第五章 丙酮酸发酵过程优化 1
第一节 丙酮酸发酵概述 1
一、引言 1
二、国外研究水平和发展趋势 1
三、发酵法生产丙酮酸研究中存在的问题 6
四、本章主要内容 7
第二节 营养条件对光滑球拟酵母WSH-IP12生产丙酮酸的影响 8
一、引言 8
二、酵母粉浓度对丙酮酸发酵的影响 8
三、蛋白胨浓度对丙酮酸发酵的影响 8
四、豆饼水解液和无机氮源对丙酮酸发酵的影响 9
五、分批培养中供氧方式和培养基碳氮比对丙酮酸发酵的影响 10
六、葡萄糖流加培养中氮的供给对丙酮酸发酵的影响 11
七、讨 论 13
第三节 维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用 15
一、引言 15
二、突变株T. glabrata WSH-IP303的获得及其氮源同化能力 15
三、维生素对WSH-IP303过量合成丙酮酸的影响 17
四、维生素亚适量供给下的分批发酵过程 20
五、讨论 22
第四节 丙酮酸分批发酵的供氧控制模式 25
一、引言 25
二、丙酮酸分批发酵过程的溶氧变化情况 25
三、不同kLa下WSH-IP303发酵生产丙酮酸的动力学特征 25
四、分阶段供氧控制模式的提出和实验验证 27
五、讨论 29
第五节 丙酮酸发酵过程的代谢网络分析 32
一、引言 32
二、代谢网络构建和代谢通量计算 32
三、不同硫胺素浓度和不同DOT下的分批发酵结果 34
四、不同硫胺素浓度和不同DOT下NADPH的产生与消耗 37
五、不同硫胺素浓度和不同DOT下NADH的产生与消耗 38
六、不同硫胺素浓度和不同DOT下ATP的产生与消耗 39
七、讨论 41
第六节 丙酮酸发酵的逐级放大和中间试验 49
一、引言 49
二、30 L发酵罐中葡萄糖浓度对WSH-IP303菌株生产丙酮酸的影响 49
三、300 L规模的丙酮酸发酵试验 50
四、5 m3规模丙酮酸发酵中试 51
第五章 丙酮酸发酵过程优化
第一节 丙酮酸发酵概述
一、引言
丙酮酸(Pyruvic acid)，又称2-氧代丙酸(2-oxopropanoic acid)、(-酮基丙酸((-ketopropionic acid)或乙酰基甲酸(acetylformic acid)，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的(-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种有用化合物的前体，因此，它在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中都有广泛的用途，如表5-1-1所示。
表5-1-1 丙酮酸的主要用途
用 途
实 例
用 途
实 例
制药工业
酶法合成L-色氨酸、L-酪氨酸、L-多巴；合成L-半胱氨酸、L-亮氨酸、VB6和VB12等。
生化研究
用于伯醇及仲醇的检定；转氨酶的测定；是脂肪族胺的显色剂等。
农用化学品
是合成乙烯系聚合物、氢化阿托酸、谷物保护剂等多种农药的起始原料。
细胞培养
与乳酸组成抗氧化剂，降低对细胞的伤害；是动物细胞培养的重要底物。
食品工业
GB 2760-1996规定为酸味添加剂。近年来由于在减肥上有特效而受到西方消费者青睐。
传感器
与乳酸、锂构成人工胰脏，作为体外传感器测定葡萄糖的含量。
虽然作为一种化工产品，丙酮酸早已实现了工业化生产，但是，直到20世纪90年代， 工业上生产丙酮酸的方法仍是酒石酸脱水脱羧法∶将酒石酸与硫酸氢钾混合物在220 ℃下蒸馏，馏出物再经真空精馏即可得到丙酮酸。这种工艺的主要缺点是∶(1) 丙酮酸产率较低(对酒石酸的产率系数为0.29～0.30 g/g)；(2)得到1 g丙酮酸需要消耗5 g硫酸氢钾。为此，在很长一段时间内，丙酮酸的价格居高不下，推广应用自然也受到限制。以丙酮酸在食品工业中的应用为例，尽管它是一种很有潜力的酸味剂，但由于其在价格上与其它有机酸相比过于昂贵，因此，几乎没有厂家愿意在饮料或食品中添加丙酮酸来改善风味。
开发成本更低的丙酮酸生产技术，如直接发酵法或生物转化法，是扩大丙酮酸应用范围的根本途径。然而，丙酮酸在代谢途径中所处的关键地位，使得丙酮酸高产菌株的选育十分困难。尽管有一些微生物能够积累丙酮酸，但其产量无法达到工业化的要求。发酵法生产丙酮酸真正取得突破，是在1988年。当时，日本东丽工业株式会社的研究人员选育出一系列丙酮酸产量超过50 g/L的球拟酵母(Torulopsis)菌株，使得发酵法生产丙酮酸的工业化成为可能。1992年，日本开始采用发酵法生产丙酮酸，产量为400 t/a，售价为4000日元/kg。国内除作者发表的论文外，尚未见关于发酵法生产丙酮酸的公开文献报道。
二、国外研究水平和发展趋势
发酵法生产丙酮酸包括两种方法∶一种是微生物在生长过程中直接利用碳源积累丙酮酸，即直接发酵法；另一种是微生物先生长，再转化底物为丙酮酸，称之为休止细胞法。休止细胞法与完整细胞酶法合成丙酮酸的区别在于∶后者是利用微生物中某一种具有特定功能的酶完成由底物(如乳酸)向丙酮酸的转化；而前者则是利用微生物中的一系列酶(如EMP途径酶系)完成由底物(如葡萄糖)生成丙酮酸的转化过程。因此，休止细胞法也可归广义的发酵法。
(一)酵母直接发酵生产丙酮酸
在直接发酵法生产丙酮酸的菌株中，酵母是研究得最多的一种。表5-1-2中对酵母发酵生产丙酮酸的情况进行了总结，从中可以了解到近30年来国外学者在利用酵母生产丙酮酸方面的研究进展。
表 5-1-2 以酵母为菌种直接发酵生产丙酮酸的研究情况一览
菌株
遗传特点
碳源
氮源
温度
/℃
时间
/ h
丙酮酸
/ g(L-1
产率
/ g(g-1
反应器
Candida lipolytica
可利用脂肪酸酰胺为碳源
乙酰胺
玉米浆
31.5
72
1.5
0.15
摇瓶
Candida maltosa
丙酸
(NH4)2SO4
NH4NO3
31.5
72
2.2
0.22
摇瓶
Candida lipolytica
硫胺素、蛋氨酸营养缺陷型
葡萄糖
NH4NO3
30
72
43.6
0.44
摇瓶
Debaryomyces coudertii
柑桔皮水解物
(NH4)2SO4
NH4NO3
30
48
11.5
摇瓶
Debaryomyces hansenii
硫胺素、生物素营养缺陷型
葡萄糖
蛋白胨
28
96
42
0.42
摇瓶
Saccharomyces cerevisiae
硫胺素营养缺陷型
葡萄糖
30
48
36.9
0.37
摇瓶
Torulopsis sp.
硫胺素营养缺陷型
葡萄糖
蛋白胨(含生物素)
30
60
40.7
0.41
摇瓶
Torulopsis sp.
精氨酸营养缺陷型
葡萄糖
聚胨
30
60
49.3
0.49
摇瓶
Torulopsis sp.
异亮氨酸、缬氨酸营养缺陷型
葡萄糖
聚胨
30
60
50
0.50
摇瓶
Torulopsis sp.
氨基羟基乙酸抗性
葡萄糖
聚胨
30
60
52.1
0.52
摇瓶
Torulopsis
Glabrata
硫胺素、生物素、精氨酸缺陷型，氨基羟基乙酸抗性
葡萄糖
蛋白胨
30
60
27.3
0.54
摇瓶
Torulopsis sp.
2-脱氧葡萄糖抗性
葡萄糖
蛋白胨
30
60
52.1
0.52
摇瓶
Torulopsis sp.
PDC活性降低
葡萄糖
蛋白胨
30
60
56.8
0.58
摇瓶
Torulopsis glabrata
硫胺素、生物素、吡哆醇、烟酸营养缺陷型
葡萄糖
聚胨
30
59
57
0.57
摇瓶
Torulopsis glabrata
硫胺素、生物素、吡哆醇、烟酸营养缺陷型
葡萄糖
聚胨
30
63
67.8
0.49
3 L发酵罐
Torulopsis etchellsii
嗜盐
葡萄糖
NH4Cl
KNO3
30
14 d
1.08
0.02
摇瓶
Torulopsis etchellsii
嗜盐
葡萄糖
酪蛋白
氨基酸
30
10 d
5.1
0.10
1 L发酵罐
图5-1-1 光滑球拟酵母中丙酮酸的代谢途径
Ⅰ: 丙酮酸脱羧酶(PDC)；Ⅱ: 转氨酶；Ⅲ: 丙酮酸羧化酶(PC)；Ⅳ: 丙酮酸脱氢酶系(PDH)
NA∶烟酸；B1∶硫胺素；B6∶吡哆醇；Bio∶生物素
球拟酵母(Torulopsis)属菌株，特别是烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素四种维生素的营养缺陷型T. glabrata IFO 0005，是发酵法生产丙酮酸的首选菌株。T. glabrata的维生素营养缺陷型能够积累丙酮酸的生理学依据如图5-1-1所示。烟酸和硫胺素是丙酮酸脱氢酶系的辅因子；生物素是丙酮酸羧化酶的辅因子；吡哆醇是转氨酶的辅因子；硫胺素是丙酮酸脱羧酶的辅因子。由于营养缺陷型菌株自身不能合成这些维生素，当培养基中这些维生素的浓度处于亚适量水平时，负责丙酮酸降解或转化的四种酶的活性均较低，于是丙酮酸得以积累。
在一般培养条件下，T. glabrata IFO 0005对葡萄糖的丙酮酸产率为0.41 g/g。米原辙对该菌株进行诱变，增加一系列遗传标记(如L-Arg营养缺陷型；L-Val和L-Ile营养缺陷型；2-脱氧葡萄糖抗性和氨基羟基乙酸抗性)以后，丙酮酸产率可提高到0.54 g/g。为了减少突变株产乙醇的能力，进一步提高丙酮酸产率，米原辙又通过选育乙酸营养缺陷型菌株，有效地降低了突变株的PDC活性，使丙酮酸产率提高到0.58 g/g。尽管经过研究者的不懈努力，摇瓶发酵中的丙酮酸产量和产率已分别达到56.8 g/L和0.58 g/g，但要获得丙酮酸高产量与高产率的统一却并非易事。如，日本东丽化学公司采用流加培养技术，在3 L发酵罐中丙酮酸产量达到67.8 g/L，然而丙酮酸产率仅为0.49 g/g。
嗜盐酵母Torulopsis etchellsii能在含盐量达80 g/L的葡萄糖培养基中积累丙酮酸，但产率很低。硫胺素营养缺陷型菌株Candida lipolytica、Debaryomyces hansenii和Saccharomyces cerevisiae积累丙酮酸的能力也不弱。其产率(0.37～0.44 g/g)虽然不及T. glabrata，但这些酵母能以无机铵盐为唯一氮源，而这一特点又是T. glabrata所不具备的。
日本开展发酵法生产丙酮酸的研究的公司主要有3家。20世纪70年代是味之素发酵株式会社，以研究假丝酵母(Candida)为主；80～90年代则是东丽工业株式会社，以研究球拟酵母(Torulopsis)为主；另一家公司(Toyobo Co. Ltd.)发表的专利和研究报告略少，以研究德巴利酵母(Debaryomyces)为主。这些公司之间的竞争，是推动日本发酵法生产丙酮酸迅速实现工业化的动力。
(二)细菌或放线菌直接发酵生产丙酮酸
在已有的文献报道中，酵母积累丙酮酸一般都以葡萄糖为底物。相对而言，细菌积累丙酮酸时所能利用的底物种类更多一些。如表5-1-3所示，能直接利用葡萄糖为底物积累丙酮酸的细菌只有大肠杆菌(E. coli)。另有许多细菌能以葡萄糖酸、丙二醇和丙酸为底物生产丙酮酸。这些细菌通常没有明显的与丙酮酸代谢有关的遗传标记，其丙酮酸产率虽然不是很低(介于0.3～0.4 g/g之间)，但丙酮酸产量最高仅为23 g/L (Nocardia fumifera以葡萄糖酸为底物积累丙酮酸)。如此低的产量注定这些研究在目前还只能处于实验室阶段。
表5-1-3 以细菌或放线菌为菌种直接发酵生产丙酮酸的研究情况一览
菌株
遗传特点
碳源
氮源
温度
/ ℃
时间
/ h
丙酮酸
/ g(L-1
产率
/ g(g-1
反应器
Schizophyllum commune
葡萄糖
聚胨
27
120
19
0.38
摇瓶
Escherichia coli
硫辛酸缺陷型
葡萄糖
聚胨
37
32
25.5
0.51
5 L
发酵罐
Escherichia coli
硫辛酸缺陷型, 缺失F1-ATP酶活性
葡萄糖
聚胨
37
24
30
0.60
5 L
发酵罐
Nocardia lutea
丙酸
(NH4)2SO4
NH4NO3
31.5
72
2.5
0.25
摇瓶
Nocardia fumifera
葡萄糖酸
(NH4)2SO4
30
96
23
0.46
摇瓶
Pseudomonas tabati
13
0.26
Pseudomonas stutzeri
葡萄糖酸
(NH4)2SO4
30
144
12
0.24
摇瓶
Enterococcus casseliflavus
葡萄糖酸
酵母膏
30
72
16
0.32
摇瓶
Corynebacterium sp.
1,2-丙二醇
铵盐
28
8.1
0.41
摇瓶
Acinetobacter sp.
硫胺素缺陷型
1,2-丙二醇
聚胨
28
96
11.6
0.58
摇瓶
Pseudomo烟酸s sp.
1,2-丙二醇
NH4NO3
30
72
14
0.35
摇瓶
与Miyata等选育T. glabrata的多重维生素营养缺陷型不同的是，Yokota选育的E. coli W1485lip2遗传标记非常简单，仅为硫辛酸营养缺陷型。硫辛酸也是PDH的辅因子，在硫辛酸亚适量供给的情况下，E. coli W1485lip2过量积累丙酮酸的原理与T. glabrata IFO 0005是基本相同的。Yokota认为硫辛酸营养缺陷型比硫胺素营养缺陷型性能更佳，其原因是由于硫胺素是磷酸戊糖途径中转酮酶的辅因子，故磷酸戊糖途径的活性在T. glabrata的硫胺素营养缺陷型中会受到影响，但在E. coli的硫辛酸营养缺陷型中则不会。E. coli W1485lip2培养32 h时丙酮酸产率达0.51 g/g，而以该菌株为出发菌株构建的缺失F1-ATP酶活性的E. coli TBLA-1培养24 h时丙酮酸产率就达到了0.6 g/g(参见表5-1-3)。其原因是∶E. coli TBLA-1缺失F1-ATP酶活性后，通过氧化磷酸化途径形成的ATP减少，细胞整体能量水平下降，葡萄糖分解速度加快，从而使得丙酮酸积累速度显著提高。
细菌发酵生产丙酮酸的另一个特点是∶培养基的pH一般在7.0左右甚至更高一些。这意味着可以构建一个发酵生产丙酮酸─酶法合成色氨酸的耦合系统。Yokota和Takao先在含50 g/L葡萄糖的培养基中培养Agaricus campestris，待发酵液中丙酮酸产量达到22～26 g/L时，加入具有色氨酸酶活性的Enterobacter aerogenes、吲哚和氯化铵，转化12 h后L-Trp产量达到15 g/L。这一耦合系统随后又有新的发展，Yokota筛选了具有色氨酸酶活性的Enterobacter aerogenes的硫辛酸营养缺陷型(可积累丙酮酸)。待发酵液中丙酮酸产量达到17 g/L时，只需加入吲哚和氯化铵就可将丙酮酸转化为L-Trp(14 g/L)。由于限制L-Trp浓度进一步提高的原因是Enterobacter aerogenes的丙酮酸产量不高，为了获得更高的L-Trp产量，Kawasaki 将Enterobacter aerogenes中编码色氨酸酶的基因克隆至质粒pKT901EA上，然后转入丙酮酸生产菌E. coli W1485lip2中。在葡萄糖浓度为50 g/L的培养基中，最终L-Trp的产量提高到23.7 g/L。
(三)休止细胞法生产丙酮酸
表5-1-4中给出的采用休止细胞法生产丙酮酸的微生物，有一些也可以用于直接发酵法。如Acinetobacter sp.(表5-1-3)和Debaryomyces coudertii(表5-1-2)。对这两株菌来说，休止细胞法的丙酮酸产量虽然略低于直接发酵法，但培养时间显著缩短，如Acinetobacter sp.由96 h缩短到24 h，Debaryomyces coudertii则由48 h缩短到10 h。其缺点是操作比较繁琐∶需要先培养细胞，再分离细胞，洗涤，最后才用于合成丙酮酸。也有不需要进行细胞分离操作的报道。一个例子是，细胞先以甘油为碳源生长，待氮源(NaNO3)耗尽后加入葡萄糖。细胞由于缺氮而不能生长，自然转向积累丙酮酸。遗憾的是丙酮酸产量不高。另一个例子是待细胞在pH 4.5～5.5的条件下生长90 h后将pH降至3.5～4.5，实验结果表明，这种pH控制策略可有效地抑制(-酮戊二酸的形成。其缺点是反应器结构比较复杂，培养时间也太长。严格地说，这两个例子都不是真正意义上的休止细胞法，但由于其有别于典型的发酵法，因此将其放至表5-1-4中进行讨论。
表5-1-4 采用休止细胞法生产丙酮酸的研究情况一览
菌株
方 法
碳源
氮源
温度
/ ℃
时间
/ h
丙酮酸
/ g(L-1
生长因子
产率
/ g(g-1
反应器
Acinetobacter sp.
先培养细胞，
再转化底物
1,2-丙二醇
28
24
10
硫胺素
0.50
摇瓶
Candida sp.
pH 4.5～5.5下生长，pH 3.5～4.5下产酸
葡萄糖
NH4NO3
30
180
40.6
生长需硫胺素，产酸不需要
0.41
5 L
发酵罐
Debaryomyces coudertii
先培养细胞，
再转化底物
柑桔皮
水解物
30
10
7.9
添加ATP和NAD+
0
摇瓶
Enterobacter aerogenes
先培养细胞，
再转化底物
葡萄糖
30
10
3.6
LA-，添加亚砷酸钠
0.8
摇瓶
Xanthomonas campestris
氮源耗尽后加入葡萄糖，产酸
甘油
葡萄糖
烟酸NO3
30
30
10.3
酵母膏
0.29
摇瓶
(四)完整细胞/酶法生产丙酮酸
近年来关于酶法生产丙酮酸的研究也很热门。如利用Acetobacter将D-(-)-乳酸氧化为丙酮酸，转化率虽然较高，但由于D-(-)-乳酸比L-(+)-乳酸价格高得多，所以在实现工业化方面有困难。由Hansenula polymorpha中的乙醇酸氧化酶催化的L-乳酸氧化反应具有高底物转化率的优点，但由于L-乳酸氧化为丙酮酸的过程中会产生H2O2，如果不及时去除，丙酮酸会被进一步氧化为乙酸。L-乳酸在价格方面是非常有优势的，目前的关键是如何解决丙酮酸被H2O2进一步氧化的问题。已经开发出一些方法，如，利用Pichia pastoris中的过氧化氢酶来分解乳酸氧化过程中产生的H2O2。在这一方面，美国杜邦公司开展了大量的研究工作，但迄今为止，还未见到工业化成功的消息。
表5-1-5 完整细胞或酶法合成丙酮酸的研究情况一览
菌 株
酶
底 物
反应原理
温度
/ ℃
时间
/ h
丙酮酸
/ g(L-1
产率
/ g(g-1
Acetobacter
D-(-)-乳酸
Bacteria
甲醛脱氢酶
丙酮醛
丙酮醛氧化
30
10
3.6
Clostridium sporogenes
丙酮酸合酶
乙酰磷酸
还原性羧化
Hansenula polymorpha
Pichia pastoris
乙醇酸氧化酶
过氧化氢酶
L-乳酸
乳酸氧化
Pediococcus homari
甘油
30
24
15
0.3
Rhodotorula gracilis
D-氨基酸氧化酶过氧化氢酶
0.23 g/dU
三、发酵法生产丙酮酸研究中存在的问题
发酵法生产丙酮酸所追求的目标，是实现丙酮酸高产率、高产量和高生产强度的统一。也就是说，在尽可能短的时间内，消耗尽可能少的底物生产出尽可能多的产品。一般情况下，这种完美的统一是无法实现的，只能退而求其次，以获得丙酮酸高产率、高产量和高生产强度的相对统一为研究目标。从代谢控制的观点考虑，为了实现这一目标，必须从两方面入手∶(1)在保证细胞正常代谢的前提下，尽可能减少丙酮酸的降解或转化，这是获得丙酮酸高产量和高产率的必要条件；(2)加快从葡萄糖到丙酮酸的代谢速度，以确保获得丙酮酸的高生产强度。
前已述及，日本东丽化学公司米原辙和宫田令子选育了具有多种遗传标记的Torulopsis glabrata菌株，且每增加一个遗传标记，丙酮酸产量就有新的提高(在摇瓶培养中丙酮酸产量和产率已分别达到56.8 g/L和0.58 g/g)，但要获得丙酮酸高产量与高产率的统一却并非易事。如，在3 L发酵罐中通过流加培养，丙酮酸产量可达67.8 g/L，其代价是丙酮酸产率仅为0.49 g/g。之所以不能很好地解决这一问题，其原因在于T. glabrata不是发酵工业上的常用菌株，学术界对该菌株在过量合成有用物质的生理生化特性上还缺乏明确的认识。
对于任何一种发酵产品，要获得高产率、高产量和高生产强度的相对统一，首先要找出影响该物质高效生产的最重要因素，然后考察这些因素对发酵过程的影响，从生理学的角度出发对这些因素的影响规律进行分析，进而提出针对这些影响因素的控制方法或策略。用这一思路去分析米原辙和宫田令子的研究结果，就会发现，他们的侧重点在于选育丙酮酸的高产菌株，对于采用什么方法来保证这些菌株发挥出高产丙酮酸的潜力，研究得还很不够，因而会产生这样一些问题∶
1．见诸文献报道的所有T. glabrata菌株均以聚蛋白胨或蛋白胨为氮源。一般来说，质量好的聚蛋白胨中应当没有维生素，但T. glabrata IFO 0005在只有聚蛋白胨而没有维生素的种子培养基中照样生长良好，表明聚蛋白胨中的维生素含量已足以满足多重维生素营养缺陷型菌株的生长。在这种情况下研究该菌株所不能合成的维生素在代谢途径中的作用，显然无法得出明确的结论，也不可能使丙酮酸产率达到很高的水平。
2．T. glabrata所不能合成的维生素有四种∶烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素。虽然宫田令子和米原辙曾采用单因素试验的方法考察了这四种维生素对丙酮酸发酵的影响，但实际上，由于培养基中四种维生素的水平直接影响PDC、PDH、PC和PT的活性，仅仅依靠单因素试验，很难分析出烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素各自在丙酮酸过量合成中的作用，也就谈不上确定合理的优化策略。
3．已有报道认为较高的溶氧有利于丙酮酸的积累，但对溶氧高到什么程度，应当怎样控制等具体问题并没有明确的结论。此外，如果把维生素作为影响T. glabrata生产丙酮酸最重要的因素，溶氧作为次重要因素，这两种因素组合起来会对丙酮酸发酵过程产生什么影响，至今未有研究者涉足。
4．培养基优化是实现T. glabrata高产丙酮酸的一项基础性工作。然而，迄今为止，关于营养条件对丙酮酸发酵过程的影响、特别是三种最主要的营养元素(碳、氮、磷)的影响未有详细报道。如，葡萄糖对菌体生长和产酸是否存在抑制? 是否有可能先培养细胞，待氮源耗尽后，细胞再转向大量积累丙酮酸? 无机磷是EMP途径的必需元素，在丙酮酸生产中又起到什么样的作用?
这些问题的解决，对理解T. glabrata 发酵生产丙酮酸的生理学本质，进而确定一系列以实现丙酮酸发酵高产率、高产量和高生产强度的相对统一为目标的控制策略，都是非常必要的。
四、本章主要内容
为了尽快填补我国在发酵法生产丙酮酸方面的空白，江苏省科委设立了“九五”工业重大科技攻关项目“发酵法生产丙酮酸中试”(BG98015-3)。我们研究室作为项目的承担单位，从实验室规模到中试规模对丙酮酸发酵进行了全面、系统、深入的研究。从过程优化的观点出发，对丙酮酸这样一个特殊的代谢中间体，其优化方法应当是在透彻分析球拟酵母发酵生产丙酮酸的生理学本质的基础上，采用一系列控制策略实现丙酮酸的过量合成。根据这一指导思想，本节将着重介绍以下四部分内容。
1．在摇瓶和小型发酵罐中，研究各种营养条件对多重维生素营养缺陷型菌株T. glabrata WSH-IP12发酵生产丙酮酸的影响。
2．为了避免蛋白胨中不定量维生素的影响，以T. glabrata WSH-IP12为出发菌株，选育能以无机氮源为唯一氮源生长和产酸的突变株。然后，透彻分析T. glabrata 所不能合成的四种维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用。
3．在培养基中维生素含量处于亚适量水平时，研究不同供氧方式下T. glabrata发酵生产丙酮酸的代谢特征，提出供氧方式的优化策略。在此基础上，利用代谢通量分析方法，得到不同硫胺素浓度和不同溶氧下发酵过程的全部代谢通量分布，探讨丙酮酸发酵过程的本质。
4．对T. glabrata 在发酵生产丙酮酸过程中表现出的一些代谢特征进行分析，同时将丙酮酸发酵逐级放大到5 m3规模。
第二节 营养条件对光滑球拟酵母WSH-IP12生产丙酮酸的影响
一、引言
由于丙酮酸是代谢途径中的重要中间产物，正常情况下很难在胞外大量积累，因此，尽管研究者在丙酮酸高产菌的选育上开展了大量研究工作，但效果均不太理想。1990年以前，除了Uchio等人的专利外，几乎没有丙酮酸产量超过20 g/L的报道。进入20世纪90年代后，发酵法生产丙酮酸才有了较大的突破，其中具有代表性的丙酮酸高产菌株有两种，一种是携带多种遗传标记的Torulopsis glabrata ，另一种则是能量代谢被削弱的Escherichia coli 。在本节中，我们主要讨论和分析营养条件对丙酮酸积累株T. glabrata WSH-IP12发酵生产丙酮酸的影响。
二、酵母粉浓度对丙酮酸发酵的影响
酵母粉是一种常用的氮源和生长因子的来源，但并不适合菌株WSH-IP12发酵生产丙酮酸。如图5-2-1所示，随着发酵培养基中酵母粉浓度的增大，细胞干重不断增加而丙酮酸产量(浓度)却迅速下降。当酵母粉浓度达到10 g/L时，发酵液中丙酮酸产量几乎降低到零。
图 5-2-1 酵母粉浓度对WSH-IP12菌株发酵生产丙酮酸的影响
酵母粉浓度(g/L): ○ zero (control); □ 1; △ 3; ● 5; ■ 8; ▲ 10.
三、蛋白胨浓度对丙酮酸发酵的影响
当初始葡萄糖浓度为80 g/L时，由图5-2-2可知，培养基中的蛋白胨浓度选择在15 g/L较为适宜，此时，丙酮酸产量为23.4 g/L。蛋白胨浓度低于15 g/L时，葡萄糖消耗速度较慢，细胞干重和丙酮酸产量也较低；而若高于此值，则丙酮酸产量明显下降。可以认为，在蛋白胨浓度较高的情况下，细胞干重的增加是以丙酮酸产量的下降为代价的。此外，由图5-2-2还可知，若要使细胞在48 h内消耗80 g/L的葡萄糖，培养基中至少应添加大于10 g/L的蛋白胨(氮浓度约为1.0 g/L)。
图5-2-2 蛋白胨浓度对菌株WSH-IP12发酵生产丙酮酸的影响
● 丙酮酸; □ 乙醇; ○ 细胞干重; ■ 葡萄糖
四、豆饼水解液和无机氮源对丙酮酸发酵的影响
(一)豆饼水解液对丙酮酸发酵的影响
如图5-2-3所示。 豆饼水解液浓度为5 g/L时，发酵液中丙酮酸产量达到18 g/L。这一水平虽然不及以蛋白胨为氮源的结果，但由于豆饼水解液来源广、价格低，故而对丙酮酸发酵而言，豆饼水解液仍是一种有潜力的氮源。
图5-2-3 豆饼水解液质量浓度对菌株WSH-IP12发酵生产丙酮酸的影响
○ 细胞干重; □ 丙酮酸
(二)无机氮源及其质量浓度对丙酮酸发酵的影响
如表5-2-1所示，尽管T. glabrata WSH-IP12可以利用(NH4)2SO4, NH4Cl, (NH4)2HPO4和尿素为唯一氮源生长，但丙酮酸产量均不及以蛋白胨和豆饼水解液为氮源的情况。
表 5-2-1 无机氮源及其质量浓度对菌株WSH-IP12发酵生产丙酮酸的影响
氮质量浓度
/ g(L-1
丙酮酸质量浓度 / g(L-1
(NH4)2SO4
NH4Cl
(NH4)2HPO4
尿素
0.32
4.1
5.4
2.5
5.0
0.64
10.0
10.0
4.3
10.0
1.27
15.6
11.8
6.7
12.0
1.91
16.3
12.8
7.5
11.8
2.54
16.0
15.2.
5.7
10.9
3.18
14.7
11.3
5.8
10.8
五、分批培养中供氧方式和培养基碳氮比对丙酮酸发酵的影响
(一)供氧方式对丙酮酸发酵的影响
由于丙酮酸处于EMP途径和TCA循环的交点位置，溶氧水平直接影响碳流的走向，因此，我们考察了溶氧浓度对丙酮酸生产的影响。在实验中采用了两种不同的供氧方式，以使发酵体系处于不同的溶氧水平。供氧方式Ⅰ为搅拌转速恒定在700 r/min，供氧方式Ⅱ为搅拌转速按DOT不低于30%的要求逐渐升高。由这两种供氧方式控制的发酵过程曲线如图5-2-4所示，过程主要参数列于表5-2-2。
图5-2-4 不同供氧方式下的丙酮酸发酵过程
○ and … 0-39h, 700 r/min; △ and ─ 0-6h，400 r/min; 6-14h, 500 r/min; 14-37h, 600 r/min
表5-2-2 不同供氧方式控制的发酵过程主要参数比较
操作方式
初始葡萄糖
/ g(L-1
t
/ h
剩余葡萄糖
/ g(L-1
丙酮酸
/ g(L-1
细胞干重
/ g(L-1
生产强度
/ g(L-1(h-1
产率
/ g(L-1
搅拌转速恒定
86.9
40
5.2.
39.5
18.5
0.99
0.47
搅拌转速变化
93.7
30
1.6
27.0
25.2
0.90
0.29
由图5-2-4可知，供氧方式Ⅱ控制下的发酵过程，总体上溶氧水平低于供氧方式Ⅰ，尽管细胞生长和葡萄糖消耗速度明显快于供氧方式Ⅰ，然而丙酮酸产率和产量却较低(表5-2-2)，表明相对较高的溶氧水平有利于T. glabrata发酵生产丙酮酸。关于溶氧水平对丙酮酸发酵的影响，后面还将进行详细论述。
(二)培养基碳氮比的影响
在小型发酵罐中进一步考察了培养基的初始葡萄糖浓度和/或碳氮比对丙酮酸发酵的影响。结果发现，如果葡萄糖和蛋白胨的浓度按碳氮比相同的原则(25:1)同时提高，则丙酮酸生产也会得到促进；然而，若蛋白胨浓度保持不变，在此基础上再提高葡萄糖的浓度(即C/N增大)，则发酵后期(40 h后)细胞生长速度和葡萄糖消耗速度明显下降(图5-2-5)，丙酮酸产率也显著降低(表5-2-3)。
图 5-2-5 分批培养中初始葡萄糖浓度和/或碳氮比对丙酮酸发酵的影响
● 葡萄糖 92 g/L，蛋白胨 15 g/L; ■ 葡萄糖 127 g/L，蛋白胨 20 g/L;○ 葡萄糖 201 g/L，蛋白胨 20 g/L.
表 5-2-3 不同初始葡萄糖浓度和/或碳氮比下的分批培养过程参数
初始葡萄糖
/ g(L-1
蛋白胨
/ g(L-1
C:N
/ g(g-1
t
/ h
剩余葡萄糖
/ g(L-1
丙酮酸
/ g(L-1
细胞干重
/ g(L-1
生产强度
/g(L-1(h-1
丙酮酸产率
/ g(g-1
细胞产率
/ g(g-1
乙醇
/ g(L-1
92
15
25:1
39
4.5
38.5
18.5
0.99
0.44
0.216
3.0
127
20
25:1
36
10.8
47.9
25.6
1.33
0.41
0.220
4.5
201
20
40:1
44
52.9
46.2
32.2
1.05
0.31
0.217
5.7
六、葡萄糖流加培养中氮的供给对丙酮酸发酵的影响
由于较高的初始葡萄糖浓度对丙酮酸生产存在一定的抑制作用，因此，可以考虑采用适宜的葡萄糖流加方案来提高丙酮酸的生产水平。在进行小型发酵罐流加培养实验前，我们先在摇瓶培养中考察了简单的补糖操作对WSH-IP12发酵生产丙酮酸的影响。如图5-2-6所示，在葡萄糖总浓度均为80 g/L的前提下，初始葡萄糖浓度为20 g/L、分三次补足80 g/L的方式(48 h丙酮酸产量30.2 g/L)，其丙酮酸产量和产率均优于初始葡萄糖浓度为80 g/L(48 h丙酮酸产量23.5 g/L)的操作方式，表明流加培养有可能提高丙酮酸的生产水平。
图5-2-6 摇瓶培养中补糖操作对丙酮酸发酵的影响。
● 补糖；○不补糖
在小型发酵罐中进行了数次流加培养实验，其中典型的发酵过程曲线如图5-2-7所示。从图5-2-7中可以发现，发酵13 h后由于葡萄糖消耗速度低于流加速度，因此罐内葡萄糖浓度有所升高，但对丙酮酸生产没有造成不利影响。然而，发酵24 h后，丙酮酸积累速度明显下降，与此同时，葡萄糖浓度迅速上升，表明细胞消耗葡萄糖的速度正在急剧下降(因为葡萄糖流加速度也在下降)。计算发现，发酵25 h时发酵罐内的葡萄糖总浓度已达到110 g/L，而初始蛋白胨浓度为15 g/L，即C/N已达到30:1，且随着葡萄糖的加入，C/N还在不断升高(33 h时达到34:1)。由于C/N过高会使细胞消耗葡萄糖的能力降低。因此，分别在34 h和40 h补入10 g蛋白胨和5 g (NH4)2SO4，使培养基的C/N下降到25:1左右，结果(图5-2-7)，葡萄糖消耗和细胞生长能力均得以恢复，发酵64 h时丙酮酸产量达到54.5 g/L(对葡萄糖产率为0.47 g/g)。由此表明，要在流加培养中获得高的丙酮酸产率和生产强度，氮的有效供给是非常重要的。
图5-2-7 典型的T. glabrata WSH-IP12流加培养过程曲线
● 丙酮酸; ○ 葡萄糖; ▲ 细胞干重; ─ 乙醇
根据以上分析，为了进一步提高丙酮酸的产量和产率，在相同的培养条件下，不补加氮源，而改用氨水代替KOH控制发酵过程的pH(相当于连续提供氮源)进行流加培养实验，结果发现(图5-2-8)，整个发酵过程中细胞均表现出很强的丙酮酸合成能力，55 h丙酮酸产量达到57.3 g/L (对葡萄糖产率0.50 g/g)，丙酮酸产量、产率、生产强度均高于图5-2-7所示的流加培养过程。此外，检测发现，发酵结束时铵离子浓度为10.3 g/L，表明发酵过程中氮的供给是充分的，细胞代谢正常进行。因此，尽管34 h后由于糖流加速率过快，造成罐内葡萄糖也有所积累，但对产酸并没有负面影响。
图5-2-8 以氨水代替KOH控制pH的T. glabrata WSH-IP12流加培养过程曲线
● 丙酮酸; ○ 葡萄糖; ▲ 细胞干重; ─ 乙醇
七、讨 论
(一)氮源对T. glabrata WSH-IP12发酵生产丙酮酸的影响
米原辙等曾发现，当培养基中硫胺素浓度超过40 (g/L时，多重维生素(烟酸、硫胺素、生物素和吡哆醇)营养缺陷菌株T. glabrata IFO 0005积累丙酮酸的能力下降。酵母粉中硫胺素的含量通常在50 (g/g左右，因此，在发酵液中添加1 g/L的酵母粉就使丙酮酸产量降低(图5-2-1)，主要原因是酵母粉中硫胺素质量分数较高，从而间接导致培养基中硫胺素浓度升高。由于硫胺素是丙酮酸脱氢酶系(PDH)和丙酮酸脱羧酶(PDC)的辅酶，而我们采用的T. glabrata WSH-IP12是硫胺素营养缺陷型，在一定范围内，硫胺素浓度增加，PDH和PDC活性也会升高。这样，随着酵母粉浓度的提高，进入TCA循环的碳流量也增加，结果导致细胞量大幅度提高，葡萄糖消耗不断加快，而丙酮酸积累却明显减少。
尽管T. glabrata WSH-IP12能够同化无机氮源并积累丙酮酸，但结果均不如以蛋白胨为氮源的情况。Yokota等人在研究E.coli的硫辛酸营养缺陷型菌株生产丙酮酸时也采用蛋白胨作为氮源，他们的观点是，对E.coli细胞来说，蛋白胨中的L-Lys和L-Met可以代替硫辛酸，这样，既可以促进细胞生长，又不会造成PDH活性升高。我们则认为，蛋白胨中的某些氨基酸类物质是丙酮酸生产的促进因子，但其中的一些维生素，由于组分和质量分数不确定，有可能会对丙酮酸积累产生负作用。对图5-2-2的数据进行碳平衡分析可以发现(表5-2-4)，蛋白胨浓度高于15 g/L后，碳流更多地由积累丙酮酸转向合成细胞和乙醇，表明PDH和PDC活性均有所增加，结果使丙酮酸的氧化脱羧作用加强。这种效应就有可能是蛋白胨中的不定量维生素带来的，只不过由于蛋白胨中的维生素质量分数低于酵母粉，因此，蛋白胨浓度增加对丙酮酸积累造成的不利影响不如酵母粉严重。
表 5-2-4 不同蛋白胨浓度下的碳平衡
碳①
蛋白胨 / g(L-1
0
3
7
10
15
20
30
45
60
葡萄糖
100
100
100
100
100
100
100
100
100
细胞量② CX
35
35
32
30
28
29
34
36
37
丙酮酸 C丙酮酸
14
19
24
30
33
26
21
20
17
乙醇 CETOH
12
8
7
7
7
8
9
10
13
剩余碳③
39
38
37
33
32
37
36
34
33
① 以被消耗的葡萄糖中的碳为基准计算。
② 假设生物量的分子式为C3.93H7.07O1.96N0.79，灰分含量3.35%。
③ 剩余碳包括二氧化碳(大约25%左右)及其它副产物，如酮戊二酸。
(二)培养基碳氮比对丙酮酸发酵的影响
运用碳平衡的观点对图5-2-5和表5-2-3的数据进行分析，可以发现(表5-2-5)，当葡萄糖和蛋白胨浓度按相同C/N提高时，C丙酮酸下降了6%，而CX和CETOH各增加了16%和10%。如果维持蛋白胨浓度不变，而将葡萄糖浓度由127 g/L提高到201 g/L，则C丙酮酸下降了24%，但CX和CETOH却保持不变。这些结果表明∶(1) 较高的初始葡萄糖浓度对丙酮酸产率也有不利影响，C/N升高后(即氮源相对缺乏)，这种不利因素就表现得更为突出；(2) C/N和氮浓度是控制细胞代谢的重要因素，氮源相对缺乏时，EMP途径的某些关键酶的合成可能受阻，结果导致细胞消耗葡萄糖的能力明显下降。Lagunas等人曾发现，在缺乏氮源的葡萄糖培养基中培养酵母，不仅酵解途径流量持续下降，细胞转运葡萄糖的能力也不断降低；(3) 蛋白胨中存在的不定量维生素对丙酮酸脱氢酶系(进入TCA循环)和丙酮酸脱羧酶(生成乙醇)的活性有着重要影响。在外加一定量维生素的前提下，蛋白胨浓度增加，CX和CETOH也增加；蛋白胨浓度不变，CX和CETOH也不变这个事实，充分说明了这一点。由于T. glabrata WSH-IP12也能利用无机氮源生长和产酸，因此，采用蛋白胨和无机氮源相组合的方法，有可能可以减轻蛋白胨中的不定量维生素带来的负面影响。
表 5-2-5 不同初始葡萄糖浓度和/或碳氮比下的碳平衡
碳①
碳氮比
25:1
25:1
42:1
初始葡萄糖 / g(L-1
88
127
201
葡萄糖
100
100
100
细胞量② CX
24
28
28
丙酮酸 C丙酮酸
45
42
32
乙醇 CETOH
5
7
7
剩余碳③
26
23
33
①、②、③与表5-2-4描述的内容相同
适宜的C/N对丙酮酸发酵的重要性在流加培养中也得到了体现。氮源缺乏导致葡萄糖消耗和丙酮酸生产停滞，补加一定量的氮又可使细胞代谢恢复正常。由于氨水也可用作氮源，因此，我们采用氨水来控制发酵过程的pH(相当于连续提供氮源)，发现流加培养也能正常进行。这一结果同时表明，蛋白胨比无机氮源更适于T. glabrata WSH-IP12生产丙酮酸的原因可能是蛋白胨中含有一些特殊因子(如氨基酸类物质)。一旦T. glabrata WSH-IP12的发酵过程被适宜浓度的蛋白胨所启动，以铵态氮为氮源也可以获得理想的丙酮酸产量，且较高的铵离子浓度(10.3 g/L)没有对细胞代谢产生明显的抑制作用。
第三节 维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用
一、引言
在有关发酵法生产丙酮酸的研究中，米原辙和宫田令子报道的Torulopsis glabrata IFO0005经63 h流加发酵，丙酮酸产量达67.8 g/L(对葡萄糖产率0.494 g/g)和Yokota等报道的缺乏F1-ATP酶活力的E. coli 经24 h发酵，丙酮酸产量达30 g/L(对葡萄糖产率0.6 g/g)，是目前该领域的最高研究水平。目前日本已用于工业上生产丙酮酸的菌株可能是T. glabrata。采用T. glabrata 发酵生产丙酮酸的主要问题是对葡萄糖的产率不太高，一般只能达到0.5～0.53 g/g。由于丙酮酸处于细胞代谢的关键节点上，要提高丙酮酸的产率和生产强度，必须在抑制负责丙酮酸降解的诸多酶(系)活性的基础上加速糖酵解。
多重维生素营养缺陷型菌株T. glabrata 中负责丙酮酸降解的酶(系)活性是受培养基中维生素的水平控制的，阐明其相互作用关系并优化其浓度，对实现丙酮酸发酵高产率与高生产强度的统一非常重要。然而，迄今为止，日本学者只是在以蛋白胨为氮源的培养基中，用单因素试验方法初步考察了维生素对丙酮酸生产的影响。蛋白胨中的维生素足以满足细胞生长，这一结论是基于日本九州工业大学清水和幸等人的实验数据∶不加维生素的种子培养基(蛋白胨浓度为30 g/L)照样可以使细胞生长良好。我们在研究中也发现了类似现象。由于蛋白胨的种类和质量通常是随生产批次而变化的，因此，以蛋白胨为氮源进行研究，很难阐明T. glabrata 对维生素的确切需求，也就很难使丙酮酸的产率有较大的提高。
在第二节中，我们发现T. glabrata WSH-IP12能够利用无机氮源生长，但丙酮酸产量不佳。理想地，细胞应具有以无机氮化合物为唯一氮源生长并大量积累丙酮酸的能力。这样，一方面可以在一个全合成培养基中很方便地研究各种维生素对代谢途径的影响，另一方面，也有利于将来实现工业化生产。基于这一思路，我们筛选得到了一株能以NH4Cl为唯一氮源生长和大量产酸的突变株T. glabrata WSH-IP303。在此基础上，详细考察了外加该菌株所缺陷的维生素对其积累丙酮酸的影响，并确定了较优的浓度组合。
二、突变株T. glabrata WSH-IP303的获得及其氮源同化能力
对经EMS诱变后获得54株CM平板上透明圈较大的菌株进行初筛，结果如图5-3-1所示。以NH4Cl为唯一氮源时，有33株菌的丙酮酸生产能力较出发菌株有所提高，其中有8株菌的提高幅度在35%以上。对这8株菌进行维生素营养缺陷型验证，发现它们仍为烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素四种维生素的营养缺陷型。
对这8株菌进行复筛，同时考察它们在连续传代过程中合成丙酮酸的稳定性，结果列于表5-3-1。突变株WSH-IP303、IP312和IP1225在传代过程中丙酮酸产生能力强且稳定，而其余5株菌在传代3次后，丙酮酸产生能力均下降了20%左右。综合考虑丙酮酸产生能力和菌株的遗传稳定性，我们确定WSH-IP303为研究用菌株。以NH4Cl为唯一氮源时，其丙酮酸产量比出发株提高近60%。
图5-3-1 以NH4Cl为唯一氮源的突变株的丙酮酸生产能力比较
表5-3-1 以NH4Cl为唯一氮源的8株较优突变株在传代过程中的丙酮酸生产能力
菌株
丙酮酸 / g(L-1
第1代
第2代
第3代
WSH-IP12
21.5
21.8
21.0
WSH-IP303
35.3
35.2
34.8
WSH-IP312
33.0
32.8
32.5
WSH-IP1225
33.6
32.8
33.0
WSH-IP1226
35.1
30.3
27.9
WSH-IP1228
35.4
31.2
29.3
WSH-IP1220P
36.9
33.4
30.2
WSH-IP1236P
35.1
32.5
29.9
WSH-IP214
33.6
30.8
26.9
突变株WSH-IP303对氮源的同化实验表明(图5-3-2)，该菌株在以NH4Cl、(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4和尿素为唯一氮源的培养基中生长非常好，随着无机氮源浓度的增加，菌株的生长略受抑制，但不是非常明显。由于该菌株是在以NH4Cl为唯一氮源的平板上筛选出来的，因此，以NH4Cl为唯一氮源的丙酮酸产量均比其它无机铵盐高。有趣的是，与第二节结论相反，蛋白胨不再是生产丙酮酸的最佳氮源，其浓度要达到20 g/L以上，才能使T. glabrata WSH-IP303的生长达到与利用无机氮源相当的水平，并且丙酮酸产量不高。图5-3-2的结果还表明，尿素也是一种非常适合T. glabrata WSH-IP303生产丙酮酸的氮源物质，但由于铵离子的测定比较简单，故我们仍选用NH4Cl为氮源，其浓度确定为7 g/L (氮浓度为1.8 g/L)。
图 5-3-2 T. glabrata WSH-IP303对氮源的同化能力
● 蛋白胨; □ (NH4)2SO4; ■ (NH4)2HPO4; ○ Urea; △ NH4Cl
注∶含氮化合物以相同的含氮量加入培养基。蛋白胨中氮质量分数为0.1 g/g。发酵培养基中含有0.03 mg/L 硫胺素, 8 mg/L 烟酸, 0.03 mg/L 生物素, 0.3 mg/L 吡哆醇和0.15 mg/L 核黄素。
三、维生素对WSH-IP303过量合成丙酮酸的影响
T. glabrata WSH-IP303能够以氯化铵为唯一氮源大量积累丙酮酸，这意味着可以在一个全合成培养基中，对维生素的影响进行深入研究。首先利用单因素试验考察了烟酸、硫胺素、吡哆醇、生物素和核黄素对丙酮酸发酵的影响。核黄素虽然不是T. glabrata WSH-IP303缺陷的维生素，但其作为FAD的前体，有可能影响电子传递链的活性，因此一并进行了研究(图5-3-3)。
图 5-3-3 维生素浓度对T.glabrata WSH-IP303发酵生产丙酮酸的影响(单因素试验)
表 5-3-2 L16(45)正交试验因素水平表
因素 ＼ 水平
1
2
3
4
A: 烟酸 / mg(L-1
2
4
6
8
B: 硫胺素 / mg(L-1
0.01
0.02
0.03
0.04
C: 吡哆醇 / mg(L-1
0.1
0.2
0.3
0.4
D: 生物素 / mg(L-1
0.01
0.02
0.03
0.04
E: 核黄素 / mg(L-1
0
0.05
0.1
0.15
维生素单因素试验结果表明∶(1) 培养基中若缺乏烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素四种维生素的任何一种，细胞生长均很弱(数据未显示)，丙酮酸产量也很低；(2) 细胞生长不需要核黄素(数据未显示)，但添加适量核黄素对丙酮酸生产有一定的促进作用；(3) T. glabrata WSH-IP303积累丙酮酸时，对不同维生素浓度变化的敏感程度不同。据此，我们认为，进一步考察烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素这四种维生素在T. glabrata WSH-IP303过量合成丙酮酸中的作用，阐明它们对丙酮酸合成与分解途径的影响，并得到优化的浓度组合，对实现高水平的丙酮酸发酵来说是非常必要的。
实际工作中，我们采用正交试验来考察这五种维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用及其相关关系。按照L16(45)正交试验因素水平表(表5-3-2)安排正交试验，其中各种维生素的浓度范围是根据单因素试验结果(图5-3-3)确定的。具体试验设计及结果见表5-3-3。
表 5-3-3 L16(45)正交试验设计及实验结果1
试验号
A
B
C
D
E
细胞生长
/ OD660
丙酮酸
/ g(L-1
葡萄糖消耗
/ g(L-1
丙酮酸产率
/ g(g-1
1
1
1
1
1
1
26.8
30.8
56.3
0.549
2
1
2
2
2
2
40.2
38.7
80.2
0.482
3
1
3
3
3
3
47.4
42.3
95.6
0.443
4
1
4
4
4
4
51.4
32.0
97.7
0.327
5
2
1
2
3
4
30.8
32.2
59.3
0.542
6
2
2
1
4
3
42.7
47.7
89.0
0.536
7
2
3
4
1
2
58.3
36.3
97.6
0.372
8
2
4
3
2
1
61.3
26.8
97.6
0.275
9
3
1
3
4
2
29.6
31.3
56.9
0.550
10
3
2
4
3
1
48.2
46.0
96.9
0.475
11
3
3
1
2
4
58.0
28.8
97.7
0.294
12
3
4
2
1
3
62.6
27.1
97.7
0.278
13
4
1
4
2
3
29.1
35.4
58.2
0.608
14
4
2
3
1
4
48.1
40.9
97.0
0.421
15
4
3
2
4
1
56.9
35.1
97.6
0.360
16
4
4
1
3
2
59.5
20.3
97.7
0.208
图 5-3-4 正交试验结果直观分析图
□ 细胞生长; ▲ 葡萄糖消耗; ○ 丙酮酸产率
对正交试验结果进行了直观分析，结果如图5-3-4所示。可以看出，在所选择的浓度范围内∶(1) 硫胺素是影响WSH-IP303细胞生长、葡萄糖消耗及丙酮酸合成的最重要因素；(2)增大吡哆醇、生物素和核黄素的浓度，对细胞生长和葡萄糖消耗没有显著影响，但对丙酮酸合成有一定的促进作用；(3)增大烟酸浓度可促进葡萄糖消耗，但不利于丙酮酸合成。
对正交试验结果进行极差分析，分别得到了以丙酮酸高产量和高产率为目标的维生素浓度优化组合(表5-3-4)。在这两个优化组合中，除了硫胺素的浓度外，其余四种维生素的浓度都是相同的。
表 5-3-4 由正交试验得到的维生素浓度优化组合
硫胺素
/ mg(L-1
烟酸
/ mg(L-1
生物素
/ mg(L-1
吡哆醇
/ mg(L-1
核黄素
/ mg(L-1
浓度组合A①
0.01
2
0.04
0.4
0.1
浓度组合B②
0.02
2
0.04
0.4
0.1
① 以获得丙酮酸高产率为目标的浓度组合
② 以获得丙酮酸高产量为目标的浓度组合
我们对图5-3-4所示的维生素浓度优化组合进行了实验验证。同时，考虑到增加烟酸浓度后，丙酮酸产量虽然有所降低，但葡萄糖消耗得到了促进，因此，在保持吡哆醇、生物素和核黄素浓度不变的前提下，适当变化烟酸和硫胺素的浓度，考察烟酸和硫胺素的水平对丙酮酸合成的协同作用，结果一并示于表5-3-5。
表 5-3-5 维生素浓度优化组合的实验验证①
烟酸
/ mg(L-1
硫胺素
/ mg(L-1
细胞生长
/ OD660
剩余葡萄糖
/ g(L-1
丙酮酸
/ g(L-1
丙酮酸产率
/ g(g-1
2 ②
0.01 ②
30.3
39.3
37.5
0.62
4
0.01
31.8
32.4
40.2
0.60
8
0.01
32.3
25.1
44.1
0.59
10
0.01
33.5
18.2
48.4
0.59
12
0.01
35.6
14.5
46.4
0.54
2 ③
0.02 ③
44.1
8.4
48.4
0.53
8
0.02
50.5
0.2
43.5
0.44
① 吡哆醇, 生物素和核黄素的浓度分别为0.4 mg/L, 0.04mg/L和0.1mg/L。
② 以获得丙酮酸高产率为目标的组合。
③ 以获得丙酮酸高产量为目标的组合。
如表5-3-5所示，采用分别以丙酮酸高产率和高产量为目标的维生素浓度优化组合进行实验，丙酮酸产率(0.62 g/g)和产量(48.4 g/L)均略高于正交试验中的最高产率(0.61 g/g)和最高产量(47.7 g/L)。培养基中硫胺素浓度为0.01 mg/L时，丙酮酸产率虽然较高(0.62 g/g)，但葡萄糖消耗速度却相对较慢(1.26 g/(L(h))。此时，增大烟酸浓度可加速葡萄糖的消耗。如，培养基中烟酸浓度从2 mg/L增加到10 mg/L后，葡萄糖消耗速度(1.70 g/(L(h))和丙酮酸产量(48.4 g/L)分别增加了35 % 和29 %，而丙酮酸产率仅下降了3.6%。另一方面，在硫胺素浓度为0.02 mg/L的培养基中，将烟酸浓度由2 mg/L提高到8 mg/L，虽然也能加速葡萄糖的消耗，但丙酮酸产量(43.5 g/L)和产率(0.44 g/g)明显下降。这些结果表明，T. glabrata WSH-IP303以葡萄糖为碳源积累丙酮酸时，烟酸和硫胺素较优浓度的确定，对维持丙酮酸合成与降解的平衡非常重要。
表5-3-6 烟酸和硫胺素较优浓度的确定①
烟酸
/ mg(L 1
硫胺素
/ mg(L 1
细胞生长
/ OD660
剩余葡萄糖
/ g(L 1
丙酮酸
/ g(L 1
丙酮酸产率
/ g(g 1
8
0.015
46.8
0.2
52.4
0.53
10
0.015
48.4
0.2
48.4
0.49
① 吡哆醇, 生物素和核黄素的浓度分别为0.4 mg/L, 0.04mg/L和0.1mg/L。
根据以上分析，在烟酸浓度为8 mg/L的前提下，将硫胺素浓度降低至0.015 mg/L，则丙酮酸产量(52.4 g/L)、产率(0.525 g/g)和葡萄糖消耗速度(2.08 g/(L(h))俱佳。然而，烟酸浓度再增大至10 mg/L，丙酮酸产率和产量又会下降(表5-3-6)。
四、维生素亚适量供给下的分批发酵过程
根据以上实验结果，我们确定较优的维生素浓度组合为∶烟酸 8 mg/L，硫胺素 0.015 mg/L，吡哆醇 0.4 mg/L，生物素 0.04 mg/L，核黄素 0.1 mg/L。采用这一组合在小型发酵罐上进行分批发酵实验，过程曲线如图5-3-5所示。
图5-3-5 T. glabrata WSH-IP303分批发酵过程曲线
■ 葡萄糖; □ 丙酮酸; △ NH4Cl; ▲ 细胞干重; 1, 溶氧; 2, 乙醇; ● 丙酮酸产率; ○ 细胞产率。搅拌转速控制∶0-16h, 700 r/min; 16 h后, 500 r/min.
如图5-3-5所示，发酵前10 h，DOT和乙醇浓度的变化最为显著，此时细胞生长较快，经计算可以发现，比生长速率(()在0.2～0.23 h-1范围内。此后(逐渐下降，24 h时降低到0.1 h-1以下，36 h后稳定在0.02 h-1的水平，且15 h后细胞产率均低于0.2 g/g。与之相应，12 h后丙酮酸开始大量产生，20～40 h丙酮酸产率基本维持在0.6 g/g以上，56 h丙酮酸产量(69.4 g/L)和产率(0.636 g/g)分别比摇瓶培养的最好结果提高了32%和21%，均高于国际上已报道的同类菌株的最佳研究结果(表5-3-7)。
表 5-3-7 T.glabrata WSH-IP303与IFO 0005产丙酮酸能力比较
菌株
培养方式
丙酮酸
/ g(L-1
总葡萄糖
/ g(L-1
剩余葡萄糖
/ g(L-1
丙酮酸产率
/ g(g-1
t
/ h
生产强度
/ g(L-1(h-1
乙醇
/ g(L-1
WSH-IP303
分批
69.4
112
3.0
0.636
56
1.24
1.6
IFO 0005①
流加
67.8
140
2.8
0.494
63
1.08
4.0
IFO 0005②
流加
25
48
10
0.53
40
0.63
4.0
①日本东丽化学公司米原辙和宫田令子研究结果
②日本九州工业大学清水和幸研究结果
五、讨论
(一)突变株T. glabrata WSH-IP303对无机氮源的同化能力
所有酵母均能利用无机铵盐，但在以无机铵盐为氮源的培养基上合成目的产物的能力则有很大差异。在第二节中，我们发现T. glabrata WSH-IP12能够以无机铵盐为唯一氮源生长，但丙酮酸产量不及以蛋白胨为氮源的情况。因此，对出发菌株T. glabrata WSH-IP12进行了诱变，以期筛选得到能以NH4Cl为唯一氮源高产丙酮酸的菌株。初筛和复筛结果表明，T. glabrata WSH-IP303在以NH4Cl为唯一氮源的培养基中具有很强的、稳定的丙酮酸合成能力。进一步研究发现，在氮浓度相同(<2.4 g/L)的前提下，该菌株在以NH4Cl和尿素为唯一氮源的培养基中，细胞生长和丙酮酸产量均高于蛋白胨，表明该突变株能够完全以无机氮源为原料合成蛋白质，满足生理和代谢需要。
从图5-3-2中还可发现，无机氮浓度在0.9～3.0 g/L这样一个较大的范围内变化，对细胞生长并没有显著的影响，且培养基中氮浓度为0.9 g/L即可满足细胞消耗100 g/L葡萄糖的需要。这一结果说明，突变株T. glabrata WSH-IP303对氮的需求量也有所下降。
(二)维生素在T. glabrata WSH-IP303过量合成丙酮酸中的重要作用
从代谢控制的观点考虑，微生物过量合成丙酮酸的主要学术思想是∶(1)在保证细胞正常生命活动的前提下，尽可能减少丙酮酸的降解或转化，这是获得丙酮酸高产量和高产率的必要条件；(2)加快从葡萄糖到丙酮酸的代谢速度，以确保获得丙酮酸的高生产强度。分析丙酮酸在细胞中的代谢途径(图5-3-6)可以发现，丙酮酸脱氢酶系(PDH)、丙酮酸脱羧酶(PDC)、丙酮酸羧化酶(PC)和转氨酶负责丙酮酸的降解。只有降低这些酶(系)的活性，才有可能使丙酮酸在胞内积累，进而溢出胞外。
酵母胞内负责丙酮酸降解的酶(系)的活性是受以维生素为主的辅因子控制的。如，硫胺素是PDH和PDC的辅因子；烟酸是PDH的辅因子；生物素是PC的辅因子；吡哆醇则是转氨酶的辅因子。多重营养缺陷型菌株T. glabrata WSH-IP303因不能合成烟酸、硫胺素、生物素和吡哆醇，故该菌株胞内负责丙酮酸降解的酶(系)活性的高低完全依赖于培养基中外加辅因子的浓度。T. glabrata WSH-IP303能够以NH4Cl为唯一氮源生长和大量产酸，无疑为深入、透彻地研究维生素在丙酮酸过量合成中的作用提供了可能。
图 5-3-6 WSH-IP303菌株中丙酮酸的代谢途径
Ⅰ: 丙酮酸脱羧酶；Ⅱ: 转氨酶；Ⅲ: 丙酮酸羧化酶；Ⅳ: 丙酮酸脱氢酶系
维生素浓度对T. glabrata WSH-IP303发酵生产丙酮酸的单因素影响试验表明(图5-3-2)，缺乏烟酸、硫胺素、生物素和吡哆醇四种维生素中的任何一种，细胞不能生长，也就不能合成丙酮酸；此外，这四种维生素中的任何一种的浓度超过一定范围后，丙酮酸产量都将明显减少，其中尤其以硫胺素浓度变化的影响最为明显。正交试验结果也表明，硫胺素是影响细胞生长、葡萄糖消耗和丙酮酸合成的最重要因素。在硫胺素缺乏的条件下，PDH复合物活性的下降导致丙酮酸氧化脱羧受阻，使得丙酮酸得以积累；然而，由于硫胺素还是转酮酶的辅因子，故而磷酸戊糖途径也受到影响。磷酸戊糖途径受损导致NADPH合成速率降低，于是细胞物质合成速度降低，细胞增殖速度变慢，结果导致丙酮酸产率虽然很高，但葡萄糖消耗速度非常慢。也就是说，当硫胺素处于限制性浓度范围时，酵解速度也受限。即，有可能在培养基中通过控制硫胺素的浓度来控制酵解的速度。增加硫胺素的浓度， 虽然磷酸戊糖途径渐被激活，但PDH复合物和PDC活性也不断增强，结果表现出细胞生长和葡萄糖消耗速度加快，然而丙酮酸产量和产率却明显下降。
烟酸浓度的变化对细胞生长也有影响。然而，与硫胺素相比，增加培养基中烟酸的浓度，更主要的作用表现在加速葡萄糖的消耗(图5-3-4)。这可能是因为烟酸是烟酸NAD的前体的缘故。当培养基中烟酸供给充分时，酵解所需辅因子──NAD的补给也较充分。不过，由于烟酸同时是PDH复合物的一个辅因子，烟酸浓度过高，也会引起丙酮酸产率的下降，尽管此时硫胺素的浓度仍控制在一个很低的水平，如0.01 mg/L。但从总体上看，烟酸浓度增大带来的对丙酮酸产率的负面影响不如硫胺素严重。如，当硫胺素浓度为0.01 mg/L时，烟酸浓度由10 mg/L增加到12 mg/L时，丙酮酸产率仅下降了8.4%(表5-3-5)。
与硫胺素和烟酸相比，在所选择的浓度范围内，生物素、吡哆醇和核黄素丙酮酸过量合成的影响不是非常显著。这意味着，可以将生物素、吡哆醇和核黄素的浓度控制在一个相对较优的水平，使一个多参数的复杂问题得以简化，在此基础上，进一步研究硫胺素和烟酸对丙酮酸合成与降解的协同作用。实验数据表明，在培养基中五种维生素(主要指硫胺素、烟酸、生物素和吡哆醇四种)处于亚适量水平时，48 h摇瓶培养即可获得较高的丙酮酸产率(0.53 g/g)和生产强度(1.1 g/(L(h))。小型发酵罐中丙酮酸发酵水平进一步得以提高，特别是过程中乙醇浓度最高未超过1.6 g/L，说明在硫胺素受限制的条件下，PDC活性很低，因此乙醇浓度下降。
由此可知，对于多重维生素营养缺陷型菌株T. glabrata WSH-IP303，在培养基中生物素、吡哆醇和核黄素的浓度处于相对较优水平的基础上，将烟酸和硫胺素的浓度控制在一个较优范围，协调好这两种维生素对丙酮酸代谢途径的调控作用，以维持丙酮酸合成(糖酵解)和降解(主要是氧化脱羧)的精确平衡，可以实现丙酮酸发酵过程高产量、高产率和高生产强度的统一。
第四节 丙酮酸分批发酵的供氧控制模式
一、引言
球拟酵母(Torulopsis)的维生素营养缺陷型以葡萄糖为底物积累丙酮酸时，溶氧是一个很重要的影响因素。已经有学者研究过溶氧对T. glabrata IFO 0005产酸性能的影响。如，米原辙和宫田令子发现供氧不足会造成该菌株丙酮酸产量下降，而乙醇产量显著增加；清水和幸等人则报道了不同溶氧水平下该菌株胞内的代谢流分配。在第二节中，我们也发现，较高的溶氧有利于T. glabrata积累丙酮酸。但是，若要实现丙酮酸发酵过程高产量、高产率和高生产强度的统一，溶氧应当高到什么程度，在发酵过程中又应当采用何种控制策略，这是已有文献尚未阐明的问题。
在第三节中，我们详细研究了维生素在T. glabrata WSH-IP303过量合成丙酮酸中的重要作用，并优化了培养基中的维生素浓度。培养基的优化为深入研究溶氧对丙酮酸发酵的影响奠定了基础。在本节中，我们首先分析了不同体积传氧系数下(溶氧均高于50%)WSH-IP303分批发酵的动力学特征，根据主要动力学参数((、qs和qp)的变化特性提出了分阶段供氧控制模式。然后，实验验证了该模式在实现丙酮酸高产量和高产率的统一上的有效性，并对不同供氧方式下细胞的代谢活性进行了讨论。
二、丙酮酸分批发酵过程的溶氧变化情况
已有的研究虽然都认为较高的溶氧有利于丙酮酸的积累，但并未揭示出Torulopsis glabrata发酵生产丙酮酸时各个阶段对氧的需求情况。在kLa恒定的条件下考察了发酵过程中溶氧的变化特征。如图5-4-1所示，在控制不同kLa的发酵过程中，溶氧均表现出相似的变化规律，但发酵的不同阶段对氧的需求却并不相同。在发酵初期(0-16 h)，菌体耗氧速率明显快于供氧速率，表现为溶氧的迅速下降；而16 h后，耗氧速率和供氧速率则基本保持平衡。
图5-4-1 不同kLa下发酵过程中DOT的变化
kLa (h-1): 1—450; 2—300; 3—200
三、不同kLa下WSH-IP303发酵生产丙酮酸的动力学特征
图5-4-2(A～C)为不同kLa下WSH-IP303发酵生产丙酮酸过程中细胞干重、葡萄糖浓度和丙酮酸浓度的变化曲线。根据(、qs和qp的定义式∶
(5-4-1)
当时间间隔很小时，可以近似用(5-4-2)式直接计算得到(、qs和qp∶
(5-4-2)
图5-4-2 不同kL a下的发酵过程动力学曲线
kL a (h-1) : ○ and 1─ 450; △ and 2─ 300; ■ and 3─ 200
因此，我们利用GRAFTOOL图形软件，对图5-4-2 (A-C)中的数据进行插值计算(时间间隔为0.1 h)，再利用EXCEL软件，求解得到发酵过程中不同时刻的(、qs和qp，经平滑处理，得到不同kL a下WSH-IP303发酵过程动力学参数的变化曲线(图5-4-2 D-F，0～60h数据)。类似地，根据(5-4-3)式，可计算得到发酵过程中丙酮酸产率和细胞产率的变化曲线(图5-4-3 A和B)。
(5-4-3)
综合分析图5-4-2 A-F及图5-4-3 A和B，可以发现∶(1) 在较高的kLa下(450 h-1)，细胞在发酵前期(0-16h)具有较高的(和qp(图5-4-2 D和F)。整个过程中细胞消耗葡萄糖的速率虽然相对较低(图5-4-2 B和E)，但能长时间维持合成丙酮酸的能力(图5-4-2 C)，且丙酮酸产率相当高(图5-4-3 A)；(2) 细胞消耗葡萄糖的速率随着kLa的降低而增大(图5-4-2 B和E)，而丙酮酸产率则反之(图5-4-3 A)。
图5-4-3 不同kLa下丙酮酸产率和细胞产率的变化
kLa ( h-1): 1─ 450; 2─ 300; 3─ 200
四、分阶段供氧控制模式的提出和实验验证
为了进一步理解不同kLa下发酵过程的特点，表5-4-1给出了不同kLa下发酵过程的主要参数。结合图5-4-2和图5-4-3，可以认为在发酵过程中控制恒定的kLa，很难实现高产量、高产率和高生产强度的统一。尽管在适中的kLa下(300 h 1)，丙酮酸产量(69 g/L)和产率(0.649 g/g)已经超过了宫田令子、米原辙和清水和幸等人采用T. glabrata IFO 0005的最佳研究结果，但仍存在残糖较高(13.2 g/L)和发酵时间较长(68 h)等不足。
表5-4-1 不同供氧控制模式下的发酵过程参数比较
参数
kLa控制模式 / h-1
450
300
200
450 (0-16h)→200 (16h后)
初始葡萄糖 / g(L-1
118.6
119.4
124.8
112.0
剩余葡萄糖 / g(L-1
11.9
13.2
6.4
2.8
总发酵时间 / h
85
68
60
56
葡萄糖消耗速率 / g(L-1(h-1
1.14
1.56
1.97
1.95
葡萄糖利用率 / %
90.0
88.9
94.9
97.5
丙酮酸产量 / g(L-1
77.3
69.0
57.2
69.4
生产强度 / g(L-1(h-1
0.91
1.01
0.95
1.24
丙酮酸产率 / g(g-1
0.724
0.649
0.483
0.636
细胞干重 / g(L-1
13.2
14.5
15.6
19.5
前16 h平均比生长速率( / h-1
0.238
0.190
0.139
0.222
过程平均比生长速率( / h-1
0.047
0.073
0.084
0.087
NH4Cl消耗 / g(L-1
5.66
5.88
6.06
6.72
KH2PO4消耗 / g(L-1
1.35
1.23
1.12
1.20
乙醇 / g(L-1
1.34
1.55
1.67
1.60
表5-4-2 恒定kLa发酵过程中不同阶段的碳平衡
0～16h
16～32h
32～48h
after 48h
kL a / h-1
450
300
200
450
300
200
450
300
200
450
300
200
葡萄糖①
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
细胞生长②
47
30
27
17
13
16
13
13
11
3
10
11
丙酮酸
44
41
32
80
60
55
83
70
57
82
78
41
乙醇
2
2
2
0
0
0
0
0
0
0
0
0
剩余碳
7
27
39
3
27
29
5
17
32
14
12
48
①所有数据换算为以消耗葡萄糖中的碳为基准的百分数
②假设细胞分子式为C3.93H7.07O1.96N0.79，其中灰分含量3.35%
不同发酵阶段的碳平衡表明(表5-4-2)，在0～16 h，底物中的碳主要用于合成细胞，16 h后碳流则转向积累丙酮酸。鉴于∶(1)丙酮酸分批发酵过程前期(0～16 h)溶氧迅速下降(图5-4-1)，且控制较高的kLa (450 h 1)在0～16 h有利于合成细胞(表5-4-2)；(2)16 h后细胞耗氧速率基本恒定(图5-4-1)，且降低kLa可明显提高细胞的丙酮酸比合成速率(图5-4-2F)，为了探讨是否存在能够尽可能实现丙酮酸高产量、高产率和高生产强度的相对统一的供氧控制模式，我们采用0～16 h控制较高的kLa (450 h 1)，16 h后将kLa降低到200 h 1的方法进行分批发酵，主要过程参数亦列于表5-4-，发酵过程曲线和碳平衡则分别见图5-4-4和表5-4-3。
图5-4-4 采用分阶段供氧控制模式的分批发酵过程曲线
■ 葡萄糖; □ 丙酮酸; △ NH4Cl; ▲ 细胞量; 1—DOT; 2—乙醇
表5-4-3 分阶段供氧控制模式下的碳平衡
0-16h
16-32h
32-48h
after 48h
葡萄糖1
100
100
100
100
细胞生长2
44
21
15
16
丙酮酸
45
73
60
53
乙醇
2
0
0
0
剩余碳
9
6
25
31
①所有数据换算为以消耗葡萄糖中的碳为基准的百分数
②假设细胞分子式为C3.93H7.07O1.96N0.79，其中灰分含量3.35%
由表5-4-1可知，采用分阶段供氧控制模式，既能够保持较高的产率(0.636 g/g)，又能保持较高的耗糖速度(1.95 g/(L(h))，发酵56 h丙酮酸产量就达到了69.4 g/L，生产强度(1.24 g/(L(h))比kLa恒定为450、300和200 h-1的分批发酵过程分别提高了36%、23%和31%。比较发酵过程的碳平衡(表5-4-2和表5-4-3)可以发现，与kLa恒定为200 h 1的分批发酵过程相比，采用分阶段供氧控制模式，16 h后通往细胞合成和丙酮酸积累的碳流平均提高了35%和20%左右。
五、讨论
在分批发酵实验中，我们控制不同的kLa导致细胞处于不同的溶氧水平，结果发现，尽管细胞处于供氧良好状态(因相对溶氧均高于50%)，但细胞的代谢活性(特别是葡萄糖消耗)仍出现了明显差异(图5-4-2)。而采用分阶段供氧控制模式，能够兼取高kLa下丙酮酸产率高和低kLa下葡萄糖消耗速度快的优点，从而实现丙酮酸发酵过程高产量、高产率和高生产强度的相对统一。
如引言所述，已有学者研究过溶氧对球拟酵母生产丙酮酸的影响。米原辙认为，在溶氧较低的情况下，胞内线粒体发育不良，酵解产生的NADH不能通过呼吸链氧化，必须将氢传递给乙醛，形成乙醇以再生NAD+，才能保持酵解的继续进行。大量乙醇的形成导致丙酮酸产率显著降低，因此保持发酵罐处于相对较高的溶氧水平，是实现丙酮酸高产率的基础。清水的观点与其类似。然而，米原辙和清水在实验中获得的丙酮酸最高产率分别为0.494 g/g ，并不是很高，其主要原因是，他们所用的培养基含有有机氮源，其中维生素质量分数相对较高。
第三节中已经发现，培养基中维生素的水平，特别是硫胺素的浓度，会影响胞内负责丙酮酸降解的酶(如PDH和PDC等)的活性，因而是影响丙酮酸产率的极其重要的因素。如图5-4-5所示，在维生素含量处于亚适量水平的前提下，PDH、PDC和PC的活性受到限制，而被PDH控制的丙酮酸的氧化脱羧途径受抑制，是丙酮酸得以积累的先决条件。不同kLa下培养4 h后(均开始迅速下降的现象表明(图5-4-2 D)，随着细胞量的增加，单位细胞能够利用的维生素量不断减少，即所谓稀释效应。分析表5-4-2还可以发现，不同kLa下培养16 h后均不再有乙醇产生(亦可参见图5-4-4)，且通往细胞合成的碳流明显、持续减少，可认为是由于硫胺素的稀释效应，导致细胞的PDH和PDC活性下降而造成的。
在培养进行了16 h、细胞转入丙酮酸合成期以后，如果假设丙酮酸的降解途径被基本阻断，则酵解产生的NADH必须以适当的方式氧化，才能保证酵解的继续进行和丙酮酸的大量积累。高kLa导致细胞处于高溶氧状态，此时，酵解产生的NADH通过呼吸链氧化产生大量ATP，而酵解途径的限速酶──磷酸果糖激酶受ATP的变构抑制，ATP水平的升高必然导致葡萄糖消耗速度下降；而在较低的kLa下，细胞处于相对较低的溶氧状态之下，可能只有一部分NADH通过呼吸链氧化，相对较低的ATP水平使酵解得以快速进行。由于PDC活性受限制，剩余的NADH或生成乳酸、或生成甘油(图5-4-5)，才能实现NAD+的再生。碳平衡(表5-4-2)表明随着kLa的降低，转向合成副产物的碳流确实增加。至于副产物到底是什么，已经发现T. glabrata IFO0005在发酵生产丙酮酸时会积累甘油，是否存在乳酸则还需进一步确证。此外，我们虽然没有测定胞内ATP的含量，但无机磷的消耗随着kLa的升高而增加(表5-4-1)，表明高溶氧状态下细胞可能合成了更多的ATP。
图5-4-5 T. glabrata WSH-IP303中丙酮酸的代谢途径
Ⅰ—乳酸脱氢酶；Ⅱ—转氨酶; Ⅲ—丙酮酸脱羧酶(PDC); Ⅳ—丙酮酸脱氢酶系(PDH); Ⅴ—丙酮酸羧化酶(PC)。虚线代表被削弱的途径。
与kLa恒定为200 h-1的分批发酵过程相比，采用发酵0-16h内kLa为450 h-1、16 h后kLa为200 h-1的分阶段供氧控制模式，16 h后通往细胞合成和丙酮酸积累的碳流之所以有所提高，可能是由于0-16 h内控制kLa为450 h-1的“惯性”引起的。因为发酵初期较高的kLa，既有利于细胞生长又有利于产物合成(表5-4-2)。然而，即便如此，为了解除ATP对酵解的抑制作用而采用的分阶段供氧控制模式，也只能达到高产量、高产率和高葡萄糖消耗速度的相对统一。由此产生了一个新的思路∶如果能在高溶氧状态下，使细胞酵解产生的NADH在氧化再生的同时，不产生ATP(即解偶联)，其能量以热的形式释放，则有可能在保证高产率的前提下，实现高速酵解和丙酮酸的快速积累。Yokota等人已证明，缺乏F1-ATP酶活性的E.coli突变株，由于能荷水平的下降而导致酵解速度加快，24 h可积累30 g/L丙酮酸(对葡萄糖产率0.6g/g)。这些事实表明，通过调节细胞的能量水平来改变某些关键途径的活性，从而提高有用代谢物的生产效率，是一个令人非常感兴趣的课题。
第五节 丙酮酸发酵过程的代谢网络分析
一、引言
发酵过程的最终目标是∶在保证过程经济性的前提下，获得尽可能高的体积生产强度。为了达到这一目标，就必须提高产物对底物的产率以及产物/底物的比生产/比消耗速率。传统的方法是应用诱变技术选育具有特定生产性状的微生物，其缺点是由于诱变剂的非专一性而导致基因突变的不可预见性。用遗传工程技术来改变代谢流，修饰、扩展和构建代谢途径，是代谢工程的基本思路。应用代谢工程技术来优化发酵产品的生产过程，首先应当阐明代谢途径中哪些是关键步骤。采用放射性标记基质或13C核磁共振方法虽然可以获得有价值的代谢流数据，但由于其操作繁、费用高，因而不可能得到广泛应用。
在代谢工程的基础研究中，目前应用最为广泛的方法是代谢通量分析(Metabolic flux analysis, MFA)。MFA的最大优点是不需要知道代谢途径中各种酶的动力学特征就可以得到关于微生物代谢的许多重要信息。其核心内容是参考已知的生化反应计量关系和特定微生物的生理代谢特征来构建代谢网络，然后根据代谢中间产物的拟稳态(pseudo-steady state)假设，得到一组线性方程组。线性方程组的自由度F，等于未知速率(反应速率+净转化速率)减去方程的总数。一旦测定了系统的F个速率，就可以计算得到代谢网络的全部代谢通量分布。
由第三节研究结果可知，本研究采用的维生素营养缺陷型菌株T. glabrata WSH-IP303，其丙酮酸产量对培养基中的维生素、特别是硫胺素浓度的变化特别敏感。第四节的研究结果则表明，当培养基中维生素的浓度处于亚适量水平时，即便供氧良好，不同DOT下该菌株生产丙酮酸的性能也呈现出较大差异。为了从生理学上对这些现象进行解释本节根据文献数据，构建了T. glabrata WSH-IP303以葡萄糖为碳源、以氯化铵为氮源积累丙酮酸的代谢网络，并应用MFA方法，对不同硫胺素浓度下不同DOT对丙酮酸发酵的影响进行了深入分析。
二、代谢网络构建和代谢通量计算
(一)理论
底物被运输到细胞质中后，经过1000多种胞内反应，它们被转化成代谢产物或细胞组分。细胞组分因大小和功能而异，但90%以上是由诸如蛋白质、RNA、DNA、脂类及碳水化合物构成的。在底物形成大分子的过程中，底物首先转化为结构单元(Building block)，如氨基酸和核苷酸，然后聚合为大分子。
细胞的合成代谢活性依赖于培养基的组成。例如，当细胞生长在含有所有氨基酸的复合培养基中时，一般情况下就不再合成氨基酸。不同的微生物合成代谢的能力也不相同。有一些微生物可以生长在只含有糖、无机氮和无机盐的全合成培养基中，而另一些微生物的生长则需要有机营养源来提供自身不能合成的结构单元。合成代谢反应需要消耗大量的吉布斯自由能(Gibbs free energy)和还原力。吉布斯自由能通常以水解ATP中的高能键的形式释放；还原力则通常由辅酶NADPH提供。
(二)分批培养中T. glabrata WSH-IP303代谢网络的构建
T. glabrata WSH-IP303的发酵培养基是一个只含有葡萄糖、氯化铵、无机盐和维生素的全合成培养基，细胞组分的结构单元，如氨基酸、核苷酸、多糖和脂类必须由细胞自身合成。考虑胞内的EMP途径、PP途径、TCA循环、氧化磷酸化、维持消耗以及氨基酸、核苷酸、多糖、脂肪酸的生物合成途径，我们构建了T. glabrata WSH-IP303以葡萄糖为碳源，以氯化铵为氮源的代谢网络，如图5-5-1所示。代谢网络由67个方程、64个化合物组成。构建代谢网络时作了以下假设和简化∶
(1) PP途径和TCA循环中的异柠檬酸脱氢反应是产生NADPH的主要途径。产生的NADPH全部用于生物合成，而没有进入线粒体氧化；
(2) P/O假设为1.2；
(3) GTP与ATP等价；ATP→AMP等价于2 ATP→2 ADP；
(4) 没有支路的代谢反应合并为一个反应。
图5-5-1 分批培养中T. glabrata WSH-IP303的代谢网络图
根据van Guilk and Heijnen (1995) 的研究结果，以葡萄糖为唯一碳源时，Saccharomyces cerevisiae 或Candida utilis中乙醛酸循环基本处于不工作状态，因此，我们构建的代谢网络虽然考虑了乙醛酸循环(r13-r14)和以乙醇为底物的反应(r64-r66)，但在本节数据计算时忽略了这5个反应。这样，代谢网络简化为62个方程，63个化合物，分别列于附录A和附录B。
(三)代谢通量计算
代谢网络中的每一个组分，都符合质量守衡定律。这样，可以将图5-5-1所示代谢网络以一种更简洁的数学形式表达出来∶
Ar = X (5-5-1)
式(5-1)中，A是一个63×62的化学计量系数矩阵，其中，元素Ai j代表第i种化合物在第j个反应方程中的化学计量系数。确定计量系数时遵循以下原则∶
(1) “反应为负，生成为正”的原则。例如，丙酮酸是第53种物质(见附录B)。反应方程中丙酮酸若作为反应物，则其系数为负；若丙酮酸作为生成物，则其系数为正；若无丙酮酸，则其系数为零；
(2) “1 C-mol为基准”的原则。含碳化合物计量系数的代数值是以1 C-mol通量为基准确定的。例如，在r2中，虽然1 mol F6P生成2 mol GA3P，但碳通量未变，因此，在该反应中，F6P的系数定为-1，GA3P的系数则为+1。辅因子系数的确定也依据这一原则。例如，在r5中，1 mol PEP转化为1 mol 丙酮酸时产生1 mol ATP。以1 C-mol为基准，ATP的系数为1/3而不是1。
r是62个代谢反应的速率矩阵(62×1)。X是63种代谢物质的净转化速率矩阵(63×1)。为了便于理解，我们给出了式(5-5-1)的矩阵形式，如式(5-5-2)所示。
(5-5-2)
采用MFA计算代谢通量，必须对系统作拟稳态假设，即假设胞内中间代谢产物均处于拟稳态，其浓度变化速率为零。这样，在净转化速率矩阵X中，底物和产物这些与环境有交换的物质，它们的消耗或积累速率可以通过胞外在线或离线方法测量得到；胞内代谢中间产物的净转化速率则全为零。
系数矩阵A的秩R(A)决定了能够求解的反应速率数。如果R(A)小于待解速率的数，则必须增加测定速率的个数，或通过增加线性不相关方程来增加系数矩阵的秩，才能获解。式(5-2)中系数矩阵的秩R(A)=62，与待定反应速率数相等，可以直接求解。
在本研究中，可测量的变量有∶细胞合成速率(x10)，乙醇生成速率(x17)，葡萄糖消耗速率(x23)，甘油生成速率(x28)，(-酮戊二酸生成速率(x34)和丙酮酸生成速率(x52)。由于培养基中葡萄糖为唯一碳源，产物主要为生物量、丙酮酸、乙醇、甘油和(-酮戊二酸，故CO2(x13)释放速率可由碳平衡计算得到。
三、不同硫胺素浓度和不同DOT下的分批发酵结果
第三节研究证实了硫胺素是影响T. glabrata WSH-IP303产丙酮酸的最重要因素，其亚适量浓度为0.015 mg/L。第四节研究结果则表明，当维生素浓度处于亚适量水平时，不同供氧方式下细胞产丙酮酸的性能出现了较大差异。为了深入研究不同硫胺素浓度下不同DOT对T. glabrata WSH-IP303生产丙酮酸的影响，我们在5 L发酵罐上进行了一系列分批培养实验。其中系列A中硫胺素的浓度均为0.03 mg/L，系列B中则为0.015 mg/L。在每个系列实验中，通气量均保持在1 L(L-1(min-1，通过自动调节搅拌转速来实现不同的DOT。发酵过程曲线示于图5-5-2(分阶段控制DOT的过程曲线没有给出)。然后，以葡萄糖中碳的消耗速率作为基准(100 mol(L-1(h-1)，计算得到了不同硫胺素浓度和不同DOT下发酵过程的碳平衡结果，如表5-5-所示。
从图5-5-2和表5-5-1可以直观地看出，DOT越高，葡萄糖消耗速率越慢。在硫胺素浓度为0.03 mg/L的条件下，这种差别表现得还不是很明显，当硫胺素浓度下降到0.015 mg/L后，葡萄糖消耗速率的不同就表现得特别突出。尤其应当注意的是，当发酵过程处于较低的DOT(5%)时，硫胺素浓度高，发酵的主要副产物是乙醇，反之则是甘油。我们在第四节的讨论部分曾作推测，不同DOT下细胞产丙酮酸性能的差异可能是由于NADH的不同去路引起的，葡萄糖消耗速率则有可能与细胞的能量水平相关。图5-5-2的结果基本证实了这一推测。根据表5-5-1的数据，我们计算得到了不同发酵过程中代谢流的分配，示于表5-5-2。限于篇幅，表5-5-2中略去了一些不重要的和较小的代谢通量。
表5-5-1 不同硫胺素浓度和不同DOT下发酵过程的主要参数
硫胺素 / mg(L-1
0.03
0.015
DOT / %
85
70
50
5
85
70
55
5
85 (0-16)
60 (16 h后)
葡萄糖
100
100
100
100
100
100
100
100
100
丙酮酸
57.2
56.2
57.4
32.4
74.0
66.4
55.2
43.4
65.0
CO2
15.3
15.3
14.6
21.8
8.1
9.5
10.7
11.6
10.3
生物量
19.5
19.2
18.4
12.6
16.2
16.7
17.4
14.6
19.0
乙醇
7.4
8.2
8.5
32.9
1.6
3.4
5.2
9.8
2.3
甘油
0
0.5
0.6
0
0
4.0
11.6
20.6
3.4
(-酮戊二酸
0.5
0.6
0.4
0.2
0
0
0
0
0
图5-5-2 不同硫胺素浓度下不同DOT对丙酮酸发酵的影响
■葡萄糖; ● 丙酮酸; □ 细胞量; △ 乙醇; ○ 甘油
A系列实验∶( (硫胺素)= 0.03 mg/L；B系列实验∶( (硫胺素)= 0.015 mg/L
表5-5-2 不同硫胺素浓度下DOT对胞内碳代谢流分配的影响
( (硫胺素) / mg(L-1
0.03
0.015
DOT / %
85
70
50
5
85
70
50
5
85 (0-16 h)
60 (16 h后)
r0
GLC→G6P
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
100.0
r1
G6P→F6P
96.6
96.5
96.4
96.6
95.8
95.8
95.6
96.3
95.4
r2
F6P→GA3P
96.9
97.0
97.0
97.7
97.1
97.1
97.1
97.5
96.8
r3
GA3P→PG
96.8
96.4
96.3
97.8
97.2
93.2
85.6
76.9
93.4
r4
PG→PEP
95.2
94.9
94.9
96.8
95.9
91.9
84.2
75.8
91.9
r5
PEP→PYR
93.8
93.5
93.5
95.8
94.6
90.6
82.8
74.6
90.5
r6
PYR→AcCoA
13.8
13.3
12.3
6.5
8.7
9.2
9.6
7.9
10.8
r7
PYR→OAA
7.6
7.6
7.1
4.9
6.1
6.3
6.5
5.5
7.1
r8
AcCoA→ICI
23.8
23.0
21.2
10.9
14.7
15.7
16.3
13.5
18.4
r9
ICI→(-KG
23.8
23.1
21.2
10.9
14.7
15.7
16.3
13.5
18.4
r10
(-KG→SUC
15.8
15.1
13.9
6.6
9.3
10.0
10.4
8.5
11.8
r11
SUC→MAL
12.6
12.1
11.1
5.3
7.4
8.0
8.3
6.8
9.5
r12
MAL→OAA
12.7
12.1
11.1
5.3
7.4
8.0
8.3
6.8
9.5
r15
G6P→Ru5P
2.2
2.3
2.4
2.5
3.1
3.1
3.2
2.7
3.4
r16
Ru5P→R5P
1.0
1.0
1.0
0.8
1.1
1.1
1.1
0.9
1.2
r17
Ru5P→X5P
0.6
0.7
0.7
0.9
1.1
1.1
1.2
1.0
1.2
r20
Ru5P→PRPP
0.3
0.3
0.3
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.5
r22
PG→SER
1.5
1.5
1.5
1.0
1.3
1.3
1.4
1.2
1.5
r25
PEP→CHR
2.4
2.4
2.3
1.7
2.1
2.2
2.3
1.9
2.5
r29
PYR→ALA
1.3
1.3
1.3
0.9
1.1
1.2
1.2
1.0
1.3
r30
PYR→KVAL
3.4
3.3
3.2
2.1
2.8
2.8
3.0
2.5
3.2
r33
(-KG→GLU
3.6
3.6
3.4
2.3
3.0
3.1
3.2
2.7
3.5
r37
OAA→ASP
4.4
4.4
4.2
2.9
3.7
3.8
4.0
3.3
4.3
r53
G6P→PSACH
1.3
1.3
1.2
0.9
1.1
1.1
1.2
1.0
1.3
r56
AA→PROT
17.5
17.2
16.5
11.3
14.6
15.0
15.6
13.1
17.1
r57
PROT→BIOM
19.5
19.2
18.4
12.6
16.2
16.7
17.4
14.6
19.0
r58
GA3P→GOH
0.0
0.5
0.6
0.0
0.0
4.0
11.6
20.6
3.4
r59
PYR→ACET
11.1
12.3
12.8
49.4
2.4
5.1
7.8
14.7
3.5
r60
ACET→ETOH
7.4
8.2
8.5
32.9
1.6
3.4
5.2
9.8
2.3
r61
NADH→ATP
40.5
39.4
38.3
21.6
39.0
36.0
30.3
20.7
38.2
r62
FADH2→ATP
3.2
3.0
2.8
1.3
1.9
2.0
2.1
1.7
2.4
r63
ATP→ADP
63.9
62.4
61.6
46.4
64.0
57.4
44.8
30.0
58.3
四、不同硫胺素浓度和不同DOT下NADPH的产生与消耗
T. glabrata WSH-IP303以葡萄糖和氯化铵为底物来合成细胞组成物质(如氨基酸、核苷酸和脂类等)时，需要NADPH提供生物合成所需的还原力。在酵母中，产生NADPH的途径有两条∶一是磷酸戊糖途径(PP途径或HMP途径)中6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖酸脱氢反应；二是三羧酸循环中的异柠檬酸脱氢反应。根据代谢通量分析结果，我们对NADPH产生途径的通量分配进行了计算，如表5-5-3所示。
表5-5-3 不同培养条件下NADPH产生途径的通量分配
硫胺素 / mg(L-1
0.03
0.015
DOT / %
85
70
50
5
85
70
50
5
85 (0-16 h)
60 (16 h后)
PP/TCA / % ①
18.3
19.7
22.4
45.9
41.9
39.1
39.9
40.7
36.4
PP/(PP+TCA) / % ②
15.5
16.5
18.3
31.5
29.5
28.1
28.5
28.9
26.7
NADPH总通量 ③
4.70
4.60
4.33
2.66
3.48
3.64
3.80
3.16
4.19
NADPHx / mmol(g-1 ④
9.78
9.77
9.55
8.60
8.71
8.89
8.89
8.83
8.97
① PP/TCA=(r15/3)/(r9/6)*100%, 表示由PP途径(r15)产生的NADPH通量与由TCA循环中异柠檬酸脱氢酶(r9)产生的NADPH通量的比值。
② PP(TCA)=(r15/3)/(r9/6+r15/3)*100%, 表示由PP途径(r15)产生的NADPH通量在NADPH总通量(由PP途径和TCA循环产生)中所占的比例。
③ 反应r15 and r9中产生的NADPH通量，以消耗100 C-mol葡萄糖/(L(h)为基准标准化。
④ NADPHx表示每合成1 g干细胞所消耗的NADPH通量(mmol)。假设细胞分子式为C3.93H7.07O1.96N0.79，灰分含量3.35%。
从表5-5-3中可知，在硫胺素浓度相同、DOT不同的条件下，NADPH的总量虽然不同，但NADPHx却基本相同。如，( (硫胺素)= 0.03 mg/L时，NADPHx在9.5～9.8 mmol/g之间(DOT为5%时例外)；( (硫胺素)= 0.015 mg/L时，NADPHx则在8.9 mmol/g左右。Gancedo 曾指出，在葡萄糖基本培养基上，每合成1 g酵母细胞需要9 mmol NADPH，这一数值与我们实验得到的结果(8.6～9.8 mmol NADPH /g cell)基本相符。
理想地，假设细胞组成在培养过程中没有变化，NADPHx应当是一个常数。但实际上，培养条件往往会影响细胞组成。如在本节中，当( (硫胺素)= 0.03 mg/L，DOT>50%时TCA循环(r6～r12)的通量、TCA循环两个主要出口(r33和r37)的通量均高于( (硫胺素)= 0.015 mg/L时的情况(表5-5-2)。其结果可能导致菌体中蛋白质含量相对升高，这样，合成菌体所需的NADPH也增多，造成NADPHx略有上升。
表5-5-3亦说明，不同培养条件下，细胞能够自动调节NADPH产生途径通量的比例，来满足生物合成对NADPH的需求。如，当( (硫胺素)= 0.03 mg/L且DOT>50%时，TCA循环通量较高，此时PP途径产生的NADPH还不到NADPH总量的20%；DOT下降至5%后，TCA循环通量平均降低了60%左右，PP途径产生的NADPH在NADPH总量中的比例也随之提高。同样地，当( (硫胺素)下降到0.015 mg/L后，由于丙酮酸氧化脱羧途径(r6)受限制，TCA循环通量明显下降，此时，由PP途径产生的NADPH，其相对比例(表5-5-3)和通量(见表5-5-2，r15/3)相对于( (硫胺素)= 0.03 mg/L的情况，均有所升高。所不同的是，在( (硫胺素)= 0.015 mg/L的情况下，不同DOT下由丙酮酸进入TCA循环的通量没有显著差别，因此，产生NADPH的两条途径的通量比例也没有明显差别。
五、不同硫胺素浓度和不同DOT下NADH的产生与消耗
根据第四节的研究结果，我们推测，胞内NADH以何种方式氧化对T. glabrata WSH-IP303的丙酮酸生产性能有着非常重要的影响。表5-5-4给出了基于代谢通量分析的NADH的产生与消耗情况。
表5-5-4 不同培养条件下NADH产生途径的通量分配
( (硫胺素) / mg(L-1
0.03
0.015
DOT / %
85
70
50
5
85
70
50
5
85 (0-16 h)
60 (16 h后)
总NADH通量 ①
44.2
43.6
42.7
38.1
39.9
39.0
36.8
32.5
40.5
来自EMP / % ②
73.0
73.7
75.1
85.6
81.3
79.6
77.5
78.9
76.9
来自TCA / % ③
24.7
24.1
22.6
12.6
16.5
18.1
19.9
18.6
20.6
被O2氧化/ % ④
91.6
90.2
89.6
56.8
98.0
92.2
82.4
63.8
94.3
形成乙醇 / % ⑤
8.4
9.4
9.9
43.2
2.0
4.4
7.1
15.1
2.8
形成甘油 / % ⑥
0.0
0.4
0.5
0.0
0.0
3.4
10.5
21.2
2.8
① 以消耗100 C-mol葡萄糖/(L(h)为基准标准化。
② 指由EMP途径(r3)产生的NADH通量在NADH总通量中所占的比例。
③ 指由TCA循环(r6和r10)产生的NADH通量在NADH总通量中所占的比例
④ 指通过电子传递链(r61)氧化的NADH通量在NADH总通量中所占的比例。
⑤ 指通过形成乙醇(r60)氧化的NADH通量在NADH总通量中所占的比例。
⑥ 指通过形成甘油(r58)氧化的NADH通量在NADH总通量中所占的比例。
从表5-5-4中易知，在T. glabrata WSH-IP303中，由于负责丙酮酸降解的多个酶的活性受限制，使得EMP途径成为最主要的NADH产生途径。在不同的培养条件下，由EMP途径产生的NADH均占NADH总量的70%以上。
当( (硫胺素)= 0.03 mg/L时，不同DOT下由EMP途径产生的NADH量几乎相同(为32.1～32.6标准单位)；而当( (硫胺素)= 0.015 mg/L时，随着DOT的降低，GA3P节点上通往甘油的通量(r58)增加，通往PG的通量(r3)减少。由于从GA3P到PG的反应(r3)正是EMP途径中产生NADH的反应，这样就导致由EMP途径产生的NADH量也在不断减少(参见表5-5-4，NADH总量×EMP途径产生NADH的比例)。( (硫胺素)由0.03 mg/L下降到0.015 mg/L后，DOT分别为85%、70%和50%时，由丙酮酸通往TCA循环的通量(r6)分别降低了37%、31%和22%，由丙酮酸通往乙醇的通量(r59,r60)则分别减少了78%、58%和38%(表5-5-)。由于硫胺素既是丙酮酸脱氢酶系(PDH)的辅因子，又是丙酮酸脱羧酶(PDC)的辅酶，因此可以认为，在硫胺素浓度处于亚适量水平时(0.015 mg/L)，PDH和PDC的活性确实受到了限制。
在( (硫胺素)= 0.015 mg/L且DOT不断降低的情况下，NADH通过呼吸链氧化的量也不断减少(由DOT=85%时的39.1标准单位一直降低到DOT=5%时的20.7标准单位)，同时由于PDC活性的限制，使得通过形成乙醇而氧化的NADH的量也维持在一个很低的水平(0.8～4.9标准单位)。这样，细胞就必须启动它的另一条再生NAD+的途径∶由磷酸二羟丙酮形成甘油。只有这样，才能保证酵解的继续进行。
六、不同硫胺素浓度和不同DOT下ATP的产生与消耗
一般情况下，由于胞内ATP产生和消耗的转换速度很快，因此，要测量胞内ATP库的实际浓度比较困难。MFA方法的产生，为研究者评价不同培养条件下胞内的能量水平提供了可能。表5-5-5所示的不同培养条件下胞内ATP产生和消耗的情况，即为我们根据T. glabrata WSH-IP303胞内的代谢通量分布(表5-5-2)计算得到的结果。从表5-5-5中可以很容易地看出不同培养条件下胞内ATP产生途径及消耗途径的特点。
分析ATP的产生情况，可以发现，在DOT高于50%的条件下，由EMP途径(r3和r5)产生的ATP占ATP总量的比例基本上都在55%左右。而在DOT很低(5%)的条件下，NADH通过呼吸链氧化的比例明显降低(表5-5-4)，故而由EMP途径产生的ATP占ATP总量的比例升高。由于进入TCA循环的通量较低(表5-5-5)，因此，TCA循环中直接产生的ATP(r10)，以及通过形成NADH(r6、r10和r12)后再经呼吸链氧化产生的ATP量，在ATP总量中所占的比例均不超过15%。硫胺素浓度越低，这一比例也越低。而在ATP的消耗途径中，酵解途径自身消耗的ATP(r0和r2)仅占ATP总量的30%左右，合成细胞物质消耗的ATP量也未超过ATP总量的20%，无效循环(Futile cycle)消耗的ATP却占了ATP总量的50%左右。
根据MFA的分析结果，我们计算得到了不同培养条件下对ATP的细胞产率(YATP)。实验条件下，T. glabrata WSH-IP303对ATP的细胞产率基本上都在4 g/mol左右。这一数值与一般认为的YATP=10 g/mol有较大差距，其原因将在讨论部分进行分析。
表5-5-5 不同培养条件下ATP产生和消耗途径的通量分配
( (硫胺素) / mg(L-1
0.03
0.015
DOT / %
85
70
50
5
85
70
50
5
85 (0-16 h)
60 (after 16 h)
总ATP通量 ①
117.0
115.4
113.6
92.5
113.7
107.7
95.8
78.1
110.9
由EMP途径 / % ②
54.2
54.9
55.7
69.7
56.2
56.9
58.6
64.7
55.3
由TCA循环 / % ③
2.7
2.6
2.4
1.4
1.6
1.9
2.2
2.2
2.1
由EMP的NADH / % ④
29.3
29.0
29.2
20.9
33.3
31.2
27.6
21.3
31.2
由TCA的NADH / % ⑤
11.2
10.9
10.2
6.2
7.0
7.9
9.2
9.3
9.0
EMP途径消耗 / % ⑥
28.0
28.5
28.9
35.6
28.9
30.5
34.5
42.1
29.0
TCA循环消耗 / % ⑦
1.6
1.6
1.6
1.3
1.3
1.5
1.7
1.8
1.6
生物合成消耗 / % ⑧
15.8
15.8
15.4
12.9
14.9
16.2
18.9
19.5
17.9
无效循环消耗 / % ⑨
54.6
54.1
54.2
50.1
56.2
53.3
46.8
38.4
52.6
YATP ⑩
4.10
4.08
3.99
3.34
3.51
3.80
4.46
4.58
4.21
葡萄糖消耗速率
/ g(L-1(h-1
1.76
1.85
1.96
2.08
1.22
1.50
1.82
1.94
1.80
葡萄糖比消耗速率
/ h-1
0.108
0.117
0.137
0.200
0.086
0.103
0.121
0.163
0.106
① 以消耗100 C-mol葡萄糖/(L(h)为基准标准化。
② 指由EMP途径(r3和r5)产生的ATP通量在ATP总通量中所占的比例。
③ 指由TCA循环(r10)产生的ATP通量在ATP总通量中所占的比例。
④ 指由EMP途径产生的净NADH(r3产生的NADH减去r58和r60消耗的NADH)通过氧化磷酸化产生的ATP通量在ATP总通量中所占的比例。
⑤ 指由TCA循环产生的NADH通过氧化磷酸化产生的ATP通量在ATP总通量中所占的比例。
⑥ 指EMP途径( r0和r2)所消耗的ATP通量在ATP总通量中所占的比例。
⑦ 指TCA循环( r7)所消耗的ATP通量在ATP总通量中所占的比例。
⑧ 指生物合成反应所消耗的ATP通量在ATP总通量中所占的比例。
⑨ 指无效循环和维持消耗所消耗的ATP通量在ATP总通量中所占的比例。
⑩ ATP产率系数，g(DCW) / mol(ATP).
第四节的研究结果表明，T. glabrata WSH-IP303消耗葡萄糖的速度可能与胞内能量水平存在一定关系。我们根据图5-5-2的数据计算了不同培养条件下的葡萄糖消耗速度，一并列于表5-5-5。可以发现，胞内ATP总量与葡萄糖消耗速度间确实存在相关性。当硫胺素浓度较高时(0.03 mg/L)，不同DOT下胞内ATP总量变化不太大，葡萄糖消耗速度变化也不大；反之，当硫胺素浓度较低时(0.015 mg/L)，随着DOT的下降，胞内ATP总量也明显减少，葡萄糖消耗速度则显著加快。由于生物合成所需的ATP量基本不变，因此，在DOT较低的情况下，ATP总量的减少导致无效循环比例明显降低，这可能是葡萄糖消耗速度得以加快的重要原因。
七、讨论
(一)NADPH的产生途径
关于生物合成所需的NADPH主要由哪条途径提供的问题，不同的研究者看法并不一致。细菌以葡萄糖为底物生长时，主要依靠磷酸戊糖途径来提供NADPH，然而在酵母中却不是。Lobo和Maitra对缺失磷酸戊糖途径两个脱氢酶活性的突变株进行了研究，他们发现，缺失6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性的突变株在葡萄糖基本培养基上的生长不受影响，表明依赖于NADP+的异柠檬酸脱氢酶也可提供生物合成所需的NADPH。但是，6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性正常，而6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶活性缺失的突变株，却不能在葡萄糖基本培养基上正常生长，推测原因是胞内积累的6-磷酸葡萄糖酸对细胞产生毒性。这些结果表明PP途径不是酵母胞内产生NADPH的唯一途径。然而，PP途径又确实是产生NADPH的重要途径。Bruinenberg et al.(1983)的计算结果也表明，在酵母中，假设不存在PP途径，由葡萄糖代谢产生的异柠檬酸全部被异柠檬酸脱氢酶氧化，仍然有20%生物合成所需的NADPH无法得到满足。我们在构建代谢网络时，假设NADPH由PP途径和异柠檬酸脱氢反应产生，正是基于以上研究结果。实际过程中，特别是在硫胺素浓度很低的情况下，由于细胞浓度相对较低(对葡萄糖产率大约在0.15 g/g左右)，因此对NADPH的总需求量也不是很高，故而PP途径的通量较低。
(二)NADH的去路问题
由于酵解途径中有一步反应(r3)会产生NADH，因此，NADH必须以适当方式氧化，才能保证酵解的继续进行。酵母好氧培养时，NADH可以通过呼吸链氧化，而在厌氧条件下，形成乙醇则是最主要的NAD+再生途径。除去这条途径外，由磷酸甘油脱氢酶催化的磷酸二羟丙酮生成磷酸甘油的反应也能再生NAD+ 。在加富培养基中酵母很少形成甘油，因为在这种条件下合成细胞物质所需的NAD+的量很低。实际上，在葡萄糖进入酵解途径的第一时间里，由于此时还未形成足够量的乙醛(r59)，为了再生NAD+，必然会有甘油形成。
酵母一般情况下不会产生大量的甘油，除非乙醛与亚硫酸氢盐形成复合物，或酵母缺失乙醇脱氢酶活性。已经发现，球拟酵母的一个种，Torulopsis magnoliae，能够将40%的糖转化为甘油，其胞内缺失乙醇脱氢酶活性和/或甘油磷酸脱氢酶活性高，可能是产生这种特殊现象的原因。在本研究中，当硫胺素浓度处于亚适量水平时，DOT越低，通往甘油的通量越大。对此，我们的观点是，由于培养基中硫胺素的限量供给，使得丙酮酸脱羧酶活性受限，通过形成乙醇来完成NAD+的再生已不能满足酵解对NAD+的需要，于是，在DOT并不低(如50%)的情况下，T. glabrata WSH-IP303也开始产生大量甘油。可以认为，这是细胞在特定营养条件下的一种自我调节机制。
(三)丙酮酸过量合成过程中的能量问题
1、T. glabrata WSH-IP303胞内能量产生与消耗途径的生理学分析
一般认为，酵母好氧发酵时，TCA循环是主要的供能途径。然而，在T. glabrata WSH-IP303胞内，EMP途径产生的ATP(包括直接产生的和由NADH通过呼吸链氧化形成的)就占了ATP总量的85%以上，这完全是因为在维生素限量供给的条件下，丙酮酸氧化脱羧途径(r6)受限制而造成的。由于进入TCA循环的通量较低，合成细胞物质的前体也较少，结果导致∶不仅生物合成所需的还原力(NADPH)较少，对ATP的需求量也不高(只占ATP总量的15～20%左右)。因此，尽管只有EMP途径作为ATP的主要产生途径，这些ATP的量也大大超过了生物合成所需的量。多余的ATP除了维持消耗以外，只能以无效循环的形式释放能量。也就是说，不同培养条件下胞内产生的ATP，仅有50%左右真正用于“有价值”的生理消耗。
另一方面，我们实验测定的YATP仅为4 g/mol左右，而通常认为，在基本培养基中无论需氧还是厌氧培养，假设用于同化构成菌体的碳源与ATP生成无关，则对于异化代谢的碳源，一般服从YATP=10 g/mol。出现这一差异是基于两方面的原因∶一是由于在本研究中，用于同化构成菌体的葡萄糖在降解过程中也产生ATP；二是因为胞内真正用于生物合成的能量消耗还不到ATP总量的50%。这样在计算YATP时，分母项(ATP总量)偏高，造成YATP偏低。排除这些因素后计算出的“真”YATP，应当也在9～10 g/mol左右。
2、细胞能量状态与葡萄糖消耗速度的关系
在第四节中发现，无机磷的消耗随着kLa的升高而增加，因此，我们推测，在高溶氧状态下细胞可能合成了更多的ATP。根据实验数据计算出的不同DOT下胞内ATP通量的变化情况(表5-5-5)证实了这一推测。硫胺素浓度很低时(0.015 mg/L)，细胞消耗葡萄糖的速度完全由细胞的能量水平控制。这一特点在DOT=85%时表现最为突出。在这一DOT下，一方面，NADH几乎全部通过呼吸链氧化，使得ATP通量明显提高(与DOT较低的情况相比)；另一方面，生物合成所需要的ATP量又非常小(只占ATP总量的15%)，使得大量ATP“屯积”在细胞内部，不得不以无效循环的形式释放能量。无效循环的速度在细胞量较小的情况下通常比较慢，结果导致细胞总是处于一个较高的能量水平。由于细胞对能量的产生和消耗有严格的调控机制，在这种高能量状态下，细胞自然会降低葡萄糖消耗速度，以降低能量水平。DOT降至70%乃至50%后，由于甘油形成途径的启动，导致EMP途径产ATP能力下降，再加上NADH通过呼吸链氧化产ATP的比例也在下降，使得细胞的能量水平明显降低。其结果是，与DOT为85%的情况相比，DOT为70%和50%时的葡萄糖比消耗速率分别提高了19.8%和40.7%(由表5-5-5数据计算而来)。
( (硫胺素)= 0.03 mg/L时，不同DOT下细胞的ATP通量也很高(介于110～120标准单位之间)，但葡萄糖比消耗速率比( (硫胺素)= 0.015 mg/L下的对应速率平均高20%左右。也就是说，在这一硫胺素浓度下，尽管ATP通量很高，但葡萄糖消耗速度却并不低。我们推测，硫胺素浓度高，合成细胞的通量也高(表5-5-2，r57)，这样，维持细胞生命活动所消耗的ATP量增多，无效循环随之加快。虽然表面上细胞的能量水平较高，但实际上，由于ATP的“周转速度”较快，ATP对磷酸果糖激酶活性的抑制作用不显著，故而在这种情况下，葡萄糖的消耗速度仍能保持在一个较高的水平之上。
3、细胞能量水平与合成细胞物质的关系
( (硫胺素)= 0.03 mg/L时，随着DOT的降低，合成细胞的通量(r57)不断减少，而形成乙醇的通量(r60)不断增加(表5-5-2)，符合巴斯德效应。但当( (硫胺素)= 0.015 mg/L时，在DOT从85%降低到50%的过程中，合成细胞的通量反而增加，我们认为，这一现象也是与能量水平密切相关的。DOT=85%时，细胞已经处于较高的能量水平，并且ATP的消耗速度较慢，此时，若不减少由丙酮酸进入TCA循环的通量，细胞的能量水平就会更高。于是，TCA循环通量减少(表5-5-2)，细胞合成也减少，表现在高溶氧状态下细胞生长缓慢(图5-5-2)。在DOT由85%降低到50%的过程中，虽然细胞整体能量水平下降，但从微观来看，细胞具有抵抗能量水平下降的机制，表现在TCA循环通量增大(表5-5-2)，这样由TCA循环产生的ATP比例也随之增大。然而，细胞的自我保护能力是有限的，若DOT太低(如5%)，TCA循环不可能活跃，能量水平的大幅度下降导致细胞量也明显减少。
更深入地分析可以发现，在两个不同的硫胺素浓度下，合成细胞物质的规律之所以出现差异，可能与丙酮酸脱氢酶系(PDH)的活性有着密切的关系。不妨假设由PDH控制的反应(r6)是一个管道。( (硫胺素)= 0.03 mg/L时，管径为A；( (硫胺素)= 0.015 mg/L时，管径为A/2。显然，细管道更容易产生“瓶颈效应”，它不仅具有抵抗外界流量变化的趋势，而且有可能产生异常现象。假设正常情况下，( A管的截面容许通过B个分子，这B个分子要通过( A/2管时，其情形肯定与( A管不同。这样，我们就可以理解，为什么在硫胺素浓度处于亚适量水平时，细胞会出现与一般情况不同的代谢特征。
(四)分阶段控制DOT策略应用于丙酮酸过量合成的生理学依据
T. glabrata WSH-IP303利用葡萄糖生产丙酮酸时，为了获得较高的丙酮酸产率，必须尽可能地减少丙酮酸的进一步转化。然而，由于微生物发酵一般是自催化反应，为了提高丙酮酸的积累速度，又必须保证体系中存在相当数量的细胞。这样就产生了一个矛盾∶细胞量多，葡萄糖消耗速度快，但丙酮酸产率必然下降；细胞量少，丙酮酸产率虽高，但生产强度难以提高。
从表5-5-2的结果来看，好氧情况下，合成细胞物质的通量(r60)要达到17.5～19.5标准单位，才能获得较高的葡萄糖消耗速度。( (硫胺素)= 0.015 mg/L且DOT=85%时，合成细胞物质的通量仅为16.2标准单位。尽管丙酮酸产率非常高，但由于无效循环在ATP总量中所占的比例高达56%，导致胞内ATP水平居高不下，造成葡萄糖消耗速度太慢。此时，若适当降低DOT以启动甘油生成途径，通过生成少量甘油来降低EMP途径的ATP产生能力(因为由葡萄糖生成甘油是ATP净消耗过程)；同时由于DOT降低导致NADH通过呼吸链氧化产ATP的速度减慢，这样就可以使细胞的整体能量水平下降。细胞为了抵抗能量水平下降的趋势，必然增大由丙酮酸进入TCA循环的通量，合成细胞物质的通量也随之增加。细胞量的增加一方面可以加速无效循环，另一方面维持消耗也增大，其结果是胞内ATP周转速度加快，部分避免了高能量水平对酵解途径的抑制，最终达到提高葡萄糖消耗速度的目的。
在硫胺素浓度为0.015 mg/L且分阶段控制DOT的实验中，我们采取了0-16 h控制DOT为85%、16 h后将DOT降至60%的方案。结果，由丙酮酸进入TCA循环的通量(10.8标准单位)和细胞通量(19.0标准单位)均高于控制DOT恒定在85%、70%和50%的情况(表5-5-2)。在分阶段控制DOT的过程中，细胞能量水平仍然较高(110.9标准单位)，无效循环占ATP总量的比例(52.6%)也不低(参见表5-5-5)，但葡萄糖消耗速度(1.80 g/(L(h))却明显加快，与控制DOT恒定在50%的葡萄糖消耗速度相当。其原因正如我们在上面分析的结果，即，虽然ATP的表观水平较高，但由于细胞量高，故ATP在胞内的周转速度较快。即使在某一时刻过高的ATP水平对磷酸果糖激酶的活性产生了抑制，这种抑制也是很容易被解除的。当然，以上分析仅仅是建立在MFA基础之上的推测，要获得更可靠的生理学依据，还需在分子水平上进行更多的研究。
附录A∶T. glabrata WSH-IP303胞内代谢反应方程
酵解途径
r0
GLC + ATP → G6P + ADP
r1
G6P → F6P
r2
F6P + ATP → 2 GA3P +ADP
r3
GA3P + NAD + Pi + ADP → PG + NADH + ATP
r4
PG → PEP
r5
PEP + ADP → 丙酮酸 + ATP
三羧酸循环
r6
丙酮酸 + CoA + NAD → AcCoA + NADH + CO2
r7
丙酮酸 + ATP + CO2 → OAA + ADP + Pi
r8
OAA + AcCoA → ICI + CoA
r9
ICI + NADP → (-KG + NADPH + CO2
r10
(-KG + NAD + ADP + Pi → SUC + NADH + ATP + CO2 (注∶GDP和ADP等价)
r11
SUC + FAD → MAL + FADH2
r12
MAL + NAD → OAA + NADH
乙醛酸循环
r13
ICI → GLX + SUC
r14
GLX + AcCoA → MAL + CoA
磷酸戊糖途径
r15
G6P + 2 NADP → Ru5P + 2 NADPH + CO2
r16
Ru5P → X5P
r17
Ru5P → R5P
r18
X5P + R5P → F6P + E4P
r19
X5P + E4P → F6P + GA3P
氨基酸生物合成s
组氨酸族氨基酸生物合成
r20
Ru5P + 2 ATP → PRPP + 2 ADP
r21
PRPP + GLN + NH3 + 2 NAD + NADPH + 3 ATP + CO2→
HIS + (-KG + 2NADH + NADP + 3 ADP + 6 Pi
丝氨酸族氨基酸生物合成
r22
PG + GLU + NAD → SER + (-KG + NADH + Pi
r23
SER + THF → GLY + METTHF
r24
SER + AcCoA + 4 NADPH + ATP → CYS + AC + CoA + 4 NADP + ADP + Pi
芳香族氨基酸生物合成
r25
2 PEP + E4P + ATP + NADPH → CHR + ADP + 4 Pi + NADP
r26
CHR + GLU + NAD → TYR + (-KG + NADH + CO2
r27
CHR + GLU → PHE + (-KG + CO2
r28
CHR + GLN + PRPP + SER → TRP + GLU + 2 Pi + GA3P + 丙酮酸 + CO2
丙氨酸族氨基酸生物合成
r29
丙酮酸 + GLU → ALA + (-KG
r30
2 丙酮酸 + NADPH → KVAL + NADP + CO2
r 31
KVAL + GLU → VAL + (-KG
r32
KVAL + AcCoA + GLU + NAD + ATP → LEU + (-KG + CoA + CO2 + NADH + ADP + Pi
谷氨酸族氨基酸生物合成
r33
(-KG + NH3 + NADPH → GLU + NADP
r34
GLU + ATP + 2 NADPH → PRO + ADP + Pi + 2 NADP
r35
2 GLU + ASP + AcCoA + 4 ATP + NH3 + CO2 + NADPH →
ARG + 4 ADP + 5 Pi + NADP + (-KG + FUM + CoA
r36
GLU + NH3 + ATP → GLN + ADP + Pi
天冬氨酸族氨基酸生物合成
r37
OAA + GLU → ASP + (-KG
r38
ASP + ATP + NADPH → ASPSa + NADP + ADP + Pi
r39
ASPSa + NADPH → HSER + NADP
r40
HSER + ATP → THR + ADP + Pi
r41
ASP + NH3 + 2 ATP → ASN + 2 ADP + 2 Pi
r42
ASPSa + 丙酮酸 + NADPH + SUCCoA + GLU → LYS + NADP + SUC + CoA + (-KG + CO2
r43
HSER + SUCCoA + CYS + MTHF + ATP → MET + CoA + SUC + 丙酮酸 + NH3 + ADP + Pi + THF
r44
THR + 丙酮酸 + NADPH + GLU → ILE + NH3 + NADP + CO2 + (-KG
核苷酸和RNA的生物合成
r45
PRPP + 2 GLN + GLY + 4 ATP + ASP + 2 FTHF + CO2
→ IMP + 4 ADP + 6 Pi + 2 GLU + 2 THF + FUM
r46
IMP + ASP + ATP → AMP + ADP + Pi + FUM
r47
IMP + NAD + 2 ATP + GLN → GMP + 2 ADP + 2 Pi + GLU + NADH
r48
GLN + PRPP + 2 ATP + ASP + NAD → UMP + 2 ADP + 4 Pi + GLU + NADH
r49
UMP + 2 ATP → UTP + 2 ADP
r50
UTP + GLN + ATP → CTP + ADP + Pi + GLU
r51
CTP + 2 ADP → CMP + 2 ATP
r52
0.2330 AMP + 0.2330 GMP + 0.3060 UMP + 0.2280 CMP + 3.2279 ATP →
9.466 R烟酸 + 3.22791 ADP + 3.22791 Pi
多糖生物合成
r53
0.16667 G6P + 0.16667 ATP → PSACH + 0.16667 ADP + 0.33333 Pi
脂肪酸生物合成
r54
8 AcCoA + 15 ATP + O2 → PAL + 8 CoA + 15 ADP + 15 NADP + 15 Pi
r55
9 AcCoA + 17 ATP + 17 NADPH + O2 → OL + 9 CoA + 17 ADP + 17 NADP + 17 Pi
氨基酸聚合及细胞形成
r56
0.0820 GLU + 0.0285 GLN + 0.0448 PRO + 0.0437 ARG + 0.0776 LYS + 0.0502 SER +0.0787 GLY + 0.0019 CYS + 0.0806 ASP + 0.0277 ASN + 0.0518 THR + 0.0138 MET + 0.0524 ILE + 0.1246 ALA + 0.0719 VAL + 0.0803 LEU + 0.0364 PHE + 0.0277 TYR + 0.0076 TRP + 0.0179 HIS + 4 ATP → 4.8248 PROT + 4 ADP + 4 Pi
r57
47003 PROT + 0.35376 PSACH + 0.05234 R烟酸 + 0.00344 PAL + 0.00344 OL + 0.00266 GOH
→ BIOM
酵解中NADH再生
r58
GA3P + NADH → GOH + NAD + Pi
r59
丙酮酸 → ACET + CO2
r60
ACET + NADH → ETOH + NAD
氧化磷酸化
r61
NADH + 0.5 O2 + 1.2 ADP + 1.2 Pi → 1.2 ATP + NAD
r62
FADH2 + 0.5 O2 + 0.5 (P/O)ADP + 0.5 (P/O)Pi →0.5 (P/O) ATP + FAD
Effective P/O ratio was assumed to be 1.2 according to van Gulik and Heijnen (1995)
用于维持能的ATP消耗
r63
ATP → ADP + Pi
以乙醇为碳源
r64
ETOH + NAD → ACET + NADH
r65
ACET + NAD → AC + NADH
r66
AC + CoA + 2 ATP → AcCoA + 2 ADP + 2 Pi
附录B∶代谢产物矢量
x1
AcCoA
x17
ETOH
x33
IMP
x49
PROT
x2
ACET
x18
F6P
x34
KG
x50
PRPP
x3
ALA
x19
FADH2
x35
KVAL
x51
PSACH
x4
AMP
x20
FUM
x36
LEU
x52
丙酮酸
x5
ARG
x21
G6P
x37
LYS
x53
R5P
x6
ASN
x22
GA3P
x38
MAL
x54
R烟酸
x7
ASP
x23
GLC
x39
MET
x55
Ru5P
x8
ASPSa
x24
GLN
x40
NADH
x56
SER
x9
ATP
x25
GLU
x41
NADPH
x57
THR
x10
生物素M
x26
GLY
x42
OAA
x58
TRP
x11
CHR
x27
GMP
x43
OL
x59
TYR
x12
CMP
x28
GOH
x44
PAL
x60
UMP
x13
CO2
x29
HIS
x45
PEP
x61
UTP
x14
CTP
x30
HSER
x46
PG
x62
VAL
x15
CYS
x31
ICI
x47
PHE
x63
X5P
x16
E4P
x32
ILE
x48
PRO
符号说明
AC
乙酸
(-KG
(-酮戊二酸
AcCoA
乙酰辅酶A
(-KG(e)
胞外(-酮戊二酸
ACET
乙醛
KVAL
酮缬氨酸
ADP
5’-二磷酸腺苷
LEU
亮氨酸
ALA
丙氨酸
LYS
赖氨酸
AMP
5’-单磷酸腺苷
MAL
苹果酸
ARG
精氨酸
MET
蛋氨酸
ASN
天冬酰胺
METTHF
亚甲基四氢叶酸
ASP
天冬氨酸
NAD
烟酸胺腺嘌呤二核苷酸
ASPSa
天冬氨酸半醛
NADH
烟酸胺腺嘌呤二核苷酸，还原型
ATP
5’-三磷酸腺苷
NADP
烟酸胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
CHR
分枝酸
NADPH
烟酸胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原型
CMP
5’-单磷酸胞嘧啶
NH3
无机氨
CO2
二氧化碳
O2
氧
CoA
辅酶A
OAA
草酰乙酸
CTP
5’-三磷酸胞嘧啶
OL
油酸
CYS
半胱氨酸
PAL
棕榈酸
E4P
4-磷酸赤藓糖
PEP
磷酸烯醇式丙酮酸
ETOH
乙醇
PG
3-磷酸甘油酸
ETOH(e)
胞外乙醇
PHE
苯丙氨酸
F6P
6-磷酸果糖
Pi
无机磷
FAD
黄素腺嘌呤二核苷酸
PRO
脯氨酸
FADH2
黄素腺嘌呤二核苷酸，还原型
PROT
蛋白质
FTHF
甲酸基-四氢叶酸
PRPP
5-磷酸核糖焦磷酸
FUM
延胡索酸
PSACH
多糖
G6P
6-磷酸葡萄糖
PYR
丙酮酸
GA3P
3-磷酸甘油醛
PYR(e)
胞外丙酮酸
GLC
葡萄糖
R5P
5-磷酸核糖
GLC(e)
胞外葡萄糖
Ru5P
5-磷酸核酮糖
GLN
谷氨酰胺
SER
丝氨酸
GLU
谷氨酸
SUC
琥珀酸
GLX
乙醛酸
SUCCoA
琥珀酰辅酶A
GLY
甘氨酸
THF
四氢叶酸
GOH
甘油
THR
苏氨酸
GOH(e)
胞外甘油
TRP
色氨酸
HIS
组氨酸
TYR
酪氨酸
HSER
高丝氨酸
UMP
5’-单磷酸尿嘧啶
ICI
异柠檬酸
UTP
5’-三磷酸尿嘧啶
ILE
异亮氨酸
VAL
缬氨酸
IMP
5’-单磷酸肌苷
X5P
5-磷酸木酮糖
第六节 丙酮酸发酵的逐级放大和中间试验
一、引言
前面我们详细考察了维生素和溶氧对T. glabrata WSH-IP303发酵生产丙酮酸的影响。应用实验得到的优化条件，在实验室2.5～5 L发酵罐中取得了较高的丙酮酸发酵水平∶分批发酵55～60 h，丙酮酸产量可达68～72 g/L，对葡萄糖产率> 0.6 g/g。其中，丙酮酸产率已超过了目前文献报道的同类菌株的最高水平。在实验室5 L罐研究的基础上，本节对30 L、300 L和5m3规模的丙酮酸发酵进行了研究。
二、30 L发酵罐中葡萄糖浓度对WSH-IP303菌株生产丙酮酸的影响
以T. glabrata WSH-IP12为出发菌株选育得到的T. glabrata WSH-IP303菌株具有更优良的丙酮酸生产性能，在5 L发酵罐中不需要进行葡萄糖流加培养，丙酮酸产量就可超过60 g/L。采用葡萄糖流加培养技术，是否能在此基础上将丙酮酸产量提高到一个新的水平呢?首先在30 L发酵罐中，考察了该菌株在不同初始葡萄糖浓度(( (IG))下的代谢特征，如图5-6-1所示。
图5-6-1 30 L发酵罐中不同初始葡萄糖浓度对丙酮酸发酵的影响
初始葡萄糖浓度: △ 115.4 g/L; ● 85.3 g/L; □ 53.4 g/L
实验中发现，在不同的( (IG)下，WSH-IP303菌株的生长、葡萄糖消耗和丙酮酸生产的速度并没有表现出明显区别。可以认为，T. glabrata 具有耐受高浓度葡萄糖的能力。虽然图5-6-1所示的不同初糖浓度下的发酵过程曲线形状相似，但若仔细观察，可以发现(表5-6-1)，在较低的初糖浓度下，细胞的(、q p、q s和乙醇产量相对较高，丙酮酸产率和生产强度则较低；而在较高的初糖浓度下，这一趋势正好相反。这一代谢特征使我们想到，如果将培养基中的初糖浓度控制在一个相对较低的水平(如50 g/L)，使细胞快速生长到一个较高的细胞量(如9～10 g/L)，然后再流加葡萄糖，也许可以提高丙酮酸的产率。根据这一思路，在初糖浓度均为55 g/L的条件下，进行了两次葡萄糖总浓度为120 g/L的流加培养实验，其中，第一个实验为葡萄糖分批补加实验∶发酵进行至24 h时一次性向发酵罐中投加葡萄糖，至总浓度为120 g/L；第二个实验为葡萄糖连续流加实验∶发酵进行至24 h时向发酵罐中连续流加浓缩葡萄糖液，至葡萄糖总浓度为120 g/L。表5-6-2给出了流加培养实验与分批发酵过程主要参数的比较。
由表5-6-1易知，采用葡萄糖分批补加或连续流加的操作方案，丙酮酸产量和产率虽然有所提高，但幅度不大，相反，由于葡萄糖消耗速度较慢导致发酵时间延长，造成丙酮酸生产强度反而下降。由此表明，简单的葡萄糖补加或流加操作不能有效地提高丙酮酸的生产水平。
表5-6-1 30 L发酵罐中不同初始葡萄糖浓度下分批发酵过程的参数比较
初始葡萄糖浓度 / g(L-1
115.4
85.3
53.4
剩余葡萄糖浓度 / g(L-1
4.0
1.1
7.7
总发酵时间 / h
58
40
24
丙酮酸产量/ g(L-1
58.0
43.1
18.9
丙酮酸产率/ g(g-1
0.516
0.512
0.459
生产强度 / g(L-1(h-1
0.999
1.072
0.781
( / h-1
0.075
0.105
0.159
q p / h-1
0.066
0.081
0.088
q s / h-1
0.128
0.156
0.214
乙醇浓度 / g(L-1
1.8
2.3
3.5
表5-6-2 30 L发酵罐中不同培养方式对丙酮酸发酵的影响
时间
/ h
剩余葡萄糖浓度
/ g(L-1
丙酮酸
产量
/ g(L-1
丙酮酸
产率
/ g(L-1
丙酮酸
生产强度
/ g(L-1
葡萄糖
消耗速率
/ g(L-1(h-1
乙醇
浓度
/ g(L-1
分批发酵
58
4.0
58.0
0.516
0.999
1.94
1.5
间歇补加1
64
5.3
60.2
0.529
0.939
1.78
3.0
连续补加1
72
7.0
62.3
0.551
0.865
1.57
2.6
1 总葡萄糖浓度为120 g/L。
制约T. glabrata WSH-IP303丙酮酸产量进一步提高的另一个原因可能是∶丙酮酸产量达到较高水平后对细胞代谢活性产生一定的抑制作用。为了考察丙酮酸浓度对细胞产丙酮酸性能的影响，我们在发酵开始时添加不同浓度的丙酮酸(以钠盐形式加入)进行实验，结果表明(表5-6-3)，初始丙酮酸浓度达到50 g/L后，细胞生长和葡萄糖消耗速度明显变慢。外加的丙酮酸也可能被细胞所利用∶如表5.3所示，在丙酮酸初始浓度为60 g/L的条件下，发酵48 h后培养基中的丙酮酸浓度不仅没有增加，反而下降到低于40 g/L，而(-KG产量却高达21.9 g/L。这些实验结果表明，在现有菌株和工艺条件的基础上，要将丙酮酸产量提高到一个新的台阶(如超过80 g/L)是比较困难的。
表5-6-3 不同初始丙酮酸浓度对细胞产丙酮酸性能的影响
初始丙酮酸浓度/ g(L-1
0
10
20
30
40
50
60
细胞干重/ g(L-1
18.5
20.9
19.3
18.2
15.4
10.3
5.3
丙酮酸/ g(L-1
41.4
44.9
48.8
53.1
52.7
47.5
38.9
(-酮戊二酸/ g(L-1
5.2
11.8
11.6
13.3
17.3
18.1
21.9
残糖浓度/ g(L-1
15.4
2.4
5.9
20.9
33.1
67.3
85.2
三、300 L规模的丙酮酸发酵试验
在30 L罐试验的基础上，将丙酮酸发酵放大到在300 L规模的发酵罐上进行了丙酮酸发酵试验的研究。采用相同的发酵工艺，试验共进行四批，过程主要技术指标如表5-6-4所示。图5-6-2给出了其中No. 95-003的发酵过程曲线。
表5-6-4 300 L规模丙酮酸发酵试验结果
批次
初糖浓度
/ g(L-1
残糖浓度
/ g(L-1
丙酮酸产量
/ g(L-1
细胞量
/ g(L-1
时间
/ h
产率
/ g(g-1
生产强度
/ g(L-1(h-1
95-001
113
11.2
54.3
13.9
65
0.533
0.835
95-002
106
5.4
56.8
14.2
70
0.565
0.811
95-003
110
4.5
57.2
13.5
68
0.542
0.841
95-004
108
4.0
58.4
13.8
64
0.562
0.912
图5-6-2 300 L规模的丙酮酸发酵过程曲线
□ 葡萄糖; ○ 丙酮酸; △ 细胞量
四、5 m3规模丙酮酸发酵中试
在300 L罐试验的基础上，我们在5 m3中试罐上进行了一批发酵试验，过程曲线如图5-6-3所示。在5 m3规模发酵罐中试中，发酵60 h丙酮酸产量达到55.8 g/L，产率(糖酸转化率)达到0.553 g/g，为实现工业化奠定了坚实的基础。
图5-6-3 5 m3规模丙酮酸中试发酵过程曲线
□ 葡萄糖; ○ 丙酮酸; △ 生物量
第五章主要参考文献
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| 课件名称： | 《发酵工程》电子教案 |
| 课件分类： | 生物 |
| 课件类型： | 电子教案 |
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