《发酵工程》电子教案：第七章MTG

第七章 谷氨酰胺转氨胺酶发酵过程优化 第一节 谷氨酰胺转胺酶发酵概述 一、新型蛋白食品与谷氨酰胺转胺酶 蛋白质作为食物中最重要的成分之一，一直受到人们的重视。目前，无论发达国家还是发展中国家都迫切要求新型蛋白食品的问世。对于发达国家的人们来说，动物蛋白质的过多摄入严重损害了人体的健康(如高血压、心脑血管病患者人数增多)；而对发展中国家的人们来说，则由于动物蛋白质摄入的贫乏，造成人们营养普遍不良。全球耕地的不断减少，而人口却与日俱增，因而对新型营养蛋白食品的需求量日益增大。我国人口占世界人口的20%，而耕地面积仅占世界的10%左右，这种需求就尤为突出。 许多食品蛋白质，由于氨基酸组成不理想，或缺乏适当的结构和构像，因而使得这些蛋白质缺乏良好的功能性质，且本身的营养价值也不高。由此可见，寻求用一种简单高效的方法生产新型蛋白食品，来替代部分传统的功能性质较差的食品显得非常迫切。人们只要摄入一定量的此类蛋白食品就能满足自身的营养要求。此类新型蛋白食品应具备以下品质：营养价值高、质构合理、外型美观、安全卫生、货架期长、口感好且抗过敏等。 对这些蛋白质进行化学修饰来改善它们的功能性质，人们曾经做过广泛的研究，但考虑到化学试剂的安全性问题及其对食品营养可能造成的不良影响，这些方法最终未能被人们普遍接受和应用。酶法修饰由于其具有安全、快速、专一性强、对食品营养无破坏的特点，而越来越得到人们的认可。至今，用酶法对蛋白质进行修饰的研究，大量集中在利用一些蛋白水解酶类对蛋白质进行局部水解，以改善它们的溶解性和发泡性。而实际上，仅仅改善这些性质还远不能达到人们对食品品质的要求。 谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-(-谷氨酰胺转移酶，Transglutaminase，EC 2.3.2.13，TG)，又称转谷氨酰胺酶或谷氨酰胺酰-肽-(-谷氨酰胺酰基转移酶，可以催化蛋白质分子内的交联、分子间的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺酰胺基的水解，从而可进一步改善蛋白质功能性质，提高蛋白质的营养价值。因此，TG被认为是一种可生产出满足人们需求的新型蛋白食品的重要酶制剂。目前，日本味之素公司已生产出TG并已投放市场。 二、谷氨酰胺转胺酶的功能性质 (一)谷氨酰胺转胺酶的来源、主要结构、组成及性质 谷氨酰胺转胺酶存在于动物、植物和微生物中。动物体中的谷氨酰胺转胺酶(Guinea-pig transglutaminase，简称GTG)及微生物生产的谷氨酰胺转胺酶(Microbial transglutaminase， 简称MTG)的主要来源、结构、组成及理化性质均不同。不同来源的酶对底物的专一性有所不同。对分子中有Lys或Lys二肽的底物，MTG表现出更强的催化能力，这是由于MTG较强的热稳定性。但当底物为CBz-Gln-Gly-Oet，CBz-Gln-Gln-Gly，CBz-Gly-Gln-Gly-Gly时，MTG酶活则低于GTG活性。GTG分子量约为MTG的2倍，且活性依赖于Ca2+，而MTG的活性则不依赖于Ca2+，但二者活性中心均包括Cys残基。 MTG是一种胞外酶，分子量在40 kD左右，活性中心包含一个游离的Cys巯基，与GTG相比，MTG表现出很多优势： (1)对钙离子的非依赖性； (2)对热和pH的稳定性； (3)易贮存性。发酵液经离心和过滤后的滤液在-20℃下可以贮存几个月，而酶活性仅损失10%。经过纯化的酶则更加稳定。 (二)谷氨酰胺转胺酶的作用机理 谷氨酰胺转胺酶是一种催化酰基转移反应的转移酶，其作用特点如图7-1-1所示。
图7-1-1 TG的作用特点 TG以肽链中谷氨酰胺残基的(-羧酰胺基作为酰基供体，而酰基受体可以是： (1)伯胺基。形成蛋白质分子和小分子伯胺之间的连接(图7-1-1a)，利用该反应可以将一些限制性氨基酸引入蛋白质以提高其营养价值； (2)多肽链中赖氨酸残基的(-氨基。形成蛋白质分子内和分子间的(-((-谷氨酰)赖氨酸异肽键(图7-1-1b)，使蛋白质分子发生交联，从而改变食物的质地和结构，改善蛋白质的溶解性、起泡性、乳化性等许多物理性质； (3)水。当不存在伯胺时，水会成为酰基受体，其结果是谷氨酰胺残基脱去氨基生成谷氨酸残基(图7-1-1c)，该反应可用于改变蛋白质的等电点及溶解度。 利用这些催化反应，在各种蛋白质分子之间或者内部引起共价交联，就可以对各种食品蛋白质进行改性。 三、谷氨酰胺转胺酶在食品工业中的应用 TG不仅可以催化同种蛋白质之间的交联，还能催化不同蛋白质之间的交联。由于各种蛋白质的氨基酸组成互不相同，因而不同的蛋白质中的限制性氨基酸不一定相同，通过TG将它们连接起来，可以实现优势互补，提高蛋白质的营养价值。除此之外，TG作用于蛋白质后，还会明显改善蛋白质的溶解性、对酸稳定性、发泡性、乳化性和乳化稳定性等性质。另外，在蛋白质食品体系中，TG的耐热稳定性可大大提高，在一般的食品加工过程中，它不会因为热处理而迅速失活。TG在食品加工中的作用主要有： 保护食品蛋白质中的赖氨酸避免发生化学反应； 提高蛋白质的营养性； 包埋脂类或脂溶性物质； 形成耐热耐水性的膜； 提高食品的弹性和持水能力等。 目前，TG已广泛应用于食品工业，其主要应用如表7-1-1所示。 表7-1-1 TG在食品工业中的应用概览 来源 产品 作用  肉 肉包 罐装肉 冻肉 模型肉 浸渍肉 提高弹性、质地、口味及风味 良好的质地和外观 改善质地，降低成本 对肉进行改型再塑造 改善肉的风味以及使贮藏期增长  鱼 鱼肉泥 碎鱼产品 提高质地和外观 明显增加凝胶强度  Krill Krill肉泥 改善质地  骨胶原 小麦 鱼翅模拟 焙烤食品 美味食品模拟 改善质地，增大体积  大豆 麻婆豆腐 煎豆腐 贮藏期增长 改善质地，贮藏期增长  蔬菜.水果 矿物质吸收促进剂 改善肠道中矿物质吸收  胶 交联蛋白质 甜食 化妆品、药物 降低过敏性 良好质地、弹性和低热量 良好的凝胶性质及粘性  脂肪、油、蛋白质 固体脂肪 良好的质地、口味、风味的猪肉替代物  植物蛋白 蛋白粉 形成具有良好质地及口味的冻胶  调味品 调味品 改善口味和风味  蛋白质冻胶 蛋白质冻胶 改善强度  米 粘米饭 增加粘度并在贮藏中保持原有口味和质地  牛奶蛋白 牛奶 粘性增加  脆性甜点 脆性甜点 防止软化  四、谷氨酰胺转胺酶的生产 生产TG的方法主要有：(1)从动植物组织中提取，(2)微生物发酵法生产。不同来源的谷氨酰胺转胺酶的生产过程如图7-1-2所示。 (一)从动植物组织中提取谷氨酰胺转胺酶 Folk等人在动植物组织中发现谷氨酰胺转胺酶，并通过离子交换、过滤、层析等分离纯化过程得到纯化了230倍的谷氨酰胺转胺酶。此后，不少研究者对来自动物体(主要是豚鼠肝脏)的谷氨酰胺转胺酶的纯化方法、性质以及应用进行了广泛研究。豚鼠肝脏是近三十年来商用谷氨酰胺转胺酶的唯一来源，由于酶的来源稀有、分离纯化工艺复杂，导致酶的售价较高(大约每个酶单位80 USD)。来自植物体(豌豆种子、羽扇豆种子)的TG的分离纯化工艺则还不成熟。由此可见，来自动物、植物中的TG很难应用于食品工业。
图7-1-2 来源不同的TG的生产过程 (二)微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶 1989年，Ando和Motoki等人报道了用微生物发酵法生产出TG。他们筛选了5000株菌株，经过大量实验与分析发现Streptoverticillium griseocaneun，S. cinnamonen和S. mobaraense能够分泌这种酶。生产TG的发酵过程在原理上和通常的微生物发酵法一样，以葡萄糖、蔗糖、淀粉等为碳源，以无机或有机氮为氮源；辅之以适量的矿物质与微量元素及非离子型表面活性剂。整个发酵过程为好氧发酵，因此必须通氧并进行适当的搅拌。微生物生长和产物形成的温度在25～35℃之间，发酵时间则由培养条件及TG达到的最高酶活所决定，一般在2～4 d。Ando和Motoki等人生产MTG的过程是∶先将微生物接种在100 mL 培养基中，pH 7.0，30 ℃下培养48 h，然后将种子液接入20 L的新鲜发酵培养基中，通气量为10 L/min，转速为250 r/min，30℃下培养3 d，发酵液酶活可达到 0.28～2.50 u/mL。吴解温等人筛选出菌株S. ladakanum，在25～28℃，100～150 r/min的培养条件下，接入103～104 cfu/mL 的种子，培养4 d后，MTG酶活达到最高。若加入2 mg/L的抗生素Colistin，则产率可以提高30%，MTG酶活达到2.1 u/mL。除了上面介绍的两种方法外，Washizu等人和Takehana等人还利用基因克隆的方法生产出TG。用这种方法生产的TG，在分子量大小和免疫性方面与MTG相似，但其酶活较低。 (三)MTG的分离纯化 MTG是一种胞外酶，因此，分离纯化工艺与其它胞外酶的提取过程相似。发酵结束后，先对发酵液进行离心分离，除去菌体，然后对上清液进行处理，则可得到酶制剂产品。应用于其它酶处理过程的技术，如离子交换、色谱、纸层析、超滤等也可用于TG的处理纯化。 五、谷氨酰胺转胺酶生产过程中存在的问题 如前所述，为解决发展中国家人们由于缺乏蛋白质而造成的营养不良问题以及发达国家人们由于摄入动物蛋白质过多而引起的营养过剩问题，用酶特别是谷氨酰胺转胺酶对蛋白质进行改性成为最有希望和前途的方法之一。商业用TG价格较为昂贵，而MTG则是从廉价的底物进行发酵生产获得，因此越来越引起人们的重视。但由于发酵法生产MTG的发展历史较短，到目前为止，对发酵法生产MTG的过程优化及控制的研究报道较少，报道的MTG酶活也较低(<3.0 u/mL)，因此，尚存在如下一些问题需要解决。 (1)原料。由于原料成本是生产成本的重要部分，开发可以利用价格低廉的原料(包括各级放大种子所用的原料)是一个重要的应用研究课题。 (2)发酵过程操作与发酵环境条件。pH值和温度是两个重要的环境条件，对细胞的生长繁殖以及发酵产酶都有密切关系。在不同的阶段，细胞生长繁殖和发酵产酶的最适pH值和温度并不相同，pH值和温度如何影响MTG发酵的过程和结果，已有的研究并没有关于这方面的报道。因此，为了获得较高的MTG酶活及生产强度，有必要对pH值和温度进行较为细致的探讨。 (3)发酵过程的搅拌及溶氧浓度。对于丝状菌发酵来说，搅拌在发酵过程中主要有以下作用：一为混合作用，维持发酵液中有足够的溶氧，并使发酵液中的各营养基质混合均匀，有利于细胞的吸收和利用；二为剪切作用∶一方面搅拌能减少气泡周围及菌丝表面的液膜厚度，有利于氧的传递，加速营养基质和溶氧进入菌球内部的速率，另一方面搅拌还可以避免菌丝结成较大的团块。发酵过程中的搅拌作用对菌丝球尺寸的影响，会间接地影响菌球内氧及基质的消耗，从而影响酶的合成，MTG发酵液具有较强的拟塑性流体特征，搅拌及溶氧浓度对MTG发酵过程有何种影响尚未见报道。 (4)菌丝球形成过程及工程特性研究。霉菌、放线菌是生产抗生素，酶制剂、有机酸等发酵产品的十分有用的菌群。采用这些菌进行液体通风培养时，常常会出现有些菌除了产生菌丝状(pulp)形态外，还会产生一种菌球体状(pellet)的形态。最近国内外报道黑曲霉的柠檬酸发酵，土曲霉的衣康酸发酵等都是以菌球体方式进行的，并且发现发酵过程中形成的菌球体越多，越小，产量越高。S. mobaraense是一种丝状菌，在MTG发酵过程中，实验观察到发酵液中也存在菌丝状及菌球体状形态，且菌球的大小直接影响MTG酶活。因此有必要研究菌球大小与产酶水平之间的关系。 (5)MTG合成氨基酸的代谢流分析。MTG是由331个氨基酸残基构成的单多肽链，MTG中各种氨基酸的组成差异较大，在酶合成过程中对各种氨基酸的需求也不一样。研究S. mobaraense发酵合成MTG过程中的氨基酸代谢流分布，尤其是对氨基酸的变化原因进行较详细的分析，可望找出MTG合成过程中关键的控制点，从根本上提高MTG酶活。 六、本章主要内容 (1)以茂原链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)WSH-Z2为生产菌株，对影响S. mobaraens菌体生长和MTG合成的一些重要环境因子进行定量的考察，确定微生物的生理生化特性、营养源供给与发酵特性之间的内在联系； (2)在小型发酵罐上考察控制不同pH值及温度对MTG发酵的影响，通过对细胞比生长速率、MTG比合成速率的变化进行研究，得出最适pH值及温度控制策略；用统计热力学理论对pH值影响细胞生长及产酶进行理论分析，建立pH影响细胞生长及产酶的模型，并就温度对细胞生长及产酶影响开展模型化研究； (3)探讨MTG发酵过程的搅拌及溶氧浓度对细胞生长及产酶的影响，并考察MTG发酵体系的流变学特性、搅拌功率的计算、混合和传氧系数等，为MTG工业化生产时反应器的设计选型提供依据，最后提出MTG发酵生产的搅拌及溶氧浓度控制策略； (4)考察MTG发酵过程中影响菌丝球增殖形态的诸多因素，深入探讨菌丝球增殖形态与产酶之间的关系，确定产酶的最适菌丝球大小，并提出控制最适菌丝球大小的策略。进而提出菌丝球生长及菌丝球内氧浓度分布的理论，把菌丝球生长及菌丝球内氧浓度分布的理论应用于实际生产过程中； (5)根据MTG的合成途径，通过质、能衡算和解析，计算主要物质的代谢流分布，确定S. mobaraense细胞培养过程的营养要求；通过对MTG的组成氨基酸水平的跟踪检测，确定MTG发酵过程中的关键控制点，为补料优化控制提供重要依据； (6)考察生产菌种对廉价底物的利用能力，并在小罐中研究淀粉的预处理对MTG发酵结果的影响，然后根据体积传氧系数相等的准则，将MTG发酵由5L罐逐级放大到300 L罐，为实现发酵法生产MTG的工业化奠定基础。 第二节 谷氨酰胺转胺酶的摇瓶发酵条件研究 一、引言 20世纪80年代末，Ando和Motoki 等人首先报道了利用微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶的方法，其中Ando等人从5000株左右的菌株中发现S. mobaraense等能够生产这种酶。近年来，国外加快了微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶的研究，并使之应用于食品工业，而国内有关这方面的研究报道目前还比较少。 影响细胞产酶的因素不是孤立的，而是互相联系，相互制约的。通常，菌种的生长与产酶未必同步，产酶量也并不完全与微生物生长的程度成正比。为了使菌体最大限度地产酶，除了根据菌种特性或生产条件选择恰当的培养基外，还应当为菌种在各个生理时期创造不同的培养环境，如pH值，温度，溶氧等。因此，首先考察了部分环境及营养条件对MTG摇瓶发酵的影响。 二、种子生长过程曲线及种龄的确定 种子生长过程曲线如图7-2-1所示。可以看出，20 h后细胞生长速率明显加快，在44 h后细胞干重开始下降，表明S. mobaraense的对数生长期为20(44 h。
图7-2-1 茂原链轮丝菌的种子生长过程曲线 为了获得最佳的种龄，采用不同种龄的种子进行摇瓶发酵试验，结果如表7-2-1所示。可以看出，用40 h种龄的种子进行发酵所获得菌体干重及酶活均达到最大。镜检发现，此时的种子菌丝粗壮，且无自溶，表明细胞处于生长旺盛期。因此确定适宜的种龄为40 h。 表7-2-1 种龄对MTG发酵的影响 种龄 / h 36 40 44  MTG酶活/ u(mL-1 1.50 1.84 1.64  细胞干重 / g(L-1 12.6 12.9 12.6  剩余淀粉浓度 / g(L-1 3.9 4.7 5.3  三、环境条件对MTG摇瓶发酵过程的影响 (一)初始pH值对菌体生长和MTG合成的影响 如表7-2-2所示。在初始pH值为7.0时，细胞干重和MTG酶活均达到了最大值，分别为12.3 g/L和1.60 u/mL。 表7-2-2 pH对菌体生长和MTG酶活的影响 初始pH 细胞干重 /g(L-1 剩余淀粉浓度 /g(L-1 MTG酶活 /u(mL-1  6.0 10.6 2.4 1.36  6.3 11.3 1.5 1.47  6.5 12.0 1.9 1.55  6.7 11.6 1.8 1.58  7.0 12.3 2.0 1.60  7.3 11.0 1.7 1.43  (二)温度对菌体生长及MTG酶活的影响 见表7-2-3。可以看出，当温度为30℃时，最适合于细胞生长和产酶，此时细胞干重及MTG酶活均最高，达到13.2 g/L及1.72 u/mL。 表7-2-3 温度对菌体生长和MTG酶活的影响 温度 /℃ 细胞干重 /g(L-1 剩余淀粉浓度 /g(L-1 MTG酶活 /u(mL-1  25 8.2 3.5 0.82  28 10.6 2.8 1.14  30 13.2 1.4 1.72  32 12.4 2.0 1.26  35 11.6 2.7 1.08  (三)接种量对菌体生长和MTG合成的影响 接种量对细胞生长和MTG合成的影响见表7-2-4。较适宜的接种量为5(20%(v/v)。 表7-2-4 接种量对菌体生长和MTG酶活的影响 接种量 / %(v/v) 细胞干重 /g(L-1 剩余淀粉浓度 /g(L-1 MTG酶活 /u(mL-1  2 10.2 2.5 0.82  5 11.0 2.1 1.45  10 11.6 1.8 1.54  15 12.5 1.7 1.59  20 13.3 1.3 1.68  (四)装液量对MTG合成的影响 500 mL三角瓶中不同装液量对MTG发酵的影响如表7-2-5所示。装液量从30 mL提高到100 mL后，酶活增加了35%。装液量为100 mL时，酶活最高为1.87 u/mL，也比装液量为140 mL时的酶活高出30%。由此可见，500 mL三角瓶较适宜的装液量为100 mL。 表7-2-5 装液量对MTG发酵的影响 体积 / mL 30 50 80 100 140  MTG酶活/ u(mL-1 1.37 1.54 1.68 1.87 1.40  细胞干重/g(L-1 12.8 12.0 12.4 12.8 12.1  剩余淀粉浓度/g(L-1 4.0 4.8 4.6 4.9 5.2  四、营养条件对MTG发酵过程的影响 (一)不同碳源种类对MTG发酵的影响 分别采用可溶性淀粉、葡萄糖、变性淀粉进行MTG的摇瓶发酵，结果如表7-2-6所示。可以看出，可溶性淀粉为合适的碳源。 表7-2-6 碳源种类对MTG发酵的影响 碳源 细胞干重 /g(L-1 剩余淀粉浓度 /g(L-1 MTG酶活 /u(mL-1  可溶性淀粉 12.9 4.7 1.84  葡萄糖 12.4 9.0 1.63  变性淀粉 乙酰基马铃薯淀粉 11.5 0.86 5.1   羟丙基淀粉 9.7 0.72 10.4  (二)初始淀粉浓度对MTG发酵的影响 以可溶性淀粉为碳源，比较了不同初始淀粉浓度对MTG发酵过程中菌体生长和产物合成的影响(表7-2-7)。初始淀粉浓度20 g/L较为适宜。 表7-2-7 初始淀粉浓度对菌体生长和MTG酶活的影响 初始淀粉浓度 /g(L-1 细胞干重 /g(L-1 剩余淀粉浓度 /g(L-1 MTG酶活 /u(mL-1  10 6.2 0 0.8  20 12.3 1.9 1.65  30 11.9 12.3 1.58  40 11.3 21.4 1.23  50 10.7 31.7 0.98  60 10.2 43.0 0.75  (三)蛋白胨种类对MTG发酵的影响 蛋白胨是提供MTG发酵过程中菌体生长和产物合成所需氨基酸的重要有机氮源。由于蛋白胨处理工艺的不同可能会影响其氨基酸组成，进而影响MTG发酵，因此，考察了不同种类的蛋白胨对MTG发酵的影响(表7-2-8)。 表7-2-8 蛋白胨种类对MTG发酵的影响 类型 蛋白胨 (细菌F403) 蛋白胨 (生化试剂) 胰蛋白胨  细胞干重/g(L-1 12.6 12.9 12.6  剩余淀粉浓度/g(L-1 3.9 4.7 5.3  MTG酶活/u(mL-1 1.00 1.78 1.04   从表7-2-8中可以看出，不同种类的蛋白胨对菌体生长影响不大，但对酶活影响显著。相对而言，生化试剂蛋白胨比较适于合成MTG。 (四)蛋白胨浓度对MTG发酵的影响 以生化试剂蛋白胨为氮源，考察了蛋白胨浓度对MTG发酵的影响，结果见表7-2-9。可以看出其适宜用量为20 g/L。 表7-2-9 蛋白胨用量对MTG发酵的影响 蛋白胨/g(L-1 15 20 25  MTG酶活/u(mL-1 1.00 1.85 1.04  细胞干重/g(L-1 12.6 12.9 12.0  剩余淀粉浓度/g(L-1 3.9 4.7 5.3  (五)酵母膏浓度对MTG发酵的影响 如表7-2-10所示。可见，酵母膏用量较低时菌体生长较差；用量较高时，菌体生长较好，但酶活较低。所以较适宜的酵母膏用量为2 g/L，此时MTG酶活最高1.85 u/mL。 表7-2-10 酵母膏用量对MTG发酵的影响 酵母膏/g(L-1 1 2 3  MTG酶活/u(mL-1 1.07 1.85 1.54  细胞干重/g(L-1 11.7 12.9 13.8  剩余淀粉浓度/g(L-1 4.2 4.7 3.2  (六)产酶促进剂对MTG发酵的影响 产酶促进剂能增加细胞膜的通透性，从而使细胞内的酶容易透过细胞膜分泌出来，提高酶产量。很多表面活性剂是产酶促进剂，从表7-2-11可以看出，不同种类的产酶促进剂均对MTG的酶活水平均有不同程度的促进。其中，聚甘油醚最有利于产酶，MTG酶活最高达2.12 u/mL，比对照组提高了40%以上。 表7-2-11 产酶促进剂对MTG发酵的影响 表面活性剂 MTG酶活 /u(mL-1 细胞干重 /g(L-1 剩余淀粉浓度 /g(L-1  对照 1.64 12.0 4.8  聚山梨醇酯-80 1.75 12.8 3.2  聚甘油醚 2.12 13.2 3.7  聚乙烯醇124 2.02 13.4 6.2  (七)MTG发酵培养基组成的正交试验优化 选择对MTG发酵有较大影响的淀粉、蛋白胨及酵母膏这三个因素进行L34正交试验，实验结果及方差分析如表7-2-12，7-2-13所示。 表7-2-12 正交实验水平、方案及结果 试验号 蛋白胨 淀粉 酵母膏 Xi(MTG酶活/u(mL-1) Xi2  1 1(15 g/L) 1(20 g/L) 1(1 g/L) 0.82 0.672  2 2(20 g/L) 2(25 g/L) 2(2 g/L) 1.85 3.28  3 3(25 g/L) 3(30 g/L) 3(3 g/L) 1.19 1.44  4 1 2 3 1.29 1.66  5 2 1 3 2.01 3.92  6 2 3 1 1.25 1.49  7 3 2 1 2.25 5.34  8 3 1 2 1.63 2.66  9 1 3 2 0.93 0.90  K1 3.04 4.46 4.32 
=13.08 
21.36  K2 5.11 5.39 4.41    K3 5.07 3.37 4.49    极差 2.18 2.04 0.12    K12 9.24 19.89 18.66    K22 26.11 29.05 19.45    K32 25.70 11.36 20.16    
61.06 60.30 58.27    表7-2-13 正交实验方差分析 误差来源 平方和 自由度 方差 F 显著性  蛋白胨 0.934 2 0.467 2.883 *  淀粉 0.681 2 0.341 2.102 *  酵母膏 0.0048 2 0.0024 0.0148   误差 0.324 2 0.162    总和 1.944 8      F0.25(2,2)=1.88 由方差分析可知，蛋白胨以及淀粉的浓度变化对MTG发酵都有显著的影响。从表7-2-12的直观分析及表7-2-13的F值可以看出，三因素对MTG发酵影响的显著性主次顺序为：蛋白胨>淀粉>酵母膏。因此，蛋白胨及淀粉的最适浓度分别为20 g/L和25 g/L，酵母膏对菌体生长以及产酶影响不太显著，可选择实验范围内的任意一点，考虑成本问题选择酵母膏浓度2 g/L。 实验得出适宜的MTG摇瓶发酵培养基组成为(g/L)∶蛋白胨20，淀粉25，酵母膏2，无水硫酸镁2，磷酸氢二钾2，磷酸二氢钾 2。 五、MTG合成的摇瓶发酵过程分析 为了全面了解MTG摇瓶发酵过程中基质消耗、菌体生长、产物形成等各参数的变化情况，根据正交实验得到的优化结果进行实验，得到发酵过程曲线(图7-2-2)。发酵过程中氨基酸的变化示于图7-2-3。可以发现，游离氨基酸在中后期MTG的合成中起着十分重要的作用，MTG酶的交联是造成培养基中游离氨基酸浓度的迅速缺乏的原因之一，而游离氨基酸的缺乏又会影响MTG酶的合成。为从根本上提高发酵水平，应对MTG合成的机理进行探讨，并对发酵条件进行进一步优化。

图7-2-2 MTG摇瓶发酵过程曲线 图7-2-3 摇瓶发酵过程中氨基酸的变化情况 ◆ 细胞干重；■ Residual 淀粉；▲ MTG酶活；◆ 总氨基酸；■ 总游离氨基酸 第三节　谷氨酰胺转胺酶分批发酵的pH值及温度控制策略 一、引言 通过第二节研究可以看出，谷氨酰胺转胺酶的分批发酵是典型的细胞生长和产物合成部分偶联的形式，细胞生长和产物合成所需控制的最佳条件不同。为了得到较高的MTG的合成速率和产率，控制较佳的环境条件非常重要。 底物分子的离子化状态因发酵液中的pH值的变化而改变。pH值的变化不仅影响基质的离子化状态，也影响蛋白质分子的离子化状态，尤其是酶，对pH值变化较为敏感。微生物生长及产物形成必需进行多种多样的酶催化反应，因此pH值是影响细胞及产物形成的重要的环境因素。通过控制培养基的pH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。如：黑曲霉当培养基的pH值偏向中性时，可使(-淀粉酶产量增加而糖化酶减少，反之，当培养基的pH值偏向酸性时，则糖化酶产量提高而(-淀粉酶的量降低。 温度也是较重要的环境条件之一。因为微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，从酶动力学来看，温度升高，反应速率加大，生长代谢加快，生产期提前。但因酶本身很易因受热而失去活性，温度越高，酶的失活也越快，表现在菌体易于衰老，发酵周期的缩短，从而影响产物的最终产量。因此在发酵系统中必须保证稳定而合适的温度环境。 细胞产酶的最适温度与最适生长温度有所不同，而且往往低于最适生长温度。例如酱油曲霉生产蛋白酶，在28℃条件下发酵，其蛋白酶产量比在40℃的条件下高2(4倍。为此，对于有些酶的发酵生产，在生长阶段应将温度控制在细胞生长的最适温度范围内，而在产酶阶段则需控制在产酶的最适温度。 本节在2.5 L小罐中研究了控制pH值为5.5~8.0，温度为25℃～35℃的情况下，MTG分批发酵过程中的动力学特征；详细探讨了pH值及温度对细胞干重、细胞产率以及MTG酶活、酶产率及酶的比合成速率的影响；在此基础上得出了S. mobaraense分批发酵生产MTG的分阶段pH值及温度控制策略，并在小型发酵罐上进行了实验验证。 二、控制不同pH值对发酵过程的影响 (一)未控制pH值的MTG发酵过程 如图7-3-1所示(初始pH值6.5，在整个发酵过程中不控制pH值)。可以看出，发酵10 h左右，细胞生长进入对数生长期，此时酶开始合成，当培养至30 h左右，细胞的生长进入平衡期，此时细胞干重达最大值22.2 g/L，残糖为4.3 g/L, 而酶继续合成至42 h左右才停止。由此可见，酶的合成伴随着细胞的生长而开始，但在细胞生长进入平衡期后，酶还延续合成较长的一段时间，此现象表明对MTG发酵，必须充分了解不同发酵阶段细胞生长和MTG合成的最适pH。
图7-3-1 未控制pH值的MTG发酵过程曲线 ◆ 淀粉；■ MTG酶活；▲ 细胞干重 (二)控制pH值的发酵过程 当pH值为5.0～5.5时菌体不生长，pH值为7.5～8.0生长较差，表明S. mobaraense在酸性环境中不能正常生长繁殖，在微碱性环境中虽然能够进行繁殖，但正常的生长及产物合成受到影响。可能是在酸性及碱性环境中，合成蛋白质分子的氢键不能正常形成，导致蛋白质分子不能正常合成。


图7-3-2 pH控制在不同水平时MTG发酵过程曲线 ◆ 淀粉；■ MTG酶活；▲ 细胞干重 图7-3-2为控制不同pH值时MTG的发酵过程曲线。从控制pH值6.0的曲线可以看出，发酵54 h 左右，细胞干重为18.5 g/L，MTG酶活达1.85 u/mL，残糖为3 g/L，细胞生长和产酶同步进行。当菌体干重达到最高点时MTG酶活也达到最大值，细胞生长停止后，酶的合成也立即停止，可能是在此pH条件下，合成该酶所对应的mRNA不太稳定。从图中还可以看出，20 h前细胞生长较缓慢，延滞期较长，20 h后细胞生长较快，所以最终达到最大细胞干重的时间较长。可以认为，pH为6.0时细胞可以生长和产酶，但该pH并不是最适的pH。 在pH为6.5的发酵过程曲线中，发酵开始10 h后，细胞干重迅速增加，伴随着细胞的生长酶也开始不断合成，20 h以后菌体干重的增加速率减慢，至42 h达到最大值，而酶则以较快的速率合成至48 h左右才停止。表明此条件下的产酶期不同于pH为6.0的产酶期。控制pH为7.0时的发酵过程曲线，曲线的变化形态和pH为6.5的发酵过程曲线基本一致，所不同的是，细胞生长延滞期较短。由此可见，控制不同的pH值，会对细胞生长和酶合成产生显著的影响。 三、pH对细胞比生长速率及MTG比合成速率的影响 (一)pH对细胞比生长速率的影响 不同pH值下的比生长速率(()是由细胞生长数据得到的。用Grooftool绘图软件对图7-3-1及7-3-2中生长数据进行插值计算(时间间隔为0.1 h)，再用Excel软件求解得到不同时刻的(，得到不同pH值下的(～t关系曲线，如图7-3-3所示。可以看出，在发酵前12 h内，pH为7.0的发酵过程比生长速率高于其它条件下的值，12 h后pH为6.5的发酵过程比生长速率高于其它条件下的值。图7-3-4为不同pH值下最大比生长速率的变化曲线。可以看出，S. mobaraense细胞在pH为5.5～7.5的范围内均能生长，但(在此范围内受pH变化的影响很大，pH为6.5时达到最大值0.185 h-1。由此可见，在MTG发酵前期，宜采用pH值7.0进行发酵，这样不仅可以缩短发酵延滞期，减少总的发酵时间，还可以获得高的细胞比生长速率。

图7-3-3 不同pH值下细胞比生长速率 图7-3-4 pH对细胞最大比生长速率的影响 pH: 1─6.5; 2─6.0; 3─不控制; 4─7.0 (二)pH对MTG产率、生产强度及MTG比合成速率的影响 不同pH值控制方式下，MTG酶活、产率(YMTG)及生产强度，如表7-3-1所示。从表7-3-1中可以看出，当pH值控制在6.5时，MTG酶活、YMTG以及生产强度均最高，分别达到2.90 u/mL、133.4 u/g和60.4 u/(L(h)。 表7-3-1不同pH值控制条件下Ycell、YMTG及MTG的生产强度 参数 控制pH的方法   6.0 6.5 7.0 不控制pH  细胞干重/g(L-1 18.5 25.1 22.6 22.2  MTG酶活/u(mL-1 1.85 2.90 2.75 2.69  细胞产率/g(g-1 0.64 1.04 0.90 0.84  MTG产率/u(g-1 79.0 133.4 123.3 114.8  生产强度/u(L-1(h-1 34.3 60.4 57.3 56.0  根据
，求得MTG比合成速率((MTG)与时间的关系曲线，如图7-3-5所示，最大MTG比合成速率如图7-3-6所示。

图7-3-5 不同pH值下MTG比合成速率 图7-3-6 pH对MTG最大比合成速率的影响 pH: 1─6.0; 2─6.5; 3─7.0; 4─不控制 从图7-3-5及7-3-6中可以看出：(1)不同pH值条件下，MTG比合成速率达到最大值的时间不同，所达到的最大值也不同。当发酵过程中pH值分别控制为6.0，6.5，7.0及不控制pH时，MTG比合成速率达到最大值的时间分别为：18.2 h，16.4 h，10.5 h和10.4 h；最大MTG比合成速率分别为：10 .8 u/(g(h)，22.5 u/(g(h)，31.6 u/(g(h)和21.2 u/(g(h)；(3) MTG比合成速率达到最大值后下降的速率不同。pH7.0时所达到的最大值最大，但其下降速率也最快；pH6.5时，尽管MTG比合成速率的最大值相对于pH7.0的值为小，但其下降趋势较慢。由此可见，在MTG发酵前13 h，宜采用相对较高的培养pH值(如pH7.0)，提高MTG比合成速率；而在发酵13 h后，宜采用相对较低的pH值(如6.5)，使MTG比合成速率继续维持在较高的值，提高MTG的发酵水平。 四、MTG发酵过程中pH值优化控制策略 在MTG发酵过程中的不同阶段，细胞生长和产酶过程所需的最适pH值不同，只有分别控制细胞生长和MTG合成阶段的最佳pH值，才能实现MTG发酵过程的优化。由以上分析可知，前期控制适当较高pH值(如7.0)不仅可缩短细胞生长的延滞期，对酶的合成也有利。在发酵中后期，可适当降低pH值以进一步促进细胞的生长，并维持较高的MTG比合成速率。 从图7-3-3及图7-3-5可以得出MTG分批发酵过程pH值控制策略为：0(13 h，控制pH为7.0，13 h后，将pH值缓慢调至6.5继续进行发酵直至结束。采用此pH值优化控制策略在2.5 L小罐上进行MTG发酵，其发酵过程曲线如图7-3-7所示，有关发酵参数见表7-3-2所示。
图7-3-7 利用pH控制策略进行发酵的过程曲线 ◆ 细胞干重；■ MTG 酶活；▲ 淀粉 从表7-3-2中可以看出，采用此控制策略进行发酵细胞量、MTG酶活、细胞产率、MTG产率以及生产强度分别比pH 6.5的值提高了9%、16%、6%、8%和32%，表明所提出的分阶段pH控制策略有效。 表7-3-2 采用pH值控制策略进行发酵后的各种发酵指标分析 参数 控制pH的方法   7.0 6.5 pH控制策略 增幅  细胞干重/g(L-1 22.6 25.1 27.3 9%  MTG酶活/u(mL-1 2.75 2.90 3.40 16%  细胞产率/g(g-1 0.90 1.04 1.10 6%  MTG产率/u(g-1 123.3 133.4 143.6 8%  生产强度/u(L-1(h-1 57.8 61.4 81.4 32%  五、不同温度下的MTG分批发酵过程 由于温度对细胞生长和酶合成过程具有很重要的影响，而且细胞生长和产酶所需的最适温度各不相同，因而，研究温度对MTG发酵过程的影响有利于确定细胞的最适生长温度及最适产酶温度。 图7-3-8为不同温度下S. mobaraense发酵生产谷氨酰胺转胺酶的动力学曲线。从图7-3-8可以发现，当温度控制相对较低时(25 ℃和28 ℃)，前期细胞生长的延滞期较长；当温度控制较高时(30 ℃，32 ℃和35 ℃时)，细胞生长的延滞期较短，细胞生长进入平衡期，酶活继续增加6 h左右才停止，达到最大酶活的时间也比温度较低时缩短。




图7-3-8 温度为25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃时MTG分批发酵过程曲线 ◆ 细胞干重；■ MTG酶活；▲ 淀粉 表7-3-3总结了不同温度下细胞的生长和产酶情况。可以看出，(1)随着发酵控制温度的提高，达到最大菌体浓度和最高酶活的时间都大大缩短了；(2)当发酵控制温度较低时，随着温度的升高，细胞干重和MTG酶活不断增加，30℃细胞干重和MTG酶活均达到最大值，当温度继续升高时，两者反而都有所下降。 表7-3-3 单一温度及分阶段控制温度对MTG发酵过程的影响 温度 /℃ 细胞干重 /g(L-1 MTG酶活 /u(mL-1 达到最大细胞干重的时间/h 达到最大MTG酶活的时间 /h  25 17.5 1.98 60 60  28 21.0 2.43 48 54  30 25.6 2.94 42 48  32 24.6 2.56 36 42  35 21 2.18 30 36  六、温度对细胞生长及产酶的影响 (一)细胞生长延滞期与温度之间的关系 如图7-3-9所示。细胞生长延滞期随着温度的升高而降低，当温度低于30℃时，延滞时间随着温度升高其降低速率较快，而当温度高于30℃时，其下降速率逐渐缓慢，因此，较高的发酵温度有利于缩短发酵延滞期，减少发酵总时间。
图7-3-9 生长延滞期与温度之间的关系 (二)温度对细胞比生长速率及其产率系数的影响 从图7-3-10中可以看出，(1)不同温度下(随着时间变化趋势相似。(2)当温度相对较高时(35℃和32℃)时，前期细胞以较高的(生长，6 h左右(迅速达到最大值，然后(迅速降低，30 h左右降为零。(3)温度较低时，(达到最大值的时间延迟，其增大和降低的速率均较慢。(4)24 h后，28℃时的(高于其它温度下的值。 图7-3-11为不同温度下的细胞产率系数(Ycell)的变化曲线。从图7-3-11可以看出，随着温度的升高，Ycell不断增大，当温度增大到32℃后Ycell下降。由此可见，在MTG发酵前期，宜采用较高的培养温度(如32℃)，这样不仅可以缩短细胞生长的延滞期，减少发酵总时间，还可以获得高的细胞产率系数，提高糖的利用率。

图7-3-10 不同温度下比生长速率的变化 图7-3-11 温度对细胞产率系数的影响 1─35℃；2─32℃；3─30℃；4─28℃；5─25℃ (三)温度对MTG产率系数及其比合成速率的影响 图7-3-12为不同温度下MTG产率系数(YMTG)的变化。当温度从25 ℃升高到32 ℃时，YMTG不断升高至最大值，然后YMTG缓慢下降。当温度从25 ℃增加到32 ℃时，YMTG从82.5 u/g增高到145.8 u/g，增加了80%，表明适当提高温度有利于产酶。
　
图7-3-12 不同温度下MTG产率 图7-3-13 不同温度下MTG比合成速率的变化 1─35℃；2─32℃；3─30℃；4─28℃；5─25℃ 不同温度下MTG比合成速率((MTG)如图7-3-13所示，从图中可以看出：(1)不同温度下(MTG与时间的变化关系都呈现钟形；(2)在12 h左右，MTG比合成速率均迅速增加，32℃时增加速率最大；(3)不同温度下，(MTG达到最大值时的发酵时间不同；(4)32 ℃时，(MTG所达到的最大值最大，但其下降趋势也最快，温度为28 ℃时，尽管(MTG的最大值相对较小，但其下降趋势较慢，发酵18 h，28 ℃时的(MTG高于32 ℃的值，20 h后，28 ℃时的(MTG高于其它温度下的(MTG。 由此可见，在MTG发酵前期，宜采用相对较高的培养温度(如32 ℃)，使(MTG的值较高，在发酵中后期宜采用较低的温度(如28 ℃)，这样可以使(MTG继续保持相对较高的值，提高MTG发酵水平，获得较高的生产强度。 七、MTG分批发酵过程分阶段温度控制策略 (一)MTG分批发酵过程分阶段温度控制策略的确定 从上述单一温度控制的分批发酵过程可以看出，前期适当高温，不仅可缩短细胞生长的延滞期，也有利于酶的合成。在发酵中后期，可适当降低温度以进一步促进菌体的生长及产酶，提高整个MTG发酵过程的生产水平。因此，我们提出分阶段温度控制策略：0～18 h，控制温度为32℃，18 h后将温度切换到28℃。采用此温度控制策略在2.5 L小罐上进行MTG发酵，其发酵过程曲线如图7-3-14所示。
图7-3-14 采用分阶段温度控制策略的发酵过程曲线 ◆ 细胞干重；■ MTG 酶活；▲ 淀粉 从图7-3-14中可见，采用此分阶段温度控制策略，发酵前期，细胞生长延滞期短，生长速率较快，整个发酵过程中MTG酶活不断增加。培养36 h左右，最大细胞干重达到26.6 g/L，42 h左右MTG酶活达到了3.37 u/mL。 (二)单一温度及分阶段控制温度MTG发酵过程的比较 图7-3-15和图7-3-16分别为单一温度及分阶段控制温度的MTG发酵过程中细胞生长及MTG酶活的情况。比较单一温度及分阶段温度控制过程可以明显看出，当前期温度控制32℃时，细胞生长的延滞期比28℃明显缩短，菌体能以较快的速率生长，而且发酵前期的产酶速率也大大高于温度较低时的情况。18 h将温度切换到28℃后，细胞生长速率及产酶速率均高于单一温度控制时的值，两者继续以较高的速率增加。42 h发酵结束时，MTG酶活比未控制温度时的最好水平提高了14%，发酵时间缩短了6 h，生产强度提高了34％。
图7-3-15 单一温度及分阶段控制温度下的细胞生长过程曲线 ◆ 32℃；■ 28℃；▲ 32℃到28℃
图7-3-16 单一温度及分阶段控制 温度下的MTG酶活变化曲线 ◆ 32℃；■ 28℃；▲ 32℃到28℃ 如表7-3-4所示，采用分阶段温度控制策略不仅可明显提高酶活，缩短发酵时间，而且生产强度也显著提高，达到80.2 u/(L(h)，比未控制温度的最好发酵水平提高了34%。MTG酶活平均比合成速率达到3.02 u/(gh)，高于其它温度条件下的平均比合成速率。细胞的平均比生长速率达到0.028 h-1，也高于28℃及32℃下的平均比生长速率，表明所提出的分阶段温度控制策略有效。 表7-3-4 单一温度及分阶段控制温度对MTG发酵过程的影响 温度 /℃ MTG生产强度 /u(L-1(h-1 细胞生产强度 /g(L-1(h-1 MTG平均比合成速率 /u(g-1(h-1 细胞平均比生长速率 / h-1 YMTG /u(g-1 Ycell /g(g-1 时间 /h  25 33.0 0.29 1.89 0.017 82.5 0.66 60  28 45.0 0.37 2.28 0.019 100.0 0.81 54  30 61.2 0.52 2.44 0.021 131.8 1.08 48  32 60.9 0.67 2.47 0.027 145.8 1.36 42  35 60.6 0.55 2.88 0.033 140.5 1.06 36  32到28 80.2 0.74 3.02 0.028 142.2 1.33 42   第四节 搅拌及溶氧浓度对谷氨酰胺转胺酶发酵过程的影响 一、引言 从第三节可知，MTG发酵过程中控制不同的条件对细胞生长及产酶影响很大。在酶制剂生产过程中，搅拌及溶氧浓度也都是非常关键的控制参数之一。由于酶生产所用的菌种一般都是需氧微生物，如放线菌和霉菌，培养时都需要通气搅拌，但是通气搅拌的程度因菌种而异。一般，通气量小对放线菌及霉菌的孢子萌发和菌丝生长有利，对酶生产不利；通气量大则促进产酶而对菌体生长不利。搅拌在发酵过程中主要起着混合和剪切作用，影响着菌丝球的大小，包括影响菌丝缠绕成球或打碎菌丝球，发酵过程中的搅拌作用对菌丝球尺寸的影响，间接地影响了菌球内氧及基质的消耗，从而影响了酶的合成。实验中还观察到，在MTG发酵的中后期，由于细胞量的增加，引起发酵液的粘度急剧增加，此时，如果搅拌不均匀，则发酵罐中易出现许多死角，对细胞生长和MTG酶活产生诸多负面影响。另外，在此高粘度的发酵液中，传氧也越来越困难，因此，研究发酵液的流变学特征可以改进发酵工艺，掌握发酵过程的规律，也为进一步工业化生产奠定了良好的基础。 本节主要研究MTG发酵体系中通气量及搅拌转速对MTG发酵的影响，然后在研究MTG发酵液流变学特征的基础上，进一步探讨了发酵体系中搅拌功率的计算及传质问题；希望通过对MTG发酵过程中混合、氧传递等问题的研究，为其工业化生产打下基础。 二、搅拌转速对细胞生长及MTG酶活的影响 (一)搅拌转速对细胞生长的影响 为了考察搅拌转速对细胞生长的影响，实验中控制不同搅拌转速，范围为300(600 r/min，研究结果示于图7-4-1和图7-4-2。可以看出，搅拌转速为400 r/min时细胞生长最快。搅拌转速升高后细胞量有所下降，可能是由于高搅拌转速时，剪切作用力较大，菌丝容易被打断，不利于菌体生长，所以对于S. mobaraense发酵不宜采用过高的搅拌转速。不同搅拌转速所获得的最大细胞干重(图7-4-3)以及到达最大细胞干重的时间并不相同。细胞产率(Ycell)的变化如图7-4-4所示。与最大细胞干重随搅拌转速的变化曲线相类似，在搅拌转速为400 r/min时，Ycell最高，达到0.974 g/g，比600 r/min的值高出37%。

图7-4-1 不同搅拌转速下细胞生长的变化 图7-4-2 不同搅拌转速下残糖的变化 搅拌转速(r/min): ◆ 300; ■ 400; ▲ 500; ＊ 600

图7-4-3 不同搅拌转速下的最大细胞干重 图7-4-4 不同搅拌转速下的细胞产率 (二)搅拌转速对MTG合成的影响 图7-4-5为不同搅拌转速时，MTG酶活随时间的变化曲线。可以看出，在较低的搅拌转速下，产酶滞后于细胞生长。当搅拌转速为300 r/min时，发酵20 h后MTG酶活才开始缓慢增加，发酵40 h后，酶合成速率明显加快，并一直维持较高的合成速率，至发酵70 h后，产酶速率才缓慢降低并逐渐停止。当搅拌转速为500 r/min和600 r/min时，产酶期较短，MTG酶活较低。这是由于高搅拌转速时，在发酵的中后期，发酵液中一直维持较高的溶氧浓度，一方面可能较高的溶氧浓度抑制酶的合成；另一方面，由于MTG是以半胱氨酸为活性中心的酶，半胱氨酸的巯基易氧化，所以过高的溶氧浓度很容易将酶氧化，导致已产生的酶失活。当酶失活速率高于合成速率时，发酵液中酶活不再增加。 不同搅拌转速下，MTG最大酶活、MTG产率(YMTG)、MTG生产强度(PMTG)和MTG比合成速率((MTG)如图7-4-6～图7-4-9所示。MTG最大酶活随着搅拌转速的增加而降低，也表明高搅拌转速不利于酶的合成。随着搅拌转速增加，PMTG和YMTG均逐渐增大，当搅拌转速增大至400 r/min时，PMTG和YMTG达到最大值，搅拌转速继续增大，PMTG和YMTG则随着降低。搅拌转速300 r/min时，MTG酶活、YMTG、PMTG分别为3.65 u/mL、132.1 u/g和59 u/(L(h)。

图7-4-5 不同搅拌转速下MTG酶活的变化 图7-4-6 不同搅拌转速下的最大MTG酶活 搅拌转速(r/min): ◆ 600; ■ 500; ▲ 400; ＊ 300

图7-4-7 转速对MTG产率的影响 图7-4-8 搅拌转速对MTG生产强度的影响
图7-4-9 不同搅拌转速下MTG比合成速率的变化 搅拌转速(r/min): 1─600；2─500；3─400；4─300 从(MTG曲线可以看出，随着搅拌转速的增加，产酶期逐渐缩短，最大(MTG也降低。发酵32 h前，搅拌转速400 r/min的(MTG高于其它搅拌转速下的(MTG，发酵32 h后，搅拌转速300 r/min的(MTG一直维持较高的值。 综上所述，在MTG发酵过程中，过高的搅拌转速对细胞的生长不利，也不利于酶的合成。控制搅拌转速400 r/min发酵时，在发酵32 h前，(MTG最高，当控制搅拌转速300 r/min发酵时，在发酵32 h后，(MTG最高，所以对MTG发酵可提出如下搅拌控制策略：在32 h前可采用400 r/min进行发酵，32 h后采用300 r/min发酵，此内容将在后面进一步讨论。 (三)MTG分批发酵过程中控制不同搅拌转速下溶氧浓度的变化 如图7-4-10示∶(1)在控制不同搅拌转速的发酵过程中，溶氧的消耗规律基本相似，但在发酵的不同阶段对氧的需求并不相同；(2)在发酵前期(20 h前)，细胞摄氧速率明显高于供氧速率，所以溶氧迅速下降；(3)在发酵中后期(20 h后)，细胞耗氧速率与供氧速率基本持平，表现为溶氧下降较慢或基本保持不变；(4)在不同的搅拌转速下，溶氧的变化也表现出其特殊性；(5)搅拌转速600r/min时，供氧速率较快，发酵前期表现为溶氧下降较慢，中后期摄氧速率低于供氧速率，溶氧表现为开始缓慢增大，并且一直维持较高的溶氧浓度。(6)搅拌转速300 r/min时，供氧速率明显较慢，表现为发酵过程中一直维持较低的溶氧浓度，在发酵中后期，发酵液中溶氧浓度几乎接近零。
三、溶氧浓度对细胞生长及MTG合成的影响 溶氧浓度对通风发酵来说是一个非常关键的控制参数，对丝状菌发酵的影响尤为显著。采用适中的搅拌转速400 r/min，考察供氧对S. mobaraense合成MTG的影响。 (一)通气量对MTG发酵的影响 通气量是影响溶氧浓度的一个重要因素，增大通气量可以增加罐内截面气速，增加发酵液的气含率，从而使气－液比表面积增大，有利于氧的传递。但是，通过增加通气量以提高氧传递速率的效果是呈递减性的。对于丝状菌发酵，若通气速率过低，且罐中搅拌不均匀使得发酵液的气含率不均一时，菌丝生长会发生异常变化，发酵液粘度过大，通过镜检发现除正常的菌球体外，还夹杂有异状粗体菌丝的菌丝体，菌丝粗细不一，有些透明中空。对于柠檬酸发酵，也有相类似的情况 搅拌转速为400 r/min时通气量对MTG合成的影响如表7-4-1所示，从表中可以看出，较高和较低的通气量均不利于MTG产酶，合适的通气量为1.25 L/(L(min)，此时，MTG酶活最高，达到2.85 u/mL。 表7-4-1 通气量对MTG发酵的影响 通气量/L(L-1(min-1 细胞干重/g(L-1 MTG酶活/u(mL-1 Ycell/g(g1 YMTG/u(g-1  2 20.8 2.45 0.89 132.7  1.25 21.3 2.85 0.93 152.4  0.75 17.3 2.58 0.79 139.8  (二)溶氧浓度对细胞生长的影响 如图7-4-11所示。可以看出，高的溶氧浓度有利于细胞生长，当溶氧浓度控制在35%至5%时，细胞干重从23.2 g/L降至15.8 g/L。一般认为，对于放线菌，细胞代谢的临界溶氧浓度为35%～40%，当溶氧浓度低于35%时，细胞的生长将会受到影响，故而在低溶氧时细胞生长较绶慢。

图7-4-11 溶氧浓度对细胞生长的影响 图7-4-12 溶氧浓度对MTG酶活的影响 溶氧浓度(%)∶◆ 35；■ 20；▲ 10；＊ 5 (三)溶氧浓度对MTG合成的影响 如图7-4-12所示。控制不同溶氧浓度，MTG酶活随着时间的变化表现出相类似的趋势。与溶氧浓度对细胞生长的影响不同，当控制溶氧浓度10％时，MTG酶活增加最快。 表7-4-2 溶氧浓度对细胞生长及产物合成的影响 DOT/% 35 20 10 5  细胞干重/g(L-1 23.2 19.9 17.5 15.8  MTG酶活/u(mL-1 2.85 3.05 3.65 3.3  Ycell/g(g-1 0.934 0.843 0.782 0.683  YMTG/u(g-1 139.8 151.6 182.4 163.6  PMTG/u(L-1(h-1 59.3 63.5 76.0 68.7   表7-4-2为控制不同溶氧浓度对MTG发酵的各项指标分析。可以看出，(1)控制溶氧浓度10%进行发酵时，除了细胞干重与Ycell，其它发酵指标均最高；(2)Ycell与细胞干重有一致的变化趋势，当溶氧浓度从35%降至5%时，Ycell从0.934 g/g降至0.683 g/g；(3)当溶氧浓度从35%降至10%时，YMTG从139.8 u/g升高至182.4 u/g，PMTG从59.3 u/(L(h)提高到76.0 u/(L(h)。综上所述，高溶氧浓度有利于细胞生长，但不利于细胞产酶，因此在产酶期必须控制合适的溶氧浓度(如10%)。 四、搅拌及溶氧浓度控制模式 从前面的研究可知，在MTG发酵过程中，过高的搅拌转速对细胞的生长不利，也不利于酶的合成，而适当低溶氧时，MTG酶活、YMTG、生产强度均较高。所以对MTG正常的发酵可提出如下搅拌及溶氧浓度控制策略：在32 h前可采用400 r/min进行发酵，32 h后采用300 r/min发酵，同时控制溶氧浓度10%。发酵过程曲线如图7-4-13所示，过程溶氧浓度的变化如图7-4-14所示。

图7-4-13 分阶段搅拌及溶氧控制策略过程曲线 图7-4-14 分阶段搅拌及溶氧控制策略 ◆ 细胞干重；▲ 淀粉; ■ MTG 酶活 过程的溶氧浓度变化曲线 与图7-4-1及图7-4-5进行比较，在发酵前期菌体量及MTG酶活均没有提高，但在发酵中后期，菌体生长速率降低，最大细胞干重与400 r/min时的菌体量相当，MTG酶合成速率则提高明显，最终MTG酶活显著提高，表明在发酵中后期，适当降低搅拌转速和控制较低的溶氧浓度可刺激细胞大量合成MTG。 五、MTG发酵体系的搅拌功率 (一)MTG发酵体系的流变学特性 放线菌和霉菌的发酵液都具有明显的非牛顿流体特性，粘度是影响流体流动状态的最重要的性质，对泵输送、物料混合、热量传递和质量传递以及通风搅拌都有显著影响，而这些因素又大大地影响着工艺过程的设计和经济核算。 对牛顿和非牛顿流体，均可用式(7-4-1)表示其流变学特征。 　　
　　　　　　 (7-4-1) 对牛顿流体：n=1，K=
为常数 彬汉塑流体　n=1，K＝
为常数 拟塑性流体　n<1，n愈小，拟塑性愈强 膨胀性流体　n>1，n愈大，膨胀性愈强 对n>1或n<1的情况
，因为
　　　　　　　　　　　　　　 (7-4-2) 
图7-4-15 不同发酵阶段发酵液的流态曲线 时间∶◆ 24 h；■ 18 h 式中
为刚性系数(或塑性粘度)，K为均匀性系数，n为流动特性指数，
为流体的剪应速率(1/s)，(为流体的剪应强度(N/m2)，
为流体的粘度(N(s/m2)。 用旋转式粘度计测定不同发酵阶段发酵液的流态曲线如图7-4-15所示。从图7-4-15中可以看出，曲线从原点出发，随着
的增大，曲线的斜率减小，所以MTG发酵体系表现为典型的拟塑性流变特征，且不同发酵阶段发酵液的流态曲线不同。

图7-4-16 (p的变化曲线 图7-4-17 (y的变化曲线 图7-4-16和图7-4-17分别为搅拌转速400 r/min时分批发酵过程塑性粘度变化曲线及屈服剪应强度(
)变化曲线。可以看出，发酵液塑性粘度
及屈服剪应强度
均随着发酵时间变化而明显变化，而且两者的变化是同步的。这是因为拟塑性发酵液的显示粘度并不唯一地决定于
，还决定于它的均匀性系数K和流动特性指数n，K和n随微生物的生长过程而变化(如发酵18 h，K=0.775，n=0.317；发酵24 h，K=0.790，n=0.375)。从图7-4-16中还可以看出，粘度变化过程与细胞干重变化过程在发酵30 h前较为一致，随着细胞干重的浓度不断增大，体系粘度也急剧增大，30 h后细胞干重的增加较小，达到最大值后基本保持不变，而体系的塑性粘度则降低较快。 (二)MTG发酵体系的搅拌功率的计算 通气搅拌罐是工业上使用范围最广的一种通用发酵罐，它既具有机械搅拌装置又有压缩空气分布的装置。高粘度发酵体系，良好的传质需要有较高的动力消耗，在机械搅拌发酵罐中，搅拌器输出的轴功率P与下列因素有关：搅拌罐直径D(m)、搅拌器直径d(m)、液柱高度HL(m)，搅拌器形式、搅拌器转速N(r/min)、液体粘度(p(Pa·s)、液体密度((kg/m3)、重力加速度g(m/s2)以及有无挡板等。由于搅拌罐直径D、液体高度HL与搅拌器直径d之间有一定的比例关系，故可用搅拌器直径d来替代。因此对牛顿型流体，可得无因次关系式(7-4-3)。 　　
(7-4-3) 其中Re为雷诺准数，Fr为搅拌下的弗鲁特准数。且：
，
(7-4-4) 搅拌器输出的功率准数与流体的流动状态有关。当流体处于湍流状态，即Re>104时，Np保持恒定。 Np=Kp=103
(7-4-5) 其中Np为功率准数，P0为不通气时搅拌器输入液体功率(kw)，N为搅拌器转速(r/s)。对圆盘六平直叶涡轮，其值为6。当Re
时，即流体处于过渡流和滞流状态时，Np随着Re变化而变化。算出Re，通过查Re-Np图即可以求得Np。则不通气时，搅拌器的输出功率为：
(7-4-6) 当发酵罐内发酵液密度为0.8～1.65 g/cm3时，通气搅拌功率为：
(7-4-7) 其中Pg为通气时的搅拌功率(kw)，Q为通气量(m3/min)，N为转速(r/min)。非牛顿流体的平均切变率一般与搅拌转速成正比：
(7-4-8)
为比例系数，其值在10(13之间，通常取11.5，平均误差在16%之内。对于非牛顿流体搅拌轴功率的计算方法与牛顿流体搅拌轴功率的计算一样。但非牛顿流体的粘度是随着搅拌器转速而变化的，因而必须先知道粘度与搅拌器转速的关系，才能计算不同搅拌转速时的Re，根据拟塑性流体的Np-Re关系图查得Np，继而求得Pg。
图7-4-18 发酵过程中搅拌功率的变化 ▲ P0；◆ Pg 用上述方法求得发酵过程中搅拌功率的变化如图7-4-18所示。所用参数如表7-4-3所示。计算过程中发现发酵体系在400 r/min时，10<Re<6000，表明所用体系在400 r/min时流动状态处于过渡态。工业生产中，采用大型发酵罐进行发酵，发酵体系的流态常处于湍流区，发酵体系的功率消耗就会稳定在一个固定的值。 表7-4-3 发酵体系参数 (/kg(m-3 Q/m3(min-1 N/r(min-1 D/m  1100 0.002 400 0.07  (三)MTG发酵体系的混合及传氧系数 传氧是反应器设计和反应过程控制中需考虑的一个重要参数。氧的传递速率是生物反应系统的一个限制性因素，同时也是反应器放大的一个重要参数。氧的传递能力的好坏是由体积氧传递系数kLa来衡量的，它受流体物性，反应器尺寸，操作条件等各方面的影响。氧的传递效率还受微生物种类、形态及浓度的影响。不同的微生物，在相似的物理条件下，其氧传递速率的差别却很明显。微生物和微生物产物的存在影响聚结和破碎，而形态则影响粘度，内在粘度的增加会使氧传递速率大为下降。特别是对丝状菌发酵液，情况的改变更加复杂化。有人证明，在亚硫酸盐水溶液中添加1.35%的死菌丝体，kLa下降50％。但未见MTG发酵液传氧性能的报道，因此研究了MTG发酵体系的混合及传氧系数，为MTG的工业化生产提供依据。图7-4-19为不同搅拌转速下，不同浓度细胞量的溶液中kLa的变化过程。
图7-4-19 不同搅拌转速下kLa随细胞干重的变化 搅拌转速(r/min): ◆ 400; ■ 300; ▲ 500; ＊ 600 不同搅拌转速下，kLa的变化趋势一致，随着细胞浓度的不断增大，kLa急剧降低，表明菌体浓度对传氧效率有很大影响。随着菌体浓度的增大，传氧效率急剧下降。MTG发酵时，随着发酵的进行，菌丝球的形态明显地发生改变，形态上的这些变化使塑性粘度急剧增大(图7-4-16)，传氧效率急剧降低。当搅拌转速为300 r/min及400 r/min时，kLa降低90%左右。随着搅拌转速的提高，kLa降低速率减慢，到600 r/min时只降低了40%左右。这是因为高的搅拌转速可以将通入培养液的空气分散成细小的气泡，防止小气泡的聚集，增大气液传质面积；搅拌可以使培养液产生涡流，延长气体在液体中的停留时间，提高空气的利用率，并且可以改变气液界面状态，增大传质推动力。 由于kLa的大小是评价发酵罐的重要指标，也是放大的一个重要依据。一般来说，kLa与操作变数之间的关系式可以表示为： 　　
　　　　　　　　　　 　　　　　(7-4-9) 其中K’’为系数，不同体积的发酵罐，其K’’值不同，vs为空截面流速。 通常选择(＝0.4，(＝0.5，(＝0.5，则关系式即为Richards关系式，此关系式在2.5 L至8500 L的试验设备里得到证明。这也是迄今为止获得广泛引用的一个比拟放大的关系式。所以，对于MTG发酵，在小型试验设备里，在一定的操作条件下，获得了满意的实验结果后，求得Pg后，选择合适的参数，按式(7-4-9)即可以求得实际发酵液的kLa，然后根据kLa相等原则放大，因此本节研究为MTG的工业化放大及设备的设计选型提供了必要的参考依据。 符号说明 d: 搅拌器直径(m) DOT: 溶氧浓度(%饱和度) Fr: 弗鲁特准数 K: 流体稠度系数(N(sn/m2 ) K': 系数 K'': 系数 kLa: 氧传递系数(s-1) n: 流动特性指数 N: 搅拌器转速(r/min) Np: 功率准数 P: 功率(w) P0: 不通气搅拌功率(w) Pg: 通气搅拌功率(w) Q: 通气量(m3/min) Re: 雷诺准数 Ycell: 细胞产率(g/g) YMTG: MTG产率(u/g) vs: 通气线速度(m/min) V: 发酵罐工作体积 (: 流体密度(kg/m3) (MTG: MTG比合成速率(u/g/h) (cell: 比生长速率(h-1) (p: 塑性粘度(Pa s) (: 液体剪应强度(Pa) (y: 液体屈服剪应强度(Pa) d(/d(: 切变率(1/s) 第五节 茂原链轮丝菌的菌丝球形态与产酶之间的关系 一、引言 从第四节可知，发酵过程中搅拌对细胞生长及MTG酶活影响很大。S. mobaraense发酵生产MTG时会产生菌丝状或菌球体状的形态，搅拌过程中的剪切力直接影响菌丝球形态及菌球大小从而影响MTG酶活，因此，研究S. mobaraense菌丝球生长及其工程特性具有重要的意义。在采用霉菌、放线菌生产抗生素、酶制剂等发酵产品时，会产生菌丝状或菌球体状的形态。菌球体的生成与否，菌球体的大小，因菌种、培养条件等不同而异。 国内外报道黑曲霉的柠檬酸发酵，土曲霉的衣康酸发酵，米根霉的L-乳酸发酵等都是以菌球体增殖方式进行的，并且发酵过程中形成的菌球体越多、越小，产量越高。青霉素生产菌产黄青霉以菌丝状增殖时，发酵液变粘稠，降低了溶解氧和营养物质的传递速率，若生成大的菌球体，则从发酵液到菌球体内部的传质也会受到限制。从培养基的流动性和物质的传递性考虑，认为形成直径为0.4～0.5 mm以下的细小菌球体比菌丝状增殖形态优越，且发酵罐内的搅拌混合好，发酵液的后处理也很容易。 在MTG发酵过程中，观察到发酵液中存在菌丝状或菌球体状的形态，且菌球体的大小直接影响MTG酶活。因此，本节首先从理论了探讨了菌球体的生成以及菌球体内氧的传递，然后研究了由于工艺条件控制的差异而造成MTG发酵过程中菌丝成球现象。在此基础上，探讨了S. mobaraense液体培养时，产生不同增殖形态的原因，以及不同增殖形态对MTG酶活的影响，得出了控制最适菌球大小的方法，并在实验中进行了验证。 二、菌丝球形成过程的理论分析 在MTG发酵过程中，当所形成的菌球大小超过一定尺寸时，会被机械搅拌作用打碎成两部分或更多部分，这些打碎的子菌球则成为下一个菌球形成的核心继续进行生长，最终形成的菌球大小一致。也就是说，搅拌作用的打碎与菌球生长之间存在动力学平衡，使得菌球平均大小保持在一定范围内，在这种情况下，菌球就成为生长单元。 (一)菌丝球形成过程及生长模型研究 在丝状菌发酵过程中，对有关搅拌作用引起菌丝球破碎的研究报道较多，但这些报道都偏重于研究菌球打碎动力学或如何确定菌球最大稳定尺寸，而对菌球大小、菌球形成的演变过程及菌球大小的分布研究较少。图7-5-1为菌丝球顶端生长图。 贴照片 图7-5-1菌丝球顶端生长图 为了建立菌球的生长模型，我们提出如下假设：(1)菌球在没有破碎的情况下，具有最大直径；(2)破碎频率与大菌球的表面积成比例；(3)菌球的平均稳定直径只与剪切作用成比例；(4)单个菌球为一个生长单元，菌球体打碎成两个菌球或多个菌球后，这些新的菌球则成为新的菌球生长单元；(5)菌球被打碎前以恒定的生长速率生长。 根据以上假设，直径为Dj的单个菌球的顶端生速率为：
(7-5-1) 其中
是顶端生长的速率常数，若菌球密度(为常数，则第j个菌球的生长为：
(7-5-2) 其比生长速率为:
(7-5-3) 当菌丝球直径生长超过平均稳定直径时，由于机械搅拌作用，菌球被打碎，因此菌球打碎与菌球生长之间存在动力学平衡。打碎概率与菌球直径大小(Dj)、搅拌转速(Nr)等有关，在时间间隔[t，t+dt]内，打碎动力学为：
(7-5-4) 其中
为第j个菌球或菌丝的打碎概率，
为菌球的破碎常数，
是菌球的平均稳定直径，且： 　　
(7-5-5) 方程(7-5-4)较为准确地描述了：(1)不存在打碎时，菌球有最大稳定直径；(2)打碎频率与大菌球的表面积成正比。 由于打碎菌球是随机过程，因此当菌球被打碎后，子菌球之间的质量分布是随机的，体积比在50/50(99.9/0.1之间，所以根据
，最小子菌球的直径是母菌球直径的1/10。为简化起见，假设子菌球的生物量分布是均匀分布，并严格限制大菌球之间的分布，因此形成的子菌球直径介于菌球直径与小菌球直径之间。计算菌球直径及数量时，假设菌球的直径和数量有相同的权，根据发酵过程中菌球直径分布，用上述打碎动力学方程可以计算发酵过程中菌球大小及菌球数量。 (二)模型参数的确定 生物技术过程的数学模型，实际上是过程输入向量、输出向量和状态向量之间的数学表达式。在研究一个被控系统过程时，通常建立的输入输出模型是：
(7-5-6) 式中：Y为系统的m维输出向量；X为系统的r维输入向量；K为要估计的n维未知参数。按一定的实验方案对被控过程进行一定的观测，取得m组数据 　　　
　 (7-5-7)
中参数
即由这m组数据决定。 描述生物技术过程物性的模型多为非线性，最小二乘法又是一种最基本、应用很普遍的估计方法。对于一般的非线性模型，其形式和观测数据如式(7-5-6)及式(7-5-7)所示，按离差平方和最小的估计原则，其性能指标为∶
(7-5-8) 若按多元函数求极值的方法对
求偏导并令其为零，可得到一组非线性方程，然而这类方程往往复杂以至于难以求解，因此有必要寻找一些简便而实用的方法。数值解法不受参数数量多少的限制，不受动力学形式和实验方法的约束，因而具有普遍的适用性。通过设定初始K0以及初始状态给定下，在获得模型的数值解后，按离差平方和最小原则，确定性能指标，求取模型中的K值。常见的方法有单纯形搜索法、最快下降法等数值寻优方法。单纯形法是一种通过比较性能指标
值的大小，直接寻找J最小值的方法。图7-5-2为系统辨识过程中采用计算机程序进行微分方程模型参数估计的基本框图。
图7-5-2 用数值法求解复杂方程形式数学模型中参数的基本程序框图 三、茂原链轮丝菌摇瓶种子菌丝状及菌球体状的形态 有学者认为，丝状菌在液体培养基中能否形成菌球体生长主要取决于发芽期孢子的行为。孢子发芽形成菌丝，菌丝互相缠绕形成菌球体，少量仍以菌丝体存在，菌球体外层由幼龄的分枝菌丝结扎而成。由内向外越来越疏松，其核心部分高度紧密成实心状。在发酵过程中，常存在菌丝状及菌球体状两种增殖形态，且有的菌球体外观平滑致密，有的粗糙蓬松。如图7-5-3所示，A为菌丝体，B为外观平滑致密的菌球体，C为外观粗糙蓬松的菌球体。 图7-5-3 S.mobaraense的菌球形态 (A: 菌丝体；B: 外观平滑致密的菌球体；C: 粗糙蓬松的菌球体) 四、培养条件对茂原链轮丝菌增殖形态及MTG发酵的影响 影响丝状菌增殖形态的因素主要有菌种的遗传特性、菌种培养的条件包括斜面种子传代代数、培养基、搅拌、溶解氧浓度、接种量等。 (一)摇瓶条件对菌球体形态及MTG发酵的影响 (1)斜面孢子接种量的影响 斜面孢子接种量对丝状菌增殖形态影响较大。前人的实验结果表明，接种量与菌球体的形成及菌球体的大小有明显关系，当接种量高于104/mL，则形成菌丝状，而接种量低于104/mL的数量级，才能形成菌球体。 在MTG发酵的种子培养过程中，斜面孢子接种量对摇瓶种子菌丝增殖形态的形成有很大影响，当接种量太小时，种子培养液中只有几十个甚至几个巨大的菌球存在，但接种量太大时，又只能形成菌丝体。只有接种量较适宜时，才能形成菌球体大小较为一致的种子。如表7-5-1所示，当接种量为102数量级时，形成的菌球个数较少，菌球直径较大，这是由于在发芽时期，孢子零散地发芽，当孢子接种量较少时，菌丝自身缠绕成球，或者还没有发芽的孢子被刚发芽的菌丝缠绕凝聚在一起，凝聚菌块的菌丝分枝生长，在摇瓶振荡条件下，慢慢变大，逐渐形成菌球体。从表中还可以看出，当孢子接种量较大时(>104)，形成的菌球直径较小，菌球数量较多，这是由于孢子接种量较大时，会形成大量数量的孢子聚结物，导致大量数量的菌球形成，且这些菌球在尺寸较小时就停止了生长，所以较大孢子接种量形成菌球数量较多，尺寸较小。 表7-5-1 斜面孢子接种量对菌球大小、数量的影响 接种量 /102孢子(mL-1 菌球数量 / 个(mL-1 直径 /mm  1.05 0.6 0.968  2.1 1.2 0.67  10.5 13 0.212  15.75 25.3 0.190  21 37.5 0.225  31.5 391 0.226  42 665 0.206  105 13780 0.146  210 19240 0.137  315 22800 0.059   在摇瓶条件下，将上述不同孢子接种量下的种子接入发酵瓶，考察孢子接种量形成的种子的菌球大小、数量对发酵时MTG酶活的影响，结果见表7-5-2。 表7-5-2 斜面孢子接种量形成的种子的菌球大小、数量对发酵时MTG酶活的影响 接种量 /102孢子(mL-1 MTG酶活 /u(mL-1 剩余淀粉浓度 /g(L-1 直径 /mm 菌球数量 / 个(mL-1  1.05 0.87 4.66 0.968 0.6  2.1 1.49 5.15 0.67 1.2  10.5 2.49 5.49 0.212 13  15.75 1.930 7.84 0.190 25.3  21 2.469 12.95 0.225 37.5  31.5 2.105 12.95 0.226 391  42 2.099 8.28 0.206 665  105 1.780 4.30 0.146 13780  210 1.53 4.16 0.137 19240  315 1.09 4.47 0.059 22800   从表7-5-2可以看出，不同孢子接种量形成的种子菌球大小、菌球数量对产酶影响很大。孢子接种量<103个孢子/mL时，形成的种子菌球直径较大，约1mm，菌球数＜10个/mL，MTG酶活较低；当接种量在103(104个孢子/mL之间，种子菌球数为10(104个/mL，菌球直径在0.2mm左右，MTG酶活较高；接种量>104/mL，菌球数大于104个/mL，种子菌球直径低于0.15mm，MTG酶活亦较低。由此可见，合适的孢子接种量范围为103(104个孢子/mL，此时形成合适的种子菌球大小及菌球数量，有助于提高MTG发酵水平。 (2)种子接种量的影响 在固定斜面接种量的情况下，考察了MTG摇瓶发酵中种子接种量对发酵时菌球大小及产酶的影响，如表7-5-3所示。 表7-5-3 种子接种量对菌球大小、数量及MTG酶活的影响 接种量 /% MTG酶活 /u(mL-1 剩余淀粉浓度 /g(L-1 细胞干重 /g(L-1 直径 /mm 菌球数量 / 个(mL-1  2 0.79 9.18 12.95 0.41 370  5 1.69 2.75 14.95 0.29 610  10 1.85 2.40 15.75 0.22 1970  15 1.76 2.23 14.85 0.14 3350  20 0.96 2.05 13.32 0.10 3970  从表7-5-3中可见，随着种子接种量的增大，菌球数与接种量成比例关系，可用下列方程表示： y=-206.098+217.31x　　　　　　 　　　　　　　(7-5-9) 式中，y表示菌球数，x表示接种量。计算值与实验值比较结果如图7-5-4所示。从图7-5-4及表7-5-2中可以看出，随着接种量的增加，发酵瓶的菌球数也成比例增大，但MTG酶活并没有成比例的增加，此结论与前人的研究不一致。为了获得较高的MTG酶活，合适的菌球数量范围为500-2500个/mL。这样，对于MTG发酵，最适接种量范围为5%～15%。
图7-5-4 不同接种量对菌球数量的影响。点为实验值，线为方程计算值 (3)摇瓶转速的影响 在MTG摇瓶发酵中，考察了不同转速对菌球大小、数量及MTG酶活的影响，如表7-5-4所示。从表中可以看出，不同的摇瓶转速下，菌球大小相近，MTG酶活相差不大，200 r/min时的菌球数量稍高于150 r/min时的菌球数量。 表7-5-4 摇瓶转速对菌球大小、数量及MTG 酶活的影响 搅拌速度 /r(min-1 MTG酶活 /u(mL-1 剩余淀粉浓度 /g(L-1 细胞干重 /g(L-1 直径 /mm 菌球数量 / 个(mL-1  200 1.85 2.40 15.75 0.22 1970  150 1.74 3.98 12.82 0.215 1820   (4)装液量的影响 考察了500mL三角瓶装液量分别为20mL，30mL，50mL，80mL，100mL，140mL，180mL时菌球大小、数量及MTG酶活的影响，结果如表7-5-5所示。从表中可见，500mL三角瓶最适装液量为100mL。 表7-5-5 装液量对菌球大小、数量及酶活的影响 体积 /mL MTG酶活 /u(mL-1 剩余淀粉浓度 /g(L-1 细胞干重 /g(L-1 直径 /mm 菌球数量 / 个(mL-1  20 0.46 4.30 15.35 0.9 1264  30 0.78 3.47 14.58 0.7 1524  50 1.23 2.92 14.5 0.55 1664  80 1.44 2.92 15.7 0.4 1760  100 1.91 3.13 15.2 0.24 1824  140 1.57 3.37 15.2 0.19 1850  180 1.36 8.07 14.6 0.10 1840  (二)摇瓶发酵过程中菌球体的形成过程 菌丝的生长动力学（如菌丝顶端的扩张速率以及出现分枝的频率）以及菌丝被打碎的速率决定了丝状菌的形态。菌丝球形成过程如图7-5-5所示，从图中可以看出，菌丝成球过程可分成以下三个阶段：(1)菌丝萌发和开始分枝；(2)疏松凝聚物的形成。分枝的菌丝以凝集菌块为核心，相互缠绕形成直径为0.05～0.1 mm的疏松聚合物，所以聚合物具有固体核心；(3)菌球体生成。在摇瓶振荡条件下，第二阶段中形成的疏松聚合物的菌丝分枝不断生长，疏松聚合物慢慢长大，逐渐形成一定菌球大小的菌球体。 贴照片（三张） 图7-5-5 摇瓶发酵过程中菌丝球形成过程照片 (三)摇瓶培养过程的菌球大小分布及菌球数量 种子的生长、菌球及菌核直径变化的时间过程曲线如图7-5-6所示。从图中可见，在种子的生长过程中，菌球及菌核直径随着时间不断增大，30 h后，触角区域(annular region)的扩张明显比核大小的改变显著，30 h左右通过显微镜还观察到菌球的破碎，即一个菌球从中间分成两个或更多个，菌核的当量直径因此发生了改变，图7-5-8为种子20 h及36 h菌核当量直径的分布图。
图7-5-6 种子菌球及菌核平均当量直径及细胞干重的变化 　
图7-5-7 发酵过程中菌球及菌核平均当量直径及细胞干重的变化 ■ 菌球直径；▲ 核直径；◆ 细胞干重 图7-5-7为发酵过程的细胞生长、菌球及菌核直径变化的时间曲线。可以看出，在摇瓶发酵过程中，菌球及菌核直径的改变明显不同于种子生长过程。在0～20 h内，菌球及菌核当量直径急剧降低，20 h后两者开始增大，当增至36 h左右，核直径保持不变，而菌球直径继续增至50 h左右。发酵过程中之所以有菌球及菌核直径的这种变化，是因为发酵前期细胞的生长主要以菌球的破碎为主，发酵中后期菌球的破碎和生长则同时进行。图7-5-9为发酵过程中菌球的直径分布。
　　
图7-5-8种子菌核直径的分布A：20 h，B：36 h

图7-5-9 发酵过程中菌球直径的分布A：20 h，B：36 h 比较图7-5-6和图7-5-7可以看出，发酵结束时，菌球及菌核直径小于种子的菌球及菌核直径，并且菌核直径为其菌球直径的2/3左右。 图7-5-10为种子及发酵过程中菌球数量的变化过程曲线。在种子的生长过程中，在20～40 h范围内，菌球的数量剧增，40 h后增加缓慢。在发酵过程中，菌球数量缓慢增加，至50 h左右逐渐停止。
图7-5-10 菌球数量的变化过程曲线 ◆ 摇瓶种子；■ 摇瓶发酵 (四)小罐培养中搅拌及溶氧浓度对菌球大小及数量的影响 由于发酵过程中菌球大小及数量会对最终MTG酶活产生较大的影响，因而有必要考察搅拌及溶氧浓度对菌球大小及数量的影响。图7-5-11为不同搅拌转速下发酵36 h样品菌球直径的分布情况，表7-5-6为搅拌转速对最终菌球平均当量直径、数量及MTG酶活的影响。



图7-5-11 不同搅拌转速下菌球直径的分布 (A: 300 r/min, B: 400 r/min, C: 500 r/min, D: 600 r/min)。(36h样品) 从图7-5-11及表7-5-6可以看出，不同搅拌转速下，菌球直径的分布明显不同。当搅拌转速为300 r/min时菌球直径主要分布在200 (m左右；搅拌转速为400 r/min时，菌球直径主要分布在150 (m~250 (m；搅拌转速为500 r/min时，菌球直径分布较宽，且各种直径的菌球的几率差别不大；搅拌转速为600 r/min时，与其它搅拌转速不同，菌球直径主要分布在两端，且以小直径菌球分布为主。与MTG酶活联系起来，表明最佳的产酶菌球直径为200 (m，而且发酵液中菌球大小越均一，产酶越高，较低及较高的菌球直径均不利于产酶。 表7-5-6 不同搅拌转速条件下菌球体大小、数量及MTG酶活的变化 搅拌转速 /r(min-1 MTG酶活 /u(mL-1 细胞干重 /g(L-1 直径 /mm 菌球数量 / 个(mL-1  300 3.65 18.1 0.198 2250  400 2.85 21.7 0.202 2243  500 2.2 17.5 0.345 1590  600 2.03 14.6 0.143 773  溶氧浓度对通风发酵来说也是一个非常关键的控制参数。对于丝状菌发酵，溶氧浓度对其影响尤为显著。表7-5-7为溶氧浓度对菌球直径分布、数量以及MTG酶活的影响。从表中可以看出，控制不同溶氧浓度对菌球大小的分布明显不同，当溶氧浓度控制为10%时，菌球直径主要集中于150 (m~250 (m之间，MTG酶活最高。所以，后期可控制较低的溶氧浓度使菌球大小分布保持在很狭窄的范围内，维持较高的产酶水平。 表7-5-7 溶氧浓度对菌球大小分布、数量以及MTG酶活的影响 溶氧浓度/% 35 20 10 5  直径 / mm 0.340 0.252 0.205 0.197  菌球数量 / 个(mL-1 2068 2452 2560 2579  细胞干重 / g(L-1 23.2 19.9 17.5 15.8  MTG酶活 / u(mL-1 2.85 3.05 3.6 3.3  直径<150 / (m 0.03 0.09 0.03 0.46  直径=150~250/ (m 0.24 0.68 0.89 0.52  直径>250 / (m 0.73 0.23 0.08 0.02  五、MTG小罐发酵过程中菌球的形成过程 MTG小罐培养过程中菌球体的形成过程如图7-5-12所示。从图中可以看出，小罐中菌球体的形成过程与摇瓶培养中菌球体的形成过程较为一致。 贴照片（三张） 图7-5-12 分批发酵过程中菌丝球形成过程照片 在MTG的小罐发酵过程中，S. mobaraense分批培养的单个菌球的物理特性常数如表7-5-8所示。采用龙格库特法求取方程的数值解，用单纯形法对较为典型的搅拌转速400 r/min时的实验数据进行拟合，寻出最优参数，如表7-5-9所示。图7-5-13为搅拌转速400 r/min菌球当量直径及菌球的数量的实验值与模型值曲线。从图中可以看出，除了个别点之外，菌球当量直径及菌球数量的测量值与模型值较吻合，表明式(7-5-4)能较好地描述菌球的形成过程。 表7-5-8 发酵体系及菌球特性参数 参数 ( / kg(m-3 Di / m ktip / m(h-1 Nr / r min-1  数值 58.3 0.07 3*10-7 400  表7-5-9 模型参数值 参数 keq kfr  Value 0.0395 3.176*104   其中(为菌球密度，Di为搅拌器直径，ktip为菌球的顶端生长速率，Nr为搅拌转速。
图7-5-13 菌球当量直径及菌球数量的实验值与模型值(点为实验值) ▲ 直径；＊ 菌球数量 六、菌球大小与产酶之间的关系 根据前面的研究可以发现摇瓶及小罐培养条件下，产酶与最终菌球大小之间具有一定的关系，归纳如图7-5-14所示，可见，最终菌球大小直接决定了酶的产量，菌球大小与MTG酶活之间存在一个独特的关系，过高和过低的菌球大小均不利于产酶。在S. mobaraense的次级代谢过程中，对于较大菌球，菌球内传质阻力较大，氧进入菌球的速率较低，越接近菌球中心，氧浓度越低，底物利用速率受到限制，对产酶不利；较小菌球，传质阻力较小，传氧进入菌球速率较高，即使菌球中心氧浓度也较高，这可能导致MTG的-SH基氧化，使MTG失活。此外，氧浓度过高，也可导致蛋白酶水平增高，由于MTG酶的催化交联性质，因此导致MTG自身酶活降低。

图7-5-14 菌球体形态与MTG酶活之间的关系 (A: 摇瓶，B: 小罐) 根据图中点的分布情况，我们提出经验关系式(7-5-10)来描述摇瓶条件及小罐培养时菌球大小与产酶之间的关系，式中各参数值如表7-5-10所示。用迭代法求取方程数值解，用单纯形法对参数进行寻优。方程计算值与实际值如图7-5-14所示，可以看出，除个别点之外，方程(7-5-10)能较好描述摇瓶及小罐培养条件下菌球大小与产酶之间的关系。
(7-5-10) 其中U为MTG酶活，d为菌球直径，ki(i=0(5)为六个经验常数。 表7-5-10 方程(7-5-10)中各参数值 参数 k0 k1 k2 k3 k4 k5  摇瓶 0.002047 0.020426 0.016428 -0.00502 0.028837 0.051742  发酵罐 0.018673 0.398408 -0.11657 0.001218 -0.04994 0.76885  七、控制菌球增殖形态的策略的确定及验证 通过前面的研究可以发现，要使MTG发酵产量较高，首先必须保证种子的正常菌球形态，合适的斜面孢子接种最为：103数量级。摇瓶发酵控制策略：种子接种量范围：5%(15%，装液量：500 mL三角瓶100 mL，摇瓶搅拌转速：150 r/min(200 r/min。在此条件下进行实验验证，结果如表7-5-11所示。 表7-5-11 摇瓶控制策略的实验结果 MTG酶活 /u(mL-1 剩余淀粉浓度 /g(L-1 细胞干重 /g(L-1 直径 /(m 菌球数量 / 个(mL-1  2.35 6.8 14.3 218 2035   
图7-5-15 运用控制策略进行发酵的菌球大小分布 在小罐发酵中，一方面必须控制合适的菌球范围(200 (m左右)，另一方面，必须使菌球均一，因此根据前面的研究可用如下的控制合适菌球大小的策略：在发酵的前32 h，采用搅拌转速为400 r/min，32 h后降低搅拌转速至300 r/min，同时控制溶氧浓度10%进行发酵，实验结果如图7-4-13所示，菌球直径的分布如图7-5-15所示。最终MTG浓度可达4.25 u/mL，比单一搅拌转速控制溶氧浓度10％发酵时MTG酶活提高了16%。比较图7-5-15与前面的各搅拌转速下的菌球直径分布图，发现菌球大小更加均一，200 (m左右的菌球占总菌球量的75%左右，由此也表明了控制策略的合理性。 符号说明 d: 菌球直径(mm) Dav: 平均菌球直径(m) De: 菌球中有效扩散率(m2/s) Deq: 菌球最大稳定尺寸(m) Di: 搅拌期尺寸(m) Dj: 第j个菌球直径(m) keq: 常数 kfr: 菌球破碎常数 ki(i=1(5): 常数 km: 氧传递动力学系数(g/m3) ktip: 顶端生长的速率常数，菌球生长的线速度(m/h) Mj: 第j个菌球质量(g) n: 菌球数量(1/mL) Nr: 搅拌器转速(r/min) Pbrj: 第j个菌球或菌丝体的打碎概率 U: MTG 酶活(u/mL) (: 干密度(g/m3) 第六节 谷氨酰胺转胺酶分批发酵过程中氨基酸代谢流分析 一、引言 游离氨基酸在MTG发酵中后期起着十分重要的作用。为了解游离氨基酸在MTG合成过程中的作用以及MTG合成对各种氨基酸的需求情况，有必要对MTG氨基酸代谢流进行分析。由于MTG的代谢途径非常复杂，对其代谢途径中单个氨基酸合成细胞蛋白质和MTG的代谢途径进行详细分析非常困难，若通过对所有重要的代谢流进行分析，建立相应的代谢流质量平衡方程，则有助于理解代谢模式，优化MTG的发酵过程，从而提高MTG的发酵水平。 本节基于代谢流分布的质量平衡理论，首先对MTG合成过程中氨基酸代谢流分布进行理论分析，在此基础上对MTG发酵过程中各种氨基酸的变化进行了较为详细的分析，由此寻求影响MTG分批发酵过程的关键因素，从根本上提出解决问题的方法。 二、理论分析 (一)MTG的组成 MTG是由331个氨基酸残基构成的单多肽链，各氨基酸组成如表7-6-1所示，其中Asp，Asn，Glu，Ser，Pro，Ala，Gly和Arg等8种氨基酸的序列数达到20个以上，Thr，Gln，Val，Leu，Tyr，Phe和Lys等7种氨基酸的序列数在10～20之间，剩下5种氨基酸在10个以下，可见MTG中各种氨基酸的组成差异较大，在酶合成过程中对各种氨基酸的需求也不一样。 表7-6-1 MTG氨基酸组成 氨基酸 序列数 氨基酸 序列数 氨基酸 序列数  Arg 30 Pro 21 Gln 10  Asp 26 Lys 18 Trp 9  Ala 26 Val 17 His 8  Gly 26 Phe 16 Met 6  Ser 27 Tyr 15 Ile 5  Glu 23 Thr 14 1/2Cys 1  Asn 21 Leu 12    总氨基酸 331  (二)氨基酸的质量平衡 20种氨基酸在MTG合成过程中发挥着重要的作用，细胞蛋白质的合成也需要大量的氨基酸，若对氨基酸的代谢流分布进行分析，则可从根本上提高MTG的发酵水平。在分批发酵过程中，对于某个氨基酸i，根据质量守衡定律，它的变化速率可用质量守衡方程表示。i氨基酸从细胞进入培养基中(或从培养基被吸收进入细胞)的速率，可以用它在两个时间间隔之间的浓度变化表示出来，如式(7-6-1)所示：
mmol/(L(h) (7-6-1) 其中
是第i个氨基酸从细胞进入培养基中的速率，如果式(7-6-1)为负值则表示菌体从培养基吸收氨基酸进入细胞。 根据总质量守衡，第i个氨基酸代谢流如图7-6-1所示。可见绝大多数氨基酸的代谢流由四个部分构成：(1)从细胞流向培养基(或培养基到细胞)，浓度变化用式(7-6-1)表示；(2)细胞物质的合成(
)；(3)胞外蛋白质包括产物MTG的合成(
)；(4)中间代谢产物的合成(或/和中间代谢产物转化成氨基酸)，如氨基酸自身的合成(
)或转化成其它氨基酸。
图7-6-1氨基酸代谢的示意图 （Asp, Glu 和Ser除外，第i氨基酸与中间代谢产物之间只存在一个反应） 总浓度变化用下式表示：
(7-6-2) 或：
mmol/(L(h) (7-6-3) 其中：
是时间间隔
(
)之间氨基酸的变化速率；
、
和
分别是时间间隔
(
)之间细胞干重、MTG和第i个氨基酸的浓度变化，单位分别是(g/L)、(g/L)和(mmol/L)；
、
分别是第i个氨基酸合成细胞物质和MTG产物的化学计量系数(mmol/L)，这两个系数给出了第i个氨基酸和细胞物质及MTG产物合成之间定量关系。 (三)代谢网络图
图7-6-2 S. Mobaraense胞内代谢反应网络 由于微生物体内糖酵解途径(EMP)和三羧酸循环途径(TCA)普遍存在，因而这些途径也存在于S. mobaraense，其代谢流网络如图7-6-2所示。从图7-6-2中可以看出，在三羧酸循环途径中，丙酮酸(Pyr)羧化形成草酰乙酸(OAA)，再进一步代谢形成一些氨基酸合成的前体，代谢反应方程如表7-6-2所示。除了Asp、Glu和Ser三种氨基酸外，其它17种氨基酸均直接参与细胞物质和蛋白质产物(MTG)的合成，并且和中间代谢产物之间只存在一种反应，如表7-6-2所示；而Asp、Glu和Ser三种氨基酸除了存在上述反应，还参与形成其它氨基酸，如从Ser→Cys、Asp→Met和Glu→Arg等，这三种氨基酸的生成速率可由代谢流网络图7-6-2得到，具体关系如下式所示。
(7-6-4) 表7-6-2 S. mobaraense的代谢反应 可直接测量代谢流量的反应∶ 1. Glc+ATP=G6P 2. 2.5AcCoA+0.087AKG+0.071F6P+0.0205G6P+0.129GAP+0.619G3P+0.754R5P+0.051PEP+ 0.028OAA+0.028Pyr+0.21ATP=细胞量(mol/g) 3. 0.454Ala+0.252ARG+0.201Asp+0.101Asn+0.101Cys+0.353Glu+0.201Gln+0.403Gly+0.05His +0.252Ile+0.403Leu+0.403Lys+0.201Met+0.151Phe+0.252Pro+0.302Ser+0.252Thr+0.05Trp+ 0.101Tyr+0.302Val=0.52 细胞蛋白(mmol/g) 4. 0.687Ala+0.792Arg+0.687Asp+0.555Asn+0.264Cys+0.607Glu+0.264Gln+0.687Gly+0.211His +0.132Ile+0.317Leu+0.475Lys+0.158Met+0.423Phe+0.555Pro+0.713Ser+0.37Thr+0.238Trp +0.396Tyr+0.449Val=MTG (mmol g-1 MTG)   可通过方程(7-6-3)计算代谢流量的反应∶ 5. R5P+ATP+Gln=His+AKG+2NADH 6. Ser+AcCoA=Cys 7. Ser=Gly 8. 2PEP+ATP+Gln+Ser=Trp+Glu+Pyr+CO2 9. 2PEP+NADH+ATP+Glu=Tyr+AKG+NADH+2CO2 10. Pyr+Glu=Ala+AKG 11. 2Pyr+NADH+Glu+AcCoA=Leu+AKG+H2O+2CO2 12. Glu+2NADH+ATP=Pro 13. 2Glu+Asp+2ATP+NADH+AcCoA=Arg+AKG 14. Glu+NH3+ATP=Gln 15. Asp+ATP+NH3=Asn 16. Asp+ATP+2NADH+Cys=Met+Pyr+NH3 17. Asp+2ATP+2NADPH=Thr 18. Asp+2NADH+ATP+Glu+Pyr=Lys+AKG+CO2 19. Asp+3NADH+2ATP+Pyr+Glu=Ile+CO2+AKG+NH3   必须通过代谢物平衡才能计算代谢流量的反应∶ 20. G6P=R5P+CO2+2NADPH 21. G6P+ATP=2GAP 22. GAP=G3P+ATP+NADH 23. G3P=PEP 24. G3P+Glu=Ser+AKG+NADH 25. PEP=Pyr+ATP 26. Pyr=AcCoA+CO2+NADH 27. Pyr+CO2+ATP=OAA 28. AcCoA+OAA=Cit 29. Cit=AKG+NADPH+CO2 30. AKG+NH3+NADPH=Glu 31. AKG=OAA+ATP+CO2+2NADH+FADH 32. OAA+Glu=Asp+AKG  (四)代谢流分布的化学计算 胞内的代谢中间产物，如果没有净积累，其累积速率为零。对于氨基酸的代谢流速率，包括20种氨基酸从培养基进入细胞的速率(吸收速率)或从细胞进入培养基的速率(分泌速率)，可以通过发酵液中氨基酸的浓度变化计算得到；20种氨基酸用于菌体生长和MTG合成的速率可通过对发酵液中细胞量及MTG量变化的计算得到；17种氨基酸的生成速率可通过式(7-6-3)计算得到；对于Asp、Ser、Glu的生成速率可通过代谢流平衡式(7-6-4)计算得到，蛋白质含量占细胞干重的0.524（直接测量值）。 三、MTG分批发酵过程分析 为了对MTG分批发酵过程中菌体生长和产物合成过程进行全面了解和认识，更好地实现对MTG发酵过程的控制，有必要对发酵过程中各参数的变化进行详细分析。图7-6-3和图7-6-4为初始淀粉浓度30g/L时MTG分批发酵过程各参数变化情况，包括整个发酵过程中菌体干重、MTG酶活、底物消耗和总氨基酸(包括游离和结合氨基酸)浓度的变化。表7-6-3，表7-6-4和表7-6-5分别为不同阶段发酵氨基酸的变化及代谢流分布。

图7-6-3 分批发酵过程曲线 图7-6-4 分批发酵过程氨基酸的变化 ◆ 细胞干重；▲ 淀粉；■ MTG 酶活 ■ 总游离氨基酸；◆ 总结合氨基酸 从图7-6-3和图7-6-4中可以看出，MTG的分批发酵过程可分为四个阶段，因而主要对四阶段的氨基酸代谢流分布及发酵过程参数了进行探讨。 第一阶段，发酵前期（0～12 h），总氨基酸浓度降低较快，淀粉消耗速率较快，细胞在经过一个较短的延滞期后，即以较快的速率生长。如表7-6-5所示，
均为负值，表明几乎所有氨基酸都被细胞吸收；
较高，菌体迅速生长。由于
(0，因而在这一阶段，氨基酸基本上不用于合成MTG，从图7-6-3中也可以看出MTG酶活增加较少。由于所有
>0.1，所以吸收的氨基酸大量用于细胞物质的合成，除了Ser，Thr，Met，Ile和Lys外，其它
＜0，表明大部分氨基酸也参与中间产物的代谢。表7-6-5(0～12h)第一列所列出的氨基酸合成的重要的反应表明，如果从培养基中吸收的氨基酸不能满足细胞物质的合成，则由中间代谢产物则合成一些氨基酸来满足这种需要，这些代谢流包括Thr、Met、Ile和Lys等氨基酸的合成，
>0 。 表7-6-3 分批发酵过程结合氨基酸浓度变化(浓度单位/mg(L-1) 氨基酸 0h 12h 24h 36h 48h 54h  Asp 1832 1655 1631 1679 1727 1793  Thr 891 793 703 563 541 563  Ser 709 537 456 520 577 624  Glu 3653 3037 2301 1804 1684 1702  Gly 1856 1663 1518 1363 1325 1341  Ala 1640 1379 1025 240 256 369  Cys - - 99 101 106 105  Val 1146 947 838 567 578 533  Met 612 522 469 253 226 227  Ile 820 680 975 313 333 331  Leu 1783 1390 948 462 449 449  Tyr 427 362 328 129 137 144  Phe 810 703 609 299 299 303  Lys 1700 1495 1281 850 846 848  His 406 347 274 229 226 250  Trp - - - - - -  Arg 1215 741 580 456 454 458  Pro 1105 898 812 773 733 704  表7-6-4 分批发酵过程游离氨基酸浓度变化(浓度单位/mg(L-1) 氨基酸 0h 12h 24h 36h 48h 54h  Asp 36 7 7 14 18 24  Thr 61 47 143 11 5 -  Ser 109 96 63 46 49 49  Glu 223 83 15 15 11 9  Gly 82 64 49 11 6 6  Ala 113 94 62 13 10 8  Cys 953 150 43 64 75 111  Val 313 274 294 49 45 -  Met 231 195 200 39 31 35  Ile 259 200 200 8 5 -  Leu 815 589 447 18 12 -  Tyr 335 259 283 21 13 10  Phe 279 116 250 14 6 -  Lys 21 21 418 62 43 34  His 1125 1470 44 38 12 5  Trp - - - - - -  Arg 502 144 76 22 10 5  Pro 77 6 15 - - -   表7-6-5 不同发酵时期氨基酸的代谢流分布(负号表示从培养基中进入细胞内) 氨基酸 代谢通量 / mmol(L-1(h-1   (0-12 h)(
=0) (12-24 h) (24-36 h) (36-48 h)   














 Asp -0.130 0.0553 0.1312 -0.016 0.0503 0.00967 0.8760 0.03490 0.0354 0.0672 -0.8198 0.0333 0.0076 0.04147 0.1622  Thr -0.089 0.1380 0.0494 0.0045 0.1256 0.00631 0.1364 -0.2157 0.0882 0.0438 -0.0837 -0.022 0.0189 0.02704 0.0238  Ser -0.147 0.1654 0.0043 -0.090 0.1505 0.0122 0.1513 0.03691 0.1057 0.0848 0.19221 0.0474 0.0226 0.05228 0.1248  Glu -0.432 0.1101 -0.556 -0.459 0.1002 0.00463 0.250 -0.2838 0.0704 0.0322 -1.389 -0.070 0.0151 0.01983 0.3306  Gly -0.235 0.2207 -0.014 -0.177 0.2008 0.0122 0.0358 -0.2148 0.1410 0.0848 0.011 -0.048 0.0302 0.05228 0.03418  Ala -0.262 0.2487 -0.013 -0.362 0.2262 0.0122 -0.1231 -0.7812 0.1589 0.0848 -0.5375 0.0122 0.0340 0.05228 0.09851  Cys — 0.0553 — — 0.0503 0.00463 0.0549 — 0.0354 0.0032 0.0386 0.0109 0.0076 0.00198 0.02049  Val -0.170 0.1654 -0.004 -0.063 0.1504 0.00757 0.0946 -0.3676 0.1057 0.0526 -0.2093 0.0053 0.0226 0.03245 0.06038  Met -0.070 0.1101 0.0396 -0.026 0.1002 0.00278 0.0765 -0.2111 0.0704 0.0193 -0.1214 -0.019 0.0151 0.0119 0.00764  Ile -0.126 0.1380 0.0115 0.1880 0.1256 0.00231 0.3159 -0.5431 0.0882 0.0161 -0.4388 0.0106 0.0189 0.00992 0.03939  Leu -0.394 0.2207 -0.173 -0.370 0.2008 0.00547 -0.164 -0.5827 0.141 0.038 -0.4037 -0.012 0.0302 0.02344 0.04131  Tyr -0.065 0.0553 -0.009 -0.005 0.0503 0.00673 0.0522 -0.2117 0.0354 0.0468 -0.1295 -0.001 0.0076 0.02885 0.03597  Phe -0.137 0.0827 -0.054 0.0210 0.0752 0.00715 0.1033 -0.2760 0.0528 0.0497 -0.1735 -0.005 0.0113 0.03065 0.03802  Lys -0.116 0.2207 0.1049 0.1033 0.2008 0.00841 0.3125 -0.4457 0.141 0.0585 -0.2462 -0.016 0.0302 0.03606 0.05044  His -0.031 0.0274 -0.002 -0.064 0.0249 0.00366 -0.035 -0.0276 0.0175 0.0254 0.0153 -0.007 0.0037 0.01568 0.01221  Arg -0.472 0.1380 -0.334 -0.130 0.1256 0.0135 0.0091 -0.1089 0.0882 0.0935 0.0728  0.0189 0.05769 0.07659  Pro — — — — — — — 0.10376 0.0882 0.0672 0.18373  0.0189 0.04146 0.06036  
=-0.7583g/L/h,
=0.548g/L/h 
=-0.575g/L/h,
=0.498g/L/h 
=-0.275g/L/h,
=0.35g/L/h 
=-0.2333g/L/h,
=0.0075g/L/h   第二阶段（12～24 h），菌体生长速率(
)及淀粉消耗速率仍然较快，MTG酶活开始增加，发酵液中游离氨基酸浓度增高，总结合氨基酸浓度继续降低，氨基酸消耗依然较快，除了Thr、Phe等氨基酸外，绝大多数氨基酸的
为负值，表明细胞继续从培养基中吸收氨基酸用于细胞生长，且
值仍然较高；
>0的数量增多，数值增大，如
从-0.0041 mmol/(L(h)变成0.09457mmol/(L(h)，可见此阶段由中间产物合成的氨基酸种类增多，速度加快。 第三阶段(24～36 h），菌体生长速率降低，酶活以较快的速率增加，
明显高于第二阶段，氨基酸及淀粉平均消耗速率降低，消耗的氨基酸主要用于菌体生长和MTG的合成，
<0，表明几乎所有氨基酸都从培养基中摄取。结合氨基酸浓度仍然以较快的速率降低，24 h后游离氨基酸开始以较快的速度降低。 第四阶段（36～48 h)，细胞干重继续增加至42 h达到最大值，酶活继续增高，但增加速率较低，至48 h左右达到最大值。该阶段发酵液中总结合氨基酸浓度略有增高，可能是由于MTG的交联作用，使蛋白质及氨基酸发生了交联，而且水解蛋白酶被交联后，不能继续降解蛋白质或多肽，因此细胞就不能利用这部分结合氨基酸。此阶段游离氨基酸浓度一直维持在较低水平。 另外，在整个发酵过程中Glu、Ser、Asp三种氨基酸由于参与了其它氨基酸的代谢，所以其生成速率(分泌速率)较高。从表7-6-5中可见，36 h前
>
，表明氨基酸主要用于菌体的生长，36 h后，
<
，氨基酸则主要用于产物的的合成。 综上所述，氨基酸在菌体生长和MTG合成过程中起着十分重要的作用。在发酵后期，发酵液中总氨基酸浓度较高，维持在11.454 g/L左右，而游离氨基酸浓度较低，其原因一方面是初始培养基中的大量游离氨基酸在对数生长期已被细胞所利用，另一方面可能是部分游离氨基酸及蛋白酶被MTG酶所交联，由于部分水解蛋白酶被MTG交联，因而尽管发酵液中结合氨基酸浓度较高，但这部分结合氨基酸已不能被细胞进一步利用。因此，为了进一步促进发酵中后期MTG的合成，可以从两方面来考虑，一方面是提高中后期游离氨基酸的水平，另一方面是解除MTG对蛋白质及氨基酸的交联作用。 四、游离氨基酸对MTG发酵的影响 由前面研究，游离氨基酸是MTG合成过程中的关键影响因素之一。为进一步研究氨基酸对MTG发酵的影响，通过对摇瓶过程中氨基酸进行分析计算，在培养基中添加Glu，Thr，Phe，Ala，Leu，Trp，Arg 等7种非常缺乏的氨基酸。从摇瓶试验可以看出(结果未列出)，添加了游离氨基酸后，MTG酶活有不同程度的提高，但是当不添加Glu、Trp和Thr三种氨基酸时，酶活较低，表明这三种氨基酸对MTG合成起较重要的作用。通过对这三种氨基酸进行不同浓度实验，得出Glu，Thr，Trp的最佳添加浓度分别为0.19 g/L，0.04 g/L，0.0985 g/L(结果略)。在此基础上按表7-6-6的方式添加三种氨基酸，结果如表7-6-7所示。从表7-6-7中可以看出，除方式1中MTG酶活增加了20％外，其它添加方式均对提高MTG酶活无显著效果。相反，方式6，7不仅无助于提高MTG酶活，反而使MTG酶活降低。初始添加氨基酸，此时发酵液中MTG酶活较低，添加的氨基酸可促进细胞生长，中后期由于MTG酶活较高，大部分添加的氨基酸被MTG所交联，不能被细胞所利用，因此对酶活无促进作用。 表7-6-6 发酵过程中氨基酸的添加方式 添加方式 0h 24h 30h 36h  空白      1 +     2  +    3   +   4    +  5  +  +  6  + + +  7 + + + +  ＋：表示加入氨基酸 表7-6-7 游离氨基酸添加方式对菌体生长及酶活的影响 添加方式 细胞干重/g(L-1 MTG酶活/u(mL-1 剩余淀粉浓度/g(L-1  对照 11.4 1.8 6.7  1 10.9 2.06 8.1  2 10.8 1.88 5.7  3 13.4 1.85 6.2  4 12.1 1.83 6.3  5 13.4 1.88 6.2  6 12.5 1.73 6.3  7 13.3 1.90 5.3  为了证实MTG对氨基酸的这种交联作用，将20种氨基酸与MTG在30 ℃下一起保温，同时进行对照实验，保温前后溶液中氨基酸的浓度如表7-6-8所示，从表中可以看出，保温1 h后，氨基酸的浓度显著降低。由此可见，在发酵过程中MTG确实具有催化交联游离氨基酸的作用，使游离氨基酸的浓度降低。 根据表7-6-8可计算出氨基酸的交联速率：
mg/(L(h) (7-6-5) 氨基酸的平均流加速率如下式所示： 　　　　
(7-6-6) 当氨基酸的流加速率大于氨基酸的交联速率时，即F>1157 mg/(L(h)，则多余的氨基酸才可被细胞所利用，但若采用流加纯氨基酸的方法进行发酵，则添加游离氨基酸的量将会非常大。由于纯氨基酸价格较高，所以用流加纯氨基酸的方法提高MTG发酵水平并不是一个较好的方法，而且它并不能从根本上解决MTG的交联问题。 表7-6-8 MTG对氨基酸的交联作用 氨基酸 Thr Ser Glu Gly Ala Cys Val Met Ile  对照/mg L-1 实验值/mg L-1 68 25 132 65 295 112 130 50 150 87 125 123 150 87 250 137 102 78   氨基酸 Tyr Phe Lys His Trp Arg Pro Asp Leu  对照/mg L-1 实验值/mg L-1 80 38 100 46 135 65 125 75 123 121 100 47 100 98 251 113 175 67  五、铵离子的解交联作用 从前面可知，添加游离氨基酸不能从根本上解决MTG的交联问题。由于MTG在催化交联氨基酸的反应中会产生铵离子，因此若能增加发酵液中铵离子浓度，一方面铵离子可以为细胞生长所利用，另一方面又可以使MTG催化交联的反应向逆反应方向进行，降低MTG的催化交联的速率，甚至交联反应不发生，使得大部分蛋白质和氨基酸可以为细胞所利用。 为了考察无机铵盐对MTG发酵的影响，在摇瓶发酵的不同阶段添加硫酸铵，添加方式与表7-6-6中列出的氨基酸的添加方式一致，总添加量5 g/L，结果如表7-6-9所示。 表7-6-9 铵离子添加方式对细胞生长及MTG酶活的影响 方式 细胞干重/g(L-1 MTG酶活/u(mL-1 剩余淀粉浓度/g(L-1 铵离子/g(L-1  对照 12.9 1.76 7.7 0.52  1 11.7 1.79 6.8 1.75  2 13.2 1.98 8.6 1.30  3 13.9 2.03 8.2 1.60  4 12.1 1.86 7.0 1.18  5 13.7 2.08 6.2 0.97  6 14.2 2.15 5.3 0.82  7 13.6 1.99 7.3 2.13  从表7-6-9中可以看出，添加铵离子后MTG酶活均有不同程度的提高，在方式6中，细胞干重增加了10％，MTG酶活比对照组高出22％，发酵液中残留铵离子浓度为0.82 g/L，表明添加的硫酸铵一方面可为细胞所利用，另一方面由于降低了MTG对蛋白质和氨基酸的催化交联速率，使得蛋白质和氨基酸能为细胞所利用。 由于在小罐上可以对发酵过程中某些参数进行在线检测和控制，且对有些基质可以进行连续流加，避免一次加料过多对菌体生长和产物形成产生抑制作用，为此在2.5 L小罐上进行硫酸铵的流加实验，结果如图7-6-5及表7-6-10所示，图7-6-6为流加硫酸铵发酵过程中总结合氨基酸及游离氨酸的变化曲线，图7-6-7及图7-6-8为MTG分批发酵和流加硫酸铵发酵的细胞干重和MTG酶活的时间过程曲线比较。
　　　
图7-6-5 流加发酵过程曲线 图7-6-6 流加发酵过程氨基酸变化 ◆ 淀粉；▲ MTG 酶活；■ 细胞干重 ■ 总游离氨基酸；◆ 总结合氨基酸
　　　
图7-6-7 不同发酵方式下MTG酶活变化 图7-6-8 不同发酵方式下细胞干重的变化 ◆ 分批发酵；▲ 流加发酵 表7-6-10 在小罐中流加铵离子对MTG发酵的影响 MTG酶活/u(mL-1 剩余淀粉浓度/g(L-1 细胞干重/g(L-1  分批 2.80 10.2 21.3  补料分批 3.79 6.8 26.2   从图7-6-5～图7-6-8中可以看出，流加铵离子发酵对细胞生长影响不大，分批发酵36 h，MTG酶活增加速率明显降低，而流加发酵中MTG酶活继续以较高的速率增加至54 h，最终MTG酶活提高了35.3%，细胞干重增加了20％。比较图7-6-4及图7-6-6可以看出，发酵36 h后流加发酵培养液中总的结合氨基酸及游离氨基酸浓度明显低于分批发酵，由此可见，无机铵离子确实能起到部分解除MTG的交联作用。 符号说明 Tpam: 总结合蛋白氨基酸(g/L) TFam: 总游离氨基酸(g/L) Glc: 葡萄糖 G6P: 6-磷酸葡萄糖 PEP: 磷酸烯醇式丙酮酸 R5P: 5-磷酸核糖 F6P: 6-磷酸果糖 GAP: 3-磷酸甘油醛 G3P: 3-磷酸甘油酸 Pyr: 丙酮酸 AcCoA: 乙酰辅酶A AKG: (-酮戊二酸 Cit: 柠檬酸 OAA: 草酰乙酸 第七章主要参考文献 Ando H, Adachi M, Umeda K, et al. Agric. Biol. Chem., 1989, 53: 2613-2617 Ando H, Adadi M, Umeda K, et al. Agric. Biol. Chem., 1989, 53: 2613-1617 Takac S, Calik G. Enzyme Microbiol. Technol., 1998, 23: 286-300 Gloria A. Enzyme Microbial. Technol., 1997, 21:537-542 Jank B. Trends in Biotechnol., 1995, 13: 42-44 Kanaji T, Ozaki H, Takao T et al. J. Biol. Chem., 1993, 268: 11565-11572 Kim S H, Carpenter J A, Wicker L. J. Food Sci., 1993, 58, 473-491 Klein J D, Guzman E, Kuehn G D. J. Bacteriol., 1992, 174: 2599-2605 Larre C, Kedzior Z M, Chenu M G. J. Agric. Food Chem., 1992, 40: 1121-1126 Larre C, Chiarello M, Dudek S et al. J. Agric. Food Chem., 1993, 41: 1816-1820 Nonaka M, Matsuura Y, Motoki M. Biosci. Biotechnol. Biochem., 1996, 60(1): 131-133 Robert L, Gino V. Biotechnol. Bioeng., 1998, 60(2): 169-178 Tsai G J, Lin S-M, Jiang S-T. J. Food Sci., 1996, 61(6): 1234-1238 Washizu K, Ando K, Koikeda S, et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., 1994, 58(1): 82-87 Yasueda H, Kumazawa Y, Motoki M. Biosci. Biotechnol. Biochem., 1994, 58: 2041-2045 Zhu Y, Rinzema A, Tramper J. Biotechnol. Bioeng., 1996, 50: 291-298 高年发，杨枫，王淑豪，天津轻工业学院学报，1998，1：11-16 吴解温，中国农业化学会志，1996，34：228-240 郑美英．生物合成谷氨酰胺转胺酶的过程优化及工业化条件研究．无锡轻工大学博士学位论文，2000年6月 Zheng M, Du G, Chen J. A temperature –shift strategy in batch microbial transglutaminase fermentation. Process Biochem., 2001, 36: 525-530 郑美英，堵国成，陈坚．Steptoverticillium mobaraense 分批发酵生产谷氨酰胺转胺酶:氨基酸代谢流分析及其初始淀粉浓度的影响．应用与环境生物学报，2000，6(1): 76-82 郑美英，堵国成，陈坚．谷氨酰胺转胺酶(MTG)分批发酵中温度对S. mobaraense生长及产酶影响的模型化．应用与环境生物学报，2000，6(5): 462-467 郑美英，堵国成，陈坚．分批发酵生产谷氨酰胺转胺酶的温度控制策略．生物工程学报，2000，16(6): 759-762  第七章 谷氨酰胺转氨胺酶发酵过程优化 1 第一节 谷氨酰胺转胺酶发酵概述 1 一、新型蛋白食品与谷氨酰胺转胺酶 1 二、谷氨酰胺转胺酶的功能性质 1 三、谷氨酰胺转胺酶在食品工业中的应用 2 四、谷氨酰胺转胺酶的生产 3 五、谷氨酰胺转胺酶生产过程中存在的问题 5 六、本章主要内容 5 第二节 谷氨酰胺转胺酶的摇瓶发酵条件研究 7 一、引言 7 二、种子生长过程曲线及种龄的确定 7 三、环境条件对MTG摇瓶发酵过程的影响 7 四、营养条件对MTG发酵过程的影响 8 五、MTG合成的摇瓶发酵过程分析 11 第三节　谷氨酰胺转胺酶分批发酵的pH值及温度控制策略 13 一、引言 13 二、控制不同pH值对发酵过程的影响 13 三、pH对细胞比生长速率及MTG比合成速率的影响 15 四、MTG发酵过程中pH值优化控制策略 16 五、不同温度下的MTG分批发酵过程 17 六、温度对细胞生长及产酶的影响 19 七、MTG分批发酵过程分阶段温度控制策略 20 第四节 搅拌及溶氧浓度对谷氨酰胺转胺酶发酵过程的影响 23 一、引言 23 二、搅拌转速对细胞生长及MTG酶活的影响 23 三、溶氧浓度对细胞生长及MTG合成的影响 26 四、搅拌及溶氧浓度控制模式 27 五、MTG发酵体系的搅拌功率 28 第五节 茂原链轮丝菌的菌丝球形态与产酶之间的关系 33 一、引言 33 二、菌丝球形成过程的理论分析 33 三、茂原链轮丝菌摇瓶种子菌丝状及菌球体状的形态 35 四、培养条件对茂原链轮丝菌增殖形态及MTG发酵的影响 36 五、MTG小罐发酵过程中菌球的形成过程 43 六、菌球大小与产酶之间的关系 44 七、控制菌球增殖形态的策略的确定及验证 45 第六节 谷氨酰胺转胺酶分批发酵过程中氨基酸代谢流分析 47 一、引言 47 二、理论分析 47 三、MTG分批发酵过程分析 51 四、游离氨基酸对MTG发酵的影响 54 五、铵离子的解交联作用 56