第三章 生物反应过程的系统优化技术 2 第一节 系统优化技术概述 2 一、系统的定义 2 二、系统的形态 2 三、系统的特征 3 四、系统优化方法的基本原则 4 第二节 ATP再生系统及其在谷胱甘肽生物合成中的应用 6 一、ATP再生系统 6 二、ATP再生和谷胱甘肽生物合成的耦合系统 10 三、生物合成谷胱甘肽种间耦合ATP再生系统的构建 16 第三节 有机废水处理和聚羟基烷酸生产的耦合系统 21 一、研究背景 21 二、实验装置 23 三、有机废水生产PHAs的初步研究 23 四、R. eutrophus 利用不同有机酸生产PHAs的比较研究 24 五、有机废水生产PHAs的机理研究 27 六、有机废水厌氧酸化最佳工艺条件的探索 29 七、PHAs分批发酵 32 八、以有机废水酸化产物为底物进行PHAs流加发酵 35 第四节 生物反应与产物分离的组合系统 37 一、随程溶剂萃取 38 二、渗透萃取 39 三、渗透蒸发 40 四、其它生物反应与产物分离技术 40 五、生物反应与产物分离组合系统的发展趋势 43 第三章 生物反应过程的系统优化技术 第一节 系统优化技术概述 在自然界和人类社会中，可以说任何事物都是以系统的形式存在的。人们在认识客观事物或改造客观事物的过程中，用综合分析的思维方式看待事物，根据事物中内在的、本质、必然的联系，从整体的角度进行分析和研究，这类事物就被看作为一个系统。 一、系统的定义 系统的思想古已有之，但是将系统作为一个重要的科学概念予以研究，则是由奥地利理论生物学家贝塔朗菲于1937年第一次提出来的，他认为系统是“一个相互作用的诸要素的综合体”。到目前为止，系统的确切定义依照学科不同，使用方法不同和解决的问题不同而有所区别，国外关于系统的定义不下40多个。我国科学家钱学森对系统的定义是∶“系统是由相互作用和相互依赖的若干组成部分结合而成的，具有特定功能的有机整体，而且这个整体又是它从属的更大的系统的组成部分”。换句话说，系统是同类或相关事物按一定的内在联系组成的整体。相对于环境而言，系统具有一定目的、一定功能并相对独立。 在日常生活中，我们对系统这个词并不陌生，自然界和人类社会中的很多事物都可以看作为系统，如消化系统，铁路系统、神经系统等；而一个工厂可以看作是由各个车间、科室、后勤等构成的系统；一部交响乐也可以看作是由多个乐章构成的系统。系统是有层次的，大系统中包含着小系统，如在自然界中，宇宙是一个系统，银河系又是一个从属于宇宙的的系统，是宇宙的子系统，而太阳系又是从属于银河系的一个银河系的子系统，再往下，地球又是太阳系的一个子系统等等。大系统有大系统的特定规律，小系统不仅要从属于大系统，服从大系统规律，而且本身又有自己的特定规律性，这是自然科学、社会科学普遍存在的带有规律性的现象。 二、系统的形态 系统是以不同的形态存在的。根据生产的原因和反映的属性不同，系统可以进行各种各样的分类。系统的形态与其所要解决的问题密切相关。系统的一般形态有： (一)自然系统和人造系统 自然系统是自然物等形成的系统。它的特点是自然形成的。自然系统一般表现为环境系统，如海洋系统、矿藏系统、生态系统、大气系统等。人造系统是为了达到人类所需要的目的，由人类设计和建造的系统。如工程技术系统、经营管理系统、科学技术系统等。 实际上，多数系统是自然系统与人造系统相结合的复合系统，因为许多系统是由人类运用科学力量认识和改造了的自然系统。如社会系统，看起来是一个人造系统，但是它的发生和发展是不以人们的意志为转移的，而是有其内在的规律性。随着科学技术的发展，已出现了越来越多的人造系统。 (二)实体系统和概念系统 实体系统是以生物、矿物、能源、机械等实体组成的系统。就是说，它的组成要素是具有实体的物质。如人─机系统，机械系统、电力系统等。实体系统以硬件为主体，以静态系统的形式来表现。概念系统则是由概念、原理、方法、制度、程序的功能观念性的非物质实体所组成的系统，它是以软件为主体，依附于动态系统的形式来表现的。如科技体制、教育体系、法律系统、程序系统等。 (三)封闭系统与开放系统 封闭系统是指与外界环境不发生任何形式交换的系统。它不向环境输出也不从环境输入，一般讲，它是专为研究系统目的而设定的。如封存的设备、仪器以及其他尚未使用的技术系统等。开放系统是指系统内部与外部环境有能量、物质和信息交换的系统。它从环境得到输入，并向环境输出，而且系统状态直接受到环境变化的影响。大部分人造系统属于这一类，如社会系统、经营管理系统等。 (四)静态系统和动态系统 静态系统是其固有状态参数不随时间变化的系统。它没有既定的相对输入与输出，表征系统运动规律的模型中不含时间因素，即模型中的变量不随时间而变化。如车间平面布置系统、城市规划布局等。静态系统属于实体系统。动态系统是系统状态变量随时间而改变的系统，它有输入和输出及转换过程，一般都有人的行为因素在内。如生产系统、服务系统、开发系统、社会系统等。 (五)对象系统和行为系统 对象系统是按照具体研究对象进行区分而产生的系统。如企业的经营计划系统、生产系统、库存系统等。行为系统是以完成目的行为作为组成要素的系统。所谓行为是指为达到某一确定的目的而执行某特定功能的作用，这种作用对外部环境能产生一定的效用。行为系统的区别是根据行为特征的内容加以区别的。也就是说，尽管有些系统组成部分及其有关内容是相同的，但如果起执行特定功能的作用不同，那么它们就不能是同类的系统。行为系统一般需要通过组织体系来体现，如社会系统、经济系统、管理系统等。 (六)控制系统和因果系统 控制系统是具有控制功能和手段的系统。当控制系统由控制装置自动进行时，称之为自动控制系统。因果系统是输出完全决定于输入的系统，其状态与结果具有一致性，这类系统一般为测试系统，如信号系统、记录系统、测量系统等。因果系统必须是开放系统。 具体系统的形态可能千变完化，但是基本上可以看作是由上述各种系统相互组合而形成的。它们之间往往是相互交叉和相互渗透的。 三、系统的特征 系统应当具备四个基本特征： (一)整体性 系统是由两个以上有一定区别又有一定相关的要素所组成，系统的整体性主要表现为系统的整体功能。系统的整体功能不是各组成要素的简单迭加，而是呈现出各组成要素所没有的新功能，概括地表述为"整体大于部分之和"。 (二)相关性 各要素组成了系统是因为它们之间存在相互联系、相互作用、相互影响的关系。这个关系不是简单的加和，即l十1≠2，而是有可能是互相增强，也有可能是互相减弱。有效的系统，各要素之间互补增强，使系统保持稳定，具有生命力。而要做到这一点，系统必须有一定的有序结构。 (三)目的性 系统具有能使各个要素集合在一起的共同目的，而且人造系统通常具有多重目的。例如企业的经营管理系统，在限定的资源和现有职能机构的配合下，它的目的就是为了完成或超额完成生产经营计划，实现规定的质量、品种、成本、利润等指标。 (四)环境适应性。 环境是指出现于系统以外的事物（物质、能量、信息）的总称，相对于系统而言，环境是一个更高级的、复杂的系统。所以系统时时刻刻存在于环境之中，与环境是相互依存的。因此，系统必须适应外部环境的变化，能够经常与外部环境保持最佳的适应状态，才能得以存在。对于社会系统而言，任何系统都是发展和变化着的，根据系统的目的，有时增加一些要素，有时删除一些要素。也存在系统的分裂及合并，研究系统，尤其是研究社会系统，应当有发展的观点。 四、系统优化方法的基本原则 生物反应系统所包含的参数绝大多数属于不可控因素，且它们相互制约，互为条件。在外界环境约束条件下，要正确处理好众多因素之间的关系，除非采用系统优化技术，否则难以得到满意结果。生物反应系统优化的基本思想是整体优化的思想，对所研究的对象采用定性或定量的模型优化技术，使系统整体目标最优。生物反应系统优化方法的原则主要有以下四个方面∶ (一)系统整体性原则 世界上的一切事物、现象和过程，几乎都是自成系统而又互成系统。客观世界的整体性正是系统优化方法整体性原则的来源和依据。在系统优化中，要求把研究对象看成由不同部分构成的有机整体，把全局观点、整体观点贯彻于整个研究的各个方面、各个部分、各个阶段。整体性原则具体包括∶(1)不能从系统的局部得出有关系统整体的结论；(2)分系统的目标必须服从于系统整体的目标。 (二)系统有序相关原则 凡是系统都是有序的。系统的有序性，是系统有机联系的反映，系统的任何联系都是按一定等级和层次进行的，都是秩序井然、有条不紊的。在系统层次上表现出来的整体特性是由要素或分系统组成的系统，由于内部结构方式、有序程度的不同，系统的整体功能表现出极大的差异性。各要素（分系统）之间的相互关系越走向有序，系统的整体功能就越强，因此，为获得预期的整体功能，从方法论上应把注意力集中于系统内部要素之间，以及各分系统之间的相互关联上。 (三)系统目标优化原则 最优化的观念贯穿系统优化的始终，它是系统优化技术的指导思想和追求目标。最优化技术是40年代发展起来的一门较新的数学分支，近几年发展迅速，应用范围愈来愈广，其方法也愈来愈成熟，所能解决的实际问题也愈来愈多。所谓最优化，就是在一定的约束条件下，如何求出使目标函数为最大(或最小)的解。求解最优化问题的方法称为最优化方法。一般讲，最优化技术所研究的问题是对众多方案进行研究，并从中选择一个最优的方案。一个系统往往包含许多参数，受外部环境影响较大，有些因素属于不可控因素。因此，也可以说，优化问题是在不可控参数发生变化的情况下，根据系统的目标，经常、有效地确定可控参数的数值，使系统经常处于最优状态。系统最优化离不开系统模型化。先有模型化而后才有系统最优化。 (四)系统动态性原则 系统优化是一个比较复杂的过程，研究对象内部复杂的相互作用和外部环境的多变性，使系统本身呈现出动态特性。因此，应把实施对象看作一个动态过程，分析系统内外的各种变化，掌握变化的性质、方向和趋势，采取相应的手段，改进研究方法，在动态变化中对系统整体进行优化。 (五)系统分解综合原则 分解是将系统中具有密切相关关系的要素进行分组。对系统来说就是归纳出相对独立、层次不同的分系统。综合则是完成新系统的筹建过程，即选择具有性能好、适用性强的分系统，设计出它们的相互关系，形成具有更广泛价值的系统，以达到预定的目的。分解的方法是多种多样的，一般可按结构要素、功能要素、时间序列、空间状态等方法进行分解。分解的原则，既要满足于系统的构建要求，又要便于进行研究。 (六)系统创造思维原则 系统创造思维的基本原则有两条。其一是把陌生的事物看作熟悉的东西，用已有的知识加以辩识和解决。从这条原则出发，不只是对新的事物给以旧的解释，还可能给予新的解释，从而创造出新的理论。其二是把熟悉的对象看作陌生的东西，用新的方法、新的原则加以研究，从而创造出新的理论，新的技术。这往往是被人们忽略的原则。创造性思维活动极为复杂，它的形式多种多样，并且常常以多种形式互相重叠交错在一起。 五、本章主要内容 图3-1-1是生物反应系统的整体示意图。对这样一个复杂的系统进行优化研究，必须从优化系统内部各要素的功能和相互间的关系、系统与环境的关系入手，才能使系统实现优化配置。我们在实践中研究过的生物系统主要包括∶(1)生物产品合成的能量(ATP)或辅因子(NADH)再生系统；(2)废水生物处理的厌氧─好氧组合处理系统；(3)生物反应与产物提取的耦合系统；(4)有机废水处理和有用物质生产的耦合系统。对这些系统进行优化，主要内容包括两个方面∶首先要构建一个系统，然后使这一系统高效运行。本章对此作一介绍。  图3-1-1 生物反应系统示意图 第二节 ATP再生系统及其在谷胱甘肽生物合成中的应用 一、ATP再生系统 20世纪60年代以来固定化技术的飞速发展，极大地促进了作为高效催化剂的酶和微生物细胞在实际工业生产中的应用。目前，固定化细胞和酶不仅已被用于大规模连续生产医药、生物和营养方面的重要产品，而且在有机合成、化学和临床分析、食品工业、医药以及生物化学的基础研究领域中也倍受人们关注。然而，遗憾的是，直到现在，固定化酶的工业应用几乎全限于催化降解反应或简单的转化反应，在复杂合成过程中的应用鲜有报道，对人们所关心的由简单前体合成复杂分子的过程更是研究甚少。而实际上，许多有用的、特别是那些本来由传统发酵工艺生产的化合物，在细胞中通常是通过多酶反应合成的，因此，如何建立一个合理的生物反应系统以实现有用化合物的高效生产，近年来已成为生化工程研究者所注目的焦点问题。 阻碍多步酶反应经济可行工艺发展的屏障在于缺乏辅因子如5'-三磷酸腺苷(ATP)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及辅酶A的再生和保留系统，故构建辅因子再生系统，无论是对酶的经济利用还是对提高反应效率来讲都是必需的。其中又以ATP再生系统最为重要，因为ATP通常作为生物合成酶反应生产有用物质所必需的能量来源，但ATP的价格又相对昂贵，经济上不允许在反应过程中直接添加ATP。因此，一旦需要利用生物合成酶反应生产某些物质，ATP提供方式是否经济、有效，直接影响反应的成功与否。 ATP再生系统可定义为一个需要ATP的生物酶反应系统与一个ATP生物合成系统所构成的耦合系统。一般地，ATP在降解为ADP(或AMP)的同时，释放贮存在ATP分子中的能量用于生物合成反应。若能建立一个适宜的反应系统，在这个系统中，由ATP降解而来的ADP(或AMP)可通过其它途径再合成ATP，使ATP能够循环使用，这样就有可能采用能够再生ATP的廉价底物来替代ATP，从而提高有用物质生产过程的经济性。 到目前为止所报道的ATP再生系统中，如果按底物的不同来分类，可以分为转移高能磷酸基的反应系统和采用碳水化合物作为基质的反应系统。前一系统由于采用高能化合物作为底物，实验室规模操作的效率虽然较高，但在工业上使用却很不稳定，会导致ATP再生反应总产率的下降，且大规模提供这些物质也有问题，故用途不广。后一系统与前者相比优势明显。因为从工业规模ATP再生反应的角度来看，碳水化合物和磷酸基团无疑是价廉、稳定且能够大规模提供的基质。采用碳水化合物为基质再生ATP，通常需要多种参与糖代谢的酶，由于不太可能分离出酵解系统的所有酶，故可以采用含有这些酶的微生物细胞作为合成ATP的酶源。根据酶源的不同，又可将利用碳水化合物为基质的ATP再生系统再分为自耦合系统(图3-2-1)和种间耦合系统(图3-2-2)。  图3-2-1 自耦合ATP再生系统示意图  图3-2-2 种间耦合ATP再生系统示意图 (一)ATP再生系统的必要条件 为了建立如图3-2-1和图3-2-2所示的耦合反应系统并成功地用于实际生产，必须满足以下条件∶(1)用于合成产物的酶的活性必须足够强且稳定；(2)能大量提供廉价、稳定的前体物质；(3)再生ATP的活性足够强且稳定，能与生物合成酶反应成功地耦合；(4)提供廉价的能量底物(如葡萄糖)和磷酸基团供体(如无机磷酸盐)以利于ATP再生；(5)若有类似于分解反应的有害副反应，则必须对其加以控制；(6)若底物或预定的产物不能透过细胞膜，则必须设法提高膜的通透性。 (二)自耦合ATP再生系统 1、反应系统概述 如图3-2-1所示，在自耦合反应系统中，生物合成酶反应所消耗的ATP被具有ATP合成活性的同种微生物菌株再生，后再用于生物合成反应。故只需提供葡萄糖和目标产物的前体，生物合成反应便可以进行下去，而无需添加超过催化剂量的昂贵的ATP。下面就举几个采用自耦合反应系统生产有用物质的例子。 2、GMP(5'-鸟苷酸钠盐)生产过程 XMP＋NH3＋ATP→GMP＋AMP＋PPi GMP具有很强的调味功能，全世界每年的需求量为数千吨。产氨短杆菌(Brevibacterium ammol/Loniagenes)具有转化XMP(5'-磷酸黄苷)生成GMP的能力，此外还需要添加葡萄糖和铵离子。由于产物GMP不能透过细胞膜，因而必须加入一种表面活性剂(POESA，聚氧乙烯硬脂酰胺)以提高细胞膜的渗透性。该菌的缺点是具有核苷酸分解酶活性，能分解XMP和GMP；并具有磷酸化GMP生成GDP和GTP的酶活性，还能转移ATP的磷酸基团到GMP的3'位置，这些都会导致GMP的产率下降。选育低核苷酸分解活性的菌株及进一步控制有关酶的形成可克服前一困难，而后面的问题则可通过优化反应条件来解决。 3、ATP(腺嘌呤核苷-5'-三磷酸钠盐)生产过程 葡萄糖→PRPP(磷酸核糖焦磷酸) 腺嘌呤＋PRPP→AMP＋PPi ATP可用作生化试剂及治疗心脏疾病、肌肉营养障碍的药物。用腺苷和AMP作为前体可积累大量ATP。近来发现，用腺嘌呤作为ATP生产的前体可能更为适宜，因为化学合成的腺嘌呤价格比较低廉。唯一的问题是腺嘌呤分子中不含核糖，若要用腺嘌呤作为前体，必须以某种方式提供核糖。一种同时具有PRPP(磷酸核糖焦磷酸)生物合成活性与ATP生物合成活性的产氨短杆菌可利用腺嘌呤为前体生产ATP。实验中观察到当ATP开始积累时反应便告停止，分析发现，镁离子是这一转化过程必须的辅因子，但ATP对二价金属离子有很强的螯合作用，而被ATP螯合后的镁离子不能作为辅因子，镁离子不足抑制了反应的继续进行。为此必须随着反应的进行适当补加镁离子以防止反应液中镁离子的缺乏。 4、GSH(谷胱甘肽)的生产过程 Glu＋Cys＋ATP→-GC(-谷氨酰半胱氨酸) -GC＋Gly＋ATP→GSH＋ADP＋Pi GSH是生物体内一种重要的生物活性三肽，通常用作治疗肝脏疾病的药物。它是由-谷氨酸半胱氨酸合成酶(GSHⅠ)和谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)在ATP存在下催化L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸的一个序贯酶反应合成的。每合成1摩尔GSH需消耗2摩尔ATP。用于核苷酸生产的产氨短杆菌不能用作合成GSH的酶源，因为该菌中GSHⅠ和GSHⅡ的活性非常弱。有报道说，将编码GSHⅠ和GSHⅡ的基因gshⅠ和gshⅡ自克隆入E. coli中，构建一株具有高GSH合成活性的重组E. coli，利用该菌可建立一个用于生产GSH的自耦合反应系统，反应液中积累的GSH比出发菌株提高了10倍。研究结果还表明该菌中ATP再生系统的效率是影响GSH产率的主要因素。 (三)种间耦合ATP再生系统 1、反应系统概况 自耦合ATP再生系统由于只用到一种微生物，故该菌中必须同时具有需要ATP的生物合成反应的酶活性和再生ATP的酶活性。要提高自耦合反应系统的效率，必须同时提高这两个系统的活性，而实际上这很难做到。一方面，虽然目前采用重组DNA技术可显著促进特定酶的活性，但酶活性的提高与作为酶活性供体的细胞数量成反比，故所需的细胞量将大量减少；另一方面，ATP的生物合成是一个多酶反应系统，要想分离出参与反应和促进活性表达的全部酶的基因非常困难，采用重组DNA技术也很难大幅度提高其活性，由此导致的结果是，用于反应的细胞数量又不能减少。这样就形成了一个矛盾。 由此想到，如果能采用不同的微生物，一种作为ATP合成活性的供体，另一种作为与此相偶联的生物合成酶活性的供体(图3-2-2)，即可构成一个种间耦合ATP再生系统。这一系统的优点在于∶①合成酶活性供体可以自如地从多种微生物中选择；②采用重组DNA技术可显著促进特定酶的活性。 在种间耦合反应系统中，通常都采用E. coli作为合成酶活性的受体菌，因为E. coli可满足大多数重组DNA技术的应用要求。以下举例说明采用重组DNA技术构建的大肠杆菌和具有较强ATP生物合成活性的产氨短杆菌或面包酵母组合而成的种间耦合反应系统。 2、GMP生产过程 日本有学者将编码GMP合成酶(或称XMP胺化酶)的基因从E. coli中克隆出，再通过自克隆使其酶活得以提高。将该菌株的培养液与XMP的发酵液(含有产氨短杆菌突变株)混合，再加入反应所必需的组分，如葡萄糖、无机磷酸盐和能赋予细胞膜通透性的试剂，以转化XMP为GMP。由于GMP合成酶活性较高，故转化反应用细胞的培养液体积可减少，这样，反应开始时XMP的浓度相对较高，反应结束后的GMP浓度也较高，从而提高了生产率。 3、IMP(5'-肌苷酸钠盐)的生产过程 Inosine(肌苷)＋ATP→IMP＋ADP 采用种间耦合系统生产IMP的思路与GMP生产类似。Mori从E. coli中克隆出编码鸟苷─肌苷激酶(负责IMP合成)的基因，并通过自克隆方法提高了其活性。以产氨短杆菌培养液中生产的肌苷被用作前体，产氨短杆菌为ATP再生活性细胞，加入具有较强肌苷─鸟苷激酶活性的E. coli培养液，IMP可大量积累。这一过程的优点亦与GMP生产过程类似。 4、CDP(胞苷二磷酸)胆碱的生产过程 氯化胆碱＋ATP→磷酸胆碱＋ADP CTP＋磷酸胆碱→CDP胆碱 CDP胆碱也是一种用途较广的药物。由于以乳清酸为底物生物合成CTP的途径是一个多酶参与的复杂反应系统，普遍认为要以乳清酸为前体酶法积累CTP是很困难的。日本学者发现，产氨短杆菌只能转化乳清酸为UTP而非CTP，使用E. coli中负责CTP合成的酶可解决这一问题，使CTP大量积累。但细菌不具有CDP胆碱生物合成系统，为此，他们克隆了酵母的CDP胆碱生物合成酶系统以及胆碱激酶(该酶能够磷酸化氯化胆碱)的基因，并使之在E. coli中高效表达。具体操作是，先将来自酵母的CDP胆碱合成酶基因和胆碱激酶的基因结合起来制备一个融合基因，再和来自E. coli的CTP合成酶基因一起插入质粒。这样，携带重组质粒的E. coli细胞内便具有了三种酶的活性。将重组E. coli和产氨短杆菌的培养液相混合就可进行CDP胆碱的生产。当然，还需加入二甲苯作为细胞膜渗透剂。结果反应液中CDP胆碱浓度达到11.7g/L，比起用胞苷和CMP作为前体的传统方法，成本显著下降。 5、GSH的生产过程 Saccharomyces cerevisiae(面包酵母)和E. coli的自耦合ATP再生系统均可生产GSH。前者的ATP再生能力虽然较强，但GSH合成活性不高；而后者利用乙酸激酶反应再生ATP，所需的底物乙酰磷酸过于昂贵。Murata利用S. cerevisiae和E. coli，构建了一个生产GSH的种间耦合系统，其中S. cerevisiae作为提供ATP的酶源。这一系统可以有两种形式，即共固定化系统(S. cerevisiae和E. coli细胞一起固定化在同一聚丙烯酰胺凝胶中)和混合固定化系统(S. cerevisiae和E. coli分别用聚丙烯酰胺凝胶固定化后再混合使用)。为了使ATP能够在两种固定化微生物细胞间转移并将其保留在反应器中，必须加入腺嘌呤。实验结果表明，混合固定化系统的GSH产量略低于共固定化系统，可能是在分别固定化的S. cerevisiae和E. coli的颗粒中ADP和ATP的扩散存在屏障。韩国仁荷大学Koo等也在研究生产GSH的混合固定化系统，其中E. coli经过重组DNA技术提高了GSH合成活性，具有高发酵活力的S. cerevisiae则作为ATP供体。研究结果尚未发表。 (四)ATP再生系统存在的问题 用微生物细胞本身作为酶源构建ATP再生系统还有几个问题尚未解决。问题之一，除了合成产物所需的关键酶以外，细胞内还有许多种酶，其中一些具有分解活性，能将反应的底物和预定的产物转化为副产物。问题之二，微生物细胞具有很强的自我保护功能，作为渗透屏障的细胞膜可防止胞内物质渗出。但当细胞用作酶源时，这种屏障就会阻碍底物和产物进出细胞。因此有必要寻求一种在不降低合成酶活性前提下提高细胞膜通透性的方法。 1、抑制副反应的方法 对于具有分解、转移底物或产物为副产物的酶，可通过选育缺失该酶活性的突变株，或优化反应条件使副产物的形成降低到最小的限度。如在GSH生产中应设法降低-谷氨酰转肽酶的活性以避免GSH降解为L-半胱氨酰甘氨酸。 2、提高膜通透性的方法 目前，多采用酵母或细菌以碳水化合物为基质和能源进行ATP再生。一般地，干燥细胞或用溶剂、表面活性剂处理细胞都可以提高细胞膜的通透性。但从工业观点看，前两种方法均存在问题，因为干燥细胞需要大型设备，而大量使用溶剂又会受到消防要求的制约。在这种形势下，使用表面活性剂的方法无论在经济性、安全性上都可能是最具优势的。Fujio研究发现，聚氧乙烯硬脂酰胺(POESA)对提高细胞膜透性较为适宜。 采用ATP再生系统来生产GMP、IMP、ATP、GSH和CDP胆碱的过程已有很多研究报道。其中除GSH已通过固定化实现连续生产以外，多数是在悬浮培养体系中构建ATP再生系统。实际上，从工业观点看，固定化微生物细胞进行有用物质的生产，具有以下优势∶①不需要提取和纯化酶的过程；②细胞可以重复使用；③可以实现连续操作；④反应器占地小；⑤反应控制容易；⑥要处理的液体体积小；⑦可以获得高纯度产品；⑨工厂污染减轻。因此，虽然固定化操作较为繁琐，研究由固定化细胞组成的ATP再生系统生产有用物质的过程，仍是这一领域今后的发展方向。 如果一个需要ATP的生物合成系统包括多步反应，确定哪一种酶是合成途径中最关键的酶就显得至关重要，因为重组DNA技术并不能无限制地提高所有酶的活性。例如，CDP胆碱的生产过程需要经过三个步骤，简单地将三种基因导入质粒并不能使之获得充分的表达，这可能是因为CDP胆碱原本不存在于细菌中的缘故。发展多酶反应系统生产有用物质的重要性是毋庸置疑的，但确定哪一个是酶反应的关键步骤还有待于进一步探究。此外，虽然基因重组也很难提高ATP生物合成系统的整体活性，但一旦ATP生物合成系统得以强化，生产率就可大大提高。从另一个角度说，ATP生物合成系统的活性是目前限制ATP再生系统推广应用的瓶颈问题。 二、ATP再生和谷胱甘肽生物合成的耦合系统 谷胱甘肽(GSH)由于具有解毒、抗衰老和抗氧化等重要的生理功能，故而在医药和食品工业中的应用前景十分广阔。虽然日本利用酵母发酵生产的GSH早在1985年就取得了中国卫生部的原料药进口许可文号，但由于GSH是酵母胞内产物，提取工艺繁琐及提取成本过高，使得GSH的价格居高不下，从而限制了它的推广应用。 (一)具有高谷胱甘肽合成活性重组大肠杆菌的构建 Bloch最早证实细胞内的GSH是由(-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH-I，EC6.3.2.2)与谷胱甘肽合成酶(GSH-II，EC6.3.2.3)在ATP存在下催化L-谷氨酸(Glu)、L-半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)的一个序贯反应合成的。要实现GSH的高效合成，GSH合成酶系的高活性和ATP的有效供给是两个必须满足的条件。重组大肠杆菌WSH-KE1能以葡萄糖为底物在胞内积累GSH。虽然可以实现该菌株的高密度培养，但由于质粒的不稳定性，使得该菌株在高密度培养过程中胞内GSH合成能力明显下降。 在经过细胞通透性处理之后，重组大肠杆菌WSH-KE1能够以L-Glu，L-Cys和Gly为底物，在胞外积累1 g/L左右的GSH。然而，在该菌株中，质粒稳定性极差。考虑到工程菌中外来基因的表达既受基因本身的影响，也受宿主细胞遗传及生理特性的影响，为此，我们改变宿主细胞，试图构建一株GSH合成活性和质粒稳定性俱佳的重组大肠杆菌。在此基础上，对新构建菌株生物合成GSH的反应过程进行了研究。 1、质粒pGH501的提取和大肠杆菌转化 携带质粒pGH501的重组E. coli WSH-KE1能够以葡萄糖为底物胞内积累GSH，然而在高密度培养条件下质粒容易丢失。Aiba等和Skogman等认为，质粒的稳定性会受到宿主细胞遗传特性、质粒的拷贝数以及质粒上基因的表达等诸多因素的影响。因此，更换质粒pGH501的宿主细胞，有可能构建出一株GSH合成活性和质粒稳定性俱佳的重组大肠杆菌。 首先从重组E. coli WSH-KE1中提取质粒pGH501，然后分别以E. coli DH5(、E. coli JM109、E. coliⅠ和E. coliⅡ为宿主进行转化，以氨苄青霉素抗性(Ampr)为选择性标记挑取转化子。在所得到的不同宿主的转化子中，各选取10个生长情况良好的单菌落，考察其GSH合成能力。结果发现，新构建的转化子中，80%以上其GSH合成能力较出发菌株有所提高。表3-2-1给出了部分转化子的GSH合成活性比较。根据初筛结果，从不同宿主细胞中分别选取GSH合成能力最强的4株菌进行复筛，结果以E. coliDH5(和E. coliJM109为宿主细胞获得的转化子，其GSH合成能力明显下降(甚至低于出发菌株)，而以野生型大肠杆菌为宿主细胞获得的转化子E. coliⅠ-2和E. coliⅡ-1，却仍能保持很强的GSH合成活性。分别从这两个转化子中提取质粒，琼脂糖凝胶电泳证实质粒pGH501已成功转入。 表3-2-1 部分新构建的转化子GSH合成活性比较* 转化子 初筛 复筛   GSH浓度 / (g/L) 比原菌提高 (%) GSH浓度/ (g/L) 比原菌提高(%)  WSH-KE1 1.03  1.03   E. coliI-2 3.98 288 3.84 273  E. coliI-4 2.63 156    E. coliI-8 1.86 81    E. coliI-9 1.22 19    E. coliII-1 4.25 313 4.17 306  E. coliII-5 2.73 166    E. coliII-6 2.54 147    E. coliII-10 2.45 138    DH5a-1 1.54 50 0.76 -26  DH5a-2 1.28 25    DH5a-6 0.68 -34    DH5a-9 0.63 -39    JM109-3 3.31 222 0.64 -38  JM109-4 2.94 186    JM109-9 1.46 42    JM109-10 1.23 20    * 大肠杆菌E. coli DH5a、E. coli JM109、E. coliI和E. coliII合成GSH的能力均小于0.2g/L。 2、新构建菌株的质粒稳定性 出发菌株E. coli WSH-KE1的最大缺陷即为质粒稳定性差。表3-2-2显示，新构建的转化子E. coliI-2和E. coliII-1，其质粒稳定性比E. coli WSH-KE1明显提高。综合考虑GSH合成活性与质粒稳定性这两个因素，选取E. coliII-1为进一步研究的对象。 表3-2-2 不同转化子质粒稳定性的比较* 菌株 LAmp平板中菌落数/ mL LB平板中菌落数/ mL 质粒丢失率/ %  E. coli I-2 5.0×107 1.0×108 50  E. coli II-1 9.1×108 1.9×109 52  E. coli WSH-KE1 3.3×106 4.6×108 99  * 质粒丢失率= (LB平板菌落数－LAmp平板菌落数) / LB平板菌落数×100% 3、E. coli II-1的遗传稳定性 将E. coliII-1用LAmp斜面连续转接5代，测定每一代的GSH合成能力。结果发现E. coliII-1连续传接5代后GSH合成能力并无明显下降(图3-2-3)。  图3-2-3 传代数对E. coli II-1合成GSH的影响 4、E. coli II-1中GSH合成酶系的稳定性 如图3-2-4所示，E. coliWSH-KE1细胞重复使用4次后，GSH合成活性就已降至初始活性的20%；而E. coliII-1细胞重复使用4次后，GSH的合成活性仍能保持初始活性的90%以上。  图3-2-4 重复使用次数对不同菌株GSH合成活性的影响 ● E. coli Ⅱ-1；○ E. coli WSH-KE1 以上实验结果表明，以野生型大肠杆菌为宿主细胞，成功地构建得到了一株既有很高的GSH合成活性，又有很强的质粒稳定性和传代稳定性，并且能够重复使用的重组大肠杆菌E. coli II-1，该菌株具有潜在的工业应用价值。 (二)E. coliⅡ-1合成GSH的反应过程 1、有机溶剂处理对E. coli II-1合成GSH的影响 如表3-2-3所示，若细胞未经有机溶剂处理，则几乎不能在胞外积累GSH。而经过一定浓度的甲苯、苯乙醇和甲醇处理后，胞外GSH浓度明显提高，其中又以甲苯的效果最好。这些有机溶剂的作用在于提高了细胞膜的通透性，使ATP、其它底物及产物能够自由出入细胞，从而促进了GSH合成反应的进行。 表3-2-3 有机溶剂处理对E. coli II-1合成GSH的影响 有机溶剂 无 10%甲苯 丙酮 10%苯乙醇 7%丁醇 10%甲醇  GSH 浓度/ g(L-1 0.14 4.1 0 2.56 0 1.37   2、前体氨基酸对E. coli II-1合成GSH的影响 不同浓度的L-Glu、L-Cys和Gly对E. coliII-1合成GSH的影响如图3-2-5所示。L-Cys浓度增大到20 mmol/L就会使GSH产量降低，可能是因为L-Cys对GSH-I的抑制作用。业已发现，当反应体系中L-Cys浓度达到60 mmol/L时，GSH-I的活性降低到最高活性的50%。而L-Glu浓度增大到120 mmol/L时GSH的合成量仍在增加，很可能是因为L-Glu对GSH-I的活性有促进作用。只有在L-Glu过量存在的情况下，L-Cys才会尽可能地转化为(-L-谷氨酰-L-半胱氨酸。  图3-2-5 前体氨基酸对E. coli II-1合成GSH的影响 注∶Glu浓度变化时，Gly和Cys浓度分别为20 mmol/L和15 mmol/L；Gly浓度变化时，Glu和Cys浓度分别为60 mmol/L和15 mmol/L；Cys浓度变化时，Glu和Gly浓度分别为60 mmol/L和20 mmol/L。  图3-2-6 GSH合成过程曲线 ● GSH；□ L-Glu；△ Gly；○ L-Cys L-Glu、L-Cys和Gly浓度固定时GSH合成反应的过程曲线示于图3-2-6。理论上，每生成1 mol GSH需要消耗各1 mol的三种前体氨基酸。然而，由图3-2-6可知，当反应体系中合成了18.3 mmol/L的GSH时，L-Cys消耗了18mmol/L，但L-Glu和Gly却只消耗了8.9 mmol/L和7 mmol/L。从图3-2-5也可看出，在反应体系中加入5 mmol/L的Gly，就能够合成4 g/L(约为13 mmol/L)的GSH，即底物的消耗和产物的生成不平衡。 这一现象的产生，可能是因为E. coliII-1细胞含有较高浓度的L-Glu和Gly。为了证实这种推测，将E. coliII-1反复用于GSH合成反应，每次反应中均测定GSH的净增加量以及L-Glu和Gly的净减少量。结果发现(表3-2-4)，E. coliII-1细胞重复使用5次后，底物氨基酸的消耗量与产物的合成量才基本达到平衡。此外，在第一次的GSH合成反应进行5 min时，测定出反应液中的L-Glu和Gly的量分别为84.3 mmol/L和31.8 mmol/L，比L-Glu和Gly的实际添加量分别高出了24.3 mmol/L和11.8 mmol/L。这些数据充分说明，E. coliII-1细胞内确实含有较高浓度的L-Glu和Gly，也可能含有少量的L-Cys。 表3-2-4 细胞回用过程中L-Glu和Gly的消耗情况 细胞回用次数/次 GSH增加量/ mmol(L-1 L-Glu消耗量/ mmol(L-1 Gly消耗量/ mmol(L-1  1 16.9 9.2 8.7  3 16.8 10.8 12.6  5 16.7 18.1 15.8  6 16.7 18.5 17.5  注∶每次反应时，Glu、Gly和Cys浓度分别为60 mmol/L、20 mmol/L和20 mmol/L 3、能量辅因子在GSH合成反应中的作用 Meister认为，在GSH的生物合成反应中，GSH-I和GSH-II催化的反应都需要ATP的参与。因此，每合成1 mol GSH，需要消耗2 mol ATP，生成2 mol ADP，如式(3-2-1)所示。  然而，图3-2-7的结果却显示，当ATP浓度低于20 mmol/L时，GSH对ATP的摩尔产率系数在85～90%之间，即GSH合成与ATP消耗的比例接近1∶1。为了更深入地对这一实验现象进行分析，在ATP初始浓度为20mmol/L的条件下，测定了GSH合成过程中ATP、ADP和AMP的变化，结果示于图3-2-8。   图3-2-7 ATP浓度对GSH合成的影响 图3-2-8 GSH合成反应过程中能量辅因子的变化 注∶反应时间为2h。● GSH; □ ATP; △ ADP; ○ AMP 根据图3-2-8的结果，可以认为，由E. coli Ⅱ-1细胞控制的GSH合成反应机理应当如(3-2-2)式所示，其中GSH-Ⅱ控制的第二步反应为整个反应的限速步骤。  提出这一反应机理是基于以下五点实验现象∶ ①GSH合成反应中ATP降解的终产物为AMP，AMP和GSH的生成量之比接近1∶1； ②反应中ATP消耗与GSH生成之比接近1∶1； ③由于质粒pGH501中gshⅠ与gshⅡ的拷贝数之比为2∶1，因此GSH-Ⅰ的活性更高。在反应的第一阶段(0～0.5h)，ATP消耗了15.5 mmol/L，而GSH仅生成6.8 mmol/L，表明GSH-Ⅰ催化生成的(-L-谷氨酰-L-半胱氨酸，由于GSH-Ⅱ活性的限制，来不及转化为GSH； ④反应进行0.5 h后，ADP成为反应的主要能量供体，将第一步反应生成的(-L-谷氨酰-L-半胱氨酸逐渐转化为GSH； ⑤分析图3-2-6亦可以发现，反应进行1 h后，L-Cys消耗了18 mmol/L，而GSH仅生成10 mmol/L，表明GSH-Ⅰ控制的反应速度比GSH-Ⅱ控制的反应速度快。 至于ATP浓度高于20 mmol/L时，GSH产量反而下降(图3-2-7)，很可能是因为GSH合成过程第一步反应产生的ADP对GSH-Ⅰ和GSH-Ⅱ均产生抑制作用。由于GSH-Ⅰ被ATP激活，因此，当反应体系中ATP浓度不断升高时，ADP浓度也不断升高。已证实10 mmol/L ADP会对GSH-I产生50%的抑制作用，但ADP对GSH-Ⅱ的抑制作用尚未见报道。若ADP对GSH-Ⅱ没有抑制作用，则ADP在GSH合成的第二步反应中会不断降解，GSH的产量会不断增加，对GSH-Ⅰ的抑制作用也会被解除，不可能出现图3-2-7所示的实验结果。当然，ADP是否确实对GSH-Ⅱ产生抑制，抑制程度如何，尚需更多的酶学实验数据。 4、反应体系中GSH降解的抑制 如图3-2-7和图3-2-8所示，在一个适宜的GSH合成反应体系中，反应时间超过2 h，GSH产量就开始下降。这可能是由于E. coli细胞中固有的(-谷氨酰转肽酶((-GTP)活性引起的，该酶可将GSH的(-谷氨酰基团转移到某些氨基酸和肽上。Nakayama等发现，一定浓度的L-Ser和硼酸盐的混合物可以抑制(-GTP的活性，为此，我们考察了在反应体系中添加L-Ser和硼酸钾对GSH合成的影响，如表3-2-5所示。实验中采用了较优的L-Cys添加方式，即反应开始时(0 h)加入15 mmol/L，反应进行0.5 h时再加入5 mmol/L。采用这一添加方式，反应体系中GSH产量可达21 mmol/L左右，而在反应开始时就加入20 mmol/L的L-Cys，GSH产量最高仅为17.7 mmol/L。 表3-2-5 添加硼酸钾和/或L-Ser对GSH合成的影响 添加物种类 GSH 浓度 / mmol(L-1   2h 3h  对照 22.4 15.4  硼酸钾 12.8 9.3  L-丝氨酸 13.8 14.8  硼酸钾和L-丝氨酸 21.6 23.0  注∶硼酸钾和L-丝氨酸的添加量分别为100 mmol/L. 由表3-2-5可知，若反应体系中不添加物质，反应2 h～3 h间，GSH产量下降了31.3%；而若加入100 mmol/L的L-Ser─硼酸钾混合物，则GSH的产量不仅没有下降，反而略有增加，表明L-Ser─硼酸钾混合物的添加有可能对(-GTP产生了抑制。然而，单独添加硼酸钾和L-Ser，却会抑制GSH的合成。表3-2-5的数据还显示，(-GTP的抑制可能是L-Ser引起的。由于E. coli胞内的(-GTP是GSH积累到一定浓度后诱导产生的，因此，从反应器的观点考虑，若要进一步提高GSH的合成效率，可以将甲苯处理过的E. coliⅡ-1进行固定化，连续合成GSH。这样，既可以减少ADP的抑制，又可以防止(-GTP对GSH的进一步降解。 三、生物合成谷胱甘肽种间耦合ATP再生系统的构建 谷胱甘肽的生物合成是一个典型的需要ATP的酶反应过程。要实现GSH的高效合成，GSH合成酶系的高活性和ATP的有效供给是两个必须满足的条件。重组大肠杆菌E. coliⅡ-1在外加20 mmol/LATP时，最高可合成7 g/L的GSH。如果能在E. coliⅡ-1合成GSH的反应体系中引入一个以廉价原料(如葡萄糖)为底物产生ATP的系统，显然，GSH合成反应的经济性将大为提高。 一般地，要在同一种微生物中同时提高GSH合成酶系和ATP合成酶系的活性，即构建自耦合ATP再生系统是很困难的。至于种间耦合ATP再生系统，虽然Murata等尝试过在固定化S. cerevisiae和E. coliB细胞间实现GSH合成与ATP再生的耦合，但由于这两株菌均未经过遗传改造，故而效果不佳。我们选择一株发酵活力较高的面包酵母WSH-J702和E. coliⅡ-1分别作为ATP合成酶系与GSH合成酶系的来源，在对细胞进行通透性处理之后，不进行固定化操作而直接将两种菌体混合，构建了一个种间耦合ATP再生系统，并对反应系统的一些特性进行了初步研究。 (一)ATP生物合成系统的选择 重组大肠杆菌E. coliⅡ-1是一株GSH合成活性与质粒稳定性俱佳的重组菌。虽然Langer等认为，E. coli细胞内的乙酸激酶反应是一个很有前途的ATP再生途径，但由于作为磷酸基团供体的乙酰磷酸盐价格昂贵且不稳定，因此，既使能构建一个自耦合反应系统也是没有经济意义的。在考察了产氨短杆菌、棒状杆菌、枯草杆菌以及一系列酵母菌在GSH生物合成反应中的作用之后，最终选择了S. cerevisiaeWSH-J702菌株作为ATP生物合成系统。 (二)S. cerevisiae WSH-J702细胞的通透性处理 前已述及，在ATP再生系统中，系统Ⅰ和系统Ⅱ应当具有良好的通透性，其目的是为了使各种底物和产物能够在细胞内外自由交换。为此，必须在保证酶活性的前提下，对细胞进行通透性处理。E. coliⅡ-1细胞经10%的甲苯处理通透性可显著提高，而对于S. cerevisiae WSH-J702细胞，在所试验的方法中，90%的丙酮处理最为有效(表3-2-6)。 表3-2-6 酵母通透性处理方法对GSH合成的影响 处理方法 不处理 2%甲苯 10%甲苯 90%丙酮 50%丙酮 30%丙酮 超声破碎 反复冻融  GSH含量 / mmol(L-1  1.2  1.99  2.78  3.14  2.56  2.03  0.64  0.78  注∶(1) 所有浓度均为体积比; (2) 反应在两种菌体的混合体系中进行，葡萄糖为能源；(3)大肠杆菌已经过10%甲苯处理。 (三)耦合系统中酵母菌的耗糖性能 1、通透性处理对细胞耗糖的影响 在含有葡萄糖(不含ATP)的反应体系中，如果只加入经过通透性处理的E. coli细胞或S. cerevisiae细胞，GSH产量均不超过0.3 mmol/L；而若同时加入这两种细胞，则反应体系中GSH含量可达2～3mmol/L(如表3-2-6所示)，表明大肠杆菌──酵母混合转化体系已构成一个种间耦合ATP再生系统(以下简称为耦合系统)。然而，与外加ATP条件下E. coliⅡ-1细胞(以下简称为非耦合系统)的GSH合成能力相比，这一ATP再生系统显得效率太低。 进一步的研究表明，在模拟反应体系(不含三种底物氨基酸及E. coli细胞)中，经过丙酮处理的S. cerevisiaeWSH-J702细胞几乎不能耗糖，而未经丙酮处理的细胞表现出极强的耗糖能力(图3-2-9)；经过超声破碎处理的S. cerevisiaeWSH-J702细胞也表现出类似的结果(图3-2-10)。究其原因，有可能是细胞经过通透性处理后，酵解途径的一些关键辅因子泄漏或被稀释。   图3-2-9 丙酮处理对酵母细胞耗糖的影响 图3-2-10 酵母超声破碎后不同组分的耗糖情况 ○ 未处理细胞; ● 丙酮处理细胞 ○ 未处理细胞; □ 细胞碎片; △ 无细胞提取物 2、耦合系统中辅因子的添加对细胞耗糖的影响 鉴于利用酵母的酵解途径再生ATP，需要加入一定量的前体物质，再考虑到酵解途径中NAD是一个不可或缺的辅因子，考察了在耦合系统中添加辅因子对S. cerevisiae WSH-J702细胞耗糖的影响(表3-2-7)。结果发现，只有在耦合系统中添加AMP(1.0 mmol/L)和NADH(0.1 mmol/L)，酵母细胞对葡萄糖的消耗能力才有显著改善。然而，即便如此，反应6 h时，细胞对葡萄糖的消耗量也仅为未处理细胞的60%(图3-2-11)。 表3-2-7 辅因子的加入对GSH合成的影响 加入的辅因子 葡萄糖的消耗量 / mmol(L-1 GSH产量/ mmol(L-1  对照 20.2 2.6  Ade(5 mmol/L) 15.2 2.2  AMP(1.0 mmol/L) 42.0 3.2  ADP(1.0 mmol/L) 21.5 1.8  AMP(1.0 mmol/L) + NADH(0.1 mmol/L) 160.3 8.9  ADP(1.0 mmol/L) + NADH(0.1 mmol/L) 25.6 2.4  注∶所有结果均在反应4h时测定。  图3-2-11 添加AMP和NADH后酵母细胞的耗糖曲线 ○ 未处理细胞; ● 丙酮处理细胞(添加1.0 mmol/L AMP和0.1 mmol/L NADH) 待耦合系统中GSH合成反应进行6 h后，离心收集细胞混合物，将这些细胞洗涤后再用于下一次GSH合成反应，测定反应系统中葡萄糖的消耗与GSH的合成情况。结果发现(表3-2-8)，尽管在第一次反应开始时添加了AMP和NADH，但随着细胞回用次数的增加，葡萄糖的消耗明显减少，与之相应，系统内GSH产量也显著下降。由此表明，在反应体系中添加适量的AMP和NADH，对于维持耦合系统的运行是十分必要的。 表3-2-8 重复反应次数对耦合系统合成GSH的影响 葡萄糖消耗/ mmol(L-1 GSH产量/ mmol(L-1  第一次反应 237 9.6  第二次反应 67 4.2  第三次反应 13 0.7  注∶在第一次反应开始时加入1.0 mmol/L AMP和0.1 mmol/L NADH。 (四)耦合系统的反应条件 1、AMP与NADH最适添加浓度的确定 由图3-2-12和图3-2-13可知，1 mmol/L的AMP和0.05 mmol/L的NADH，即可启动耦合系统中的糖酵解途径。   图3-2-12 AMP对耦合系统合成GSH的影响 图3-2-13 NADH对耦合系统合成GSH的影响 (添加NADH 0.1 mmol/L) (添加AMP 1mmol/L) 2、葡萄糖浓度对耦合系统合成GSH的影响 如图3-2-14所示，提高耦合系统内的葡萄糖浓度可促进GSH的合成。然而，从消耗237 mmol/L葡萄糖仅合成9.6 mmol/LGSH(表3-2-8)这个结果来看，耦合系统中ATP的利用效率非常低。假设∶(1)耦合系统中的ATP全部由S. cerevisiaeWSH-J702的酵解途径产生；(2)葡萄糖全部用作能源，由于E. coliⅡ-1合成1 molGSH仅需要1 molATP，这样，耦合系统中产生的ATP用于GSH合成的部分仅为2%。此外，由图3-2-14亦可知，若反应系统内只有E. coliⅡ-1细胞或只有S. cerevisiaeWSH-J702细胞，均不能构成ATP再生系统，故而GSH产量很低。  图3-2-14 葡萄糖浓度对耦合系统合成GSH的影响 ● 耦合系统 ○ 没有S. cerevisiae细胞的反应系统; △ 没有E. coli的反应系统 3、Mg2+对GSH合成的影响 在缺乏Mg2+的情况下，无论是耦合系统还是添加ATP的非耦合系统，都不能合成GSH(图3-2-15)，证实不仅E. coliⅡ-1细胞中的GSH-Ⅰ和GSH-Ⅱ需要Mg2+，S. cerevisiaeWSH-J702细胞中酵解途径的关键酶和腺苷酸激酶也需要Mg2+提供活性。然而，Mg2+浓度对耦合系统及非耦合系统合成GSH的影响却是不同的。 耦合系统中Mg2+超过20 mmol/L后GSH产量降低，不能归咎于Mg2+与PO43-结合形成难溶物导致ATP减少，因为非耦合系统中Mg2+增加到40 mmol/L后才表现出抑制作用。较可能的解释是∶ATP对Mg2+有很强的螯合作用，而被ATP螯合的Mg2+不能作为辅因子，Mg2+的缺乏导致ATP的生物合成不能继续进行。在非耦合系统中，ATP的量仅为20 mmol/L，难以螯合Mg2+；而在耦合系统中，由于葡萄糖浓度很高(400 mmol/L)，势必产生大量ATP，即使Mg2+浓度很低也会被螯合。一旦Mg2+被螯合，葡萄糖的消耗与GSH的合成均受到抑制，结果导致耦合系统中GSH的产量始终不及非耦合系统(图3-2-15)。  图3-2-15 镁离子浓度对GSH合成的影响 ● 耦合系统; ○ E. coliⅡ-1 (添加20 mmol/L ATP) 根据以上分析，我们采用初始Mg2+浓度20 mmol/L、反应2 h和4 h时分别添加10 mmol/L Mg2+的方案进行实验，反应6 h时系统内GSH产量达到14.3 mmol/L，比不补加Mg2+的实验提高了40%。然而，与非耦合反应系统相比，所构建的这一ATP再生系统仍显得效率低下。究其原因，一方面可能是系统自身的问题，如∶(1)ATP在两种微生物之间转运的损失较大；(2)酵母产生的ATP与大肠杆菌的GSH合成酶系亲和性较差，另一方面则是反应器的问题。如果ATP和Mg2+的螯合作用是导致分批反应中ATP再生系统运行效率低的重要因素，那么，只有将两种细胞共固定化后置于反应器中连续合成GSH，ATP再生系统的运行效率才有可能显著提高。 第三节 有机废水处理和聚羟基烷酸生产的耦合系统 一、研究背景 塑料在人类生活中扮演着重要的角色。无论是工业、农业、建筑业，还是人们的日常生活，都与塑料密切相关。但目前所使用的化学合成塑料在自然环境中很难分解，燃烧处理又会产生有害气体，在污染环境、破坏生态的同时，也引起了全世界的关注和忧虑。化工合成塑料污染的主要特点是∶ (1)污染范围广。江河湖泊，田野山川无处不有。 (2)污染物增长量快。全世界每年对塑料的需求量为1亿吨。由于价廉、易老化，塑料用量的增加导致其废弃物也迅速增加，倾入海洋的塑料垃圾达数十万吨，陆上的更是难以计数。 (3)处理困难。塑料具有耐酸碱、抗氧化、难腐蚀、难降解的特性，埋地处理百年不烂；燃烧时产生大量有毒气体，如HCl、硫氧化物、碳氧化物等。 (4)回收利用难。塑料制品种类繁多，难以分拣回收再利用。 (5)对生态环境危害大。地膜降低耕地质量，农作物植株矮小，抗病力差；残膜随风飘动，对周围环境、畜牧业、养殖业都有很大的影响。 数量巨大的塑料垃圾造成了严重的环境和生态灾难，许多国家已开始考虑用可生物降解塑料代替部分石油化工合成塑料，并陆续颁布了一些法规禁用某些塑料制品。如意大利已立法规定，自1991年起所有包装用塑料都必须具有生物可降解的性能。我国也已开始考虑禁用塑料方便餐盒等不可降解的塑料制品。 聚羟基烷酸酯(Polyhydroxyalkoates，简称PHAs)是生物可降解材料的一个研究热点。其中聚-(-羟基丁酸(简称PHB)及3-羟基丁酸与3-羟基戊酸的共聚物(简称P(3HB-co-3HV)或PHBV)是PHAs族中研究和应用最广泛的两种多聚体。PHAs作为一种有光学活性的聚酯，除具有高分子化合物的基本特性，如质轻、弹性、可塑性、耐磨性、抗射线等外，更重要的是其还具有生物可降解性和生物可相容性。已有研究表明，采用PHAs制作的香波瓶，在自然环境中9个月后，可基本上被完全降解，而用合成塑料制作的同样物品，完全降解的时间约需100年。因此研究和开发PHAs作为各种容器、瓶、袋和薄膜等包装材料，使之成为同类用途的石化合成塑料最有潜力的替代品，可避免或减少塑料废物对环境的污染，具有深远的环境意义。据估计到2000年，每年全球生物可降解塑料的产量将达到140万吨。PHAs难以大规模生产的最大障碍是生产成本太高，其中原材料价格较高是影响其成本的一个重要因素。为了使PHAs能获得广泛的应用，开发廉价的原料是世界各国研究PHAs学者都在关注的问题。 有机废水也是地球环境的一大污染源，1994年我国年排放的高浓度有机废水总量达365.9亿吨。但有机废水同时也是一种资源，近几十年来，有机废水的资源化技术发展极其迅速，已被认为是消除有机废水污染的最经济有效的途径之一。用于高浓度有机废水处理的厌氧消化技术，自20世纪50年代以后得到了迅速发展，先后出现了厌氧滤池(AF)、上流式厌氧污泥床反应器(UASB)、附着膜厌氧膨胀床反应器(AAFEB)、厌氧流化床反应器等，其中UASB的应用最为广泛。该反应器能培养并保持大量活性高、沉降性能好的颗粒污泥，因而反应器的处理能力大大提高，水力停留时间大大缩短。 有机废水的厌氧发酵过程是一个复杂的有多种微生物类群参加的生物化学过程，通常可分为酸性发酵阶段(产酸)和甲烷化阶段(产甲烷)两阶段。产酸阶段主要是有机废水中复杂的大分子有机物在厌氧条件下被水解和产酸细菌发酵成为有机酸，如丁酸、乙酸、乳酸和丙酸等。此阶段的细菌种类多，代谢能力强，繁殖速度快。产甲烷阶段主要是产酸阶段产生的小分子有机酸被产甲烷菌利用转化为甲烷。在厌氧酸化阶段，不同的研究者得到的结果不同(见表3-3-1)。可以看出，文献报道的有机废水酸化一般以丁酸、乙酸或乳酸为优势产物。 表3-3-1 不同研究者研究结果的比较 基质 温度 反应器 酸化相优势产物 研究者  葡萄糖 20 CSTR 丁酸 Cohen  糖蜜废水 35 CSTR 丁酸 Gil-Pena  葡萄糖 35 CSTR 乙酸 Zoetemeyer  葡萄糖 35 CSTR 乙酸 Roy  葡萄糖 35 UASB 乳酸 Shiyi Lun   真养产碱杆菌(Ralstonia eutrophus)中的一些种，能够以有机酸为碳源积累PHAs。基于此，我们提出了构建有机废水处理和PHAs生产耦合系统的新思路，试图在解决有机废水污染的同时，生产出生物可降解塑料。这一思路的理论依据是∶①有机废水在厌氧处理过程中，产酸微生物能将废水中生物可降解的大分子物质转变为小分子有机酸，如乙酸、丙酸、乳酸、丁酸以及其它可溶性小分子化合物，然后被产甲烷菌或其它微生物进一步利用；②已有文献报道，真养产碱杆菌在好氧、碳源充足、贫氮的条件下能利用有机酸在胞内大量积累PHAs。 因此，将有机废水酸化反应器与PHAs发酵罐相组合，可使酸化反应器为R. eutrophus 提供相对稳定、较佳的底物，从而在发酵罐中相对廉价地生产出PHAs。这一研究具有减少有机废水污染和塑料废物污染的双重意义，无论对生物可降解塑料生产的理论、应用研究，还是对有机废水的资源化工程研究均具有十分重要的理论和实践意义。 关于采用有机废水为原料生产生物可降解塑料的研究报道，国内没有，国外也很少。1994年，日本学者采用模拟的工业废水对此进行了初步的生产性研究，废水BOD去除率达50%，PHAs浓度达到3.7 g/L。香港科技大学Yu小组采用两阶段生物过程从城市污泥中生产出PHAs，积累的PHAs占细胞的34%，上清液中大约78%的有机碳被R. eutrophus 所利用，其中乙酸、丙酸、丁酸和戊酸这四种主要有机酸的利用率分别为87.6%、62.6%、56.8%和32%。Ali 等进行了Rhodobacter sphaeroides 利用棕榈油废水(POME)生产PHAs的研究。其结果表明，在消化阶段产生的甲酸明显地抑制PHAs的产量和含量；当稀释率为0.072 d-1时，从经过消化、有机酸含量为5.5 g/L的POME中可得到1.0 g/L 的PHAs，其含量占细胞干重的30%；若稀释率降低到0.024 d-1，PHAs的产量可以提高。 与本节内容相关的研究受到国家自然科学基金(29677011)的资助，目标是得到优化的有机废水酸化操作条件，最大比例地得到最佳酸化产物，然后利用酸化废水为底物，进行PHAs发酵条件的研究。通过将有机废水处理系统和PHAs的生产系统相组合，达到两个方面的目的∶一方面极大地降低生物可降解塑料的生产成本(相对采用葡萄糖、丁酸等)；另一方面是进一步开拓有机废水资源化技术。本节主要内容包括以下五个方面∶ (1)合成废水生产PHAs的初步条件； (2) R. eutrophus发酵生产PHAs最佳有机酸种类的确定，包括以有机酸为底物生产PHAs的代谢机理、理论产率和PHAs发酵的实际产率； (3)高效厌氧酸化工艺，包括酸化率达100%时有机酸分布的工艺学条件等； (4)在小型发酵罐中，以不同浓度的酸化废水为碳源进行分批发酵实验，在对PHAs发酵过程动力学分析的基础上，建立较为合理的PHAs发酵过程动力学模型； (5)进行了有机废水生产PHAs流加发酵的初步研究，比较了分批和流加发酵过程中丁酸对PHAs产率的变化。 二、实验装置 (一)有机废水的厌氧酸化装置及流程 实验所采用的酸化反应器为上流式厌氧污泥床(UASB)反应器，其结构见图3-3-1(A)，整个装置用有机玻璃加工制作，采用恒温箱控制运行温度。酸化实验过程中，改变一操作参数后，经过5个停留时间达稳态取数据。  图3-3-1(A) UASB酸化反应器示意图 (二)有机废水处理和PHAs生产耦合系统实验装置 有机废水酸化采用上流式厌氧污泥床(UASB)反应器，酸化废水采用真空浓缩，发酵罐为韩国KFC公司生产的5-L全自动控制发酵罐，具体流程见图3-3-1(B)。  图3-3-1(B) 有机废水酸化和PHAs生产耦合系统 ①进水池 ②泵 ③UASB酸化反应器 ④出水池 ⑤分离浓缩系统 ⑥浓缩的有机酸 ⑦PHA发酵罐 三、有机废水生产PHAs的初步研究 有机废水生产PHAs是指R. eutrophus 以有机废水厌氧酸化的产物为生产PHAs的基质。许多研究结果表明，在一定温度下，水力停留时间(HRT)和pH值(进水碱度)对酸化产物分布的影响最显著。因此，以含15 g/L葡萄糖的合成废水作为酸化进水，酸化阶段采用不同的HRT和不同的进水碱度，酸化率达100%的条件下，对酸化废水发酵生产PHAs进行了初步的研究，结果如图3-3-2和3-3-3所示。 从图中可以看出，当废水进水碱度为6500 mg/L时，有机废水厌氧酸化阶段最佳HRT为5 h，此后增加HRT，由于酸化产物中有机酸组成的变化，导致酸化废水生产PHAs阶段中PHAs的浓度略有下降；碱度的变化对酸化废水中有机酸组成的影响更大。控制HRT为5 h，进水碱度8000 mg/L，R. eutrophus 利用合成废水厌氧酸化产物发酵生产的PHAs浓度最大，为1.92 g/L。可见，用有机废水为原料可以生产出生物可降解塑料，它为降低PHAs生产成本，减少有机废水和塑料废物对地球环境的污染，提供了一条新的思路。  图3-3-3 酸化阶段HRT对发酵阶段PHAs浓度的影响  图3-3-3 进水碱度对发酵阶段PHAs浓度的影响 四、R. eutrophus 利用不同有机酸生产PHAs的比较研究 PHAs是许多微生物在碳源充足、而其它营养成分如氮、磷等缺乏的条件下积累的胞内碳源和能量物质。目前研究采用的生产方式通常有两种∶一种是一步发酵法，即细胞生长与PHAs积累相偶联；另一种是两步发酵法，即微生物生长和PHA积累分两阶段进行，第一阶段细胞大量形成，第二阶段细胞基本不繁殖而PHAs大量积累，这种方法需进行菌体的离心收集。 采用不同工艺对有机废水进行厌氧酸化，可得到以乙酸、丙酸、乳酸或丁酸等为优势产物的酸化废水。为了确定哪一种有机酸是R. eutrophus生产PHAs的最适碳源，分别以乙酸、丙酸、乳酸和丁酸为碳源，在摇瓶条件下，采用分批补料一步发酵法和两步发酵法，对R. eutrophus WSH1利用这四种酸合成PHAs的情况进行了比较研究，以期为进一步采用有机废水进行PHAs的生产研究打下基础。 (一)不同初始pH值对菌体生长和PHAs合成的影响 菌体细胞内部许多酶系所进行的催化反应过程受环境pH值的影响，因而培养基的pH对细胞的生长和代谢有显著的影响。以丁酸为碳源时，不同初始pH值对菌体生长和PHAs积累的影响见表3-3-2。可以看出，在6.8～7.2范围内，pH值对菌体细胞的生长影响不很明显，超出这个范围，细胞生长明显受到抑制。细胞干重和PHAs浓度在pH 7.0时达到最大值。 表3-3-2 pH对菌体生长和PHAs合成的影响* pH 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6  细胞干重/ g(L-1 5.1 5.61 5.75 5.57 5.15 4.9  PHAs浓度/ g(L-1 2.72 3.03 3.24 2.97 2.7 2.51  PHAs含量/ g(L-1 53.3 54.0 56.4 53.3 52.4 51.2  * 硫酸铵浓度1.5 g/L，丁酸总浓度15 g/L，发酵时间36 h。 (二)R. eutrophus WSH1以不同有机酸为碳源发酵生产PHAs (1)两步发酵法生产PHAs 在摇瓶条件下，首先研究了以单一酸为碳源、两步发酵法生产PHAs的情况。4种有机酸的初始浓度采用10 g/L，并分别在发酵的19 h、25.5 h、32.5 h和43 h补充加入2.5 g/L的酸。PHAs合成阶段初始细胞干重为3.3 g/L，细胞中无PHAs积累，发酵过程中菌体干重(细胞干重)变化和PHAs的积累如图3-3-4和图3-3-5所示。  图3-3-4 发酵过程中菌体干重的变化 碳源为∶，丁酸；，乳酸； ，丙酸；，乙酸  图3-3-5 PHAs的积累过程 碳源为∶，丁酸；，乳酸； ，丙酸；，乙酸 从图中可以看出，R. eutrophus WSH1以乙酸、丙酸和乳酸为碳源积累PHAs的速度缓慢且持续的时间较短，在32 h已达最大值，PHAs的浓度分别为2.2 g/L、3.2 g/L和4.1 g/L；而以丁酸为碳源时，PHAs的合成一直保持较高的速率，43 h时PHAs浓度达到最高，为6.8 g/L。Doi等以20 g/L的乙酸、丙酸和丁酸为碳源分批发酵获得的PHAs分别为2.0 g/L、1.8 g/L和4.3 g/L，略低于本研究结果。 (2)一步发酵法生产PHAs 已有不少研究表明，通过控制发酵液初始氮源浓度，可使R. eutrophus的菌体生长和PHAs积累相偶联，即一步发酵法生产PHAs。分别采用以乙酸、丙酸、乳酸和丁酸为唯一碳源的合成培养基，以细胞干重和PHAs占细胞干重的百分数为指标，考察了R. eutrophus WSH1对不同有机酸的利用情况，结果如表3-3-3所示。可以看出，R. eutrophus WSH1对4种酸的利用情况相差很大。以丁酸为碳源时，PHAs浓度达10.2 g/L，远远超过其它3种酸。 表3-3-3 R. eutrophus WSH1对不同酸的利用* 乙酸 丙酸 乳酸 丁酸  细胞干重/ g(L-1 6.5 8.9 9.7 14.8  PHAs浓度/ g(L-1 2.1 4.3 5.2 10.2  PHAs含量/ % 32.3 48.3 53.6 68.9  * 初始酸浓度为10 g/L，分别在19h、25h、32h、43h、50h加入5 g/L的酸。 (三)R. eutrophus WSH1利用混合酸发酵PHAs 由于有机废水酸化后得到的一般为混合酸，为进一步确定有机废水厌氧酸化生产PHAs的最佳酸化产物，对混合酸发酵生产PHAs进行了研究。初始酸浓度10 g/L(乙酸、丙酸、乳酸和丁酸各2.5 g/L)，发酵41 h和57 h分别加入8 g/L的混合酸(乙酸、丙酸、乳酸和丁酸各2 g/L)，结果如图3-3-6(A)和图3-3-6(B)所示。可以看出∶(1)前16 h为菌体的适应期，菌体生长很少，酸的浓度变化也较小。16 h后菌体进入生长旺盛期，加入的酸消耗很快，41 h时丙酸、乳酸和丁酸都已降为零，乙酸浓度为0.64 g/L。第一次流加混合酸16 h后丁酸又降为零，丙酸和乳酸也几乎被消耗完，而发酵液中乙酸逐渐积累，为1.65 g/L。再次流加混合酸后，至67 h，PHAs已达最大值7.3 g/L，细胞干重为11.3 g/L，PHAs占细胞干重的64.7%。(2) R. eutrophus WSH1在对数生长期已开始积累PHAs，在生长和合成PHAs阶段对有机酸的利用顺序皆为丁酸>乳酸>丙酸>乙酸。这与Lee和Yu报道的碳链越长，菌体利用脂肪酸的速度越慢的研究结果完全不同。  图3-3-6(A) 发酵过程中细胞干重()、PHA()和NH4+浓度()的变化  图3-3-6(B) 发酵过程中乙酸()、丙酸()、乳酸()和丁酸()浓度的变化 五、有机废水生产PHAs的机理研究 (一)废水中大分子物质转化为小分子有机酸 酸化UASB反应器中的水解和/或发酵细菌，将复杂的含碳大分子有机物首先水解为简单的小分子单糖、氨基酸、脂肪酸和甘油，然后再进一步发酵为各种有机酸。厌氧微生物己糖降解最重要的代谢途径是EMP和HMP途径，先生成丙酮酸，然后形成挥发性有机酸、乳酸等。控制不同酸化条件，可以使不同的有机酸成为主要酸化产物。代谢方程分别为∶ C6H12O6 + 4H2O → 2CH3COO- + 2HCO3- + 4H+ + 4H2 C6H12O6 + 2H2 → 2CH3CH2COO- + 2H2O +2H+ C6H12O6 + 2H2O → CH3CH2CH2COO- + 2HCO3- +3H+ +2H2 C6H12O6 → 2CH3CHOHCOO- + 2H+ (二)有机酸合成PHAs的代谢途径 R. eutrophus 利用小分子有机酸合成的PHAs主要为聚羟基丁酸(PHB)、羟基丁酸和羟基戊酸的共聚物(PHBV)两种；以丙酸为碳源时合成PHBV；以乙酸、乳酸、丁酸为碳源时，合成PHB；以乳酸为碳源时的代谢途径未见报道，推测认为乳酸脱羧后经乙酰CoA合成PHB。以乙酸、丙酸、乳酸和丁酸为碳源时PHAs的合成途径如图3-3-7所示。     图3-3-7 以有机酸为碳源生产PHAs的代谢途径 (三)不同有机酸对PHAs的产率与理论产率的比较 根据不同有机酸生成PHAs的代谢途径及一步法和两步法合成PHAs的发酵过程，可以计算出四种酸对PHAs的理论产率和实际产率、，如表3-3-4所示。从表中可看出，从理论上计算丁酸的产率最高，与实际发酵结果一致。在一步发酵法中，由于所消耗的有机酸有一部分用于合成细胞的合成，因而4种有机酸对PHAs的实际产率均小于两步法，但它们对PHAs和细胞的产率之和却大于两步法的产率。 表3-3-4 不同有机酸对PHAs的产率与理论产率的比较 碳源 NADPH再生 PHAs  / g(g-1 一步法 两步法           乙酸 异柠檬酸 PHB 0.48 0.12 0.24 0.27  丙酸 异柠檬酸 PHBV 0.58～0.68 0.18 0.19 0.32  乳酸 不需要 PHB 0.48 0.19 0.16 0.33  丁酸 异柠檬酸 PHB 0.65 0.32 0.14 0.41   以上研究结果表明，R. eutrophus 以4种不同有机酸为碳源生产PHAs时，丁酸具有最大的理论产率，在实际中以单一酸为碳源发酵生产PHAs时，丁酸的产率最高可达到0.46 g/g，高于其它三种酸。由此表明，为了提高R. eutrophus WSH1菌株利用有机废水生产PHAs的效率，应当尽可能地控制条件，使有机废水厌氧酸化产物中丁酸比例最高。 六、有机废水厌氧酸化最佳工艺条件的探索 在有机废水厌氧酸化过程中，参加产酸过程的微生物的组成非常复杂，倍增时间最短为几十分钟，且最适pH范围偏酸性。当进入消化器的容积负荷过大时，发酵细菌的生长不受基质限制而大量繁殖，大量的产酸菌群将可溶性有机化合物转化为低分子物质。控制不同酸化操作条件，可以使不同的有机酸成为主要酸化产物，包括甲酸、乙酸、乙醇、丙酸、乳酸、丁酸、戊酸等。前面的研究表明，相对于其它有机酸，丁酸是R. eutrophus WSH1生长和积累PHAs的最佳碳源，因而有必要研究有机废水厌氧酸化过程中操作条件对废水酸化率的影响，确定废水酸化的适宜温度、HRT、pH和进水葡萄糖浓度，使酸化率接近100%并得到最大比例的丁酸。 (一)高酸化率工艺的探索 评价酸化相运行的一个重要指标是酸化反应器的酸化率。酸化率是指进入反应器的废水中有机物转化为有机酸的百分比，一般用下式计算∶  酸化率越高，说明有机废水中的有机物降解得越完全。有关酸化率的影响因素很多，它与pH、温度、负荷、进水浓度、HRT等均有关系，在研究中主要考察了酸化温度与HRT对酸化率的影响。 (1)酸化温度的确定 控制HRT为10 h，进水葡萄糖质量浓度为30 g/L，考察了在三种操作温度下反应器运行稳定后所能达到的酸化率，结果如图3-3-8所示。显然，在实验范围内，酸化率随温度的升高而增加，当温度为40℃时，酸化率已达99.3%，因此以后实验采用的酸化温度为40℃。  图3-3-8 温度对酸化率的影响 (2)进水葡萄糖浓度和水力停留时间的确定 控制温度为40℃，进水自然pH的条件下，考察了进水葡萄糖浓度和HRT对出水葡萄糖浓度的影响，结果见图3-3-9。控制进水葡萄糖浓度为15 g/L，HRT为5 h时，出水中葡萄糖浓度仅为0.5 g/L，若HRT超过8 h，出水中未检出葡萄糖；当进水葡萄糖浓度增加为30 g/L，HRT为3 h时，出水中葡萄糖浓度为13 g/L，随着HRT的增大，出水葡萄糖浓度逐渐降低，HRT为10 h时，葡萄糖浓度降为0.48 g/L；当进水葡萄糖浓度为45 g/L时，出水葡萄糖浓度随着HRT 由3 h增加到15 h的过程中，从26 g/L降为10.4 g/L。  图3-3-9 HRT对出水葡萄糖浓度的影响 葡萄糖浓度∶ 15 g/L;  30 g/L ;  45 g/L 当进水葡萄糖浓度为15 g/L时，虽然在实验的HRT范围内，酸化率为100%，但其酸化能力还有相当的潜力；在30 g/L葡萄糖进水浓度时，延长HRT可以提高酸化率；对45 g/L的葡萄糖浓度，在HRT从3 h增加到15 h的过程中，酸化率均未达到100%，而且出水葡萄糖浓度的降低随HRT的延长而变得缓慢。因而在进行产酸相产物分布研究时确定进水葡萄糖浓度为30 g/L。 (二)产酸相产物分布及其影响因子的研究 以上讨论了废水酸化率的问题，确定了酸化温度、HRT和进水葡萄糖浓度，在最佳条件下，废水的酸化率接近100%。但提高酸化率只解决了如何最大量地获得混合酸这个问题，要使混合酸适于R. eutrophus生产PHAs，但还必须确定使混合酸中丁酸比例最高的酸化操作条件。 (1)产物分布影响因子的确定 产酸相的产物即是PHAs发酵生产的基质，如果能确定一个工艺条件使产酸相获得稳定的较佳产物分布，对R. eutrophus WSH1菌株的生长和积累PHAs是非常有利的。本研究在产酸UASB反应器运行60 d后，成功地培养出产酸颗粒污泥，形成了产酸颗粒污泥床，其酸化产物有一定的分布特点。各种操作参数对产酸相产物分布的影响归根到底是对酸化菌群的影响，主要影响微生物的代谢途径或产酸优势菌群的变化。 (2)HRT对酸化产物分布的影响 图3-3-10为进水葡萄糖浓度30 g/L，自然pH值时HRT和酸化产物分布的关系。从图中可以看出，当HRT为3 h时，乳酸浓度最高，为8.92 g/L，其次是乙酸，浓度为3.25 g/L，丁酸浓度最低为0.72 g/L。随着HRT的增加，丁酸浓度大幅度升高，在13 h时达到11.6 g/L。整个过程中乙酸和丙酸的浓度略有增加，而乳酸浓度却呈下降趋势。表明有可能通过延长HRT使产酸相中丁酸成为主要产物。  图3-3-10 HRT对酸化产物分布的影响 (3)不同pH条件下UASB反应器出水产物分布 根据文献报道，HRT对酸化产物的影响是通过“菌体洗出”使优势菌群发生变化。还有许多研究结果表明，在一定的酸化温度条件下，对于易水解的碳水化合物，pH对产物分布的影响远远大于HRT对产物分布的影响。40℃下，控制进水葡萄糖浓度为30 g/L，水力停留时间10 h，当酸化率达到99%以上时，维持反应器中不同pH值对出水酸化相组成的影响如图3-3-11所示。  图3-3-11 UASB反应器中pH值对出水酸分布的影响  丁酸  乙酸  丙酸  乳酸 从图中可以看出，pH 5.7时出水中丁酸浓度最高，pH大于或小于5.7时，产物分布随pH的微小波动而发生巨大的变化。由于已有的研究表明，R. eutrophus WSH1利用丁酸生长和积累PHAs的能力远远超过乳酸、乙酸和丙酸等其它几种酸，因而确定酸化pH为5.7，此时酸化废水中的成分主要为丁酸、乙酸和丙酸，其他成分很少，其中丁酸约占总酸质量的68%。 根据以上研究，可以得到以下结论∶通过提高厌氧酸化反应器的运行温度和延长HRT都有助于增加配制葡萄糖废水的酸化率，在30 g/L进水葡萄糖浓度，HRT为10 h的条件下，酸化率几乎达到100%；产酸相产物分布的主要影响因素是反应器内的pH值和HRT，其中pH的影响较大，其微小的变化会导致产物分布的巨大变化。在pH5.7时UASB酸化反应器出水中，丁酸为优势产物，浓度达到13.5 g/L，占总酸质量浓度的68%。 七、PHAs分批发酵 目前有关发酵过程控制的研究多集中于流加发酵的优化控制，进行流加发酵的优化研究，必须以分批发酵过程研究和确立合理的分批发酵动力学模型为基础。对分批发酵过程动力学的研究和分批发酵模型的建立，将有助于更好地认识发酵过程中菌体生长和PHAs形成的机制，以及影响这些机制的一些重要环境因素，最终实现对PHAs发酵过程的有效控制，达到提高PHAs发酵指标的目的。 (一)不同初始酸浓度对PHAs发酵过程的影响 (1)不同初始酸浓度下发酵过程中菌体总干重的变化 图3-3-12为不同初始总酸浓度下细胞干重随时间的变化，其中硫酸铵浓度为1.5 g/L。从图中可以看出，不同初始酸浓度最终所能达到的细胞干重不同，当初始酸浓度为5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L和25 g/L时，最大的细胞干重分别达到2.85 g/L、5.35 g/L、7.3 g/L、8.23 g/L和8.2 g/L。在初始酸浓度为20 g/L和25 g/L时，细胞干重基本接近，初始酸浓度的增加并不导致细胞干重的增加，因此，在废水生产PHAs的分批发酵中，当硫酸铵浓度为1.5g/L时，初始酸浓度在20g/L左右较佳。  图3-3-12 不同初始酸浓度对细胞干重的影响 初始酸浓度∶ ○ 5 g/L；□ 10 g/L；△ 15 g/L； 20 g/L；◇ 25g/L (2)不同初始酸浓度下酸浓度的变化 废水酸化相中，有机酸主要为丁酸、乙酸和丙酸，图3-3-13为不同初始酸浓度下这3种酸浓度的变化。研究表明，随着初始酸浓度的增加，细胞利用酸生长和积累PHAs的速度降低，并且细胞优先利用丁酸，因而细胞消耗丁酸的速率大大超过乙酸和丙酸的消耗速率。当初始酸浓度为5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L和25 g/L时，最终发酵液中残留的丁酸浓度为∶0、0.01 g/L、0.16 g/L、0.58 g/L和3.81g/L。    图3-3-13 乙酸、丁酸和丙酸浓度与发酵时间的关系 初始酸浓度∶ ○ 5 g/L；□ 10 g/L；△ 15 g/L； 20 g/L；◇ 25g/L (3)不同初始酸浓度下PHAs浓度的变化 图3-3-14为不同初始酸浓度下PHAs浓度的变化情况。从图中可以看出，当酸浓度为5 g/L至25 g/L时，最大PHAs浓度分别达到0.28 g/L、1.52 g/L、3.33 g/L、3.85 g/L和3.88 g/L。由于PHAs是在细胞大量形成的基础上合成的，如果发酵液中作为碳源的酸浓度很低，PHAs在胞内积累的量将会很少。   图3-3-14 PHAs浓度的变化 图3-3-15 残留细胞量随时间的变化 初始酸浓度∶ ○ 5 g/L；□ 10 g/L；△ 15 g/L； 20 g/L；◇ 25g/L (4)不同初始酸浓度下残留细胞量的变化 图3-3-15为不同初始酸浓度下残留细胞量随时间的变化。图中表明，初始酸浓度在5 g/L至25 g/L时，最大残留细胞量浓度分别为2.58 g/L、3.89 g/L、3.90 g/L、4.37 g/L和4.34 g/L，达到最大值的时间分别为10 h、22.5 h、27 h、32 h和45 h。可见不同初始酸浓度下，菌体的比生长速率不同。 (二)PHAs发酵过程分析 图3-3-16为初始总酸浓度19.5 g/L，硫酸铵浓度1.5 g/L条件下的PHAs发酵过程。可以看出，PHAs的发酵过程明显分为两个阶段，第一阶段为氮源丰富的菌体生长期，第二阶段是从23 h开始氮源缺乏的PHAs合成期。36 h时，虽然发酵液中有机酸仍有一定浓度，但PHAs的积累已停止，ρ(PHAs)=3.8 g/L，占细胞干重(细胞干重)的44.7%。  图3-3-16 分批发酵过程曲线  PHAs； 细胞干重； 丁酸； 乙酸； 丙酸 (三)PHAs分批发酵动力学 (1)细胞生长动力学 因为PHAs为胞内产物，在R. eutrophus 的PHAs发酵过程中，细胞由两部分组成∶即残留菌体(XR)和PHAs (P)，其中残留菌体量是细胞具有催化活性的组分，负责胞内各种代谢活动。因而PHAs发酵过程的细胞生长可表示为∶  (3-3-1) 对于R. eutrophus 的细胞生长过程，Heinzle和Belfares分别采用了方程(3-3-2)和(3-3-3)来描述∶  (3-3-2)  (3-3-3) 采用方程(3-3-2)能较好地预测R. eutrophus 以H2、O2和CO2为基质条件下的菌体生长行为；方程(3-3-3)是以葡萄糖为碳源，硫酸铵为氮源条件下R. eutrophus 的细胞生长模型。 假设产物和基质对细胞生长的抑制机制相同，根据Loung提出的生长抑制模型，本文提出R. eutrophus WSH1的分批生长模型∶  (3-3-4) 式中是菌体的最大比生长速率；sC/sN为有机酸与硫酸铵浓度之比；Ks为基质半饱和常数；Sm为菌体完全受抑制时有机酸与硫酸铵之比；n为匹配参数，无物理意义。 图3-3-17为发酵液中硫酸铵浓度为1.5g/L，不同初始总酸浓度下，通过作细胞量与时间的半对数图，求得分批发酵过程中细胞最大比生长速率值。从图中可以看出，细胞生长速率是C/N的函数。  图 3-17 C/N对细胞生长速率的影响. ○为实验值，曲线代表模型计算值 用式(3-3-4)对不同条件下的PHAs分批发酵的实验数据进行拟合，计算出模型参数(m=0.21 h-1，Ks=1.15，sm=34.6，n=0.87。因此，R. eutrophus WSH1的生长模型为∶  (2)PHAs形成模型 PHAs发酵中产物的形成与细胞的生长部分偶联，在细胞生长阶段形成部分PHAs，细胞停止生长后，产物开始大量合成。最终PHAs由两部分组成∶细胞生长阶段合成的PHAs和细胞停止生长后合成的PHAs。因此PHAs的形成可用方程(3-3-5)表示∶  (3-3-5) 对细胞实际积累PHAs过程中的数据进行拟合，计算出参数k1和k2分别为0.96和0.057。因而，本研究所提出的PHAs形成模型为∶   图 3-3-18 PHAs积累与模型计算值的比较 ○为实验值，曲线代表模型计算值 八、以有机废水酸化产物为底物进行PHAs流加发酵 (一)流加发酵 由于高浓度有机酸对细胞的生长有抑制作用，因而在发酵的初始阶段，有机酸浓度应降低到对细胞抑制作用以下，以缩短细胞生长的延滞期；发酵后期则应当进行补料发酵，使酸保持在相对稳定和较低的浓度，以延长细胞积累PHAs的时间，获得PHAs的最大产量。在分批发酵的基础上，将UASB出水中的总有机酸浓度浓缩至150 g/L左右，进行PHAs流加发酵的初步研究，发酵罐中各物质的质量浓度变化如图3-3-19。发酵初始有机酸浓度的降低，缩短了细胞生长的延滞期，在7 h后细胞即进入对数生长期，23 h后发酵液中的有机酸逐渐积累，导致细胞生长减慢，PHAs积累的速度降低。氮源浓度在17 h左右降为零，此后流加的氮源使发酵液中NH4+保持低浓度，PHAs开始大量积累，在54 h时DCW和PHAs达到最大值，分别为15.8 g/L和10 g/L。整个发酵过程中，R. eutrophus WSH1优先利用丁酸，这与前面的研究是一致的。  图3-3-19 流加发酵过程中DCW、PHAs、NH4+、有机酸的浓度变化 □ DCW； PHA；▲ 丁酸；● 乙酸；△ 丙酸；■ NH4+ (二)酸化废水发酵过程中丁酸对PHAs的产率的变化 对酸化废水的分批和流加发酵过程进行分析，得到丁酸对PHAs的产率变化(图3-3-20和图3-3-21)。可以看出，对于分批发酵，由于初始阶段主要进行细胞的生长，因而丁酸对PHAs的产率逐渐降低，随着当细胞生长的停止、PHAs的积累，丁酸对PHAs的产率又逐渐增大，最终达到0.293 (gPHAs/g丁酸)。同样，流加发酵的初始阶段进行细胞的生长，产率逐渐降低；在发酵至12 h后，由于细胞生长速率的降低、胞内PHAs的积累，丁酸的产率又逐渐提高。与分批发酵不同的是，当发酵至一定程度，丁酸对PHAs的产率又会降低，这可能是流加的浓缩废水中含有的NH4+会使细胞维持一定的生长活性，消耗了部分有机酸。在发酵过程中，最大产率达到0.58 g/g。  图3-3-20 分批发酵过程中丁酸对PHAs的产率变化  图3-3-21 流加发酵过程中丁酸对PHAs的产率变化 所以，与分批发酵相比，流加发酵不仅延长了PHAs的积累时间，大幅度地提高了PHAs的产量，而且会提高底物的产率。如果能够确定由流加起始条件、流加方式、流加控制的基质浓度等组成的流加策略，可以实现PHAs的最大生产。 总之，构建有机废水处理与聚羟基烷酸生产的耦合系统，用有机废水为原料生产出生物可降解塑料，为降低PHAs生产成本，减少有机废水和塑料废物对地球环境的污染，提供了一条新的思路。 第四节 生物反应与产物分离的组合系统 产物和底物抑制是生物反应中限制生产强度和产物浓度的两个主要因素。由于产物和底物抑制，生物细胞及酶的潜力不能充分发挥，造成过程的转化率(或产率)也难以提高。长期以来，人们一直在探索解决这一问题的途径。选育能耐受高浓度底物或产物的生物细胞固然可以使生产指标得以提高，但并不能从根本上解决问题。而选择性地从培养液中连续分离有抑制性、有毒性或不稳定性产物，或者将底物以一种可控的方式添加到培养液中，对生物反应过程都能产生极大的促进作用。于是，一门新的技术∶生物反应与分离(或分配)相组合的技术便应运而生了。 生物反应与产物分离的组合系统也称为原位(in situ)产物分离过程或提取生物转化，即在生物反应发生的同时，选择一种合适的分离方法及时将对生物反应有抑制或毒害作用的产物或副产物选择性地从生产性细胞或生物催化剂周围移走。一般地，生物反应与产物分离的组合系统具有如下三个特征；(1)耦合过程是一种集成式单元操作，其生物反应器具有特殊的结构；(2)实现产物及时分离的方法有很多，但必须考虑产物的特性及具体的生物反应体系来合理选择和设计；(3)耦合过程作为一种新的反应工程技术，可适用于各种生物反应过程。生物反应与产物分离的组合系统至今尚未有统一的分类标准。从生物反应的体系来看，可分为生物催化─分离组合系统，微生物反应─分离组合系统，动植物细胞培养─分离组合系统等。 生物反应与产物分离组合系统的关键是如何选择一种合适的分离技术来转移产物或副产物。分离技术的选择主要基于四个方面的因素∶(1)分离技术应当具备生物相容性，适宜的分离技术应当对生物反应不造成负面影响，不会造成生物催化剂或细胞的失活、变性和死亡，也不会改变生物反应的代谢和调节机制；(2)应当考虑产物或副产物的物理化学特性和生物学特性；(3)考虑系统的流体特性，因为流体力学性质决定并影响分离过程的传质，从而影响分离的容量和速度，如高粘度的非牛顿型流体就不能用膜分离技术；(4)考虑工程及经济因素，理想的分离技术应当是操作费用低、性能稳定、工程上易于实现的技术。 近十年来，在乙醇、丙酮、丁醇等传统发酵产品以及高附加值产品的生产中，研究人员对这种生物反应与分离的组合系统进行了大量的研究。随着层析技术、膜技术和双液相技术的发展，传统的结晶、透析、吸附、离子交换与亲和色谱、电渗析、随程溶剂萃取、渗透萃取、渗透蒸发及气体抽提技术都被用于与生物反应相组合，这种生物反应与产物分离相组合的技术对生物反应过程产生的巨大促进作用正不断为人们所认识。以下即从分离技术的角度出发，对这种组合系统 一、随程溶剂萃取 在利用微生物或植物细胞生产有用物质的过程中，常常发现产物的生成会抑制培养的进一步进行。一方面是因为产物本身对细胞有毒性或有抑制作用，如丙酮丁醇发酵中当丁醇浓度达到10～15 g/L时细胞的生长就受到明显抑制。另一方面是因为产物的生成恶化了细胞生长的环境，如随着产物的积累，培养液粘度升高，限制了传氧过程。还有一种情况，即产物容易被酶降解或被反应器的搅拌剪切力破坏。在这些情况下，都希望能够随时分离产物，以免产物抑制培养的继续进行，或培养环境对产物造成破坏。将萃取技术与培养结合起来的随程溶剂萃取技术，就是一种可以有效提高反应器生产强度的方法。这种技术包括内部随程萃取和外部随程萃取两种方式。 内部随程萃取是指萃取剂在反应器中与培养基直接接触，以便将产物萃取到溶剂中去。在利用帚状地霉发酵生产酯类风味物质的研究中，内部溶剂萃取技术得到了很好的应用。由于选用的萃取剂对各组分均有较大的分配系数(大于20)，因而能迅速将产物从水相转移入有机相，从而有效地降低了产物对菌体生长的反馈抑制作用，使总酯量和生产强度均有较大的提高。采用多级萃取发酵优点更加明显，总酯量比非萃取发酵提高了近一倍。该研究为了对这一特定萃取发酵过程进行较为完善的描述，还建立了萃取发酵中预测菌体生长、产物浓度和生产强度的数学模型。Jones等在Cadida preudotropicalis转化乳糖为乙醇的研究中采用内部溶剂随程萃取技术，实验结果也有明显提高。内部溶剂萃取的特点是∶溶剂和液相混合均匀，因而有利于传质的进行；但溶剂也可能在培养液中形成稳定的乳化作用，这对溶剂与产物的分离不利。 萃取发酵中有机溶剂的选择是十分关键的。溶剂应当有优良的萃取性能，但人们似乎对溶剂的疏水性以及溶剂对生物催化剂的毒性更感兴趣。生物相容性指数logP(有机溶剂在水─辛醇两相系统中的分配系数的对数值)是用来衡量有机溶剂的疏水性的重要指标。一般说来，logP指数大于4的有机溶剂疏水性较强而且通常对生物催化剂没有毒性。Bruce和Daugulis对生物催化的萃取反应系统所应采用的溶剂选择策略进行了研究，他们认为有可能对各种有机溶剂进行组合使它们既表现出优良的萃取性能又表现出良好的生物相容性。采用这种策略，就有可能使用那些适于萃取但生物相容性相对高的有机溶剂。生物相容性并不是衡量有机溶剂适用性的唯一指标。在Qureshi等人的研究中，虽然油醇是一种优良的萃取剂，而且油醇的生物相容性指数logP值（7.0）高于有机溶剂对这种生物的临界值（5.0），但由于油醇对生物体的一些不明抑制作用，因此，他们所采用的直接萃取方法并没有完全成功。 外部随程萃取是指萃取剂和培养液在反应器外的萃取装置中逆流接触，从而萃取产物的过程。用这种方法可以减轻内部溶剂萃取中的乳化问题。采用外部溶剂萃取方法来转移产物，可减轻毛根培养（Hyoscyamus mutians）生产Solavetivone过程的反馈阻遏。由于这一培养是植物次级代谢产物的积累过程，因此，人们更关心的是次级代谢物的物理性质及提取过程的经济性，而非溶剂的生物相容性。Solavetivone的沸点较高，采用低沸点的溶剂可以使溶剂与产物的分离变得容易，而这些溶剂常常是非生物相容的。Corry等人选用己烷作为萃取剂，己烷的logP值为3.5，虽然小于有机溶剂对H. mutians的临界logP值(大约为5)，但在外循环中用己烷来转移产物却能够显著提高整个系统的转化率。假如用己烷进行内部溶剂萃取就不会收到这样的好效果，因为在发酵系统中加入挥发性溶剂，会导致传氧困难，即便细胞处于产物合成的旺盛期也会减少产物的生成，即所谓的“相毒性”(phase toxocity)。外部随程萃取则不存在这一问题，在外循环中多余的溶剂可用气体抽提去除，若细胞对溶剂敏感，还可在微量溶剂回流反应器前进行脱气处理。这些因素表明，外部溶剂萃取有其独到的优点。 目前，虽然在乙醇的萃取发酵生产过程中，150 L规模的发酵罐已经成功地通过中试，进入年产3000吨的工业化阶段，但培养结合萃取技术的广泛应用仍存在许多困难，这些困难集中表现在高效无毒的萃取溶剂的筛选中。 二、渗透萃取 Solichien等人在利用Propionibacterium acidipropionici生产丙酸和乙酸时采用基于膜的萃取技术随程分离丙酸和乙酸。膜技术在萃取中得到应用是因为膜能够增加传质面积，降低乳化程度及减轻溶剂对微生物的毒害作用。用于萃取的膜的构型主要有两种形式∶一种是支持液膜(Supported Liquid Membrane，SLM)，另一种是膜萃取(Membrane Extration，ME)。这两种方法在提高生产乙醇、乙酸和丁酸的反应器的生产强度方面都有成功的报道。在基于膜技术的萃取系统中，溶剂由于影响到产物形成和细胞生长因而显得十分重要，它应该是对细胞无毒的；对目标产物有较高的分配系数而对培养液中其它组分的分配系数相对较小。Solichien采用氧化三辛基膦(TOPO)与煤油的复合体系作为溶剂，由于萃取剂和培养液被膜隔开，萃取剂对细胞的毒性有所降低。研究结果显示，丙酸和乙酸的浓度被控制低于1.5%和1.0%(w/w)的有毒浓度。 乳酸在发酵液中的积累也会进一步抑制它的生成。为了解除这一末端产物抑制并提高反应器生产强度，必须随程移去产物。Eyal等人采用液─液萃取法去除乳酸，但此法对溶剂的需求量过大。Yanannavar和Wang采用15%的叔胺油醇溶剂分离乳酸。液体表面活性剂膜(Liquid Surfactant Membrane，LSM)萃取法近年来也颇受关注。比起其它分离技术，这一方法的优点在于液体表面活性剂膜所具有的巨大表面适于传质从而能加快分离速度。但由于操作复杂及LSM的膨胀等原因，LSM在工业上的应用并不多。支持液膜法由于其独到之处也被用于乳酸的分离。它的优点主要有低能耗、较高的分离系数以及在分离过程中能够富集乳酸，遗憾的是支持液膜不够稳定。基于膜技术的萃取发酵系统近年来被广泛用于产物抑制的发酵过程，但对于乳酸和葡萄糖这两种分子大小相近的物质，基于微孔中空纤维膜的萃取工艺不能选择性地分离它们。Wang等人采用基于离子交换膜的萃取发酵系统来转移乳酸。这种系统包括三个部分∶发酵、基于中空纤维膜的萃取及阴离子交换。研究发现，这一技术能选择性地从乳酸─葡萄糖溶液中分离乳酸，有效地促进了发酵的进行。 Grobben等人报道了渗透萃取技术的应用。他们研制了一种聚丙烯中空纤维渗透萃取系统，将这一系统和反应器相组合，可以把丙酮和丁醇转移到一种油醇与葵烷50/50(V/V) 的混合物中，从而减轻产物的抑制作用。这一系统能在短时间内充分发挥作用，只不过因导致薄膜堵塞而需及时终止。 三、渗透蒸发 渗透蒸发技术的分离因子高、操作费用低，再加上对膜结构的无限制性以及操作时具有较高的机械强度等优点，近年来在有机液体和水的分离研究中广泛受到人们的重视。采用这一技术能够使接近共沸点、相对含水较少的乙醇溶液脱水，并且已经被用于日产2吨 ～150吨规模的工业化生产。在乙醇的生产工艺中，渗透蒸发是将乙醇从发酵液中连续分离的最有效手段，由于降低了产物抑制和分离操作费用，生产率得以显著提高。传统的渗透蒸发需要真空装置和膜的支持介质以提供物质通过膜的驱动力，采用一种疏水多孔的聚硅酮中空纤维膜就可省去真空系统。由于水蒸汽的冷凝潜热能促进有机物质汽化，因此，若采用水蒸汽作为载气还可以加速分离过程。Susumu等人[16]在总结前人工作的基础上，采用聚二甲基硅氧烷中空纤维膜(PDMS─HF)结合氮气作为载气，从水相中连续分离乙醇和异丙醇，发现乙醇通过膜的速率可以用"溶解─扩散─蒸发"模型来成功地描述，根据这一模型，加快气体流速可以提高乙醇对水的分离因子。这一模型还可用于传统的结合真空装置的渗透蒸发体系中。 　　 根据减轻末端产物抑制以提高发酵转化率的思路，Dettwiler等建立了一种数学模型，采用这种数学模型，可以预测采用渗透蒸发技术将3-羟基丁酮和丁二醇从枯草杆菌发酵液中移走后对过程特性的促进程度 。如果要利用这一模型把过程特性预测得更为可靠，就应采用选择性更高的薄膜。 四、其它生物反应与产物分离技术 (一)气体抽提 Mollah和Struckey已在Clostridium acetobutylicum生产丙酮丁醇的过程中成功地应用了气体抽提技术。他们研究了藻酸钙包埋细胞连续发酵中气体喷射速率及稀释率的影响，发现采用一种H2、N2和CO2组成的气态混合物可有效地控制丁醇浓度低于有毒浓度5 g/L，并且能显著提高反应器的生产强度。气体抽提技术的优点在于∶不需分离混合物；抽提气体十分干净且不会对微生物产生毒害作用；发酵产物本身的蒸汽也可用于抽提。由于这一技术只带走挥发性溶剂而不带走营养物质，因而显得比其它提取技术更为有效。 (二)吸附 Yang等人在利用重复补料和细胞循环技术培养Clostridium acetobutylicum生产丙酮丁醇时发现，为了提高反应器生产强度及最终产物浓度，必须连续地将抑制性产物从发酵液中分离。他们选择聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为吸附剂连续去除终产物，发现抑制效应减轻，产物形成速率加快，且能获得高的细胞比生长速率。比起传统的分批发酵，产物浓度和发酵罐生产强度分别提高了140%和320%。他们还发现，在丁醇浓度达到12 g/L之前应及时更换吸附柱，以免产物浓度过高，细胞处于毒性循环之中，发酵速率和产物吸附速率也随之下降。 在生物表面活性剂的生产中，为避免发酵最终产物的抑制作用及可能出现的泡沫问题，也可采用随程提取的技术。利用Pseudomonas sp.DSM2874生产鼠李糖脂时，鼠李糖脂可以从固定化细胞发酵液中连续转移出来并被吸附在XAD-2吸附剂上。 (三)结晶 Aguma等人最近报道了另一个利用发酵与提取组合技术来减轻反馈阻遏的有趣例子。他们用结晶法来促进大肠杆菌重组体生产L-色氨酸。以前曾观察到发酵培养基中L-色氨酸积累到大约30 g/L时，吲哚开始在发酵液中出现。这表明色氨酸合成酶受积累的L-色氨酸抑制，因而限制了L-色氨酸的最终浓度。在发酵液中添加非离子表面活性剂可降低L-色氨酸的溶解度，使色氨酸从溶液中结晶出来，降低对色氨酸合成酶的抑制，从而使发酵能够进一步进行，L-色氨酸的浓度最终可达到50 g/L。 (四)层析技术 最近有研究表明，培养细胞与分离产物相耦合可促进单克隆抗体的生成。生产单克隆抗体时，随着培养时间的延长，抗体蛋白质的降解是过程操作的限制因素。若不能选择性地分离产物就将导致已积累的许多抗体遭到破坏。Mohan等人成功地将一根层析柱与反应器相组合，发酵液从柱中流过不仅能及时转移产物，而且能防止这种产物的蛋白质被降解。 作者曾对固定化青霉素酰化酶水解青霉素G(PenG)生产6-氨基青霉烷酸(6-APA)进行过研究。实验中发现∶(1)水解反应副产物苯乙酸(PAA)对酶解反应存在竞争性抑制；(2)酶解反应降低pH造成青霉素G和6-APA的内酰胺环不稳定。因此，从青霉素G水解反应混合液中连续去除苯乙酸是十分重要和令人感兴趣的。采用固定化酶─离子交换组合系统连续去除PAA可维持反应混合液中的低PAA浓度，从而得到较高的酶转化效率。在实验条件下，从反应混合液中可去除53%的PAA，青霉素G水解速率也提高了10.2%。研究建立的数学模型，能够很好地对青霉素G水解生产6-APA的过程进行计算机模拟和预测，并且对离子型产物抑制的酶转化过程具有普遍应用价值。另有学者报道了采用离子交换电渗析去除PAA的方法。阴离子交换膜能够吸附PAA，6-APA和PenG，三者之间竞争性吸附依赖于分子大小及各物质对膜的亲和力。由于PAA对膜的亲和力小于其它二者，因而最容易被去除。此法快速、有效，为促进6-APA酶解反应的研究开辟了新的途径。 (五)电渗析 电渗析是一种较新颖的用于降低有机酸发酵中末端产物抑制的技术。由于丙酸和乙酸的混合浓度达到2～4%时就会产生抑制，因此用电渗析法来收集丙酸和乙酸[28]可以提高发酵产率。尽管没有随程应用这种技术，电渗析在合成培养基及实际发酵液中的应用也已小获成功。不过，培养基中其它盐类的存在会对这种方法产生严重抑制。Nomura等人曾报道过在啤酒酵母生产乳酸的过程中采用电渗析技术随程分离乳酸及控制pH保持恒定的例子。 (六)动电技术 培养哺乳动物细胞生产单克隆抗体时，培养液中的铵离子和乳酸的积累会对细胞产生毒性并降低生产率。铵离子浓度在2～10 mmol/L时抑制50%的细胞生长，它的毒性主要在于会引起胞内pH值的升高。对于文献报道的Hybridoma细胞，铵浓度4.5 mmol/L时开始抑制部分细胞生长，8.0 mmol/L时抑制所有细胞生长。乳酸对培养过程的抑制作用表现在它能酸化培养基。乳酸浓度在20～40 mmol/L时抑制50%的细胞生长，分批反应器中乳酸的浓度至高不超过35 mmol/L。因此随程去除铵离子和乳酸就显得十分重要。中空纤维膜已成功地用于从10 L规模的抗生素发酵中分离铵离子，但由于哺乳动物细胞对环境变化有着很强的敏感性，因而针对哺乳动物细胞培养选择随程分离技术就显得十分困难。透析法是目前报道的随程去除哺乳细胞代谢毒物的较有效方法。铵和乳酸被去除，必需营养物和大分子蛋白则保留在生物反应器中，透析培养液中抗体的最终效价要比典型分批培养液中的抗体效价高数倍。Yu-Hsiang等人采用动电技术(Electrokinetic)在流加培养生物反应器中强化营养培养基、随程分离铵和乳酸获得成功。在电流密度50 A/m2的条件下，细胞产生的铵几乎被完全去除，细胞生长速度和抗体效价分别提高了30%和50%。 (七)受控底物分配 最近有些研究者将焦点集中生物反应过程与底物分配相结合的技术上。这与生物反应过程与产物提取相结合是类似的。由于底物可能不溶于含水的发酵液，或可能对细胞有毒害作用，因此，采用一个两相（第二相为有机相）体系，以一种可控的方式将底物添加到生物反应器中，并使之选择性地被分配到两相中，就可以减轻底物对反应的不良影响，促进反应的进行。 脂的酶解近年来已有报道。脂酶是表面活性酶，它的活力受到油水两相接触面积的影响，而与水能混溶的有机相可以增大接触面积。在解脂反应中应用有机相，其优点是明显的∶(1)疏水底物和产物溶解在有机相中，可以减轻底物或产物抑制；(2)酶不需要固定化也可以很容易地从产物相中得以分离；(3)有机相中产物浓度可以很高，使提取变得容易；(4)生物解脂反应能以连续的方式进行。但是，有机相也可能会使生物催化剂变性。Kim和Rhee利用一株能耐受有机溶剂的Pseudomonas putida 3sk作为脂酶来源，将一个水相—有机相两相体系用于脂酶水解橄榄油的过程。研究发现，水解程度受两相体积比例、培养基种类以及底物(橄榄油)在有机相中的浓度影响。至于有毒的是底物还是产物(或是两者都有)，以及究竟是将底物还是末端产物分配进入相邻的有机相，才能更有效地减轻抑制效应，这些还都有待于深入研究。采用生物相容性指数logP与菌体的解脂活力相关联，研究者比较了许多用来溶解（不溶性）橄榄油底物的溶剂，发现异辛烷为最佳。实验还确定了水—有机相比例及有机相底物浓度的最佳条件，在最佳条件下，底物水解率达到95%。 Oda和Ohta研制了一套用相似理论来解决底物或产物毒性的“界面生物反应器”(Interface Bioreactor)。这包括在固体表面(如琼脂)上生长细胞，其上放置一层有机物，既作为有毒或不溶性的底物来源，又可容纳有机可溶性的产物。转化反应的结果表明，该系统与乳浊液系统相比显示出更优良的性能。例如，2-辛醇（logP＝2.86）可被细胞氧化为2-辛醛（logP＝2.36），这两种物质均可溶于一种生物相容性较好的溶剂正十六烷（logP＝8.67）中，而它们在单独存在时均不溶或对细胞有毒性。界面生物反应器的不足之处在于∶水溶性产物会在固相中积累，而细胞又正是生长在固相表面，产物若为酸性，pH就会下降，从而抑制细胞生长。 El Aalam等人也报道了一个关于有毒及不溶性底物受控分配的成功例子。将苯乙烯（当它在水相中的浓度达到70 mg/L时对微生物产生毒性）溶于硅酮油，然后以80∶20（v/v)的比例加入发酵液中。硅酮油使得苯乙烯在被微生物降解时仅有微量转移入水相中。采用这种方式，大约24 h内可消耗5g/L苯乙烯；系统保持正常操作。 从以上三个研究中可以看出，在双液相系统中选择性地分配有毒或不溶性物质对过程有明显的促进作用。这种技术的关键在于，怎样确定第二相（有机相）的系统性选择原则，以及如何根据这一原则对特定的反应过程选择合适的有机相。 (八)在酶学上的应用 萃取发酵中采用的有机溶剂对酶促反应有着良好的影响。在非水环境中的酶反应（包括脂肪酶），合成酶反应比起水解酶反应来更容易被促进。此外，在有机—水两相系统内，选择性地加入溶剂相能显著影响分配平衡。除去确认生物相似性指数logP在两相生物反应系统研究中的有用性，近年来有关酶学的研究还考察了一些基础论题诸如水的活度、界面张力、溶剂极性及水的可混性对酶反应的影响，这有助于人们更加深入、细致地理解这些因素的重要作用。发酵领域内的其它基础性研究也得到了较大的进展。此外，针对特定反应系统的预测技术，如基于UNIFAC计算方法的TREP程序(两相反应平衡预测)，已经在一个两相酶系统∶脂酶催化甘油和脂肪酸的酯化反应中得到成功应用。该技术能够预测出甘油与各种脂肪酸反应的平衡位置，对实现工业化非常有帮助。 五、生物反应与产物分离组合系统的发展趋势 系统适用的生物反应体系种类不断增多。研究和应用对象除了初级代谢产物外，更多地转向高附加值的药物产品(如FDP和抗生素)、食品添加剂(维生素、色素、香料)和一些高分子量的产物(如酶、治疗用蛋白、单克隆抗体和生物碱)，这就为该系统提供了更具工业应用前景的广阔空间。 反应分离耦合过程的内涵不断深化。建立耦合系统的目标主要是为了消除产物和副产物累积而引起的反馈抑制作用，现在的研究在此基础上更加深入和细化，耦合过程包括∶(1)有抑制或毒害作用副产物的选择性分离；(2)选择性地供给营养底物；(3)不可发酵底物或老龄化细胞的分离。 新的分离技术不断出现。主要体现在两个方面∶(1)新的选择性更强、生物相容性更好的生化分离方法的开发和应用(如基于分子识别的分离方法)；(2)将传统分离技术组合使耦合系统的选择性更好、效果更理想，如前面介绍的膜技术。 总之，生物反应与产物分离的耦合系统在消除产物或副产物的抑制，提高产物产率和生产强度，简化产物的后处理工艺，降低投资成本和操作方面具有优势，是一种具有重要理论意义和工业应用价值的生产技术，它代表了生物反应的一种集成化发展趋势。 第三章主要参考文献 林金萍．谷胱甘肽生物合成的研究──高谷胱甘肽合成活性菌株的构建及合成过程的研究．无锡轻工大学硕士学位论文，1999年12月 李寅，陈坚，伦世仪．ATP再生系统及其应用．食品与发酵工业，1998，24(3)∶60-65 Li Y, Chen J, Lun S. 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