第五章：氨基酸生产第一节：总论一、 氨基酸的用途全世界AA的年需求量10%的速度增长，年总产量120万吨以上，而其需求量达800万吨。作为食品添加剂占40%，饲料添加剂占40%，医药保健品占20%。年产值已接近600亿美元。
1999年国内氨基酸产值30亿元，2000年达40亿元。目前用于AA输液的18种AA原料药品种，14种已工业化，原料药生产厂家从1989年的8家发展到现在的40多家。AA生产企业有100多家，年产量3万吨左右。
1、 医药工业：
(1) 氨基酸注射液由1985年的100万瓶增长到2003的1.5万瓶，每年以15-20%的速度递增，全行业的年产值预计能达到10亿元。
2、 食品工业：
(1) 我国味精的年产量已达100万吨，产销量占世界第一位。
(2) 氨基酸口服液、胶囊等湖北省八峰药业股份有限公司 准备上一条年产1.6亿瓶氨基酸口服液生产线。产品有复合型八峰氨基酸口服液、乐百寿、快快好、好轻松、凡童 五种。
3、饲料工业：
目前作为饲料添加剂的氨基酸有蛋氨酸、赖氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、丙氨酸和苏氨酸7种。 其中以蛋氨酸(鸡饲料)、赖氨酸为主，近年某些国家已将苏氨酸用作饲料添加剂，主要用于以麦类为主的饲料中。天津化工厂从法国引进1万吨/年蛋氨酸生产装置，另已有三套3000吨/年以上的赖氨酸生产厂：广西赖氨酸厂（5000吨/年）、中外合资泉州大泉赖氨酸有限公司（5000吨/年）、四川化工厂与日本味之素公司合资的赖氨酸厂（6000吨/年）。色氨酸由于价格过高，无法被人们接受。
表3--8 世界氨基酸主要生产厂家生产能力品名 厂家 生产能力 品名 厂家 生产能力蛋氨酸 日本曹达 20000 谷氨酸 味之素 60000
蛋氨酸 日本住友化学 5000 谷氨酸 日本旭化成 15000
蛋氨酸 日本化药 2500 谷氨酸 协和发酵 15000
蛋氨酸 德国迪高沙 85000 谷氨酸 日本武田药品 15000
蛋氨酸 法国AEC 105000 色氨酸 味之素 100
蛋氨酸 美国孟山都 45000 色氨酸 昭和电工 200
蛋氨酸 墨西哥阿尔拜梅克斯 5000 色氨酸 三井东压 100
蛋氨酸 西班牙Sodeti 4000 色氨酸 田造制药 50
蛋氨酸 苏联Volgograd 4000 色氨酸 日本化药 50
色氨酸 协和发酵 50
赖氨酸 日本味之素 55000 甘氨酸 日本有机合成化学 6000
赖氨酸 日本协和发酵 20500 甘氨酸 协和发酵 5000
赖氨酸 日本东丽 6500 甘氨酸 日本化药 1000
赖氨酸 南朝鲜味元 10000 丙氨酸 武藏野化学研究所 ——
丙氨酸 日本化药 ——
二、 生产概况
1、 提取法，2、化学合成法，3、发酵法，4、酶法
1866年德国的Ritthausen博士利用硫酸水解小麦面筋，分离到一种酸性氨基酸，原料取材，命名为谷氨酸。1910年日本的味之素公司用水解法生产谷氨酸。1956年日本协和发酵公司分离到谷氨酸棒杆菌，1957年开始发酵法生产味精。
我国1958年开始研究，1965年在上海天厨味精厂投产。
迄今日本有18种AA用直接发酵法，4种用酶法。
甘氨酸 + 甲醛 L-Ser
三、 发展趋势
(1) 瓶颈产品生产技术的突破：L-Trp、L-Ser、L-His,L-Arg
(2) 氨基酸衍生物的发展：聚氨基酸(聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸)；5-羟色氨酸，谷胱甘肽，腺苷蛋氨酸等。
第二节：淀粉水解糖的制备许多工业微生物不能利用淀粉（如所有的氨基酸生产菌，大部分酵母），故发酵前必须将淀粉水解成糖。目前已发展成一门独立的工业——葡萄糖工业。
一、 淀粉的结构及特点直链——大米，小麦支链——玉米，高梁，薯类为主复习结构方面概念：α-1，4糖苷键，α-1，6糖苷键，还原性末端（自由醛基），非还原性末端，与碘呈色反应（6 个葡萄糖与1个碘分子形成一圈螺旋，呈蓝色）。
二、 酸水解水解原理：（C6H10O5）n + nH2O n(C6H12O6)
理论转化率 y=180/164×100% = 111%
但存在副反应
1） 复合反应复合二糖主要由α-1，6糖苷键聚合成异麦芽糖
β-1，6糖苷键聚合成龙胆二糖多数复合二糖不能被微生物利用，发酵结果残糖增加，提取精制困难。
复合反应进行的程度与淀粉乳浓度、酸种类、酸浓度、温度有关。
①淀粉乳浓度增加，葡萄糖值增加，复合反应增加。
淀粉乳浓度（%） DE值 复合糖
13.5 94 6
22.5 89.6 10.4
18-20(10-12Beo) 90-92 7
②酸对复合反应的影响用盐酸水解生成最多，其次为硫酸，最少为草酸
2） 分解反应造成的损失约1%左右，主要影响是生成色素。
三、 双酶法制糖工艺味精工业的酸法糖化改为双酶法糖化，使转化率从90％左右提高到97％-98％，味精总收率提高4％，全行业年增产味精 2万多 吨，年节粮8万吨。
由于酶的高度专一性及反应条件的温和，使淀粉水解液的葡萄糖纯度得以提高，颜色浅，出糖率大大增加（DE值可达98%）。
双酶工艺主要包括：液化和糖化两个步骤。
液化是利用液化酶（α-淀粉酶）使淀粉糊化，粘度下降，并水解到糊精和低聚糖的程度。
糖化是用糖化酶将液化产物（糊精、低聚糖）进一步彻底水解成葡萄糖的过程。
1、 液化
α-淀粉酶能水解α-1，4糖苷键，生成糊精及低聚糖。随着糖苷键的断裂，分子量越来越小，反应液粘度不断下降，流动性增加，这种现象，工业上称为液化；因为主要产物为糊精，也称糊化。
（1）液化条件 随酶的不同性质和活力而定国产BF7658α-淀粉酶，在30~35%浓度下，在85~87℃时活力最高，但当温度100℃10分钟则完全失活；
地衣芽孢杆菌的耐热α-淀粉酶热稳定性比BF7658α-淀粉酶高20℃，液化淀粉可在110℃进行，无需钙离子作稳定剂。
（2）液化程度如果让液化长时间进行，最终产物也是葡萄糖等。但这样所得的糖液葡萄值低，作用时间长。而且一部分已液化的淀粉会重新结合成硬束状体，使糖化酶难以作用；另一方面，糖化酶水解糊精及低聚糖分子时，需先与底物分子生成络合结构，这就要求底物分子具有一定的大小范围。
正常液化条件下，控制液化在DE10~20之间。（此时多量糊精及低聚糖，少量单糖）
2、 糖化糖化的温度和pH取决于糖化剂的性质生产上使用的糖化酶主要来自黑曲霉，根霉和拟内孢霉。
黑曲霉UV-11 55~60℃，pH4.0~4.5，DE值可达99%
根 霉 50~55℃，pH4.0~4.5
DE值达最高时应停止酶反应，否则，生成的葡萄糖经α-1，6键起复合反应而使DE值下降。
糖化终了，80℃20分钟灭酶。
新工艺介绍
第三节 谷氨酸发酵的代谢控制一、 代谢途径见P113
主要的酶反应：
α－酮戊二酸 + NH4+＋NADPH2 谷氨酸＋H2O＋NADP
在TCA循环中：
α－酮戊二酸 +NADP＋CoA-SH 琥珀酰CoA＋CO2
葡萄糖 2丙酮酸
理论收率：147÷180×100%=81.7%
完全走乙醛酸途径
1.5 葡萄糖 3丙酮酸 3 乙酰CoA
2乙酰COA 2异柠檬酸
故若完全走乙醛酸补充途径，则 1.5葡萄糖 1谷氨酸
理论收率为147÷（1.5×180）= 54%
菌种的特征：
1、 谷氨酸脱氢酶活力强
2、 α-酮戊二酸氧化能力弱
3、 NADPH再氧化能力低
4、 生物素缺陷型
二、 生物素与细胞膜透性的关系
1、 作用机制生物素是羧化酶的辅基，属VB族，它在CO2固定和脂肪酸合成中起催化作用。
结构式：
总反应式：
CH3CO~SCOA + CO2 + ATP HOOCCH2 CO~SCOA +ADP +Pi
然后由乙酰COA与丙二酰CoA反应生成β酮丁酰以至丁酰CoA，
即 C2+ C3 C4 + CO2
C4 + C3 C6 + CO2
……………………
作为脂肪酸生物合成最初反应的关键酶——乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。
细胞膜由磷脂双分子层为其基本结构，其中60%为蛋白质，40%为类脂。磷脂主要是卵磷脂，结构如下：
R1，R2为高级脂肪酸的链，主要有软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸及十八碳三烯酸与二十碳四烯酸。
生物素缺陷型，脂肪酸合成少，磷脂合成少，细胞膜不完整，当磷脂合成减少到正常量的50%左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中。
2、 控制的关键生物素亚适量5~10μg/L。发酵初期（0~8h），菌体正常生长；当生物素耗尽后，在菌的再次倍增期间，开始出现异常形态的细胞，菌体伸长、膨大乃至不规则形，边缘有折绉、稍模糊，电镜观察似疱疹样，完成向谷氨酸非积累型向积累型细胞的转变。
讨论：有否别的措施？
除此外，还可甘油缺陷，油酸缺陷型第二层次：添加饱和脂肪酸、表面活性剂，它们的作用主要是在不饱和脂肪酸合成中，作为抗代谢物。即它们存在，油酸合成下降，透性增加。
在高浓度油酸存在时，添加上述三种也无效，必须控制以后的反应，即磷脂、细胞膜的形成或破坏细胞壁。
青霉素和细胞壁关系：
第四节 谷氨酸生产菌及种子扩大培养（2学时左右）
一、菌的特征与菌学性质
现有氨基酸生产菌主要是棒杆菌属（Corynebacterium）
短杆菌属 (Brevibacterium)
小杆菌属 (Microbacterium)
节杆菌属 (Arthrobacter)
共同特征为：
1） 细胞形态为棒杆、短杆
2） G+，无芽孢，无鞭毛，不能运动
3） 都是需氧型
4） 生物素缺陷型
5） 脲酶强阳性
6） 不分解淀粉
7） 发酵中菌体发生明显的形态变化，同时细胞膜渗透性的变化。
8） CO2固定反应酶系活力强
9） 乙醛酸循环弱
10、α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱
11、谷氨酸脱氢酶活力强
12、不分解谷氨酸，并能耐高浓度谷氨酸
北京棒杆菌AS1.299,
1、 形态特征：普通光学显微镜观察在普通肉汁斜面上培养6、12、24及48小时的染色培养物，细胞通常为短杆至小棒状，有时微呈弯曲状，两端钝圆，不分枝，呈多种形态，即培养6小时细胞有延长现象；细胞呈单个、成对及V字型排列；细胞大小为0.7-0.9×1.0-2.5μm。
2、 培养特征：
（1） 普通肉汁琼脂斜面 中间划直线培养，呈中度生长，菌苔线状，24 h为白色，48 h后稍呈淡黄色，随培养时间的延长颜色稍增深，表面湿润，光滑，有光泽，无粘性，不产生水溶性色素。
（2） 普通肉汁琼脂平板 菌落圆形，培养24h菌落为白色，直径约1mm，48 h为2.5 mm，延长培养至一周可达4.5-6.5mm，淡黄色，中央隆起，表面湿润，光滑且有光泽，边缘整齐并呈半透明状，无粘性，不产生水溶性色素。
（3） 普通肉汁液体培养
（4） 普通肉汁琼脂穿刺
二、种子扩大培养
斜面活化 一级种子 二级种子
（1）斜面：肉膏培养基，18~24h，32℃
（2）一级种子：三角瓶200ml/1000ml△，瓶口八层纱布包扎，碳源为葡萄糖。摇床性能介绍（往复，96rpm,76mm振幅；旋转，偏心距5cm，220 rpm）,瓶口八层纱布包扎，碳源为葡萄糖
（3）二级种子：种子罐500升，培养基为水解糖
一级种子质量要求：
1） 用显微镜观察，菌体粗壮、均匀，排列整齐。
2） 用琼脂平板检查，无杂菌，无噬菌斑。
3） OD值净增在0.6左右。
4） 种子培养液pH在6.4左右。
5） 种子培养液残糖含量在0.5%以下二级种子质量要求：
1） pH在7.2左右；
2） 残糖含量在1.5%以下；其他同一级种子。
第五节：发酵工艺
一、 温度对发酵的影响及控制
1、 发酵热：引起发酵过程温度变化的原因是发酵过程所产生的热量，称为发酵热。发酵热包括生物热、搅拌热、蒸发(汽化)热和辐射热等。
（1）生物热：由于菌体的生长繁殖和形成代谢产物，不断地利用营养物质，将其分解氧化获得能量，其中一部分能量用于合成高能化合物，供合成细胞物质和合成代谢产物所需要的能量。其余部分以热的形式散发出来，这就是生物热。
发酵过程的产热具有明显的时间性。即在不同培养阶段，菌体呼吸作用和发酵作用强度不同，所产生的热量不同。
（2）搅拌热：Q搅拌=P×3600 KJ/h 3600——机械能转变为热能的热功当量
（3）蒸发热：通气时，引起发酵液水分蒸发，发酵液因蒸发而被带走的热量称为汽化热。
Q汽化=4.18 G (I出-I进) G——空气的重量流量；I出——出口空气的热焓。
（4） 辐射热：因发酵过程温度与周围环境温度不同，发酵液的部分热量通过罐体向外辐射。客观存在的大小，取决于罐内外温度差，冬天大些，夏天小些。一般不超过5%。
发酵过程需要用冷却方式带走的发酵热为：
Q总 = Q生+ Q搅拌-Q汽化- Q辐射
2、 温度对发酵的影响
（1） 从动力学角度来看，T升高，反应速度加快，生长繁殖快，产物提前合成；另一方面，T升高，酶失活愈快，菌体易于衰老，影响产物合成，失活愈快，周期缩短，产物最终产量少。
（2） T通过影响发酵液的物理性质间接影响发酵，影响氧的溶解和传递，影响对基质的分解和吸收速度。
（3） 影响生物合成方向。如金色链霉菌>35℃时，合成四环素；<30℃时，合成金霉素。
3、 最适温度的选择各种微生物在一定条件下，都有一个最适的生长温度范围；产物合成的最适温度与生长温度往往不同。
谷氨酸产生菌 最适生长30-32℃，产物34-37℃
黑曲霉 37℃，柠檬酸、糖化酶32-34℃
青霉素 30℃，分泌青霉素20℃
变温培养法比常温25℃提高产量16%
二、 pH对发酵的影响及控制
1、 pH对发酵的影响
（1） 影响酶的活性。影响酶活性中心上有关基团的解离；影响底物（培养基成分）的解离，从而影响酶——底物的结合
（2） 影响细胞膜电荷，膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及低谢产物的排泄。
（3） 引起菌体的代谢过程不同
柠檬酸 黑曲霉 草酸
乙醇 酵母 甘油
谷氨酰胺 棒杆菌 谷氨酸
2、 发酵过程pH的变化
3、 发酵过程pH的调节方式
（1） 添加CaCO3 采用生理酸性铵盐作为氮源时，由于NH4+被利用，剩下的酸根引起pH下降；有机酸发酵时形成钙盐沉淀。
但是，碳酸钙用量大，消毒困难，易堵塞管道，在操作上易引起染菌，而且对产物的提取有影响。此法在工业上不使用。
（2） 氨水、尿素流加法
（3） 其他方法 酶制剂、抗生素发酵通过加糖、淀粉来控制pH。如表霉素 根据代谢需要，改变加糖率，比固定加糖而用酸碱调节pH增产25%。
三、 供氧对发酵的影响通风适量 生成谷氨酸通风过量 生成α-酮戊二酸
通风不足 生成乳酸或琥珀酸
谷氨酸发酵时不同容积发酵罐的搅拌转速和通风比发酵罐容积m3 0.05 0.5 5 10 20 50
搅拌转速r/min 550 300 185 160 140 110
通风比（m3/ m3,Min） 1:0.5-0.6 1:0.3 1:0.18-0.2 1:0.16-0.17 1:0.15 1:0.12
四、 泡沫的消除
1、 泡沫给发酵造成的影响
a） 过多，升到罐顶从轴封渗出，造成染菌；
b） 使发酵罐装填系数减少，设备利用率下降；
c） 影响通风搅拌正常进行，影响氧的传递，妨碍菌的呼吸；
d ）增加菌群的非均一性，微生物随泡沫漂浮。
2、 泡沫形成的规律
泡沫的多少，一方面与搅拌、通风有关；另一方面，与培养基性质有关。蛋白质原料，如蛋白胨、玉米浆、黄豆粉、酵母粉等是主要发泡剂。
3、 泡沫的消除机械消泡：利用机械力将泡沫打破，或借压力变化使泡沫破裂。最常用的是耙式消沫浆。
化学消泡：破泡作用——当消泡剂加入到发泡体系中，由于消泡剂的表面张力低（相对于发泡体系），在消泡剂接触液膜面时，成为泡膜的一部分，使液膜面扩大，变薄，同时使泡膜局部表面张大降低，力的平衡破坏，在力的作用下气泡破裂、合并，最后导致泡沫破灭。
消泡剂选用原则：
（1） 消泡剂必须是表面活性剂，具有较低的表面张力。
（2） 对气液界面的铺展系数必须足够大，以便能迅速发挥其消泡活性，这就要求消泡剂具有一定的亲水性。
（3） 在水中的溶液解度极小，保持持久的消泡或抑泡作用。
（4） 无毒，不影响发酵。
常用消泡剂：
（1） 天然油脂类，包括豆油、菜子油、花生油、玉米油等。由于油脂分子中无亲水基团，在发酵液中难铺展，所以消泡活性差，用量大，一般为发酵液的0.1-0.2%
（2） 聚醚类
GP亲水性差，溶液解度小，抑泡性能比消泡性能好；
GPE10亲水性好，易铺展，消泡性能强；但相应溶解度大，消泡活性维持时间短。用量一般为发酵液的0.01-0.03%
(3)硅酮主要是聚二甲基硅氧烷及衍生物，分子式为：
是无色液体，不溶于水，表面张力低达21dyn/cm（泡敌为33，向日葵油40，青霉素发酵液60-68 dyn/cm）。纯的聚二甲基硅氧烷的消泡能力奶低，因此常加分散剂来提高消泡活性，或乳化剂成乳状液。
硅酮消泡剂适用于微碱性发酵，对于微酸性发酵较差。
（4）醇类 十八醇是常用的一种，它可以单独或与载体一起使用。
五、 发酵过程主要变化及中间代谢
（一） 中间分析
1、 菌体形态和浓度 菌体形态的改变是代谢变化的反映，抗生素生产中以菌丝形态作为衡量种子质量，区分不同发酵阶段、控制代谢变化及决定发酵周期的依据之一。
2、 目的产物含量的测定 控制发酵生产以及决定放罐时间的重要参数。
3、 pH 反映营养物质消耗、产物形成的综合指标
4、 基质浓度 糖、氮、磷含量。控制这些物质的供给和消耗是提高产量的重要手段。
（二） 中间补料
菌体生长代谢需要一个合适的浓度，过高的浓度对菌体生长有抑制作用，过低，不能满足产物合成的需要。
中间补料主产生菌在分泌期有足够多而不过多的养料，使代谢活动朝着有利于合成产物的方向发展，延长分泌期，提高抗生素产量。
1、 补糖：
开始补糖的时间 过早，刺激生长，加速糖利用；过迟，所需能量跟不上。谷氨酸发酵在对数生长期的末期补料；
补糖方式 连续流加，少量多次间歇补入和大量少次补入三种方式。
注意要避免环境突然变化对代谢带来影响。
补糖量：以维持稳定的糖浓度；如，四环素发酵还糖维持在0.8-1.2%
例子：谷氨酸追加糖液发酵在原工艺基础上，加大接种量到10%，增加生物素用量达5μg/L，减少初糖浓度（12%——7-8%）尽快获得大量的生产型菌体，当菌体处在生长对数期后进入产酸期，糖浓度在2%左右时，连续流加糖果液，维持2%左右的糖浓度。
优点：低浓度发酵，以利于生长和发酵
总糖浓度达20%，产酸高。
2、 补氮：
流加尿素，一方面调节pH，另一方面补氮谷氨酸发酵时，初尿用量和补尿多少取决于菌种的脲酶活力强弱和耐尿能力；
As1.299 脲酶活力低，耐尿强，初尿用量多2%，流加次数少
T6-13 脲酶活力强，耐尿低，初尿用量少0.6%，流加以少量多次好
As1.524 1-1.4%
第六节：谷氨酸的提取（2～3学时）
第一节 发酵液的性质和发酵废液的综合利用一、 发酵液性质发酵呈浅黄色浆状，温度34～36℃，pH7左右
1） 谷氨酸以铵盐形式存在
2） 含无机盐，有K，Na,NH4+,Mg,Ca,Fe,Cl,SO4,PO4等，还有残糖、色素、尿素等。此外，还有消泡剂。
3） 大量菌体、蛋白质等固形物悬浮在发酵液中，湿菌体约占发酵液的5-8%
4） 发酵液中尚有其他副产物。有机酸类有乳酸、α-酮戊二酸、琥珀酸等；氨基酸类有Asp、Ala、Val、Pro、Ile、Leu、Gly、His、Gln等。各种氨基酸量小于1%
5） 铵离子0.6-0.8%，残糖0.5%
6） 腺嘌呤0.02-0.05%，而尿嘧啶约占001-0.03%
二、 菌体分离菌体很轻很小，大小为0.7~1.0×1.0~3微米
1） 机械分离
2） 添加凝聚剂
第二节 等电点法提取谷氨酸
p220-223
1、 谷氨酸结晶性质：
α型：晶体粗壮，呈颗粒状，质量重，易沉降，与母液分离容易
β型：晶轴长短不一，呈针状或鳞片状，晶粒微细，纯度低，难沉降。
2、 影响结晶析出的主要因素
温度：（a）影响溶解度；
温度℃ 0 5 10 15 20 25 30 35
溶解度% 0.341 0.411 0.495 0.596 0.717 0.864 1.040 1.250
（b）影响晶型
30℃以下，α型为主；30℃以上，β型为主
在中和调等电点过程中，发酵液的温度应缓慢下降，结晶颗粒大。若温度下降过于迅速，晶核小而多。
加酸：
缓慢加酸，使谷氨酸溶解度逐渐降低，可控制一定数量的晶核，即晶核不会形成太多，经养晶育晶后成长壮大，析出的结晶颗粒大。加酸过快，容易形成局部过饱和，晶核过多，结晶细小，不易沉降分离。
晶种：
晶核形成以前，适时投放一定量的晶种，有利于收率的提高，投放晶种条件一定要准确，过早，晶种化掉；过迟，刺激更多晶核形成。
投放目的：控制一定数量的晶核，并以晶核为核心，使其不断长大。
国外的提取技术：
发酵液 菌体过滤（加助滤剂或超速离心） 四效浓缩10倍
冷却到室温调pH3.2 谷氨酸析出90%，纯度86-90%
优点：1 吨水产生0.25吨蒸汽，二次蒸汽利用，很经济
废水量减少为国内的1/10，盐酸用量减少
菌体回用，提取核苷酸等贵重药品，或作为饲料；菌体存在于发酵液中,不利于谷氨酸的结晶分离。
清洁生产工艺
由谷氨酸制成味精p336
1999年国内氨基酸产值30亿元，2000年达40亿元。目前用于AA输液的18种AA原料药品种，14种已工业化，原料药生产厂家从1989年的8家发展到现在的40多家。AA生产企业有100多家，年产量3万吨左右。
1、 医药工业：
(1) 氨基酸注射液由1985年的100万瓶增长到2003的1.5万瓶，每年以15-20%的速度递增，全行业的年产值预计能达到10亿元。
2、 食品工业：
(1) 我国味精的年产量已达100万吨，产销量占世界第一位。
(2) 氨基酸口服液、胶囊等湖北省八峰药业股份有限公司 准备上一条年产1.6亿瓶氨基酸口服液生产线。产品有复合型八峰氨基酸口服液、乐百寿、快快好、好轻松、凡童 五种。
3、饲料工业：
目前作为饲料添加剂的氨基酸有蛋氨酸、赖氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、丙氨酸和苏氨酸7种。 其中以蛋氨酸(鸡饲料)、赖氨酸为主，近年某些国家已将苏氨酸用作饲料添加剂，主要用于以麦类为主的饲料中。天津化工厂从法国引进1万吨/年蛋氨酸生产装置，另已有三套3000吨/年以上的赖氨酸生产厂：广西赖氨酸厂（5000吨/年）、中外合资泉州大泉赖氨酸有限公司（5000吨/年）、四川化工厂与日本味之素公司合资的赖氨酸厂（6000吨/年）。色氨酸由于价格过高，无法被人们接受。
表3--8 世界氨基酸主要生产厂家生产能力品名 厂家 生产能力 品名 厂家 生产能力蛋氨酸 日本曹达 20000 谷氨酸 味之素 60000
蛋氨酸 日本住友化学 5000 谷氨酸 日本旭化成 15000
蛋氨酸 日本化药 2500 谷氨酸 协和发酵 15000
蛋氨酸 德国迪高沙 85000 谷氨酸 日本武田药品 15000
蛋氨酸 法国AEC 105000 色氨酸 味之素 100
蛋氨酸 美国孟山都 45000 色氨酸 昭和电工 200
蛋氨酸 墨西哥阿尔拜梅克斯 5000 色氨酸 三井东压 100
蛋氨酸 西班牙Sodeti 4000 色氨酸 田造制药 50
蛋氨酸 苏联Volgograd 4000 色氨酸 日本化药 50
色氨酸 协和发酵 50
赖氨酸 日本味之素 55000 甘氨酸 日本有机合成化学 6000
赖氨酸 日本协和发酵 20500 甘氨酸 协和发酵 5000
赖氨酸 日本东丽 6500 甘氨酸 日本化药 1000
赖氨酸 南朝鲜味元 10000 丙氨酸 武藏野化学研究所 ——
丙氨酸 日本化药 ——
二、 生产概况
1、 提取法，2、化学合成法，3、发酵法，4、酶法
1866年德国的Ritthausen博士利用硫酸水解小麦面筋，分离到一种酸性氨基酸，原料取材，命名为谷氨酸。1910年日本的味之素公司用水解法生产谷氨酸。1956年日本协和发酵公司分离到谷氨酸棒杆菌，1957年开始发酵法生产味精。
我国1958年开始研究，1965年在上海天厨味精厂投产。
迄今日本有18种AA用直接发酵法，4种用酶法。
甘氨酸 + 甲醛 L-Ser
三、 发展趋势
(1) 瓶颈产品生产技术的突破：L-Trp、L-Ser、L-His,L-Arg
(2) 氨基酸衍生物的发展：聚氨基酸(聚谷氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸)；5-羟色氨酸，谷胱甘肽，腺苷蛋氨酸等。
第二节：淀粉水解糖的制备许多工业微生物不能利用淀粉（如所有的氨基酸生产菌，大部分酵母），故发酵前必须将淀粉水解成糖。目前已发展成一门独立的工业——葡萄糖工业。
一、 淀粉的结构及特点直链——大米，小麦支链——玉米，高梁，薯类为主复习结构方面概念：α-1，4糖苷键，α-1，6糖苷键，还原性末端（自由醛基），非还原性末端，与碘呈色反应（6 个葡萄糖与1个碘分子形成一圈螺旋，呈蓝色）。
二、 酸水解水解原理：（C6H10O5）n + nH2O n(C6H12O6)
理论转化率 y=180/164×100% = 111%
但存在副反应
1） 复合反应复合二糖主要由α-1，6糖苷键聚合成异麦芽糖
β-1，6糖苷键聚合成龙胆二糖多数复合二糖不能被微生物利用，发酵结果残糖增加，提取精制困难。
复合反应进行的程度与淀粉乳浓度、酸种类、酸浓度、温度有关。
①淀粉乳浓度增加，葡萄糖值增加，复合反应增加。
淀粉乳浓度（%） DE值 复合糖
13.5 94 6
22.5 89.6 10.4
18-20(10-12Beo) 90-92 7
②酸对复合反应的影响用盐酸水解生成最多，其次为硫酸，最少为草酸
2） 分解反应造成的损失约1%左右，主要影响是生成色素。
三、 双酶法制糖工艺味精工业的酸法糖化改为双酶法糖化，使转化率从90％左右提高到97％-98％，味精总收率提高4％，全行业年增产味精 2万多 吨，年节粮8万吨。
由于酶的高度专一性及反应条件的温和，使淀粉水解液的葡萄糖纯度得以提高，颜色浅，出糖率大大增加（DE值可达98%）。
双酶工艺主要包括：液化和糖化两个步骤。
液化是利用液化酶（α-淀粉酶）使淀粉糊化，粘度下降，并水解到糊精和低聚糖的程度。
糖化是用糖化酶将液化产物（糊精、低聚糖）进一步彻底水解成葡萄糖的过程。
1、 液化
α-淀粉酶能水解α-1，4糖苷键，生成糊精及低聚糖。随着糖苷键的断裂，分子量越来越小，反应液粘度不断下降，流动性增加，这种现象，工业上称为液化；因为主要产物为糊精，也称糊化。
（1）液化条件 随酶的不同性质和活力而定国产BF7658α-淀粉酶，在30~35%浓度下，在85~87℃时活力最高，但当温度100℃10分钟则完全失活；
地衣芽孢杆菌的耐热α-淀粉酶热稳定性比BF7658α-淀粉酶高20℃，液化淀粉可在110℃进行，无需钙离子作稳定剂。
（2）液化程度如果让液化长时间进行，最终产物也是葡萄糖等。但这样所得的糖液葡萄值低，作用时间长。而且一部分已液化的淀粉会重新结合成硬束状体，使糖化酶难以作用；另一方面，糖化酶水解糊精及低聚糖分子时，需先与底物分子生成络合结构，这就要求底物分子具有一定的大小范围。
正常液化条件下，控制液化在DE10~20之间。（此时多量糊精及低聚糖，少量单糖）
2、 糖化糖化的温度和pH取决于糖化剂的性质生产上使用的糖化酶主要来自黑曲霉，根霉和拟内孢霉。
黑曲霉UV-11 55~60℃，pH4.0~4.5，DE值可达99%
根 霉 50~55℃，pH4.0~4.5
DE值达最高时应停止酶反应，否则，生成的葡萄糖经α-1，6键起复合反应而使DE值下降。
糖化终了，80℃20分钟灭酶。
新工艺介绍
第三节 谷氨酸发酵的代谢控制一、 代谢途径见P113
主要的酶反应：
α－酮戊二酸 + NH4+＋NADPH2 谷氨酸＋H2O＋NADP
在TCA循环中：
α－酮戊二酸 +NADP＋CoA-SH 琥珀酰CoA＋CO2
葡萄糖 2丙酮酸
理论收率：147÷180×100%=81.7%
完全走乙醛酸途径
1.5 葡萄糖 3丙酮酸 3 乙酰CoA
2乙酰COA 2异柠檬酸
故若完全走乙醛酸补充途径，则 1.5葡萄糖 1谷氨酸
理论收率为147÷（1.5×180）= 54%
菌种的特征：
1、 谷氨酸脱氢酶活力强
2、 α-酮戊二酸氧化能力弱
3、 NADPH再氧化能力低
4、 生物素缺陷型
二、 生物素与细胞膜透性的关系
1、 作用机制生物素是羧化酶的辅基，属VB族，它在CO2固定和脂肪酸合成中起催化作用。
结构式：
总反应式：
CH3CO~SCOA + CO2 + ATP HOOCCH2 CO~SCOA +ADP +Pi
然后由乙酰COA与丙二酰CoA反应生成β酮丁酰以至丁酰CoA，
即 C2+ C3 C4 + CO2
C4 + C3 C6 + CO2
……………………
作为脂肪酸生物合成最初反应的关键酶——乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。
细胞膜由磷脂双分子层为其基本结构，其中60%为蛋白质，40%为类脂。磷脂主要是卵磷脂，结构如下：
R1，R2为高级脂肪酸的链，主要有软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸及十八碳三烯酸与二十碳四烯酸。
生物素缺陷型，脂肪酸合成少，磷脂合成少，细胞膜不完整，当磷脂合成减少到正常量的50%左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中。
2、 控制的关键生物素亚适量5~10μg/L。发酵初期（0~8h），菌体正常生长；当生物素耗尽后，在菌的再次倍增期间，开始出现异常形态的细胞，菌体伸长、膨大乃至不规则形，边缘有折绉、稍模糊，电镜观察似疱疹样，完成向谷氨酸非积累型向积累型细胞的转变。
讨论：有否别的措施？
除此外，还可甘油缺陷，油酸缺陷型第二层次：添加饱和脂肪酸、表面活性剂，它们的作用主要是在不饱和脂肪酸合成中，作为抗代谢物。即它们存在，油酸合成下降，透性增加。
在高浓度油酸存在时，添加上述三种也无效，必须控制以后的反应，即磷脂、细胞膜的形成或破坏细胞壁。
青霉素和细胞壁关系：
第四节 谷氨酸生产菌及种子扩大培养（2学时左右）
一、菌的特征与菌学性质
现有氨基酸生产菌主要是棒杆菌属（Corynebacterium）
短杆菌属 (Brevibacterium)
小杆菌属 (Microbacterium)
节杆菌属 (Arthrobacter)
共同特征为：
1） 细胞形态为棒杆、短杆
2） G+，无芽孢，无鞭毛，不能运动
3） 都是需氧型
4） 生物素缺陷型
5） 脲酶强阳性
6） 不分解淀粉
7） 发酵中菌体发生明显的形态变化，同时细胞膜渗透性的变化。
8） CO2固定反应酶系活力强
9） 乙醛酸循环弱
10、α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱
11、谷氨酸脱氢酶活力强
12、不分解谷氨酸，并能耐高浓度谷氨酸
北京棒杆菌AS1.299,
1、 形态特征：普通光学显微镜观察在普通肉汁斜面上培养6、12、24及48小时的染色培养物，细胞通常为短杆至小棒状，有时微呈弯曲状，两端钝圆，不分枝，呈多种形态，即培养6小时细胞有延长现象；细胞呈单个、成对及V字型排列；细胞大小为0.7-0.9×1.0-2.5μm。
2、 培养特征：
（1） 普通肉汁琼脂斜面 中间划直线培养，呈中度生长，菌苔线状，24 h为白色，48 h后稍呈淡黄色，随培养时间的延长颜色稍增深，表面湿润，光滑，有光泽，无粘性，不产生水溶性色素。
（2） 普通肉汁琼脂平板 菌落圆形，培养24h菌落为白色，直径约1mm，48 h为2.5 mm，延长培养至一周可达4.5-6.5mm，淡黄色，中央隆起，表面湿润，光滑且有光泽，边缘整齐并呈半透明状，无粘性，不产生水溶性色素。
（3） 普通肉汁液体培养
（4） 普通肉汁琼脂穿刺
二、种子扩大培养
斜面活化 一级种子 二级种子
（1）斜面：肉膏培养基，18~24h，32℃
（2）一级种子：三角瓶200ml/1000ml△，瓶口八层纱布包扎，碳源为葡萄糖。摇床性能介绍（往复，96rpm,76mm振幅；旋转，偏心距5cm，220 rpm）,瓶口八层纱布包扎，碳源为葡萄糖
（3）二级种子：种子罐500升，培养基为水解糖
一级种子质量要求：
1） 用显微镜观察，菌体粗壮、均匀，排列整齐。
2） 用琼脂平板检查，无杂菌，无噬菌斑。
3） OD值净增在0.6左右。
4） 种子培养液pH在6.4左右。
5） 种子培养液残糖含量在0.5%以下二级种子质量要求：
1） pH在7.2左右；
2） 残糖含量在1.5%以下；其他同一级种子。
第五节：发酵工艺
一、 温度对发酵的影响及控制
1、 发酵热：引起发酵过程温度变化的原因是发酵过程所产生的热量，称为发酵热。发酵热包括生物热、搅拌热、蒸发(汽化)热和辐射热等。
（1）生物热：由于菌体的生长繁殖和形成代谢产物，不断地利用营养物质，将其分解氧化获得能量，其中一部分能量用于合成高能化合物，供合成细胞物质和合成代谢产物所需要的能量。其余部分以热的形式散发出来，这就是生物热。
发酵过程的产热具有明显的时间性。即在不同培养阶段，菌体呼吸作用和发酵作用强度不同，所产生的热量不同。
（2）搅拌热：Q搅拌=P×3600 KJ/h 3600——机械能转变为热能的热功当量
（3）蒸发热：通气时，引起发酵液水分蒸发，发酵液因蒸发而被带走的热量称为汽化热。
Q汽化=4.18 G (I出-I进) G——空气的重量流量；I出——出口空气的热焓。
（4） 辐射热：因发酵过程温度与周围环境温度不同，发酵液的部分热量通过罐体向外辐射。客观存在的大小，取决于罐内外温度差，冬天大些，夏天小些。一般不超过5%。
发酵过程需要用冷却方式带走的发酵热为：
Q总 = Q生+ Q搅拌-Q汽化- Q辐射
2、 温度对发酵的影响
（1） 从动力学角度来看，T升高，反应速度加快，生长繁殖快，产物提前合成；另一方面，T升高，酶失活愈快，菌体易于衰老，影响产物合成，失活愈快，周期缩短，产物最终产量少。
（2） T通过影响发酵液的物理性质间接影响发酵，影响氧的溶解和传递，影响对基质的分解和吸收速度。
（3） 影响生物合成方向。如金色链霉菌>35℃时，合成四环素；<30℃时，合成金霉素。
3、 最适温度的选择各种微生物在一定条件下，都有一个最适的生长温度范围；产物合成的最适温度与生长温度往往不同。
谷氨酸产生菌 最适生长30-32℃，产物34-37℃
黑曲霉 37℃，柠檬酸、糖化酶32-34℃
青霉素 30℃，分泌青霉素20℃
变温培养法比常温25℃提高产量16%
二、 pH对发酵的影响及控制
1、 pH对发酵的影响
（1） 影响酶的活性。影响酶活性中心上有关基团的解离；影响底物（培养基成分）的解离，从而影响酶——底物的结合
（2） 影响细胞膜电荷，膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及低谢产物的排泄。
（3） 引起菌体的代谢过程不同
柠檬酸 黑曲霉 草酸
乙醇 酵母 甘油
谷氨酰胺 棒杆菌 谷氨酸
2、 发酵过程pH的变化
3、 发酵过程pH的调节方式
（1） 添加CaCO3 采用生理酸性铵盐作为氮源时，由于NH4+被利用，剩下的酸根引起pH下降；有机酸发酵时形成钙盐沉淀。
但是，碳酸钙用量大，消毒困难，易堵塞管道，在操作上易引起染菌，而且对产物的提取有影响。此法在工业上不使用。
（2） 氨水、尿素流加法
（3） 其他方法 酶制剂、抗生素发酵通过加糖、淀粉来控制pH。如表霉素 根据代谢需要，改变加糖率，比固定加糖而用酸碱调节pH增产25%。
三、 供氧对发酵的影响通风适量 生成谷氨酸通风过量 生成α-酮戊二酸
通风不足 生成乳酸或琥珀酸
谷氨酸发酵时不同容积发酵罐的搅拌转速和通风比发酵罐容积m3 0.05 0.5 5 10 20 50
搅拌转速r/min 550 300 185 160 140 110
通风比（m3/ m3,Min） 1:0.5-0.6 1:0.3 1:0.18-0.2 1:0.16-0.17 1:0.15 1:0.12
四、 泡沫的消除
1、 泡沫给发酵造成的影响
a） 过多，升到罐顶从轴封渗出，造成染菌；
b） 使发酵罐装填系数减少，设备利用率下降；
c） 影响通风搅拌正常进行，影响氧的传递，妨碍菌的呼吸；
d ）增加菌群的非均一性，微生物随泡沫漂浮。
2、 泡沫形成的规律
泡沫的多少，一方面与搅拌、通风有关；另一方面，与培养基性质有关。蛋白质原料，如蛋白胨、玉米浆、黄豆粉、酵母粉等是主要发泡剂。
3、 泡沫的消除机械消泡：利用机械力将泡沫打破，或借压力变化使泡沫破裂。最常用的是耙式消沫浆。
化学消泡：破泡作用——当消泡剂加入到发泡体系中，由于消泡剂的表面张力低（相对于发泡体系），在消泡剂接触液膜面时，成为泡膜的一部分，使液膜面扩大，变薄，同时使泡膜局部表面张大降低，力的平衡破坏，在力的作用下气泡破裂、合并，最后导致泡沫破灭。
消泡剂选用原则：
（1） 消泡剂必须是表面活性剂，具有较低的表面张力。
（2） 对气液界面的铺展系数必须足够大，以便能迅速发挥其消泡活性，这就要求消泡剂具有一定的亲水性。
（3） 在水中的溶液解度极小，保持持久的消泡或抑泡作用。
（4） 无毒，不影响发酵。
常用消泡剂：
（1） 天然油脂类，包括豆油、菜子油、花生油、玉米油等。由于油脂分子中无亲水基团，在发酵液中难铺展，所以消泡活性差，用量大，一般为发酵液的0.1-0.2%
（2） 聚醚类
GP亲水性差，溶液解度小，抑泡性能比消泡性能好；
GPE10亲水性好，易铺展，消泡性能强；但相应溶解度大，消泡活性维持时间短。用量一般为发酵液的0.01-0.03%
(3)硅酮主要是聚二甲基硅氧烷及衍生物，分子式为：
是无色液体，不溶于水，表面张力低达21dyn/cm（泡敌为33，向日葵油40，青霉素发酵液60-68 dyn/cm）。纯的聚二甲基硅氧烷的消泡能力奶低，因此常加分散剂来提高消泡活性，或乳化剂成乳状液。
硅酮消泡剂适用于微碱性发酵，对于微酸性发酵较差。
（4）醇类 十八醇是常用的一种，它可以单独或与载体一起使用。
五、 发酵过程主要变化及中间代谢
（一） 中间分析
1、 菌体形态和浓度 菌体形态的改变是代谢变化的反映，抗生素生产中以菌丝形态作为衡量种子质量，区分不同发酵阶段、控制代谢变化及决定发酵周期的依据之一。
2、 目的产物含量的测定 控制发酵生产以及决定放罐时间的重要参数。
3、 pH 反映营养物质消耗、产物形成的综合指标
4、 基质浓度 糖、氮、磷含量。控制这些物质的供给和消耗是提高产量的重要手段。
（二） 中间补料
菌体生长代谢需要一个合适的浓度，过高的浓度对菌体生长有抑制作用，过低，不能满足产物合成的需要。
中间补料主产生菌在分泌期有足够多而不过多的养料，使代谢活动朝着有利于合成产物的方向发展，延长分泌期，提高抗生素产量。
1、 补糖：
开始补糖的时间 过早，刺激生长，加速糖利用；过迟，所需能量跟不上。谷氨酸发酵在对数生长期的末期补料；
补糖方式 连续流加，少量多次间歇补入和大量少次补入三种方式。
注意要避免环境突然变化对代谢带来影响。
补糖量：以维持稳定的糖浓度；如，四环素发酵还糖维持在0.8-1.2%
例子：谷氨酸追加糖液发酵在原工艺基础上，加大接种量到10%，增加生物素用量达5μg/L，减少初糖浓度（12%——7-8%）尽快获得大量的生产型菌体，当菌体处在生长对数期后进入产酸期，糖浓度在2%左右时，连续流加糖果液，维持2%左右的糖浓度。
优点：低浓度发酵，以利于生长和发酵
总糖浓度达20%，产酸高。
2、 补氮：
流加尿素，一方面调节pH，另一方面补氮谷氨酸发酵时，初尿用量和补尿多少取决于菌种的脲酶活力强弱和耐尿能力；
As1.299 脲酶活力低，耐尿强，初尿用量多2%，流加次数少
T6-13 脲酶活力强，耐尿低，初尿用量少0.6%，流加以少量多次好
As1.524 1-1.4%
第六节：谷氨酸的提取（2～3学时）
第一节 发酵液的性质和发酵废液的综合利用一、 发酵液性质发酵呈浅黄色浆状，温度34～36℃，pH7左右
1） 谷氨酸以铵盐形式存在
2） 含无机盐，有K，Na,NH4+,Mg,Ca,Fe,Cl,SO4,PO4等，还有残糖、色素、尿素等。此外，还有消泡剂。
3） 大量菌体、蛋白质等固形物悬浮在发酵液中，湿菌体约占发酵液的5-8%
4） 发酵液中尚有其他副产物。有机酸类有乳酸、α-酮戊二酸、琥珀酸等；氨基酸类有Asp、Ala、Val、Pro、Ile、Leu、Gly、His、Gln等。各种氨基酸量小于1%
5） 铵离子0.6-0.8%，残糖0.5%
6） 腺嘌呤0.02-0.05%，而尿嘧啶约占001-0.03%
二、 菌体分离菌体很轻很小，大小为0.7~1.0×1.0~3微米
1） 机械分离
2） 添加凝聚剂
第二节 等电点法提取谷氨酸
p220-223
1、 谷氨酸结晶性质：
α型：晶体粗壮，呈颗粒状，质量重，易沉降，与母液分离容易
β型：晶轴长短不一，呈针状或鳞片状，晶粒微细，纯度低，难沉降。
2、 影响结晶析出的主要因素
温度：（a）影响溶解度；
温度℃ 0 5 10 15 20 25 30 35
溶解度% 0.341 0.411 0.495 0.596 0.717 0.864 1.040 1.250
（b）影响晶型
30℃以下，α型为主；30℃以上，β型为主
在中和调等电点过程中，发酵液的温度应缓慢下降，结晶颗粒大。若温度下降过于迅速，晶核小而多。
加酸：
缓慢加酸，使谷氨酸溶解度逐渐降低，可控制一定数量的晶核，即晶核不会形成太多，经养晶育晶后成长壮大，析出的结晶颗粒大。加酸过快，容易形成局部过饱和，晶核过多，结晶细小，不易沉降分离。
晶种：
晶核形成以前，适时投放一定量的晶种，有利于收率的提高，投放晶种条件一定要准确，过早，晶种化掉；过迟，刺激更多晶核形成。
投放目的：控制一定数量的晶核，并以晶核为核心，使其不断长大。
国外的提取技术：
发酵液 菌体过滤（加助滤剂或超速离心） 四效浓缩10倍
冷却到室温调pH3.2 谷氨酸析出90%，纯度86-90%
优点：1 吨水产生0.25吨蒸汽，二次蒸汽利用，很经济
废水量减少为国内的1/10，盐酸用量减少
菌体回用，提取核苷酸等贵重药品，或作为饲料；菌体存在于发酵液中,不利于谷氨酸的结晶分离。
清洁生产工艺
由谷氨酸制成味精p336
