04   从模型中看出，产物的形成和菌体的生长同时受抑制，为上节讨论中的类型Ⅲ。可选流加方式如图4-5-1中(ⅢA-ⅢC)所示，考虑到实际发酵中起始阶段总能维持一定的初糖浓度，因此最优流加方式包括：最小、单一、最大三个阶段，如图4-5-1中(Ⅲ-B)。 优化的目的为获得最高的产物浓度，因此J=-Pr。由表4-5-1可知：(1(tf)= (2 (tf)=(5 (tf)=0，(3=-1，H*=0。这样关于(的三个关系式(4-5-28)可以写为：  (4-5-32) 得：  (4-5-33) 式(4-5-33)中：   将(4-5-33)代入(4-5-27)得：  (4-5-34) 从式(4-5-34)中可以看出Fs与(无关，最优控制的求解只要确定t1的时间即可，具体运算步骤如下： (1)取t1，t1>0； (2)积分状态方程，取F=0； (3)如果基质浓度<0，到(9)，否则到(4)； (4)当t=t1时，取F=Fs，Fs由式(4-5-34)给出； (5)继续积分状态方程； (6)当V=Vf时，取F =0； (7)继续积分状态方程，直至终点条件满足； (8)将所得t1和计算结果存盘； (9)比较所有的计算值，其中产物浓度最大值所对应的t1即为求解结果，该轨迹为最佳轨迹。 表4-5-3 模型计算的初始值 初糖浓度s0/ g(L-1 初始体积v0/ L 最终体积vf/ L 发酵总糖s总/ g 补液糖浓sf/ g(L-1  40 8 16 3200 360   表4-5-3为模型计算的初始值，计算出的最优化流加方式以及菌体、残糖、产物的变化曲线如图4-5-2所示。最优化流加方式包括开始的分批阶段(0 h ~11.1 h)，单一控制阶段(11.1 h ~63.9 h)和停止流加后的一个分批阶段(63.9 h~72.4 h)。从图中可以看出单一控制分为明显的两个过程；在11.1~17.4 h之间流加速度增长很快，此时葡萄糖的浓度很快从13.54 g/L增加到22.4 g/L；当t>17.4 h后流加速度突然从0.35 L/h降低到0.128 L/h，其后流加速度一直缓慢地增加，增加趋势几乎呈线性变化，在这一阶段葡萄糖浓度一直维持在22.4g/L这个恒定的水平。菌体浓度的变化在发酵开始阶段增加很快，当t>17.4 h后，菌体浓度基本达到饱和。产物浓度的变化在整个发酵过程中一直保持增长的趋势，按此最佳操作，发酵72.4 h后，发酵液中的产物浓度为85.85 g/L，总转化率为0.429 g/g。 从模型计算结果可以看出，发酵终点的产物浓度和转化率均大大高于分批操作，这是在单一控制阶段通过优化流加方式而实现的，那么在单一控制阶段到底隐含着一个什么样的发酵本质？ 图4-5-2 最优化流加方式下过程曲线(模型计算) (二)单一控制阶段的发酵本质 直接用上述赖氨酸分批发酵动力学模型进行分析较为困难，若假定(、(、( 只是基质s的函数。因J=-Pr所以(1(tf)= (2 (tf)=(5 (tf)=0，(3(tf)=-1，H*=0。 则哈密顿函数为：  (4-5-35) 其中： (T (4-5-36)  (4-5-37) (通过(4-5-15)式求解，具体表达为：  (4-5-38)  (4-5-39)  (4-5-40)  (4-5-41)  (4-5-42) (注：式(4-5-38)、(4-5-40)中上标’代表对限制性基质浓度s的微分) 等式(4-5-28)可以表达为：  将式(5-4-43)～(5-4-44)代入式(5-4-38)～(5-4-42)，可知在单一控制阶段有：  (4-5-46) Fs的一般求解可以通过等式(4-3-16)，但对于所讨论的具体情况Fs为：  (4-5-47) 所以，对t的再次微分也为零，得：  即：  (4-5-48) 式(4-5-48)中S表示基质浓度，上标’’代表对限制性基质浓度S的二阶微分。由等式(4-5-46)可知，所以，即在单一控制阶段反应器中基质的浓度维持在一个恒定的水平(S*)，因此流加速度Fs为：  (4-5-49) S*的值可以通过(4-5-43)、(4-5-45)联立，消去(2得：  (4-5-50) 等式(4-5-50)可以变化为：  得：  (4-5-51) 因、均为零，所以(1、(3是常数，其值为可用终点状态表示∶ ， 代入(4-5-51)得：  (4-5-52) 由等式(4-5-52)可以求出S*，分析(4-5-52)可以看出该S*值使得发酵过程的产物的转化率达到最大。因此单一控制阶段的实质为：当发酵结束时为了获得最高的产物浓度，在单一控制阶段基质的浓度以维持产物的转化率处于最大。当(、(、(只是基质S的函数时，在单一控制阶段最佳的基质浓度是一个定值，因此在单一控制阶段基质浓度一直处于这一恒定的水平：  (4-5-53) 从式(4-5-53)中可以看出，(、(、(均是s、x的函数，所以在单一控制阶段要使每一时刻的转化率处于最大，基质浓度必然随菌体浓度的变化而变化。但当x接近xmax时，由赖氨酸发酵动力学模型可知：  (4-5-54)  (4-5-55) 所以：  (4-5-56) 得：=22.5 (g/L) 上述分析结果和图4-5-2直接计算出的结果完全一致：流加开始阶段(11.4~17.4 h)随着菌体浓度的变化，基质浓度从7.9 g/L增加到22.4 g/L，当t>17.4 h后，菌体浓度基本接近其最大值，此时基质浓度一直维持在22.4 g/L。 (三)最优化流加操作方式的简化 通过前面对单一控制阶段的讨论可以看出，在最优化的流加方式下流加阶段每一时刻产物的转化率均处于最高的状态，因而能获得最理想的发酵结果。但是分析图4-5-2可以看出，最优化的流加方式非常复杂，特别是流加开始阶段s随着x而变化造成Fs急剧升高，因此直接按此流加方式进行实际操作非常困难。事实上，由于菌体浓度能很快地接近其最大值，所以流加培养过程的开始阶段在流加阶段中所占份额很小，据此可以得出如下的次优化流加方式，即：流加培养过程从开始到结束均维持基质浓度处于22.5 g/L。这样整个发酵过程为： (1)开始的一段分批发酵过程； (2)当基质浓度为22.5 g/L时开始流加，在流加阶段一直维持基质浓度处于22.5 g/L； (3)流加结束后再经一个分批发酵阶段，直至发酵结束。 图4-5-3为按优化流加方式计算出的流加方式以及菌体浓度、残糖浓度和产物浓度的变化曲线，模型计算初值选用表4-5-3的数据。按次优化流加方式培养72.8 h后，发酵液中的产物浓度为85.65 g/L，总转化率为0.428 g/g。这和图4-5-2中按最优化方式计算出的结果非常接近。 图4-5-3 次优化流加方式下发酵过程曲线(模型计算) (四)流加发酵全过程的模型分析 通过前面的研究，我们得到了流加过程的操作方式：流加阶段应维持基质的浓度处于22.5 g/L。但流加发酵的全过程不仅仅包括流加阶段还包括分批阶段。以表4-5-4的数据进行分析：发酵的总糖为3200 g，其中分批阶段投入的糖为320 g，流加阶段投入的糖为2880 g。可见在整个发酵过程中糖的消耗被分为二个部分，因此要考察流加发酵全过程是否合理，还有一个问题需要考虑：对于一定的总糖，在分批阶段和流加阶段应如何分配才最为合理？ 分批阶段所消耗的糖为(s0(V0)，流加阶段所消耗的糖为(s总-s0(V0)，可见在总糖一定时，上述分配比例仅仅和s0、V0有关。下面我们讨论总糖为3200 g、Vf=16 L时，s0、V0对整个发酵的影响，依此决定较适的x0、V0，并进一步分析流加阶段基质浓度变化时对整个发酵的影响。 (1)s0的变化对流加发酵全过程的影响 表4-5-4 模型计算初始值 初糖浓度s0/ g(L-1 初始体积v0/ L 最终体积vf/ L 发酵总糖s总/ g 补液糖浓sf/ g(L-1  s0 8 16 3200 (3200-8s0)/8   从图4-5-4中可以看出，在较低的初糖浓度范围内(<50 g/L)，流加发酵过程能保持高的总转化率，初糖浓度提高，转化率呈下降的趋势，且初糖浓度越高转化率下降的幅度越大，进一步说明高浓度基质对赖氨酸合成存在抑制作用。因此在流加发酵中不但要保持流加阶段处于最适的条件，在开始的分批阶段也应维持较适当的初糖浓度，才能充分发挥流加操作的优势。 图4-5-4 s0的变化对发酵过程转化率的影响 (2)V0的变化对流加发酵全过程的影响 表4-5-5 模型计算初始值 初糖浓度s0/ g(L-1 初始体积v0/ L 最终体积vf/ L 发酵总糖s总/ g 补液糖浓sf/ g(L-1  50 V0 16 3200 (3200-50V0)/(16-V0)   V0增加意味着更多的糖在分批发酵中消耗。当分批阶段初始糖浓较高时，赖氨酸的合成会受抑制作用，此时随着V0的增加，发酵过程中赖氨酸形成受抑制的时间将会延长，造成发酵过程总转化率的下降，从图4-5-5中可见，当初糖浓度为150 g/L时，随着V0的增加，发酵过程的总转化率呈下降的趋势。 在初糖浓度较低时(50 g/L)，V0的变化对发酵过程的影响如图4-5-6所示。初糖浓度较低时分批阶段赖氨酸的形成几乎不受影响，再加上分批阶段所消耗的糖相对较少，因而V0的增加对发酵过程的总转化率影响不大。从图4-5-6中可以看出，与初糖浓度较高时不同，发酵过程的总转化率没有表现出随V0升高而下降的趋势，其值几乎保持不变。不但如此，由于V0的增加，分批培养阶段所获得的菌体量也增加，有利于缩短发酵总时间。从图4-5-6中可以进一步看出，发酵过程的生产强度几乎随V0的增加呈线性的增长，因此在初糖浓度低时增加V0对整个流加操作是有利的。 图4-5-5 V0的变化对发酵过程转化率的影响(s0=150 g/L) 图4-5-6 V0的变化对发酵过程转化率和生产强度的影响(s0=50 g/L) 从上述对V0和s0的分析可以得出如下的结论：分批阶段应保持较低的s0，在此基础上V0应尽可能取最大值。然而，当Vr、s总和s0一定时，V0的增加将导致流加液中基质浓度sr增加。由于实际生产中sf常常不可能取很大的值，所以V0的取值也是有限制的，可由式(4-5-57)计算出该值。图4-5-7给出了sf随s0的变化关系(模型计算初始值同图4-5-6)。  (4-5-57) 图4-5-7 sr随V0的变化关系 (3)流加阶段基质浓度变化对发酵过程的影响 表4-5-6 模型计算初始值 初糖浓度s0/ g(L-1 初始体积v0/ L 最终体积vf/ L 发酵总糖s总/ g 补液糖浓sf/ g(L-1  50 8 16 3200 350   流加阶段的糖浓度应处于22.5 g/L，图4-5-8进一步分析了流加阶段糖浓度(s*)的变化对发酵结果的影响：流加阶段糖浓度(s*)>22.5 g/L时，随s*的升高发酵过程的转化率下降；但当s*<22.5 g/L时，发酵过程的转化率随s*的升高而升高；当s*维持在22.5 g/L时，发酵过程可以获得很高的转化率。值得一提的是当s*处于22.5 g/L附近时，糖浓度的变化对转化率的影响不很明显，从图4-5-8中可以看出当s*在20~30 g/L时均可以获得较高的转化率。 图4-5-8 s*的变化对发酵过程转化率的影响 (五)流加发酵优化控制的结果 通过前面的研究，我们可以总结出赖氨酸产生菌FB42流加发酵优化控制的策略： 选取分批阶段适宜的初糖浓度，其值为50 g/L左右； 选取分批阶段适宜的操作体积，该值可由(4-5-57)式得出； 在流加过程中控制糖浓度处于22.5 g/L，如果条件不允许，可更粗略地控制糖浓度在20~30 g/L之间。 按上述控制方式进行实验，实验结果列于表4-5-7中，图4-5-9为46批发酵过程曲线。从表4-5-7中可以看出平均发酵产酸为81.6 g/L，转化率为0.418 g/g，生产强度为1.16 g/(L(h)。和分批发酵相比(见表4-5-8)分别提高了45.4%、9.7%和28.3%。 表4-5-7 流加发酵的实验结果 批号 s0 / g(L-1 V0 / L Vr / L S总 / g(L-1 产酸 / g(L-1 转化率 / g(g-1 发酵周期 /h 生产强度 /g(L-1(h-1  46 45.6 8.7 16.3 20.1 85.2 0.423 71 1.2  48 53.2 9.2 15.9 18.8 78.3 0.416 70 1.11  49 50.2 8.8 16.2 19.2 80.0 0.416 71 1.13  平均     81.6 0.418  1.16   注：表4-5-7中S总以浓度表示，等于投入的总糖质量除以发酵总体积。 图4-5-9 第46批实际发酵过程曲线 表4-5-8 流加发酵和分批发酵的比较 操作方式 产酸/ g(L-1 转化率/ g(g-1 生产强度/ g(L-1(h-1  分批发酵 56.1 0.381 0.904  流加发酵 81.6 0.418 1.16  注：表4-5-8中分批发酵的数据取之表4-4-4 由此表明，赖氨酸发酵实现高水平必须要通过流加方式，但如不进行很好的控制，流加操作方式的优势往往得不到发挥。此外，流加发酵最优化的研究所涉及的问题较为广泛，因此必须针对具体的发酵类型进行分析，才能得出合理的算法，求解出底物的最佳流加方式。直接计算出底物最优化流加方式后，还必须进行深入的分析，得出较为简单的控制方式，这样才能在实际应用中成为可能。流加操作的全过程包括分批和流加两个阶段，因此仅仅着眼于流加阶段的优化还不够，必须对分批和流加两个阶段进行通盘考虑，这样才能使流加操作全过程处于最合理的状态。 第四章主要参考文献 Kess RD, Stephanopoulos G. Metabolic characterization of l L-lysine producing strain by continuous culture. Biotechnol. Bioeng., 1992, 39: 565-574 Vallino JJ, Stephanopoulos G. Metabolic flux distributions in Corynebaxterium glutamicum during growth and lysine overproduction. Biotechnol. Bioeng. 1993, 41: 633~646. Nielsen J, Nikolajsen K, Villadsen J. Structured modelling of a microbial system II. Experimental verification of a structured lactic acid fermentation model. Biotechnol. Bioeng., 1991, 38:11-23 宫衡．赖氨酸发酵优化与控制的研究．无锡轻工业学院博士学位论文，1994年12月