中国药典三部附录（2005年版）
135种
页码数,2005版药典附录第44页
附录VI G A群脑膜炎球菌多糖
第一法测磷法(仲裁法)
本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数(KD)和多糖在规定KD值以前的回收率。
试剂 (1)流动相取氯化钠11．7g、叠氮钠0．1g，加水使溶解成1000ml，混匀，
用O．1mol／L氢氧化钠溶液调节pH至7．O。
(2)蓝色葡聚糖2000溶液 取蓝色葡聚糖2000 20mg，加流动相使溶解成10ml。
(3)维生素B12溶液称取10mg维生素B12，加流动相使溶解成10ml。
色谱柱的制备取琼脂糖4B凝胶或琼脂糖CL-4B凝胶约200ml，加流动相400ml充分搅拌，放置约1小时使其沉淀，倾去上层含悬浮颗粒的悬液。如此反复3～5次后，加流动相200ml，混匀，抽去凝胶中的空气，装于1．5cm×90cm色谱柱中，约
87cm高，．用流动相洗脱，流速为每小时15～20ml，以2～3倍柱床体积的流动相洗脱(约500m1)，使柱床平衡。
色谱柱的标定取蓝色葡聚糖2000溶液lml加于已平衡的色谱柱中，以流动相洗脱，流速每小时15～20ml，用组分收集器收集洗脱液，每管收集3～5ml，照紫外
-可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长260nm处测定各管洗脱液的吸光度，以吸光度为纵坐标，洗脱液体积(m1)为横坐标分别作图，260nm波长处的峰顶洗脱液体积为空流体积V0。
取维生素B12溶液lml，自“加于已平衡的色谱柱中起，同法操作，370nm波长处的峰顶洗脱液体积为柱床体积Vi。
测定法取供试品约lml(含多糖抗原3～5mg，如为冻干制品可用流动相溶解)，加于已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，用组分收集器收集洗脱液，每管收集5ml，
照磷含量测定法(附录ⅦA)测定每管洗脱液的磷含量。以供试品每管洗脱液的磷含量为纵坐标，洗脱液体积(m1)为横坐标作图，主峰峰顶洗脱液体积为Ve。
按下式计算
KD=ve-v0/Vi-V0。
式中KD为供试品分配系数；
Ve为供试品洗脱液体积，ml；
V0为空流体积，ml；
Vi为柱床体积，ml。
计算供试品在KD值<0．5的多糖回收率
Rx(％)=Ax/At×100％
式中Rx为KD值<O．5供试品的多糖回收率；
Ax为供试品在KD值<O．5各管洗脱液的磷含量 之和；
At为供试品所有管洗脱液的磷含量之和。
第二法仪器法
试剂与色谱柱的制备同第一法。
色谱柱的标定取蓝色葡聚糖2000溶液lml与维生素B12溶液0．2ml，混匀后加于已平衡的色谱柱中，以流动相洗脱，流速每小时15～20ml，检测波长206nm，用组分收集器收集洗脱液，记录色谱图，色谱图中，第一峰为蓝色葡聚糖2000峰，
峰顶的洗脱液体积为空流体积V0；第二峰为维生素B12的峰，峰顶的洗脱液体积为柱床体积Vi。
测定法取供试品约lml(含多糖抗原3～5mg，如为冻干制品可用流动相溶解)，
加于已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，流速为每小时15～20 ml，检测波长
206nm，用组分收集器收集洗脱液，记录色谱图，即得。
按下式计算
KD=Ve-V0/Vi-V0
式中KD为供试品分配系数；
V为供试品洗脱液体积，ml,
K为空流体积，m1；
Ⅵ为柱床体积，ml。
计算供试品在KD值<O．5多糖回收率
Rx(％)=Ax/At*100％
式中凡为KD值<O．5供试品的多糖回收率(％)；
Ax为供试品在KD值<O．5的色谱图面积；
A0为供试品色谱图总面积。
【附注】 过柱操作在10～20℃进行。
书页号：2005版药典三部附录71页
附录Ⅺ K IgG含量测定法
(紫外-可见分光光度法)
本法系依据免疫球蛋白G(IgG)与相应的抗体特异性结合后，在适宜的电解质、温度、pH条件下，产生凝集反应，形成抗原抗体复合物，根据供试品的吸光度求出供试品中IgG的含量。
试剂 (1) 缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.42g、氯化钠9g、聚乙二醇
(PEG 6000)50g、牛血清白蛋白(BSA)1g、叠氮钠(NaN3)1g，加水溶解，用1.0mol/L盐酸调
pH至7.4，加水稀释至1000ml。
(2) 抗人IgG血清 按说明书要求将冻干抗人IgG血清复溶，按标示效价取一定量抗人IgG血清，加缓冲液稀释至抗体最终效价为1：4(例如，抗人IgG血清效价为
1：100，取原液2ml加抗体缓冲液48ml)，充分混匀，0.45μm膜过滤。4℃保存备用。
IgG标准品溶液的制备 用生理氯化钠溶液将IgG标准品在每1ml含0.2～6.0mg范围内做适当的系列稀释(通常做5个稀释度)。
供试品溶液的制备 用生理氯化钠溶液将供试品稀释成高、中、低3个稀释度，其IgG含量均应在标准曲线范围内。
测定法 取供试品溶液10μl，加已预热至37℃的抗体液1ml，混匀，每个稀释度做2管，37℃水浴中保温1小时，充分混匀，照紫外-可见分光光度法(附录Ⅱ A)，
于波长340nm处分别测定吸光度。
用IgG标准品溶液10μl替代供试品溶液，同法操作。
计算标准品和供试品不同稀释度溶液的吸光度的均值。将标准品溶液的IgG
含量的对数对其相应的吸光度的对数进行直线回归，相关系数应不低于0.99；然后将供试品溶液吸光度的对数值代入回归方程，求得值的反对数，再乘以稀释倍数，求取每1ml供试品溶液IgG含量(g/L)，再由供试品各稀释度IgG含量求平均值，
即为供试品IgG含量(g/L)。
【附注】 (1) 全部反应管必须在10分钟内测量完毕。
(2) 设置紫外分光光度计狭缝宽度(Slit Width)为2nm。
(3) 每次测定可根据供试品IgG含量，适当调整标准品溶液中IgG含量范围。
页码数,2005版药典附录第32页
附录ⅥF 0一乙酰基测定法
试剂 (1)2mol／L盐酸羟胺溶液 称取盐酸羟胺13．9g，加水溶解并稀释至lOO
ml，冷处保存。
(2)3．5mol／L氢氧化钠溶液称取氢氧化钠14．Og，加水使溶解并稀释至100ml。
(3)4mol／L盐酸溶液量取盐酸33．3ml，加水稀释至lOOml的溶液。
(4)0．37mol／L三氯化铁一盐酸溶液 称取三氯化铁(FeCl3·6H20)10．Og，加
O．1mol／L盐酸溶液溶解并稀释至100ml。
(5)碱性羟胺溶液 取等体积的盐酸羟胺溶液(2mol／L)与氢氧化钠溶液
(3．5mol／L)混合。3小时内使用。
对照品溶液的制备精密称取已干燥至恒重的氯化乙酰胆碱22．7mg(或溴化乙酰胆碱28．3mg)，置50ml量瓶中，加0．001mol／L醋酸钠溶液(pH4．5)溶解并稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液的制备 取供试品，用水稀释成O-乙酰基浓度为O．5～2．5mmol／L
的溶液。
测定法精密量取氯化乙酰胆碱(或溴化乙酰胆碱)对照品溶液O．2ml、0．4ml、
O．6ml、O．8ml、1_Oml，分别置试管中，补加水至lml，加新鲜配制的碱性羟胺溶液2ml，摇匀，于室温放置4分钟，加4mol／L盐酸lml，调pH值至1．2±O．2，摇匀，加O．37mol／L三氯化铁一盐酸溶液lml，摇匀，照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长540nm处测定吸光度。另精密量取上述相应的系列对照品溶液，
自“补加水至lml※’起，除加酸与加碱性羟胺的次序颠倒外，同法操作，用作对应的空白对照。
精密量取供试品溶液Iml置试管中，自“加新鲜配制的碱性羟胺溶液2ml※’起，同法操作。并取供试品溶液Iml，同法操作，用作供试品的空白对照。
将标准管各吸光度分别减去相应的空白对照管的吸光度，以标准管中所含的对照品溶液的体积与对应的吸光度作直线回归，将供试品的吸光度减去供试品溶液空白吸光度代入直线回归方程，计算出每Iml供试品相当于对照品溶液的体积(E，m1)。
供试品中O-乙酰基含量(mm01／L)=E×2．5式中2．5为对照品溶液中乙酰胆碱的含量(mmol／L)。
页码数,2005版药典附录第22页
附录ⅣC SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法
大多数蛋白质与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
仪器恒压或恒流电源，垂直板或圆盘电泳槽和制胶模具。
试剂 (1)水(电阻率不低于18．2MΩ．cm)
(2)A液 1．5mol／L三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲 液。称取三羟甲基氨基甲烷18．15g，加适量水溶解，用 盐酸调pH值至8．8，加水稀释至100ml。
(3)B液 30％丙烯酰胺一0．8％N，N’一亚甲基双丙烯酰胺溶液(避光保存)。
(4)C液1％十二烷基硫酸钠溶液。
(5)D液10％四甲基乙二胺溶液。
(6)E液10％过硫酸铵溶液，临用前配制。
(7)F液 O．5mol／L三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液。称取三羟甲基氨基甲烷6．05g加适量水溶解，用盐酸调pH值至6．8，加水稀释至100ml。
(8)电极缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷3g、甘氨酸14.4g、十二烷基硫酸钠1g，
加适量水溶解，用盐酸调pH值至8．3，加水稀释至1000ml。
(9)供试品缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷O．303g、溴酚蓝2mg、十二烷基硫酸钠O．8g，量取盐酸0．189ml、甘油4ml，加水溶解并稀释至10ml，此溶液用于非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，如用于还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，则再加
β-巯基乙醇2ml。
(10)分子量标准供试品的分子量应包括在使用的分子量标准范围之内。
(11)固定液量取甲醇250ml、冰醋酸60ml，加水稀释至500ml。
(12)漂洗液量取乙醇100ml、冰醋酸50ml，加水稀释至1000m|。
(13)辅染液称取重铬酸钾10g，量取硝酸2ml加适量水溶解并稀释至200ml。用前40倍稀释。
(14)银染液称取硝酸银2．04g，加水溶解并稀释至1000ml。
(15)显色液称取碳酸钠30g加适量水溶解，加甲醛O．5ml，并稀释至1000ml。
(16)终止液量取冰醋酸10ml加水稀释至1000ml。
(17)考马斯亮蓝染色液称取考马斯亮蓝R250 1g，加入甲醇200ml、冰醋酸
50ml、水250ml混匀。
页码数,2005版药典附录第50页
附录ⅨH SV40核酸序列检查法
本法系通过设计两对特异引物扩增SV40 VPl 100bp(2220～2319)和大T抗原C-末端
451bp(2619～3070)两个片段，采用聚合酶链反应(PCR)检查供试品中是否存在SV40核酸序列。
供试品溶液及对照溶液的制备取供试品400μ1，加2％蛋白酶K溶液25μ1、10％
SDS溶液50μl、O．05mol／L EDTA溶液(pH8．O)10μ1，56℃培养1小时，用等体积的酚
-三氯甲烷(1：1)混合液抽提后，再用等体积的三氯甲烷抽提，加2倍体积的乙醇，
-20℃放置16小时，以每分钟10000转离心15分钟，沉淀用75％乙醇溶液洗涤干燥，
加无DNA酶和RNA酶的水10μl，使溶解。阳性及阴性对照按上述方法与供试品同时处理。
引物
VPl上游引物：2220 5※_ACA CAG CAA CCA CAG TGG TTC-3’2240
VPl下游引物：2319 5※_GTA AAC AGC CCA CAA ATG TCA AC-3’2297
T抗原C_末端上游引物：3070 5※-GAC CTG TGG CTG AGT TTG CTC A-3’3049
T抗原c_末端下游引物：2619 5’一GCT TTA TTT GTA ACC ATT ATA AG-3’2641
检查法 (1)每个待扩增的供试品引物加量为30×10-12 mol，DNA模板加量为1μl，总体积50μl。在PCR仪上以94℃先变性3分钟；94℃变性20秒、50℃C退火20秒、72℃延伸40秒共进行40个循环；72℃延伸3分钟。
(2)扩增产物电泳检查：2％琼脂糖凝胶(每lml含1μg溴化乙锭)，缓冲液为1×TAE，
在100V条件下电泳40分钟，检查扩增片段。VPl扩增片段为100bp，大T抗原C_末端片段为451bp。
(3)以同样模板重复扩增VPl片段，排除污染因素导致的非特异扩增；或将扩增产物及对照从胶上移至Hybond N尼龙膜上，与VPl探针进行免疫印迹试验以证明所扩增片段确为VPl片段。
(4)以自动测序仪对供试品及阳性对照的大T抗原C_末端扩增产物进行序列测定。
结果判定 阳性对照应得到特异产物，阴性对照应无相应片段，则试验成立。
若未能扩出VPl片段，则结果判定为未检出SV40核酸序列。
若扩增出VPl片段，可重复试验1次，仍未扩增出VPl片段者，判定为未检出
SV40核酸序列。
若重试仍能扩增出VPl片段，则应扩增大T抗原C-末端片段，如扩增出大T抗原
C-末端片段，则其扩增产物和阳性对照扩增产物进行测序并比较，核酸序列一致判定为检出SV40核酸序列；如未扩增出大T抗原C-末端片段，则可按上述步骤
(1)～(3)重复试验1次，如仍未扩增出大T抗原C_末端片段，则可判定为未检出
SV40核酸序列。
页码数,2005版药典附录第24页
附录V
除另有规定外，水溶液的pH值应以玻璃电极为指示电极、饱和甘汞电极为参比电极的酸度计进行测定。酸度计应定期进行计量检定，并符合国家有关规定。测定前，应采用下列标准缓冲液校正仪器，也可用国家标准物质管理部门发放的标示pH值准确至0．01pH单位的各种标准缓冲液校正仪器。
1．仪器校正用的标准缓冲液
(1)草酸盐标准缓冲液精密称取在54~C±3~C干燥4～5小时的草酸三氢钾12．71g，
加水使溶解并稀释至1000ml。
（2）苯二甲酸盐标准缓冲液 精密称取在115℃± 5℃干燥2～3小时的邻苯二甲酸氢钾10．21g，加水使溶解并稀释至1000ml。
(3)磷酸盐标准缓冲液 精密称取在115℃士5℃干燥2～3小时的无水磷酸氢二钠
3．55g与磷酸二氢钾3．40g，加水使溶解并稀释至1000ml。
(4)硼砂标准缓冲液精密称取硼砂3．81g(注意避免风化)，加水使溶解并稀释至1000ml，置聚乙烯塑料瓶中，密塞，避免空气中二氧化碳进入。
(5)氢氧化钙标准缓冲液 于25℃，用无二氧化碳的水制备氢氧化钙的饱和溶液，取上清液使用。存放时应防止空气中二氧化碳进入。一旦出现浑浊，应弃去重配。
上述标准缓冲溶液必须用pH值基准试剂配制。不同 温度时各种标准缓冲液的pH值如下表（表略）。
2．注意事项
测定pH值时，应严格按仪器的使用说明书操作，并注意下列事项。
(1)测定前，按各品种项下的规定，选择二种pH值约相差3个pH单位的标准缓冲液，并使供试液的pH值处于二者之间。
(2)取与供试液pH值较接近的第一种标准缓冲液对仪器进行校正(定位)，使仪器示值与表列数值一致。
(3)仪器定位后，再用第二种标准缓冲液核对仪器示值，误差应不大于±0．02pH
单位。若大于此偏差，则应小心调节斜率，使示值与第二种标准缓冲液的表列数值相符。重复上述定位与斜率调节操作，至仪器示值与标准缓冲液的规定数值相差不大于0．02pH单位。否则，需检查仪器或更换电极后，再行校正至符合要求。
(4)每次更换标准缓冲液或供试液前，应用纯化水充分洗涤电极，然后将水吸尽，也可用所换的标准缓冲液或供试液洗涤。
(5)在测定高pH值的供试品和标准缓冲液时，应注意碱误差的问题，必要时选用适当的玻璃电极测定。
(6)对弱缓冲液(如水)的pH值测定，先用苯二甲酸盐标准缓冲液校正仪器后测定供试液，并重取供试液再测，直至pH值的读数在1分钟内改变不超过±0·05止；然后再用硼砂标准缓冲液校正仪器，再如上法测定；二次pH值的读数相差应不超过O．1，取二次读数的平均值为其pH值。
(7)配制标准缓冲液与溶解供试品的水，应是新沸过并放冷的纯化水，其pH值应为5．5～7．0。
(8)标准缓冲液一般可保存2～3个月，但发现有浑浊、发霉或沉淀等现象时，
不能继续使用。
页码数,2005版药典附录第67页
附录ⅪE白喉抗毒素效价测定法(家兔皮肤试验法)
本法系根据抗毒素能中和毒素的作用，将供试品与标准品进行对比试验，
推算出每lml供试品中所含抗毒素的国际单位数(IU／m1)。
试剂 稀释液(硼酸盐缓冲盐水) 称取氯化钠8．5g、硼酸4．5g、四硼酸钠
(Na2 B4()7·10H20)O．5g，加水使溶解至1000ml，过滤，灭菌后pH值为7．O～7．2。
白喉抗毒素标准品溶液的制备取白喉抗毒素标准品适量，稀释至每lml含
1／5 IU，即与毒素等量混合后每 O．1ml注射量中含1／300 IU。白喉抗毒素标准品原液的一次吸取量应不低于0．5ml。
供试品溶液的制备将供试品稀释成数个稀释度，使每lml含抗毒素约
1／15 IU，其稀释度间隔约为5％～10％。
测定法 将毒素稀释至每lml含20个试验量(1／300 Lr)，即与抗毒素等量混合后每O．1ml注射量中含1个试验量(1／300 Lr)。定量吸取稀释后的抗毒素标准品溶液及不同稀释度的供试品溶液分别加入小试管中，每管加入等量的稀释毒素溶液，混合均匀，加塞，37℃结合1小时后，立即注射。
选用体重2～3kg的健康白皮肤家兔，试验前1日用适宜方法进行背部脱毛，
凡皮肤有发炎或大量斑点现象者不应使用。每份供试品溶液注射2只家兔，每只家兔不能超过4份供试品溶液。每稀释度注射O．1ml于家兔皮内(应在近背脊两侧)。每只家兔至少应包括3个不同注射部位(前、中、后)的对照试验。标准品溶液与供试品溶液不得用同一支注射器注射。
结果判定试验家兔于注射后48小时及72小时各观察1次，并测量反应面积。
以48～72小时结果作最后判定。注射对照部位一般于48～72小时内轻度发红，其直径应为10～14mm。供试品之效价应以与多数对照的反应强度相同之最高稀释度判定之，但反应强度不得超过对照。有下列情况之一者应重试：
(1)对照反应不符合规定标准；
(2)供试品的稀释度过高或过低；
(3)反应不规则。
【附注】毒素由国家药品检定机构提供，亦可自行制备，但应选经保存1年以上、毒力适宜的毒素。试验用的毒素须以国家药品检定机构分发的标准抗毒素准确标定其试验量(1／300 Lr)，并应每3个月复检一次。毒素应保存于2～8℃避光处，并加入甲苯或其他适宜防腐剂。
页码数,2005版药典附录第34页
附录ⅥM苯酚测定法
本法系依据溴酸盐溶液与盐酸反应产生溴，遇苯酚生成三溴苯酚，过量的溴与碘化钾反应释出碘，析出的碘用硫代硫酸钠滴定液滴定，根据硫代硫酸钠滴定液的消耗量，可计算出供试品中苯酚的含量。
测定法精密量取供试品lml，置具塞锥型瓶中，加水50ml，精密加人
0．02mol／L溴溶液(取溴酸钾O．56g，加溴化钾3g，加水溶解并稀释成1000m1)15～
25ml(供试品含苯酚量0．3％～0．5％时加25ml，小于O．3％则加15 m1)，沿瓶壁加入6mol／L盐酸溶液lOml，摇匀，密塞，在暗处放置30分钟后，加25％碘化钾溶液
2ml于具塞锥型瓶颈口，稍启瓶塞，使流下，密塞，摇匀。以少量水洗瓶颈，用硫代硫酸钠滴定液(O．02mol／L)滴定至近终点时，加淀粉指示液约O．5ml，滴定至蓝色消失。并将滴定的结果用空白试验校正。
按下式计算
苯酚含量(％)=(Vo-V1)*c*15．69*100/1000
式中VO为空白试验消耗硫代硫酸钠滴定液的体积，ml；
V1为供试品消耗硫代硫酸钠滴定液的体积，ml；
c为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol／L；
15．69为苯酚相对分子质量的1／6。
【附注】 (1)硫代硫酸钠滴定液(O．1mol／L)的制备及标定取硫代硫酸钠26g与无水碳酸钠0·20g，加新沸过的冷水适量溶解并稀释成1000ml，摇匀，放置1个月后滤过。取在120~C干燥至恒重的基准重铬酸钾O·15g，精密称定，置碘瓶中，加水50ml溶解，加碘化钾2·Og，轻轻振摇使溶解，加稀硫酸(5．7—100)40ml，摇匀，
密塞；在暗处放置10分钟后，加水250ml稀释，用本液滴定至近终点时，加淀粉指示液(取可溶性淀粉O·5g，加水5ml混悬后，缓缓倾入100ml沸水中，随加随搅拌，继续煮沸2分钟，冷却，倾取上层清液。本液应临用配制)3ml，继续滴定至蓝色消失而显亮绿色，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml硫代硫酸钠滴定液(O·lmol／L)相当于4．903mg重铬酸钾。根据本液的消耗量与重铬酸钾的取用量，算出本液的浓度，即得。
(2)硫代硫酸钠滴定液(0．02mol／L)的制备 精密量取硫代硫酸钠滴定液
(o．1mol／L)100ml，加水准确稀释至500ml，摇匀。
(3)可做限度测定。
页码数,2005版药典附录第26页
附录V C崩解时限检查法
本法系用于检查曰服固体制剂在规定条件下的崩解情况。
崩解系指口服固体制剂在规定条件下全部崩解溶散或成碎粒，除不溶性包衣材料或破碎的胶囊壳外，应全部通过筛网。如有少量不能通过筛网，但已软化或轻质上漂且无硬心者，可作符合规定论。
凡规定检查溶出度、释放度或融变时限的制剂，不再附录V C崩解时限检查法进行崩解时限检查。
一、片剂
仪器装置采用升降式崩解仪，主要结构为一能升降的金属支架与下端镶有筛网的吊篮，并附有挡板。
升降的金属支架上下移动距离为55mm±2mm，往返频率为每分钟30～32次。
吊篮 玻璃管6根，管长77．5mm±2．5mm，内径21．5mm，壁厚2mm；透明塑料板2块，直径90mm，厚6mm，板面有6个孔，孔径26mm不锈钢板1块(放在上面一块塑料板上)，直径90mm，厚lmm，板面有6个孔，孔径22mm;不锈钢丝筛网1张(放在下面一块塑料板下)，直径90mm，筛孔内径2．0mm；以及不锈钢轴1根(固定在上面一块塑料板与不锈钢板上)，长80mm。将上述玻璃管6根垂直置于2块塑料板的孔中，并用3只螺丝将不锈钢板、塑料板和不锈钢丝筛网固定，即得(如图1)。
单位：mm
图1 （图略）
挡板为一平整光滑的透明塑料块，相对密度1．18～1．20，直径20．7mm±
0．15mm，厚9．5mm±O．15mm；挡板共有5个孔，孔径2mm，中央1个孔，其余4个孔距中心6mm，各孔间距相等；挡板侧边有4个等距离的V形槽，V形槽上端宽
9．5mm，深2．55mm，底部开口处的宽与深度均为1．6mm(如图2)。
检查法将吊篮通过上端的不锈钢轴悬挂于金属支架单位：mm
图2（图略）
上，浸入1000ml烧杯中，并调节吊篮位置使其下降时筛网距烧杯底部25mm，烧杯内盛有温度为37~C土1℃的水，调节水位高度使吊篮上升时筛网在水面下
15mm处。
除另有规定外，取供试品6片，分别置上述吊篮的玻璃管中，启动崩解仪进行检查，各片均应在15分钟内全部崩解。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
薄膜衣片，按上述装置与方法检查，并可改在盐酸溶液(9一lOOO)中进行检查，应在30分钟内全部崩解。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
糖衣片，按上述装置与方法检查，应在1小时内全部崩解。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
肠溶衣片，按上述装置与方法，先在盐酸溶液(9-1000)中检查2小时，每片均不得有裂缝、崩解或软化现象；继将吊篮取出，用少量水洗涤后，每管加入挡板1块，再按上述方法在磷酸盐缓冲液(pH6．8)中进行检查，1小时内应全部崩解。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
含片，除另有规定外，按上述装置和方法检查，各片均应在30分钟内全部崩解或溶化。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
舌下片，除另有规定外，按上述装置和方法检查，各片均应在5分钟内全部崩解并溶化。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
可溶片，除另有规定外，水温为15～25~C，按上述装置和方法检查，各片均应在3分钟内全部崩解并溶化。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
结肠定位肠溶片，除另有规定外，按上述装置照品种项下规定检查，各片在盐酸溶液(9—1000)及pH6．8以下的磷酸盐缓冲液中均应不释放或不崩解，而在
pH7．8～8．o的磷酸盐缓冲液中1小时内应全部释放或崩解，片心亦应崩解。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
泡腾片，取1片，置250ml烧杯中，烧杯内盛有200ml水，水温为15～25~C，有许多气泡放出，当片剂或碎片周围的气体停止逸出时，片剂应溶解或分散在水中，无聚集的颗粒剩留。除另有规定外，同法检查6片，各片均应在5分钟内崩解。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
二、胶囊剂
硬胶囊剂或软胶囊剂，除另有规定外，取供试品6粒，按片剂的装置与方法
(如胶囊漂浮于液面，可加挡板)检查。硬胶囊应在30分钟内全部崩解，软胶囊应在1小时内全部崩解。软胶囊可改在人工胃液中进行检查。如有1粒不能完全崩解，应另取6粒复试，均应符合规定。
肠溶胶囊剂，除另有规定外，取供试品6粒，按上述装置与方法，先在盐酸溶液(9一lOOO)中检查2小时，每粒的囊壳均不得有裂缝或崩解现象；继将吊篮取出，用少量水洗涤后，每管加入挡板，再按上述方法，改在人工肠液中进行检查，1小时内应全部崩解。如有1粒不能完全崩解，应另取6粒复试，均应符合规定。
三、滴丸剂
按片剂的装置，但不锈钢丝网的筛孔内径应为O．425mm；除另有规定外，取供试品6粒，按上述方法检查，应在30分钟内全部溶散，包衣滴丸应在1小时内全部溶散。如有1粒不能完全溶散，应另取6粒复试，均应符合规定。
以明胶为基质的滴丸，可改在人工胃液中进行检查。
【附注】人工胃液取稀盐酸16．4ml，加水约800ml与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000ml，即得。
人工肠液即磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH 6．8)(见二部附录XV D缓冲液)。
书页号：2005版药典三部附录11页
附录I L鼻用制剂
鼻用制剂系指直接用于鼻腔，发挥局部或全身治疗作用的生物制品。鼻用
制剂可分为鼻用液体制剂(滴鼻剂、洗鼻剂和鼻用喷雾剂)、鼻用半固体制剂(鼻
用软膏剂、鼻用乳膏剂和鼻用凝胶剂)、鼻用同体制剂(鼻用散剂、鼻用粉雾剂
和鼻用棒剂)等。
鼻用制剂在生产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产及质量控制应符合相关品种
要求。
二、鼻用制剂通常含有如调节黏度、控制pH值、增加活性成分溶解、提高
制剂稳定性或能够赋形的辅料。除另有规定外，多剂量水性介质鼻用制剂应
添加适宜浓度的抑菌剂。制剂本身如有足够抑菌性能，可不加抑菌剂。
三、鼻用制剂多剂量包装容器应配有完整的滴管或适宜材料组合成套，一
般应配有橡胶乳头或塑料乳头的螺旋盖滴管。容器应无毒并清洗干净，不应
与药物或辅料发生理化作用，容器的瓶壁要有一定的厚度且均匀，除另有规
定外，装量应不超过10m1或5g。
四、鼻用溶液制剂应澄清，不得有沉淀异物；鼻用混悬液可能含沉淀物，
但经振摇易分散；鼻用乳液可能有油水相分离，但经振摇易恢复成乳液。
五、鼻用制剂应无刺激性，对鼻黏膜及其纤毛不应产生副作用。如为水性
介质的鼻用制剂应等渗。
六、除另有规定外，鼻用制剂还应符合相应剂型制剂通则项下有关规定，
如鼻用喷雾剂应符合喷雾剂的规定。
除另有规定外，鼻用制剂应置2～8℃避光贮存和运输。
鼻用制剂应进行以下相应检查。
【重量差异或装量差异】 除另有规定外，单剂量包装的鼻用固体制剂或半
固体制剂重(装)量差异限度应符合规定。
检查法取供试品20个，分别称量内容物，计算平均重量，超过平均重量的
±10％者，不得过2个，并不得有超过平均重量的±20％者。
凡规定检查含量均匀度的鼻用制剂，可不作重(装)量差异的检查。
【装量】 除另有规定外，单剂量包装的鼻用液体制剂应符合规定。
取供试品10个，分别将内容物倾尽，测定其装量，均不得少于其标示量。
多剂量包装的鼻用制剂，照最低装量检查法(附录VF)检查，应符合规定。
【微生物限度】 除另有规定外，照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符
合规定。
凡规定进行无菌检查的鼻用制剂可不进行微乍物限度检查。
【无菌】 凡标签注明为无菌者，照无菌检查法(附录ⅫA)检查，应符合规定。
书页号：2005版药典三部附录76页
附录Ⅻ C 病毒外源因子检查法
病毒类制品在毒种选育和生产过程中，经常使用动物或细胞基质培养，因
此，有可能造成外源因子(特别是外源病毒因子)的污染。为了保证制品质量，需
要对毒种和细胞进行外源因子的检测。
病毒种子批外源因子检查
对病毒主种子批或工作种子批，应抽取足够检测试验需要量的供试品进行
病毒外源因子检测。在试验前应用非人源和非猴源(特殊情况除外)的特异性抗体
中和本病毒。制备抗血清(或单克隆抗体)所用的免疫原应采用与生产疫苗(或制
品)不同种而且无外源因子污染的细胞(或动物)制备。如果病毒曾在禽类组织或细
胞中繁殖过，则抗体不能用禽类来制备。若用鸡胚，应来自SPF鸡群。
1．动物试验法
(1) 小鼠试验法 取15～20g小鼠至少10只，用经抗血清中和后的病毒悬液，每
只脑内接种0.03ml，同时腹腔接种0.5ml。至少观察21天。在观察期内至少有80%最
初接种的小鼠存活，试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染，为符合要求。
解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠，直接肉眼观察其病理改变，
并将有病变的相应的组织悬液通过脑内和腹腔接种另外至少5只15～20g小鼠，并
观察21天，如果没有小鼠出现病毒感染，则符合要求。
(2) 乳鼠试验法 取出生后24小时内的乳鼠至少10只，用经抗血清中和后的病
毒悬液，脑内接种0.01ml，同时腹腔接种至少0.1ml。每天观察，至少14天。在观察
期内至少有80%最初接种的乳鼠存活，试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染，
为符合要求。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的乳鼠，直接肉眼观察
其病理改变，并取有病变的相应的组织和脑、脾制备成悬液通过脑内和腹腔接
种另外至少5只出生后24小时内的乳鼠，并每天观察至接种后第14天，如果没有
乳鼠出现病毒感染，则符合要求。
2．细胞培养法
(1) 非血吸附病毒检查 用经抗血清中和后的病毒悬液，分别接种于人源、猴
源和生产用的同种细胞。用人二倍体细胞生产的，还应接种另外一株人二倍体
细胞。每种细胞至少接种6瓶，每瓶病毒悬液接种量不少于培养液总量的25%。
于36℃±1℃培养，观察14天，必要时可更换细胞培养液，未见细胞病变为阴性，
符合要求。
(2) 血吸附病毒检查 上述接种病毒的各种细胞于第6～8天和第14天，每种细
胞各取出2瓶进行血吸附病毒检查。用0.2%～0.5%鸡和豚鼠红细胞混合悬液覆盖于
细胞表面，置2～8℃ 30分钟，然后置20～25℃ 30分钟，分别进行镜检，观察红细
胞吸附情况，结果应均为阴性。
3．鸡胚检查法
在禽类组织或细胞中繁殖过的病毒种子需用鸡胚检查禽类病毒的污染。选
用9～11日和5～7日龄两组SPF鸡胚，每组至少5只，分别于尿囊腔和卵黄囊接种经
抗血清中和后的病毒悬液，每胚0.5ml。孵育7日后，取尿囊液用豚鼠和鸡红细胞
混合悬液做血球凝集试验，应为阴性。被接种的鸡胚至少80%存活7天，试验有
效。
生产用细胞外源因子检查
1．非血吸附病毒检查
(1) 细胞直接观察 每批生产用细胞应留取5%(或不少于500ml)细胞悬液不接种
病毒，作为对照细胞加入与疫苗生产相同的细胞维持液，置与疫苗生产相同的
条件下培养，观察14天，在显微镜下观察是否有细胞病变出现，无细胞病变出现
者为阴性，符合要求。在观察期末至少有80%的对照细胞培养物存活，试验有效。
(2) 细胞培养试验 上述试验观察期末，收取上清液混合后，取适量接种于猴
源和人源的细胞培养物，如果疫苗病毒在非猴源或非人源其他细胞系上生产，
还应接种于同种不同批细胞。接种量应不少于总量的25%。每种细胞至少检查
5ml上清混合液，置与生产相同的培养条件下培养。无细胞病变者为阴性，符合
要求。
2．血吸附病毒检查
对上述细胞直接观察及细胞培养试验的细胞培养物在观察期末取至少25%的
细胞培养瓶进行血吸附病毒检查(方法同病毒种子批外源因子检查的血吸附病毒
检查)。
页码数,2005版药典附录第20页
附录ⅣA醋酸纤维素薄膜电泳法
试剂 (1)巴比妥缓冲液(pH8．6) 称取巴比妥2·76g、巴比妥钠15．45g，加水溶
解使成1000ml。
(2)氨基黑染色液称取氨基黑10B O．5g，溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的
混合液中。附录ⅣC SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
(3)漂洗液量取乙醇45mi、冰醋酸5ml及水50ml，混匀。
(4)透明液 量取冰醋酸25ml、无水乙醇75ml，混匀。
测定法取醋酸纤维素薄膜，裁成2cmX 8cm膜条，将无光泽面向下，浸入巴比
妥缓冲液(pH8．6)中，待完全浸透，取出夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液
后，将膜条无光泽面向上，置含巴比妥缓冲液(pH8．6)的电泳槽架上，通过滤
纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH8．6)中。于膜条上距负极端2cm处，条状滴加蛋白含
量约5％的供试品溶液2～3ffl，在O．4～O．6mA／cm[总电流量=电流量(mA／cm)×
每条膜的宽度(cm)×膜条数]电流条件下电泳；同时取新鲜人血清作对照，电泳时
间以白蛋白与丙种球蛋白之间的电泳展开距离约2cm为宜。电泳完毕，将膜条
取下浸于氨基黑染色液中，2～3分钟后，用漂洗液浸洗数次，直至脱去底色为
止。将洗净并完全干燥的膜条浸于透明液中，待全部浸透后，取出平铺于洁净
的玻板上，干燥后即成透明薄膜，可供测定纯度和作标本长期保存。将干燥的
醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪采用反射(未透明薄膜)或透射(已透明薄膜)方式在
记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图，以人血清作对照，按峰面积计算各蛋白
组分的含量(％)。
页码数,2005版药典附录第47页
附录ⅨC大肠杆菌菌体蛋白残留量测定法
本法系采用酶联免疫法测定大肠杆菌表达系统生产的重组制品中残留菌体
蛋白含量。
试剂 (1)包被液(pH9．6碳酸盐缓冲液) 称取碳酸钠O．32g、碳酸氢钠0．586g，
置200ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度。
(2)磷酸盐缓冲液(pH 7．4) 称取氯化钠8g、氯化钾0．2g、磷酸氢二钠l.44g、磷
酸二氢钾0．24g，加水溶解并稀释至500ml，121℃灭菌15分钟。
(3)洗涤液(pH 7．4) 取聚山梨酯20 0．5ml，加磷酸盐缓冲液至500ml。
(4)稀释液(pH 7．4) 称取牛血清白蛋白0．5g，加洗涤液溶解并稀释至100ml。
(5)浓稀释液称取牛血清白蛋白1．0g，加洗涤液溶解并稀释至100ml。
(6)底物缓冲液(pH5．0枸橼酸一磷酸盐缓冲液) 称取磷酸氢二钠
(Na2 HP04·12H20)1．84g、枸橼酸O．51g，加水溶解，并稀释至100ml。
(7)底物液取邻苯二胺8mg，30％过氧化氢30μ1，溶于底物缓冲液20ml中。(临用
时现配。)
(8)终止液1mol／L硫酸溶液标准品溶液的制备按菌体蛋白标准品说明书加水
复溶，精密量取适量，用稀释液稀释成每lml中含菌体蛋白500ng、250ng、125ng、
62．5ng、31．25ng、15．625ng、7．8125ng的溶液。
供试品溶液的制备取供试品适量，用稀释液稀释成每lml中约含250μg的溶液。
如供试品每lml中含量小于500μg时，用浓稀释液稀释一倍。
测定法取兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体适量，用包被液溶解并稀释成每lml中含
10μg的溶液，以100μl／孔加至96孔酶标板内，4℃放置过夜(16～18小时)。用洗涤
液洗板3次；用洗涤液制备1％牛血清白蛋白溶液，以200μl／孔加至板内，37℃放
置2小时；将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次；以100μ1／孔加入标准品溶液和
供试品溶液，每个稀释度做双孔，同时加入两孔空白对照(稀释液)，37℃(3放置
2小时；用稀释液稀释辣根过氧化酶(HRP)标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体1000
倍，以100μl孔加至板内，37℃放置1小时，用洗涤液洗板10次，以100μl／孔加入底
物液，37℃避光放置40分钟，以50μ1／孔加入终止液终止反应。用酶标仪在492nm
波长处测定吸光度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工
作图法计算。
以标准品溶液吸光度对相应的浓度作标准曲线，并以供试品溶液吸光度在
标准曲线上得到相应菌体蛋白含量，按以下公式计算
供试品菌体蛋白残留含量(％)= c*D*100%/T*1000000
式中 c为供试品溶液中菌体蛋白质含量，ng／ml；
D为供试品稀释倍数；
T为供试品蛋白质含量，mg／ml。
页码数,2005版药典附录第29页
附录ⅥA氮测定法
(半微量法)
本法系依据含氮有机物经硫酸消化后，生成硫酸铵，硫酸铵被氢氧化钠分
解释放出氨，后者借水蒸气被蒸馏人硼酸液中生成硼酸铵，最后用强酸滴定，
依据强酸消耗量可计算出供试品的氮含量。
试剂(1)消化剂 称取硫酸铜(CuS04·5H20)10g、硫酸钾lOOg，置乳钵内，共同研
细，混匀。
(2)混合指示液0．2％溴甲酚绿乙醇溶液5份与O．1％甲基红乙醇溶液2份混合
配成。
(3)2％硼酸吸收液称取硼酸20g，加水溶解并稀释成1000ml，加混合指示液10ml，
混匀。
(4)硫酸滴定液(O．05mol／L) 取硫酸3ml，缓缓注入适量水中，冷却至室温，
加水稀释至1000ml，摇匀。
取在270～300℃干燥至恒重的基准无水碳酸钠约O．15g，精密称定，加水50ml
使溶解，加甲基红-溴甲酚绿混合指示剂10滴，用本液滴定至溶液由绿色转变为
紫红色时，煮沸2分钟，冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。每
lml硫酸滴定液(O．05tool／L)相当于5．30mg的无水碳酸钠。根据本液的消耗量与
无水碳酸钠的取用量，算出本液的浓度，即得。
(5)硫酸滴定液(0．005tool／L)的配制 精密量取硫酸滴定液(0．05 tool／L)lOOml，
置于1000ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
测定法精密量取一定体积的供试品(约相当于含氮量1．0～2．Omg)，置凯氏
定氮瓶中，加消化剂约0．3g，硫酸lml消化至澄明，呈蓝绿色，继续消化约60分
钟。
取2％硼酸吸收液10ml置lOOml锥形瓶内，将凯氏蒸馏器冷凝管末端浸入硼酸
吸收液内，将消化好的供试品移入凯氏蒸馏器内，用水洗定氮瓶3～4次，将洗
液移入蒸馏器内，再加入50％氢氧化钠溶液5ml，然后进行蒸馏，待接收液总体
积约35～50ml，将冷凝管末端移出液面，使蒸汽继续冲洗约1分钟，用水淋洗尖
端后停止蒸馏。接收液用硫酸滴定液(O．005mol／L)进行滴定，至溶液由蓝绿色
变为灰紫色，并将滴定的结果用空白试验校正。
按下式计算
氮含量(mg／m1)=(Vx-Vo)*c*14．01*n*2/V
式中Vx为供试品消耗酸滴定液的体积，ml；
V0为空白消耗酸滴定液的体积，ml；
c为硫酸滴定液的浓度，mol／L；
n为供试品的稀释倍数；
V为供试品溶液的体积，ml；
14．Ol为氮的相对原子质量。
【附注】 (1)蒸馏前应蒸洗蒸馏器15分钟以上。
(2)蒸汽发生瓶内应加数滴硫酸及甲基红指示剂至呈明显红色。
(3)也可用全自动凯氏定氮仪测定。
页码数,2005版药典附录第29页
附录ⅥB蛋白质测定法
第一法凯氏定氮法
本法系通过测定供试品的总氮含量以及经钨酸沉淀去除蛋白的供试品滤液
中的非蛋白氮含量，计算出蛋白质的含量。
供试品溶液的制备 (1)总氮测定溶液的制备精密量取供试品lml，用生理氯化
钠溶液准确稀释至每lml含氮量约lmg。
(2)非蛋白氮测定溶液的制备 精密量取供试品2ml，加水14ml、10％钨酸钠溶
液2ml、硫酸溶液(1．86-100)2ml，摇匀，静置30分钟过滤，取滤液测定。
测定法精密量取总氮测定溶液lml，置凯氏定氮瓶中，照氮测定法(附录ⅥA)
测定供试品中总氮含量。同时做空白对照。
精密量取非蛋白氮测定溶液5ml，置凯氏定氮瓶中，照氮测定法(附录ⅥA)测
定供试品中非蛋白氮含量。
按下式计算
CTN(mg／m1)=(Vx1-Vo)*C*14．01*n*2/v1
CNPN(mg／m1)=(Vx2-Vo)*c*14．01*n*2/v2
CPN(mg/ml)=CTN-CNPN
供试品蛋白质含量(％，g／m1)=CPN*6．25*100/1000
式中CTN为供试品溶液总氮含量，mg／ml；
CNPN为供试品溶液非蛋白氮含量，mg／ml；
Vxl为供试品总氮测定溶液消耗酸滴定液的体积，ml；
Vx2为供试品非蛋白氮测定溶液消耗酸滴定液的体积，ml；
V0为空白试验消耗酸滴定液的体积，ml；
c为硫酸滴定液的浓度，mol／L；
CPN为供试品蛋白氮含量，mg／ml；
n为供试品的稀释倍数；
V1为供试品总氮测定溶液的体积，ml；
V2为供试品非氮测定溶液的体积，ml；
14．01为氮的相对原子质量；
6．25为常数(1g氮相当于6．25g蛋白质)。
【附注】 (1)供试品蛋白质含量如超过10％(g／m1)，除蛋白质时应适当加大供
试品稀释倍数，10％钨酸钠溶液及硫酸溶液用量相应地按比例增加，使溶液中
的钨酸浓度仍保持1％。
(2)总氮测定和非蛋白氮测定可用同一空白对照。
第二法Lowry法
本法用于微量蛋白质的含量测定。蛋白质在碱性溶液中可形成铜一蛋白质
复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm处
的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质
含量。
试剂(1)酚试剂 取钨酸钠(NazW04·2HzO)100g、钼酸钠(NazM004·2H20)25g，置1500ml
蒸馏瓶中，加入700ml水、85％磷酸50ml、盐酸100ml，上连回流管(使用木塞或锡纸
包裹的橡皮塞)微沸回流10小时。取下回流管，加入硫酸锂150g、水50ml、溴液几
滴，煮沸约15分钟，驱除过量的溴。冷却，加水至1000ml，过滤，为酚试剂贮备
液。
酚试剂贮备液用氢氧化钠滴定液(O．5mol／L)测定酸浓度，然后加水稀释至
相当于1mol／L盐酸浓度。
(2)碱性铜溶液 取0．1mol／L酒石酸钾溶液与O．04mol／L硫酸铜溶液各0．5 ml，
4％碳酸钠溶液与O．8％氢氧化钠溶液各25 m1，摇匀，即得。本液应临用配制。
(3)氢氧化钠滴定液(O．5mol／L)的配制及标定 取氢氧化钠适量，加水搅拌使
溶解成饱和溶液，冷却后，置聚乙烯塑料瓶中，静止数日，澄清后，取澄清的
氢氧化钠饱和溶液28ml，加新煮沸后冷却的水，使成1000ml，摇匀。
取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约3g，精密称定，加新沸过的冷
水50ml，振摇，使其尽量溶解；加酚酞指示剂2滴，用本液滴定；在接近终点
时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。每lml氢氧化钠滴定
液相当于102．1mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的
取用量，算出本液的浓度。
标准蛋白质溶液的制备取人血白蛋白标准品一支，用水定量稀释至每lml含
lmg，作为贮备液。精密量取贮备液2．5ml置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇
匀，即为每lml含100μg的标准蛋白质溶液。
测定法 精密量取一定体积供试品(含蛋白质50μg左右)置试管内，加水至lml，
加碱性铜溶液5ml，摇匀，室温放置10分钟，快速加入酚试剂O．5 ml，摇匀，室
温放置30分钟，显色后，照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长650nm处测
定吸光度(呈色后，如发现浑浊，经每分钟3000转离心15分钟后，取上清液测定)。
精密量取标准蛋白质溶液0．2ml、O．4ml、O．6ml、0．8ml、1．0m1分别置于试管
中，自"加水至Iml"0，同法操作。准确量取水lml，自“加碱性铜溶液5ml”起，同法
操作，作空白对照。以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度，求直线回归方
程；将测得供试品的吸光度代入直线回归方程，即得供试品的蛋白质含量。
第三法双缩脲法
本法系依据蛋白质肽键在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色深
浅与蛋白质含量成正比，利用标准蛋白质溶液作对照，采用紫外一可见分光光
度法测定供试品蛋白质含量。
试剂 双缩脲试剂。取硫酸铜(CuS04·5HzO)3．Og、酒石酸钾钠
(KNaC4H4 06·4HzO)9．0g、碘化钾5．Og、氢氧化钠24g，加水溶解并稀释至1000ml，
摇匀，即得。
标准蛋白质溶液的制备精密量取人血白蛋白标准品适量，用水定量稀释成
每lml含50mg的溶液。
供试品溶液的制备 精密量取适量的供试品，加水制成每lml约含50mg的溶液。
测定法 分别精密量取供试品溶液与标准蛋白质溶液各0．05ml置玻璃试管中，
分别加双缩脲试剂4．0ml，混匀，置37℃水浴中30分钟，照紫外一可见分光光
度法(附录ⅡA)，在波长540nm处测定吸光度。另精密量取水0．05ml，自"加双缩
脲试剂4．0ml"起，同法操作，作为空白对照。
按下式计算
蛋白质含量(mg／m1)=A1*C*n/A2
式中 A1为供试品溶液的吸光度；
A2 为标准蛋白质溶液的吸光度；
c为标准蛋白质溶液的浓度，mg／ml；
n为供试品稀释倍数。
【附注】 本法的测定范围为1～10mg。
页码数,2005版药典附录第22页
附录ⅣD等电聚焦电泳法
两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所
带的电荷与介质的pH值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，
当到达其等电点(此处的pH值使相应的蛋白质不再带电)时，电流达到最小，不
再移动。本法用于检测蛋白类供试品的等电点。
第一法等电聚焦垂直板电泳
试剂 (1)水(电阻率不低于18．2MΩ·cm)
(2)A液称取丙烯酰胺29．1g、亚甲基双丙烯酰胺0．9g，加适量水溶解，并稀
释至100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B液10％过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4倍浓度) 量取甘油8ml、40％两性电解质(pH3～10)溶液4ml，
加水至20ml。加0．1％甲基红溶液20μl。,
(5)固定液 称取三氯醋酸34．5g，磺基水杨酸10．4g，加水溶解并稀释至300
ml。
(6)脱色液(平衡液) 量取95％乙醇500ml、冰醋酸160ml，加水稀释至2000ml。
(7)染色液 称取考马斯亮蓝G250(或R250)0．35g，加脱色液300ml，在60～70℃水
浴中加热，使溶解。
(8)保存液 量取甘油30ml，加脱色液300ml，混匀。
(9)正极液(O．01mol／L磷酸溶液) 量取磷酸lml，加水至1800ml。
(10)负极液(0．01mol／L氢氧化钠溶液) 称取氢氧化钠0．4g，加少量水溶解
后，加水至1000ml。
供试品溶液的制备供试品对水透析(或用其他方法)脱盐后，与供试品缓冲液
按3：1混匀(供试品溶液最终浓度应在每lml含0．5mg以上，如供试品浓度太低，
则需要采用适当方法浓缩)。
测定法装好垂直平板电泳槽，压水，于玻璃板和玻璃 纸之间加入60％甘油
lml。取水12ml、甘油2ml、A液4．0ml、两性电解质(pH3～10)溶液(或其他两性电解
质)1．0ml，混匀，脱气，再加B液72μl，N，N，N※，N※一四甲基乙二胺3μl，混
匀后注入槽内聚合1小时。每孔加供试品缓冲液20μl，接通冷却循环水，于lo℃
250v(约10mA)条件下电泳30分钟。每孔加样20μl。于10~C 500V(约10mA)，上限电压
2000V条件下，电泳约3．5小时。同时做等电点标准。电泳结束后，即将凝胶放
入固定液中固定20分钟以上，取出，放入平衡液中20～30分钟，再放人染色液中
40～60分钟，然后用脱色液浸洗至背景无色，取出放人保存液中30分钟。亦可做
成干胶保存。根据标准品的等电点(pI对其相应的迁移距离作直线回归，将供试
品的迁移距离代入直线回归方程，求出供试品的等电点。
第二法等电聚焦水平板电泳
试剂 (1)水(电阻率应不低于18MΩ·cm)附录V A pH值测定法
(2)A液称取丙烯酰胺29．1g、亚甲基双丙烯酰胺O．9g，加适量水溶解，并稀
释至100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B液10％过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)固定液 称取三氯醋酸34．5g、磺基水杨酸10．4g，加水溶解并稀释至
300ml。
(5)脱色液(平衡液) 量取95％乙醇500ml、冰醋酸160ml，加水稀释至2000ml。
(6)染色液 称取考马斯亮蓝G250(或R250)0．35g，加脱色液300ml，在60～70℃水
浴中加热，使溶解。
(7)保存液 量取甘油30ml，加脱色液300ml，混匀。
(8)正极液(O．5tool／L磷酸溶液) 量取磷酸50ml，加水至1800ml。
(9)负极液(O．2mol／L氢氧化钠溶液) 称取氢氧化钠8g，加水溶解并稀释至
1000ml。
供试品溶液的制备将供试品对水透析(或用其他方法)脱盐，并使蛋白质含量
调节至每lml含0．5mg以上附录V A pH值测定法(如供试品蛋白浓度太低，则需采
用适当方法浓缩)。
测定法取A液6．25ml，pH3～10两性电解质(或其他两性电解质)1_5ml，水
17．1ml，抽气5～10分钟，加B液175 μl，N，N,N※N※一四甲基乙二胺20μl，混匀
后缓慢地注入水平模具内，室温下聚合。将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放在冷却
板上，其间涂以液体石蜡或煤油并避免产生气泡。用正极液与负极液分别润湿
正极与负极电极条，然后分别放于阳极与阴极上，将加样滤纸放在凝胶上。加
供试品溶液5～30μl。将电极对准电极条的中心，加盖，在上限电压2000V、上
限电流50mA、功率为每1cm胶1W、温度4℃的电泳条件下，开始电泳，电泳
2．5小时，同时做等电点标准。电泳30分钟后去掉加样滤纸，电泳结束后，即
将凝胶放入固定液中固定20分钟以上，取出放入平衡液20～30分钟，再放人染色
液40～60分钟，然后用脱色液浸洗至背景无色，取出放人保存液中30分钟，晾
干。亦可做成干胶永久保存。根据标准品的等电点(pI)对其相应的迁移距离作直
线回归；将供试品的迁移距离代入直线回归方程，求出供试品的等电点。
页码数,2005版药典附录第20页
附录IV电泳法
电泳法是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋
酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中，在电场的作用下，带电粒子
按各自的速度向极性相反的电极方向进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，
用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量的方法。除另有规定外，
各电泳法，照下述方法操作。
书页号：2005版药典三部附录12页
附录Ⅱ 分光光度法
分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度
或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
常用的波长范围为,(1)200～400hm的紫外光区；(2)400～760hm的可见光区；
(3)2．5～25μm(按波数计为4000～400cm-1)的红外光区。所用仪器为紫外分光光度
计、可见分光光度计(或比色计)、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为
保证测量的精密度和准确度所用仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定，
定期进行校正检定。
单色光辐射穿过被测物质溶液时，在一定的浓度范围内被该物质吸收的量
与该物质的浓度和液层的厚度(光路长度)成正比，其关系如下式：
A=1g1/T=ECL
式中A为吸光度；
T为透光率；
E为吸收系数，采用的表示方法是E1％1CM，其物理意义为当溶液浓度为1％
(g／m1)，液层厚度为lcm时的吸光度数值；
C为100ml溶液中所含被测物质的重量(按干燥品或无水物计算)，g；
L为液层厚度，cm。
物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。
当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试品配成溶
液，测定其吸光度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，
除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在一定条件下加入
显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称比色分析。
页码数,2005版药典附录第19页
附录ⅢD分子排阻色谱法
分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。
分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅
胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶(Sephadex)和聚丙烯酰胺凝胶(Sepharose)等为
填充剂，这些填充剂表面分布着不同尺寸的孔径，药物分子进入色谱柱后，它
们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔径内，大于所有孔径的分子不能进
入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现
为保留时间较短；小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在
色谱柱中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被
洗脱。
1．对仪器的一般要求
分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法，液相色谱泵一
般分常压、中压和高压。在药物分析中，尤其是分子量或分子量分布测定中，
通常采用高效分子排阻色谱法(HPSEC)。应选用与供试品分子大小相适应的色谱
柱填充剂。使用的流动相通常为水溶液或缓冲液，溶液的pH值不宜超出填充剂
的耐受力，一般pH值在2～8范围。流动相中可加入适量的有机溶剂，但不宜过
浓，一般不应超过30％，流速不宜过快，一般每分钟为0．5～1．0ml。
2．系统适用性试验
高效分子排阻色谱法的系统适用性试验中色谱柱的理论板数(n)、分离度、重
复性、拖尾因子的测定方法，在一般情况下，同高效液相色谱法项下方法，但
在高分子杂质检查时，某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线分离时，
其分离度的计算公式为,R=二聚体的峰高/单体与二聚体之间的谷高
除另有规定外，分离度应大于2．0。
3．测定法
（l）分子量测定法
一般适用于蛋白质多肽的分子量测定。按各品种项下规定的方法，选用与
供试品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的对照品，除另有规定外，
对照品与供试品均需使用二硫苏糖醇(DTT)和十二烷基硫酸钠(SDS)处理，以打
开分子内和分子间的二硫键，并使分子的构型与构象趋于一致，经处理的蛋白
质和多肽分子通常以线性形式分离，以对照品分子量(Mw)的对数值对相应的保
留时间(tR)制得标准曲线的线性回归方程lgMw=a+btR，供试品以保留时间由标准
曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。
(2)生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法
生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和胶原蛋白等具有分子大小不均一
的特点，故生物大分子聚合物分子量与分子量分布是控制该类产品的关键指
标。在测定生物大分子聚合物分子量与分子量分布时，选用与供试品分子结
构与性质相同或相似的对照品十分重要。
按各品种项下规定的方法，除另有规定外，同样采用分子量对照品和适宜
的GPC软件，以对照品重均分子量(Mw)的对数值对相应的保留时间(tR)制得标准
曲线的线性回归方程lgMw—a+btR，供试品采用适宜的GPC软件处理结果，并按下
列公式计算出供试品的分子量与分子量分布。
Mn=∑RIi／∑(RIi／Mi)
Mw=∑(RIiMi)／∑RL
D=Mw/Mn。
式中Mn为数均分子量；
Mw为重均分子量；
D为分布系数；
RLi为供试品在保留时间i时的峰高；
舰为供试品在保留时间i时的分子量。
(3)高分子杂质测定法
高分子杂质系指供试品中含有分子量大于药物分子的杂质，通常是药物在
生产或贮存过程中产生的高分子聚合物或在生产过程中未除尽的可能产生过敏
反应的高分子按各品种项下规定的色谱条件进行分离。
定量方法
①主成分自身对照法同高效液相色谱法项下规定。
一般用于高分子杂质含量较低的品种。
②面积归一化法 同高效液相色谱法项下规定。
③限量法除另有规定外，规定不得检出保留时间小于对照品保留时间的组
分，一般用于混合物中高分子物
④自身对照外标法一般用于Sephadex G-lO凝胶色谱系统中β内酰胺抗生素中
高分子杂质的检查。在该分离系统中，除部分寡聚物外，β内酰胺抗生素中高
分子杂质在色谱过程中均不保留，即所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰，
以供试品自身为对照品，按外标法计算供试品中高分子杂质的相对百分含量。
【附注】 Sephadex G-IO的处理方法
色谱柱的填装装柱前先将约15g葡聚糖凝胶Sepha—dex G-lO用水浸泡48小时，使
之充分溶胀，搅拌除去空气泡，徐徐倾人玻璃柱，一次性装填完毕，以免分
层，然后用水将附着玻璃管壁的Sephadex G-lO洗下，使色谱柱面平整，新填装的
色谱柱要先用水连续冲洗4～6小时，以排出柱中的气泡。
供试品的加入进样可以采用自动进样阀，也可以直接将供试品加在床的表
面(此时，先将床表面的流动相吸干或渗干，立即将供试品溶液沿着色谱管壁
转圈缓缓加入，注意勿使填充剂翻起，待之随着重力的作用渗入固定相后，再
沿着色谱管壁转圈缓缓加入3～5ml流动相，以洗下残留在色谱管壁的供试品溶
液)。
页码数,2005版药典附录第56页
附录X C干扰素生物学活性测定法(细胞病变抑制法)
本法系依据干扰素可以保护人羊膜细胞(WISH)受水泡性口炎病毒(VSV)破坏的
作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，于波长570nm处测定其吸光可得到干
扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测干扰素生物学活性。
试剂 (1)MEM或RPMI 1640培养液取MEM或RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，
加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素10 5 IU和链霉素10 5 IU，再加碳酸氢钠2．1g，
溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。
(2)完全培养液 量取新生牛血清10ml，加MEM或RPMI 1640培养液90ml。4℃保存。
(3)测定培养液量取新生牛血清7ml，加MEM或RPMI 1640培养液93ml。4℃保存。
(4)攻毒培养液量取新生牛血清3ml，加MEM或RPMI 1640培养液97ml。4℃保存。
(5)消化液 取乙二胺四乙酸二钠O．2g、氯化钠8．Og、氯化钾0．2g、磷酸氢
二钠1．152g、磷酸二氢钾0．2g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃ 15分钟灭菌。
(6)染色液取结晶紫50mg，加无水乙醇20ml溶解后，加水稀释至100ml，即得。
(7)脱色液取无水乙醇50ml、乙酸O．1ml，加水稀释至100ml。
(8)PBS取氯化钠8．Og、氯化钾0．20g、磷酸氢二钠1．44g、磷酸二氢钾O．24g，
加水溶解并稀释至1000ml，经121℃(2 15分钟灭菌。
标准品溶液的制备 取人干扰素生物学活性测定的国家标准品，按说明书复
溶后，用测定培养液稀释至每lml含1000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀
释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。
供试品溶液的制备将供试品按标示量溶解后，用测定培养液稀释成每lml约含
1000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个
孔。在无菌条件下操作。
测定法 使WISH细胞在培养基中贴壁生长。按1：2～1：4传代，每周2～3次，
于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗2次后消化和收集细
胞，用完全培养液配制成每lml含2．5×10 5～3．5×10 5个细胞的细胞悬液，接种于
96孔细胞培养板中，每孔100ul。于37℃、5％二氧化碳条件下培养4～6小时。将配
制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种WISH细胞的培养板中，每孔加入
100μ1。于37℃、5％二氧化碳条件下培养18～24小时。弃去细胞培养板中的上清
液。将保存的水泡性口炎病毒(VSV，一70℃保存)用攻毒培养液稀释至100CCID50，
每孔100μ1。于37℃、5％二氧化碳培养24小时(镜检标准品溶液的50％病变点在
1IU／m1)。然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入染色液50μ1，室温放置30
分钟后，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100ul，室
温放置3～5分钟。混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸
光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试
验结果
供试品生物学活性(IU／m1)=Pr×Ds*Es/Dr*Er
式中Pr为标准品生物学活性，1U／ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效稀释倍数。
页码数,2005版药典附录第41页
附录ⅦL干燥失重测定法
取供试品，混合均匀(如为较大的结晶，应先迅速捣碎使成2mm以下的小粒)，
取约1g或各品种项下规定的重量，置与供试品相同条件下干燥至恒重的扁形称
量瓶中，精密称定，除另有规定外，在105℃干燥至恒重。由减失的重量和取样
量计算供试品的干燥失重。
供试品干燥时，应平铺在扁形称量瓶中，厚度不可超过5mm，如为疏松物
质，厚度不可超过10mm。放入烘箱或干燥器进行干燥时，应将瓶盖取下，置称
量瓶旁，或将瓶盖半开进行干燥；取出时，须将称量瓶盖好。置烘箱内干燥的
供试品，应在干燥后取出置干燥器中放冷，然后称定重量。
供试品如未达规定的干燥温度即融化时，应先将供试品于较低的温度下干
燥至大部分水分除去后，再按规定条件干燥。
当用减压干燥器或恒温减压干燥器时，除另有规定外，压力应在2．67kPa
(20mmHg)以下；干燥器中常用的干燥剂为无水氯化钙、硅胶或五氧化二磷；恒
温减压干燥器中常用的干燥剂为五氧化二磷，除另有规定外，温度为60℃。干
燥剂应保持在有效状态。
页码数,2005版药典附录第54页
附录ⅨP肝素含量测定法 (凝固法)
本法系依据硫酸鱼精蛋白能中和抗凝剂肝素，从而影响血浆凝固时间的原
理，测定供试品中肝素含量。
试剂(1)缺血小板人血浆 无菌采集人全血于3．8％枸橼酸钠抗凝剂(9：1)中，
混匀，以每分钟1500转在4℃离心30分钟，用塑料注射器取上层2／3的血浆，以每
分钟3500转在4℃离心30分钟，取上层2／3血浆，分装于塑料管中，每支3ml，保
存-40℃备用。
(2)三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH7．5)取三羟甲基氨基甲烷7．27g、氯化钠
5．27g，加水溶解并稀释至1000ml(用盐酸调节pH至7．5)。
(3)脑磷脂混悬液冻干脑磷脂加水复溶，取适量，用生理氯化钠溶液稀释，稀
释后的脑磷脂混悬液应使空白凝固时间在200～300秒。
(4)O．025 mol／L氯化钙溶液 取氯化钙(CaCl2·2H2 0)147g溶于1000ml水中，制成
1mol／L氯化钙贮备液。临用时，用水将1mol／L氯化钙贮备液稀释40倍。
(5)硫酸鱼精蛋白溶液取硫酸鱼精蛋白适量，用pH7．5 Tris缓冲液溶解并稀释
成每lml含1～20 mg的溶液。
供试品溶液的制备于每支含不同浓度的硫酸鱼精蛋白溶液10μl的塑料管中，
分别加入按标示量复溶后的供试品0．5ml，混匀。
测定法在已含有缺血小板人血浆0．1ml的塑料管中，加人脑磷脂混悬液
O．1ml，混匀，37℃放置1分钟，加供试品溶液0．1ml、已预热至37℃的
0．025 mol／L氯化钙溶液0．1ml，记录凝固时间。用Tris缓冲液(pH7．5)O．1ml替
代供试品溶液，同法操作作空白对照。空白对照凝固时间不低于200秒试验成
立。取凝固时间最短的供试品管，作为硫酸鱼精蛋白中和0．5ml供试品中的肝素
量。硫酸鱼精蛋白10μg中和1IU肝素。例如凝固时间最短的供试品管中含硫酸鱼
精蛋白30μg，则中和供试品O．5ml中的肝素量则为3IU，即供试品每lml含6IU肝
素。
【附注】直接与血和血浆接触的器具应为塑料制品或硅化的玻璃制品。
页码数,2005版药典附录第17页
附录ⅢB高效液相色谱法
高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱
柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在
柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色
谱信号。
1．对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符
合有关规定。
(1)色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性
填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的
硅烷键合硅胶(如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等)也有使用。正相色谱系
统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色
谱；凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用
于对映异构体的拆分分析。
填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖
度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和
分离效果。孔径在15nm(1nm一10A)以下的填料适合于分析分子量小于2000的化合
物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。
以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用pH2~8的流动相。当pH大于8时，
可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色
谱系统中需使用pH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶
为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机一无机杂化
填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充
剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十
八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。
(2)检测器最常用的检测器为紫外检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检
测器(DAD)、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器
和质谱检测器等。
紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅
与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；示差折光检测器和蒸发光散
射检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结
构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可
以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱鉴定
和色谱峰的纯度检查。
紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待附录ⅢB高效液相色谱
法测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测
溶液的浓度通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。
不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应至
少符合紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)项下对溶剂的要求；采用低波长检测
时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸
发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。
(3)流动相 由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷
键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于
5％，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。
各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变
外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流
动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适
应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。但对某些品种，必须用特定
牌号的填充剂方能满足分离要求者，可在该品种项下注明。
2．系统适用性试验
色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四
个指标。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数。
按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系
统进行试验，应符合要求。如达不到要求，可对色谱分离条件作适当的调整。
(1)色谱柱的理论板数(n)在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下
规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留
时间tR以分钟或长度计，下同，但应取相同单位)和半高峰宽(Wh／z)，按
n=5．54(tR／Wh／2)2计算色谱柱的理论板数。
(2)分离度(R) 无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标
峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。分离度的计算公式为：
R=2(tR2tRl)/w1+w2
式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；
tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；
W1及W2为此相邻两峰的峰宽(如图,图略）
除另有规定外，定量分析时分离度应大于1·5。
(3)重复性取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面
积测量值的相对标准偏差应不大于2．0％。也可按各品种校正因子测定项下，
配制相当于80％、100％和120％的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3
种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差
应不大于2·0％。
(4)拖尾因子(T) 为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否
符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为：
T=W0.05h/2d1
式中Wo．05h为5％峰高处的峰宽；
d1为峰顶点至峰前沿之间的距离(如图,图略)。
除另有规定外，峰高法定量时T应在0·95～1．05之间。峰面积法测定时，T值偏
离过大，也会影响小峰的检测和定量的准确度。
3．测定法
(1)内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量按各品种项下的规
定，精密称(量)取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成
校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和
内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：
校正因子(f)=As/Cs／AR/CR
式中As为内标物质的峰面积或峰高；
AR为对照品的峰面积或峰高；
cs为内标物质的浓度；
cR为对照品的浓度。
再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测
量供试品中待测成分(或其杂质)和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：
含量(cX)=f.Ax/A※s/c※s
式中Ax为供试品(或其杂质)峰面积或峰高；
Cx为供试品(或其杂质)的浓度；
A※s为内标物质的峰面积或峰高；
c※s为内标物质的浓度；
f为校正因子。
当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液，使用等量
同一浓度的内标物质溶液时，cs=c※s,则配制内标物质溶液不必精密称(量)取。
(2)外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量
按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密
取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分
的峰面积(或峰高)，按下式计算含量：
含量(cx)=cR.Ax/AR
式中各符号意义同上。
由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或
主成分含量时，以定量环或自动进样器进样为好。
(3)加校正因子的主成分自身对照法
测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，
按各品种项下的规定，精密称(量)取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配
制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述(1)法计算杂质的校正
因子。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些
需作校正计算的杂质，通常以主成分为参照采用相对保留时间定位，其数值
一并载入各品种项下。
测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂
质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节检测灵敏度(以噪音水平可接受为
限)或进样量(以柱子不过载为限)，使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量
程的10％～25％或其峰面积能准确积分[通常含量低于O．5％的杂质，峰面积的
相对标准偏差(RSD)应小于10％；含量在0．5％～2％的杂质，峰面积的RSD应小
于5％；含量大于2％的杂质，峰面积的RSD应小于2％]。然后，取供试品溶液和
对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间，除另有规定外，应为
主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分
别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含
量。
(4)不加校正因子的主成分自身对照法
当没有杂质对照品时，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上
述(3)法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分
别进样，前者的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，
测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，
计算杂质含量。
若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶
液的色谱图I，再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。色谱图工上杂质峰的总面积(
包括溶剂峰),减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然
后依法计算。
(5)面积归一化法
由于峰面积归一化法测定误差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供试品
中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。方法是测量各
杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积及其之
和占总峰面积的百分率。
页码数,2005版药典附录第42页
附录ⅦM固体总量测定法
本法系在一定温度下，使供试品的液体成分蒸发，用剩余的固体成分计算
供试品的固体总量。
测定法
第一法105℃干烤法
精密量取一定体积供试品于干燥至恒重的适宜的玻璃称量瓶中，置干烤箱
中于105℃烘至恒重。
第二法50℃干烤法
精密量取一定体积供试品于干燥至恒重的适宜的玻璃称量瓶中，置干烤箱中
于50℃烘至恒重。
按下式计算
Cx(％，g／m1)一—W*100/v
式中cx为供试品的固体总量，g／ml；
W为供试品恒重后的重量，g；
V为供试品的体积，m1。
书页号：2005版药典三部附录72页
附录Ⅺ L 猴体神经毒力试验
本法用于脊髓灰质炎减毒活疫苗检定。
应使用体重1.5kg以上的健康猕猴，猴血清经1：4稀释后应证明不含同型别病
毒中和抗体。试验用猴必须经选择和检疫，并未做过其他试验，其隔离检疫应
不少于6周，应无结核、B病毒感染及其他急性传染病，血清中foamy病毒抗体应
为阴性。凡有严重化脓灶、赘生物以及明显的肝肾病理改变者不得用于试验。
可采用脊髓注射方法或脑内注射方法。
脊髓法 (1) 猴的数量 猴体试验必须设立参考品。评价Ⅰ、Ⅱ型供试品及其
参考品最少应各使用11只有效猴，评价Ⅲ型供试品应至少有18只有效猴。猴子的
大小和性别应随机分配到各试验组。同型参考品可用于测试1批以上疫苗。
有效猴系指脊髓灰质炎病毒引起中枢神经系统的特异性神经元损伤的猴子。
供试品组有效猴不足时，允许补足，但参考品组应同时补充相同数量的猴。
如需补足参考品组有效猴，则供试品组亦须同时补充相同数量猴。如试验需要2
个工作日，则每1个工作日用供试品和同型参考品接种的猴只数应相等。为了保
证有效猴只数，通常要相应地增加接种猴只数。
(2) 供试品和参考品的病毒滴度 供试品和参考品的病毒含量应调整到尽可能
接近，每只猴于腰髓第一、二椎间隙注射0.1ml(病毒含量6.5～7.5 lg CCID50/ml)，仅用
1个病毒浓度接种动物。
(3) 检查法 全部猴子应观察17～22天。在接种24小时后死亡猴应做尸体解剖，
检查是否系因脊髓灰质炎引起的死亡。因其他原因死亡的猴子在判定时可以剔
除。在观察期内存活的猴数不低于80%时，试验成立。呈濒死状态或严重麻痹的
猴子应处死进行尸检。
每只猴子取中枢神经系统切片进行组织学检查。切片厚度为10～15μm，没食
子蓝染色检查切片数如下：
腰膨大12个切面；
颈膨大10个切面；
延髓2个切面；
桥脑和小脑各1个切面；
中脑1个切面；
大脑皮层左右侧和丘脑各1个切面。
应由同一人员统一采用4级计分法判断其病变严重程度：
1级 仅有细胞浸润(这不足以认为是有效猴)；
2级 细胞浸润伴有少量的神经元损害；
3级 细胞浸润伴有广泛的神经元损害；
4级 大量的神经元损害，伴有或无细胞浸润。
切片中有神经元损害，但未见针迹者应视为有效猴。切片中由外伤引起的
损害，而又无特异的病理改变则不视为有效猴。
严重程度的分值是由腰髓、颈髓和脑组织切片的整个切片的计分累计而成
的。每只有效猴的病变分值(LS)为
(腰髓分值总和/半个切片数+颈髓分值总和/半个切片数
+脑分值总和/半个切片数)／3
再计算每组有效猴的平均分值。
参考品的平均病变分值在上限与下限之间时，才能根据C1、C2、C3值判定疫
苗合格与否。判定标准如下：
疫苗的平均病变分值(X〈〔test〕〉)与参考品的平均病变分值(X〈〔ref〕〉)
相比较
合格 Xtest－Xref<C1
不合格 Xtest－Xref>C2
重试Ⅰ C1<Xtest－Xref<C2(仅限1次)
重试Ⅱ 同一次试验中，疫苗组平均分值与参考组平均分值之差小于Cl时，
而疫苗组中如单只猴最高分值等于或高于2.5，并大于参考组单只猴最高分值的2
倍时，本批疫苗应重试。
重试合格
(X〈〔(test1+test2)〕〉－X〈〔(ref1+ref2)〕〉)／2<C3
重试不合格
(X〈〔(test1+test2)〕〉－X〈〔(ref1+ref2)〕〉)／2>C3
脑内法 取健康猴20只。麻醉后在两侧视丘分别注入0.5ml原倍供试品(应不低
于7.0 lg CCID50/ml)及10〈－1〉供试品各10只，观察21天，到期存活动物数应不低于
80%，有效猴数应不低于16只，试验有效，否则应补足。注射后48小时内死亡或
出现非特异性麻痹症状者剔除不计，中途死亡及到期处死动物，做中枢神经系
统病理组织学检查，判定标准如下。
(1) 合格标准 凡符合下列情况之一者判为合格：
① 中枢神经系统无脊髓灰质炎病理组织学改变；
② 有2只猴发生轻度及其以下病变；
③ 1只猴发生中度及其以下病变。
(2) 不合格标准
① 1只猴有中度病变，同时1只猴有轻度以上病变者；
② 1只猴有重度以上病变者。
(3) 重试标准 数个亚批疫苗合并试验结果不合格者，可以分批重试，并按上
述标准判定。
页码数,2005版药典附录第54页
附录ⅨO活化的凝血因子活性检查法
本法系依据活化的凝血因子在脑磷脂存在下，使缺血小板人血浆发生凝固
的原理。将供试品和缺血小板人血浆及脑磷脂混合，测定凝固时间，根据凝固
时间判定供试品是否含有活化的凝血因子。
试剂(1)缺血小板人血浆 无菌采集人全血于3．8％枸橼酸钠抗凝剂(9：1)中，
混匀，以每分钟1500转在4℃离心30分钟，用塑料注射器取上层2／3的血浆，以每
分钟3500转在4℃离心30分钟，取上层2／3血浆，分装于塑料管中，每支3ml，保
存-40℃备用。
(2)三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH7．5)取三羟甲基氨基甲烷7．27g、氯化
钠5．27g，加水溶解并稀释至1000ml(用盐酸调节pH至7．5)。
(3)脑磷脂混悬液冻干脑磷脂加水复溶，量取适量用生理氯化钠溶液稀释，稀
释后的脑磷脂混悬液应使空白凝固时间在200～300秒。
(4)O．025 mol／L氯化钙溶液 取氯化钙(CaCl2·2H20)147g溶于1000ml水中，制成
lmol／L氯化钙贮备液。临用时，用水将lmol／L氯化钙贮备液稀释40倍。
(5)硫酸鱼精蛋白溶液取硫酸鱼精蛋白适量，用pH7．5的Tris缓冲液溶解并稀
释成适宜浓度的溶液。
供试品溶液的制备取复溶后的供试品，根据测得的肝素含量(附录ⅨP)加硫
酸鱼精蛋白溶液适量中和供试品中的肝素(10μg硫酸鱼精蛋白中和1IU肝素)，再
用Tris缓冲液(pH7．5)稀释10倍和100倍。
测定法取缺血小板人血浆O．1ml，加脑磷脂混悬液0．1ml，混匀，37℃放置1
分钟，加供试品溶液(10倍或100倍稀释液)0．1ml、已预热至37℃的O．025 mol／L氯
化钙溶液O．1ml，记录凝固时间。用Tris缓冲液(pH7．5)O．1ml替代供试品溶液，
同法操作，作空白对照。
结果判定空白对照凝固时间不低于200秒，试验成立。1：10和1：100供试品稀
释液凝固时间均应不低于150秒。
【附注】(1)直接与血和血浆接触的器具应为塑料制品或硅化的玻璃制品。从
供试品稀释到测定完毕应在30分钟内完成。
(2)供试品每个稀释度做2管。
书页号：2005版药典三部附录15页
附录III A纸色谱法
某些含碱金属或碱土金属元素的供试品溶液用喷雾装。置以气溶胶
形式引入火焰光源中，靠火焰的热能将供试品元素原子化并激发出它们的特征
光谱，通过光电榆测系统测量出待测l元素特征光谱的发光强度可求出供试品中
待测元素的含量。通常借比较对照品溶液和供试品溶液的发光强度，求得供试
品中待测元素的含量。
对仪器的一般要求
所用仪器为火焰光度计，由燃烧系统、单色器和检测系统等部件组成。
燃烧系统由喷雾装置、燃烧灯、燃料气体和助燃气体的供应等部分所组成。
燃烧火焰通常是用空气作助燃气，用煤气或液化石油气等作燃料气组成的火
焰，即空气煤气或空气液化石油气火焰。
仪器某些lT作条件(如火焰类型、火焰状态、空气压缩机供应压力等)的变化
可影响灵敏度、稳定程度和F扰情况，应按各品种项下的规定选用。
测定法
火焰光度法用于含量测定及杂质限度检查时，照原子吸收分光光度法(附录
IIB)中第一法、第二法进行测定
页码数,2005版药典附录第49页
附录ⅨF激肽释放酶原激活剂测定法
本法系采用显色底物法(或显色基质法)测定供试品中激肽释放酶原激活剂
(PKA)含量。
试剂 (1)0．05m01／L三羟甲基氨基甲烷-O．15mol／L氯化钠溶液(TNB) 用lmol／L
盐酸调节pH值至8．0。
(2)2mmol／L激肽释放酶显色底物(S-2302)溶液称取S-2302 12．5mg，加10ml水溶解。
(3)前激肽释放酶(PK) 采用适宜方法提纯PK，小体积分装，-30℃以下保存备
用。
PKA标准溶液的制备 取PKA标准品适量，用0．85％氯化钠溶液稀释成每lml中
含10．0IU、20．0IU、30．0IU、40．0IU、50．0 IU的溶液。按每次用量，小体积
分装，一30℃保存备用，用前融化(仅允许冻融1次)，并用TNB稀释10倍。
供试品溶液的制备 取供试品适量，用TNB稀释10倍。
测定法取供试品溶液20μl加至96孔微量滴定板孔内，加PK 20μl，振荡1分钟，加
盖置25～30℃放置30分钟(或37℃ 10分钟)后，加2mmol／L S-2302溶液20μ1，振荡1分
钟，加盖置25～30℃放置15分钟(或37℃ 10分钟)，加50％醋酸溶液20μl，振荡1分钟
后，照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长405nm处测定吸光度。同时以
TNB 20μl代替PK 20μ1，同法操作，作为空白对照。用PKA标准溶液20μl替代供试品
溶液，同法操作。将标准品溶液PKA活性的对数对其相应的吸光度对数进行线
性回归，求出回归方程，计算出供试品PKA活性。
【附注】 (1)每个标准溶液和供试品做3孔，其中2个测定孔、1个对照孔，两个
测定孔吸光度差值应小于0．020。
(2)每次测定可根据供试品PKA含量，适当调整PKA标准溶液的范围。
(3)线性回归的相关系数应不低于0．99。
(4)加PK、S-2302及50％醋酸溶液时，各孔的间隔时间应相同，加液的顺序要一
致，尽可能使各孔处于同一反应条件下。
页码数,2005版药典附录第40页
附录ⅦI钾离子测定法
本法系用火焰光度法测定供试品中钾离子含量。
测定法精密量取供试品2ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，即为供试品
溶液。照火焰光度法(附录ⅡD)测定，在波长769nm处测定供试品溶液的发光强
度。另精密称取于110℃干燥至恒重的氯化钾56．0mg，置500ml量瓶中，用水溶解
并稀释至刻度，再精密量取该溶液1．0ml、2．0ml、3．0ml、4．0ml、5．0ml，分
别置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，制成O·03mmol／L、0．06mmol／L、0．09
mmol／L、0．12mmol／L、O．15mmol／L的系列标准钾溶液，同法测定。
用系列标准钾溶液的浓度对其相应的发光强度作直线回归处理，将供试品溶
液发光强度代入回归方程，求得供试品溶液钾离子浓度(mmol／L)，再乘以供试
品的稀释倍数(25)，计算出供试品钾离子含量(mmol／L)。
页码数,2005版药典附录第48页
附录ⅨD假单胞菌菌体蛋白残留量测定法
本法系采用酶联免疫法测定假单胞菌表达系统生产的重组制品残留菌体蛋
白含量。
试剂 (1)包被液(pH9．6碳酸盐缓冲液) 精密称取碳酸钠O．32g、碳酸氢钠
0.586g，置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。
(2)磷酸盐缓冲液 称取氯化钠8．Og、氯化钾O．20g、磷酸氢二钠1．44g、磷
酸二氢钾0．24g，置500ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，121℃灭菌15分钟。
(3)洗涤液取聚山梨酯20 O．5ml，加磷酸盐缓冲液至500ml。
(4)浓稀释液 称取牛血清白蛋白1．0g，加洗涤液使溶解成100ml。
(5)稀释液 浓稀释液与水等体积混合。
(6)底物缓冲液(0．005mol／L醋酸钠-枸橼酸缓冲液) 称取醋酸钠O．68g、枸橼
酸(C6H8o7·H20)1．05g，加水溶解并稀释至1000ml，调节pH至3．6。
(7)底物液A称取3，3’，5，5’一四甲基联苯胺(TMB)0．08g，加二甲基亚砜40ml
溶解，加甲醇60ml，混匀，加底物缓冲液100ml，避光搅拌2小时至完全溶解，室
温静置4小时。
(8)底物液B取1．5％过氧化氢溶液3．2ml，加底物缓冲液至1000ml。
(9)底物液临用前取底物液A、B等体积混合。
(10)终止液2mol／L硫酸溶液。
标准品溶液的制备按试剂盒使用说明书用稀释液溶解菌体蛋白标准品，精
密量取适量，用稀释液稀释成每lml中含菌体蛋白20ng、10ng、5ng、2．5ng、
1．2ng、O．6ng、O．3ng的溶液。
供试品溶液的制备取供试品适量，用稀释液稀释成每lml中约含蛋白100μg的
溶液。如供试品每lml中含蛋白量小于200μg时，用浓稀释液将供试品稀释1倍。
测定法取包被抗体，用包被液稀释至适宜的浓度(稀释倍数参见试剂盒说明
书)，以100μ1／孔加至96孔酶标板内，在2～8℃放置16～20小时；用洗涤液洗板3
次；用洗涤液制备1％牛血清白蛋白溶液，以200μ1／孔加至板内，置室温振荡(
每分钟200～300转)1小时，用洗涤液洗板3次；以100μ1／孔加入标准品溶液和供试
品溶液，每个稀释度做双孑L，同时加入两孔空白对照(稀释液)，置室温振荡(每
分钟200～300转)1小时；用洗涤液洗板3次；按试剂盒说明书用稀释液稀释一抗至
适宜的浓度，以100μl／孔加至板内，置室温振荡(每分钟200~300转)1小时；用洗涤
液洗板3次；然后按试剂盒说明书用稀释液稀释辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗至
适宜的浓度，以100μl／孔加至板内，置室温振荡(每分钟200～300转)30分钟，用洗
涤液洗板8次；以100μ1／孔加入底物液，置室温避光反应10～15分钟，以
100μ1／孔加入终止液终止反应。用酶标仪在450nm波长处测定吸光度，应用计算
机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作图法计算。
以标准品溶液吸光度对相应的浓度作标准曲线，并以供试品溶液吸光度在
标准曲线上得到相应菌体蛋白含量，按以下公式计算
供试品菌体蛋白质残留含量(％)=c*D*100%/T*1000000
式中c为供试品溶液中菌体蛋白质含量，ng／ml,
D为供试品稀释倍数；
T为供试品蛋白质含量，mg／ml。
页码数,2005版药典附录第35页
附录ⅥN 间甲酚测定法
本法系依据4一氨基安替比林、铁氰化钾在碱性条件下与苯酚反应生成一种
红色物质，用比色法测定供试品中间甲酚含量。
测定法精密量取一定体积的供试品，置试管中，定量稀释50倍，即为供试
品溶液。量取供试品溶液1·0ml，加水5．0ml，混匀，依次加pH 9．8缓冲液(称取
无水碳酸钠6．36g、碳酸氢钠3．36g，加水溶解并稀释至800ml，用1 mol／L盐酸
调pH值至9．8后，再加水至1000m1)、0．3％4一氨基安替比林溶液、1．2％铁氰
化钾溶液及1mol／L磷酸二氢钾溶液各1．0ml，混匀，于室温避光放置10 分钟，
照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长510nm处测定吸光度。
精密量取间甲酚对照品溶液(取间甲酚适量，精密称定，置量瓶中，加水溶
解并稀释至每lml含10μg)1．0ml、2．0ml、3．0ml、4．0ml、5．0ml、6．0ml，分别
置试管中，加水补至6．0ml，自“依次加pH 9·8缓冲液起，同法操作，测定各管
的吸光度。
以间甲酚对照品溶液的系列浓度对相应的吸光度作直线回归，将供试品溶液
的吸光度代入回归方程，得供试品的间甲酚含量(mg／m1)。
书页号：2005版药典三部附录8页
附录I F胶囊剂
胶囊剂 系指以生物制品原液经干燥后制成的干粉为原料药物，加入适宜辅
料后，充填于空心胶囊或密封于软质囊材中的固体制剂。该药物可由一种或
多种活性成分组成。
胶囊剂根据其溶解与释放特性，可分为硬胶囊(通称为胶囊)、肠溶胶囊等。
硬胶囊 系指将原料药物或加适宜辅料制成均匀粉末、颗粒、小片或小丸等充
填于空心胶囊中制成。
肠溶胶囊 系指硬胶囊经药用高分子材料处理或其他适宜方法加工而成；可用
适宜的肠溶材料制备而得；也可用经肠溶材料包衣的颗粒或小丸填充胶囊而制
成。肠溶胶囊不溶于胃液，但能在肠液中崩解而释放活性成分。
胶囊剂在生产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产和质量控制应符合相关品种要
求。
二、胶囊剂内容物不论其活性成分或辅料，均不应造成胶囊壳的变质。
三、胶囊剂应整洁，不得有黏结、变形、渗漏或囊壳破裂现象，并应无异
臭。
四、除另有规定外，胶囊剂应置2～8℃密封贮存和运输。
胶囊剂应进行以下相应检查。
【装量差异】 胶囊剂的装量差异限度，应符合规定。
检查法除另有规定外，取供试品20粒，分别精密称定重量后，倾出内容物(
不得损失囊壳)；硬胶囊用小刷或其他适宜用具拭净，再分别精密称定囊壳重
量，求出每粒内容物的装量与平均装量。每粒的装量与平均装量相比较，超
出装量差异限度的不得多于2粒，并不得有1粒超出限度1倍。
【崩解时限】 除另有规定外，照崩解时限检查法(附录V C)检查，均应符合
规定。
【微生物限度】 除另有规定外，照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符
合规定。
凡规定进行杂菌检查的胶囊剂，可不进行微生物限度检查。
页码数,2005版药典附录第48页
附录ⅨE酵母工程菌菌体蛋白残留量测定法
本法系采用酶联免疫法测定酵母表达系统生产的重组制品残留菌体蛋白含
量。
试剂 (1)包被液(pH9．6碳酸盐缓冲液) 称取碳酸钠O．32g、碳酸氢钠0．586g，
加水溶解并稀释成200ml。
(2)PBS称取氯化钠8．Og、氯化钾0．20g、磷酸氢二钠1．44g、磷酸二氢钾
O．24g加水使溶解成1000ml，调节pH值至7．4，121℃灭菌15分钟。
(3)洗涤液(PBS-Tween20) 取聚山梨酯20 O．5ml，加PBS至1000ml。
(4)稀释液称取牛血清白蛋白0．5g，加洗涤液溶解，并稀释至100ml。
(5)底物缓冲液(0．005mol／L醋酸钠一枸橼酸缓冲液) 称取醋酸钠O．68g、枸橼
酸(C6H8O7·H20)1．05g，加水溶解并稀释至1000ml，调节pH值至3．6。
(6)底物液A 称取3，3’，5，5，_四甲基联苯胺(TMB)0．08g，加二甲基亚砜40ml
溶解，加甲醇60ml，混匀，加底物缓冲液100ml，避光搅拌2小时至完全溶解，室
温静置4小时。
(7)底物液B取1．5％过氧化氢溶液3．2ml，加底物缓冲液至1000ml。
(8)底物液 临用前取底物液A、底物液B等体积混匀。
(9)终止液lmol／L硫酸溶液。
标准品溶液的制备按试剂盒使用说明书加水复溶，精密量取适量，用稀释
液稀释成每lml中含菌体蛋白质1000ng、500ng、250ng、125ng、62．5ng的溶液。
供试品溶液的制备取供试品适量，用稀释液稀释成适当浓度。
测定法 取豚鼠抗酵母工程菌蛋白抗体适量，用包被液稀释成适当浓度，以
100μl／孔加至酶标板内，用保鲜膜封好，4℃放置过夜；用洗涤液洗板3次，用
洗涤液制备1％牛血清白蛋白溶液，以200μl／孔加至板内，37℃放置2小时；将
封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次；以100μ1／孔加入标准品溶液及供试品溶液，
每个稀释度做双孔，同时加入两孔空白对照(稀释液)，封板，37℃放置1小时；
用洗涤液洗板6次；按试剂盒使用说明书，取兔抗酵母工程菌蛋白抗体适量，用
稀释液稀释成适当浓度，以100μ1／孔加至酶标板内，封板，37℃放置1小时；用
洗涤液洗板6次；用稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体溶液(IgG-HRP)
至适当浓度，以100μl／孔加至酶标板内，用保鲜膜封好，37℃放置1小时；用洗
涤液洗板6次，以100μ1／孔加入底物液，室温避光放置5～10分钟；以100ul／孔加
入终止液终止反应。用酶标仪以630nm波长为参比波长，在450nm波长处测定吸光
度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作图法计算。
以标准品溶液吸光度对相应的浓度作标准曲线，并以供试品溶液吸光度在
标准曲线上得到相应菌体蛋白含量，按以下公式计算
菌体蛋白质残留含量(％)=c*D*100%/T*1000000
式中c为供试品溶液中菌体蛋白质含量，ng／ml；
D为供试品稀释倍数；
T为供试品蛋白质含量，mg／ml。
页码数,2005版药典附录第32页
附录ⅥH聚山梨酯80残留量测定法
本法系依据聚山梨酯80中的聚乙氧基(Polyethoxy-lated)和铵钴硫氰酸盐反应形
成蓝色复合物，可溶于二氯甲烷，用比色法测定聚山梨酯80含量。
测定法取供试品1．0ml于离心管中，加乙醇一氯化钠饱和溶液5ml，摇匀，
每分钟3000转离心10分钟，取上清液，再用乙醇一氯化钠饱和溶液1．0ml小心冲
洗管壁，洗液与上清液合并，每分钟3000转离心10分钟，上清液置55℃水浴中，
用空气吹扫法将其浓缩至0．1～0．5ml，加lml水溶解。准确加入二氯甲烷2．0ml、
硫氰钴铵溶液(称取硝酸钴6．0g、硫氰酸铵40．0g，加水溶解并稀释至200m1)
3．0ml，加塞，混匀，室温放置过夜，每15分钟振荡1次，测定前静置半小时，
弃上层液，照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长620nm处测定下层二氯
甲烷液的吸光度。用二氯甲烷作空白对照。
精密量取聚山梨酯80对照品溶液(取聚山梨酯80约100mg，精密称定，加水溶
解后置100ml量瓶中，加水稀释至刻度)0μl、10μ1、25μl、50μ1、75μ1、100μ1，
加入预先加入lml水的离心管中混匀，准确加入二氯甲烷2．0ml、硫氰钴铵溶液
3．0ml，加塞，混匀，自"室温放置过夜"起，同法操作。
用上述聚山梨酯80系列浓度(μg／m1)与相应的吸光度作直线回归，相关系数
应不低于0．98，将供试品吸光度代入回归方程，求得供试品聚山梨酯80含量
(μg／m1)。
页码数,2005版药典附录第32页
附录ⅥG聚乙二醇残留量测定法
本法系依据聚乙二醇与钡离子和碘离子形成复合物(1：1)，用比色法测定聚
乙二醇含量。
测定法 取供试品适量，用水稀释，使蛋白质浓度不高于1％，即为供试品
溶液。精密量取供试品溶液1．Oml，加入O．5mol／L高氯酸溶液5．Oml，混匀，
室温放置15分钟，每分钟4000转离心10分钟。取上清液4ml，加入氯化钡溶液(称
取氯化钡5g，加水溶解使成lOOml)1．Oml和0．1mol／L碘溶液(称取碘化钾2．0g，
加少量水溶解，然后加碘1．3g，再加水使成50ml，摇匀)O．5ml，混匀，室温反
应15分钟，照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长535nm处测定吸光度。
同时以lml水代替供试品溶液，同法操作，即为空白对照。
另精密称取聚乙二醇(相对分子质量4000或6000)适量，加水溶解，并制成每lml
含聚乙二醇100μg的溶液，即为聚乙二醇对照品贮备溶液。
取按下表制备的每lml含10～50μg的聚乙二醇对照品溶液1．0ml，加入
O．5mol／L高氯酸溶液5．Oml，混匀，自"室温放置15分钟"起，同法操作。
┏━━━━━━━━━━━━━━┳━━━┳━━━┳━━━┳━━━┳━━━┓
┃聚乙二醇含量/ug.ml-1 ┃ 10 ┃ 20 ┃ 30 ┃ 40 ┃ 50 ┃
┣━━━━━━━━━━━━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━┫
┃聚乙二醇对照品贮备溶液／mJ ┃ O．2 ┃ O．4 ┃ O．6 ┃ O．8 ┃ 1．0 ┃
┣━━━━━━━━━━━━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━┫
┃约1％蛋白质溶液／ml ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃
┣━━━━━━━━━━━━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━┫
┃水／ml ┃ 1．6 ┃ 1．4 ┃ 1．2 ┃ 1．O ┃ O．8 ┃
┗━━━━━━━━━━━━━━┻━━━┻━━━┻━━━┻━━━┻━━━┛
用聚L-"醇对照品溶液的浓度(μg／m1)与相应的吸光度作直线回归，将供试
品溶液吸光度代入直线回归方程，计算出供试品溶液聚乙二醇含量F(μg／m1)，
按下式计算
供试品聚乙二醇含量(g／L)=F*G* 10-3式中F为供试品溶液中聚乙二醇含量，
μg／ml；
G为供试品稀释倍数。
【附注】 (1)整个比色过程应在试剂加入后的15～45分钟内完成，否则将要影
响结果。
(2)本法的灵敏度随被测聚乙二醇的分子量的增加而提高。
(3)1％的蛋白质溶液系用不含聚乙二醇的蛋白质溶液配制。
页码数,2005版药典附录第51页
附录ⅨJ抗A、抗B血凝素测定法 (间接抗人球蛋白法)
本法系采用间接抗人球蛋白法(Coombs试验)，测定供试品中抗A、抗B血凝
素。
试剂 (1)红细胞悬液取A型、B型、RhD阳性的O型红细胞各3例，分别混合，
用适量生理氯化钠溶液洗涤3次，最后以每分钟2000转离心5分钟，吸取沉淀红
细胞适量，用生理氯化钠溶液制成5％(ml／m1)红细胞悬液。自红细胞采集之日
起1周内使用。
(2)抗人球蛋白血清为多价抗人球蛋白血清，使用前需标定，选择适宜的稀
释度用于试验，如生产厂商有说明，按说明书稀释后使用，也可按附注方法确
定。
测定法取供试品适量用生理氯化钠溶液进行2倍系列稀释，每个稀释度的供
试品使用两排管(75mm×12mm小试管)，每管分别加入供试品溶液O．2ml，向第一
排各管加A型5％红细胞悬液0．2ml，第二排各管加B型5％红细胞悬液0．2ml，混
匀，置37℃水浴30分钟，用适量的生理氯化钠溶液洗涤3次，每次以每分钟1000
转离心1分钟，每管加入抗人球蛋白血清0．2ml，混匀，以每分钟1000转离心1分
钟，肉眼观察结果。本试验同时设阴性、阳性及红细胞对照组。
(1)阴性对照取AB型人血清0．2ml(双份)，分别加入5％A型及B型红细胞悬液
0．2ml，混匀，自置37℃水浴30分钟”起，同法操作。
(2)阳性对照取抗D血清(IgG型)O．2ml，加入5％RhD阳性O型红细胞0．2ml，混
匀，自置37℃(3水浴30分钟”起，同法操作。
(3)红细胞对照取生理氯化钠溶液O．2ml(双份)，分别加入5％A型及B型红细胞
悬液O．2ml，混匀，自‘‘置37℃水浴30分钟"起，同法操作。
结果判定阴性对照及红细胞对照结果均呈阴性，阳性对照结果不低于"+++"，
试验成立。
抗A、抗B血凝素滴度以产生“+”凝集的供试品最高稀释倍数计算，不计红细
胞悬液及抗人球蛋白血清的体积。
【附注】 (1)供试品为凝血因子Ⅷ制剂时，需先用生理氯化钠溶液预稀释成
每lml中含4IU后，再进行测定。
(2)抗人球蛋白血清的标定：将抗人球蛋白血清和抗D血清分别用生理氯化钠
溶液进行2倍系列稀释，每管0．2ml，于稀释的抗D血清管中加入5％RhD阳性的0
型压积红细胞悬液0．1ml，混匀后置37℃水浴中30分钟，用生理氯化钠溶液洗3次
并配成2％的细胞悬液，取每个稀释度致敏红细胞悬液O．2ml，分别加入一排稀
释的抗人球蛋白血清中，混匀，以每分钟1000转离心1分钟，判定结果。用等量
未致敏人RhD阳性0型红细胞替代致敏红细胞，同法操作，作为阴性对照。阴性
对照成立，以出现"+"血凝反应的抗D血清的最高稀释倍数所对应的抗人球蛋白
血清的最高稀释倍数为最适稀释度。
(3)红细胞凝集判定标准如下：
++++一个结实的凝集块；
+++几个大的凝集块；
++ 中等大的凝集块，背景清晰；
+小凝集块，背景浑浊；
阴性 无凝集和溶血。
(4)阴性、阳性、红细胞对照与供试品试验应同步进行。
页码数,2005版药典附录第51页
附录ⅨK抗补体活性测定法
本法系采用免疫溶血反应作指示系统，根据供试品消耗补体所反映出的溶
血率变化，测定供试品的抗补体活性。
试剂 (1)镁-钙贮备液取氯化钙1．103g、氯化镁(MgCl2·6H2 O)5．083g，加水溶解
并稀释至25ml。
(2)巴比妥缓冲液贮备液取氯化钠41．5g、巴比妥钠5．1g，加水800ml溶解。用
lmol／L盐酸溶液调pH值至7．3，加镁一钙贮备液2．5ml，加水稀释至1000ml，用
0．22μm膜滤过，4℃保存备用。
(3)明胶巴比妥缓冲液(GVB) 取明胶0．625g，加水30ml煮沸使溶解，加巴比妥缓
冲液贮备液100ml，再加水稀释至500ml，新鲜制备，当天使用。
(4)阿氏液(Alsever※s液) 取枸橼酸0．5g、枸橼酸钠8．Og、葡萄糖20．5g、氯化
钠4．2g，加水溶解并稀释至1000ml(pH6．2左右)。根据一次采羊血需要量将该溶
液分装于采血瓶中，116℃蒸汽灭菌10分钟(灭菌后，尽快释放蒸汽)。放冷后置
4℃冰箱保存备用。
(5)绵羊红细胞 由绵羊颈静脉无菌采集全血适量，与等体积的阿氏液混合，
无菌分装，4℃保存一周后方可使用。
(6)溶血素兔抗羊红细胞血清。
(7)豚鼠血清(补体)取10只以上豚鼠血清，混合，4℃离心除去血细胞，分装，
一70℃保存，也可冻干保存。豚鼠血清每lml中的补体总活性应不低于200CH50。
5％羊红细胞悬液制备取绵羊红细胞适量，用明胶巴比妥缓冲液至少洗3次
后，悬浮于适量明胶巴比妥缓冲液中。取O．2ml红细胞悬液，加至2．8ml水中，
待红细胞完全溶解后照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)在波长541nm处测定吸光
度，根据下列公式，将该溶液的吸光度调节至0．62±0．01(每lml红细胞悬液含红
细胞1×109个)。
Vf=Vi*A/0.62
式中Vi为稀释前红细胞悬液体积，ml；
A为稀释前红细胞溶解液吸光度；
Vf为稀释后红细胞悬液体积，ml。
溶血素滴定按表1稀释溶血素。从1：75稀释的溶血素开始，1．0ml不同稀释
度的溶血素分别与5％羊红细胞悬液1．0ml混合，37℃放置30分钟后，取O．2ml，
加明胶巴比妥缓冲液1．10ml，稀释的豚鼠补体溶液(如150倍稀释补体)0．2ml，
37℃放置60分钟后，以每分钟2000转离心5分钟，吸取上清液，照紫外-可见分光
光度法(附录ⅡA)于波长541nm处测定各管吸光度。每个稀释度做2管。同时再做
3管未溶血对照管(明胶巴比妥缓冲液1．4ml，加5％羊红细胞悬液O．1m1)，3管全
溶血管(水1．4ml加5％羊红细胞O．1m1)，同法操作。按下式计算各管溶血率(y)，
以y值为纵坐标，以不同溶血素稀释度为横坐标作图，从而确定敏化羊红细胞
所用的溶血素的稀释度。选择增加溶血素的量也不影响y值的溶血素的稀释度，
为每lml含1个最大溶血单位(即每lml含1MHU)。最大溶血率应在50％～70％范围，否
则试验不成立。
y=各管吸光度-未溶血对照管吸光度*100%/全溶血管吸光度-未溶血对照管吸光度
表1溶血素稀释 （表略）
最适敏化的羊红细胞(EA)的制备量取每lml含2MHU的溶血素(A)适量，缓慢注
入等体积的5％羊红细胞(E)悬液中，37℃放置15分钟后，2～8℃保存，6 小时内使
用。
滴定豚鼠血清中补体活性用明胶巴比妥缓冲液适当稀释豚鼠血清，然后按
表2滴定补体。以补体用量的对数对Y／(1一y)的对数作直线回归，从而求出直
线回归方程的截距(a)、斜率(b)和相关系数(r)，补体活性按下式计算
补体活性(CHso／m1)=1/x*补体稀释倍数/5
式中1／X为a值反对数的倒数。
抗补体活性测定根据测得的豚鼠血清补体活性，用明胶巴比妥缓冲液稀释成
每lml含100CH50溶液，按表3制备培养混合物。表3中静注人免疫球蛋白(IVIG)是按
每lml含50mg浓度计算的。如果IVIG的浓度不是每
附录52
表2补体滴定
┏━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━┳━━━━┳━━━━┳━━━━┳━━━━┳━━━━━━┓
┃ ┃ 1 ┃ 2 ┃ 3 ┃ 4 ┃ 5 ┃ 6 ┃ 7 ┃
┣━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━━━┫
┃ GVB／ml ┃ 1．2 ┃ 1_1 ┃ 1．0 ┃ O．9 ┃ O．8 ┃ O．7 ┃ O．6 ┃
┃ 适当稀释的 ┃ O．1 ┃ O．2 ┃ O．3 ┃ O．4 ┃ O．5 ┃ O．6 ┃ O．7 ┃
┃补体／ml ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃
┃ EA／ml ┃ 0．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ 0．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃
┣━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━━━┫
┃ ┃ 8 ┃ 9 ┃ 10 ┃ 11 ┃ 12 ┃ 13 ┃ 14 ┃
┣━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━━━┫
┃ GVB／ml ┃ O．5 ┃ O．4 ┃ O．3 ┃ 0．2 ┃ O．1 ┃ 1．3 ┃ 1．3(水,┃
┃ 适当稀释的 ┃ O．8 ┃ O．9 ┃ 1．O ┃ 1．1 ┃ 1．2 ┃ _—— ┃ ┃
┃补体／ml ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃
┃ EA／ml ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃
┗━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━━━┛
37℃培养60分钟一冰浴中冷却一每分钟2000转离心5分钟→取上清液测吸光度
lml含50mg时，则按下式计算IVIG的加量(V)。然后再根据IVIG的实际取量计算明胶
巴比妥缓冲液的加量，但要保持供试品加缓冲液的总量为0．8ml。将此混合物在
37℃放置60分钟后，取0．2ml加9．8ml明胶巴比妥缓冲液(50倍稀释)，测定剩余补
体活性。
V(m1)=10mg/供试品每1ml中IgG含量（mg)
表3供试品及补体对照管制备
┏━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━━━━┓
┃ ┃ 供试品管／ml ┃补体对照管／ml ┃
┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
┃ 供试品(50mg／m1) ┃ O．2· ┃ ┃
┃ 明胶巴比妥缓冲液 ┃ O．6 ┃ O．8 ┃
┃ 补体(100CHso／m1) ┃ O．2 ┃ O．2 ┃
┗━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━┻━━━━━━━━┛
按下式计算供试品抗补体活性。D为每lml含80～120 CH50时，试验成立。
供试品抗补体活性(％)=D-G/D×100％
式中D为补体对照管剩余补体活性，CHso／ml；
G为供试品管剩余补体活性，CHso／m1。
【附注】 (1)洗红细胞时，务必将白细胞弃掉。
(2)敏化红细胞时一定要慢慢轻摇。
(3)仅允许使用澄清明胶溶液。
页码数,2005版药典附录第44页
附录ⅧF抗毒素F(ab)2测定法
本法系依据电泳法的原理，采用薄层扫描定量检测供试品组分的含量。
试剂 (1)丙烯酰胺溶液取丙烯酰胺14g与双丙烯酰胺O．367g，加水使溶解成
50ml。
(2)磷酸盐缓冲液 取磷酸二氢钠(Nail2P04·2H20)17．8g、磷酸氢二钠
(Na2 HP04·12H20)103g与十二烷基硫酸钠4g，加水使溶解成2000ml。
(3)10％十二烷基硫酸钠溶液(SDS)
(4)供试品结合液量取10％SDS溶液4ml，磷酸盐缓冲液0．2ml与甘油10ml，加水
至20ml。
(5)电极缓冲液取上述磷酸盐缓冲液稀释1倍。
(6)固定液量取甲醇400ml，冰醋酸70ml，加水配制成1000ml。
(7)染色液取考马斯亮蓝2．5g，加甲醇500ml与冰醋酸70ml，再加水使溶解成
1000ml。
(8)脱色液量取冰醋酸70ml与甲醇50ml，加水至1000ml。
(9)干燥液 量取甘油30ml与甲醇200ml，加水至1000ml。
供试品溶液的制备取含一定蛋白质浓度的供试品0．1ml，加供试品结合液
0．1ml，置100℃水浴加热2分钟或37℃ 2小时，冷却。
测定法在凝胶溶液中[磷酸盐缓冲液一丙烯酰胺溶液-水-1．5％过硫酸铵溶液
(2：1：O．8：O．25)]加四甲基L胺(TEMED)1～2滴，混匀后立即加入电泳槽的玻
璃板间，要避免产生气泡。于每一供试品孔内加入经处理的供试品25μg蛋白
质，电泳。电泳条件为每一个供试品孔的电流恒定为2～3mA。当溴酚蓝电泳至
底部时停止电泳。
电泳完毕后，将胶板放人固定液中过夜。于染色液中 染色1～2小时，然后
置脱色液中进行脱色，直至底色成为无色，用扫描仪于波长575nm处对每一供试
品进行扫描，得出(或计算出)供试品中F(ab)2的含量。
书页号：2005版药典三部附录70页
附录Ⅺ J 抗狂犬病血清效价测定法
本法系根据抗狂犬病血清能中和狂犬病病毒的作用，将供试品与标准品做
系列稀释，分别与狂犬病病毒悬液结合，小鼠脑内注射，在规定时间内观察小
鼠存活和死亡情况，以测定供试品效价。
试剂 (1) 2%小牛血清磷酸盐缓冲液 称取磷酸二氢钾1.2g、磷酸氢二钠
(Na2HPO4·12H2O)20.8g，加注射用水溶解并稀释至1000ml，溶解后过滤，调pH至7.6。
灭菌后pH值应为7.2～8.0。于磷酸盐缓冲液98ml中，加入2ml灭能小牛血清，临用前
配制。
(2) 20%小牛血清磷酸盐缓冲液 称取磷酸二氢钾1.2g、磷酸氢二钠
(Na2HPO4·12H2O)20.8g，加注射用水溶解并稀释至1000ml，溶解后过滤，调pH至7.6。
灭菌后pH值应为7.2～8.0。于磷酸盐缓冲液80ml中，加入20ml灭能小牛血清，临用
前配制。
中和用病毒悬液的制备 (1) 病毒悬液的制备 取CVS毒种(一般为冻干毒种)制
成10〈-2〉悬液，制法见本法(2)项，脑内接种体重10～12g小鼠每只0.03ml，待发病
后取鼠脑再制成10〈-2〉悬液，接种于小鼠脑内进行传代，一般传2～3代。选用
第5天发病并麻痹的鼠脑以脱脂牛乳研磨稀释成20%的脑悬液，按0.5ml分装安瓿，
冻干后真空封口，制成冻干中和用病毒，－30℃冻存待用；或用第5天发病并麻
痹的鼠脑用20%小牛血清磷酸盐缓冲液研磨稀释成10〈-1〉悬液，以每分钟2000转
离心20分钟，取上清液混匀后分装小管，－70℃冻存待用。
(2) 病毒悬液毒力的预测
① 冻干病毒的预测。 取含20%脑悬液的冻干病毒，启开后加入2%小牛血清
磷酸盐缓冲液1.0ml，吹打均匀后加入4.0ml 2%小牛血清磷酸盐缓冲液与病毒液充分
混匀，以每分钟1500转离心10分钟，取上清液与等量的2%小牛血清磷酸盐缓冲液
混合即为10〈-2〉悬液，然后再稀释至10〈-3〉、10〈-4〉、10〈－5〉、10〈－6〉
,从10〈－6〉至10〈－2〉的稀释液中各取0.5ml置于5个小管内，每管再加入2%小
牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml，置37℃水浴1小时。用体重10～12g小鼠30只，分成5组，
每组6只，用经37℃作用的10〈-6〉至10〈-2〉病毒悬液接种小鼠，每个稀释度接
种6只小鼠，每只小鼠脑内接种0.03ml，每天观察小鼠发病死亡情况，观察14天，
接种后4天内死亡的小鼠按非特异性死亡计。以接种5天后的发病死亡小鼠统计
LD50。
② －70℃冻存病毒的预测。取含10%脑悬液的冰冻病毒融化后即为10〈-1〉
悬液，然后再稀释至10〈-2〉～10〈-7〉。从10〈-7〉至10〈-3〉各取0.5ml加至5个小
管内，每管再加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml，置37℃水浴l小时。用体重10～
12g小鼠30只，分成5组，每组6只，用经37℃作用的10〈-7〉至10〈-3〉病毒悬液接
种小鼠，每个稀释度接种小鼠6只，每只小鼠脑内接种0.03ml，每天观察小鼠发病
死亡情况，观察14天。接种后4天内死亡的小鼠按非特异性死亡计。以接种5天后
的发病死亡小鼠统计LD50。
(3) 中和用病毒悬液的制备 按病毒悬液预测的100个LD50的病毒稀释度作为中
和用病毒悬液稀释倍数，用于小鼠中和试验。要求中和用病毒悬液经37℃水浴
作用1小时的病毒量在32～320LD50之间。
抗狂犬病血清标准品溶液的制备 由国家药品检定机构提供，或用经国家药
品检定机构认可的各生产单位工作用标准品。配制方法按使用说明书进行。
供试品溶液的制备 用2%小牛血清磷酸盐缓冲液将供试品进行2倍稀释，一般
可采用1：800、1：1600、…、1：102 400，但可根据供试品实际效价适当降低或提
高最低稀释倍数，如采用上述8个稀释倍数，则按稀释液2.7ml加入供试品0.3ml作为
1：10供试品溶液，然后再用稀释液3.5ml加入混匀的1：10的供试品溶液0.5ml作为
1：80供试品溶液，再按稀释液2.7ml加入1：80的供试品溶液0.3ml作为1：800供试品
溶液(1)。再按0.5ml加0.5ml做倍比稀释制备供试品溶液(2)～(8)，它们的稀释倍数依
次为1：1600、1：3200、1：6400、1：12 800、l：25 600、1：51 200和1：102 400。
测定法 取8个稀释度的供试品溶液(1)～(8)各0.5ml置8支小试管中，另取8个稀
释度的抗血清标准品溶液各0.5ml置8支小试管中，共16支小试管，分别加入中和
用病毒悬液0.5ml，放置37℃水浴1小时，供注射小鼠用。另用相同体重的小鼠测
定中和用病毒悬液的实际LD50。其方法可将中和用病毒悬液作为原倍再稀释
10〈0〉、10〈-1〉、10〈-2〉、10〈-3〉等共4个稀释度，以上4个稀释度各加入
0.5ml于小管内，每管再加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml，同样放置37℃水浴1小
时作为中和病毒对照。将已中和的供试品和标准品的不同稀释度的悬液以及病
毒对照分别接种小鼠，供试品和标准品按从浓到稀的倍数接种小鼠，而病毒对
照则按从稀到浓的倍数接种小鼠。小鼠体重10～12g，每只小鼠脑内接种0.03ml。
每稀释度注射6只小鼠。
每天记录小鼠的发病死亡情况，共观察14天，接种后4天内死亡的小鼠作为
非特异性死亡计。
供试品效价(IU/ml)=(B1/B2)×D
式中 B1为供试品ED50的倒数；
B2为抗血清标准品ED50的倒数；
D为抗血清标准品的国际单位，IU/ml。
页码数,2005版药典附录第64页
附录X Q抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(E玫瑰花环形成抑制试验)
本法系依据抗人T细胞免疫球蛋白与人淋巴细胞E受体结合后，可阻止绵羊
红细胞与淋巴细胞E受体特异性结合，根据其结合抑制率测定供试品抗人T淋巴
细胞免疫球蛋白效价。
试剂 (1)淋巴细胞分离液(Ficoll※s液)
(2)Hank’s液
(3)20％胎牛血清Hank’s液试验当天取适量灭菌的Hank’s液，加入经56℃ 30分钟
灭能及羊红细胞吸收过的胎牛血清，配成20％浓度。用0．5mol／L碳酸氢钠溶
液或稀盐酸调pH至7．2～7．4。
(4)1％羊红细胞悬液 颈静脉采羊血于Alsever※s液中，可保存2周。试验前取适
量羊红细胞用生理氯化钠溶液洗3次，用20％胎牛血清Hank※s液配成1％羊红细胞
悬液。
(5)淋巴细胞悬液取肝素抗凝新鲜人静脉血加等量生理氯化钠溶液混匀后，
缓慢加至等量淋巴细胞分离液液面上，以每分钟2000转离心20分钟，吸出淋巴细
胞层细胞，加适量生理氯化钠溶液清洗，以每分钟1200转离心 10分钟，弃上清
液，沉淀加入适量20％胎牛血清Hank※s液，摇匀，为淋巴细胞原液；用1％醋酸
蓝液将淋巴细胞原液稀释20倍，镜检计数淋巴细胞。根据计数结果，用20％胎
牛血清Hank’s液将淋巴细胞原液稀释成每lml含5×10 6个淋巴细胞，即为淋巴细胞
悬液。
供试品溶液的制备 根据供试品效价，用20％胎牛血清Hank’s液将供试品稀释
至几个适宜浓度。
测定法 取供试品溶液100μl加入淋巴细胞悬液100μl，摇匀，置37℃水浴30分
钟；加入1％羊红细胞悬液100p．1，混匀，室温放置15分钟。每分钟500转离心5
分钟后放冰箱过夜，每稀释度供试品溶液做2管。次日取出各管，加入当天稀释
的0．2％台盼蓝溶液100μl，轻轻摇匀，镜检计数花环形成率(％)。取20％胎牛血
清Hank’s液100μl，加入淋巴细胞悬液100μl，自"摇匀，置37℃水浴30分钟”起，同
法操作，作对照组。计算花环抑制率(％)，以花环抑制率在25％以上的供试品的
最高稀释倍数为花环抑制效价。
页码数,2005版药典附录第64页
附录X R抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(淋巴细胞毒试验)
本法系依据抗人T细胞免疫球蛋白与人淋巴细胞结合，在补体存在下破坏淋
巴细胞，根据淋巴细胞死亡率测定供试品抗人T细胞免疫球蛋白效价。
试剂 (1)淋巴细胞分离液(Ficoll’s)
(2)Hank※s液
(3)20％胎牛血清Hank’s液试验当天取适量经消毒保存的Hank※s液，加入经56℃
30分钟灭能的胎牛血清，配成20％浓度。用O．5mol／L碳酸氢钠溶液或稀盐酸
调pH至7．2～7．4。
(4)淋巴细胞悬液取肝素抗凝新鲜人静脉血加等量生理氯化钠溶液混匀后，
缓慢加至等量淋巴细胞分离液液面上，以每分钟2000转离心20分钟，吸出淋巴细
胞层细胞，加适量生理氯化钠溶液清洗，以每分钟1200转离心10分钟，弃上清
液，沉淀加入适量20％胎牛血清Hank’液，摇匀，为淋巴细胞原液；用1％醋酸蓝
液将淋巴细胞原液稀释20倍，镜检计数淋巴细胞。根据计数结果，用20％胎牛
血清Hank※s液将淋巴细胞原液稀释成每lml含5×10 6个淋巴细胞，即为淋巴细胞悬
液。
(5)补体正常家兔血清。作补体用的兔血清要求对试验用的靶细胞无明显的
毒性，因此家兔血清要预先进行选择，方法如下：取淋巴细胞悬液0．05ml，
加1：5稀释的家兔血清O．05ml，置37℃1小时后，加0．5％台盼蓝盐水溶液
O．05ml，置37℃ 5分钟后镜检计数淋巴细胞，死亡细胞率在10％以下者方可作补
体用。
(6)O．5％台盼蓝生理氯化钠溶液
(7)2．5％戊二醛溶液(用Hank’s液稀释) 供试品溶液的制备 根据供试品效价，
用20％胎牛血清Hank※s液将供试品稀释至几个适宜浓度。
阳性对照溶液的制备将经人T淋巴细胞免疫的猪血浆或兔血清在60℃加热10
分钟后，用生理氯化钠溶液稀释10倍。
阴性对照溶液的制备 将正常猪血浆或兔血清在60℃加热10分钟后，用生理]
氯化钠溶液稀释10倍。
测定法 取供试品溶液O．05ml，加淋巴细胞悬液O．05ml，置37℃ 1小时，加
1：5稀释的家兔血清O．05ml，置37℃ 30分钟后加0．5％台盼蓝生理氯化钠溶液
0．05ml，置37℃，5分钟，立即镜检计数淋巴细胞，计算死亡细胞率，一般数
100个淋巴细胞。取阳性对照溶液O．05ml，加淋巴细胞悬液0．05ml，自置37℃，
1小时起，同法操作，作阳性对照。取阴性对照溶液0．05ml，加淋巴细胞悬液
O．05ml，自“置37℃，1小时起，同法操作，作阴性对照。
结果判定 阳性对照组的死亡淋巴细胞率大于20％，且阴性对照组的死亡淋
巴细胞率小于10％试验成立。以(+)为判定终点，出现(+)供试品的最高稀释度为
该供试品的淋巴细胞毒效价。
【附注】(1)试验组死亡淋巴细胞率
小于10％ (一) 41％～60％ (++)
10％～20％ (±) 61％～80％ (+++)
21％～40％ (+) 不低于81％ (++++)
(2)如供试品较多或来不及看结果时，为避免试验误差，可在抗原、抗体、补
体作用后加0．5％台盼蓝生理氯化钠溶液O．05ml，置37℃ 5分钟后，立即加
2．5％戊二醛溶液0．05ml，留待适当时候镜检；或先加2．5％戊二醛溶液
O．05ml，室温放置10分钟后，加入0．5％台盼蓝生理氯化钠溶液0．05ml，置
37℃，5分钟后留待适当时候镜检。
页码数,2005版药典附录第70页
附录Ⅺ I 抗蛇毒血清效价测定法 (小鼠试验法)
本法系根据抗蛇毒血清能中和蛇毒的作用，将供试品与标准品做系列稀
释，分别与定量蛇毒相混合，注射小鼠后，比较标准品组和供试品组的小鼠死
亡时间和数量，计算出供试品的效价。
试剂稀释液称取氯化钠8．5g、硼酸4．5g、四硼酸钠(Na2 B4 07·10H20)O．5g，用
注射用水溶解并稀释至1000ml，过滤，灭菌后pH值应为7．0～7．2。
抗蛇毒血清标准品溶液的制备将抗蛇毒血清标准品用稀释液稀释至每lml含
5U(抗银环蛇、抗蝮蛇毒血清)、5IU(抗眼镜蛇毒血清)或10U(抗五步蛇毒血清)，即
与5个相应蛇毒试验量混合后每O．4ml注射量分别含相应抗蛇毒血清效价1U或
2U。
蛇毒溶液的制备蛇毒须以国家药品检定机构分发的抗蛇毒血清标准品准确
标定其试验量(蝮蛇、眼镜蛇及银环蛇1个L+，五步蛇2个L+)，将蛇毒稀释至其5
个试验量不高于O．8ml体积。即在与抗蛇毒血清混合后，补加稀释液至2ml时，
每0．4ml注射量中含1个试验量。
供试品溶液的制备 将供试品稀释成数个稀释度，使每lml含抗蝮蛇、抗眼镜
蛇或抗银环蛇毒血清效价约5U,抗五步蛇毒血清效价约10U。各稀释度间隔
5％～10％。
测定法量取不同稀释度供试品溶液各1．0ml、抗蛇毒血清标准品溶液lml作为
对照①、抗蛇毒血清标准品溶液1．2ml作为对照②，将上述抗蛇毒血清分别置
小试管中，每管加入5个试验量与供试品溶液相应的蛇毒溶液，补加稀释液至
2ml(即供试品每0．4ml注射量中含1个试验量或2个试验量)，混合均匀，加塞，置
37℃结合45分钟后立即注射小鼠。
将每个稀释度的供试品溶液、对照①及对照②各注射体重18～20g小鼠4只，
每只腹腔注射0．4ml。
结果判定每日观察1次试验小鼠，观察48～72小时，并记录发病及死亡情况。
对照①小鼠死亡不低于50％，对照②小鼠应比对照①死亡晚、死亡只数少或不
死亡。供试品溶液之效价为与对照①小鼠死亡情况(时间、数量)相同之最高稀
释度。
试验小鼠死亡情况发生倒置或对照不成立，应重试。
【附注】(1)注射动物要做到量准、部位准，同时要防止注射液流出。
(2)使用干燥毒素时，须精密称定，每次称量应不低于5mg，溶解后应在3天内
(保存于2～8℃)用完。干燥毒素应封存于装有干燥剂的真空器皿中。亦可将冻干
蛇毒配成液体蛇毒，即将蛇毒复溶后与中性甘油(116℃ 10分钟灭菌)等量混合。
每lml至少含50个试验于2～8℃避光处。
页码数,2005版药典附录第45页
附录IXA 抗生素残留量检查法
本法系依据在琼脂培养基内抗生素对微生物的抑制作用，比较对照品与供
试品对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，检查供试品中氨苄西林或四环素残
留量。
磷酸盐缓冲液(pH 6．0)的制备 称取磷酸二氢钾8．Og、磷酸氢二钾2．Og，
加水溶解，使成1000ml，经121℃灭菌30分钟。
抗生素Ⅱ号培养基的制备称取胨6g、牛肉提取粉1．5g、酵母浸出粉6g，加
入适量水溶解后，加入琼脂13～14g，加热使之溶胀，滤过除去不溶物，加入葡
萄糖1g，溶解后加水至1000ml，调节pH值使灭菌后为6．5～6．6；分装于玻璃管
或锥形瓶中，经115℃灭菌30分钟，4℃保存。
对照品溶液的制备 取氨苄西林对照品适量，用0．01mol／L盐酸溶解并稀释
成每lml中含氨苄西林10mg的溶液，精密量取适量，用磷酸盐缓冲液稀释成每10ml
中含1．0／lg的溶液。
取四环素对照品适量，用生理氯化钠溶液溶解并稀释成每lml中含O．125μg的
溶液。
菌悬液的制备 (1)金黄色葡萄球菌(Staphylo—COCCUS aureus)悬液用于检测氨苄
西林。取金黄色葡萄球菌(CMCC 26003)营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜
面上，35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或O．9％无菌氯化钠溶液将
菌苔洗下，备用。
(2)藤黄微球菌(Micrococcus luteus)悬液用于检测四环素。取藤黄微球菌
[CMCC(B)28001]营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，置于26～27℃培
养24小时。临用时，用0．9％无菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
检查法取直径8cm或10cm的培养皿，注入融化的抗生素Ⅱ号培养基15～20ml，
使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。取抗生素Ⅱ号培养基
10～15ml置于1支50~C水浴预热的试管中，加入O．5％～1．5％(ml／m1)的菌悬液
300μl混匀，取适量注入已铺制底层的培养皿中，放置水平台上，冷却后，在每
个培养皿上等距离均匀放置钢管(内径6～8mm、壁厚1～2mm、管高10～15mm的不
锈钢管，表面应光滑平整)，于钢管中依次滴加供试品溶液、阴性对照液(磷酸
盐缓冲液)及对照品溶液。培养皿置37℃培养18～22小时。
结果判定对照品溶液有抑菌圈，阴性对照液无抑菌圈。供试品溶液抑菌圈
的直径小于对照品溶液抑菌圈的直径时判为阴性；否则判为阳性。
【附注】 本试验应在无菌条件下进行，使用的玻璃仪器，钢管等应无菌。
书页号：2005版药典三部附录9页
附录I J颗粒剂
颗粒剂 系指以生物制品原液经干燥后制成的干粉为原料药物，与适宜的辅
料混合制成具有一定粒度的干燥颗粒状制剂；原料药物可由一种或多种活性
成分组成。颗粒剂可分为可溶颗粒(通称为颗粒)、混悬颗粒、肠溶颗粒等。供
口服用。
混悬颗粒系指难溶性原料药物与适宜的辅料混合后制成一定粒度的干燥颗
粒剂。临用前加水或其他适宜的液体，振摇即可分散成混悬液，供口服。
除另有规定外，混悬颗粒应进行溶出度检查。
肠溶颗粒系指采用肠溶材料包裹颗粒或其他适宜方法制成的颗粒剂。
肠溶颗粒耐胃酸而在肠液中释放活性成分，可防止药物在胃内分解失效，
避免对胃的刺激或控制药物在肠道内定位释放。
除另有规定外，肠溶颗粒应进行释放度检查。
颗粒剂在生产与贮藏期间均应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产及质量控制应符合相关品种
要求。
二、原料药物与辅料应均匀混合；凡属挥发性药物或遇热不稳定的药物在
制备过程应注意控制温度，凡遇光不稳定的药物应避光操作。
三、颗粒剂应干燥，粒径应均一，色泽一致，无吸潮、软化、结块、潮解
等现象。
四、如有必要，颗粒剂制备时，叮加入适宜的矫味剂、芳香剂、着色剂、
分散剂和防腐剂等添加剂。
五、除另有规定外，颗粒剂应置2～8℃避光干燥处密封贮存和运输。
颗粒剂应进行以下相应检查。
【粒度】 除另有规定外，照粒度测定法(附录V G)
检查，不能通过一号筛(2000μm)与能通过五号筛(180μm)的总和不得超过供试量
的15％。
【干燥失重】 除另有规定外，照十燥失重测定法(附录ⅦL)测定，于105℃干
燥至恒重，含糖颗粒在80℃减压十燥，减失重量不得过2．0％。
【溶化性】 除另有规定外，可溶颗粒照下述方法检查，应符合规定。
取供试品lOg，加热水200ml，搅拌10分钟，可溶颗粒应全部溶化或轻微浑
浊，但不得有异物。
混悬颗粒或已规定检查溶出度或释放度的颗粒剂，可不进行溶化性检查。
【装量差异】 单剂量包装的颗粒剂的装量差异限度，应符合规定。
检查法取供试品10包(瓶)，除去包装，分别精密称定每包(瓶)内容物的重
量，求出每包(瓶)内容物的装量与平均装量。每包(瓶)装量应与平均装量相比较
[凡无含量测定的颗粒剂，每包(瓶)装量应与标示装量比较]，超出装量差异限
度的不得多于2包(瓶)，并不得有1包(瓶)超出装量差异限度l倍。
凡规定检查含量均匀度的颗粒剂，可不进行装量差异的检查。
【装量】 多剂量包装的颗粒剂，照最低装量检查法(附录V F)检查，应符合
规定。
【微生物限度】 除另有规定外，照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符
合规定。
凡规定进行杂菌检查的颗粒剂，可不进行微生物限度检查。
页码数,2005版药典附录第24页
附录V B可见异物检查法
(灯检法)
可见异物是指存在于注射剂中，在规定条件下目视可以观测到的任何不溶
性物质。
实验室检测时应避免引入可见异物。当复溶冻干制剂时，或盛装供试品的容
器(如不透明、不规则形状容器等)不适于检测，需转移至洁净透明的适宜容器
中时，均应在100级洁净环境(如层流净化台)中进行。
检查装置如下图所示，图略。
图中A为带有遮光板的日光灯光源。光照度可在1000～3000 1x范围内调节。用
于无色溶液检查，光照度应为1000～1500 1x；用于透明塑料容器或有色溶液检
查，光照度应为2000～3000 lx。B为不反光的黑色背景。C为不反光的白色背景和
底部(供检查有色异物)。D为反光的白色背景(指遮光板内侧)。
检查人员条件远距离和近距离视力测验，均为4·9或4．9以上(矫正后视力应
为5．0或5．O以上)；应无色盲。
检查法除另有规定外，取供试品，除去容器标签，擦净安瓿(瓶)外壁污痕，
放室温静置一定时间(人血白蛋白和人免疫球蛋白类制品一般放置过夜)，在避
光室内或暗处，手持瓶颈部于伞棚边缘处，在明视距离(指供试品至人眼的距
离，通常为25cm)，分别在黑色和白色背景下，轻轻旋转和翻转容器使药液中可
能存在的可见异物悬浮(注意不使药液产生气泡)，用目检视，检查时限为20秒。
供试品装量每支(瓶)在10ml以下的每次检查拿取2支(瓶)；10ml以上的每次检查拿
取1瓶(支)。50ml或50ml以上注射液按直、横、倒三步法旋转检视。
(1)注射液除另有规定外，取供试品20支(瓶)，照上述方法检查，检出可见异
物的应不得超过1支(瓶)。如检出可见异物的有2支(瓶)，应另取20支(瓶)同法复
试，均不得检出。初试和复试均不得检出玻璃屑、纤维、色点、色块及其他外
来异物。
(2)注射用冻干制剂除另有规定外，取供试品5支(瓶)。将供试品和溶解液的温
度平衡至各品种规定的溶解温度，再沿瓶壁缓缓注入溶解液，旋转轻摇溶解。
有真空的供试品，待供试品即将全部溶解时，破其真空，照上述方法检查；
无真空度的供试品，待供试品全部溶解后照上述方法检查，应不得检出可见异
物。如检出可见异物的有1支(瓶)，应另取5支(瓶)同法复试，均不得检出。初试
和复试均不得检出玻璃屑、纤维、色点、色块及其他外来异物。
【附注】 (1)检查时发现瓶盖松动或有微量沉积物的供试品需做无菌检查。
(2)冻干制剂需按各品种规定的温度及方式复溶。
页码数,2005版药典附录第50页
附录ⅨI类A血型物质测定法
(血凝抑制法)
本法系用标准类A血型物质和供试品分别与抗A血型血清反应，通过比较血
凝反应终点，测定供试品中类A血型物质含量。
1％A型人红细胞悬液6人份A型血等量混合，加适量生理氯化钠溶液混匀，以
每分钟2000转离心10分钟，倾去上清液，用生理氯化钠溶液洗3次，吸取沉积红细
胞lml，加生理氯化钠溶液99ml，混匀，制成1％红细胞悬液。
标准类A血型物质溶液的制备 由国家药品检定机构分发或经其认可。将标准
品制成每lml中含lmg的标准溶液。取1组10支直径9mm的试管，将标准溶液用生理
氯化钠溶液进行2倍系列稀释，体积为O．1ml，由1／100稀释度(每lml含0．01mg)开
始。
供试品溶液的制备取1组10支直径9mm的试管，将供试品用生理氯化钠溶液进
行2倍系列稀释，体积为O．1ml，由原倍供试品开始。
抗A血型血清试验剂量的测定取1组10支直径9mm的试管，将抗A血型血清用生
理氯化钠溶液进行2倍系列稀释，体积为0．1ml，由1／2稀释度开始，加1％A型
人红细胞悬液0．1ml。同时取生理氯化钠溶液0．1ml与1％A型人红细胞O．1ml作
为阴性对照。摇匀，室温放置15分钟，以每分钟1500转离心1分钟，按细胞沉降
压缩情况观察凝集程度。以呈现完全凝集(++++)的抗A血型血清的最高稀释度为
1个抗体试验剂量。
测定法在每稀释度供试品及标准类A血型物质溶液中分别加含2个抗体试验剂
量的抗A血型血清0．1ml。摇匀，36．5～37．5℃放置10分钟，再于上述各管中分
别加入1％A型人红细胞悬液O．1ml，摇匀，36．5～37．5℃放置15分钟，以每分
钟1500转离心1分钟，按红细胞沉降压缩情况观察凝集程度。
结果判定供试品呈现完全血凝抑制(终点)的最高稀释倍数乘以对照组呈现相
似血凝抑制的最高倍稀释管的血型物质含量，即为每lml供试品所含类A血型物质
的质量(mg)。
页码数,2005版药典附录第67页
附录ⅪD类毒素絮状单位测定法
本法系根据类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度、反应时间等
条件下，可在试管中发生抗原抗体结合，产生肉眼可见的絮状凝集反应。根据
抗毒素絮状反应标准品可测定供试品的絮状单位(Lf)值。
试剂硼酸盐缓冲液称取四硼酸钠(Na2B407·10H20)O．5g、硼酸4．5g、氯化钠
8．5g，加水1000ml，使之完全溶解。pH值为7．0～7．2。
标准品溶液的制备精密量取白喉或破伤风抗毒素絮状反应国家标准品，用
硼酸盐缓冲液准确稀释至每lml含100Lf的溶液。
供试品溶液的制备取供试品适量，加硼酸盐缓冲液稀释至适宜絮状单位。
测定法精密量取每lml含100Lf的抗毒素絮状反应标准品溶液0．3ml、0．4ml、
0．5ml、0．6ml、0．7ml，分别加入絮状反应管，精密量取供试品溶液lml快速准
确加入上述各反应管内，摇匀，置45℃水浴中，连续观察，并记录絮状出现次
序和时间。再取5支反应管，重复上述试验，将最先出现絮状之管放中间，前
后各加两管不同量标准抗毒素絮状反应标准品溶液，每管间隔O．05ml，再向
各管中加入供试品lml，观察絮状出现情况。根据结果，再重复试验一次，将最
先出现管放中间，前后各加两管不同量抗毒素絮状反应标准品溶液，每管间
隔O．02ml，同上法观察并记录结果，以2～3次相同值为最终测定值。
按下式计算
供试品絮状单位(Lf／m1)=E* F*100
式中E为最先出现絮状时使用的每lml含100Lf的抗毒素絮状反应标准品溶液的体
积，ml；
F为供试品稀释倍数。
页码数,2005版药典附录第27页
附录V G粒度测定法
本法用于测定原料药和药物制剂的粒子大小或粒度分布。其中第一法、第
二法用于测定药物制剂的粒子大小或限度，第三法用于测定原料药或药物制剂
的粒度分布。
第一法(显微镜法)
本法中的粒度，系以显微镜下观察到的长度表示。目镜测微尺的标定用以
确定使用同一显微镜及特定倍数的物镜、目镜和镜筒长度时，目镜测微尺上
每一格所代表的长度。
将镜台测微尺置于显微镜台上，对光调焦，并移动测微尺于视野中央；取
下目镜，旋下接目镜的目镜盖，将目镜测微尺放入目镜筒中部的光栏上(正面
向上)，旋上目镜盖后返置镜筒上。此时在视野中可同时观察到镜台测微尺的
像及目镜测微尺的分度小格，移动镜台测微尺和旋转目镜，使两种量尺的刻
度平行，并令左边的0刻度重合；寻找第二条重合刻度，记录两条刻度的读数；
并根据比值计算出目镜测微尺每小格在该物镜条件下所相当的长度(μm)。由
于镜台测微尺每格相当于lOμm，故目镜测微尺每1小格的长度为：
10*相重区间镜台测微尺的格数 /相重区间目镜测微尺的格数
当测定时要使用不同的放大倍数时，应分别标定。
测定法 取供试品，用力摇匀，黏度较大者可按品种项下的规定加适量甘油
溶液(1→2)稀释，照该剂型或品种项下的规定，量取供试品，置载玻片上，覆
以盖玻片，轻压使颗粒分布均匀，注意防止气泡混入，半固体可直接涂在载
玻片上，立即在50～100倍显微镜下检视盖玻片全附录V H渗透压摩尔浓度测定
法部视野，应无凝聚现象，并不得检出该剂型或品种项下规定的50μm及以上
的粒子。再在200～500倍的显微镜下检视该剂型或品种项下规定的视野内的总
粒数及规定大小的粒数，并计算其所占比例(％)。
第二法(筛分法)
1．单筛分法
称取各品种项下规定的供试品，置规定号的药筛内，筛上加盖并在筛下配
有密合的接收容器。按水平方向旋转振摇至少3分钟，并不时在垂直方向轻叩
筛。取筛下的颗粒及粉末，称定重量，计算其所占比例(％)。
2．双筛分法
取单剂量包装的5包(瓶)或多剂量包装的1包(瓶)，称定重量，置该剂型或品种
规定的药筛中，保持水平状态过筛，左右往返，边筛动边拍打3分钟。取不能
通过小号筛和能通过大号筛的颗粒及粉末，称定重量，计算其所占比例(％)。
页码数,2005版药典附录第36页
附录VII A 磷测定法
本法系将有机磷转变为无机磷后进行磷含量测定。磷酸根在酸性溶液中与
钼酸铵生成磷钼酸铵，遇还原剂即生成蓝色物质(三氧化钼和五氧化钼的混合
物)，称之为"钼蓝"，用比色法测定供试品中磷含量。
测定法精密量取供试品适量(约含磷4～20μg)置附录ⅦC硫酸铵测定法试管
中，加4滴硫酸(约O．08m1)加热至炭化，再加2滴高氯酸(约O．06m1)消化至无色
澄清，消化完全后稍置片刻，立即加水2ml，加O．04mol／L钼酸铵溶液(称取
钼酸铵5g，加水溶解并稀释至lOOml)O．4ml，混匀；加-还原剂(称取亚硫酸氢钠
6g、亚硫酸钠1．2g、1-氨基-2-萘酚4-磺酸0．1g，置棕色瓶中，加水至50ml，一周
内使用)0．2ml，混匀；加水至6ml，15～20分钟后，照紫外-可见分光光度法(附录
ⅡA)，在波长820nm处测定吸光度。
精密量取标准磷溶液(精密称取干燥至恒重的磷酸二氢钾439．3mg，置l00ml量
瓶中，加水溶解并稀释至刻度；再精密量取2ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻
度，即得每lml含磷20μg的标准磷溶液)O．2ml、O．4ml、O．6ml、O．8ml、1．Oml，
分别置试管中，各补加水至lml，自“加4滴硫酸”起，同法操作，测定各管的吸光
度。
以标准磷溶液的系列浓度对吸光度作直线回归，然后将供试品溶液的吸光度
代入直线回归方程，求出其相应体积(ml)。
磷含量(μg／m1)=V*CR／vx
式中 v为供试品溶液吸光度相对于标准磷溶液的体积，ml；
cR为标准磷溶液的浓度，μg／ml,
Vx为供试品的体积，m1。
【附注】 (1)加高氯酸消化时，必要时可加1～2滴30％过氧化氢，但最后必须将
过氧化氢除尽。
(2)加高氯酸消化后，如在冷却后加水，须再加热。
(3)测定A群脑膜炎球菌多糖疫苗成品磷含量时，至少取3支安瓿溶解后混合
备用。
页码数,2005版药典附录第33页
附录ⅥJ磷酸三T酯残留量测定法
本法系用气相色谱法测定供试品中磷酸三丁酯残留量。
照气相色谱法(附录ⅢC)测定。
色谱条件与系统适用性试验 用酸改性聚乙二醇(20M)毛细管柱，柱温140℃，
气化室温度190℃，火焰离子化检测器或氮磷检测器，检测器温度210℃，载气
(氮气)流速为每分钟60ml，或根据仪器选择检测条件。理论板数按磷酸三丁酯峰
计算应不低于5000，磷酸三丁酯峰与磷酸三丙酯峰的分离度应不小于1．5，磷
酸三丁酯对照品溶液连续进样5次，所得磷酸三丁酯峰与磷酸三丙酯峰面积之
比的相对标准偏差(RSD)应不大于5％。
内标溶液的制备取磷酸三丙酯适量，用正己烷溶解并定量稀释制成每lml中约
含400μg的溶液。
测定法精密量取供试品3ml，置具塞玻璃离心管中，精密加内标溶液50μl与
1．5mol／L高氯酸溶液O．75ml，振荡1分钟，置37℃水浴保温10分钟后，再加
正己烷4ml，振荡2分钟，以每分钟2000转离心20分钟。小心吸取上层正己烷，用
空气流将其浓缩至约o．2ml(不能加热)，取0．1μ1注入气相色谱仪。另取磷酸三
丁酯对照品适量，精密称定，加正己烷溶解并定量稀释制成每lml中约含600μg的
溶液；精密量取该溶液10μ1、20μ1、40μ1、60μ1、80μl，分别置已精密加水3ml的具
塞玻璃离心管中，再向各对照品管精密加内标溶液50μ1，自“振荡1分钟”起，同
法操作。以各磷酸三丁酯对照品峰面积与内标峰面积比，对磷酸三丁酯对照
品溶液浓度作直线回归，求得回归方程。计算出供试品中磷酸三丁酯含
量(μg／m1)。
【附注】 (1)对照品溶液与供试品溶液的溶剂挥发的速度应尽量保持一致；
若离心后，乳化仍未完全破除，可在振荡器上稍微振摇一下，再离心一次。
(2)直线回归相关系数应不低于O．99。
页码数,2005版药典附录第37页
附录ⅦB硫柳汞测定法
本法系依据汞有机化合物经强酸消化成无机汞离子，与双硫腙溶液形成橙
黄色化合物，根据双硫腙滴定液的消耗量，可计算出供试品中硫柳汞含量。
试剂 (1)双硫腙滴定液 精密称取双硫腙50mg，置lOOml量瓶中，加三氯甲烷溶
解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。
临用前，精密量取贮备液2．5ml，置100ml量瓶中，加四氯化碳稀释至刻度，
摇匀，即得双硫腙滴定液，保存于冷暗处。
(2)标准汞溶液取置硫酸干燥器中干燥至恒重的氯化高汞约O．135g，精密称
定，置lOOml量瓶中，加0．5mol／L硫酸溶解并稀释至刻度，摇匀，即为标准汞
贮备液。
临用前，精密量取标准汞贮备液适量，置lOOml量瓶中，加0．5mol／L硫酸溶
液稀释至刻度，摇匀，即为每Iml相当于50μg Hg的标准汞溶液。
测定法 (1)消化精密量取供试品适量(约相当于含汞量50μg)，置150ml圆底磨口
烧瓶(附长40cm回流管)中，加硫酸2ml，8．Omol／L硝酸溶液O．5ml混匀后，置电
炉上加热回流15分钟(或置于3cmX 24cm试管中，加盖置85～90℃水浴加热1小时)，
冷却后加水40ml，加20％盐酸羟胺溶液5ml。
(2)滴定用水40ml将上述消化后溶液分数次冲洗入125m1分液漏斗中，用双硫腙
滴定液滴定，开始时每次可加入2ml左右，以后逐渐减少至每次O．5ml，最后还
可少至O．2ml。每次加入滴定液后，振摇10秒钟，静置分层，弃去四氯化碳层，
继续滴定，直至双硫腙液的绿色不变，即为终点。
(3)双硫腙滴定液的标化 精密量取标准汞溶液1ml，置125m1分液漏斗中，加硫
酸2ml，加水80ml和20％盐酸羟胺溶液5ml，自“用双硫腙滴定液滴定”起，同法操
作。
按下式计算
硫柳汞含量(％)=V1*O．05*2．02*100/V2*V3*1000
式中V1为供试品消耗双硫腙滴定液的体积，ml；
V2为标准汞溶液消耗双硫腙滴定液的体积，ml；
V3为供试品的体积，ml；
O．050为标准汞溶液的浓度，mg／ml；
2．02为常数(1g汞相当于2．02g硫柳汞)。
【附注】 (1)抗毒素及免疫球蛋白供试品用水浴消化法滴定时会出现少量絮
状物，但不影响结果。
(2)可做限度测定。
页码数,2005版药典附录第37页
附录ⅦC硫酸铵测定法
本法系依据硫酸铵被氢氧化钠分解释放出氨，并被硼酸吸收生成硼酸铵，
用酸滴定液滴定。根据酸滴定液的消耗量可计算出供试品中硫酸铵含量。
供试品溶液的制备除蛋白质方法同蛋白质含量测定
(附录ⅥB第一法)。
测定法精密量取除蛋白质滤液lOml，置凯氏蒸馏器内，加4％氢氧化钠溶液
lml，加少量水，照氮测定法(附录ⅥA)进行蒸馏、滴定。并将滴定的结果用空
白试验校正。
按下式计算
硫酸铵含量(％)=(Vl-Vo)*C*14．01*4．715*2×100/1000
式中v1为供试品消耗硫酸滴定液的体积，ml,
V0为空白对照消耗硫酸滴定液的体积，ml；
c为硫酸滴定液的浓度，mol／L；
页码数,2005版药典附录第39页
附录ⅦG氯化钠测定法
本法系用硝酸破坏供试品中的蛋白质后，再加入过量的硝酸银，使供试品
中的氯离子与硝酸银完全反应，生成氯化银沉淀析出，过量的硝酸银用硫氰
酸铵滴定液滴定，根据硫氰酸铵滴定液消耗的量，可计算出供试品中氯化钠
的含量。
测定法精密量取供试品1．0ml，精密加入O·lmol／L硝酸银溶液(称取硝酸银
17．0g，加水溶解并稀释成1000m1)5ml(若蛋白质含量较高者，加2ml饱和高锰酸
钾溶液)，混匀，加8．0mol／L硝酸溶液10ml，加热消化至溶液澄清，冷却，加水
50ml，8％硫酸铁铵指示液lml，用硫氰酸铵滴定液(0．05mol／L)滴定至溶液呈淡棕
红色，振摇后仍不退色，即为终点。并将滴定的结果用空白试验(可不消化)校
正。
按下式计算
氯化钠含量(g／L)=(V0一Vx)×c×58·45
式中 V0为空白试验消耗硫氰酸铵滴定液的体积，ml；
Vx为供试品消耗硫氰酸铵滴定液的体积，ml；
c为硫氰酸铵滴定液浓度，mol／L；
58．45为氯化钠的相对分子质量。
【附注】 (1)硫氰酸铵滴定液(0．1mol／L)的制备及滴定取硫氰酸铵8．0g，加
水溶解并稀释成1000ml，摇匀。精密量取硝酸银滴定液(O．1mol／L)25ml，加水
50ml、硝酸2ml与8％硫酸铁铵指示液2ml，用本液滴定至溶液微显淡棕红色；经
剧烈振摇后仍不退色，即为终点。根据本液的消耗量算出本液的浓度。
(2)硫氰酸铵滴定液(O．05mol／L)制备 精密量取硫氰酸铵滴定液(O．1mol／L)
100ml，加水准确稀释至200ml，摇匀。
页码数,2005版药典附录第43页
附录ⅧD免疫电泳法
本法系将供试品通过电泳分离成区带的各抗原，然后与相应的抗体进行双
相免疫扩散，当两者比例合适时形成可见的沉淀弧。将沉淀弧与已知标准抗
原、抗体生成的沉淀弧的位置和形状进行比较，即可分析供试品中成分及其
性质。
试剂 (1)巴比妥缓冲液(pH8．6) 取巴比妥4．14g与巴比妥钠23．18g，加适量
水，加热使溶解，冷却至室温，再加叠氮钠0．15g，加水使溶解成1500ml。
(2)O．5％氨基黑染液取氨基黑10B 0．5 g，加甲醇50ml、冰醋酸10ml与水40 ml的
混合液，溶解。
(3)1．5％琼脂糖溶液 取琼脂糖1．5g，加水50ml与巴比妥缓冲液50ml，加热使
溶胀完全。
(4)脱色液量取乙醇45ml、冰醋酸5ml与水50ml混合均匀。
(5)溴酚蓝指示液 取溴酚蓝50mg，加水使溶解成100ml。
对照品正常人血清或其他适宜的对照品。
供试品溶液的制备用生理氯化钠溶液将供试品蛋白质浓度稀释成0．5％。
检查法将1．5％琼脂糖溶液倾倒于大小适宜的水平玻板上，厚度约3mm，静
置，待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层后，于琼脂板负极1／3处的上下各打一
孔，孔径3mm，孔距10～15mm。测定孔加供试品溶液10μl和溴酚蓝指示液1滴，对
照孔加正常人血清10μl和溴酚蓝指示液1滴。用3层滤纸搭桥和巴比妥缓冲液(电
泳缓冲液)接触，100V恒压电泳约2小时(指示剂迁移到前沿)。电泳结束后，在两
孔之间距离两端约3～5mm处挖宽3mm槽，向槽中加入血清抗体，槽满但不溢出。
放湿盒中37℃扩散24小时。扩散完毕后，用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂板，
以除去未结合蛋白质。将浸泡好的琼脂板放入0．5％氨基黑溶液染色，再用脱
色液脱色至背景基本无色。用适当方法保存或复制图谱。与对照品比较，供试
品的主要沉淀线应为待测蛋白质。
注意事项 (1)电泳时应有冷却系统，否则琼脂糖会出现干裂。
(2)用生理氯化钠溶液浸泡应充分，否则背景不清晰。
页码数,2005版药典附录第43页
附录ⅧC免疫双扩散法
本法系在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别加入抗原
与抗体，若抗原、抗体互相对应，浓度、比例适当，则一定时间后，在抗原
与抗体孔之间形成免疫复合物的沉淀线，以此对供试品的特异性进行检查。
供试品溶液的制备用生理氯化钠溶液将供试品的蛋白质浓度稀释至适当浓
度。
试剂 (1)O．5％氨基黑染色剂 取氨基黑10B0．5g，加甲醇50ml、冰醋酸10ml与
水40ml的混合液，溶解，即得。
(2)脱色液量取乙醇45 ml、冰醋酸5 ml与水50ml混合均匀，即得。
检查法将完全溶胀的1．5％琼脂糖溶液倾倒于水平玻板上(每平方厘米加
0．19ml琼脂糖)，凝固后，按下图打孔，直径3mm，孔距3mm(方阵型)。根据需要
确定方阵型图数量。中央孔加入抗血清，周边孔加入供试品溶液，并留1孔加
入相应阳性对照血清。每孔加样20μ1。然后置水平湿盒中，37℃水平扩散24小
时。用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂板，以除去未结合蛋白质。将浸泡好的
琼脂板放入O．5％氨基黑溶液中染色。用脱色液脱色至背景无色，沉淀线呈清
晰蓝色为止。用适当方法保存或复制图谱。
O
O O O
O
图方阵型
结果判定各阳性对照出现相应的沉淀线则试验成立，供试品与人血清(血浆)
抗体之间应出现相应沉淀线，表示两者为同源性。
页码数,2005版药典附录第42页
附录ⅧA免疫印迹法
本法系以供试品与特异性抗体结合后，抗体与酶标抗体特异性结合，通过
酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。
试剂 (1)TG缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷15．12g与甘氨酸72g，加水溶解并稀
释至500ml。4℃保存。
(2)EBM缓冲液取TG缓冲液20ml与甲醇40ml，加水稀释至200ml。4℃保存。
(3)TTBS缓冲液取三羟甲基氨基甲烷6．05g与氯化钠4．5g，取聚山梨酯80
0．55ml，加适量水溶解，用盐酸调pH至7．5，加水稀释至500ml。4℃保存。
(4)底物缓冲液 取3，3’一二氨基联苯胺盐酸盐15mg，加甲醇5ml与30％过氧化
氢15μl，加TTBS缓冲液25ml使溶解，即得。临用现配。
检查法 照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(附录ⅣC)，供试品与阳性对照品上样
量应大于100ng。取出凝胶，切去凝胶边缘，浸于EBM缓冲液中30分钟。另取与
凝胶同样大小的厚滤纸6张、硝酸纤维素膜1张，用EBM缓冲液浸透。用半干胶
转移仪进行转移：在电极板上依次放上湿滤纸3张、硝酸纤维素膜1张、电泳凝
胶、湿滤纸3张，盖上电极板，按O．8mA／cm2硝酸纤维素膜恒电流转移45分钟。
取出硝酸纤维素膜浸入封闭液(10％小牛血清的TT—KS缓冲液，或其他适宜
封闭液)封闭60分钟。弃去液体。加入TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的供试品
抗体(参考抗体使用说明书的稀释度稀释)，室温过夜。硝酸纤维素膜用TTBS缓
冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟。弃去液体，再加入TTBS缓
冲液10ml，摇动加入适量的生物素标记的第二抗体，室温放置40分钟。硝酸纤维
素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟。弃去液体，
更换TTBS缓冲液10ml，摇动，加入适量的亲和素溶液和生物素标记的辣根过氧
化物酶溶液，室温放置60分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS
缓冲液浸洗4次，每次8分钟。弃去液体，加入适量底物缓冲液，置于室温避光
条件下显色，显色程度适当时水洗终止反应。
结果判定 阳性结果应呈现明显色带。阴性结果不显色。
书页号：2005版药典三部附录97页
附录ⅩⅤ 灭菌法
灭菌法系指用适当的物理或化学手段将物品中活的微生物杀灭或除去的方
法。本法适用于制剂、原料、辅料及医疗器械等物品的灭菌。
无菌物品是指物品中不含任何活的微生物。对于任何一批灭菌产品来说，
绝对无菌既无法保证也无法用试验来证实。实际生产过程中，灭菌是指将物品
中污染的微生物残存概率下降至一定水平，以无菌保证水平SAL(sterility assurance
level)表示。最终灭菌的产品微生物存活概率不得高于10〈-6〉。已灭菌产品达到
的无菌保证水平可通过验证确定。
灭菌产品的无菌保证不能依赖于最终产品的无菌检验，而是取决于生产过
程中采用合格的灭菌工艺、严格的GMP管理和良好的无菌保证体系。灭菌工艺的
确定应综合考虑被灭菌物品的性质、灭菌方法的有效性和经济性、灭菌后物品
的完整性等因素。
灭菌程序的验证是无菌保证的必要条件。灭菌程序经验证后，方可交付正
式使用。验证内容包括：
(1) 撰写验证方案及制定评估标准。
(2) 确认灭菌设备技术资料齐全、安装正确，并能处于正常运行(安装确认)。
(3) 确认关键控制设备和仪表能在规定的参数范围内正常运行(运行确认)。
(4) 采用被灭菌物品或模拟物品进行重复试验，确认灭菌效果符合规定(性能
确认)。
(5) 汇总并完善各种文件和记录，撰写验证报告。
日常生产中，应对灭菌程序的运行情况进行监控，确认关键参数(如温度、
压力、时间、湿度、灭菌气体浓度及吸收的辐照剂量等)均在验证确定的范围
内。灭菌程序应定期进行再验证。当灭菌设备或程序发生变更(包括灭菌物品装
载方式和数量的改变)时，应进行再验证。
产品的无菌保证与灭菌前产品被污染的程度及污染菌的特性相关。因此，
应严格监控被灭菌品灭菌前的微生物污染水平及污染菌的耐受性，并在生产的
各个环节采取各种措施降低污染，确保微生物污染控制在规定的限度内。
灭菌冷却阶段，应采取措施，防止已灭菌物品被再次污染。任何情况下，
都应要求容器及其密封系统确保产品在有效期内符合无菌要求。
灭菌方法
常用的灭菌方法有湿热灭菌法、干热灭菌法、辐射灭菌法、气体灭菌法和
过滤除菌法。可根据被灭菌物品的特性采用一种或多种方法组合灭菌。只要产
品允许，应尽可能选用最终灭菌法灭菌。若产品不适合采用最终灭菌法，可选
用过滤除菌法或无菌生产工艺达到无菌保证要求，只要可能，应对非最终灭菌
的产品作补充性灭菌处理(如流通蒸汽灭菌)。
一、湿热灭菌法
本法系指将物品置于灭菌柜内利用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微
生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。该法灭菌能力强，
为热力灭菌中最有效、应用最广泛的灭菌方法。药品、容器、培养基、无菌衣、
胶塞以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损坏的物品，均可采用本法灭菌。流
通蒸汽不能完全杀灭细菌孢子，一般可作为不耐热无菌产品的辅助灭菌手段。
湿热灭菌条件通常采用121℃×15min、121℃×30min或116℃×40min的程序，也可采
用其他温度和时间参数，但必须保证物品灭菌后的SAL≤10〈-6〉。对热稳定的物
品，可采用过度杀灭法，其SAL应≤10〈-12〉。热稳定性较差产品的标准灭菌时间
F〈〔0〕〉[指灭菌温度为121.1℃，生物指示菌的耐热参数D值为1分，灭菌温度系
数z值为10.0℃时的标准灭菌时间(121.1℃下计算的微生物等效灭活率)]一般不低于
8min。如产品的热稳定性很差时，可允许湿热灭菌的F〈〔0〕〉低于8，此情况
下，应在生产全过程中，对产品中污染的微生物严加监控，并采取各种措施降
低微生物污染水平，确保被灭菌产品达到无菌保证要求。
采用湿热灭菌时，被灭菌物品应有适当的装载方式，不能排列过密，以保
证灭菌的有效性和均一性。
湿热灭菌法应确认灭菌柜在不同装载时可能存在的冷点。当用生物指示剂
进一步确认灭菌效果时，应将其置于冷点处。本法常用的生物指示剂为嗜热脂
肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus)。
二、干热灭菌法
本法系指将物品置于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中，利用干热空气达
到杀灭微生物或消除热原物质的方法。适用于耐高温但不宜用湿热灭菌法灭菌
的物品灭菌，如玻璃器具、金属材质容器、纤维制品、固体试药、液状石蜡等
均可采用本法灭菌。
干热灭菌条件一般为160～170℃×120min以上、170～180℃×60min以上或250℃×
45min以上，也可采用其他温度和时间参数。应保证物品灭菌后的SAL≤10〈-6〉。
干热过度杀灭后物品的SAL应≤10〈-12〉，此时物品一般无需进行灭菌前污染微生
物的测定。250℃×45min的干热灭菌也可除去无菌产品包装容器及有关生产灌装用
具中的热原物质。
采用干热灭菌时，被灭菌物品应有适当的装载方式，不能排列过密，以保
证灭菌的有效性和均一性。
干热灭菌法应确认灭菌柜中的温度分布符合设定的标准及确定最冷点位置
等。常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus Subtilis)。细菌内毒素
灭活验证试验是证明除热原过程有效性的试验。一般将不小于1000单位的细菌内
毒素加入待去热原的物品中，证明该去热原工艺能使内毒素至少下降3个对数单
位。细菌内毒素灭活验证试验所用的细菌内毒素一般为大肠埃希菌内毒素
(Escherichia coli endoxin)。
三、辐射灭菌法
本法系指将灭菌物品置于适宜放射源辐射的γ射线或适宜的电子加速器发生
的电子束中进行电离辐射而达到杀灭微生物的方法。本法最常用的为〈60〉Co-γ
射线辐射灭菌。医疗器械、容器、生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成
品等均可用本法灭菌。
采用辐射灭菌法灭菌后的产品其SAL应≤10〈-6〉。γ射线辐射灭菌所控制的参
数主要是辐射剂量(指灭菌物品的吸收剂量)。该剂量的制定应考虑灭菌物品的适
应性及可能污染的微生物最大数量及最强抗辐射力，事先应验证所使用的剂量
不影响被灭菌物品的安全性、有效性及稳定性。常用的辐射灭菌吸收剂量为
25kGy。对最终产品、原料药、某些医疗器材应尽可能采用低辐射剂量灭菌。灭
菌前，应对被灭菌物品微生物污染的数量和抗辐射强度进行测定，以评价灭菌
过程赋予该灭菌物品的无菌保证水平。
灭菌时，应采用适当的化学或物理方法对灭菌物品吸收的辐射剂量进行监
控，以充分证实灭菌物品吸收的剂量是在规定的限度内。如采用与灭菌物品一
起被辐射的放射性剂量计，剂量计要置于规定的部位。在初安装时剂量计应用
标准源进行校正，并定期进行再校正。
〈60〉Co-γ射线辐射灭菌法常用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子(Spores of
Bacillus pumilus)。
四、气体灭菌法
本法系指用化学消毒剂形成的气体杀灭微生物的方法。常用的化学消毒剂
有环氧乙烷、气态过氧化氢、甲醛、臭氧(O3)等，本法适用于在气体中稳定的物
品灭菌。采用气体灭菌法时，应注意灭菌气体的可燃可爆性、致畸性和残留毒
性。
本法中最常用的气体是环氧乙烷，一般与80%～90%的惰性气体混合使用，
在充有灭菌气体的高压腔室内进行。该法可用于医疗器械，塑料制品等不能采
用高温灭菌的物品灭菌。含氯的物品及能吸附环氧乙烷的物品则不宜使用本法
灭菌。
采用环氧乙烷灭菌时，灭菌柜内的温度、湿度、灭菌气体浓度、灭菌时间
是影响灭菌效果的重要因数。可采用下列灭菌条件：
温度 (54±10)℃
相对湿度 (60±10)%
灭菌压力 8×10〈5〉Pa
灭菌时间 90min
灭菌条件应予验证。灭菌时，将灭菌腔室先抽成真空，然后通人蒸汽使腔
室内达到设定的温湿度平衡的额定值，再通入经过滤和预热的环氧乙烷气体。
灭菌过程中，应严密监控腔室的温度、湿度、压力、环氧乙烷浓度及灭菌时间。
必要时使用生物指示剂监控灭菌效果。本法灭菌程序的控制具有一定难度，整
个灭菌过程应在技术熟练人员的监督下进行。灭菌后，应采取新鲜空气置换，
使残留环氧乙烷和其他易挥发性残留物消散。并对灭菌物品中的环氧乙烷残留
物和反应产物进行监控，以证明其不超过规定的限度，避免产生毒性。
采用环氧乙烷灭菌时，应进行泄漏试验，以确认灭菌腔室的密闭性。灭菌
程序确认时，还应考虑物品包装材料和灭菌腔室中物品的排列方式对灭菌气体
的扩散和渗透的影响。生物指示剂一般采用枯草芽孢杆菌孢子(Spores ofBacillus
subtilis)。
五、过滤除菌法
本法系利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理以除去气体或液体中微生物
的方法。常用于热不稳定的药品溶液或原料的除菌。
除菌过滤器采用孔径分布均匀的微孔滤膜作过滤材料，微孔滤膜分亲水性
和疏水性两种。滤膜材质依过滤物品的性质及过滤目的而定。药品生产中采用
的除菌滤膜孔径一般不超过0.22μm。过滤器不得对被滤过成分有吸附作用，也不
能释放物质，不得有纤维脱落，禁用含石棉的过滤器。滤器和滤膜在使用前应
进行洁净处理，并用高压蒸汽进行灭菌或作在线灭菌。更换品种和批次应先清
洗滤器，再更换滤膜。
过滤过程中无菌保证与过滤液体的初始生物负荷及过滤器的对数下降值
LRV(log reduction value)有关。LRV系指规定条件下，被过滤液体过滤前的微生物数
量与过滤后的微生物数量比的常用对数值。即：
LRV=lgN〈0〉－lgN
式中 N〈0〉为产品除菌前的微生物数量；
N为产品除菌后的微生物数量。
LRV用于表示过滤器的过滤除菌效率，对孔径为0.22μm的过滤器而言，要求
每1cm〈2〉有效过滤面积的LRV应不小于7。因此过滤除菌时，被过滤产品总的污
染量应控制在规定的限度内。为保证过滤除菌效果，可使用两个过滤器串连过
滤，或在灌装前用过滤器进行再次过滤。
在过滤除菌中，一般无法对全过程中过滤器的关键参数(滤膜孔径的大小及
分布，滤膜的完整性及LRV)进行监控。因此，在每一次过滤除菌前后均应作滤器
的完整性试验，即气泡点试验或压力维持试验或气体扩散流量试验，确认滤膜
在除菌过滤过程中的有效性和完整性。除菌过滤器的使用时间应进行验证，一
般不应超过一个工作日，否则应进行验证。
过滤除菌法常用的生物指示剂为缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta)。
通过过滤除菌法达到无菌的产品应严密监控其生产环境的洁净度，建议在
无菌环境下进行过滤操作。相关的设备、包装容器、塞子及其他物品应采用适
当的方法进行灭菌，并防止再污染。
六、无菌生产工艺
无菌生产工艺系指必须在无菌控制条件下生产无菌制剂的方法，无菌分装
及无菌冻干是最常见的无菌生产工艺。后者在工艺过程中须采用过滤除菌法。
无菌生产工艺应严密监控其生产环境的洁净度，并应在无菌控制的环境下
进行过滤操作。相关的设备、包装容器、塞子及其他物品应采用适当的方法进
行灭菌，并防止被再次污染。
无菌生产工艺过程的无菌保证应通过培养基无菌灌装模拟试验验证。在生
产过程中，应严密监控生产环境的无菌空气质量、操作人员的素质、各物品的
无菌性。
无菌生产工艺应定期进行验证，包括对环境空气过滤系统有效性验证及培
养基模拟灌装试验。
生物指示剂
生物指示剂系一类特殊的活微生物制品，可用于确认灭菌设备的性能、灭
菌程序的验证、生产过程灭菌效果的监控等。用于灭菌验证中的生物指示剂一
般是细菌的孢子。
1．制备生物指示剂用微生物的基本要求
不同的灭菌方法使用不同的生物指示剂，制备生物指示剂所选用的微生物
必须具备以下特性：
(1) 菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能污染菌的耐受性。
(2) 菌种应无致病性。
(3) 菌株应稳定。存活期长，易于保存。
(4) 易于培养。若使用休眠孢子，生物指示剂中休眠孢子含量要在90%以上。
2．生物指示剂的制备
生物指示剂的制备应按一定的程序进行，制备前，需先确定所用微生物的
特性，如D值(微生物的耐热参数，系指一定温度下，将微生物杀灭90%所需的时
间，以分表示)等。菌株应用适宜的培养基进行培养。培养物应制成悬浮液，其
中孢子的数量应占优势，孢子应悬浮于无营养的液体中保存。
生物指示剂中包含一定数量的一种或多种孢子，可制成多种形式。通常是
将一定数量的孢子附着在惰性的载体上，如滤纸条、玻片、不锈钢、塑料制品
等；孢子悬浮液也可密封于安瓿中；有的生物指示剂还配有培养基系统。生物
指示剂应选用合适的材料包装，并设定有效期。载体和包装材料在保护生物指
示剂不致污染的同时，还应保证灭菌剂穿透并能与生物指示剂充分接触。载体
和包装的设计原则是便于贮存、运输、取样、转移接种。
有些生物指示剂可直接将孢子接种至液体灭菌物或具有与其相似的物理和
化学特性的替代品中。使用替代品时，应用数据证明二者的等效性。
3．生物指示剂的应用
在灭菌程序的验证中，尽管可通过灭菌过程某些参数的监控来评估灭菌效
果，但生物指示剂的被杀灭程度，则是评价一个灭菌程序有效性最直观的指标。
可使用市售的标准生物指示剂，也可使用由日常生产污染菌监控中分离的耐受
性最强的微生物制备的孢子。在生物指示剂验证试验中，需确定孢子在实际灭
菌条件下的耐受性，并测定孢子的纯度和数量。验证时，生物指示剂的微生物
用量应比日常检出的微生物污染量大，耐受性强，以保证灭菌程序有更大的安
全性。在最终灭菌法中，生物指示剂应放在灭菌柜的不同部位。并避免指示剂
直接接触到被灭菌物品。生物指示剂按设定的条件灭菌后取出，分别置培养基
中培养，确定生物指示剂中的孢子是否被完全杀灭。
过度杀灭产品灭菌验证一般不考虑微生物污染水平，可采用市售的生物指
示剂。对灭菌手段耐受性差的产品，设计灭菌程序时，根据经验预计在该生产
工艺中产品微生物污染的水平，选择生物指示剂的菌种和孢子数量。这类产品
的无菌保证应通过监控每批灭菌前的微生物污染的数量、耐受性和灭菌程序验
证所获得的数据进行评估。
4．常用生物指示剂
(1) 湿热灭菌法 湿热灭菌法最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子
(Spores of Bacillus stearother-mophilus，如NCTC 10007、NCIMB 8157、ATCC 7953)。D值为
1.5～3.0min，每片(或每瓶)活孢子数5×10〈5〉～5×10〈6〉个，在121℃、19min下应
被完全杀灭。此外，还可使用生孢梭菌孢子(Spores of Clostridium sporogenes，如
NCTC 8594、NCIMB 8053、ATCC 7955)，D值为0.4～0.8min。
(2) 干热灭菌法 干热灭菌法最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子(Spores
of Bacillus subtilis，如NCI-MB 8058、ATCC 9372)。D值大于1.5min，每片活孢子数
5×10〈5〉～5×10〈6〉个。去热原验证时使用大肠埃希菌内毒素(Escherichia coli
endoxin)，加量不小于1000细菌内毒素单位。
(3) 辐射灭菌法 辐射灭菌法最常用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子(Spores
of Bacillus pumilus，如NCTC 10327、NCIMB 10692、ATCC 27142)。每片活孢子数10〈7〉
～10〈8〉，置于放射剂量25kGy条件下，D值约3kGy。但应注意灭菌产品中所负载
的微生物可能比短小芽孢杆菌孢子显示更强的抗辐射力。因此短小芽孢杆菌孢
子可用于监控灭菌过程，但不能用于灭菌辐射剂量建立的依据。
(4) 气体灭菌法 环氧乙烷灭菌最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子
(Spores of Bacillus subtilis，如NCTC 10073、ATCC 9372)。气态过氧化氢灭菌最常用的生
物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillusstearothermophilus，如NCTC 10007、
NCIMB 8157、ATCC 7953)。每片活孢子数1×10〈6〉～5x10〈6〉个。环氧乙烷灭菌中，
枯草芽孢杆菌孢子D值大于2.5min，在环氧乙烷浓度为600mg/L，相对湿度为60%，
温度为54℃下灭菌，60min应被杀灭。
(5) 过滤除菌法 过滤除菌法最常用的生物指示剂为缺陷假单胞菌(Pseudomonas
diminuta，如ATCC 19146)，用于滤膜孔径为0.22μm的滤器；黏质沙雷菌(Serratin
marcescens)(ATCC 14756)用于滤膜孔径为0.45μm的滤器。
页码数,2005版药典附录第41页
附录ⅦJ钠离子测定法
本法系用火焰光度法测定供试品中钠离子含量。
测定法精密量取供试品0．5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，即为供试
品溶液。按火焰光度法(附录ⅡD)测定，在589nm波长处测定供试品溶液的发光
强度。另精密称取于110℃干燥至恒重的氯化钠0．293g，置100ml量瓶中，用水稀
释至刻度，再精密量取该溶液O．9ml、1．1ml、1．3ml、1．5ml、1．7ml，分别置
50ml量瓶中，用水稀释至刻度，制成0．9mmol／L、1．1mmol／L、1．3mmol／L、
1．5mmol／L、1．7mmol／L的系列标准钠溶液，同法操作。
用系列标准钠溶液的浓度对其相应的发光强度作直线回归处理，将供试品
溶液发光强度代人回归方程，求得供试品溶液钠离子浓度为(mmol／L)，再乘以
供试品的稀释倍数(100)，计算出供试品钠离子含量(mmol／L)。
页码数,2005版药典附录第53页
附录ⅨM逆转录酶活性检查法
本法系以雀麦草花叶病毒RNA为模板，采用RT-PCR法扩增特定片段并用
ELISA法检测特异片段与探针的杂交信号，从而测定供试品中逆转录酶活性。
试剂 (1)供试品稀释液(A液) 每1L A液含三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris—HCl，
pH7．5)25mmol、氯化钾50mmol、二硫苏糖醇(DTT)5mmol、四甲基乙二胺(EDTA)
O．25tmmol、TritonX-100 25ml、甘油500ml。
(2)供试品保存液(B液) 每1L A液中含亮抑蛋白酶肽lmg、抑胃肽0．7mg及抑蛋
白酶肽lmg。
(3)引物及探针序列
上游引物：5’Biotin-CGTGGTTGACACGCAGAC -CTCTTAC-3※
下游引物：5’一TCAACACTGTACGGCACCCGCAT-TC-3’
探针：5※_NH2 ATTATCT~GAGAGTTAC-TC※UFFG-3’
(4)模板雀麦草花叶病毒RNA(BMV RNA)。
(5)反转录缓冲液每1L反转录缓冲液含Tris-HCl(pH8．3)50mmol、氯化钾40mmol、
氯化镁6mmol、DTT lOmmol、脱氧核糖核苷酸200mmol、下游引物O．8×10 3mmol。
(6)扩增缓冲液 每1L扩增缓冲液含Tris-HCl (pH8．8)25mmol、氯化钾40mmol、氯化
镁2mmol、脱氧腺嘌呤核糖核苷酸200μmol、脱氧胞嘧啶核糖核苷酸200μmol、脱
氧鸟嘌呤核糖核苷酸200μmol及脱氧尿嘧啶核糖核苷酸200μmol，上、下游引物
各O．4×10-3mmol，核糖核酸酶A O．8g，Taq DNA聚合酶6×104U，尿嘧啶N-糖基化
酶(LING)4×10 4u。
(7)封闭液3％牛血清白蛋白或0．5％酪蛋白溶液。
(8)变性缓冲液 0．2mol／L氢氧化钠，5mmol／L EDTA溶液。,
(9)包被液O．05mol／L磷酸氢二钠溶液(pH8．5)。
供试品、阳性对照及灵敏度对照的制备 (1)取供试品200μ1，每分钟5000转
离心5分钟，取上清液100μ1，加入B液100μl和用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的5％
Triton X-100 2μL，混匀后，置冰浴15分钟后，置一70％保存备用。
(2)阳性对照 用SP2／O细胞培养上清液作阳性对照，同上处理后，按单次
使用量分装，一70℃保存备用。
(3)灵敏度对照 取鼠源白血病病毒逆转录酶(MMLV)适量，用A液系列稀释至
10-8 U／μl，充分混匀，按单次使用量分装，一70℃保存备用。
检查法
(1)反转录将已处理的供试品及阳性对照用A液10倍稀释。
反转录反应管中加入反转录缓冲液20．8ul、500mg／LBMV-RNA O．2ul，混匀
后，标记，70％放置10分钟，置冰浴。
在相应的反转录反应管中分别加入4μl已稀释的供试品、阳性对照及灵敏
度对照，以A液作阴性对照。反转录反应体系为25μL。37℃反应90分钟。
(2)PCR扩增取反转录产物5ul加至PCR扩增缓冲液20μl中，PCR扩增反应体系
为25μl。混匀后，按下列条件进行扩增：37℃ 30分钟，预变性94℃ 5分钟，94℃
45秒，56℃ 45秒，72％45秒，进行35个循环，72℃延伸5分钟。
(3)杂交检测用经包被液适当稀释的探针100μl包 附录ⅨN人凝血酶活性检查
法被DNA结合板，4℃过夜；次日，用封闭液200bd 37℃封闭60分钟，用洗涤液洗
涤3次，备用；扩增结束后，每个反应管中加入变性液25μ1，混匀；在封闭洗
涤后的包被板上每孔加入供试品25μA，再加入杂交液100μ1，混匀后，37℃反
应60分钟，用洗涤液洗涤5次；每孔中加入链亲和素标记的辣根过氧化物酶
100μl，37℃反应30分钟；用洗涤液洗涤5次；每孔加入显色液100μl，37℃显色
10分钟；每孔加入终止液100μl终止反应。用酶标仪以630nm 为参比波长，在波
长492nm处测定吸光度。
结果判定Cutoff值为阴性对照的吸光度加0．2。
阴性对照吸光度应不高于0．2，如小于0．05按0．05计。
阳性对照应为阳性，其吸光度应不低于1．5。
灵敏度对照应为阳性，其吸光度应不低于o．8。
供试品吸光度大于Cutoff值者为阳性。
注意事项 (1)如供试品为培养细胞，则将细胞传代后，培养3～4天长成单层，
取上清液检测，取供试品前不得换液。
(2)试验中所有试剂及吸头均需灭菌。与RNA操作有关的试剂及材料均需经过
焦碳酸二乙酯(DEPC)处理。
(3)加供试品区、扩增区及PCR产物检测区及其所用加样枪及服装应严格区分。
(4)定期对各区进行消毒，PCR产物及其加供试品吸头应及时进行有效处理。
书页号：2005版药典三部附录11页
附录I M 凝胶剂
凝胶剂 系指以生物制品原液或经干燥后制成的干粉为原料药物，与能形成
凝胶的辅料制成均,混悬或乳液型的稠厚液体或半固体制剂。除另有规定
外，凝胶剂限局部用于皮肤及体腔如鼻腔、阴道和直肠。乳液型凝胶剂又
称为乳胶剂。小分子无机药物(如氢氧化铝)凝胶剂是由分散的药物胶体小粒子
以网状结构存在于液体中，属两相分散系统，也称}昆悬型凝胶剂。混悬型凝
胶剂具有触变性，静止时形成半固体而搅拌或振摇时成为液体。
凝胶剂基质属单相分散系统，有水性与油性之分。水性凝胶基质一般由水、
甘油或内二醇与纤维素衍生物、卡波姆和海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、淀粉
等构成；油性凝胶剂基质由液状石蜡与聚氧乙烯或脂肪油与胶体硅或铝皂、
锌皂构成。
凝胶剂在生产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产和质量控制应符合相关品种
要求。
二、混悬型凝胶剂中胶粒应分散均匀，不应下沉、结块。
三、凝胶剂应均匀、细腻，在常温时保持胶状，不干涸或液化。
四、凝胶剂必要时可加人保湿剂、防腐剂、抗氧剂、乳化剂、增稠剂和透
皮促进剂等。
五、凝胶剂基质不应与药物发生理化作用。
六、混悬型凝胶剂在标签上注明“用前摇匀”。
七、凝胶剂用于严重损伤的皮肤、鼻腔和阴道内应无菌。
八、凝胶剂所用内包装材料不应与药物或基质发生理化作用。
九、除另有规定外，凝胶剂应置密闭容器中，于2～8℃避光贮存和运输，
并应防止冻结。
凝胶剂应进行以下相应检查。
【粒度】 除另有规定外，混悬型凝胶剂取适量的供试品，涂成薄层，薄层
面积相当于盖玻片面积，共涂3片，照粒度测定法(附录V G第一法)检查，均不得
检出大于180μm的粒子。
【装量】 照最低装量检查法(附录V F)检查，应符合规定。
【微生物限度】 照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符合规定。
凡规定进行无菌检查的凝胶剂，可不进行微生物限度检查。
【无菌】 有无菌要求的凝胶剂照无菌检查法(附录ⅫA)检查，应符合规定。
书页号：2005版药典三部附录9页
附录I H喷雾剂
喷雾剂 是以一种或一种以上生物制品原液为原料药物，加入适宜稳定剂或
辅料后，填充于特制的装置中制成的液体制剂。使用时借用手动泵的压力、
高压气体、超声振动或其他方法将内容物呈雾状物释出。用于直接喷至皮肤
的制剂，也称外用喷雾剂。按给药定量与否，喷雾剂可分为定量喷雾剂和非
定量喷雾剂。
喷雾剂在生产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液半成品和成品的生产和质量控制应符合相关品种要求。
二、喷雾剂制备应控制温度，制备完成后应立即置于规定的温度下贮存，减
少温度对药物的活性成分的影响。
三、喷雾剂配制时，根据需要可加入溶剂、助溶剂、抗氧剂、表面活性剂或
其他附加剂，所有附加剂均应对皮肤无刺激性。
四、溶液型喷雾剂药液应澄清；乳液型喷雾剂液滴在液体介质中应分散均匀；
混悬型喷雾剂应将药物和附加剂充分混匀制成稳定的混悬剂。
五、喷雾剂装置中各组成部件均应采用无毒、无刺激性、性质稳定、与药物
不起作用的材料制备。
除另有规定外，喷雾剂应置2～8℃避光保存和运输。
喷雾剂应进行以下相应检查。
【每瓶总喷次】 多剂量喷雾剂按下述方法检查，每瓶总喷次应符合规定。
检查法 取供试品4瓶，分别除去帽盖，精密称重(W1)，充分振摇，在通风橱
内按使用说明书操作，向已加入适量吸收液的容器内喷射最初10喷，用溶剂洗
净套口，充分干燥后，精密称重(W2)；振摇后向上述容器内连续喷射10次，用
溶剂洗净套口，充分干燥后，精密称重(W3)；打开储液罐，弃去药液，用溶剂
洗净供试品容器，干燥后，精密称重(W4)，按下式计算每瓶总喷次，均应不少
于每瓶标示总喷次。
总喷次=10×(W1一W4)/(W2一W3)
【每喷喷量】 除另有规定外，定量喷雾剂照下述方法检查，每喷喷量应符
合规定。
检查法取供试品4瓶，按使用说明书操作，分别试喷数次后，擦净，精密称
定，再连续喷射3次，每次喷射后均擦净，精密称定，计算每次喷量，连续喷
射10次，擦净，精密称定，再按上述方法测定3次喷量，再连续喷射10次后，
按上述方法再测定4次喷量，计算每瓶10次喷量的平均值。除另有规定外，均
应为标示喷量的80％～120％。
凡规定测定每喷主药含量的喷雾剂，不再进行每喷喷量的测定。
【每喷主药含量】 除另有规定外，定量喷雾剂照下述方法检查，每喷主药
含量应符合规定。
检查法取供试品1瓶，照使用说明书操作，试喷5次，用溶剂洗净喷口，充分
干燥后，喷射10次或20次(注意喷射每次间隔5秒并缓缓振摇)，收集于一定量的
吸收溶剂中，转移至适宜量瓶中并稀释至刻度，摇匀，测定。所得结果除以10
或20，即为平均每喷主药含量，每喷主药含量应为标示含量的80％～120％。
【装量差异】 除另有规定外，单剂量喷雾剂装量差异应符合规定。
检查法除另有规定外，取供试品20个，照各品种项下规定的方法，求出每
个内容物装量与平均装量。每个装量与平均装量相比较，超出装量差异限度
的不得多于2个，并不得有1个超出限度1倍。
【装量】 多剂量喷雾剂照最低装量检查法(附录VF)检查，应符合规定。
【微生物限度】 除另有规定外，照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符
合规定。
凡规定进行无菌检查的喷雾剂可不进行微生物限度检查。
【无菌】 用于烧伤、严重损伤或溃疡的喷雾剂照无菌检查法(附录ⅫA)检
查，应符合规定。
书页号：2005版药典三部附录7页
附录I E 片剂
片剂系指以生物制品原液经干燥后制成的干粉为原料药物，与适宜的辅料
混匀压制而成的圆片状或异形片状的固体制剂；该原料药物可由一种或多种
活性成分组成。
片剂以口服普通片为主，另有泡腾片、肠溶片等。
普通片 系指原料药物与适宜辅料混匀压制成的普通片剂，非包衣的片剂多
为此类片剂，重量一般为0．1～0.5g。
泡腾片 系指含有碳酸氢钠和有机酸、遇水可产生气体而呈泡腾状的片剂。
泡腾片中的药物一般应是易溶性的，加水产生气泡后应能溶解。有机酸一
般用枸橼酸、酒石酸、富马酸等。
肠溶片 系指用肠溶性包衣材料进行包衣的片剂。
为防止药物在胃内分解失效、避免对胃的刺激或控制药物在肠道内定位释
放，可对片剂包肠溶衣；为治疗结肠部位疾病，可对片剂包结肠定位肠溶衣。
片剂在牛产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的牛产及质量控制应符合相关品种
要求。
二、原料药与辅料应混合均匀，药物含量应准确。含药量小的片剂，应采用
适宜方法使药物分散均匀。
三、凡属挥发性或对光、热不稳定的药物，在制片过程中应避光、避热，以
避免成分损失或失效。
四、压片前的半成品应按相关品种要求控制水分。根据需要可加入矫味剂、
芳香剂和着色剂。
五、为增加药物稳定性、掩盖药物小良臭味、改善片剂外观等，可对片剂进
行包薄膜衣。
六、片剂外观应完整光洁，色泽均匀。有适宜的硬度和耐摩擦性。除另有规
定外，对于非包衣片，应符合片剂脆碎度检查法的要求，防止包装贮运过程中
发生磨损或破碎。
七、除另有规定外，片剂应置2～8℃或适宦湿度下密封贮存和运输。
片剂应进行以下相应检查。
【重量差异】 片剂重量差异的限度，应符合规定。
检查法取供试品20片，精密称定总重量。求得平均片重后，再分别精密称定
每片的重量，每片莺量与平均片重相比较(凡尢含量测定的片剂，每片重量应
与标示片重相比较)，超出限度的药片不得多于 2片，并不得有1片超出限度1倍。
薄膜衣片应在包薄膜衣后检查重量差异，并符合规定。
【崩解时限】 除另有规定外，照崩解时限检查法(附录V C)检查。应符合规
定。
凡规定检查溶出度、释放度或融变时限的片剂，不再进行崩解时限检查。
【微生物限度】 除另有规定外，照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符
合规定。
凡规定进行杂菌检查的片剂，可不进行微生物限度
页码数,2005版药典附录第68页
附录Ⅺ F 破伤风抗毒素效价测定法(小鼠试验法)
本法系根据抗毒素能中和毒素的作用，将供试品与标准品进行对比试验，
推算出每lml供试品中所含抗毒素的国际单位数(IU／m1)。
试剂 硼酸盐缓冲盐水 称取氯化钠8·5g、硼酸4·5g、四硼酸钠
(Na2 B4 07·10H20)O．5g，加水至1000ml，过滤，灭菌后pH值为7．0～7．2。
标准品溶液的制备(1)破伤风抗毒素标准品的稀释抗毒素标准品用硼酸盐缓
冲盐水稀释至每lml含o．5 Iu，即与毒素等量混合后每0．4ml注射量中含1／10 Iu。
抗毒素标准品原液的1次吸取量应不低于O．5ml。
(2)破伤风毒素的稀释毒素用硼酸盐缓冲盐水稀释至每lml含5个试验量
(1／10 L+)，即与抗毒素等量混合后每0．4ml注射量中含1个试验量(1／10 L+)。试
验用的毒素须以国家药品检定机构颁发的抗毒素标准品准确标定其试验量
(1／10 L+)，并须每3个月复检一次。
供试品溶液的制备用硼酸盐缓冲盐水将供试品稀释成数个稀释度，使每lml
含抗毒素约O．5IU，即与毒素等量混合后每0．4ml注射量中含抗毒素约1／10 Iu。
稀释度的间隔约为5％。
测定法定量吸取稀释后的抗毒素标准品溶液及不同稀释度的供试品溶液分
别加入小试管中，每管加入等量的稀释毒素溶液，混合均匀，加塞，37℃结合
1小时后，立即注射。
于17～19g小鼠腹部或大腿根部皮下注射O．4ml，应注意勿使注射液流出，
标准品及供试品的每个稀释度各注射小鼠至少3只。标准品溶液与供试品溶液
不得用同一支注射器注射。同一供试品的不同稀释度溶液可用同一支注射器
注射。由高稀释度向低稀释度依次注射。在更换稀释度时应用下一稀释度溶液
洗2～3次。每日上、下午至少观察试验小鼠1次，连续5日，并记录其发病及死
亡情况。
结果判定对照小鼠应于72～120小时内全部死亡。
供试品的效价为与对照小鼠同时死亡或出现破伤风神经毒症状最重的最高
稀释度。
有下列情况之一者应重试：
(1)供试品的稀释度过高或过低；
(2)对照试验小鼠在72小时前或120小时后死亡；
(3)死亡不规则以及在同一稀释度的小鼠中有2只以上属非特异死亡。
【附注】使用干燥毒素时，须精密称定，每次称取量应不低于10mg。毒素溶
解后应一次用完。剩余的干燥毒素应封存于装有干燥剂的真空器皿中。亦可用
干燥毒素制成液体毒素，即干燥毒素以生理氯化钠溶液溶解，与中性甘油
(经116℃ 10分钟灭菌)等量混合，每lml至少含20个试验量。毒素应保存于2～8℃避
光处。
页码数,2005版药典附录第19页
附录ⅢC气相色谱法
气相色谱法系采用气体为流动相(载气)流经装有填充剂的色谱柱进行分离测
定的色谱方法。物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分
先后进入检测器，用记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。
1．对仪器的一般要求
所用的仪器为气相色谱仪，气相色谱仪由载气源、进样部分、色谱柱、柱温
箱、检测器和数据处理系统组成。进样部分、色谱柱和检测器的温度均在控
制状态。
(1)载气源气相色谱法的流动相为气体，称为载气，氦、氮和氢可用作载气，
可由高压钢瓶或高纯度气体发生器提供，经过适当的减压装置，以一定的流速
经过进样器和色谱柱；根据供试品的性质和检测器种类选择载气，除另有规定
外，常用载气为氮气。
(2)进样部分进样方式一般可采用溶液直接进样或顶空进样。
溶液直接进样采用微量注射器、微量进样阀或有分流装置的气化室进样；
采用溶液直接进样时，进样口温度应高于柱温30～50~C；进样量一般不超过数
微升；柱径越细，进样量应越少，采用毛细管柱时，一般应分流以免过载。
顶空进样适用于固体和液体供试品中挥发性组分的分离和测定。将固态或
液态的供试品制成供试液后，置于密闭小瓶中，在恒温控制的加热室中加热至
供试品中挥发性组分在非气态和气态达至平衡后，由进样器自动吸取一定体积
的顶空气注入色谱柱中。
(3)色谱柱色谱柱为填充柱或毛细管柱。填充柱的材质为不锈钢或玻璃，内径
为2～4mm，柱长为2～4m，内装吸附剂、高分子多孔小球或涂渍固定液的载体，
粒径为O．25～0．18mm、O．18～O．15mm或O．15～0．125mm。
常用载体为经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高分子多孔小球，常用固定液有
甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛细管柱的材质为玻璃或石英，内壁或载体经涂
渍或交联固定液，内径一般为0．25mm、O．32mm或0．53mm，柱长5～ 60m，固定
液膜厚O．1～5．0um，常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例组成的苯基甲
基聚硅氧烷、聚乙二醇等。
新填充柱和毛细管柱在使用前需老化以除去残留溶剂及低分子量的聚合物，
色谱柱如长期未用，使用前应老化处理，使基线稳足。
(4)柱温箱由于柱温箱温度的波动会影响色谱分析结果的重现性，因此柱温
箱控温精度应在±1℃，且温度波动小于每小时o．1℃。温度控制系统分为恒温
和程序升温两种。
(5)检测器适合气相色谱法的检测器有火焰离子化检测器(FID)、热导检测器
(TCD)、氮磷检测器(NPD)、火焰光度检测器(FPD)、电子捕获检测器(ECD)、质谱
检测器(MS)等。火焰离子化检测器对碳氢化合物响应良好，适合检测大多数的
药物；氮磷检测器对含氮、磷元素的化合物灵敏度高；火焰光度检测器对含
磷、硫元素的化合物灵敏度高；电子捕获检测器适于含卤素的化合物；质谱检
测器还能给出供试品某个成分相应的结构信息，可用于结构确证。除另有规定
外，一般用火焰离子化检测器，用氢气作为燃气，空气作为助燃气。在使用火
焰离子化检测器时，检测器温度一般应高于柱温，并不得低于150℃，以免水气
凝结，通常为250～350℃。
(6)数据处理系统可分为记录仪、积分仪以及计算机工作站等。
各品种项下规定的色谱条件，除检测器种类、固定液品种及特殊指定的色
谱柱材料不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体牌号、粒度、固定液涂
布浓度、载气流速、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适
应具体品种并符合系统适用性试验的要求。一般色谱图约于30分钟内记录完
毕。
2．系统适用性试验
除另有规定外，应照高效液相色谱法(附录ⅢB)项下的规定。
3．测定法
(1)内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成 分含量
(2)外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量
(3)面积归一化法
上述(1)～(3)法的具体内容均同高效液相色谱法
(附录ⅢB)项下相应的规定。
(4)标准溶液加入法测定供试品中某个杂质或主成分
精密称(量)取某个杂质或待测成分对照品适量，配制成适当浓度的对照品溶
液，取一定量，精密加入到供试品溶液中，根据外标法或内标法测定杂质或主
成分含量，再扣除加入的对照品溶液含量，即得供试液溶液中某个杂质和主成
分含量。
也可按下述公式进行计算，加入对照品溶液前后校正因子应相同，即：
Ais/Ax=Cx+△cx／cx
则待测组分的浓度cx可通过如下公式进行计算：
cx=△cx/(Ais/Ax)-1
式中cx为供试品中组分x的浓度；
Ax为供试品中组分x的色谱峰面积；
△cx为所加入的已知浓度的待测组分对照品的浓度；
Ais为加入对照品后组分x的色谱峰面积。
气相色谱法定量分析，当采用手工进样时，由于留针时间和室温等对进样
量的影响，使进样量不易精确控制，故最好采用内标法定量；而采用自动进样
器时，由于进样重复性的提高，在保证进样误差的前提下，也可采用外标法定
量。当采用顶空进样技术时，由于供试品和对照品处于不完全相同的基质中，
故可采用标准溶液加入法以消除基质效应的影响；当标准溶液加入法与其他定
量方法结果不一致时，应以标准加入法结果为准。
页码数,2005版药典附录第68页
附录Ⅺ G 气性坏疽抗毒素效价
本法根据抗毒素能中和毒素的作用，将供试品与标准品做系列稀释，分别
与相应毒素结合，注入小鼠体内，在规定的时间内，比较小鼠存活和死亡情
况，以测定供试品效价。
试剂 (1)稀释液 称取氯化钠8．5g、硼酸4．5g、四硼酸钠(Na2 B4()7·10H20)
0．5g，用水溶解并稀释至1000ml，过滤。灭菌后pH值应为7．0～7．2。
(2)气性坏疽毒素溶液 由国家药品检定机构提供，亦可自备。试验用的气性
坏疽毒素须以国家药品检定机构分发的气性坏疽抗毒素标准品准确标定其试验
量(见测定参数表)，并每3个月复检1次。使用前将毒素用稀释液稀释至每lml含5个
(水肿型为20个)毒素试验量。
气性坏疽抗毒素效价测定参数表（表略）
气性坏疽抗毒素标准品溶液的制备气性坏疽(产气荚膜、水肿、败毒、溶组
织)抗毒素标准品由国家药品检定机构提供。于2～8℃处避光保存。使用时，将
抗毒素标准品溶液用稀释液稀释至每lml含测定参数表所示效价。抗毒素标准品
原液的1次吸取量应不低于0．5ml。
供试品溶液的制备将供试品用稀释液稀释成数个稀释度，使每lml约含5个试
验量(水肿型为20个试验量)。各稀释度之间的间隔约为5％～10％。
测定法 精密量取气性坏疽抗毒素标准品溶液O．8ml、1．0ml、1．2m1分别置
小试管中，按管序分别补加稀释液O．7ml、0．5ml、0．3ml。精密量取不同稀释
度的供试品溶液各1．0m1分别加入小试管中，每管补加稀释液0．5ml(可在抗毒素
之前加入)。以上各管分别加入气性坏疽毒素溶液1．0ml(水肿型为O．5m1)，混合
均匀，加塞，20～25℃结合1个小时，按测定参数表所示剂量与途径，立即注射
17～19g小鼠。每稀释度注射小鼠4只。
结果判定每天上、下午各观察试验动物1次，并记录发病及死亡情况，连续
3天。标准品组动物在3天内，抗毒素量最少(即O．8m1)的4只动物中至少应有2只
以上死亡。对比标准品组与供试品组动物死亡情况，推算供试品的效价。
有下列情况之一者应重试：
(1)标准品组动物在3天内全部死亡或者全无死亡，或者抗毒素量最少的4只动
物死亡不足半数，抗毒素量最多的4只动物死亡超过半数；
(2)供试品组动物在3天内全部死亡或者全无死亡；
(3)动物死亡数极不规则，以致无法进行判定；
(4)每稀释度注射的动物中有2只以上属非特异死亡。
【附注】(1)自备气性坏疽毒素的制法(包括菌种、培养基、培养条件及干燥方
法等)应与国家药品检定机构分发者相同。
(2)使用干燥气性坏疽毒素时，须精密称定，每次称取量应不低于10mg，溶解
后应一次用完。剩余的干燥毒素应封存于装有干燥剂的真空器皿中。亦可用干
燥毒素制成液体毒素，即干燥毒素以生理氯化钠溶液溶解，与中性甘油(经116℃
10分钟灭菌)等量混合，每lml至少含50个试验量。毒素应保存于2～8℃避光处。
页码数,2005版药典附录第39页
附录ⅦF氢氧化铝(或磷酸铝)测定法
本法系依据过量的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)与铝离子发生反应，再用锌滴
定液滴定剩余的EDTA，根据锌滴定液的消耗量，可计算出供试品中氢氧化铝
(或磷酸铝)的含量。
测定法 精密量取供试品适量(约相当于含铝1～lOmg)，置250 ml锥形瓶中，加
磷酸溶液(6—100)1．5ml，使完全溶解。必要时于水浴中加温(难于溶解时尚可适
当增加磷酸量)。精密加入乙二胺四乙酸二钠滴定液(0．05mol／l)10ml，醋酸一醋
酸铵缓冲液(pH4．5)(称取醋酸铵7．7g，加水50ml溶解后，加冰醋酸6ml与适量的
水稀释成100m1)0ml，置沸水浴上加热10分钟，取出冷至室温，加二甲酚橙指示
液lml，用锌滴定液(0．025mol／I)进行滴定，当溶液由亮黄色变为橙色，即为终
点。并将滴定的结果用空白试验校正。
按下式计算
氢氧化铝含量(mg／m1)=(Vo-V1)*c*78．01/V2
磷酸铝含量(mg／m1)=(Vo-Vl)*c*l21.95/V2
铝含量(mg／m1)=(Vo-V1)*c*26．98/V2
式中 V0为空白试验消耗锌滴定液的体积，ml；
Vl为供试品消耗锌滴定液的体积，ml；
c为锌滴定液的浓度，mol／L；
V2为供试品的体积，ml；
78．01、121．95、26．98分别为氢氧化铝、磷酸铝,铝的相对分子质量或相
对原子质量。
【附注】 (1)锌滴定液(O．05mol／L)的制备与滴定取硫酸锌15g(相当于锌约
3．3g)，加稀盐酸(23．4→100)lOml，适量水溶解并稀释至1000ml，摇匀。精密量取
本液25ml，加0．025％甲基红的乙醇溶液1滴，滴加氨试液至溶液显微黄色，加
水25ml、氨-氯化铵缓冲液(pill0．0)10ml与铬黑T指示剂少量，用乙二胺四乙酸二
钠滴定液(0．05mol／L)滴定至溶液由紫色变为纯蓝色，并将滴定的结果用空白
试验校正。根据乙二胺四乙酸二钠滴定液(0．05tool／L)的消耗量，算出本液的
浓度，即得。
(2)锌滴定液(0．025mol／L)的制备 精密量取锌滴定液(0．05mol／L)lOOml，加水
准确稀释至200ml，摇匀，即得。
(3)乙二胺四乙酸二钠滴定液(O．05tool／L)的制备与滴定取乙二胺四乙酸二钠
19g，加适量的水溶解并稀释成1000ml，摇匀。取于约800℃灼烧至恒重的标准氧
化锌0．12g，精密称定，加稀盐酸(23．4→100)3ml使溶解，加水25ml，加O．025％
甲基红的乙醇溶液1滴，滴加氨试液至溶液显微黄色，加水25ml与氨一氯化铵缓
冲液(pHl0．O)10ml，再加铬黑T指示剂少量，用本液滴定至溶液由紫色变为纯蓝
色，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml乙二胺四乙酸二钠滴定液
(0．05mol／L)相当于4．069mg的氧化锌。根据本液的消耗量与氧化锌的取用量，
算出本液的浓度，即得。
页码数,2005版药典附录第21页
附录lV B琼脂糖凝胶电泳法
试剂 (1)巴比妥缓冲液(pH8．6) 称取巴比妥4·14g、巴比妥钠23．18g，加水适
量，加热使之溶解，放冷至室温，再加叠氮钠O．15g，溶解后，加水稀释成
1500ml。
(2)1．5％琼脂糖溶液称取琼脂糖1．5g，加水50ml和巴比妥缓冲液(pH8．6)50ml，
加热使完全溶胀。
(3)0·5％氨基黑溶液称取氨基黑10B 0．5g，溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml
的混合液中。
(4)脱色液量取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混匀。
(5)溴酚蓝指示液 称取溴酚蓝50mg，加水使之溶解，并稀释成100ml。
对照品正常人血清或其他适宜的对照品。
供试品溶液的制备用生理氯化钠溶液将供试品稀释成蛋白质浓度为1％～2％
的溶液。
测定法趁热将1．5％琼脂糖溶液倾倒于大小适宜的水平玻板上，其厚度约
3mm，静置，待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层后，于琼脂板负极端的1／3处打
孔，孔径2～3mm。置含有巴比妥缓冲液(pH8．6)的电泳槽架上，测定孔加适量
供试品溶液和1滴溴酚蓝指示液，对照孔加适量对照品及1滴溴酚蓝指示液。用
3层滤纸搭桥与巴比妥缓冲液(pH8．6)接触，100V恒压条件下电泳2小时(指示剂迁
移到前沿)。电泳结束后，用O．5％氨基黑溶液染色，再用脱色液脱色至背景无
色。
书页号：2005版药典三部附录77页
附录Ⅻ D 热原检查法
本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家
兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
供试用家兔 供试用的家兔应健康，体重1.7～3.0kg，雌兔应无孕。预测体温
前7日即应用同一饲料饲养，在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等
不得有异常现象。未曾用于热原检查的家兔，应在检查供试品前3～7日内预测体
温，进行挑选。挑选的条件与检查供试品相同，仅不注射药液，每隔30分钟测量
体温1次，共测8次，8次体温均在38.0～39.6℃的范围内，且最高与最低体温差不超
过0.4℃的家兔，方可供热原检查用。用于热原检查后的家兔，若供试品判定为
符合规定，至少应休息48小时后可重复使用；对血液制品、抗毒素和其他同一过
敏原的供试品在5天内可重复使用1次。若供试品判定为不符合规定，则组内全部
家兔不再使用。
试验前准备热原检查前1～2日，供试验用家兔应尽可能处于同一温度的环境
中，实验室和饲养室的温度相差不得大于5℃，实验室的温度应在17～25℃，热原
检查全过程中，应注意室温变化不得大于3℃；并应保持安静，避免强光照射，
避免噪声干扰和引起动物骚动。家兔在检查前至少1小时开始停止给食并置于适
宜的装置中，直至检查完毕。家兔体温应使用精密度为±0.1℃的测温装置。测温
探头或肛温计插入肛门的深度和时间各兔应相同，深度一般约6cm，时间不得少
于1.5分钟。每隔30分钟测量体温1次，一般测量2次，两次体温之差不得超过0.2℃，
以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔，正常体温应在
38.0～39.6℃的范围内，同组兔间正常体温之差不得超过1℃。
检查用的注射器、针头及一切与供试品接触的器皿，应置干烤箱中用250℃
加热30分钟，也可用其他适宜方法除热原。
检查法 供试品或稀释供试品的无热原稀释液，在注射前应预热至38℃。供
试品的注射剂量按各制品规程的规定。但家兔每1kg体重注射体积不得少于0.5ml，
不得大于10ml。
取适用的家兔3只，测定其正常体温后15分钟内，自家兔耳静脉缓缓注入规
定剂量并预热至38℃的供试品溶液，然后每隔30分钟按前法测量其体温一次，共
测6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温升高的温度。如3
只家兔中，有1只家兔体温升高0.6℃或0.6℃以上；或3只家兔体温升高均低于0.6℃
,但体温升高的总和达1.4℃或1.4℃以上，应另取5只家兔复试，检查方法同上。
结果判定 在初试3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高
总和低于1.4℃；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔仅有1
只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或3.5℃以下，均认为供
试品的热原检查符合规定。
在初试的3只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只；或在复试的
5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只；或在初试、复试合并8只
家兔的体温升高总和超过3.5℃，均认为供试品的热原检查不符合规定。
当家兔升温为负值时，均以0℃计。
页码数,2005版药典附录第55页
附录ⅨQ人红细胞抗体测定法(微量板法)
本法系依据红细胞与红细胞抗体结合后发生凝集的原理，通过比较血凝反
应终点，测定供试品中人红细胞抗体效价。
试剂1％O型红细胞悬液取3例或3例以上O型抗凝血混合，采血后7日内使用。
用前以生理氯化钠溶液洗涤3次，末次以每分钟2000转离心10分钟，取压积红
细胞适量，用生理氯化钠溶液制成1％浓度备用。
测定法在"V"形、底角呈90。的96孔微量板上，用生理氯化钠溶液将供试品做
2倍系列稀释，每个供试品做两排，每孔加入50ul。再向每孑L加入1％O型红细胞
悬液50μl，轻拍微量板30秒混匀。室温静置3小时观察结果，同时用生理氯化钠
溶液替代供试品，同法操作作阴性对照。
结果判定将微量板置于白色背景之上，将供试品孔与阴性对照孔比较，红细
胞沉于底部成一规则的圆点而孔壁未粘有红细胞判为阴性；孔壁上均匀附着一
层红细胞，或红细胞未全部沉于底部，部分附着于孔壁上均判为阳性。以供试
品出现阳性的最高稀释倍数为其红细胞抗体的效价。如同批供试品前后排结果
相差在1个以上稀释度时应重试。相差1个稀释度时，则以两排结果中出现阳性
的最高稀释度为该供试品的红细胞抗体效价。
页码数,2005版药典附录第63页
附录X P人免疫球蛋白Fc段生物学活性测定法
本法系依据特异性抗体(免疫球蛋白)Fab段与红细胞上已包被的相应抗原结
合，抗体暴露出Fc段补体Clq的结合位点，从而激活后续的补体各成分，最终导
致红细胞的细胞膜受到攻击、破裂，释放出血红蛋白。通过溶血反应动力学曲
线，计算人免疫球蛋白激活补体活性的功能指数(JFc)，以此测定供试品Fc段生
物学活性。
试剂 (1)PBS(pH7．2) 取无水磷酸氢二钠1．02g、无水磷酸二氢钠0．34g、氯化
钠8．77g，加适量水溶解，用lmol／L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH至7．2，再
加水稀释至1000ml。
(2)钙镁贮备液 取氯化钙1．10g、氯化镁5．08g，加水25ml使溶解。
(3)巴比妥一钙镁贮备液 取氯化钠5L 85g、巴比妥钠6．37g，加1000ml使溶解，
加入钙镁贮备液3．125ml，用lmol／L盐酸溶液调节pH至7．3，再加水稀释至
1250ml。除菌过滤后4℃保存备用。
(4)牛白蛋白一巴比妥缓冲液取牛血清白蛋白0．15g于巴比妥贮备液20ml中，加
水溶解并稀释至100ml。本液应临用前配制。
(5)1．3mg／L鞣酸PBS(pH7．2)溶液 A液称取鞣酸lmg加PBS(pH7．2)10ml，使溶解；
B液量取A液O．1ml加PBS(pH7．2)7．5ml，混匀，即得，临用前配制。
(6)10％氯化铬溶液称取氯化铬5g，加生理氯化钠溶液50ml使溶解，4℃保存(可
保存半年)。
(7)1％氯化铬溶液 取10％氯化铬溶液O．1ml，加生理氯化钠溶液O．9ml，混
匀。临用前配制。
敏化红细胞的制备
A液取健康人抗凝的0型血3人份以上混合，用PBS洗涤3次，最后一次于每分
钟2000转离心10分钟分离红细胞。取适量压积红细胞悬浮于1．3mg／L鞣酸
PBS(1:40)，置37℃水浴中轻摇30分钟后再用PBS洗涤3次，最后用PBS制备成2．5％
红细胞悬浮液。
B液用PBS适当稀释的白喉类毒素或流行腮腺炎病毒与1％氯化铬溶液O．25ml
混合(10：1)后，置37℃水浴中轻摇15分钟。
将A液、B液按1：4混合，置37℃水浴中轻摇30分钟。离心，去上清液，用PBS
将沉淀(敏化红细胞)洗涤3次，用牛白蛋白一巴比妥缓冲液悬浮红细胞，调节至
适宜浓度，使其在波长541nm处的吸光度为1．O±O．1。
参考品溶液的制备用1mol／L氢氧化钠溶液将参考品pH调至6·8～7．O，再用
牛白蛋白一巴比妥缓冲液将参考品IgG浓度稀释至每lml含40mg。
供试品溶液的制备用lmol／L氢氧化钠溶液将供试品pH调至6．8～7．O，再用
牛白蛋白一巴比妥缓冲液将供试品IgG浓度稀释至每lml含40mg。
测定法 取供试品溶液0．9ml加敏化红细胞悬液O·lml，混匀，置37℃水浴中轻
摇30分钟。离心，去上清液，用牛白蛋白一巴比妥缓冲液lml洗涤红细胞，共洗
3次。末次离心后弃上清液800μl，向沉淀中加入600μl预热到37℃的牛白蛋白一
巴比妥缓冲液，充分混匀，2分钟后再加入已稀释至每lml含150 CH50的补体
200μl，混匀后立即照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)在波长541nm处测定起始
吸光度(A。)，之后，每隔1分钟测定1次，即得供试品在波长541nm处的吸光度与
时间的溶血反应动力学曲线。当吸光度越过了曲线的内曲点后即可停止测量。
分别取参考品及阴性对照(牛白蛋白一巴比妥缓冲液)O·9ml，自“加敏化红细胞悬
液O．1ml※’起，同法操作。按公式(1)分别计算出参考品、供试品和阴性对照曲线
斜率。按公式(2)计算供试品激活补体的功能指数(IFc)。
S※=Sexp/As (1)
IFc=Sc※-Sc※/Sr※-Sc※ *100% (2)
式中S※为用As修正Sexp得到曲线斜率；
As分别为供试品、参考品、阴性对照在波长
541nm处测定的起始吸光度；
Sexp分别为供试品、参考品及阴性对照各自的溶血反应动力学曲线分别计算出
的相邻三点间的曲线最大斜率；
IFc为供试品激活补体的功能指数；
Ss※为供试品曲线斜率;
Sr※为参考品曲线斜率；
Sc※为阴性对照曲线斜率。
页码数,2005版药典附录第36页
附录ⅥR人免疫球蛋白类制品IgG单体加二聚体测定法
本法系用分子排阻色谱法测定人免疫球蛋白类制品IgG单体加二聚体含量。
照分子排阻色谱法(附录ⅢD)测定。
色谱条件和系统适用性试验用亲水硅胶高效体积排阻色谱柱(SEC，排阻极
限300kD，粒度10#m)，柱直径7．5mm，长60cm。以含1％异丙醇的pH 7．O O．
2mol／L磷酸盐缓冲液[取0．5mol／L磷酸二氢钠200ml、O．5mol／L磷酸氢二钠
420m1、异丙醇15．5ml及水914．5ml，混匀]为流动相，检测波长为280nm，流速为
每分钟O．6ml。取每lml含蛋白质为4mg的白蛋白溶液20μ1，注入色谱柱，记录色
谱图，白蛋白单体峰与二聚体峰间的分离度应大于1．5，拖尾因子按白蛋白单
体峰计算应为O．95～1．40。
测定法取供试品适量，用流动相稀释成每lml约含蛋白质4mg的溶液，取20μ1，
注入色谱柱，记录色谱图60分钟。按面积归一法计算，色谱图中单体加二聚体
峰的含量，即为IgG单体加二聚体含量。图谱各峰的界限为两峰间最低点到基
线的垂直线。主峰为IgG单体；相对保留时间约0．85的峰为二聚体。
页码数,2005版药典附录第63页
附录X o人免疫球蛋白中白喉抗体效价测定法
本法系依据绵羊红细胞经醛化和鞣酸化处理后，具有较强的吸附蛋白质的
能力，能将白喉类毒素吸附于红细胞表面上，若遇到供试品中相应抗体，会发
生抗原抗体结合，产生特异性凝集，通过比较凝集反应终点测定供试品中白喉
抗体效价。
试剂 (1)1％兔血清生理氯化钠溶液无菌采集兔全血，分离血清，置56℃ 30分
钟灭能。取O．5ml兔血清加49．5ml生理氯化钠溶液，混匀。
(2)白喉抗体诊断红细胞悬液用1％兔血清生理氯化钠溶液复溶冻干白喉抗体
诊断红细胞至5％悬液。
白喉抗体标准品溶液的制备用1％兔血清生理氯化钠溶液将白喉抗体标准品
稀释至每lml含O．2 HAU。
供试品溶液的制备用1％兔血清生理氯化钠溶液将供试品稀释4倍。
测定法在UV型血凝板上，用1％兔血清生理氯化钠溶液将供试品溶液做2倍
系列稀释，每孔留25μ1，再向每孔加25μ1白喉抗体诊断红细胞悬液，置振荡器
混匀30～60秒，放湿盒内37℃结合1小时。
在UV型血凝板上，用1℃兔血清生理氯化钠溶液将白喉抗体标准品溶液做2倍
系列稀释，每孔留25μl，自再向每孔加25／11白喉抗体诊断红细胞悬液起，同法
操作。
在UV型血凝板上，加1％兔血清生理氯化钠溶液25tμ1，自再向每孔加25pl白喉
抗体诊断红细胞悬液起，同法操作，为阴性对照。
阴性对照孔呈典型的"-",”，否则试验不成立，应重试。以出现"++"为判定终
点。按下式计算供试品白喉抗体效价
供试品白喉抗体效价(HAU／g)=E*D/F
式中E为出现"++"的最高稀释倍数的标准品的白喉
抗体效价，HAU／ml；
D为出现“++”的供试品的最高稀释倍数；
F为静注人免疫球蛋白供试品IgG含量(g／m1)；
或人免疫球蛋白供试品蛋白含量(g／m1)。
【附注】(1)判定标准
"-"红细胞集中在孔底中央，呈一边缘光滑致密的小红点；
"+"大部分红细胞沉于孔底中央，周围有少量的红细胞；
"++"红细胞部分凝集，孔底中央有一疏松的小红圈；
"+++"大部分红细胞凝集呈均匀分布，孔底中央有很弱的小红圈；
"++++"红细胞凝集呈均匀分布。
(2)血凝板孔要保持清洁干净，避免表面磨损，否则红细胞不易下沉，易出现
假阳性。
页码数,2005版药典附录第54页
附录ⅨN人凝血酶活性检查法
本法系依据凝血酶能使人纤维蛋白原凝固原理，将供试品和人纤维蛋白原
混合，观察是否产生凝块，以此判定供试品是否具有凝血酶活性。
试剂 (1)0．5％纤维蛋白原溶液用生理氯化钠溶液将复溶的冻干人纤维蛋白
原溶液稀释成每lml含5mg的溶液。
(2)人凝血酶溶液用生理氯化钠溶液将复溶的冻干人凝血酶稀释成每lml中含
0．5IU的溶液。
测定法取供试品O．2ml，加0．5％纤维蛋白原溶液O．2ml，37℃放置24小时，
观察有无凝块或纤维蛋白析出。放置期间至少观察2次。同时做阴性及阳性对
照。
(1)阴性对照 用O．2ml生理氯化钠溶液替代供试品，同法操作。
(2)阳性对照用O．2ml凝血酶溶液(每lml含O．5IU)替代供试品，同法操作。
结果判定阴性对照无任何凝块或纤维蛋白析出，阳性对照应有凝块或纤维
蛋白析出，则试验成立。肉眼观察供试品应无凝块或纤维蛋白析出。
【附注】含肝素的供试品应根据肝素含量，用适量的硫酸鱼精蛋白中和供试
品内的肝素(按10μg硫酸鱼精蛋白中和IIU肝素进行)，再取供试品照上述方法检
查。
页码数,2005版药典附录第60页
附录X J人凝血因子Ⅱ效价测定法(一期法)
本法系用人凝血因子Ⅱ缺乏血浆为基质血浆，采用一期法测定供试品人凝
血因子Ⅱ效价。
试剂 (1)稀释液取巴比妥钠11．75g、氯化钠14．67g溶于适量水中，用lmol／L
盐酸溶液调pH值至7．3，再加水稀释至2000ml。临用前，加适量20％人血白
蛋白至终浓度为1％。
(2)含钙促凝血酶原激酶(Thromboplastin)
(3)人凝血因子Ⅱ缺乏血浆人凝血因子Ⅱ含量低于1％的人血浆或人工基质血
浆。
人凝血因子Ⅱ标准溶液的制备用 人凝血因子Ⅱ缺乏血浆将标准品稀释成
每lml含1IU凝血因子Ⅱ，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰
浴备用。
供试品溶液的制备用人凝血因子Ⅱ缺乏血浆将供试品稀释成每lml约含IIU凝
血因子Ⅱ，再用稀释液进行10倍、20倍或40倍稀释，置冰浴待用。
测定法取供试品溶液O．1ml，加人凝血因子Ⅱ缺乏血浆0．1ml，混匀，置37℃
水浴中保温一定时间(一般3分钟)，然后加已预热至37℃含钙促凝血酶原激酶溶
液0．2ml，记录凝固时间。
用不同稀释度的人凝血因子Ⅱ标准溶液O．1ml替代供试品溶液，同法操作。
将人凝血因子Ⅱ标准溶液效价(IU／m1)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数
进行直线回归处理，求出直线回归方程，计算供试品溶液人凝血因子Ⅱ效价，
再乘以稀释倍数，即为供试品人凝血因子Ⅱ效价(IU／m1)。
【附注】(1)直线回归相关系数应不低于O．98。
(2)测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10％，否则
重测。
(3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。
(4)采用全自动凝血仪操作，按仪器使用说明书进行。
页码数,2005版药典附录第61页
附录X K人凝血因子Ⅶ效价测定法(一期法)
本法系用人凝血因子Ⅶ缺乏血浆为基质血浆，采用一期法测定供试品人凝
血因子Ⅶ效价。
试剂 (1)稀释液 取巴比妥钠11．75g、氯化钠14．67g，溶于适量水中，用
1mol／L盐酸溶液调pH值至7．3，再加水至2000ml。临用前加适量20％人血白蛋白
至终浓度为1％。
(2)含钙促凝血酶原激酶(Thromboplastin)
(3)人凝血因子Ⅶ缺乏血浆人凝血因子Ⅶ含量低于1％的人血浆或人工基质血
浆。
人凝血因子Ⅶ标准溶液的制备用人凝血因子Ⅶ缺乏血浆将标准品稀释成每
1ml含IIU凝血因子Ⅶ，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰浴
备用。
供试品溶液的制备用人凝血因子Ⅶ缺乏血浆将供试品稀释成每1ml约含1IU凝
血因子Ⅶ，再用稀释液进行10倍、20倍或40倍稀释，置冰浴待用。
测定法取供试品溶液0．1ml，加人凝血因子Ⅶ缺乏血浆O．1ml，混匀，置37℃
水浴保温一定时间(一般3分钟)，然后加入已预热至37℃含钙促凝血酶原激酶溶
液0．2ml，记录凝固时间。
用不同稀释度的人凝血因子Ⅶ标准溶液O．1ml替代供试品溶液，同法操作。
将标准溶液人凝血因子Ⅶ效价(IU／m1)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数
进行直线回归处理，求出直线回归方程，计算供试品溶液人凝血因子Ⅶ效价，
再乘以稀释倍数，即为供试品人凝血因子Ⅶ效价(IU/m1)。
【附注】(1)直线回归相关系数应不低于0．98。
(2)测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10％，否则重
测。
(3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。
(4)采用全自动凝血仪操作，按仪器使用说明书进行。
页码数,2005版药典附录第62页
附录X N人凝血因子Ⅷ效价测定法(一期法)
本法系用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆为基质血浆，采用一期法测定供试品人凝
血因子Ⅷ效价。
试剂 (1)3．8％枸橼酸钠溶液 取无水枸橼酸钠9．5g，加水溶解并稀释至250ml。
(2)咪唑缓冲液(pH 7．3)取咪唑O．68g和氯化钠1．17g，加水使溶解成r00ml，加
入O．1mol／L盐酸溶液42．2ml，再加水稀释至200ml，即得。
(3)稀释液取1体积的3．8％枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20％
人血白蛋白至终浓度为1％。
(4)激活的部分凝血活酶(APTT)试剂
(5)人凝血因子Ⅷ缺乏血浆为人凝血因子Ⅷ含量低于1％的人血浆或人工基质
血浆。
(6)O．05mol／L氯化钙溶液 取氯化钙(CaCl2·2H20)147g，加水溶解并稀释至
1000ml，配制成1mol／L氯化钙贮存液，用前用水稀释20倍，配制成O．05mol／L
氯化钙溶液。
人凝血因子Ⅷ标准溶液的制备用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将标准品稀释成每
lml含1IU凝血因子Ⅷ，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰
浴待用。
供试品溶液的制备用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将供试品稀释成每lml约含1IU凝
血因子Ⅷ，再用稀释液进行10倍和20倍或40倍稀释，置冰浴待用。
测定法取激活的部分凝血活酶试剂O．1ml，置37℃水浴保温一定时间(一般4
分钟)，加人凝血因子Ⅷ缺乏血浆0．1ml、供试品溶液0．1ml，混匀，置37℃水浴
保温一定时间(一般5分钟)，加已预热至37℃ 0．05mol／L氯化钙溶液0．1ml，记录
凝固时间。
用不同稀释度的人凝血因子Ⅷ标准溶液O．1ml替代供试品溶液，同法操作。
将标准溶液人凝血因子Ⅷ效价(IU／m1)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数进
行直线回归处理，求出直线回归方程。计算供试品溶液人凝血因子Ⅷ效价，再
乘以稀释倍数，即为供试品人凝血因子Ⅷ效价(IU／m1)。
【附注】(1)直线回归相关系数应不低于0．98。
(2)测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10％，否则重
测。
(3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。
(4)采用全自动凝血仪操作，按仪器使用说明书进行。
页码数,2005版药典附录第61页
附录X L人凝血因子Ⅸ效价测定法(一期法)
本法系用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆为基质血浆，采用一期法测定供试品人凝
血因子Ⅸ效价。
试剂 (1)3．8％枸橼酸钠溶液称取无水枸橼酸钠9．5g，加水溶解并稀释至
250ml。
(2)咪唑缓冲液(pH 7．3)称取咪唑O．68g、氯化钠1．17g，溶于100ml水中，加
入0．1mol／L盐酸溶液42．2ml，再加水稀释至200ml，即得。
(3)稀释液取1体积的3．8％枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液，混合，加适量
20％人血白蛋白至终浓度为1％。
(4)激活的部分凝血活酶(APTT)试剂
(5)人凝血因子Ⅸ缺乏血浆为人凝血因子Ⅸ含量低于1％的人血浆或人工基质
血浆。
(6)0．05mol／L氯化钙溶液 取氯化钙(CaCl2·2H2 O)147g，加水溶解并稀释至
1000ml，配制成lmol／L氯化钙贮存液。临用前，用水稀释20倍，配制成
0．05mol／L氯化钙溶液。
人凝血因子Ⅸ标准溶液的制备 用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆将标准品稀释成每
lml含1IU凝血因子Ⅸ，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰
浴待用。
供试品溶液的制备若供试品中含有肝素，先用硫酸鱼精蛋白中和供试品中的
肝素。测定时先用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆稀释成每lml约含1IU凝血因子Ⅸ，再用
稀释液进行10倍、20倍或40倍稀释，置冰浴待用。
测定法取激活的部分凝血活酶试剂0．1ml，置37℃水浴中保温一定时间(一般
4分钟)，加人凝血因子Ⅸ缺乏血浆0．1ml、供试品溶液0．1ml，混匀，置37℃水浴
中保温一定时间(一般5分钟)，加已预热至37~C的0．05mol／L氯化钙溶液0．1ml，
记录凝固时间。
用不同稀释度的人凝血因子Ⅸ标准溶液O．1ml替代供试品溶液，同法操作。
将标准溶液人凝血因子Ⅸ效价(IU／m1)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数
进行直线回归处理，求出直线回归方程，计算供试品溶液人凝血因子Ⅸ效价，
再乘以稀释倍数，即为供试品人凝血因子Ⅸ效价(IU/m1)。
【附注】(1)直线回归相关系数应不低于0．98。
(2)测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10％，否则重
测。
(3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。
(4)采用全自动凝血仪操作，按仪器使用说明书进行。
页码数,2005版药典附录第62页
附录X M人凝血因子X效价测定法(一期法)
本法系用人凝血因子X缺乏血浆为基质血浆，采用一期法测定供试品人凝血
因子X效价。
试剂 (1)稀释液 取巴比妥钠11．75g、氯化钠]4．67g，溶于适量水中，用lmol／L
盐酸溶液调pH至7．3，再加水稀释至2000ml。临用前加适量20％人血白蛋白至终
浓度为1％。 ’
(2)含钙促凝血酶原激酶(Thromboplastin)
(3)人凝血因子X缺乏血浆人凝血因子X含量低于1％的人血浆或人工基质血浆。
人凝血因子X标准溶液的制备用人凝血因子X缺乏血浆将标准品稀释成每lml
含1IU凝血因子X，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰浴
备用。
供试品溶液的制备用人凝血因子X缺乏血浆将供试品稀释成每lml约含1IU凝
血因子X，再用稀释液进行10倍和20倍或40倍稀释，置冰浴待用。
测定法取供试品溶液0．1ml，加人凝血因子X缺乏血浆O．1ml，混匀，置3℃
水浴中保温一定时间(一般3分钟)，然后加入已预热至37℃含钙促凝血酶原激酶
溶液0．2ml，记录凝固时间。
用不同稀释度的人凝血因子X标准溶液0．1ml替代供试品溶液，同法操作。
将标准溶液人凝血因子X效价(IU／m1)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数
进行直线回归处理，求出直线回归方程，计算供试品溶液人凝血因子X效价，
再乘以稀释倍数，即为供试品人凝血因子X效价(IU／m1)。
【附注】(1)直线回归相关系数应不低于O．98。
(2)测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10％，否则
重测。
(3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。
(4)采用全自动凝血仪操作，按仪器使用说明书进行。
页码数,2005版药典附录第36页
附录ⅥQ人血白蛋白多聚体测定法
本法系用分子排阻色谱法测定人血白蛋白多聚体含量。
照分子排阻色谱法(附录ⅢD)测定。
色谱条件与系统适用性试验用亲水硅胶高效体积排阻色谱柱(SEC，排阻极
限300kD，粒度10μm)，柱直径附录Ⅶ A磷测定法7．5mm，长30cm或60cm；以含1％
异丙醇的pH7．O O．2mol／L磷酸盐缓冲液[取0．5mol／L磷酸二氢钠200ml、
0．5mol／L磷酸氢二钠420ml、异丙醇15．5ml及水914．5ml，混匀]为流动相；检测
波长为280nm；流速为每分钟0．6ml。取每lml含蛋白质为4mg的白蛋白溶液20μ1，
注入色谱柱，记录色谱图，白蛋白单体峰与二聚体峰间的分离度应大于1．5，
拖尾因子按白蛋白单体峰计算应为O．95～1．40。
测定法取供试品适量，用流动相稀释成每lml约含蛋白质4mg的溶液，取20μl，
注入色谱柱，记录色谱图30分钟(色谱柱长30cm)或60分钟(色谱柱长60cm)。
按面积归一法计算，色谱图中未保留(全排阻)峰的含量(％)除以2，即为人血
白蛋白多聚体含量。
页码数,2005版药典附录第41页
附录ⅦK人血白蛋白铝残留量测定法
本法系用原子吸收分光光度法测定人血白蛋白制品中残留的铝含量。
测定法按表1精密量取供试品、100ng／ml标准铝溶液(精密量取100μg／m1标准
铝溶液O．1ml，置100ml量瓶中，用O．15mol／L硝酸溶液稀释至刻度)，分别制备
空白对照溶液、供试品溶液和标准铝加供试品的混合溶液。照原子吸收分光
光度法(附录ⅡB)测定，选择铝灯，测定波长为309．3nm、狭缝为O．7nm。按表
2设置石墨炉的干燥、灰化、原子化等炉温程序，精密量取空白对照溶液、供
试品溶液和标准铝加供试品的混合溶液各30bd，分别注入仪器，读数。按下式
计算
供试品铝含量(μg／L)=20*(S0一B)×12．5/S-S0
式中 B为空白对照溶液读数；
S0为供试品溶液读数；
S为标准铝加供试品的混合溶液读数；
20为标准铝加供试品的混合溶液中标准铝的含量,μg／L；
12．5为供试品稀释倍数。
表1空白、供试品及混合溶液的制备
┏━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━┓
┃ ┃空白对照溶液┃供试品溶液 ┃混合溶液 ┃
┣━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃供试品／ml ┃ ┃ O．2 ┃ O．2 ┃
┃标(100 ng／m1)／ml ┃ —— ┃ _—— ┃ O．5 ┃
┃ O．3mol／L HN03／rnl ┃ 2．5 ┃ 2．3 ┃ 1．8 ┃
┗━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━┛
表2炉温控制程序
┏━━━━┳━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━━┓
┃ ┃ ┃ ┃ 时间／秒 ┃
┃ 程序 ┃ 步骤 ┃ 温度／℃ ┃ ┃
┃ ┃ ┃ ┃ 爬坡时间+保持时间 ┃
┃ 1 ┃ 预热 ┃ 80 ┃ 0+10 ┃
┃ 2 ┃ 干燥 ┃ 220 ┃ 120+5 ┃
┃ 3 ┃ 灰化 ┃ 1200 ┃ 10+20 ┃
┃ 4 ┃ 原子化 ┃ 2600 ┃ 0+5 ┃
┃ 5 ┃ 清除 ┃ 2650 ┃ 0+5 ┃
┗━━━━┻━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━━┛
【附注】 (1)供试品和标准铝取量可根据仪器性能进行适当调整，使读数在所
用仪器可准确读数范围内。
(2)表2列出的炉温控制程序可根据仪器性能作适当调整。
(3)尽量避免使用玻璃容器。
页码数,2005版药典附录第55页
附录ⅨR 人血小板抗体测定法
本法系采用血小板与血小板抗体结合后，使血小板发生凝集的原理。通过
比较凝集反应终点测定供试品中人血小板抗体效价。
试剂(1)5％乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝剂取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)
0．365g、磷酸二氢钾O．875g、氯化钠2．125g、7-胺四乙酸二钠(EDTA-Na2．
2H2 O)12．5g，加水溶解并稀释至250ml。
(2)O．33％EDTA溶液称取磷酸氢二钠(Na2HPO4．12H2 0)0．73g、磷酸二氢钾
1．75g、氯化钠4．25g、乙二胺四乙酸二钠(EUFA-Na2·2H2O)1．65g、加水溶解并稀
释至500ml。
(3)血小板稀释液取3人份以上AB型血清混合，56℃灭能30分钟，按AB型血清
每100ml加硫酸钡50g的比例加人硫酸钡，置37℃吸附1小时，随时搅动，然后以每
分钟3000转离心30分钟，弃去沉淀，吸上清液备用。
试验当天按1份血清加3份生理氯化钠溶液配成血小板稀释液(注意AB型血清
中不得混有红细胞及溶血)。
(4)血小板悬液的制备采集人静脉血20ml，按5％EDTA溶液与全血以1：9的比例
混合，在20℃以每分钟800转离心15分钟，取上层血浆加0．33％EDTA溶液至原全
血体积，于20℃每分钟1500转离心10分钟，弃去上清液，如此再重复用O．33％
EDTA洗涤2次，弃上清液，向沉淀中加血小板稀释液0．5ml，混匀，计数并将血
小板浓度调至2．5×103～3．5×10 5／mm3即可(注意：计数时血小板悬液应在计数
板上静置2～3分钟，并在10分钟内计数完)。
供试品溶液的制备用生理氯化钠溶液将供试品进行2倍系列稀释至1：16。
阳性对照溶液的制备 取经人血小板免疫的猪血浆(或兔血清)0．5ml 60℃灭能
10分钟，用硫酸钡0．05g于37℃吸附15分钟后，以每分钟3000转离心20分钟，取
上清液备用。
阴性对照溶液 生理氯化钠溶液及血小板稀释液。
测定法取不同稀释度供试品溶液各O．1ml，分别加血小板悬液0．1ml，在37℃
保温30分钟后，滴到计数板上，静置2～3分钟，在20～40倍显微镜下观察结果。
本试验同时设阴性、阳性对照组。
(1)阳性对照取阳性对照溶液0．1ml，自“加血小板悬液O．1ml※’起，同法操作。
(2)阴性对照取阴性对照溶液0．1ml，自“加血小板悬液0．1ml”起，同法操作。
结果判定阳性对照为“++”；阴性对照为“-”试验成立。以“+”为判定终点，即以
供试品出现“+”的最高稀释度为该供试品的血小板抗体效价。
【附注】(1)“-”无凝块或偶见2～3个血小板成串。
(2)‘‘+’’小凝块，3～5个血小板凝集，游离血板少。
(3)“++’’大凝块，6个以上血小板聚集，几乎游离血小板。
页码数,2005版药典附录第36页
附录ⅥP人血液制品中糖及糖醇测定法
本法系用高效液相色谱法测定人血液制品中糖及糖醇含量。
照高效液相色谱法(附录ⅢB)测定。
色谱条件与系统适用性试验用苯乙烯一二乙烯基苯共聚物为基质的阳离子
交换色谱柱(H+)，粒度9μm或8μm，内径7．8mm，柱长300 mm；柱温50℃(测定蔗
糖含量时，柱温为20～30℃)；流动相为O．004mol／L硫酸溶液，流速为每分钟
O．8 m1；示差折光检测器。取2％麦芽糖lml和1．5％磺基水杨酸lml的混合物
20μ1，注入色谱柱，记录色谱图，麦芽糖与磺基水杨酸两峰间的分离度应大
于1．5，拖尾因子按麦芽糖峰计算应为O·95～1·20。
对照品溶液的制备 (1)麦芽糖对照品溶液分别取经减压干燥至恒重的麦芽糖
对照品1·Og、2·0g、3·og，精密称定，各置100ml量瓶中，分别加水溶解并稀释至
刻度，摇匀，即得。
(2)葡萄糖对照品溶液分别取经减压干燥至恒重的葡萄糖对照品0．5g、
1．Og、1．5g，精密称定，各置100ml 量瓶中，分别加水溶解并稀释至刻度，摇
匀，即得。
(3)山梨醇对照品溶液分别取经减压干燥至恒重的山梨醇对照品0．5g、
1．Og、1．5g，精密称定，各置100ml 量瓶中，分别加水溶解并稀释至刻度，摇
匀，即得。
(4)蔗糖对照品溶液分别取经减压干燥至恒重的蔗糖对照品1．Og、2．0g、
3．0g，精密称定，各置100ml量瓶中，分别加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即
得。
供试品溶液的制备精密量取供试品lml，加1．5％磺基水杨酸4．0ml，混匀，
室温放置至少2小时，以每分钟3000转离心10分钟，取上清液，即得。
测定法精密量取对照品溶液与供试品溶液，分别注.入液相色谱仪，记录色
谱图；进样量为20μ1。
以各对照品溶液浓度(mg)对峰面积作直线回归，求得回归方程，计算出供试
品溶液中糖或糖醇含量(A)，再按下列公式计算
供试品糖或糖醇含量(g／L)=A*n/进样量（ml）
式中 A为供试品溶液中糖或糖醇含量；
n为供试品稀释倍数。
【附注】 (1)根据供试品的糖含量，对照品和供试品的取量可作适当调整。
(2)直线回归相关系数应不低于O．999。
(3)不同厂家的阳离子交换色谱柱(H+)的流速、流动相、柱温等会有所不同，
可根据色谱柱说明书对色谱条件进行适当调整。
页码数,2005版药典附录第65页
附录ⅪA人用狂犬病疫苗效价测定法(NIH法)
本法系将供试品免疫小鼠后，产生相应的抗体，通过小鼠抗体水平的变化
测定供试品的免疫原性。
试剂 稀释液(PBS) 量取0．9％磷酸二氢钾溶液75ml、2．4％磷酸氢二钠
(Na2HP()4·12H20)溶液425ml、8．5％氯化钠溶液500ml，混合后加水至5000ml，调pH值
至7．2～8．O。
攻击毒株CVS制备启开毒种，稀释成10-2悬液，接种11～13g小鼠，不少于8只，
每只脑内接种0．03ml，连续传2～3代，选择接种4～5天有典型狂犬病症状的小
鼠脑组织，研磨后加入含2％马血清或小牛血清制成20％悬液，经每分钟1000转
离心10分钟，取上清液经病毒滴定(用10只18～20g小鼠滴定)及无菌检查符合规定
后作攻击毒用。
参考疫苗的稀释 参考疫苗用PBS稀释成1：25、1：125和1：625等稀释度。
供试品溶液的制备供试品用PBS做5倍系列稀释，一般稀释成
1：5、1：25、1：125和1：625等稀释度。
测定法用不同稀释度的供试品及参考疫苗分别免疫14～16g小鼠16只，每只
小鼠腹腔注射0．5ml，间隔1周再免疫1次。
小鼠于第一次免疫后14天，用经预先测定的含5～100个LD50的病毒量进行脑
内攻击，每只0．03ml。同时将攻击毒稀释成1、10-1、10-2和10-3进行毒力滴定，
每个稀释度均不少于8只小鼠。小鼠攻击后逐日观察14天，并记录死亡情况，统
计第5天后死亡和呈典型脑症状的小鼠。
页码数,2005版药典附录第69页
附录ⅪH肉毒抗毒素效价测定法(小鼠试验法)
本法系根据抗毒素能中和毒素的作用，将供试品与标准品做系列稀释，分
别与肉毒毒素结合后，注入小鼠体内，在规定时问内观察小鼠存活和死亡情
况，以测定供试品效价。
试剂稀释液称取磷酸二氢钾0．7g、磷酸氢二钠(Na2 HP04·12H20)2．4g、氯化
钠6．8g，用注射用水溶解并稀释至1000ml，加明胶2．0g，溶解后过滤。灭菌后
pH值应为6．2～6．8。
肉毒抗毒素标准品溶液的制备将肉毒抗毒素标准品用生理氯化钠溶液溶解
后，与中性甘油(经116℃ 10分钟灭菌)等量混合，稀释至一定浓度，于2～8℃避
光处保存。使用前，将肉毒抗毒素标准品溶液用稀释液稀释至每lml含效价如测
定参数表所示。原液的一次吸取量应不低于0．5ml。
肉毒毒素溶液的制备 肉毒毒素由国家药品检定机构提供，亦可自备。试验
用的肉毒毒素须以国家药品检定机肉毒抗毒素效价测定参数表构分发的肉毒抗
毒素标准品准确标定其试验量(见测定参数表)，并每3个月复检1次。使用前，将
肉毒毒素用稀释液稀释至每lml含5个毒素试验量。
供试品溶液的制备供试品用稀释液稀释成数个稀释度，使每lml约含测定参数
表所示单位。稀释度之间隔约为5％～10％。
测定法精密量取肉毒抗毒素标准品溶液O．8ml、1．0ml、1．2m1分别加入小试
管中，再依次分别补加稀释液O-7ml、O．5ml、O．3ml。精密量取不同稀释度的供
试品溶液各1．0m1分别加入小试管中，每管补加稀释液0．5ml。以上各管分别加
入肉毒毒素稀释液1．0ml，混合均匀，加塞，37℃结合45分钟，按测定参数表所
示剂量与途径，立即注射体重14～16g小鼠，每稀释度注射小鼠4只。
结果判定注射后，每天上、下午各观察试验动物1次，并记录发病及死亡情
况，连续4天。以标准品组动物50％死亡终点比较供试品组动物的50％保护终
点，推算供试品的效价。
有下列情况之一者应重试：
(1)标准品组动物无死亡或全死亡，而无法计算50％死亡终点；
(2)供试品组动物无死亡或全死亡，而无法计算50％保护终点；或死亡极不规
律或死亡极不规律
(3)每稀释度注射的动物中有2只以上属非特异死亡。
【附注】(1)自备毒素的制法(包括菌种、培养基、培养条件及干燥方法等)应
与国家药品检定机构分发者相同。
(2)使用干燥毒素时，须精密称定，每次称量应不低于10mg，溶解后应一次用
完。剩余的干燥毒素应封存于装有干燥剂的真空器皿中。亦可用干燥毒素制成
液体毒素，即干燥毒素以生理氯化钠溶液溶解，与中性甘油(经116℃ 10分钟灭
菌)等量混合，每lml至少含20个试验量。毒素应保存于2～8℃避光处。
页码数,2005版药典附录第8页
附录I G软膏剂、乳膏剂
软膏剂系指以生物制品原液或经干燥后制成的干粉为原料药物，与油脂性
或水溶性基质混合制成的半固体外用制剂。因药物在基质中分散状态不同，有
溶液型软膏剂和混悬型软膏剂之分。溶液型软膏剂为药物溶解(或共熔)于基质
或基质组分中制成的软膏剂；混悬型软膏剂为药物细粉均匀分散十基质中制成
的软膏剂。
乳膏剂 系指以生物制品原液或经十燥后制成的干粉为原料药物，分散或溶
解于乳液型基质中形成均匀的半固体外用制剂。乳膏剂由于基质不同，可分为
水包油型乳膏剂与油包水型乳膏剂。
软膏剂、乳膏剂在生产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产和质量控制应符合相关品种
要求。
二、软膏剂、乳膏剂选用基质应根据各剂型的特点、药物的性质、制剂的
疗效和产品的稳定性。基质也可由不同类型基质混合组成。
软膏剂的基质可分为油脂性基质和水溶性基质，油脂性基质常用的有凡士
林、石蜡、液状石蜡、硅油、蜂蜡、硬脂酸、羊毛脂等。水溶性基质主要有聚
乙二醇。
乳膏剂基质可分为水包油型乳化剂与油包水型乳化剂。水包油型乳膏剂常
用乳化剂有钠皂、三乙醇胺皂类、脂肪醇硫酸(酯)钠类(十二烷基硫酸钠)和聚山
梨酯类。油包水型乳膏剂常用乳化剂有羊毛脂、单甘油酯、脂肪醇等。
三、软膏剂与乳膏剂基质应均匀、细腻，涂于皮肤或黏膜上应无刺激性。
混悬型软膏剂中不溶性固体药物成分，应预先用适宜的方法磨成细粉，确保粒
度符合规定。
四、软膏剂与乳膏剂根据需要可加入保湿剂、防腐剂、增稠剂、抗氧剂及
透皮促进剂。
五、软膏剂、乳膏剂用于大面积烧伤及严重损伤的皮肤时，基质与产品
均应进行无菌处理。
六、软膏剂、乳膏剂应具有适当的黏稠度。应易涂布于皮肤或黏膜上，
不融化，黏稠度随季节变化应很小。
七、软膏剂与乳膏剂应无酸败、异臭、变色、变硬，乳膏剂不得有油水
分离现象。
八、软膏剂、乳膏剂所用内包装材料，不应与药物或基质发生物理化学
变化，无菌产品的内包装材料应无菌。
九、除另有规定外，软膏剂、乳膏剂应置2～8℃避光密闭保存和运输。
软膏剂、乳膏剂应进行以下相应检查。
【粒度】 除另有规定外，混悬型软膏剂取适量的供试品，涂成薄层，薄
层面积相当于盖玻片面积，共涂三片，照粒度测定法(附录V G)检查，均不得检
出大于180μm的粒子。
【装量】 照最低装量检查法(附录V F)检查，应符合规定。
【微生物限度】 照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符合规定。
凡规定进行无菌检查的软膏剂、乳膏剂可不进行微生物限度检查。
【无菌】 除另有规定外，软膏剂与乳膏剂用于大面积烧伤及严重损伤的
皮肤时，照无菌检查法(附录ⅫA)检查，应符合规定。
页码数,2005版药典附录第35页
附录Ⅵo三氯甲烷测定法
本法系将三氯甲烷经乙醚提取后，加入碱性吡啶，水浴加温生成红色化合
物，用比色法测定供试品中三氯甲烷含量。
测定法精密量取供试品lml，置5ml量瓶中，加水稀释至刻度，即为供试品
溶液。精密量取供试品溶液O．5ml，置具塞试管中，加无过氧化物的乙醚18ml，
猛烈振摇3分钟，静置。精密量取乙醚提取液5ml置具塞试管中，加碱性吡啶[取
20％氢氧化钠溶液与吡啶以2：5(ml／m1)混合，振摇至呈碱性，放置分层，取上
清液，如吡啶显红色，需重蒸馏。临用配制]5ml，混匀，置80~C水浴中加热8分
钟，取出后用水冷却，加水至12ml,充分振摇，静置分层，倾去上层液，照紫
外一可见分光光度法(附录ⅡA)在波长520nm处测定吸光度。
精密量取三氯甲烷lml，置100ml量瓶中，用乙醇稀释至刻度，临用前，用水
定量稀释至0．1％，即为对照品溶液。精密量取三氯甲烷对照品溶液0·lml、
0·2ml、O．3ml、O．4ml、O．5ml，分别置于5支具塞试管中，加水至o．5ml，自"加
无过氧化物的乙醚18ml"起，同法操作，测定各管的吸光度。
以三氯甲烷对照品溶液的系列浓度对相应的吸光度作直线回归，将供试品
溶液的吸光度代人回归方程，测定供试品中三氯甲烷含量。
【附注】 (1)配制碱性吡啶的氢氧化钠须不含碳酸钠，否则有浑浊现象。
(2)可用于限量试验。
书页号：2005版药典三部附录10页
附录I K散剂
散剂 系指以生物制品原液经干燥后制成的干粉为原料药物或加入适宜辅料
经粉碎、均匀混合制成的干燥粉末状制剂。
口服散剂一般溶于或分散于水、稀释液或其他液体小服用，亦可直接用水
送服。
散剂在生产和贮藏期间应符合卜列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产及质量控制应符合相关品种
要求。
二、供制散剂的成分应经干燥、制成干粉并粉碎成细粉。散剂应干燥、疏
松、混合均匀、色泽一致。
三、散剂中可含有或不含辅料。口服散剂需要时亦可加矫味剂、芳香剂、
着色剂等。
四、为防止胃酸对散剂中活性成分的破坏，散剂稀释剂中可调配中和胃酸
的成分。
五、散剂可单剂量包装也可多剂量包(分)装，多剂量包装者应附分剂量的用
具。
六、含挥发性药物或可吸潮药物的散剂应采用防潮材料包装。
七、除另有规定外，散剂应置2～8℃密封贮存和运输。
散剂应进行以下相应检查。
【粒度】 除另有规定外，取供试品10 g，精密称定，置七号筛(125μm)，筛上
加盖，并在筛下配有密合的接受容器。照粒度测定法(附录V G)单筛分法检查。
精密称定通过筛网的粉末重量，应不低于95％。
【外观均匀度】 取供试品适量，置光滑纸上，平铺约5cFn2，将其表面压平，
在亮处观察，应呈现均匀的色泽、无花纹与色斑。
【干燥失重】 除另有规定外，取供试晶照干燥失重测定法(附录ⅦL)测定，
在105℃干燥至恒重，减失重量不得过2．0％。
【装量差异】 单剂量包装的散剂装最差异限度，应符合规定。
检查法取散剂10包(瓶)，除去包装，分别精密称定每包(瓶)内容物的重量，
求出内容物的装量与甲均装量，每包(瓶)装量与甲均装量相比较r凡无含量测
定的散剂，每包(瓶)装量应与标示装量相比较]，超出装量差异限度的散剂小
得多于2包(瓶)．并不得有1包(瓶)超出装量差异限度的1倍。
凡规定检查含量均匀度的散剂，检查。
【装量】 多剂量包装的散剂，(附录V F)检查，应符合规定。可不进行装量
差异的照最低装量检查法
【微生物限度】 除另有规定外，照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符
合规定。
凡规定做杂菌检查的散剂不进行本项检查。
页码数,2005版药典附录第15页
附录Ⅲ 色谱法
色谱法根据其分离原理可分为：吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法
与排阻色谱法等。吸附色谱法是利用被分离物质在吸附剂上吸附能力的不同，
用溶剂或气体洗脱使组分分离；常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸
附活性的物质。分配色谱是利用被分离物质在两相中分配系数的不同使组分分
离，其中一相被涂布或键合在固体载体上，称为固定相，另一相为液体或气
体，称为流动相；常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。
离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上交换能力的不同使组分分
离；常用的树脂有不同强度的阳离子交换树脂、阴离子交换树脂，流动相为水
或含有机溶剂的缓冲液。分子排阻色谱法又称凝胶色谱法，是利用被分离物质
分子大小的不同导致在填料上渗透程度不同使组分分离；常用的填料有分子
筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，根据固定相和供试品的
性质选用水或有机溶剂作为流动相。
色谱法又可根据分离方法分为：纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色
谱法、高效液相色谱法等。所用溶剂应与供试品不起化学反应，纯度要求较
高。分析时的温度，除气相色谱法或另有规定外，系指在室温操作。分离后各
成分的检出，应采用各品种项下所规定的方法。采用纸色谱法、薄层色谱法或
柱色谱法分离有色物质时，可根据其色带进行区分；分离无色物质时，可在短
波(254nm)或长波(365nm)紫外光灯下检视，其中纸色谱或薄层色谱也可喷以显色剂
使之显色，或在薄层色谱中用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光猝灭法检
视。柱色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法可用接于色谱柱出口处的各种检
测器检测。柱色谱法还可分部收集流出液后用适宜方法测定．
页码数,2005版药典附录第45页
附录ⅧH伤寒Vi多糖分子大小测定法
本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数(KD)和多糖在规定KD值
以前的回收率。
试剂、色谱柱的制备与色谱柱标定 同附录ⅧG第二法。
测定法取供试品约lml(含多糖抗原3～5mg)，加于已标定的色谱柱中，用流动
相洗脱，流速为每小时15～20 m1，用组分收集器收集洗脱液，每管3～5ml。照
O-乙酰基含量测定法(附录ⅥF)，测定每管洗脱液中O-乙酰基的含量，求出O-乙
酰基含量最高时的洗脱体积，即为多糖主峰峰顶洗脱体积Ve。
按下式计算
KD=Ve-Vo/Vi-V0
式中KD为供试品分配系数；
Ve为供试品洗脱液体积，ml；
Vo为空流体积，ml；
Vi为柱床体积，ml。
计算供试品在KD值≤0．25的多糖回收率
Rx(％)=Ax/At×100％
式中Rx为KD值≤0．25供试品的多糖回收率(％)；
Ax为供试品在KD值≤0．25各管洗脱液等体积合并液的O-乙酰基含量；
At为供试品所有管洗脱液等体积合并液的0-乙酰基含量。
【附注】 过柱操作在10～20℃进行。
页码数,2005版药典附录第28页
附录V H渗透压摩尔浓度测定法
溶剂通过半透膜由低浓度溶液向高浓度溶液扩散的现象称为渗透，阻止渗
透所需施加的压力，称为渗透压。生物膜，例如人体的细胞膜或毛细血管壁，
一般具有半透膜的性质。在制备注射剂、滴眼剂等药物制剂时，必须考虑其渗
透压。对静脉输液、营养液、电解质或渗透利尿药(如甘露醇注射液)，应在标
签上注明溶液的渗透压摩尔浓度，以提供临床医生参考。
渗透压摩尔浓度的单位，通常以每千克溶剂中溶质的毫渗透压摩尔来表示，
可按下列公式计算毫渗透压摩尔浓度(mOsmol／kg)：
毫渗透压摩尔浓度(mOsmol／kg)一[每千克溶剂中
溶解溶质的克数／分子量]*n * 1000
式中，n为一个溶质分子溶解时形成的粒子数。在理想溶液中，例如葡萄糖
n=1，氯化钠或硫酸镁n=2，氯化钙n=3，枸橼酸钠n=4。
在生理范围及很稀的溶液中，其渗透压摩尔浓度与理想状态下的计算值偏差
较小；随着溶液浓度的增加，与计算值比较，实际渗透压摩尔浓度下降。例如
0．9％氯化钠注射液，按上式计算，毫渗透压摩尔浓度是2×1000×9／
58．4=308mOsmol／kg，而实际上在此浓度时氯化钠溶液的n稍小于2，其实际测得
值是286mOsmol／kg；复杂混合物，如水解蛋白注射液的理论渗透压摩尔浓度不
容易计算，因此通常采用实际测定值表示。
仪器 通常采用测量溶液的冰点下降来间接测定其渗透压摩尔浓度。在理想
的稀溶液中，冰点下降符合△Tf=Kf·m的关系，式中，△Tf为冰点下降，Kf为冰
点下降常数(当水为溶剂时为1．86)，m为重量摩尔浓度。而渗透压符合P0=Ko·m
的关系，式中，P。为渗透压，K。为渗透压常数，m为溶液的重量摩尔浓度。
由于两式中的浓度等同，故可以用冰点下降法测定溶液的渗透压摩尔浓度。
常用的所谓渗透压计即是采用冰点下降的原理设计的。
渗透压计由一个供试溶液测定试管、带有温度调节器的冷却装置和一对热
敏电阻组成。测定时将探头浸入试管的溶液中心，并降至冷却部分同时启动
冷却装置，使溶液结冰，仪器具有将被测得的温度(冰点)转换为电信号并显示
测量值的系统。
毫渗透压摩尔浓度的测定用一定体积(按仪器说明书规定)的水(新鲜制备)调
节零点，由下表选择两种校正用标准液(它们的渗透压摩尔浓度应跨于供试品
预计值的两侧)校正仪器，再测定供试溶液的毫渗透压摩尔浓度(或冰点下降)。
当供试溶液的毫渗透压摩尔浓度大于仪器的测定范围时，用适宜的溶剂稀释至
可测定的毫渗透压摩尔浓度范围内；供试品若为固体，先溶解于适宜的溶剂
中，再进行测定。
渗透压计校正用标准溶液的制备 按照表中所列数据，精密称取经500～650℃
干燥40～50分钟并置干燥器(硅胶)中放冷的氯化钠(基准试剂)一定量，加水lkg
溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。
┏━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━━━━┓
┃ 每lkg水中氯化 ┃毫渗透压摩尔浓度 ┃ 冰点下降 ┃
┃ 钠的重量／g ┃ ／mOsmol·kg-1 ┃ ／℃ ┃
┣━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━━━┫
┃ 3．087 ┃ 100 ┃ O．186 ┃
┃ 6．260 ┃ 200 ┃ O．372 ┃
┃ 9．463 ┃ 300 ┃ O．558 ┃
┃ 12．684 ┃ 400 ┃ O．744 ┃
┃ 15．916 ┃ 500 ┃ O．930 ┃
┃ 19．147 ┃ 600 ┃ 1．116 ┃
┃ 22．380 ┃ 700 ┃ 1．302 ┃
┗━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━━━━━┛
毫渗透压摩尔浓度比的测定 供试品与0．9％(g／m1)氯化钠溶液的毫渗透压
摩尔浓度比率称为毫渗透压摩尔浓度比。用渗透压计分别测得供试品与标准溶
液的毫渗透压摩尔浓度OT与0s，并用下列公式计算毫渗透压摩尔浓度比：
毫渗透压摩尔浓度比=OT/OS
毫渗透压摩尔浓度比测定用标准溶液的制备 精密称取经500～650~C干燥
40～50分钟并置干燥器(硅胶)中放冷的氯化钠(基准试剂)0．900g，置100ml量瓶中，
加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
注射剂、滴眼剂等制剂处方中的氯化钠，其作用若主要为调节制剂的渗透
压，则可通过渗透压摩尔浓度的测定取代氯化钠的定量测定。
页码数,2005版药典附录第93页
附录XIIIC实验动物寄生虫学检测要求
本标准(引自GB 14922．1—2001)适用于地鼠、豚鼠、兔、犬、猴和清洁级及以
上小鼠、大鼠。
1．实验动物寄生虫学等级
(1)普通级动物Conventioml(CV)Animal不携带所规定的人兽共患寄生虫。
(2)清洁动物clean(CL)Animal 除普通动物应排除的寄生虫外，不携带对动物危害
大和对科学研究干扰大的寄生虫。
(3)无特定病原体动物Specific Pathogen Free(SPF)Animal除普通动物，清洁动物应排
除的寄生虫外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的寄生虫。
(4)无菌动物Garm Free(GF)Animal无可检出的一切生命体。
2．检测要求
(1)外观指标动物应外观健康，无异常。
(2)寄生虫学指标寄生虫学指标见表1、表2和表3。
表1小鼠和大鼠寄生虫学检测指标
动物等级 应排除寄生虫项目 动物种类
小鼠大鼠
无无 清 体外寄生虫(节肢动物)Ectoparasites ●●
菌特 洁 弓形虫Toxoplasma gondii ●●
动定 动 兔脑原虫Encephalitozoon cuniculi O O
物病 物 卡氏肺孢子虫Pneumocystis carinii O O
原 全部蠕虫All Helminths ●●
体 鞭毛虫Flagellates ●●
动 纤毛虫Ciliates ● ●
物
无任何可检测到的寄生虫 ● ●
注：●必须检测项目，要求阴性；o必要时检测项目，要求阴性。
表2豚鼠、地鼠和兔寄生虫学检测指标
动物等级 应排除寄生虫项目 动物种类
无无清 体外寄生虫(节肢动物)Ectopara- ● ●●
菌特洁 sites
动定动 弓形虫Toxoplasma gondii ● ●●
物病物 兔脑原虫Encephalitozoon cuniculi o o
原 爱美尔球虫Eimaria spp,o o
体 卡氏肺孢子虫Pneumocystis carinii ●
全部蠕虫 All Helminths ● ●●
鞭毛虫Flagellates ● ●●
纤毛虫Ciliates ●
无任何可检测到的寄生虫
注：●必须检测项目，要求阴性；o必要时检测项目，要求阴性。
表3犬和猴寄生虫学检测指标
动物等级 应排除寄生虫项目 动物种类
犬猴
无 普 体外寄生虫(节肢动物)Ectoparasites ●●
特 通 弓形虫Toxoplasma gondii ●●
定 动 全部蠕虫All Helminths ●●
病 物 溶组织内阿米巴 Entamoeba spp,O ●
原 疟原虫Plasmodium spp,●
体 鞭毛虫Flagellates ●●
注：●必须检测项目，要求阴性；o必要时检测项目，要求阴性。
页码数,2005版药典附录第92页
附录ⅫB实验动物微生物学检测要求
本标准(引自GB 14922．2—2001)适用于豚鼠、地鼠、兔、犬、猴和清洁级及以
上小鼠、大鼠。
1．实验动物微生物学等级分类
(1)普通级动物Conventional(CV)Animal 不携带所规定的人兽共患病病原和动物烈
性传染病的病原。
(2)清洁动物C1earl(CL)Animal除普通动物应排除的病原外，不携带对动物危害大
和对科学研究干扰大的病原。
(3)无特定病原体动物Specfic Pathogen Free(SPF)Animal除清洁动物应排除的病原外，
不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原。
(4)无菌动物Germ Free(GF)Anirnal无可检出的一切生命体。
2．检测要求
(1)外观指标动物应外观健康、无异常。
(2)病原菌指标 病原菌指标见表1、表2和表3。
(3)病毒指标病毒指标见表4、表5和表6。
附录92
表1小鼠、大鼠病原菌检测项目
动物等级 病 原 菌 动物种类
无无清 小鼠大鼠
菌特洁 沙门菌Salmonella spp,● ●
动定动 单核细胞增生性李斯特杆菌Listeria mono—o o
物病物 cytogenes
原 假结核耶尔森菌Yersinia pseudotuberculosis o o
体 小肠结肠炎耶尔森菌Yersinia enterocolitica o o
动 皮肤病原真菌Pathogenicdermal fungi o o
物 念珠状链杆菌Streptobacillusmoniliformis o o
支气管鲍特杆菌Bordetellabronchiseptica ●
支原体Mycoplasma spp,● ●
鼠棒状杆菌Corynebacterium kutscheri ● ●
泰泽病原体Tyzzer’s orgamnism ● ●
大肠埃希菌0115 a，C，K(B)Escherchia coli o
0115 a,C,K(B)
嗜肺巴斯德杆菌Pasteurella pneumtropica ● ●
肺炎克雷伯杆菌Klebsiella pneumomae ● ●
金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ● ●
肺炎链球菌Streptococcus pnemoniae o o
乙型溶血性链球菌Streptococcushemdytis-β o o
绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa o o
无任何可查到的细菌 ● ●
注：●必须检测项目，要求阴性；o必要时检查项目，要求阴性。
表2豚鼠、地鼠、兔病原菌检测项目
动物等级 病原菌 动物种类
豚鼠地鼠兔
无 无清普 沙门菌Salmonella spp,● ●●
菌 特 洁通 单核细胞增生性李斯特杆菌Liste o o o
动 定动级 ria monocytogenes
物 病 物动 假结核耶尔森菌Yersinia pseudo- o o o
原 物 tuberculosis
体 小肠结肠炎耶尔森菌Yersinia e- o o o
动 terocolitica
物 皮肤病原真菌Pathogenk"dental fungi o o o
念珠状链杆菌Strepto~llus monili— o o
formis
多杀巴斯德杆菌Pasteurella multocida ● ●
支气管鲍特杆菌Bordetella bron- ●
chiseptica
泰泽病原体Tyzzer’s organism ● ●●
嗜肺巴斯德杆菌Pasteurella pneumo- ● ●●
opica
肺炎克雷伯杆菌Klebsiella pnewmoniae ● ●●
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ● ●●
肺炎链球菌Streptococcus pnemoniae o o o
乙型溶血性链球菌Streptococcus hem- ● o o
dytis-β
绿脓杆菌Pseudomoms aeruginosa ● ●●
无任何可查到的细菌 ● ●●
注：●必须检测项目，要求阴性；O必要时检查项目，要求阴性。
表3犬、猴病原菌检测项目
动物等级 病原菌 动物种类
无普 犬猴
特通 沙门菌Salmonella spp,●●
定级 皮肤病原真菌Pathogenic dermal fungi ●●
病动 布鲁杆菌Brucella spp,●
原物 钩端螺旋体Leptospira spp,△
体 志贺菌Shigella spp,●
动 结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis ●
物
钩端螺旋体1）Leptospira spp,●
小肠结肠炎耶尔森菌Yersinia enterocolitica o o
空肠弯曲杆菌CamPYlobaceter jeiuni o o
注：●必须检测项目，要求阴性；o必要时检测项目，要求阴
性；△必要时检测项目，可以免疫。1)不能免疫，要求阴性。
表4小鼠、大鼠病毒检测项目
动物等级 病 毒 动物种类
小鼠大鼠
无无清 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒Lymphocytic O
菌特洁 Choriomeningitis Virus(LCMV)
动定动 汉坦病毒 Hanta Virus(HV) O●
物病物 鼠痘病毒 Ectromelia Hepatitis Virus(MHV) ●
原 小鼠肝炎病毒Mouse HepatitisVirus(MHV) ●
体 仙台病毒sendai Virus(SV) ●●
动
物
小鼠肺炎病毒Pneumon Virus of Mice ●●
(PVM)
呼肠孤病毒Ⅲ型Reovirus TypeⅢ(Reo_3) ●●
小鼠细小病毒Minute Virus of MIce(MVM) ●
小鼠脑脊髓炎病毒Theiler※s Mouse Encepha- O
lomyelitis Virus(TMEV)
小鼠腺病毒Mouse Adenovirus(Mad) O
多瘤病毒Rolyoma Virus(POLY) O
大鼠细小病毒RV珠Rat Parvovirus(KRV) ●
大鼠细小病毒H-1株RatParvovirus(H-1) ●
大鼠冠状病毒／大鼠涎泪腺炎病毒Rat Coro- ●
navirus(RCV)/Sialodacryoadenitis Virus(SDAY)
无任何可查到的病毒 ●●
注：●必须检测项目，要求阴性；O必要时检查项目，要求阴性。
表5豚鼠、地鼠、兔病毒检测项目
动物等级 病 毒 动物种类
豚鼠地鼠兔
无 无清普 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒Lympho- ●●
菌特 洁通 cytic Choriomeningtis Virus(LCMV)
动定动动 兔出血症病毒Rabbit H~rrhagic Dis-
物病物物 物easeⅥms(RHDV) ▲
原 仙台病毒Sendai Vmas(SV) ●●
体 兔出血症病毒1)Rabbit Hemorrhagic Dis ●
动 ease Virus(RHDV)
物 仙台病毒Sendai Virus(SV) ●
小鼠肺炎病毒Pneumonia Virus of Mice ●●
(PVM)
呼肠孤病毒Ⅲ型Reovirus TypeⅢ(Reo-3) ●●
轮状病毒Rotavirus(RRV)
无任何可查到的病毒 ●●●
注：●必须检测项目，要求阴性；▲必须检测项目，可以免疫。
1)不能免疫，要求阴性。
表6犬、猴病毒检测项目
动物等级 病 毒 动物种类
无 普 犬 猴
特 通 狂犬病病毒Rabies Virus(RV) ▲
定 级 犬细小病毒Canine Parvovirus(CPV) ▲
病 动 犬瘟热病毒Canine Distemper virus(CDV) ▲
原 物 传染性犬肝炎病毒Infectious Canine Hepati- ▲
体 tis Virus(ICHV)
动 猕猴疱疹病毒1型(B病毒)Cercopithecine ●
物 Herpesvirus Type 1(BV)
猴逆转D型病毒Simian Retrovirus D(SRV) ●
猴免疫缺陷病毒Simian Immunodeficiency ●
Virus(SIV)
猴T细胞趋向性病毒I型Simian T Lympho- ●
tropic Virus Type 1(STLV-1)
猴痘病毒Simian Pox Virus(SPV) ●
上述4种犬病毒不免疫 ●
注：●必须检测项目，要求阴性；▲必须检测项目，要求免疫。
页码数,2005版药典附录第52页
附录ⅨL 鼠IgG残留量测定法
本法系用酶联免疫法测定经单克隆抗体亲和层析方法纯化的重组制品中残
留鼠IgG含量。
试剂 (1)包被液(pH9．6碳酸盐缓冲液) 取碳酸钠0．32g、碳酸氢钠O．586g，
加水溶解并稀释成200ml。
(2)PBS(pH7．4) 取氯化钠8．Og、氯化钾0．20g、磷酸氢二钠1．44g、磷酸二氢
钾O．24g加水溶解并稀释成1000ml，121℃灭菌15分钟。
(3)洗涤液(PBS-Tween20) 量取聚山梨酯20O．5ml，加PBS至1000ml。
(4)稀释液取牛血清白蛋白O．5g，加洗涤液溶解并稀释成100ml。 -
(5)底物缓冲液(枸橼酸PBS) 取磷酸氢二钠(Na2 HP04·12H2 0)1．84g、枸橼酸
O．51g，加水溶解并稀释成100ml。
(6)底物液 取邻苯二胺8mg、30％过氧化氢溶液30μl，溶于底物缓冲液20ml
中。(用前配制。)
标准品溶液的制备按使用说明书用适量水复溶鼠IgG标准品。精密量取适
量，用稀释液稀释成每lml中含100ng、50ng、25ng、12．5ng、6．25ng、3．13ng的溶
液。
供试品溶液的制备取供试品适量，用稀释液稀释成每lml中含一个成品剂量
(如未能确定制剂的规格，则按成品的最大剂量计算)的溶液。
测定法取山羊抗鼠IgG抗体适量，用包被液稀释成每lml含10μg的溶液；以
100μ1／孔加至96孔酶标板内，40C放置过夜(16～18小时)，用洗涤液洗板3次；用
洗涤液制备l％牛血清白蛋白溶液，以200／11／孔加至板内，37℃封闭2小时，将
封闭好的酶标板用洗涤液洗3次，以lOOμl／孔加标准品溶液和供试品溶液，
37℃放置1小时，将封闭好的酶标板用洗涤液洗3次；按使用说明书用稀释液稀
释辣根过氧化物酶标记的绵羊抗鼠]gG抗体，以100μ1／孔加至板内，37℃放置
30分钟，用洗涤液洗板3次；以50ul／孔加入底物液，37℃避光放置20分钟，以
50μl／孔加入终止液(1mol／L硫酸溶液)终止反应。用酶标仪在波长492nm处测定
吸光度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作图法计
算。
以标准品溶液吸光度对相应的浓度作标准曲线，线性回归的相关系数应大
于O．995。以供试品溶液吸光度在标准曲线上读出相应的鼠IgG残留量。
供试品的鼠IgG残留量(ng／剂量)=C*D*F/T
式中 c为供试品溶液鼠IgG残留量，ng／ml，
D为供试品溶液的稀释倍数；
F为成品的剂量规格，IU／剂量或μg/剂量；
T为供试品的效价或主成分蛋白含量，IU／m1或 μg／ml。
书页号：2005版药典三部附录89页
附录XII H 鼠源性病毒检查法
鼠源性单抗体制品具有潜在病毒污染，如流行性出血热病毒、淋巴细胞脉
络丛脑膜炎病毒、3型呼肠孤病毒、仙台病毒、脱脚病病毒、小鼠腺病毒、小
鼠肺炎病毒、逆转录病毒等。其中前四种病毒属I组，为能够感染人与灵长类
动物的病毒；后四种属Ⅱ组，为目前尚无迹象表明感染人的病毒，但能在体外
培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类具有潜在危险陛，这些病毒应
作为重点进行检测。
本法用于杂交瘤细胞株及鼠源性单抗制品的鼠源性病毒检测。通过细胞试
验、动物抗体产生试验、鸡胚感染试验等检测活病毒抗原及病毒抗体。
试剂(1)0．01mol／L pH7．4 PBS称取磷酸氢二钠(Na2 HP04·12H20)2．9g、磷酸二氢
钠0．2g、氯化钠8．Og、氯化钾0．2g，加水溶解并稀释至1000ml。
(2)pH9．6包被缓冲液称取碳酸钠1．59g、碳酸氢钠2．93g、叠氮钠O．20g，
加水溶解并稀释至1000ml。
(3)O．01mol／L pH7．4 PBS洗液称取磷酸氢二钠(Na2 HP04·12H20)2．9g、磷酸二
氢钠O．295g、氯化钠8．5g、聚山梨酯80 5ml，加水溶解并稀释至1000ml。
(4)底物缓冲液 称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)12．9g、枸橼酸3．26g，加水溶
解，并稀释至700ml。
(5)底物溶液称取邻苯二胺4mg，溶于底物缓冲液10ml中，再加入30％过氧化氢
4μl。
(6)终止液lmol／L硫酸溶液。
供试品的制备供试品包括杂交瘤细胞株、腹水和单抗半成品或成品。杂交
瘤细胞株应进行细胞试验、动物抗体产生试验和鸡胚感染试验；腹水和单抗半
成品或成品应进行动物抗体产生试验和鸡胚感染试验。
(1)细胞试验用的供试品取3瓶生长良好的杂交瘤细胞，于一40℃反复冻融3次
后，在无菌条件下合并分装小管，每管3ml，换上胶塞，一40℃保存。
(2)动物抗体产生试验用的供试品单抗腹水、半成品或成品，不需处理，-20℃
保存。而杂交瘤细胞按下述步骤进行处理后使用。
取7瓶生长良好的杂交瘤细胞，弃去培养液，用PBS轻轻将细胞吹打下来，移
入小管，再用PBS冲洗细胞瓶，以收集残余的细胞。于小管中洗涤，每分钟1000
转离心10分钟，弃去上清液，用PBS重新悬浮细胞，以上步骤重复2次。细胞集
中后，悬浮于4mlPBS中。冻融3次，超声波处理。每分钟10 000转离心30分钟，吸
取上清液，每分钟40 000转离心4小时，弃上清液，将沉淀溶于适量的PBS中，即
为动物抗体产生试验用抗原。一40℃保存。
检查法检查方法包括细胞试验、动物抗体产生试 验、鸡胚感染试验等。
1．细胞试验
用已知病毒抗体检查供试品中未知病毒抗原。
(1)细胞培养根据被检的病毒，选择其敏感的细胞。每种细胞6瓶，细胞应生长
良好。用O．01mol／LpH7．4 PBS洗细胞2次。每瓶接种供试品O．3m|，每批供试
品接种4瓶，另外2瓶为对照。37℃吸附1小时，弃去吸附的供试品液体，加入细
胞维持液。每天观察细胞形态，并记录结果。接种后每隔3～4天换一次液。第
一代细胞应维持10～14天。冻融3次后，将对照组2瓶、供试品组4瓶分别合并。
将收获的对照组和供试品组的细胞悬液分别接种同种细胞，接种后，每隔3～4
天，换一次液。
(2)涂片 培养至10～14天，吸出维持液，再用PBS洗细胞2次，每瓶加消化液
O．15ml，使细胞分散、脱壁，吸出细胞悬液，再用PBS洗涤2次。用适量的PBS
悬浮细胞，将对照组的正常细胞涂在抗原片的第一行，供试品组的细胞涂在第
二行，吹干，丙酮固定,-40℃保存，即为供试品细胞涂片。
(3)间接免疫荧光法检测制备已知病毒抗原片，将已知特异性阳性血清和阴性
血清进行1：5～1：20的稀释；应用制备的已知病毒抗原片作为血清对照，检查
供试品细胞涂片。将涂有供试品细胞的玻片，加经PBS 10倍稀释的已知阳性血
清、阴性血清，置湿盒中，37℃放置30分钟后，用PBS洗涤3次，每次浸泡5分
钟，待干燥后，滴加荧光抗体，37℃保温30分钟后，用PBS洗涤3次，每次浸泡
5分钟，再用水洗1次，待干燥后，加50％甘油，用盖玻片封好，镜检。
(4)结果判定在已知病毒抗原片上，阴性对照血清与正常细胞孔、病毒细胞孔
无荧光，阳性对照血清与正常细胞孔无荧光、与病毒细胞孔有荧光；在供试品
细胞涂片上，阴性对照血清与正常细胞孔、供试品细胞孔无荧光，阳性对照血
清与正常细胞孔无荧光时，试验成立。阴性对照血清与正常细胞孔和供试品细
胞孔有荧光反应或阳性对照血清与正常细胞孔有荧光反应，试验不成立。供试
品细胞涂片上，阳性对照血清与供试品细胞孔有荧光判为阳性。
2．动物抗体产生试验
(1)供试品抗体的制备每批供试品按下表参数注射无特定病原体小鼠
(BALB／c或KM)共50只。
(2)血清学检查对经肌内注射和腹腔注射的供试品组和对照组小鼠分别采血，
分离血清后用ELISA法检测抗体。包被病毒抗原和正常细胞抗原，每孔O．1ml，
置37℃ l小时后，放4℃过夜，用洗液充分洗涤，拍干。每份供试品分别加入病
毒抗原孔和正常细胞抗原孔各1个，37℃培养1小时，用洗液充分洗涤，拍干。
加酶结合物，37℃培养1小时，用洗液充分洗涤，拍干。每孔加入底物溶液
O．1ml，37℃培养10～20分钟，当阳性血清对照孔出现颜色，阴性对照孔无颜色
时，每孔加入1mol／L硫酸液0．1m1终止反应，测吸光度。
(3)结果判定P／N值不小于2．1为阳性；
P／N值在1．5～2．O为可疑；
P／N值小于1．5为阴性。
P为供试品免疫小鼠血清与病毒抗原的吸光度减去供试品免疫小鼠血清与正
常细胞抗原的吸光度；
N为对照组动物血清与病毒抗原的吸光度减去对照组动物血清与正常细胞抗
原的吸光度。
3．鸡胚感染试验
于接种前24小时观察鸡胚。活鸡胚具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还
可看到胚动。死胚血管暗昏模糊，没有胚动。接种前用检卵灯再次检查鸡胚活
力，并标出气室和胚胎的位置。按无菌操作要求，以卵黄囊、尿囊腔和绒毛尿
囊膜途径接种供试品。接种后，每日观察，培养5天。无菌操作收卵黄囊、绒毛
尿囊膜和尿囊液。卵黄囊和绒毛尿囊膜经研磨后，离心，取上清液，与尿囊液
分别用豚鼠或鸡红细胞做血凝试验。
取每排8孔微量血凝反应板，从第2孔～第8孔每孔加生理氯化钠溶液50μl。
第1、2孔各加经上述处理的供试品50μl，然后从第2孔吸取50μl至第3孔，第3孔
吸取50μ1至第4孔(以此类推)进行倍比稀释，至第7孔时丢弃50μl。第8孔为对照
孔。第1孔～第8孔各加1％豚鼠红细胞悬液50μl，混匀。做两块反应板，分别静
置于4℃和室温，至对照孔呈现明显阴性时判定结果。
结果判定：
++++红细胞均匀铺于孔底；
+++红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整齐，有下滑趋向；
++ 红细胞于孔底形成小环，但周围有小凝集块；
+红细胞于孔底形成小团，边缘可见少许凝集块；
-红细胞集中在孔底中央，呈一边缘致密的红点。
以凝集反应出现++，或++以上者判为阳性。
书页号：2005版药典三部附录6页
附录I B栓剂
栓剂 系指以生物制品原液经干燥后制成的干粉为原料药物，与适宜基质制成
供腔道给药的固体制剂。
栓剂因施用腔道的不同，分为直肠栓、阴道栓和尿道栓。直肠栓为鱼雷形、
圆锥形或圆柱形等；阴道栓为鸭嘴形、球形或卵形；尿道栓一般为棒状。
栓剂在生产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产和质量控制应符合相关品种要
求。
二、栓剂常用基质为半合成脂肪酸甘油酯、可可豆脂、聚氧乙烯硬脂酸酯、
聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、氢化植物油、甘油明胶、聚乙二醇类或其他适宜
物质。
因油脂性基质如可可豆脂在阴道内不能被吸收而形成残留物，不作阴道栓用
基质。常用水溶性或水能混溶的基质制备阴道栓。
三、除另有规定外，供制栓剂用的固体药物，应预先用适宜方法制成细粉，
根据施用腔道和使用目的的不同，制成各种适宜的形状。
四、根据需要可加入表面活性剂、稀释剂、吸收剂、润滑剂和防腐剂等。
五、栓剂中的药物与基质应混合均匀，栓剂外形要完整光滑；塞入腔道后应
无刺激性，应能融化、软化或溶化，并与分泌液混合，逐渐释放出药物，产生
局部或全身作用；并应有适宜的硬度，以免在包装或贮藏时变形。
六、栓剂所用内包装材料应无毒性，并不得与药物或基质发生理化作用。
七、除另有规定外，栓剂应置2～8℃下避光贮存和运输，防止因受热、受潮
而变形、发霉变质。
栓剂应进行以下相应检查。
【重量差异】 栓剂重量差异的限度，应符合规定。
检查法取供试品10粒，精密称定总重量，求得平均粒重后，再分别精密称定
各粒的重量。每粒重量与平均粒重相比较，超出重量差异限度的不得多丁1粒，
并不得超出限度1倍。
【融变时限】 除另有规定外，照融变时限检查法(附录V D)检查，应符合规定。
【微生物限度】 除另有规定外，照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符合
规定。
页码数,2005版药典附录第38页
附录ⅦD水分测定法
第一法(费休氏法)
A．容量滴定法
本法是根据碘和二氧化硫在吡啶和甲醇溶液中能与水起定量反应的原理以测
定水分。所用仪器应干燥，并能避免空气中水分的侵入；测定操作宜在干燥处
进行。
费休氏试液的制备与标定
(1)制备称取碘(置硫酸干燥器内48小时以上)110g，置干燥的具塞锥形瓶中，加
无水吡啶160ml，注意冷却，振摇至碘全部溶解后，加无水甲醇300ml，称定重
量，将锥形瓶置冰浴中冷却，在避免空气中水分侵入的条件下，通入干燥的二
氧化硫至重量增加72g，再加无水甲醇使成1000ml，密塞，摇匀，在暗处放置24小
时。
本液应遮光，密封，置阴凉干燥处保存。临用前应标定浓度。
(2)标定用水分测定仪直接标定。或取干燥的具塞玻瓶，精密称人重蒸馏水
约30mg，除另有规定外加无水甲醇2～5ml，在避免空气中水分侵入的条件下，
用本液滴定至溶液由浅黄色变为红棕色，或用永停滴定法(二部附录ⅦA)指示终
点；另作空白试验，按下式计算：
F=W/A-B
式中 F为每lml费休氏试液相当于水的重量，mg；
W为称取重蒸馏水的重量，mg；
A 为滴定所消耗费休氏试液的容积，ml；
B为空白所消耗费休氏试液的容积，m1。
测定法精密称取供试品适量(约消耗费休氏试液1～5m1)，除另有规定外，溶
剂为无水甲醇，用水分测定仪直接测定。或将供试品置干燥的具塞玻瓶中，加
溶剂2～5ml，在不断振摇(或搅拌)下用费休氏试液滴定至溶液由浅黄色变为红棕
色，或用永停滴定法(二部附录ⅦA)指示终点；另作空白试验，按下式计算：
供试品中水分含量(％)=(A-B)F/W×100％
式中A为供试品所消耗费休氏试液的容积，ml；
B为空白所消耗费休氏试液的容积，m1；
F为每lml费休氏试液相当于水的重量，mg；
W为供试品的重量，mg。
B．库仑滴定法
本法仍以卡尔一费休氏(Karl Fischer)反应为基础，应用永停滴定法(二部附录
ⅦA)测定水分。与容量滴定法相比，库仑滴定法中滴定剂碘不是从滴定管加
入，而是由含有碘离子的阳极电解液电解产生。一旦所有的水被滴定完全，
阳极电解液中就会出现少量过量的碘，使铂电极极化而停止碘的产生。根据
法拉第定律，产生的碘的量与通过的电量成正比，因此可以用测量滴定过程中
流过的总电量的方法测定水分总量。本法主要用于测定含微量水分
(0．0001％～O．1％)的物质，特别适用于测定化学惰性物质如烃类、醇类和酯
类中的水分。所用仪器应干燥，并能避免空气中水分的侵入；测定操作宜在干
燥处进行。
费休氏试液按卡尔一费休氏库仑滴定仪的要求配制或购置滴定液。本法无
须标定滴定液。
测定法先将系统中的水分预滴定除去，而后精密量取供试品适量(含水量约
为0．5～5mg)，迅速转移至阳极电解液中，用卡尔-费休氏库仑滴定仪直接测
定，以永停滴定法(二部附录ⅦA)指示终点，从仪器显示屏上直接读取供试品
中水分的含量，其中每lmg水相当于10．72库仑的电量。
第二法(甲苯法)
仪器装置如图（图略）。A为500ml的短颈圆底烧瓶；B为水分测定管；C为直
形冷凝管，外管长40cm。使用前，全部仪器应清洁，并置烘箱中烘干。
测定法取供试品适量(约相当于含水量1～4m1)，精密称定，置A瓶中，加甲
苯约200ml，必要时加入干燥、洁净的无釉小瓷片数片或玻璃珠数粒，将仪器各
部分连接，自冷凝管顶端加入甲苯至充满B管的狭细部分。将A瓶置电热套中或
用其他适宜方法缓缓加热，待甲苯开始沸腾时，调节温度，使每秒钟馏出2滴。
待水分完全馏出，即测定管刻度部分的水量不再增加时，将冷凝管内部先用
甲苯冲洗，再用饱蘸甲苯的长刷或其他适宜方法，将管壁上附着的甲苯推下，
继续蒸馏5分钟，放冷至室温，拆卸装置，如有水黏附在B管的管壁上，可用蘸
甲苯的铜丝推下，放置使水分与甲苯完全分离(可加亚甲蓝粉末少量，使水染
成蓝色，以便分离观察)。检读水量，并计算成供试品的含水量(％)。
【附注】 甲苯须先加水少量充分振摇后放置，将水层分离弃去，经蒸馏后
使用。
页码数,2005版药典附录第31页
附录ⅥC唾液酸测定法
(间苯二酚显色法)
本法系用酸水解方法将结合状态的唾液酸变成游离状态，游离状态的唾液
酸与间苯二酚反应生成有色化合物，再用有机酸萃取后，测定唾液酸含量。
唾液酸对照品溶液(200μg／m1)的制备 精密称取唾液酸对照品10．52mg(1μg
唾液酸相当于3．24nm01)，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀，即为
唾液酸贮备液(1mg／m1)，按一次使用量分装，-70℃贮存，有效期1年。仅可冻
融1次。4℃保存使用期为2周。精密量取唾液酸贮备液lml，置5ml量瓶中，加水
至刻度，即为每lml含200μg的唾液酸对照品溶液，用前配制。
测定法取供试品适量，加水稀释至蛋白质浓度约为每lml含O．2～O．4mg，
作为供试品溶液。按下表取唾液酸对照品溶液、水及供试品溶液于10ml玻璃试
管中，混匀，每管再加入间苯二酚一盐酸溶液(分别量取2％间苯二酚溶液
2．5ml、0．1tool／L硫酸铜溶液62．5μl、25％盐酸溶液20ml，加水稀释至25ml，混
匀。试验前4小时内配制)lml，加盖，沸水煮沸30分钟(水浴面高于液面约2cm)，
取出置冰浴中3分钟(同时振摇)后，每管加乙酸丁酯一丁醇液(取乙酸丁酯4份与
丁醇1份混匀，室温下保存，12小时内使用)2ml，充分混匀，室温放置10分钟，
照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长580nm处测定吸光度。(图表略）
用唾液酸对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归(相关系数应不
低于O．99)，由直线回归方程求出5μg唾液酸的吸光度，再按下式计算
供试品唾液酸含量A2*5*3．24*W*D/A1×PXl00
(mol／mol蛋白质)
式中A1为5μg唾液酸的吸光度；
A2为供试品的吸光度；
D为供试品稀释倍数；
P为供试品蛋白质含量，μg／μl；
W为1nmol促红素的量(不包括糖成分量)，相当于18．2μg。
书页号：2005版药典三部附录7页
附录I D外用溶液剂
外用溶液剂系指以生物制品原液为原料药物，加入适宜稳定剂或其他辅料制
成的无菌澄明溶液。供刨伤面涂抹治疗用。
外用溶液剂在生产和贮藏期间应符合下列有关规定。
一,所用生物制品原液、半成品和成品的生产和质量控制应符合相关品种
要求。
二、外用溶液剂中所含药物可被创面所吸收，使用时需加在棉签或柔软物料
上，轻轻涂抹患处，所用物料必须洁净、灭菌，不得污染微生物。
三、外用溶液剂不得有酸败、异臭、变色等异常现象，必要时可加适宜防腐
剂或抗氧剂。
四、除另有规定外，外用溶液剂应置2～8℃避光贮存和运输。
外用溶液剂应进行以下相应检查。
【装量】 除另有规定外，照附录I A中装量项进行。应符合规定。
【无菌】 照无菌检查法(附录ⅫA)检查，应符合规定。
页码数,2005版药典附录第46页
附录ⅨB外源性DNA残留量测定法
供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可
与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。将特异性单链
DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物
相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供
试品中外源性DNA的含量。
试剂 (1)DNA标记和检测试剂盒
(2)DNA杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜。
(3)2％蛋白酶K溶液称取蛋白酶K O．20g，溶于灭菌水10ml中，分装后储藏于
-20℃备用。
(4)3％牛血清白蛋白溶液 称取牛血清白蛋白O．30g，溶于灭菌水10ml中。
(5)lmol／L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液(pH8．0) 用盐酸调pH值至8．O。
(6)5．0mol／L氯化钠溶液
(7)0．5mol／L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8．0) 用10mol／L氢氧化钠溶液调节pH
至8．O。
(8)20％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液 用盐酸调pH至7．2。
(9)蛋白酶缓冲液(pH8．0) 量取lmol／L Tris溶液1．0ml(pH8．O)，5mol／L氯化钠溶
液2．Oml，0．5mol／L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8．O)2．Oml，20％SDS溶液2．5
ml，加灭菌水至lOml。
(10)TE缓冲液(pH8．0) 量取1mol／L Tris溶液(pH8．O)10ml，0．5mol／L乙二胺四乙
酸二钠溶液(pH8．0)2ml，加灭菌水至1000ml。
(11)1％鱼精DNA溶液 精密称取鱼精DNA0．10g，置10ml量瓶中，用TE缓冲液溶
解并稀释至刻度，摇匀，用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子，分装后贮
藏于-20℃备用。
(12)DNA稀释液取1％鱼精DNA溶液50μd，加TE缓冲液至10ml。
用于探针标记和阳性对照的DNA制备用于探针标记和阳性对照的DNA，由生
产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴定可
参考下述推荐方案进行，具体方法可参考《分子克隆实验指南》([美]J．萨姆布
鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002)或《精编分子生物学实验指南》(
[美]F．奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，科学出版社，1998)。
将待提取的细胞基质悬液的细胞浓度调整为每lml含107个细胞，如果为细
菌，则将其浓度调整为每lml含108个细胞。取悬液lml，离心，在沉淀中加裂解
液400μ1混匀，37℃作用12～24小时后，加入饱和酚溶液450μ1，剧烈混合，以每分
钟10000转离心10分钟，转移上层液体，以饱和酚溶液450μd重复抽提一次；转移
上层液体，加入三氯甲烷450μ1，剧烈混匀，以每分钟10000转离心10分钟；转移
上层液体，加入pH 5．2的3mol／L醋酸钠溶液40μl，充分混合，再加人-20℃以下
的无水乙醇lml，充分混合，-20℃以下作用2小时，以每分钟15000转离心15分钟；
用适量-20℃ 70％乙醇溶液洗涤沉淀1次，以每分钟15000转离心15分钟，弃上清
液，保留沉淀，吹至干燥后，加适量灭菌TE缓冲液溶解，RNase酶切，酚／三
氯甲烷抽提，分子筛纯化DNA，即得。
用1％琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法鉴定阳性对照品的DNA纯度：应无RNA
和寡核苷酸存在；Az60／Az80比值应在1．8～2．0之间(测定时将供试品稀释至
A260为O．2～1．O)。
用于阳性对照和标记探针的DNA在使用前应进行酶切或超声波处理，使其片
断大小适合于DNA杂交和探针标记。
阳性对照品的DNA浓度根据下式计算DNA浓度(ng／μ1)=50*A260
阳性对照品可分装于适宜的小管中，-20℃以下保存，长期使用。
探针的标记按试剂盒使用说明书进行。
测定法 (1)蛋白酶K预处理 按下表对供试品、阳性和阴性对照进行加样，混
合后37℃保温4小时以上，以保证酶切反应完全。
┏━━━━┳━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━┳━━━━━━┳
┃ 加样量 ┃2％蛋白酶 ┃ 蛋白酶 ┃3％牛血清白 ┃加水至
┃ ┃ K溶液 ┃ 缓冲液 ┃ 蛋白溶液 ┃ 终体积
┣━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋
┃供试品 ┃ lOOμ1 ┃ 1μl ┃ 20μ1 ┃ ┃200μ
┃ D1 ┃ lOOμ1 ┃ 1ul ┃ 20μ1 ┃ 适量 ┃ 200μ1 ┃
┃ D2 ┃ lOOμ1 ┃ 1μ1 ┃ 20μ1 ┃ 适量 ┃ 200μ1 ┃
┃ D3 ┃ lOOμ1 ┃ 1μ1 ┃ 20μ1 ┃ 适量 ┃ 200μ1 ┃
┃ 阴性 ┃ lOOμ1 ┃ 1μL ┃ 20μ1 ┃ 适量 ┃ 200ul ┃
┗━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━┻━━━━━━┻
注意事项：供试品的稀释
根据成品最大使用剂量，用DNA稀释液将供试品(原液)稀释至每100μ1含1人份
剂量；如成品最大使用剂量较大，而供试品的蛋白含量较低，可用DNA稀释液
将供试品稀释至每100μ1含1／10人份剂量或每100μ1含1／100人份剂量。
Dl、D2、D3为稀释的阳性DNA对照。用DNA稀释液稀释至每lml中含DNA 1000ng。
然后依次10倍稀释成10ng／100／μ1(D1)、lng／100μl(D2)、100pg／100μl(D3)三个稀释
度；如成品使用剂量较大，而且DNA限量要求(100pg／剂量)较严格时，则需要
提高DNA检测灵敏度，相应的阳性DNA对照应稀释成100pg／100μl(D1)、10pg／
100μl(D2)、lpg／100μl(D3)三个稀释度。阴性对照为DNA稀释液，空白对照为未进
行蛋白酶K预处理的TE缓冲液。
当供试品1／100人份剂量大于100μ1时，终体积也随之增大，一般终体积为供
试品体积的一倍左右，供试品体积和终体积相差过小，可能会影响蛋白酶K的
活性。
2％蛋白酶K溶液和蛋白酶缓冲液的比例为1／20，蛋白酶缓冲液和终体积的
比例为1／10。
加入3％牛血清白蛋白溶液适量，是为了使阳性对照和阴性对照中含有一定
的蛋白质与供试品(通常为蛋白质)的酶切条件保持一致；如供试品为其他物质，
则应改用其他相应物质。
若预处理后的供试品溶液中的蛋白质干扰本试验，可用上述饱和酚溶液抽
提法或其他适宜方法提取供试品DNA(阳性对照、阴性对照也应再次提取DNA，
与供试品溶液平行)。
(2)点膜用TE缓冲液浸润杂交膜后，将预处理的供试品、阳性对照、阴性对照
与空白对照置100℃水浴加热10分钟，迅速冰浴冷却，以每分钟8000转离心5秒。
用抽滤加样器点样于杂交膜(因有蛋白质沉淀，故要视沉淀多少确定加样量，以
避免加入蛋白质沉淀。所有供试品与阳性对照、阴性对照、空白对照加样体积
应一致，或按同样比例加样)。晾干后置80℃真空干烤1小时以上。
(3)杂交及显色按试剂盒使用说明书进行。
结果判定 阳性对照应显色，其颜色深度与DNA含量相对应，呈一定的颜色
梯度；阴性、空白对照应不显色，或显色深度小于阳性DNA对照D3，试验成
立。将供试品与阳性对照进行比较，根据显色的深浅判定供试品中外源性DNA
的含量。
书页号：2005版药典三部附录81页
附录Ⅻ G 微生物限度检查法
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度
的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气
区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区
域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌
的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效
性及对微生物的生长和存活无影响。
除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温
度为23～28℃；控制菌培养温度为35～37℃。
检验结果以lg、1ml、10g、10ml或10cm〈2〉为单位报告。
检验量
检验量即一次试验所用的供试品量(g、m1或cm〈2〉)。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；化学膜剂为100cm〈2〉；
贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检
验量应增加10g或10ml。
检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。
供试液的制备
根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试
液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培
养基，不得超过1小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
1．液体供试品
取供试品10ml，加pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10
的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体
制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2．固体、半固体或黏稠性供试品
取供试品10g，加pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他
适宜的方法，混匀，作为1：10 的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并
置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
3．需用特殊供试液制备方法的供试品
(1)非水溶性供试品
方法1 取供试品5g(或5m1)，加至含溶化的(温度不超过45℃)5g司盘80、3g单硬脂
酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢
加入45℃的pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mI，边加边搅拌，使供试品充分
乳化，作为1：20的供试液。
方法2 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异内酯(制法见附录Ⅺ H无菌检
查法中供试品的无菌检查项下)和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四
烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的pH7．0无菌氯化
钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层
作为1：10的供试液。
(2)膜剂供试品
取供试品100cm〈2〉，剪碎，加pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml(必要时
可增加稀释液)，浸泡，振摇，作为1：10的供试液。
(3)肠溶及结肠溶制剂供试品
取供试品10g，加pH6．8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或pH7．6无菌磷酸
盐缓冲液(用于结肠溶制剂) 至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1：10的
供试液。
(4)气雾剂、喷雾剂供试品
取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品开启部
位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓
缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7．0无菌氯化钠一蛋
白胨缓冲液(若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80)中，混匀，取相当于
10g或10ml的供试品，再稀释成1：10的供试液。
(5)具抑菌活性的供试品
当供试品有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用
的方法如下。
①培养基稀释法 取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内
的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取
同稀释级的供试液2ml，每lml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混
匀，凝固，培养，计数。每lml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1m1的菌
落数，计算每1ml 供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检
查时，可加大增菌培养基的用量。
②离心沉淀集菌法 取一定量的供试液，每分钟3000转离心20分钟(供试液如有
沉淀，先以每分钟500转离心5分钟，取全部上清液再离心)，弃去上清液，留底
部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。
③薄膜过滤法 见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。
④中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和
剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。
细菌、霉菌及酵母菌计数
计数方法的验证
当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的
验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若
药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列
要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。
菌种 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的冷
冻干燥菌种为第O代)，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学
特性。
大肠埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44102］
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26003］
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ［CMCC(B) 63501］
白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC(F)98001］
黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98003］
菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物
至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新
鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。上述培
养物用O．9％无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数为50～100CFU的菌悬液。接种黑曲
霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7天，加入3～5ml 0．9％
无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花
或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内，用0．9％无菌氯化钠溶液制
成每lml含孢子数50～100CFU的孢子悬液。
验证方法 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每
次试验的回收率。
(1)试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液lml和50～100CFU
试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平
皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法汁数时，取规定量试验可能用的最低稀
释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～100CFU试验菌，过
滤，按薄膜过滤法测定其菌数。
(2)菌液组 测定所加的试验菌数。
(3)供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
(4)稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等
特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的
程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为
每lml供试液含50～100CFU，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌
数。
结果判断 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照
组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70％。若试验组的
菌回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的
平均菌落数的百分率)均不低于70％，照该供试液制备方法和计数法测定供试品
的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70％，应采
用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这
些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。
检查法
计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时，按已验证的计数方法进行供
试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。
取按验证的方法制备的均匀供试液，用pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀
释成1:10、l:10〈2〉、1:10〈3〉等稀释级。
1．平皿法
采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2～3个稀释级的供试液。
取供试液lml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化
的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，
混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。
阴性对照试验 取试验用的稀释液lml，置无菌平皿中，注人培养基，凝固，
倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。
培养和计数 除另有规定外，细菌培养48小时，逐日点计菌落数，一般以48小
时的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养72小时，逐日点计菌落数，一般以72小时的
菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间至5～7天进行菌落计数并报告。菌落
蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌
落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15。
则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母
菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若
营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌．则应
分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母
菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵
母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数
为计数结果。
含蜂蜜、王浆的液体制剂，用攻瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出
粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。
菌数报告规则 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间、霉菌平均菌落
数在30～100之间的稀释级，作为菌数报告(取两位有效数字)的依据。
(1)当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释
倍数的值报告菌数。
(2)当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值(比值为高稀释
级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值)而定。
若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大
于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比
值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应
查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。
(3)当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释
倍数的值报告菌数。
(4)如各稀释级的平板均无菌落生长。或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但
平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
2．薄膜过滤法
采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0．45μm，直径约为50mm。选择滤膜材质
时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采
用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液
过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使
用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗
液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张
滤膜每次冲洗量为100ml。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生
物受损伤。
取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，
过滤。若供试品每1g或lml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液lml，过
滤。用pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方
法和冲洗量同“计数方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培
养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每
种培养基至少制备一张滤膜。
阴性对照试验 取试验用的稀释液1m1，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对
照。阴性对照不得有菌生长。
培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过
100个。
菌数报告规则 以相当于1g或lml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落
生长，以＜1报告菌数(每张滤膜过滤1g或1m1供试品)，或＜1乘以稀释倍数的值报
告菌数。
控制茵检查
控制菌检查方法的验证
当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认
所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改
变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。
验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的
菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按
供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。
菌种 对试验菌种的要求同细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。
大肠埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44102］
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ［CMCC(B)26003］
乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)［CM-CC(B)50094］
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) ［CMCC(B)10104］
生孢梭菌(Clostridium sporogenes) ［CMCC(B)64941］
菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单
胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培
养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时。用0．9％无菌氯化钠溶液制
成每lml含菌数为10～100CFU的菌悬液。
验证方法
(1) 试验组 取规定量供试液及10～100CFU试验菌加入增菌培养基中，依相应控
制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，
试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增
菌培养基中。
(2)阴性菌对照组 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。
方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采
用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，梭菌检查法时的阴
性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。
结果判断 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌。按此供
试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验
菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联
合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。
检查法
供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制
菌检查方法的验证。
阳性对照试验 进行供试品控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试
验的加菌量为10～100CFU，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相
应的控制菌。
阴性对照试验 取稀释液10 m1照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性
对照应无菌生长。
(1)大肠埃希茵(Escherichia coli) 取供试液10ml (相当于供试品1g、lml、lOcm〈2〉)，
直接或处理后接种至适量(不少于100m1)的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时，
必要时可延长至48小时。
取上述培养物0．2ml，接种至含5ml MUG培养基的试管内，培养，于5小时、
24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内
培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管
的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，
为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。
如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质
阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、
靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养
基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。
若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，判供
试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表1所列的菌落形态特征相符或
疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希
菌。
表l 大肠埃希菌菌落形态特征
┏━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 培养基 ┃ 菌落形态 ┃
┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落 ┃
┃ 曙红亚甲蓝 ┃中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸 ┃
┃琼脂 ┃起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属 ┃
┃ ┃光泽 ┃
┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色,┃
┃ 麦康凯琼脂 ┃ ┃
┃ ┃圆形，扁平．边缘整齐，表而光滑，湿润 ┃
┗━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┛
(2)大肠菌群(Coliform) 取含适量(不少于10m1)的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分
别加入1：10的供试液lml(含供试品0．1g或0．1m1)、1：100的供试液1m1(含供试品
0．0lg或0．0lml)、l：1000的供试液lml(含供试品0．001g或0．001m1)，另取1支胆盐乳
糖发酵培养基管加入稀释液1m1作为阴性对照管。培养18～24小时。
胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大
肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂
培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。
若平板上无菌落生长，或生长的菌落与表2所列的菌落形态特征不符或为非
革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长的菌落与表2所列
的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。
表2 大肠菌群菌落形态特征
┏━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 培养基 ┃ 菌落形态 ┃
┣━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色,┃
┃曙红亚甲蓝琼脂 ┃圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面 ┃
┃ ┃光滑，湿润 ┃
┣━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍 ┃
┃麦康凯琼脂 ┃ ┃
┃ ┃凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润 ┃
┗━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━┛
确证试验 从上述分离平板上挑选4～5个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵
管中，培养24～48小时。若产酸产气，判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群，否则
判未检出大肠菌群。
根据大肠菌群的检出管数，按表3报告1g或lml供试品中的大肠菌群数。
表3 可能的大肠菌群数表
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━┓
┃ 各供试品量的检出结果 ┃ ┃
┃ ┃可能的大肠菌群数N ┃
┣━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┫ ┃
┃ 0．1g或 ┃ 0．01g或 ┃ 0．00lg或 ┃ (个／g或m1) ┃
┃ 0．1ml ┃ 0．0hnl ┃0．001ml ┃ ┃
┣━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━ ╋━━━━━━ ━━ ━ ┫
┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＞10 ┃
┃ ＋ ┃ ＋ ┃ － ┃10〈2〉＜N＜10〈3〉 ┃
┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃10＜N＜10〈2〉 ┃
┃ － ┃ － ┃ － ┃ ＜10 ┃
┗━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━ ━ ┻━━━━━━━━━┛
注：＋代表检出大肠菌群；一代表未检出大肠菌群。
(3)沙门菌(Salmonella) 取供试品l0g或l0ml，直接或处理后接种至适量(不少于
200m1)的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养18～24小时。
取上述培养物lml，接种于lOml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24小时
后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂(或沙门、志贺菌属琼脂)培养基和麦康凯琼脂
(或曙红亚甲蓝琼脂)培养基的平板上，培养18～24小时(必要时延长至40～48小时)。
若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于表4所列的特征，判供试品未检出
沙门菌。
若平板上生长的菌落与表4所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选
2～3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养
18～24小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判供
试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生
化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门菌。
表4 沙门菌菌落形态特征
┏━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 培养基 ┃ 菌落形态 ┃
┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 无色至浅橙色，半透明，菌落中心带 ┃
┃胆盐硫乳琼脂 ┃ ┃
┃ ┃黑色或全部黑色或无黑色 ┃
┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 无色至淡红色，半透明或不透明，菌 ┃
┃沙门、志贺菌属琼脂 ┃ ┃
┃ ┃落中心有时带黑褐色 ┃
┣━━━━━━━━━━ ╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 无色至浅橙色，透明或半透明，光滑 ┃
┃曙红亚甲蓝琼脂 ┃ ┃
┃ ┃湿润的圆形菌落 ┃
┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 无色至浅橙色，透明或半透明，菌落 ┃
┃麦康凯琼脂 ┃ ┃
┃ ┃中心有时为暗色 ┃
┗━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┛
(4)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 取供
试液l0ml(相当于供试品1g、lml、l0cm〈2〉)，直接或处理后接种至适量(不少于l00ml)
的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。取上述培养物，划线接种于溴化十六
烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。
铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，
周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特
征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板生长的菌落与上述菌落形态特
征相符或疑似，应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养
18～24小时。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验。
氧化酶试验 取洁净滤纸片置于半皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤
纸片上，滴加新配制的1％二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉
红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。
若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未
检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试验。
绿脓菌素(Pyocyanin)试验 取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上，培养
24小时，加三氯甲烷3～5ml全培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将
三氯甲烷相移至另一试管中，加入lmol／L盐酸试液约1ml，振摇后，静置片刻，
观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则为阴性。同时用未接
种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。
若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判
供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及
绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的生化试验，确认是否为铜绿假单胞菌。
(5)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 取供试液10ml(相当于供试品lg、lml、
10cm〈2〉)，直接或处理后接种至适量(不少于lOOml)的亚碲酸钠(钾)肉汤(或营养
肉汤)培养基中，培养18～24小时，必要时可延长至48小时。取上述培养物，划线
接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24～
72小时。若甲板上无菌落生长或生长的菌落不同于表5所列特征，判供试品未检
出金黄色葡萄球菌。
表5金黄色葡萄球菌菌落形态特征
┏━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 培养基 ┃ 菌落形态 ┃
┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 金黄色．圆形凸起．边缘整齐，外围 ┃
┃甘露醇氯化钠琼脂 ┃ ┃
┃ ┃有黄色环，菌落直径0．7～1mm ┃
┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围 ┃
┃卵黄氯化钠琼脂 ┃有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径 ┃
┃ ┃l～2ram ┃
┗━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━━┛
若平板上生长的菌落与表5所列的菌落特征相符或疑似，应挑选2～3个菌
落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时。取营养琼脂培养基的
培养物进行革兰染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养18～24小时，作血浆凝
固酶试验。
血浆凝固酶试验 取灭菌小试管3支，各加入血浆和无菌水混合液(1：1)
0．5ml，再分别加入可疑菌株的营养肉汤培养物(或由营养琼脂培养基斜面培养
物制备的浓菌悬液)0．5ml、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物(或由营养琼脂培养
基斜面培养物制备的浓菌悬液)0．5ml、营养肉汤或0．9％无菌氯化钠溶液0．5ml，
即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。将3管同时培养，3小时后开始观察直
至24小时。阴性对照管的血浆应流动自如，阳性对照管血浆应凝固，若试验管
血浆凝固者为血浆凝固酶试验阳性，否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管
不符合规定时，应另制备血浆，重新试验。
若上述疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性，判供试品未检出
金黄色葡萄球菌。
(6)梭菌(cIostridium) 取供试液10ml(相当于供试品1g、lml)2份，其中1份置80℃保温
10分钟后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后分别接种至100ml的0．1％新鲜
庖肉培养基中。各培养基管在厌氧条件下培养72～96小时。如试验管不出现浑
浊、产气、消化碎肉、臭气等现象，判供试品未检出梭菌；否则，应取上述培
养物0．2 m1，涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比业琼脂培养基平板上，在厌氧条
件下培养48～72小时。若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上有
菌落生长，应挑选2～3个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。
过氧化氢酶试验 取上述平板上的菌落，置洁净玻片上，滴加3％过氧化氢试
液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。
若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌．有或无卵圆形或球形的芽孢，过氧化氢酶
阴性，判供试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。
结果判断
供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。
供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，
应从同一批样品中随机抽样．独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数。
眼用制剂检出霉菌和酵母菌数时，须以两次复试结果均不得长菌，方可判供
试品的霉菌和酵母菌数符合该品种项下的规定。
若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌三项检验结果均符合该品种
项下的规定．判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，
判供试品不符合规定。
稀释液
稀释液配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
1．pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 照无菌检查法(附录ⅪH)制备。
2．pH6．8无菌磷酸盐缓冲液、pH7．6无菌磷酸盐缓冲液 按缓冲液(二部附
录ⅩⅤ D)配制后，过滤，分装，灭菌。
如需要，可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。
3．0．9％无菌氯化钠溶液 取氯化钠9．0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分
装，灭菌。
培养基及其制备方法
培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养
基。配制后．应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
1．营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁
培养基及改良马丁琼脂培养基
照无菌检查法(二部附录Ⅺ H)制备。
2．玫瑰红钠琼脂培养基
胨 5．0g玫瑰红钠 0．0133g
葡萄糖 10．0g琼脂 14．0g
磷酸二氢钾 1．0g水 1000ml
硫酸镁 0．5g
除葡萄糖、玫瑰红钠外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，加入葡萄
糖、玫瑰红钠，分装，灭菌。
3．酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)
胨 10．0g琼脂 l4．0g
酵母浸出粉 5．0g水 1000ml
葡萄糖 20．0g
除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，加入葡萄糖，分装，
灭菌。
4．胆盐乳糖培养基(BL)
胨 20．0g磷酸二氢钾 1．3g
乳糖 5．0g牛胆盐 2．0g
氯化钠 5．0g(或去氧胆酸钠) (0．5g)
磷酸氢二钾 4．0g水 1000ml
除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶解，调节
pH值使灭菌后为7.4±0．2，煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分
装，灭菌。
5．胆盐乳糖发酵培养基
取未灭菌的胆盐乳糖培养基1000ml，加入 0．04％溴甲酚紫指示液25ml，根据
要求的用量分装于含倒管的试管中。灭菌。所用倒管的规格应保证产气结果的
观察。
6．曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)
营养琼脂培养基 100ml曙红钠指示液 2ml
20％乳糖溶液 5ml亚甲蓝指示液 1．3～1．6ml
取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操作加入灭菌的其他
3种溶液．摇匀，倾注平皿。
7．麦康凯琼脂培养基(MacC)
陈 20．0g 1％中性红指示液 3ml
乳糖 10．0g琼脂 14．0g
牛胆盐 5．0g水 1000ml
氯化钠 5．0g
除乳糖、1％中性红指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，微温
溶解，调节pH值使灭菌后为7．2±0．2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各
成分，摇匀，分装，灭菌，冷至约60℃，倾注平皿。
8．4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-methylumbelliferyl-β-D- glucuronide，MUG)培养基
胨 l0．0g磷酸二氢钾(无水) 0．9g
硫酸锰 0．5mg磷酸氢二钠(无水) 6．2g
硫酸锌 0．5mg亚硫酸钠 40mg
硫酸镁 0．1g去氧胆酸钠 1．0g
氯化钠 5．0g MUG 75mg
氯化钙 50mg水 1000ml
除MUG外，取上述成分．混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7．3±
0．1，加入MUG，溶解，每管分装5ml，灭菌。（未完待续《微生物限度检查
法2》
(续） 附录Ⅻ G 微生物限度检查法
书页号：2005版药典三部附录81页
9．三糖铁琼脂培养基(TSI)
胨 20．0g硫酸亚铁 0．2g
牛肉浸出粉 5．0g硫代硫酸钠 0．2g
乳糖 10．0g 0．2％酚磺酞指示液 l2．5ml
蔗糖 10．0g琼脂 12．0g
葡萄糖 1．0g水 1000ml
氯化钠 5．0g
除三种糖、0．2％酚磺酞指示液、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶
解，调节pH值使灭菌后为7．3±0．1，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成
分，摇匀，分装，灭菌，制成高底层(2～3cm)短斜面。
10．四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB)
胨 5．0g硫代硫酸钠 30.0g
牛胆盐 1．0g水 1000ml
碳酸钙 10．0g
取上述成分，混合．微温溶解，灭菌。
临用前，取上述培养基，每10ml加入碘试液0．2ml 和亮绿试液0．1ml，混匀。
11．沙门、志贺菌属琼脂培养基(ss)
胨 5．0g硫代硫酸钠 8．5g
牛肉浸出粉 5．0g中性红指示液 2．5ml
乳糖 l0．0g亮绿试液 0．33ml
牛胆盐 8．5g琼脂 l6．0g
枸橼酸钠 8．5g水 1000mI
枸橼酸铁铵 1．0g
除乳糖、中性红指示液、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节
pH值使灭菌后为7．2±0．1，滤过，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成
分，摇匀，火菌，冷至60℃，倾注平皿。
12．胆盐硫乳琼脂培养基(DHL)
胨 20．0g 枸橼酸钠 1．0g
牛肉浸出粉 3．0g 枸橼酸铁铵 1．0g
乳糖 10．0g 中性红指示液 3ml
蔗糖 l0．0g 琼脂 l6．0g
去氧胆酸钠 1．0g 水 1000ml
硫代硫酸钠 2．3g
除糖、指示液及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭
菌后为7.2±0．1，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余成分，摇匀，冷至60℃，
倾注平皿。
13．溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基
胨 10．0g 溴化十六烷基三甲铵 0.3g
牛肉浸出粉 3．0g 琼脂 14.0g
氯化钠 5．0g 水 1000ml
除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解．调节pH值使灭菌后为
7．5±0．1，加入琼脂，加热溶化后，分装，灭菌，冷至60℃，倾注平皿。
14．亚碲酸盐肉汤培养基
临用前，取灭菌的营养肉汤培养基，每100ml中加入新配制的1％亚碲酸钠
(钾)试液O．2ml，混匀，即得。
15．卵黄氯化钠琼脂培养基
胨 6．0g 10％氯化钠卵黄液 100ml
牛肉浸出粉 1．8g 琼脂 14．0g
氯化钠 30．0g 水 650ml
除10％氯化钠卵黄液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌
后为7．6+0．1，灭菌，待冷至约60℃，以无菌操作加入10％氯化钠卵黄液，充分
振摇，倾注平皿。
10％氯化钠卵黄液的制备 取新鲜鸡蛋1个，以无菌操作取出卵黄，放入l0％
无菌氯化钠溶液100ml中，充分振摇，即得。
16．甘露醇氯化钠琼脂培养基
胨 10．0g 酚磺酞指示液 2．5ml
牛肉浸出粉 1．0g 琼脂 14．0g
甘露醇 10．0g 水 1000ml
氯化钠 75．0g
除甘露醇、酚酞磺指示液及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节
pH值使灭菌后为7．4±0．2，加入琼脂，加热溶化后，滤过，分装，灭菌，冷至
60℃，倾注平皿。
17．乳糖发酵培养基
胨 20．0g 乳糖 10．0g
0．04％溴甲酚紫指示液 水 1000ml
25ml
除0．04％溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使
灭菌后为7．2+0．2，加入指示液，分装于含倒管的小试管中，每管3ml。灭菌。
18．绿脓菌素(pyocyanin)测定用培养基(PDP琼脂培养基)
胨 20．0g 甘油 10ml
氯化镁(无水) 1．4g 琼脂 14．0g
硫酸钾(无水) 10．0g 水 1000ml
取胨、氯化镁、硫酸钾和水混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为
7．3±0．1，加入甘油及琼脂，加热溶化，混匀，分装于试管，灭菌，置成斜面。
19．庖肉培养基
牛肉碎块的制备 取新鲜牛肉，除去脂肪和筋腱，加蒸馏水煮沸约10分钟，
切成约5mm〈3〉的小块，称重，按1：3(肉：水)加蒸馏水，置4～lO℃浸18～20小
时后，煮沸1小时，用白布过滤(滤液即为1：3牛肉浸液)，肉渣用自来水漂洗2
次，然后加入适量氢氧化钠溶液，搅拌，使pH在8．4左右，浸泡过夜，次日倾
去上层水，用蒸馏水冲洗2～3次，放在纱布上，自动沥干(不要挤压)。将肉渣铺
在搪瓷盘上，灭菌，于80～100℃烘干，筛去碎屑，装瓶，保持干燥，备用。
庖肉培养基的制备 将上述碎肉块装入合适的容器中，再加入营养肉汤培养
基．碎肉的量约为1．5％，调节pH使灭菌后为7．3±0．1。灭菌。
20．哥伦比亚琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物 10．0g 肉胃酶消化物 5．0g
心胰酶消化物 3．0g 酵母浸出粉 5．0g
玉米淀粉 1．0g 氯化钠 5．0g
琼脂 15．0g 水 1000ml
除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为
7．3±0．2，加入琼脂，加热溶化，滤过，分装，灭菌，冷45～50℃，加入相当于
20mg庆大霉素的无菌硫酸庆大霉素，混匀，倾注平皿。
试 药
十四烷酸异丙酯lsopropyl Myristate[C〈［17］〉H〈［34］〉O〈［2］〉
＝270．46］
本品为无色液体。溶于乙醇、乙醚、丙酮、三氯甲烷或甲苯，不溶于水、
甘油或丙二醇。约208℃分解。
二盐酸二甲基对苯二胺 N，N-Dimethyl-p-Pheny- lenediamine Dihydrochloride
［C〈［8］〉 H〈［12］〉 N〈［2］〉·2HCI＝209．12］
本品为白色或灰白色结晶性粉末；置空气中色渐变暗；易吸潮。在水或乙
醇中溶解。
牛肉浸出粉 Beef Extract Powder
本品为米黄色粉末，在水中溶解。
牛胆盐Ox Bile Salt
本品为淡黄色或黄棕色粉末．味苦而甜，具吸湿性。在水或醇中易溶。
4-甲基伞形酮葡糖苷酸 4-Methylumbelliferyl-β-D- Glucuronide，MUG［C〈［18］〉
H〈［16］〉O〈［9］〉＝376．3]
本品为白色针状结晶。在水、乙醇或乙醚中溶解。在稀氢氧化钠溶液中分
解。
玫瑰红钠(四氯四碘荧光素钠) Rose Bengal Sodium Salt［C〈［20］〉H〈［2］〉
CI〈［4］〉I〈［4］〉Na〈［2］〉O〈［5］〉＝1017．6]
本品为棕红色粉末。在水中溶解，溶液呈紫色，无荧光；在硫酸中溶解，
溶液为棕色。
单硬脂酸甘油酯Glycerol Monostearte［C〈［21］〉H〈［42］〉O〈［4］〉＝
358．56］
本品为白色或黄色蜡状。在热有机溶剂或矿物油中溶解，在水中不溶，但
与水能乳化。
枸橼酸铁铵Ammonium Ferric Citrate［C〈［12］〉H〈［22］〉FeN〈［3］〉
O〈［14］〉＝488．16］
本品为棕红色或绿色鳞片或粉末，易潮解，见光易还原成亚铁。在水中溶
解，在醇或醚中不溶。
胰蛋白胨 Tryptone
本品为米黄色粉末。在水中溶解。
液状石蜡 Paraffin Liquid
本品为无色油状液体。在水和醇中不溶。能与醚、苯、三氯甲烷、二硫化
碳和油类相混溶。
酪蛋白胰酶消化物(胰酪胨或酪胨)Pancreatic Di-gest of Casein
本品为黄色或浅黄色颗粒。以干酪素为原料经胰酶水解、活性炭脱色处理、
精制而成。
试 液
二盐酸二甲基对苯二胺试液 取二盐酸二甲基对苯二胺0．1g，加水10ml，即
得。临用时少量配制，于冷处避光保存，如试液变成红褐色，不可使用。
亚碲酸钠(钾)试液 取亚碲酸钠(钾)0．1g，加新鲜煮沸后冷全50℃的水10ml使溶
解。
玫瑰红钠试液 取玫瑰红钠0．1g，加水使溶解成75ml。
亮绿试液 取亮绿0．1g，加水100ml使溶解。
盐酸试液 取盐酸8．4ml，加水使稀释成100ml。
靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛5．0g，加人戊醇(或丁醇)75ml，充分振摇，
使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽
变深，或取对二甲氨基苯甲醛1．0g，加入95％乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解
后，取盐酸20ml徐徐滴入。
碘试液 取碘6g与碘化钾5g，加水20ml使溶解。
过氧化氢试液 取浓过氧化氢溶液(30％)，加水稀释成3％的溶液。临用时配
制。
指示液
中性红指示液 取中性红1．0g，研细，加95％乙醇60ml使溶解，再加水至
100ml。
变色范围pH6．8～8．0(红→黄)。
亚甲蓝指示液 取亚甲蓝0．5g，加水使溶解成100ml。
酚磺酞指示液 取酚磺酞1．0g，加lmol／L氢氧化钠溶液2．82ml，使溶解，再
加水至100ml。
变色范围pH6．8～8．4(黄→红)。
溴甲酚紫指示液 取溴甲酚紫1．6g，加95％乙醇使溶解成100ml。
变色范围pH5．2～6．8(黄→紫)。
曙红钠指示液 取曙红钠2．0g，加水使溶解成100ml。
微生物限度标准
非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径及对患者健康潜在的
危害而制订的。药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料的检验，
新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，
其微生物限度均以本标准为依据。
1．制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂 应符合无菌检
查法规定。
2．口服给药制剂
细菌数 每1g不得过1000个。每lml不得过100个。
霉菌和酵母菌数 每lg或1ml不得过100个。
大肠埃希菌 每1g或1ml不得检出。
3．局部给药制剂
3．1用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂 应符合无菌检查法规定。
3．2 眼部给药制剂
细菌数 每1g或1ml不得过10个。
霉菌数和酵母菌数 每1g或1ml不得检出。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌 每1g或1ml不得检出。
3．3 耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂
细菌数 每1g、1m1或10cm〈2〉不得过100个。
霉菌和酵母菌数 每1g、1ml或10cm〈2〉不得过10个。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 每1g、1ml或10cm〈2〉不得检出。
大肠埃希菌 鼻及呼吸道给药的制剂，每1g、1ml或10cm〈2〉不得检出。
3．4阴道、尿道给药制剂
细菌数 每lg或Iml不得过100个。
霉菌数和酵母菌数 每1g或1ml应小于10个。
金黄色葡萄球菌、铜绿似单胞菌 每lg或1ml不得检出。
3．5直肠给药制剂
细菌数 每lg不得过1000个。每1ml不得过100个。
霉菌和酵母菌数 每1g或1ml不得过100个。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌 每1g或lml不得检出。
3．6其他局部给药制剂
细菌数 每1g、lml或10cm〈2〉，不得过100个。
霉菌和酵母菌数 每1g、1ml或10cm〈2〉不得过100个。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 每1g、1ml或10cm〈2〉不得检出。
4．含动物组织(包括提取物)的口服给药制剂 每10g或10ml还不得检出沙门菌。
5．有兼用途径的制剂 应符合各给药途径的标准。
6．霉变、长螨者 以不合格论。
7．原料及辅料 参照相应制剂的微生物限度标准执行。
书页号：2005版药典三部附录73页
附录Ⅻ A 无菌检查法
无菌检查法系用于确定要求无菌的生物制品、原料、辅料及要求无菌的其
他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明供试品
在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在环境洁净度10 000级和局部洁净度100级的单向流空气区域内或
隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流
空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉
降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进
行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
除另有规定外，稀释液、冲洗液、培养基、实验器具等灭菌时，采用验证合
格的灭菌程序灭菌。
各种生物制品的无菌检查，除另有规定外，均应照本法进行。
当供试品为新的产品或供试品的生产工艺改变时，应进行方法验证，以确
认供试品在该试验条件下无抑菌活性或抑菌活性可忽略不计。
一、培养基及其制备方法
培养基应适合需氧菌、厌氧菌或真菌的生长，可按以下处方制备，亦可使
用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。
(一) 硫乙醇酸盐流体培养基(用于培养需氧菌、厌氧菌)
胰酪蛋白胨(或酪素胰酶消化液，总氮含量为2000mg) 15.0g
酵母浸出粉(或酵母透析液200ml) 5.0g
葡萄糖 5.0g
氯化钠 2.5g
L-胱氨酸(或半胱氨酸盐酸盐) 0.5g
硫乙醇酸钠(或硫乙醇酸 0.6m1) 0.5g
琼脂 0.65～0.75g
刃天青 0.001g
水 1000ml
除葡萄糖和刃天青外，称取上述成分加入水中，微温溶解后，调节pH为弱
碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为
7.1±0.2。
在供试品接种前，氧化层的颜色(粉红色)不得超过培养基深度的1/3，否则，
须经水浴煮沸加热至粉红色消失(不超过20分钟)，迅速冷却。培养基只限加热一
次，并防止被污染。
(二) 改良马丁培养基(用于培养真菌)
蛋白胨 5.0g
酵母浸出粉(或酵母透析液100ml) 2.0g
葡萄糖 20.0g
磷酸氢二钾 1.0g
硫酸镁(MgS04·7H2O) 0.5g
水 1000ml
除葡萄糖外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH值约为6.8，煮沸，
加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2。
(三) 营养琼脂培养基(用于培养需氧菌)
蛋白胨 10.0g 琼脂 14.0g
牛肉浸粉 5.0g 水 1000ml
氯化钠 5.0g
取上述成分加入水中，微温溶解后，调节pH值为弱碱性，煮沸，滤清，调
节pH值使灭菌后为7.2±0.2。
以上培养基一般分别按10ml、40ml、100ml、200ml(或其他适宜体积)分装于试管
或其他容器中(装量为试管或容器高度的2/5)，随后采用验证合格的灭菌程序灭
菌。灭菌后，培养基需经无菌检查合格。合格的培养基应保存在2～25℃，并防
止被污染；使用期限不得超过3周。
二、培养基灵敏度检查
(一) 菌种
由国家药品检定机构分发。
需氧菌
乙型溶血性链球菌 (Streptococcus hemdytis-β) [CMCC (B) 32210]
短芽孢杆菌 (Bacillus brevis 7316株)
厌氧菌
生孢梭菌(Clostridium sporogenes) [CMCC (B) 64941]
真菌
白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC (F) 98001]
(二) 菌液制备
将乙型溶血性链球菌、生孢梭菌、短芽孢杆菌新鲜培养物分别接种于被检
的培养基中，经30～35℃培养一定时间(乙型溶血性链球菌和生孢梭菌培养24～48
小时，短芽孢杆菌培养18～20小时)后，将乙型溶血性链球菌和短芽孢杆菌分别刮
入0.9%无菌氯化钠溶液内制成均匀菌液；将生孢梭菌菌液吸入灭菌的试管内，用
0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀菌液；白色念珠菌接种在土豆培养基上，置
20～25℃培养5～7天后，用0.9%无菌氯化钠溶液洗下菌苔制成均匀菌液，再将以
上菌液稀释至与标准比浊管(由国家药品检定机构分发)相同之浓度，然后用0.1%
蛋白胨水作10倍系列稀释。
(三) 培养基接种
取稀释度为10〈-6〉～10〈-8〉的短芽孢杆菌菌液、10〈-6〉～10〈-8〉生孢梭
菌菌液、10〈-7〉～10〈-9〉乙型溶血性链球菌菌液和10〈-5〉～10〈-7〉白色念珠
菌菌液各1ml，分别接种到每管装量为9ml的被检培养基中(用于厌氧菌的培养基在
试管中装量高度不得低于7cm)。每个稀释度菌液至少接种3管，并用未接种的培
养基作对照，将接种乙型溶血性链球菌、生孢梭菌的培养基置30～35℃培养3天，
接种短芽孢杆菌的培养基置30～35℃培养5天，接种白色念珠菌的培养基置
20～25℃培养5天，逐日记录结果。
(四) 结果判定
以接种后培养基管数的2/3以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度，
在3次试验中，以2次达到的最高灵敏度为判定标准。
培养基灵敏度 乙型溶血性链球菌应达到10〈-8〉，短芽孢杆菌和生孢梭菌应
达到10〈-7〉，白色念珠菌应达到10〈-6〉。
(五) 注意事项
(1) 不应在同一洁净室内同时操作两个菌株，以防止交叉污染。
(2) 无菌检查用培养基应每批进行灵敏度检查，合格后方可使用。
三、各种培养基的采用
(一) 检查需氧性和厌氧性杂菌，应采用硫乙醇酸盐流体培养基。
(二) 检查活疫苗时，可适当增加琼脂含量，做成斜面。
四、抽样量及抽验瓶数
(一) 原液及半成品
原液及半成品抽验量应至少为0.1%，但不得少于10ml。如原液及半成品除菌
过滤后分装于多个容器内，则每个容器抽验量不得少于10ml。原液及半成品每开
瓶一次，应如上法抽验。体外用诊断制品半成品每批抽验量至少3ml。
(二) 成品
每亚批均应进行无菌检查。供试品应随机抽取，具有代表性(包括分装过程
的前、中、后抽样或冻干柜中不同板层的抽样)。成品抽验量分出厂制品抽验量
和上市制品监督抽验量两种。
1．出厂制品抽验量
(1) 分装量在100支(瓶)或100支(瓶)以下者抽验不少于5支，101～500支(瓶)者抽验
不少于10支(瓶)，500支(瓶)以上者抽验不少于20支(瓶)。
(2) 每瓶装量在20ml以上的冻干血液制品，每柜冻干200瓶以下者抽验2瓶，200
瓶或以上者抽验4瓶。每瓶装量6～20ml抽验数量加倍。5ml和5ml以下者按“1.出厂制
品抽检量”的(1)抽验。
2．上市制品监督抽验量
(1) 除血液制品外，其他生物制品每批抽验8支(瓶)。
(2) 血液制品每瓶装量在50ml以下者抽验6瓶，50ml或50ml者以上抽2瓶。
3．需要复核结果的送检制品，其无菌检查的抽验量同上市制品监督抽检
量。
4．每支(瓶)抽验量
(1) 直接接种法 按下表抽取。
┏━━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━┳━━━━━┳━━━━
┃每支(瓶)制品装量V/ml ┃V＜0.5 ┃0.5≤V＜5 ┃ 5≤V＜20 ┃ 20≤V＜100
┣━━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━
┃每支(瓶)抽验量/ml ┃全量 ┃ 0.5 ┃ 1.0 ┃ 5.0
┗━━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━┻━━━━━┻━━━━
(2) 薄膜过滤法 每瓶装量100ml或100ml以下者取全量，100ml以上者取半量。
五、检查法
无菌检查法包括直接接种法及薄膜过滤法。除另有规定外，如供试品允许，
应优先采用薄膜过滤法。
(一) 直接接种法
(1) 含防腐剂的供试品，应先增菌培养。按成品抽样量及抽验瓶数的要求抽
取的供试品逐瓶取样，并按每20支安瓿混合后接种。应接种培养基瓶数依供试
品混合总量(全部接种)而定。接种量与培养基的比例：用苯酚或三氯甲烷作防腐
剂者至少为1：20；用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛、抗生素者至少为1：50。
将混合供试品先按此比例接种于硫乙醇酸盐流体培养基(不得少于200ml)内增菌。
于20～25℃培养3～4天后移种至硫乙醇酸盐流体培养基、营养琼脂斜面、改良马
丁培养基各2管，每管10ml培养基接种0.5ml。将硫乙醇酸盐流体培养基、营养琼脂
斜面各1管置30～35℃培养，其余各管置20～25℃培养；同时以0.9%无菌氯化钠溶
液代替供试品，同法操作作阴性对照。增菌管及移种管培养时间全程不得少于
14天。
(2) 不含防腐剂供试品，不需增菌培养。按成品抽样量及抽验瓶数的要求将
每批(或亚批)抽检的供试品逐瓶(支)取样混合，装量在5.0ml或5.0ml以下者每10瓶(安
瓿)混合，装量在5.0ml以上者，每7瓶(安瓿)混合，应接种培养基管数依供试品混
合总量(全部接种)而定。混合后的供试品接种量按不超过培养基体积10%(ml/m1)直
接接种于硫乙醇酸盐流体培养基、营养琼脂斜面及改良马丁培养基，三种培养
基接种支数之比为1：1：1。接种后的硫乙醇酸盐流体培养基及营养琼脂斜面按
各自总数的1/2置30～35℃培养，其余置20～25℃培养；改良马丁培养基置20～25℃
培养。同时以0.9%无菌氯化钠溶液代替供试品，同法操作做阴性对照。培养时间
不得少于14天。
(3) 供试品浑浊和(或)接种后不能判定结果的制品，可按上表取规定量的供试
品，按直接接种的增菌法做无菌检查。
(4) 体外诊断制品 只需做半成品无菌检查，即半成品除菌过滤后，在加防腐
剂之前留样做无菌检查，用直接接种法，培养8天，观察结果；如有菌生长，制
品需除菌处理后再做无菌检查，若再有菌生长应废弃。如半成品加防腐剂后除
菌，则应留样按直接接种的增菌法作无菌检查，但增菌管及移种管培养时间全
程不得少于8天。
(二) 薄膜过滤法
采用全封闭式薄膜过滤器，薄膜孔径不大于0.45μm，膜直径约47mm。
取规定抽验供试品数(如供试品少于10ml，则先加入100ml 0.9%无菌氯化钠溶液
或适宜的无菌溶剂)，立即在无菌条件下导人无菌薄膜过滤器内，加压或减压过
滤。含汞类等防腐剂的供试品，在供试品过滤后，用0.9%无菌氯化钠溶液或其他
适宜的无菌溶剂冲洗滤膜3次，每次100ml。过滤后，两个滤器中加硫乙醇酸盐流
体培养基各100ml，另一个滤器加改良马丁培养基100ml。一个装硫乙醇酸盐流体培
养基的滤器置30～35℃培养，其余置20～25℃培养，培养时间不少于14天。同时以
0.9%无菌氯化钠溶液代替供试品同法操作，作阴性对照。
(三) 结果判定
如硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基均为澄清，或虽显浑浊但经证
明并非有菌生长，营养琼脂斜面培养基未见菌生长，判供试品符合规定；如硫
乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营养琼脂斜面培养基中任何一管确证
有菌生长，并证明生长的微生物为供试品所含有，判供试品不符合规定。当满
足下列至少一个条件时，判试验结果无效：
(1) 对无菌检查相关设施的微生物监控数据表明其不符合规定；
(2) 对无菌检查过程的回顾，揭示了本操作程序是错误的；
(3) 阴性对照管有菌生长；
(4) 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证微生物生长是因无菌检查中使
用的物品和(或)无菌操作技术不当引起的。
试验如经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，如
无菌生长，判供试品符合规定；如有菌生长，判供试品不符合规定。
页码数,2005版药典附录第91页
附录XIII A 无特定病原体鸡胚质量检测要求
无特定病原体(SPF)鸡系指在严格控制饲养条件下，符合所规定的微生物学
检测要求的鸡。无特定病原体鸡胚是指SPF鸡生产的受精卵，在符合生物制品
生产的条件下，经孵化后所生成的鸡胚。通过对SPF鸡蛋和SPF鸡群病原微生物
的检测，使SPF鸡胚质量得以控制。
检测项目与方法SPF鸡胚病原微生物检测项目和检测方法见下表。（表略）
【附注】●必须检测项目，要求阴性；o必要时检测项目，要求阴性；SPA血清平板凝集试验；IA病原菌分类，AGP琼
脂扩散试验；HI血凝抑制试验；ELISA酶联免疫吸附试验；EST胚敏感试验；SN血清中和试验；TA试管凝集试验；IFA
间接免疫荧光试验。
检测要求 (1)取样禽淋巴白血病病毒和禽脑脊髓炎病毒的检测均应取新鲜鸡
蛋。其他病原微生物检测一律检测血清，每份供试品血清量应不少于lml。必须
按无菌操作程序取样，防止污染。
(2)取样数量淋巴白血病病毒检测，每个鸡群取鸡蛋200枚(少于200只的鸡群从
全群中取样)，每只鸡取蛋1枚。禽脑脊髓炎病毒检测，每个鸡群取鸡蛋不少于
50枚(少于50只鸡的鸡群应从全群中取样)，每只鸡取蛋1枚。其他病原微生物感染
检测，应采取随机方式取样，抽取每个鸡群的5％，少于200只鸡的鸡群应按
10％～15％抽样。
(3)供试品的保存与运输 取样后应尽快将供试品送往检测实验室检验。不能
及时运送的供试品，血清须在-15℃以下保存，鸡蛋应在4～10℃保存。保存时间
应不超过1周。供试品应有明显的编号标志，并附送检单，写明鸡群名称、鸡群
数量、供试品名称及数量。供试品在运送过程中应避免温度上升，防止破损。
结果判定检测结果如有1项不符合SPF鸡胚微生物学检测指标，则此批送检的
鸡胚判为不合格。
页码数,2005版药典附录第33页
附录ⅥI戊二醛残留量测定法
本法系依据戊二醛与2，4一二硝基苯肼反应生成正戊醛二硝基苯肼，用高
效液相色谱法，测定供试品中戊二醛含量。
照高效液相色谱法(附录ⅢB)测定。
色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂(SGl20，S-5μm，直径4．6mm，长
250mm)；以70％乙腈溶液为流动相；流速为每分钟1．2ml；检测波长为360nm；
记录时间为30分钟。
测定法取戊二醛对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释成每lml中约
含10μg的溶液；精密量取该溶液O．2ml、0．4ml、O．6ml、O．8ml、1．0ml，分
别置试管中，各加水至1．0ml，精密加流动相lml与2，4-二硝基苯肼溶液(取2，4-
二硝基苯肼2．4g，加30％高氯酸溶液，溶解成100m1)O．1ml，立即于混合器上混
匀，用O．45μm膜滤过。另取供试品适量，以每分钟3000转离心10分钟，精密
量取上清液lml，自“加流动相lml※’起，同法操作。分别精密量取对照品溶液与供
试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
以戊二醛对照品溶液的浓度对峰面积作直线回归，求得回归方程；计算出
供试品溶液中戊二醛含量。
【附注】 (1)配制戊二醛对照品溶液用的戊二醛用量0．1 g(系经色谱纯度测定
后折算其含量为100％)。
(2)直线回归相关系数应不低于O．99。
本法系用气相色谱法测定供试品中磷酸三丁酯残留量。
页码数,2005版药典附录第66页
附录ⅪC吸附白喉疫苗效价测定法
第一法豚鼠毒素攻击法(仲裁法)
本法系用白喉毒素攻击经供试品与标准品分别免疫后的豚鼠，比较其存活
率，计算出供试品的效价。
标准品和供试品溶液的制备将标准品和供试品用生理氯化钠溶液按等比间
隔稀释3～5个稀释度，使中间藕释度在攻毒后必须能保护约半数动物。
测定法用稀释好的标准品和供试品溶液分别免癌250～350g豚鼠，每个稀释度
至少免疫10只。另取5只不免疫豚鼠同时饲养作为对照。
免疫4周后，每只免疫豚鼠皮下注射100LD50白喉茜素1·0ml。对照组豚鼠注射
经100倍稀释之上述毒素，每只皮下注射1．0ml。攻毒后观察5天，每日记录动物
死亡情况。根据第5天存活率，以标准品的效价为标准，用平行线法计算供试
品的效价。供试品的效价为每1人用剂量应不低于30IU。如95％可信限大于
50％～200％，则95％可信限的低限效价应大于30IU／人用剂量。
【附注】试验成立的条件：
(1)供试品的最低稀释度能保护半数以上动物；
(2)供试品的最高稀释度能保护半数以下动物；
(3)对照组动物应部分死亡而不全部死亡；
(4)供试品和标准品的剂量反应曲线在平行性及直线性上的差异无显著意义。
第二法小鼠Vero细胞法
本法系用Vero细胞法测定经供试品与标准品分别免疫后的小鼠血清中的白喉
抗毒素水平，计算出供试品的效价.
试剂 (1)MEM培养液临用时于MEM培养液中加入小牛血清、3％谷氨酰胺、青
霉素、链霉素适量，使其终浓度分别为10％、O．03％、100IU／ml和100IU／m1。
用7％碳酸氢钠溶液调pH至7．0～7．2．
(2)无Ca2+、Mg2+缓冲液称取氯化钠8．Og、氯化钾O·2g、磷酸氢二钠1．15g，
加水溶解并稀释至1000ml。
(3)O·25％胰酶溶液称取胰酶2．5g、乙二胺四乙酸二钠O·2g，用无CaZ+、Mg2+
缓冲液溶解，并稀释至 1000ml，用7％碳酸氢钠溶液调pH至7．0。
Veto细胞悬液的制备 将Vero细胞培养于150cm2培养瓶中，待单层细胞长满至
80％～100％时，弃去上层培养液，加人O．25％胰酶溶液10ml，置37℃消化数分
钟，弃去胰酶，加入10ml培养液，分散细胞进行计数,用培养液调整细胞浓度
至每lml含2．5×10 5个细胞。
标准品及供试品溶液的稀释用生理氯化钠溶液将吸附白喉类毒素标准品和供
试品分别以2倍系列稀释法稀释成3～5个适当稀释度。
测定法 (1)免疫与采血用吸附白喉类毒素标准品和供试品的每一稀释度分别
免疫10～14g NIH小鼠8只，每只小鼠皮下注射0．5ml。免疫5周后，采血，分离血
清，56℃ 30分钟灭能，置-20℃保存。
(2)阳性对照小鼠血清用吸附白喉疫苗免疫1批小鼠，免疫5周后采血，分离血
清，56℃ 30分钟灭能，分装小管，冷冻干燥，保存于-20℃。
(3)毒素试验量测定 Vero细胞测定白喉抗体试验时毒素浓度采用1／10 000 Lcd。
在96孔培养板中用MEM培养液将毒素做2倍系列稀释，每孔50μl，然后向各孔
中加入标准白喉抗毒素(O．0001IU)50μ1，加盖，室温放置1小时后，加入Vero细
胞悬液50／11，加盖，用封板膜封板，置37℃二氧化碳孵箱培养6～7天后，观察
结果，使细胞死亡的最大毒素稀释度(红色)即1／10 000 Lcd。
1／10 000 Lcd的毒素量相当于1×10-4 Lf的毒素，适合本试验。
(4)抗体滴定于96孔微量培养板中测定。
①向每孔加人50μl培养液，但A11、A12孔和Hll、H12孔不加，而G11、G12孔加
100μ1培养液。
②取8份待检血清，分别加入A1至H1孔各50μl，横向进行2倍系列稀释，直至
A10和Hlo孔。
③将标准白喉抗毒素稀释至每lml含0．008IU，加入All、A12、B11和B12孔各
50μl，从B11和B12孔开始竖向做2倍稀释至Dll和D12孔。
④Hll和H12孔加入阳性对照小鼠血清50μ1。
⑤除Gll和G12孔外，向其余各孔中加入毒素(1／10 000 Lcd)50μl，轻轻转动培养
板，混匀，加盖后，置室温1小时。
⑥收集Vero细胞，进行计数，并稀释成每lml含2．5×10 5个细胞的悬液。
⑦室温放置1小时之培养板，每孔立即加入50μl Vero细胞悬液，加盖，用封板
膜封板后，置37℃二氧化碳孵箱培养6～7天。
⑧取出培养板，根据培养液颜色变化记录结果，黄色为(+)，红色(一)，颜色
不明显者则可用显微镜观察，如单层细胞完整无损为(+)，否则记录(一)。最终
结果用以2为底的指数表示，终点为变成黄色的最高稀释度孔的指数。例如，变
黄的最后1孔稀释倍数是256，即为2 8，则结果记为8。
用平行线分析法进行结果计算。供试品和标准品的剂量反应曲线在平行性及
直线性上的差异无显著意义。供试品的效价每1人用剂量应不低于30IU。如95％
可信限大于50％～200％，则95％可信限的低限效价每1人用剂量应大于30IUo
【附注】试验要求：
(1)Ell、E12、Fit和F12孔代表毒素量和Vero细胞敏感度，应出现(一)，如果出
现(+)，则毒素量和细胞敏感度都很低，应重试；
(2)细胞孔G11、G12和阳性对照孔Hll、H12都必须是(+)，如出现(一)，应重试；
(3)如毒素用量准确(1／10 000 Lcd)，则All、A12和B11、B12孔均应为(+)，而Cn、
C12和D11、D12均应为(一)，否则应重试；
(4)细胞计数应准确。
页码数,2005版药典附录第66页
附录ⅪB吸附破伤风疫苗效价测定法
本法系用破伤风毒素攻击经供试品与标准品分别免疫后的小鼠(或豚鼠)，比
较其存活率，计算出供试品的效价。
标准品和供试品溶液的制备用生理氯化钠溶液将破伤风类毒素标准品和供试
品以适当比例稀释成3～5个稀释度(居中的稀释度必须在攻毒后能保护约半数动
物)。
测定法用每一稀释度的破伤风类毒素标准品和供试品溶液分别免疫体重
14～16g NIH小鼠至少14只(或250～350g豚鼠至少10只)，每只小鼠皮下注射O．5ml
(或每只豚鼠皮下注射lml)。另外10只未注射的小鼠作为对照(或另外未注射的5只
豚鼠作为对照)。免疫4周后，每只免疫小鼠皮下注射50LD50破伤风毒素O．5ml(
或每只免疫豚鼠皮下注射100 LD50破伤风毒素1．0m1)。对照组每只小鼠皮下注射
1LD50破伤风毒素O．5ml(或对照组每只豚鼠注射1LD50破伤风毒素1．0m1)。攻击
后观察5天，每日记录结果。根据第5日存活率的剂量反应曲线，用平行线法计
算结果。95％可信限应不大于效价的50％～200％，否则95％可信限的低限应大于
相应品种中要求的效价规格。
【附注】试验成立应具备的条件：
(1)供试品的最低稀释度能保护半数以上动物；
(2)供试品的最高稀释度能保护半数以下动物；
(3)供试品和标准品的剂量反应曲线在平行性及直线性上的差异无显著意义；
(4)对照组动物应部分死亡而不全部死亡。
书页号：2005版药典三部附录78页
附录Ⅻ E 细菌内毒素检查法
本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断
供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法
和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结
果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、
仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用
于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。
光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法
是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方
法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无
内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。
供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成
供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱
或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液(或其稀释液)的pH值，可使用酸、
碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌
内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒
素和干扰因子。
内毒素限值的确定 药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确
定：
L=K/M
式中 L 为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性单位)表示；
K 为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg·h)表示，注射
剂K=5EU/(kg·h)，放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg·h)，鞘内用注射剂
K=0.2EU/(kg·h)；
M 为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)或
U/(kg·h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。
按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况
做必要调整，但需说明理由。
确定最大有效稀释倍数(MVD) 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被
允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。
用以下公式来确定MVD：
MVD=cL/λ
式中 L 为供试品的细菌内毒素限值；
c 为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或
EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原
料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L；
λ 为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)，或是在光度测定法中所使用的
标准曲线上最低的内毒素浓度。
方法1 凝胶法
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素
的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内
毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试
剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复
核试验。
根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ)，将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工
作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成
2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上
混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的
鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个
内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将
试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分
钟±2分钟。
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不
变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管
壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，
试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的
测定值(λc)。
λc=lg〈-1〉(∑X/4)
式中 X 为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度
中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度
λ为该批鲎试剂的灵敏度。
干扰试验 按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内
毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操
作。
只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结
果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的
反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)。
Es=lg〈-1〉(∑Xs/4)
Et=lg〈-1〉(∑Xt/4)
式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值(lg)。
当Es在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es～2Es(包括0.5Es和2Es)时，认为供试品在
该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应
将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
表1 凝胶法干扰试验溶液的制备
┏━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━┳━━┳━━━━┳━━━
┃ 编号 ┃内毒素浓度／配制┃稀释用液 ┃稀释┃所含内毒┃平行
┃ ┃ 内毒素的溶液 ┃ ┃倍数┃素的浓度┃管数
┣━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━ ╋━━╋━━━━╋━━━
┃ A ┃ 无/供试品溶液 ┃ — ┃ — ┃ — ┃ 2
┣━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━ ╋━━╋━━━━╋━━━
┃ B ┃ 2λ/供试品溶液 ┃ 供试品溶液 ┃ 1 ┃ 2λ ┃ 4
┃ ┃ ┃ ┃ 2 ┃ 1λ ┃ 4
┃ ┃ ┃ ┃ 4 ┃ 0.5λ ┃ 4
┃ ┃ ┃ ┃ 8 ┃ 0.25λ ┃ 4
┣━━━╋━━━━━━━━╋━━━ ━━ ╋━━╋━━━━╋━━━
┃ C ┃ 2λ/检查用水 ┃ 检查用水 ┃ 1 ┃ 2λ ┃ 4
┃ ┃ ┃ ┃ 2 ┃ 1λ ┃ 4
┃ ┃ ┃ ┃ 4 ┃ 0.5λ ┃ 4
┃ ┃ ┃ ┃ 8 ┃ 0.25λ ┃ 4
┣━━━╋━━━━━━━━╋━━━ ━ ━╋━━╋━━━━╋━━━
┃ D ┃ 无/检查用水 ┃ — ┃ — ┃ — ┃ 2
┗━━━┻━━━━━━━━┻━━━ ━ ━┻━━┻━━━━┻━━━
注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系
列；D为阴性对照。
可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、
透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不
会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液
进行干扰试验。
当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检
查法时，须进行干扰试验。
当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能
影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
检查法
(1) 凝胶限量试验
按表2制备溶液A、B、c和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试
品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表2 凝胶限量试验溶液的制备
┏━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━┓
┃ 编号 ┃内毒素浓度／配制内毒素的溶液 ┃ 平行管数 ┃
┣━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━┫
┃ A ┃ 无／供试品溶液 ┃ 2 ┃
┣━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━┫
┃ B ┃ 2λ／供试品溶液 ┃ 2 ┃
┣━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━┫
┃ C ┃ 2λ／检查用水 ┃ 2 ┃
┣━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━┫
┃ D ┃ 无／检查用水 ┃ 2 ┃
┗━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━━┛
注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。
结果判断 保温60分钟±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴
性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳
性，试验有效。
若溶液A的两个平行管均为阴性，判供试品符合规定；若溶液A的两个平行
管均为阳性，判供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另
一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为
阴性，判供试品符合规定；否则判供试品不符合规定。
(2) 凝胶半定量试验
本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按表3制备
溶液A、B、C和D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表3 凝胶半定量试验溶液的制备
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┃ 编号 ┃内毒素浓度／配制┃稀释用液 ┃稀释┃所含内毒 ┃平行
┃ ┃ 内毒素的溶液 ┃ ┃倍数┃素的浓度 ┃管数
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┃ A ┃ 无／供试品溶液 ┃ 检查用水┃ 1 ┃ — ┃ 2
┃ ┃ ┃ ┃ 2 ┃ — ┃ 2
┃ ┃ ┃ ┃ 4 ┃ — ┃ 2
┃ ┃ ┃ ┃ 8 ┃ — ┃ 2
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┃ B ┃ 2λ／供试品溶液 ┃ ┃ 1 ┃ 2λ ┃ 2
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┃ C ┃ 2λ／检查用水 ┃ 检查用水┃ 1 ┃ 2λ ┃ 2
┃ ┃ ┃ ┃ 2 ┃ 1λ ┃ 2
┃ ┃ ┃ ┃ 4 ┃ 0.5λ ┃ 2
┃ ┃ ┃ ┃ 8 ┃ 0.25λ ┃ 2
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┃ D ┃ 无／检查用水 ┃ — ┃ — ┃ — ┃ 2
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注：A为不超过MYD并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀
释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀释倍数不得超过
MVD。
B为2λ浓度标准内毒素的溶液A(供试品阳性对照)。
C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。
D为阴性对照。
结果判断 若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平
行管均为阳性，系列溶液c的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ～2λ之间，试验有
效。
系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点
浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度[按
公式cE=lg〈-1〉(∑X/2)]。如果检验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液
内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。
如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于λ(如果
检验的是稀释过的供试品，则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀释
倍数)。如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等
于最大的稀释倍数乘以λ。
若内毒素浓度小于规定的限值，判供试品符合规定。若内毒素浓度大于或
等于规定的限值，判供试品不符合规定。
方法2 光度测定法
光度测定法分为浊度法和显色基质法。
浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量
的方法。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据
反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率)之间存在
着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到
达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底
物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显
色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终
止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态
显色法是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，
或检测色度增长速度的方法。
光度测定试验需在特定的仪器中进行，温度一般为37℃±1℃。
供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照
所用仪器和试剂的有关说明进行。
为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及
供试品的干扰试验。
标准曲线的可靠性试验 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能
会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。
用标准内毒素配成溶液，制成至少3个浓度的稀释液(相邻浓度间稀释倍数不
得大于10)，最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀
时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照。当阴性对
照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归分
析。
根据线性回归分析，标准曲线的相关系数(r)的绝对值应大于或等于0.980，试
验方为有效。否则须重新试验。
干扰试验 选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度(设为λm)，作为供
试品干扰试验中添加的内毒素浓度。按表4制备溶液A、B、C和D。
表4 光度测定法干扰试验溶液的制备
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┃ ┃ ┃ 配制内毒 ┃ ┃
┃编号 ┃ 内毒素浓度 ┃ 素的溶液 ┃ 平行管数 ┃
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┃ A ┃ 无 ┃ 供试品溶液 ┃ 不少于2个 ┃
┣━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃ ┃ 标准曲线的中点(或附 ┃ ┃ ┃
┃ B ┃ ┃ 供试品溶液 ┃不少于2个 ┃
┃ ┃ 近点)的浓度(设为Xm) ┃ ┃ ┃
┣━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃ ┃ 至少3个浓度(最低一 ┃ ┃ 每一浓度 ┃
┃ C ┃ ┃ 检查用水 ┃ ┃
┃ ┃ 点设定为λ) ┃ ┃ 不少于2个 ┃
┣━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃ D ┃ 无 ┃ 检查用水 ┃ 不少于2个 ┃
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注：A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液；
B为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的，且与溶液A
有相同稀释倍数的供试品溶液；
C为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒
素溶液；
D为阴性对照。
按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液
的内毒素含量c〈〔t〕〉和c〈〔s〕〉，再按下式计算该试验条件下的回收率
(R)。
R=(c〈〔s〕〉－c〈〔t〕〉)/λm×100%
当内毒素的回收率在50%～200%之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不
存在干扰作用。
当内毒素的回收率不在指定的范围内，须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除
干扰因素。并重复干扰试验来验证处理的有效性。
当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何
有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
检查法
按“光度测定法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。
使用系列溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。
试验必须符合以下三个条件方为有效：
(1) 系列溶液C的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求；
(2) 用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的内毒素
的回收率要在50%～200%的范围内；
(3) 溶液D的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。
结果判断若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小
于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，
判供试品不符合规定。
注：本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。
页码数,2005版药典附录第94页
附录XlV 细菌生化反应培养基
下列各类培养基常用于测定细菌的糖类代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试
验、碳源和氮源利用试验等生化反应。
1．糖、醇发酵培养基
(1)成分
基础液
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
0．5％酸性品红指示液 10ml
(或O．4％溴麝香草酚蓝指示液) (6m1)
水 1000ml
糖、醇类 每100ml基础液内各加0．5g
(2)制法 取蛋白胨和氯化钠加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为
7．3土0．1，加入指示液混匀。每100m1分别加入一种糖、醇或糖苷，混匀后分
装于小管中(若需观察产气反应，在小管内另放置杜汉小倒管)。于116℃灭菌1
5分钟。
常用的糖、醇或糖苷：阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、
半乳糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、蕈糖、纤维二糖、蜜二糖、棉子糖、松三糖、
菊糖、糊精、淀粉、甘露醇、卫矛醇、山梨醇、肌醇、甘油、水杨素、七叶苷
等。
(3)用途 鉴别各种细菌对糖类的发酵生化反应，发酵者产酸，培养基变色(加
酸性品红者由无色至红色或再至黄色；加溴麝香草酚蓝者由蓝色至黄色)；产气
时，小倒管内有小气泡。
2．七叶苷培养基
(1)成分
蛋白胨 5g 七叶苷3g
磷酸氢二钾 1g 水1000ml
枸橼酸铁 O．5g
(2)制法除七叶苷外，取上述成分混合，微温使溶解，加入七叶苷混匀，调节
pH值使灭菌后为7．3±0．1，分装于试管中，121℃灭菌15分钟。
(3)用途用于鉴别细菌对七叶苷的水解试验，产生棕黑色沉淀为阳性反应。
3．磷酸盐葡萄糖胨水培养基
(1)成分
蛋白胨 7g 葡萄糖 5g
磷酸氢二钾 3．8g 水 1000ml
(2)制法取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7．3±0．1，分装
于小试管中，121℃灭菌15分钟。
(3)用途用于鉴别细菌的甲基红试验(M-R反应)和乙酰甲基甲醇试验(V-P反应)。
①甲基红试验(M-R反应) 取可疑菌落或斜面培养物，接种磷酸盐葡萄糖胨水
培养基中，于35℃培养2～5日，于培养管内加入甲基红指示液(取甲基红0．1g，
加95％乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml)数滴，立即观察，呈鲜红色或橘红色
为阳性，呈黄色为阴性。
②乙酰甲基甲醇生成试验(V-P反应)取可疑菌落或斜面培养物，接种磷酸盐葡
萄糖胨水培养基中，于35℃培养48小时，取2ml培养液，加入a-萘酚乙醇试液(取
α-萘酚5g，加无水乙醇溶解使成100m1)lml，混匀，再加40％氢氧化钾溶液O．4ml，
充分振摇，立刻或数分钟内出现红色，即为阳性反应；无红色反应为阴性，如
为阴性反应，置35℃水浴4小时后再观察。
4．蛋白胨水培养基
(1)成分
蛋白胨 10g 水 1000ml
氯化钠 5g
(2)制法 取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7．3±0．1，分
装于小试管，121℃灭菌15分钟。
(3)用途用于鉴别细菌能否分解色氨酸而产生靛基质的生化反应。
①靛基质试验取可疑菌落或斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，于35℃
培养24～48小时，必要时培养4～5日，沿管壁加入靛基质试液数滴，液面呈玫瑰
红色为阳性，呈试剂本色为阴性。
②靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛5g，加入戊醇(或异戊醇)75ml，充分振摇，
使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色
泽变深。或取对二甲氨基苯甲醛1g，加入95％乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解
后，再取浓盐酸20ml徐徐滴入。
5．三糖铁琼脂培养基
(1)成分
蛋白胨 20g 硫酸亚铁 O．2g
牛肉浸出粉 5g 硫代硫酸钠 O．2g
乳糖 10g 0．2％酚磺酞指示液 12．5ml
蔗糖 10g 琼脂 12～15g
葡萄糖1g 水 1000ml
氯化钠5g
(2)制法除乳糖、蔗糖、葡萄糖、指示液、琼脂外，取上述成分，混合，加热
使溶解，调pH值使灭菌后为7．3±0．1，加入琼脂，加热溶胀后，再加入其余成
分，摇匀，分装，121℃灭菌15分钟。置成高底层(2～3cm)短斜面。
(3)用途用于初步鉴别肠杆菌科细菌对糖类的发酵反应和产生硫化氢试验。
方法和结果观察：取可疑菌落或斜面培养物，做高层穿刺和斜面划线接种，
于35℃培养24～48小时观察结果。培养基底层变黄色为葡萄糖发酵阳性，斜面
层变黄色为乳糖、蔗糖发酵阳性；底层或整个培养基呈黑色表示产生硫化氢。
6．克氏双糖铁琼脂培养基
(1)成分
蛋白胨20g 枸橼酸铁 0．3g
牛肉浸粉 3g 硫代硫酸钠 0．3g
酵母浸粉3g 0．2％酚磺酞指示液12．5ml
乳糖10g 琼脂 12～15g
葡萄糖1g 水 1000ml
氯化钠 5g
(2)制法除乳糖、葡萄糖、指示液、琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶
解，调pH值使灭菌后为7．3土0．1，加入琼脂，加热溶胀后，再加入其余成分，
摇匀，分装，121℃灭菌15分钟。置成高底层(2～3cm)短斜面。
(3)用途用于初步鉴别肠杆菌科细菌对糖类的发酵反应和产生硫化氢试验。
方法和结果观察：取可疑菌落或斜面培养物，做高层穿刺和斜面划线接种，
于35℃培养24～48小时，观察结果。培养基底层变黄色为葡萄糖发酵阳性，斜面
层呈黄色为乳糖发酵阳性，斜面层呈红色为乳糖发酵阴性；底层或整个培养基
呈黑色表示产生硫化氢。
7．脲(尿素)培养基
(1)成分
蛋白胨 1g 0．2％酚红溶液 6ml
葡萄糖lg 20％无菌脲溶液 100ml
氯化钠 5g 水1000ml
磷酸氢二钾 2g
(2)制法 除脲溶液外，取上述成分，混合，调节pH值使灭菌后为6．91± 0．1，
混匀后，121℃灭菌15分钟，冷至 50～55 ℃，加入无菌脲溶液(经膜除菌过滤)，混
匀，分装于灭菌试管中。
(3)用途用于鉴别细菌的尿素酶反应。
方法和结果观察：取可疑菌落或少量斜面培养物接种于培养基内，于35℃培
养24小时观察结果，若培养基变为红色为尿素酶阳性；不变色者为阴性，阴性
者需延长观察至一周。
8．苯丙氨酸琼脂培养基
(1)成分
磷酸氢二钠 1g 氯化钠 5g
酵母浸膏3g 琼脂 12～15g
DL-苯丙氨酸(DL-phenylalanine) 2g 水 1000ml
(或L-苯丙氨酸) (1g)
(2)制法除琼脂外，取各成分溶于水，调节pH值使灭菌后为7．3±0．1，再加入
琼脂，加热溶胀，分装试管，121℃灭菌15分钟，制成长斜面。
(3)用途用于鉴别细菌的苯丙氨酸脱氨酶试验(也称苯丙酮酸试验)。
方法和结果观察：取斜面培养物，大量接种于苯丙氨酸琼脂斜面，置35℃培
养4小时或18～24小时，取4～5滴10％三氯化铁溶液试剂，由斜面上部流下，若出
现墨绿色，即为苯丙氨酸脱氨酶阳性。倘若不变色则为阴性。
9．氨基酸脱羧酶试验培养基
(1)成分
①基础液
蛋白胨 5g 1.6％溴甲酚紫指示液lml
酵母浸出粉 3g 水 1000ml
葡萄糖 1g
②氨基酸
L-赖氨酸 O．5g (需加碱溶液溶解)
L_鸟氨酸 0．5g (需加碱溶液溶解)
L-精氨酸 0．5g (不需加碱溶液溶解)
(2)制法先配制基础液备用；将溶解后的三种氨基酸，各分别加至100ml基础液
(使氨基酸的终浓度为0·5％)，混匀，调节pH值使灭菌后为6．8。分装于小试管
中，每管2．5ml并滴加一层液体石蜡。同时分装一部分基础液于小试管，作为
对照培养基，均置116℃灭菌10分钟。
(3)用途用于鉴别细菌的脱羧酶、双水解酶试验。
方法和结果观察：取疑似菌斜面培养物分别接种于上述三种培养基及基础液
对照培养基，置35℃培养24～48小时。在培养初期由于待检细菌发酵葡萄糖产
酸，试验培养基和对照培养基应呈黄色，继续培养时，试验培养基如呈紫色或
紫红色，即为阳性反应；如至培养末期，培养基仍同对照管呈黄色则判为阴性
反应。
10．明胶培养基
(1)成分
蛋白胨 5g 明胶 120g
牛肉浸出粉3g 水1000ml
(2)制法取上述成分加入水中，浸泡约20分钟，加热溶解，调节pH值使灭菌后
为7．3±0．1，分装于小试管中，121℃灭菌15分钟。
(3)用途用于细菌的明胶液化试验。
方法和结果观察：取少量待检菌斜面培养物穿刺接种于明胶培养基内，置
35℃培养24小时，取出置冰箱内10～20分钟。如培养基仍呈溶液状，则为阳性；
培养基重新凝固，则为阴性。细菌液化明胶之作用有时甚为缓慢，如未见液
化，需继续培养1～2周方可确定阴性。
11．丙二酸钠培养基
(1)成分
酵母浸出粉 1g 磷酸二氢钾 O．4g
氯化钠2g 丙二酸钠 3g
葡萄糖0·25g 0．4％溴麝香草酚蓝指示液6ml
硫酸铵 2g 水 1000ml
磷酸氢二钾0．6g
(2)制法 除指示液外，将上述成分溶解，调节pH值使灭菌后为6．8，再加入
指示液。分装小管中，121℃灭菌15分钟。
(3)用途用于鉴别细菌能否利用丙二酸钠作为碳源而生长繁殖。
方法和结果观察：取斜面或肉汤培养物接种于培养基内。35℃培养48小时。
于24小时和48小时后各观察一次结果。培养基颜色由绿色变成蓝色为阳性反应；
无颜色变化，或由绿色变成黄色，则为阴性反应。
12．枸橼酸盐培养基
(1)成分
氯化钠5g 枸橼酸钠(无水) 2g
硫酸镁O·2g 1．0％溴麝香草酚蓝指示液lOml
磷酸氢二钾1g 琼脂 14g
磷酸二氢铵1g 水 1000ml
(2)制法除指示液和琼脂外，取上述成分，混合，微温使溶解，调节pH值使灭
菌后为6．9±0．1，加入琼脂，加热溶胀，然后加入指示液，混匀，分装于小试
管中，121℃菌15分钟，制成斜面。
(3)用途用于鉴别细菌能否利用枸橼酸盐作为碳源和氮源而生长繁殖。
方法和结果观察：取可疑菌落或斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基的斜面
上，一般培养48～72小时，凡能在培养基斜面生长出菌落，培养基即由绿色变成
蓝色者为阳性反应；无菌落生长，培养基仍绿色者为阴性反应，阴性反应者应
继续培养观察至7天。
13．硝酸盐胨水培养基
(1)成分
蛋白胨 10g 硝酸钾 2g
酵母浸出粉 3g 水 1000ml
(2)制法 取上述成分，加热溶解，调节pH值使灭菌后为7．3±0．1，分装于小
试管中，121℃灭菌15分钟。
(3)用途 用于鉴别细菌能否还原硝酸盐成亚硝酸盐。
方法和结果观察：取待检菌培养物接种于硝酸盐胨水培养基中，于35℃培养
24小时。将下列甲液和乙液于用前等量混合，每个培养物加混合物O．1ml，产
生红色为阳性反应，不产生红色为阴性反应。
甲液：取α-萘胺5g溶解于5mol／L醋酸1000ml中。
乙液：取磺胺酸(对氨基苯磺酸)8g溶解于5mol／L醋酸1000ml中。
14．石蕊牛奶培养基
(1)成分
脱脂奶粉 10g 水 100ml
10％石蕊溶液 O．65ml
(2)制法 取上述成分混匀后，分装于小试管中，116℃灭菌10分钟。
(3)用途用于检查细菌对牛奶的凝固和发酵作用。
15．半固体琼脂
(1)成分
蛋白胨10g 琼脂4g
牛肉浸出粉3g 水1000ml
氯化钠 5g
(2)制法除琼脂外，取上述成分，混合，微温使溶解，调pH使灭菌后为7．2±
O．2，再加入琼脂，加热溶胀，分装于小管中，121℃灭菌15分钟后，直立放
置。待凝固后备用。
(3)用途用于观察细菌的动力；也可用于一般菌种的保存。
细菌动力检查：取疑似菌斜面培养物穿刺接种于半固体营养琼脂培养基中，
35℃培养24小时，细菌沿穿刺外周扩散生长，为动力阳性；否则为阴性。阴性
者，应再继续培养观察2～3天。
页码数,2005版药典附录第94页
附录ⅫD小牛血清检测要求
蛋白质含量应为3．5％～5．0％(附录ⅥB第一法)。
无菌检查依法检查，应符合规定(附录ⅫA)。
细菌内毒素每lml应不高于1OEU(附录ⅫE凝胶限量试验)。
牛腹泻病毒 采用下述培养法(或其他适宜的方法)检测，不得有牛腹泻病毒
污染。
培养法 牛肾原代细胞以MEM培养基制成细胞悬液，接种等量供试品，37℃培
养5～7天观察细胞病变，同时设立阴性、阳性对照。
血红蛋白 用氰化高铁法或其他适宜的方法测定。应不高于O．02％。
大肠杆菌噬菌体 采用噬斑法和增殖法检测。不得有噬菌体污染。
支原体 采用培养法和DNA染色法(附录ⅫB)测定，不得有支原体污染。
支持细胞增殖检查 用Sp2／0-Agl4或适宜的非贴壁传代细胞进行。
(1)细胞生长曲线的测定取供试品按10％浓度配制细胞培养液，按每lml含10 4的
细胞浓度接种细胞，每天计数活细胞，连续观察一周，并绘制生长曲线，细胞
的最大增殖浓度应不低于每lml含10 6。
(2)细胞倍增时间的测定按生长曲线计算细胞的倍增时间。取细胞峰值前一天
的细胞计数(y)、接种细胞数(X)及生长时间(T)计算。
倍增时间=T/A A=1og2Y/x
Sp2／0-Ag14细胞的倍增时间应不超过20小时。
(3)克隆率的测定 按有限稀释法将细胞稀释，并按每孔1个细胞的浓度接种于96
孔细胞培养板，于37℃、5％二氧化碳培养1周后计算克隆率。
克隆率=A/BX100％
式中A为细胞生长阳性孔数；
B为接种细胞的总孔数。
页码数,2005版药典附录第33页
附录ⅥK辛酸钠测定法
本法系用气相色谱法测定供试品中辛酸钠含量。
照气相色谱法(附录Ⅲc)测定。
色谱条件与系统适用性试验 用酸改性聚乙二醇(20M)毛细管柱，柱温160℃，
火焰离子化检测器，检测器温度230℃，气化室温度230℃，载气(氮气)流速为每
分钟35ml。辛酸峰与庚酸峰的分离度应大于1．5，辛酸峰的拖尾因子应为
O．95～1．20，辛酸对照品溶液连续进样5次，所得辛酸峰与庚酸峰面积之比的
相对标准偏差(RSD)应不大于5％。
内标溶液的制备取庚酸，加三氯甲烷制成每lml中含10mg的溶液，即得。
测定法取供试品用水准确稀释成每升含蛋白质40～50g的溶液，即为供试品
溶液，精密量取供试品溶液O．5ml，加内标溶液30μ1与1．5mol／L高氯酸溶液
O．2 ml，于振荡器上混合1分钟，加三氯甲烷4ml，加盖，于振荡器上剧烈混合
2分钟，以每分钟3000转离心20分钟，除去上层水相，小心将三氯甲烷层倾入
10ml试管中，将三氯甲烷挥发至干，加三氯甲烷100~1溶解残渣，取0．1μ1注入
气相色谱仪。另取辛酸对照品约O．15mg，精密称定，置10ml量瓶中，用三氯甲
烷溶解并稀释至刻度，即为辛酸对照品溶液。精密量取辛酸对照品溶液10μl、
20μl、30μl、40ul、50μl，各精密加内标溶液30μl，于振荡器上混合1分钟，加
三氯甲烷4ml，将三氯甲烷挥发至干，各加三氯甲烷lOOul溶解残渣，同法操作。
以各辛酸对照品溶液峰面积与内标峰面积比对各辛酸对照品溶液辛酸量(μg)
作直线回归，求得回归方程，计算出供试品溶液辛酸绝对量(A)，再按下式计算
供试品辛酸钠含量
辛酸钠含量(mmol／g蛋白质)=A*N/144．22*B*C*l000
式中A为供试品溶液辛酸绝对量，μg；
B为取样量，即为O．5ml；
N为供试品稀释倍数；
c为供试品蛋白质含量，g／ml；
144．22为辛酸的相对分子质量。
【附注】 (1)lmmol辛酸相当于lmmol辛酸钠。
(2)对照品溶液与供试品溶液的溶剂挥发的速度应尽量保持一致。
(3)直线回归相关系数应不低于0．99。
页码数,2005版药典附录第39页
附录ⅦE亚硫酸氢钠测定法
本法系依据亚硫酸氢钠与过量的碘反应，用硫代硫酸钠滴定液滴定多余的
碘，根据硫代硫酸钠滴定液的消耗量，可计算出供试品中亚硫酸氢钠的含量。
测定法精密量取供试品适量(约相当于含亚硫酸氢钠量2．5mg)，置具塞锥形
瓶中，精密加入0．05mol／L碘溶液(称取碘13．0g，加碘化钾36g与水50ml溶解后，
加盐酸3滴与水适量使成1000ml，摇匀，用垂熔玻璃滤器滤过)20ml，放置5分钟，
沿瓶壁加入盐酸溶液(5→10)2．Oral，摇匀。用硫代硫酸钠滴定液(O．Imol／L)滴
定至近终点时，加0．5％淀粉指示液约O．5ml，滴定至蓝色消失，并将滴定的
结果用空白试验校正。
按下式计算
亚硫酸氢钠含量(％)—(Vo-V1)．*c*52．03*100/V2*1000
式中v0为空白试验消耗硫代硫酸钠滴定液的体积，ml；
v1为供试品消耗硫代硫酸钠滴定液的体积，ml；
V2为供试品的体积，ml；
c为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mool／L。
【附注】 硫代硫酸钠滴定液(O．1m01／L)的制备及滴定称取硫代硫酸钠26g与
无水碳酸钠O．20g，加新沸过的冷水适量使溶解成1000ml，摇匀，放置1个月后
滤过。
精密称取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾0．15g，置碘瓶中，加水50ml使
溶解，加碘化钾2．0g，轻轻振摇使溶解，加稀硫酸(5．7一100)40ml，摇匀，密
塞，在暗处放置10分钟后，加水250ml稀释，用本液滴定至近终点时，加淀粉指
示液(取可溶性淀粉0．5g，加水5ml搅匀后，缓缓倾入lOOml沸水中，随加随搅拌，
继续煮沸2分钟，冷却，倾取上层清液。本液应临用配制)3ml，继续滴定至蓝色
消失而显亮绿色，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml硫代硫酸钠滴定液相
当于4．903mg的重铬酸钾。根据本液的消耗量与重铬酸钾的取用量，算出本
液的浓度，即得。
书页号：2005版药典三部附录6页
附录I C眼用制剂
眼用制剂 系指直接用于眼部发挥治疗作用的生物制 品。眼用制剂可分为眼
用液体制剂(滴眼剂、洗眼剂、眼 内注射溶液)、跟用半固体制剂(眼膏剂、眼用
乳膏剂,眼用凝胶剂)等。
眼用制剂在生产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产及质量控制应符合相关品种要
求。
二、除另有规定外，滴眼剂应与泪液等渗，并应进行渗透压摩尔浓度测定。
三、滴眼剂每个容器的装量，除另有规定外，应不超过10ml。
四、眼膏剂的基质应过滤并灭菌。眼膏剂应均匀、细腻、无刺激性，易涂布
于眼部，便于药物分散和吸收。
五、包装容器应不易破裂，并清洗干净及灭菌，其透明度应不影响可见异物
检查。
六、除另有规定外，眼用制剂应置2～8℃避光、密封贮存和运输。
七、多剂量包装的眼用制剂在启用后最多可使用4周。 ·
眼用制剂应进行以下相应检查。
【可见异物】 除另有规定外，滴眼剂照町见异物检查法(附录V B)检查，应符
合规定。
【金属性异物】 除另有规定外，眼用半固体制剂按以下方法检查，金属性异
物检查应符合规定。
检查法 取供试品10支，分别将全部内容物置于底部平整光滑、无可见异物和
气泡、直径为6cm的平底培养皿中，加盖，置85℃保温2小时，使供试品摊布均
匀，室温放冷至凝固后，倒置于适宜的显微镜台上，用聚光灯从上方以45℃角
的入射光照射皿底，放大30倍，检视不小于50 μm且具有光泽的金属性异物数。
10个供试品中金属性异物超过8粒者，不得过1个，且其总数不得超过50粒；如不
符合上述规定，应另取20个复试；初、复试结果合并计算，30个中每个内含金
属性异物超过8粒者不得多于3个，且其总数不得超过150粒。
【重量差异或装置差异】 除另有规定外，单剂量包装的眼用半固体制剂应符
合规定。
检查法取供试品20个，分别称量内容物，计算平量，超过半均重量的±10％者
不得过2个，并不得有超过平均重量±20％者。
【装量】 除另有规定外，单剂量包装的眼用液体制剂装量应符合规定。
取供试品1个，分别将内容物倾尽，测定其装量，每个装量均不得少于其标
示量。
多剂量包装的眼用制剂，照最低装量检查法(附录VF)检查，应符合规定。
【无菌】 眼内注射溶液及供眼部手术、伤口、角膜穿通伤用的眼用制剂，照
无菌检查法(附录ⅫA)检查，应符合规定。
【微生物限度】 除另有规定外，照微生物限度检查法(附录Ⅻ(G)检查，应符合
规定。
凡规定进行无菌检查的眼用制剂，可不进行微生物限度检查。
页码数,2005版药典附录第31页
附录ⅥD乙醇残留量测定法
(康卫皿扩散法)
本法系依据乙醇在饱和碳酸钠溶液中加热逸出，被重铬酸钾硫酸溶液吸收
后呈黄绿至绿色，用比色法测定血液制品中乙醇残留量。
测定法在康卫皿外圈的凸出部位均匀涂抹凡士林，准确量取重铬酸钾一硫
酸溶液(称取重铬酸钾3．7g，加水150ml，充分溶解后缓慢加入硫酸280ml，放冷，
加水至500ml，摇匀)，2．0ml加入内圈中，量取饱和碳酸钠溶液[称取碳酸钠
(NazC03·10H20)适量，加等重量的水，充分摇匀，取上清液]1．5ml和精密量取的
供试品溶液1·5ml，加入外圈中，立即加盖玻璃板(粗糙面向下)密封扩散皿，摇
匀，80℃反应30分钟后，取内圈溶液，照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在
波长650nm处测定吸光度(A1)。精密称取无水乙醇适量，加水制成每lml中含乙醇
O·25mg的溶液，即为对照品溶液，精密量取对照品溶液1．5ml替代供试品，同法
操作，测定吸光度(A2)。A1读数不得大于A2。
书页号：2005版药典三部附录81页
附录Ⅻ F 异常毒性检查法
本法系生物制品的非特异性毒性的通用安全试验，检查制品中是否污染外
源性毒性物质以及是否存在意外的不安全因素。
检查法除另有规定外，异常毒性试验应包括小鼠试验和豚鼠试验。
(1) 小鼠试验法 除另有规定外，每批供试品用5只小鼠，注射前每只小鼠称
体重，应为18～22g。每只小鼠腹腔注射供试品0.5ml，观察7天。观察期内，小鼠
应全部健存，且无异常反应，到期时每只小鼠体重应增加，供试品判为合格。
如不符合上述要求，可用10只小鼠复试一次，判定标准同前。
(2) 豚鼠试验法 除另有规定外，每批供试品用2只豚鼠，注射前每只豚鼠称
体重，应为250～350g。每只豚鼠腹腔注射供试品5.0ml，观察7天。观察期内，豚
鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只豚鼠体重应增加，供试品判为合格。
如不符合上述要求，可用4只豚鼠复试一次，判定标准同前。
书页号：2005版药典三部附录14页
附录ⅡC荧光分析法
某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧
光。物质的激发光谱和荧光发射光谱，可以用作该物质的定性分析。当激发
光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其
发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用作定量分析。荧光分
析法的灵敏度一般较紫外可见分光光度法为高，但浓度太高的溶液会有“自熄
灭”作用，以及由于在液面附近溶液会吸收激发光，使发射光强度下降，导致
发射光强度与浓度不成正比，故荧光分析法应在低浓度溶液中进行。
测定法
所用的仪器为荧光计或荧光分光光度计，按各品种项下的规定，选定激发
光波长和发射光波长，并制备对照品溶液和供试品溶液。
通常荧光分析法都是在一定条件下，用对照品溶液测定荧光强度与浓度的
线性关系。当线性关系良好时，可在每次测定前，用一定浓度的对照品溶液
校正仪器的灵敏度；然后在相同的条件下，分别渎取对照品溶液及其试剂
空白的荧光强度与供试品溶液及其试剂空白的荧光强度，用下式计算供试品浓
度：
cx=Rx-Rxb/Rr-Rrb *Cr
式中cx为供试品溶液的浓度；
Cr为对照品溶液的浓度；
Rx为供试品溶液的荧光强度；
Rxb为供试品溶液试剂空白的荧光强度；
Rr为对照品溶液的荧光强度；
Rrb为对照品溶液试剂空白的荧光强度。
因荧光分析法中的浓度与荧光强度的线性较窄，故(Rx—Rxb)／(Rr一Rrh)应为
O．5～2；如有超过，应在调节溶液浓度后再测。偏离线性时应改用工作曲线
法。
对易被光分解或弛豫时间较长的品种，为使仪器灵敏度定标准确，避免因激
发光多次照射而影响荧光强度，可选择一种激发光和发射光波长与之近似而对
光稳定的物质配成适当浓度的溶液，作为基准溶液，例如蓝色荧光可用硫酸奎
宁的稀硫酸溶液，黄绿色荧光可用荧光素钠水溶液，红色荧光可用罗丹明B水
溶液等。在测定供试品溶液时用基准溶液代替对照品溶液校正仪器的灵敏度。
注意事项
荧光分析法因灵敏度高，故干扰因素也多。
1．溶剂不纯会带入较大误差，应先作空白检查，必要时，应用玻璃磨口蒸
馏器蒸馏后再用。
2·溶液中的悬浮物对光有散射作用，必要时，应用垂熔玻璃滤器滤过或用离
心法除去。
3．所用的玻璃仪器与测定池等也必须保持高度洁净。
4．温度对荧光强度有较大的影响，测定时应控制温度一致。
5·溶液中的溶氧有降低荧光作用。必要时可在测定前通入惰性气体除氧。
6·测定时需注意溶液的pH值和试剂的纯度等对荧光强度的影响。
页码数,2005版药典附录第34页
附录ⅥL游离甲醛测定法
本法系依据品红亚硫酸在酸性溶液中能与甲醛生成紫色复合物，用比色法
测定供试品中游离甲醛含量。
对照品溶液的制备精密量取已标定的甲醛溶液适量，置500ml量瓶中，用水
稀释至刻度，摇匀，制成0．05％甲醛对照品贮备液。
临用前，精密量取甲醛对照品贮备液lOml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，
摇匀，作为甲醛对照品溶液。
测定法精密量取供试品lml，用水稀释至甲醛含量约为O．005％，即为供试品
溶液。精密量取供试品溶液lml，置50ml具塞试管中，加水4ml，加品红亚硫酸溶
液lOml，混合酸溶液(取水783ml，置烧杯内，缓缓注入盐酸42ml、硫酸175ml，混
匀)10ml，摇匀，在25~C放置3小时，照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波
长590nm处测定吸光度。
精密量取O．005％甲醛对照品溶液0．5ml、1．Oml、1．5ml、2．Oml，分别置
50ml具塞试管中，自"加水4ml"起，同法操作。
以甲醛对照品溶液的浓度对相应的吸光度作直线回归，将供试品溶液的吸
光度代入回归方程，计算供试品中的游离甲醛含量。
【附注】 (1)品红亚硫酸溶液的制备及二氧化硫含量的标定称取碱性品红4．5g，
于3000ml锥形瓶中，加水1500ml，振摇或加温使品红全部溶解，待冷后，加亚
硫酸钠lOg，摇匀，静置5～10分钟，再加入3mol／L硫酸溶液40ml，摇匀，以橡皮
塞塞紧瓶口，放置过夜，如有颜色，加骨炭5～lOg迅速摇匀，以布氏漏斗快速
抽滤，即得品红亚硫酸溶液。品红亚硫酸溶液中的S02含量可控制在
28～48mmol／L(S02含量过多可通空气驱除，过少可通入S02)。
二氧化硫(SO2)含量测定 量取品红亚硫酸溶液10ml于锥形瓶内，加水20ml，淀
粉指示液5ml，用碘滴定液(O．05mol／L)滴定至呈浅蓝色，按下式计算S02的含量。
SO2的含量(mm01／L)=50*V*c
式中V为消耗碘滴定液(O．05mol／L)的体积，ml；
c为碘滴定液的浓度，mol／L。
(2)甲醛溶液的标定取甲醛溶液约1．5ml，精密称定，置锥形瓶中，加水10ml、
过氧化氢溶液25ml与溴麝香草酚蓝指示液2滴，滴加氢氧化钠滴定液(1mol／L)
至溶液显蓝色；再精密加入氢氧化钠滴定液(1mol／L)25ml，瓶口置一玻璃小漏
斗，置水浴中加热15分钟，不时振摇，冷却，用水洗涤漏斗，加溴麝香草酚蓝
指示液2滴，用盐酸滴定液(1mol／l)滴定至溶液显黄色，并将滴定的结果用空白
试验校正。每lml氢氧化钠滴定液(1mol／L)相当于30．03mg的甲醛。
(3)对照品溶液和供试品溶液与品红亚硫酸溶液的显色时间有时不一致，测定
时，显色慢者应酌情早加品红亚硫酸溶液。
(4)供试品中如含有酚红，标准管中应予以校正。
书页号：2005版药典三部附录100页
附录ⅩⅥ 原子量表
(〈12〉C=12.00)
(录自2001年国际原子量表)
┏━━━━┳━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━┳━━━━━━━━┓
┃中文名 ┃ 英文名 ┃ 符号 ┃ 原子量 ┃ 中文名 ┃ 英文名 ┃ 符号 ┃ 原子量 ┃
┣━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━╋━━━━━━━━┫
┃ 氢 ┃Hydrogen ┃ H ┃ 1.00794(7) ┃ 硅 ┃ Silicon ┃ Si ┃ 28.0855(3) ┃
┃ 氦 ┃ Helium ┃ He ┃ 4.002602(2) ┃ 磷 ┃ Phosphorus ┃ P ┃ 30.973761(2) ┃
┃ 锂 ┃ Lithium ┃ Li ┃ 6.941(2) ┃ 硫 ┃ Sulfur ┃ S ┃ 32.065(5) ┃
┃ 硼 ┃ Boron ┃ B ┃ 10.811(7) ┃ 氯 ┃ Chlorine ┃ Cl ┃ 35.453(2) ┃
┃ 碳 ┃ Carbon ┃ C ┃ 12.0107(8) ┃ 氩 ┃ Argon ┃ Ar ┃ 39.948(1) ┃
┃ 氮 ┃ Nitrogen ┃ N ┃ 14.0067(2) ┃ 钾 ┃ Potassium(Kalium) ┃ K ┃ 39.0983(1) ┃
┃ 氧 ┃ Oxygen ┃ O ┃ 15.9994(3) ┃ 钙 ┃ Calcium ┃ Ca ┃ 40.078(4) ┃
┃ 氟 ┃ Fluorine ┃ F ┃ 18.9984032(5) ┃ 钛 ┃ Titanium ┃ Ti ┃ 47.867(1) ┃
┃ 钠 ┃ Sodium(Natrium) ┃ Na ┃ 22.989770(2) ┃ 钒 ┃ Vanadium ┃ V ┃ 50.9415(1) ┃
┃ 镁 ┃Magnesium ┃ Mg ┃ 24.3050(6) ┃ 铬 ┃ Chromium ┃ Cr ┃ 51.9961(6) ┃
┃ 铝 ┃ Aluminium ┃ Al ┃ 26.981538(2) ┃ 锰 ┃ Manganese ┃ Mn ┃ 54.938049(9) ┃
┗━━━━┻━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━┻━━━━━━━━┛
续表
┏━━━━┳━━━━━━━━━┳━━━┳━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━━┳━━━┳━━━━━━━━┓
┃ 中文名 ┃ 英文名 ┃ 符号 ┃ 原子量 ┃ 中文名 ┃ 英文名 ┃ 符号 ┃ 原子量 ┃
┣━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━╋━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━╋━━━━━━━━┫
┃ 铁 ┃Iron(Ferrum) ┃ Fe ┃ 55．845(2) ┃ 锡 ┃Tin(Stannum) ┃ Sn ┃ 118．710(7) ┃
┃ 钴 ┃Cobalt ┃ Co ┃ 58．933200(9) ┃ 锑 ┃Antimony(Stibium) ┃ Sb ┃ 121．760(1) ┃
┃ 镍 ┃ Nickel ┃ Ni ┃ 58．6934(2) ┃ 碘 ┃Iodine ┃ I ┃ 126．90447(3) ┃
┃ 铜 ┃ Copper(Cuprum) ┃ Cu ┃ 63．546(3) ┃ 碲 ┃ Tellurium ┃ Te ┃ 127．60(3) ┃
┃ 锌 ┃ Zinc ┃ Zn ┃ 65．409(4) ┃ 氙 ┃ Xenon ┃ Xe ┃ 131．293(6) ┃
┃ 镓 ┃ Gallium ┃ Ga ┃ 69．723(1) ┃ 钡 ┃ Barium ┃ Ba ┃ 137．327(7) ┃
┃ 锗 ┃ Germanium ┃ Ge ┃ 72．64(1) ┃ 镧 ┃ Lanthanum ┃ La ┃ 138．9055(2) ┃
┃ 砷 ┃ Arsenic ┃ As ┃ 74．92160(2) ┃ 铈 ┃ Cerium ┃ Ce ┃ 140．116(1) ┃
┃ 硒 ┃ Selenium ┃ Se ┃ 78．96(3) ┃ 钬 ┃ Holmium ┃ Ho ┃ 164．93032(2) ┃
┃ 溴 ┃ Bromine ┃ Br ┃ 79．904(1) ┃ 镱 ┃ Ytterbium ┃ Yb ┃ 173．04(3) ┃
┃ 锶 ┃ Strontium ┃ Sr ┃ 87．62(1) ┃ 钨 ┃ Tungsten(Wolfram) ┃ W ┃ 183．84(1) ┃
┃ 锆 ┃ Zirconium ┃ Zr ┃ 91．224(2) ┃ 铂 ┃Platinum ┃ Pt ┃ 195．078(2) ┃
┃ 钼 ┃ Molybdenum ┃ Mo ┃ 95．94(2) ┃ 金 ┃ Gold(Aurum) ┃ Au ┃ 196．96655(2) ┃
┃ 锝 ┃ Technetium ┃ Tc ┃ [99] ┃ 汞 ┃Mercury(Hydrargyrum) ┃ Hg ┃ 200．59(2) ┃
┃ 钯 ┃ Palladium ┃ Pd ┃ 106．42(1) ┃ 铅 ┃Lead(Plumbum) ┃ Pb ┃ 207．2(1) ┃
┃ 银 ┃ Silver(Argentum) ┃ Ag ┃ 107．8682(2) ┃ 铋 ┃Bismuth ┃ Bi ┃ 208．98038(2) ┃
┃ 镉 ┃Cadmium ┃ Cd ┃ 112．411(8) ┃ 钍 ┃ Thorium ┃ Th ┃ 232．0381(1) ┃
┃ 铟 ┃ Indium ┃ In ┃ 114．818(3) ┃ 铀 ┃ Uranium ┃ U ┃ 238．02891(3) ┃
┗━━━━┻━━━━━━━━━┻━━━┻━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━━━┻━━━┻━━━━━━━━┛
注：1．原子量末位数的准确度加注在其后括号内。
2．中括号内的数字是半衰期最长的放射性同位素的质量数。
书页号：2005版药典三部附录14页
附录ⅡB原子吸收分光光度法
原子吸收分光光度法的测量对象是呈原子状态的金属元素和部分非金属元
素，系由待测元素灯发出的特征谱线通过供试品经原子化产生的原子蒸气时，
被蒸气中待测元素的基态原子所吸收，通过测定辐射光强度减弱的程度，求出
供试品中待测元素的含量。原子吸收一般遵循分光光度法的吸收定律，通常借
比较对照品溶液和供试品溶液的吸光度，求得供试品中待测元素的含量。
对仪器的一般要求
所用仪器为原子吸收分光光度计，它由光源、原子化器、单色器和检测系统
等组成，另有背景校正系统、自动进样系统等。
l．光源常用待测元素作为阴极的空心阴极灯。
2．原子化器 主要有四种类型：火焰原子化器、石墨炉原了化器、氢化物
发生原子化器及冷蒸气发牛原子化器。
(1)火焰原子化器 由雾化器及燃烧灯头等主要部件组成。其功能是将供试品
溶液雾化成气溶胶后，再与燃气混合，进入燃烧灯头产生的火焰中，以干燥、
蒸发、离解供试品，使待测元素形成基态原子。燃烧火焰由不同种类的气体混
合物产生，常用乙炔空气火焰。改变燃气和助燃气的种类及比例可以控制火焰
的温度，以获得较好的火焰稳定性和测定灵敏度。
(2)石墨炉原子化器 由电热石墨炉及电源等部件组成。其功能是将供试品溶
液干燥、灰化，再通过高温原子化阶段使待测元素形成基态原子。 一般以石
墨作为发热体，炉中通入保护气，以防氧化并能输送试样蒸气。
(3)氢化物发生原子化器 由氢化物发生器和原子吸收池组成，可用于砷、硒、
锡、锑等元素的测定。其功能是将待测元素在酸性介质中还原成低沸点、易受
热分解的氢化物，再由载气导入由石英管、加热器等组成的原子吸收池，在吸
收池中氢化物被加热分解，并形成基态原子。
(4)冷蒸气发生原子化器 由汞蒸气发生器和原子吸收池组成，专门用于汞的
测定。其功能是将供试品溶液中的汞离子还原成汞蒸气，再由载气导入石英原
子吸收池，进行测定。
3．单色器其功能是从光源发射的电磁辐射中分离出所需要的电磁辐射，仪
器光路应能保证有良好的光谱分附录lIC荧光分析法辨率和在相当窄的光谱带
(O．2nm)下正常工作的能力，波长范围一般为1 90．O～900．0nm。
4·检测系统 由检测器、信号处理器和指示记录器组成·应具有较高的灵敏度
和较好的稳定性，并能及时跟踪吸收信号的急速变化。
5．背景校正系统 其作用是校正供试品原子化时蒸气相对吸收测定的干扰，
常用的背景校正系统有以下四种：连续光源(在紫外区通常用氘灯)、塞曼效应、
自吸效应、非吸收线等。
在原子吸收分光光度分析中，必须注意背景以及其他原因引起的对测定的
干扰。仪器某些工作条件(如波长、狭缝、原子化条件等)的变化可影响灵敏
度、稳定程度和干扰情况。在火焰法原子吸收测定中可采用选择适宜的测定
谱线和狭缝、改变火焰温度、加入络合剂或释放剂、采用标准加入法等方法消
除干扰；在石墨炉原子吸收测定中可采用选择适宜的背景校正系统、加入适
宜的基体改进剂等方法消除干扰。具体方法应按各品种项下的规定选用。
测定法
第一法(标准曲线法) 在仪器推荐的浓度范围内，制备含待测元素的对照品溶
液至少3份，浓度依次递增，并分别加入各品种项下制备供试品溶液的相应试
剂，同时以相应试剂制备空白对照溶液。将仪器按规定启动后，依次测定空白
对照溶液和各浓度对照品溶液的吸光度，记录读数。以每一浓度3次吸光度读数
的平均值为纵坐标、相应浓度为横坐标，绘制标准曲线。按各品种项下的规定
制备供试品溶液，使待测元素的估计浓度在标准曲线浓度范围内，测定吸光
度，取3次读数的平均值，从标准曲线上查得相应的浓度，计算元素的含量。
第二法(标准加入法) 取同体积按各品种项下规定制备的供试品溶液4份，分别
置4个同体积的量瓶中，除(1)号量瓶外，其他量瓶分别精密加入不同浓度的待
测元素对照品溶液，分别用去离子水稀释至刻度，制成从零开始递增的一系列
溶液。按上述标准曲线法自“将仪器按规定启动后”操作，测定吸光度，记录读
数；将吸光度读数与相应的待测元素加入量作图，延长此直线至与含量轴的
延长线相交，此交点与原点问的距离即相当于供试品溶液取用量中待测元素的
含量(如图，图略)。再以此计算供试品中待测元素的含量。此法仅适用于第一法标准
曲线呈线性并．通过原点的情况。
当用于杂质限度检查时，取供试品，按各品种项下的规定，制备供试品溶
液；另取等量的供试品，加入限度量的待测元素溶液，制成对照品溶液。照上
述标准曲线法操作，设对照品溶液的读数为a，供试品溶液的读数为b，b值应小
于a-b。
书页号：2005版药典三部附录75页
附录Ⅻ B 支原体检查法
主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行
支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞法(DNA染色法)。病毒类疫苗的病
毒收获液、原液采用培养法检查支原体，必要时，亦可采用指示细胞法筛选培
养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。
第一法 培养法
推荐培养基及其处方
(1) 支原体肉汤培养基
猪胃消化液 500ml 氯化钠 2.5g
牛肉浸液(1：2) 500ml 葡萄糖 5.0g
酵母浸粉 5.0g 酚红 0.02g
pH值7.6±0.2。于121℃灭菌15分钟。
(2) 精氨酸支原体肉汤培养基
猪胃消化液 500ml 葡萄糖 1.0g
牛肉浸液(1：2) 500ml L-精氨酸 2.0g
酵母浸粉 5.0g 酚红 0.02g
氯化钠 2.5g
pH值7.1±0.2。于121℃灭菌15分钟。
(3) 支原体半流体培养基 按(1)项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂
2.5～3.0g。
(4) 支原体琼脂培养基 按(1)项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂
13.0～15.0g。
培养基灵敏度检查(变色单位试验法) (1) 菌种肺炎支原体(ATCC 15531株)，口腔
支原体(ATCC 23714株)。由国家药品检定机构分发。
(2) 操作 将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变
色，盲传两代后，将培养物接种到待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体
稀释至10〈-7〉～10〈-9〉，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至
10〈-3〉～10〈-5〉，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种3支试
管，置36℃±1℃培养7～14天观察培养基变色结果。
(3) 结果判定 以接种后培养基管数的2/3以上呈现变色的最高稀释度为该培养
基的灵敏度。
液体培养基的灵敏度：肺炎支原体(ATCC 15531株)应达到10〈-8〉，口腔支原
体(ATCC 23714株)应达到10〈-4〉。
检查法 (1) 供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查者可贮存于2～8℃；
超过24小时应置－20℃以下贮存。
(2) 检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基(或支原体琼脂
培养基)。半流体培养基(或琼脂培养基)在使用前应煮沸10～15分钟，冷却至56℃
左右，然后加入灭能小牛血清(培养基：血清为8：2)，并可酌情加入适量青霉素，
充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。
取每支装量为10ml的支原体半流体培养基(已冷至36℃±1℃)和支原体肉汤培养
基各4支，每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃±1℃培养21天。于接种后的第
7天从4支中取2支进行次代培养，每一支培养基转种支原体半流体培养基及支原
体肉汤培养基各2支，置36℃±1℃培养21天，每隔3天观察一次。
(3) 结果判定 培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试
品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，
供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。
【附注】 质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏
度。
第二法 指示细胞培养法(DNA染色法)
将供试品接种于指示细胞(无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其
他细胞)中培养后，用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体，在荧光显微镜
下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。
试剂 (1) 二苯甲酰胺荧光染料(Hoechst 33258)浓缩液 称取二苯甲酰胺荧光染料
5mg，加入100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank※s平衡盐溶液中，在室温用磁力搅拌
30～40分钟，使完全溶解，－20℃避光保存。
(2) 二苯甲酰胺荧光染料工作液 无酚红和碳酸氢钠的Hank※s溶液100ml中加入二
苯甲酰胺荧光染料浓缩液1ml，混匀。
(3) 固定液乙酸：甲醇(1：3)混合溶液。
(4) 封片液 量取0.1mol/L枸橼酸溶液22.2ml、0.2mol/L磷酸氢二钠溶液27.8ml、甘油
50.0ml混匀，调pH至5.5。
培养基及指示细胞 (1) DMEM完全培养基
(2) DMEM无抗生素培养基
(3) 指示细胞(已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞) 取培养的Vero
细胞经消化后，制成每1ml含10〈5〉的细胞悬液，以每孔0.5ml接种6孔细胞培养板
或其他容器，每孔再加无抗生素培养基3ml，于5%二氧化碳孵箱36℃±1℃培养过
夜，备用。
供试品处理 (1) 细胞培养物 将供试品经无抗生素培养液至少传一代，然后
取细胞已长满的且3天未换液的细胞培养上清液待检。
(2) 毒种悬液 如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时，应用对支
原体无抑制作用的特异抗血清中和病毒后或用不产生细胞病变的另一种指示细
胞进行检查。
(3) 其他供试品 检查时所选用的指示细胞应为该供试品对其生长无影响的细
胞。
测定法 于制备好的指示细胞培养板中加入供试品(细胞培养上清液)2ml(毒种
或其他供试品至少1ml)，置5%二氧化碳孵箱36℃±1℃培养3～5天。指示细胞培养
物至少传代1次，末次传代培养用含盖玻片的6孔培养板培养3～5天后，吸出培养
孔中的培养液，加入固定液5ml，放置5分钟，吸出固定液，再加5ml固定液固定10
分钟，吸出固定液，使盖玻片在空气中干燥，加二苯甲酰胺荧光染料(或其他
DNA染料)工作液5ml，加盖，室温放置30分钟，吸出染液，每孔用水5ml洗3次，吸
出水，盖玻片于空气中干燥，取洁净载玻片加封片液一滴，分别将盖玻片面向
下盖在封片液上制成封片。用荧光显微镜观察。
用无抗生素培养基2ml替代供试品，同法操作，作为阴性对照。
用已知阳性的供试品标准菌株2ml替代供试品，同法操作，作为阳性对照。
结果判定 (1) 阴性对照 仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。
(2) 阳性对照 荧光显微镜下除细胞外，可见大小不等、不规则的荧光着色颗
粒。
当阴性及阳性对照结果均成立时，试验有效。
如供试品结果为阴性，则供试品判为合格；如供试品结果为阳性或可疑时，
应进行重试；如仍阳性时，供试品判为不合格。
页码数,2005版药典附录第15页
附录ⅢA纸色谱法
纸色谱法系以纸为载体，以纸上所含水分或其他物质为固定柑，用展开剂
进行展开的分配色谱。供试品经展开后，可用比移值(Rf)表示其各组成成分的
位置(比移值一原点中心至斑点中心的距离／原点中心至展开剂前沿的距离)，
但由于影响比移值的因素较多，凶而一般采用在相同实验条件下与对照物质对
比以确定其异同。作为药品的鉴别时，供试品在色谱图中所显主斑点的位置与
颜色(或荧光)，应与对照品在色谱图中所显主斑点相同。作为药品的纯度检查
时，可取一定量的供试品，经展开后，按各品种项下的规定，检视其所显杂
质斑点的个数或呈色深度(或荧光强度)。作为药品的含量测定时，将主色谱斑
点剪下洗脱后．冉用适宜的方法测定。
1．仪器与材料
(1)展开容器通常为圆形或长方形玻璃缸，缸上具 有磨口玻璃盖，应能密闭。
用于下行法时，盖上有孔，可插入分液漏斗，用以加入展开剂。在近顶端有一
用支架架起的玻璃槽作为展开剂的容器，槽内有一玻棒，用以压住 色谱滤纸；
槽的两侧各支一玻棒，用以支持色谱滤纸使其自然下垂，避免展开剂沿色谱滤
纸与溶剂槽之间发生虹吸现象。用于上行法时，在盖上的孔中加塞，塞中插入
玻璃悬钩，以便将点样后的色谱滤纸挂在钩上；并除去溶剂槽 和支架。
(2)点样器 常用具支架的微量注射器或定量毛细管，应能使点样位置正确、集
中。
(3)色谱滤纸应质地均匀平整，具有一定机械强度，不含影响展开效果的杂
质；也不应与所用显色剂起作用，以致影响分离和鉴别效果，必要时可进行处
理后再用。用于下行法时，取色谱滤纸按纤维长丝方向切成适当大小的纸条，
离纸条上端适当的距离(使色谱滤纸上端能足够浸入溶剂槽内的展开剂中，并使
点样基线能在溶剂槽侧的玻璃支持棒下数厘米处)用铅笔划一点样基线，必要
时，可在色谱滤纸下端切成锯齿形便于展开剂滴下。用于上行法时，色谱滤纸
长约25cm，宽度则按需要而定，必要时可将色谱滤纸卷成筒形；点样基线距底
边约2．5cm。
2．操作方法
(1)下行法将供试品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用定量毛细管
或微量注射器吸取溶液，点于点样基线上，溶液宜分次点加，每次点加后，俟
其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干，样点直径为2～4mm，点间距离约为
1．5～2．0cm，样点通常应为圆形。
将点样后的色谱滤纸的点样端放在溶剂槽内并用玻棒压住，使色谱滤纸通过
槽侧玻璃支持棒自然下垂，点样基线在支持棒下数厘米处。展开前，展开缸内
用各品种项下规定的溶剂的蒸气使之饱和，一般可在展开缸底部放一装有规定
溶剂的平皿或将浸有规定溶剂的滤纸条附着在展开缸内壁上，放置一定时间，
俟溶剂挥发使缸内充满饱和蒸气。然后添加展开剂使浸没溶剂槽内的色谱滤
纸，展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸移动进行展开，展开至规定的距离后，
取出色谱滤纸，标明展开剂前沿位置，俟展开剂挥散后按规定方法检出色谱斑
点。
(2)上行法点样方法同下行法。展开缸内加入展开剂适量，放置俟展开剂蒸气
饱和后，再下降悬钩，使色谱滤纸浸入展开剂约O．5cm，展开剂即经毛细管作
用沿色谱滤纸上升，除另有规定外，一般展开至约15cm后，取出晾干，按规定
方法检视。
展开可以单向展开，即向一个方向进行；也可进行双向展开，即先向一个
方向展开，取出，俟展开剂完全挥发后，将滤纸转动90。，再用原展开剂或另
一种展开剂进行展开；亦可多次展开、连续展开或径向展开等。
书页号：附录 5
附录I 制剂通则
本通则适用于治疗用生物制品，包括血液制品、免疫血清、细胞因子、单克隆
抗体、免疫调节剂、微生态制剂等。预防用生物制品，按具体品种的要求进行。
页码数,2005版药典附录第49页
附录ⅨG质粒丢失率检查法
大肠杆菌表达系统的工程菌含有表达目的蛋白的表达质粒，质粒上一般带
有抗生素抗性基因便于筛选，在菌体传代过程中，在一定浓度的抗生素环境
下(如种子培养液)，质粒丢失后菌体便不能存活，而在不含抗生素的发酵培养
液中，随着传代代次的提高，可能有部分大肠杆菌丢失了质粒，失去了抗生素
抗性基因，也同时失去表达目的蛋白的能力。通过比较在含有或不含抗生素培
养基的菌体存活数，可以检测质粒的丢失率，考察质粒稳定性。
实际操作中一般用模拟发酵或发酵过程实时收集的发酵液，包括最后阶段(
传代最多代次)的收集液，经过适当稀释后涂布于不含抗生素的培养基上，在
37℃培养过夜；挑取不少于100个单菌落，分别接种到含抗生素和不含抗生素的
培养皿中，在37℃培养过夜。比较二者差异，一般应重复2次以上，计算质粒丢
失率。工艺验证中应规定质粒丢失率，并应在允许的范围内。
页码数,2005版药典附录第60页
附录X I重组链激酶生物学活性测定法
本法系依据链激酶和纤溶酶原形成的复合物能激活游离的纤溶酶原为有生
物学活性的纤溶酶，纤溶酶能降解人纤维蛋白为可溶性的纤维蛋白片段，在纤
维蛋白平板上出现透明的溶解圈，以此定量测定重组链激酶的生物学活性。
试剂 (1)人凝血酶溶液用生理氯化钠溶液配制成每lml含100IU，于-20℃保存。
(2)人纤溶酶原溶液用生理氯化钠溶液配成每lml含0．5mg，于-20℃保存。
(3)人纤维蛋白原溶液试验前配制，配制前将人纤维蛋白原和备用的生理氯
化钠溶液均在37℃水浴预热15分钟，然后用适量生理氯化钠溶液溶解，37℃水浴
静置保温30分钟使其完全溶解，配制成每lml含6mg溶液待用。
标准品溶液的制备按使用说明书，将重组链激酶生物学活性测定国家标准
品复溶后，用生理氯化钠溶液稀释成每lml含1000IU、250IU、62．5IU、15．6IU、
3．9IU等5个稀释度，待用。
供试品溶液的制备供试品按标示量加生理氯化钠溶液复溶后，用生理氯化
钠溶液稀释至约每lml含100 IU或1μg。
测定法取琼脂糖125mg，加生理氯化钠溶液23ml，煮沸使之溶胀，置55～60℃水
浴中平衡，加每lml含100 Iu人凝血酶溶液14μl，人纤溶酶原溶液(每lml含0．5mg)
280μ1，边加边摇匀，加每lml含6mg人纤维蛋白原溶液2．2ml，不停地摇匀，浑浊
后立即倒入直径8cm的平皿中，水平放置充分凝固后，4℃放置至少30分钟待
用(应在两天之内使用)。在含纤维蛋白平皿内打孔，孔径为2mm，在孔内分别加
入供试品溶液和标准品溶液，每孔10μl，每个稀释度做两个孔，37℃湿盒水平放
置24小时。纵向和横向量取溶圈直径，各2次，取平均值。以标准品溶液各个稀
释度的生物学活性的对数对相应的溶圈直径的对数进行直线回归，并求得回归
方程，根据供试品的溶圈直径的对数求得供试品的生物学活性。
页码数,2005版药典附录第57页
附录X D重组人白介素-2生物学活性测定法(CTLL-2细胞／MTT比色法)
本法系根据在不同白介素-2(IL-2)的浓度下，其细胞依赖株CTLL-2细胞存活率
不同，以此检测IL-2的生物学活性。
试剂(1)RPMI 1640培养液取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀
释至1000ml，加青霉素10 5 IU和链霉素10 5 IU，再加碳酸氢钠2．1g，溶解后，混
匀，除菌过滤，4℃保存。
(2)基础培养液 取新生牛血清(FBS)10ml，加RPMI 1640培养液90ml。4℃保存。
(3)完全培养液取基础培养液100ml，加重组人白介素-2至终浓度400～800IU。4℃
保存。
(4)PBS取氯化钠8．Og、氯化钾0．20g、磷酸氢二钠1．44g、磷酸二氢钾O．24g，
加水溶解并稀释至1000ml，经121℃15分钟灭菌。
(5)噻唑蓝(MTT)溶液取MTT 0．1g，加PBS溶解并稀释成20ml，经O．22μm滤膜过
滤除菌。4℃避光保存。
(6)裂解液15％十二烷基硫酸钠溶液，使用期限不得超过12个月。
CTLL-2细胞应为偏酸性、略微浑浊液体，传代后48～60小时用于重组人白介
素-2生物学活性测定。
标准品溶液的制备 取重组人白介素-2生物学活性测定的国家标准品，按使用
说明书复溶后，用基础培养液稀释至每lml含2001U。在96孔细胞培养板中，做2倍
系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔。每孔分别留50μl标准品溶液，弃
去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释成每lml约含
200IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2
孔。每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下
进行。
测定法CTLL-2细胞用完全培养液于37℃、5％二氧化碳条件下培养至足够量，
离心收集CTLL-2细胞，用RPMI 1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液中配
制成每lml含6．O×10 5个细胞的细胞悬液，置37℃5％二氧化碳条件下备用。在
加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬液50μ1，
于37~C、5％二氧化碳培养18～24小时。然后每孔加入MTT溶液20μl，于37℃，
5％二氧化碳培养4～6小时后，每孔加入裂解液150μl，于37℃、5％二氧化碳条
件下保温18～24小时。以上操作均在无菌条件下进行。混匀细胞板中的液体，
放人酶标仪，以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试
验结果
供试品生物学活性(IU／m1)=Pr*Ds*Es/Dr*Er
式中Pr为标准品生物学活性，Iu／ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
E为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效稀释倍数。
页码数,2005版药典附录第60页
附录X H重组人表皮生长因子生物学活性测定法
(细胞增殖法／MTT比色法)
本法系依据重组人表皮生长因子对小鼠胚胎成纤维细胞(Balb／c 3T3细胞)的
生长具有刺激作用，Balb／c 3T3细胞的生长状况因重组人表皮生长因子生物学
活性的不同而异，以此检测重组人表皮生长因子的生物学活性。
试剂(1)RPMI 1640培养液RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀释
至1000ml，加青霉素10 5IU和链霉素10 5Iu，再加碳酸氢钠2．1g，溶解后，混匀，
除菌过滤，4℃保存。
(2)维持培养液 量取新生牛血清4ml，加RPMI1640培养液至1000ml。
(3)完全培养液量取新生牛血清100ml，加RPMI1640培养液至1000ml。
(4)PBS取氯化钠8g、氯化钾O．2g、磷酸氢二钠1．44g、磷酸二氢钾O．24g，
加水溶解并稀释至1000ml的溶液，经121℃ 15分钟灭菌。
(5)噻唑蓝(MTT)溶液取MTT粉末0．10g，加PBS 20ml使溶解，经O．22／μm滤膜
过滤除菌。4℃避光保存。
标准品溶液的制备取重组人表皮生长因子标准品按说明书复溶后，用维持培
养液稀释至每lml含50IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，
每个浓度做2个孔。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备将供试品按标示量复溶后，用维持培养液稀释成每lml约
含50IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2个
孔。以上操作在无菌条件下进行。
测定法 Balb／c 3T3细胞株用完全培养液于37℃、5％二氧化碳培养，控制细胞
浓度为每lml含1．0×10 5～5．0*10 6个细胞，传代后24～36小时用于生物学活性测
定。弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞 用完全培养液配成每lml含
5．0* 10 4～8．0×10 4个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μ1。
在37℃、5％二氧化碳条件下培养。24小时后换成维持培养液。置37℃、5％二氧
化碳培养24小时。制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和供试品溶
液，每孔100μ1。置37℃、5％二氧化碳培养64～72小时。每孔加入MTT溶液20μl，
于37℃、5％二氧化碳培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中
的液体后，向每孔中加入二甲基亚砜(DMSO)100μ1，混匀后在酶标仪上，以630nm
为参比波长，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算结果
供试品生物学活性(IU／m1)=Pr*Ds*Es/Dr*Er
式中Pr为标准品生物学活性，IU／ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效稀释倍数。
页码数,2005版药典附录第56页
附录X B 重组人促红素体内生物学 活性测定法(网织红细胞法)
本法系依据人促红素(EPO)可刺激网织红细胞生成的作用，给小鼠皮下注射
EPO后，其网织红细胞数量EPO注射剂量的增加而升高。利用网织红细胞数对红
胞数的比值变化，通过剂量一反应平行线法检测EPO体生物学活性。
试剂 (1)乙二胺四乙酸二钾抗凝剂称取乙二胺乙酸二钾100mg，加生理氯化钠
溶液10ml溶解，混匀使用时新鲜配制。
(2)稀释液取O．1g牛血清白蛋白，加生理氯化溶液溶解并稀释至100ml，即得。
标准品溶液的制备按标准品说明书，将EPO标品复溶，用稀释液将EPO标准品
稀释成高、中、低3剂量EPO标准溶液。
供试品溶液的制备 用稀释液将供试品稀释成中、低3个剂量与EPO标准溶液
单位相近的供试品溶液。
测定法 按低、中、高(如10IU／鼠、20IU／401U／鼠)3个剂量组，分别给近交系
6～8周龄小鼠 性BALB／C小鼠)或B6D2F1小鼠皮下注射EPO标准品及供试品溶液，
每组至少4只，每鼠注射量为不大于O．5ml。在注射后的第4天从小鼠眼眶采血
3～4滴，置于预先加入200μl EDTA-K2抗凝剂的采血管中。取抗凝用全自动网织红
细胞分析仪计数每只小鼠血液中的网织红细胞数对红细胞总数的比值(Ret％)。
按注射剂量(IU)对Ret％的量反应平行线测定法(二部附录XIV)计算试品体内生物学
活性。
页码数,2005版药典附录第58页
附录X E重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定法(NFS-60细胞／MTT比色法)
本法系依据小鼠骨髓白血病细胞(NFS-60细胞)的生长状况因重组人粒细胞刺
激因子(G-CSF)生物学活性的不同而不同，以此检测G-CSF的生物学活性。
试剂(1)RPMI 1640培养液取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀
释至1000ml，加青霉素10 5 IU和链霉素10 5 IU，再加碳酸氢钠2．1g，溶解后，混
匀，除菌过滤，4℃保存。
(2)基础培养液取新生牛血清100ml，加入RPMI 1640培养液900ml中。4℃保存。
(3)完全培养液基础培养液中加入重组人粒细胞刺激因子至最终浓度为每lml
含20ng或每lml含3000IU
(4)PBS取氯化钠8g、氯化钾0．2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾O．24g，加
水溶解并稀释成1000ml，经121℃ 15分钟灭菌。
(5)噻唑蓝(MTT)溶液取MTT粉末0．10g，加入PBS 20ml中，配制成每lml含5．0mg
的溶液，经0·22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。
(6)裂解液取盐酸14ml、Triton X-100溶液50ml，加异丙醇，配制成500ml的溶液。
室温避光保存。
标准品溶液的制备取重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定标准品按说明
书复溶后，用基础培养液稀释至每lml含50～100IU。在96孔细胞培养板中，进行
2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔，每孔分别留50μl标准品溶
液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释成约每lml
含50～100IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释
度做2个孔，每孔分别留50μ1供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无
菌条件下进行。
测定法NFS-60细胞株用完全培养液于37℃、5％二氧化碳培养，控制细胞浓度
为每lml含1．0* 10 5～4·0*10 5个细胞，传代后24～36小时用于生物学活性测定。将
试验所用溶液预温至37℃。取足量NFS-60细胞培养物，离心收集NFS-60细胞，用
RPMI 1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液配成每lml含2．O×10 5个细胞的
细胞悬液，置37℃备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中
每孔加入细胞悬液50ml，于37℃、5％二氧化碳培养40～48小时。每孔加入MTT
溶液20μl，于37℃、5％二氧化碳培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。每
孔加入裂解液100μl，混匀后，放入酶标仪，以630nm为参比波长，于波长570nm
处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算结果
供试品生物学活性(IU7m1)=Pr*Ds*Es/Dr*Er
式中Pr为标准品生物学活性，IU／ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效稀释倍数。
页码数,2005版药典附录第58页
附录X F重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子生物学活性测定法
(TF_1细胞／MTT比色法)
本法系依据人红细胞白血病细胞(简称TF-1细胞)的生长状况因重组人粒细胞
巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)生物学活性的不同而不同，以此检测GM-CSF的生物
学活性。
试剂(1)RPMI 1640培养液取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀
释至1000ml，加青霉素10 5IU和链霉素10 5IU，再加碳酸氢钠2．1g，溶解后，混
匀，除菌过滤，4℃保存。
(2)基础培养液取新生牛血清100ml，加入RPMI1640培养液900ml中。4℃保存。
(3)完全培养液基础培养液加重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子至终浓度为每lml
含5．0ng或每lml含80IU。
(4)PBS取氯化钠8g、氯化钾0．2g，磷酸氢二钠1．44g、磷酸二氢钾O．24g，加
水溶解并稀释至1000m1，经121℃ 15分钟灭菌。
(5)噻唑蓝(MTT)溶液取MTT粉末0．10g，溶于PBS 20ml中，配制成每lml含5mg的
溶液，经O．22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。
(6)裂解液取盐酸14ml、Triton X-100溶液50ml，加异丙醇配制成500ml的溶液。
标准品溶液的制备取重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子标准品按说明书复溶
后，用基础培养液稀释至每lml含10～20IU。在96孔细胞培养板中，进行2倍系列
稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔。每孔分别留50μl 标准品溶液，弃去
孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释成约每lml含
10～20IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2
个孔。每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件
下进行。
测定法TF-1细胞株用完全培养液于37℃、5％二氧化碳培养，控制细胞浓度为
每lml含2．O×10 5～7．0×10 5个细胞，传代后24～36小时用于生物学活性测定。将
试验所用溶液预温至37℃。取足量TF-1细胞培养物，离心并收集TF-1细胞，用基
础培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液中配成每lml含4．0×10 5个细胞的细胞
悬液，置37℃备用。向加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中加入
细胞悬液，每孔50μl，于37℃、5％二氧化碳培养48～52小时后，每孔加入MTT
溶液20μl，于37℃、5％二氧化碳培养5小时，以上操作在无菌条件下进行。再
向上述各孔加裂解液100μl，混匀后，放入酶标仪，以630nm为参比波长，于波
长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算结
果
供试品生物学活性(IU／m1)=Pr*Ds*Es/Dr*Er
式中Pr为标准品生物学活性，IU／ml；
Ds 为供试品预稀释倍数；
Dr 为标准品预稀释倍数；
Es 为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er 为标准品半效稀释倍数。
页码数,2005版药典附录第56页
附录X A重组乙型肝炎疫苗(酵母)体外相对效力检查法
本法系以酶联免疫法测定供试品中的乙型肝炎表面抗原(HgsAg)含量，并以参
考品为标准，采用双平行线分析法计算供试品的相对效力。
试剂 (1)PBS(pH7．2)取氯化钠8．850g、磷酸二氢钠(NaH2P04·2H20)O．226g和磷酸
氢二钠(Na2HP04．12H2O)1．698g，加适量水溶解，调pH至7．2，加水稀释至1000ml。
(2)供试品处理液 取20％二乙醇胺1．25ml和10％Triton X-100 0．20ml，加PBS
8．55ml，混匀备用。
(3)供试品稀释液取牛血清白蛋白10．Og，加PBS溶解并稀释至1000ml，备用。
参考品溶液及供试品溶液的制备精密量取参考品及供试品O．1ml，各加入
0．1ml供试品处理液，加盖混匀，在20～28℃静置30～35分钟。将处理后的参考
品和供试品分别以供试品稀释液进行适当稀释，稀释后取1：2000、1：4000、
1：8000、1：16 000、1：32 000及其他适宜稀释度进行测定，每个稀释度做双份测
定。阴性对照为供试品稀释液(双份)，阴性和阳性对照均不需稀释。
测定法按试剂盒使用说明书进行。相同试验在3天内应重复两次。试剂盒阴
性和阳性对照的吸光度均值应在试剂盒要求范围内，试验有效。3次测定的数据
均用量反应平行线测定法(二部附录ⅪV)计算相对效力。以3次相对效力的几何均
值为其体外相对效力。以参考品为标准，供试品相对效力几何均值不小于0．5，
判为合格。
书页号：2005版药典三部附录5页
附录I A注射剂
注射剂系指以生物制品原液为原料药物，加入适宜稳定剂或其他辅料等制成
的可供注入体内的无菌溶液、乳液、混悬液及临用前用无菌溶剂复溶为溶液、
混悬液的无菌冻干制剂。
注射剂可分注射液、注射用无菌粉末。
注射液 系指注入体内的无菌溶液型注射液、乳液型注射液或混悬型注射液。
可用于皮下注射、皮内注射、肌内注射、静脉注射和静脉滴注。其中，供静脉
滴注用的大体积(除另有规定外，一般不小于50m1)注射液也称静脉输液。
注射用无菌粉末(以冷冻干燥法制备的称为注射用冻干制剂) 系指供临用前以
适宜的无菌溶液配制成澄清溶液或均匀混悬液的无菌粉末或无菌块状物。可用
适宜的注射用溶剂配制后注射，也可用静脉输液配制后静脉滴注。
注射剂在生产和贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产及质量控制应符合相关品种要
求。
二、所用溶剂必须安全无害，并不得影响疗效和质量。一般分为水溶性溶剂
和非水溶性溶剂。
(1)水溶性溶剂最常用的为注射用水，也可用O．9％氯化钠溶液或其他适宜的
水溶液。
(2)溶解注射用冻干制剂的无菌溶剂，通常也称注射用稀释剂，主要为灭菌注
射用水、氯化钠注射液，应符合本版药典(二部)的规定。其他注射用稀释剂，
除另有规定外，应进行无菌、热原或细菌内毒素及异常毒性检查，并应符合规
定。
三、配制注射剂时，可根据制品的性质加入适宜的附加剂。常用的有pH值调
节剂、稳定剂、增溶剂、抗氧剂、防腐剂等。所用附加剂应不影响制品的疗
效，对检验不产生干扰。
注射剂中防腐剂的浓度应加以控制，常用防腐剂如苯酚的浓度应不高于
O．5％，硫柳汞的浓度应不高于O·01％。除另有规定外，供静脉用的注射液不
得添加任何防腐剂，并慎用增溶剂。抗氧剂可增加生物学活性物质在冻干后贮
存期间的稳定性，如维生素C、维生素E、硫代硫酸钠等。赋形剂能使生物学活
性物质在冻干时和冻于后成形，不致飞扬损失，如蔗糖、山梨醇、乳糖等。
四、注射剂常用的容器有玻璃安瓿、玻璃瓶、塑料瓶及预装式注射器等，应
符合国家标准规定，瓶塞的质量亦应符合国家有关标准规定。
五、注射液的实际分装量应符合“生物制品分装和冻干规程”的规定。
除另有规定外，多剂量包装的注射剂，每一容器的装量不得超过10次注射剂
量。
六、注射剂在灌装后应立即熔封或加塞严封。要求真空或充氮封口者，容器
内应先排除空气，然后真空熔封或填充纯氮气熔封。对温度敏感的制品在灌封
过程中应控制温度，灌封完成后的注射剂应立即置于规定的温度下保存。
七、注射用冻干制剂分装后应及时冷冻干燥，采用适宜条件按“生物制品分装
和冻干规程”进行。冻干后残留水分应符合相关品种的要求。
除另有规定外，熔封或严封后的注射剂，应采用减压法或其他适宜的方法进
行容器检漏。
八、除另有规定外，应置2～8℃避光贮存和运输。
注射剂应进行以下相应检查。
【装量】 除另有规定外，注射液应符合规定。
注射液的标示装量为2ml或2ml以下者取供试品5支，2ml以上至50ml者取供试品3
支；开启时注意避免损失，将内容物分别用相应体积的干燥注射器及注射针
头抽尽，然后注入标化的按量入而设计的量具内(量具的大小应使待测体积至少
占其额定体积的40％)，在室温下检视。测定混悬液的装量时，应先摇匀，再用
干燥注射器及注射针头抽尽后，同前法操作，室温检视。每支注射液的装量均
不得少于其标示量。
标示装量为50ml以上的注射液照最低装量检查法(附录V F)检查，应符合规定。
【装量差异】 除另有规定外，注射用冻干制剂的装量差异限度，应符合规
定。
检查法 取供试品5瓶(支)，除去标签、铝盖，容器外壁用乙醇洗净，干燥，开
启时注意避免玻璃屑等异物落入容器中，分别迅速精密称定，倾出内容物，容
器可用水、乙醇洗净·在适宜条件下干燥后，再分别精密称定每一容器的重量，
求出每1瓶(支)的装量与平均装量。每1瓶(支)中的装量与平均装量相比较，应符
合下列规定。如有1瓶(支)不符合规定，应另取10瓶(支)复试，应符合规定。
【可见异物】 除另有规定外，照可见异物检查法(附录VB)检查，应符合规定。
【无菌】 照无菌检查法(附录ⅫA)检查，应符合规定。
书页号：2005版药典三部附录12页
附录ⅡA紫外一可见分光光度法
仪器的校正和检定
1．波长 由于环境因素对机械部分的影响，仪器的波长经常会略有变动，因
此除应定期对所用的仪器进行全面校正检定外，还应于测定前校正测定波长。
常用汞灯中的较强谱线237．83nm，253．65nm，275·28nm，296·73tml，313．16nm，
334．15nm，365．02nm，404．66nm，435·831nm，546．07nm与576．96nm，或用仪器中
氘灯的486·02nm与656．10nm谱线进行校正，钬玻璃在波长279·4nm，287．5nm，
333．7nm，360．9nm，418·5nm，460·Onm，484．5nm，536．2nm与637．5nm处有尖锐吸
收峰，也可作波长校正用，但因来源不同或随着时间的推移会有微小的变化，
使用时应注意。
2．吸光度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。取在120~C干燥至恒重的
基准重铬酸钾约60mg，精密称定，用O．OO5mol／I。硫酸溶液溶解并稀释至
1000ml，在规定的波长处测定并计算其吸收系数，并与规定的吸收系数比较，
应符合表中的规定。
┏━━━━━━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━┓
┃ 波K／nm ┃ 235(／i~4、) ┃257G．~)v2) ┃31 3(最小) ┃350(~3v) ┃
┣━━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃ 吸收系数(E1%1CM) ┃ 124．5 ┃ 144．0 ┃ 48．6 ┃ 106．6 ┃
┃的规定值 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃
┃ 吸收系数(E1%) ┃ 123．O～ ┃ 142．8～ ┃ 47．O～ ┃ 105．5～ ┃
┃的许可范围 ┃ 126．O ┃ 146．2 ┃ 50．3 ┃ 108．5 ┃
┗━━━━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━┛
3．杂散光的检查 可按下表所列的试剂和浓度，配制成水溶液，置lcm石英吸
收池中，在规定的波长处测定透光率，应符合表中的规定。
┏━━━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━━┓
┃ 试剂 ┃NN／％(g／m1) ┃测定垌波长／nm ┃透光率／％ ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━┫
┃ 碘化钠 ┃ 1．00 ┃ 220 ┃ <O．8 ┃
┃ 亚硝酸钠 ┃ 5．OO ┃ 340 ┃ <O．8 ┃
┗━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━━━┻━━━━━━┛
含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末端吸收。因此，当作溶剂使
用时，它们的使用范围均不能小于截止使用波长。例如甲醇、乙醇的截止使
用波长为205nm。另外，当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸收。因此，在测定
供试品前，应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求，即
将溶剂置1 cm石英吸收池中，以空气为空白(即空白光路中不置任何物质)测定
其吸光度。溶剂和吸收池的吸光度，在220～240nm范围内不得超过0．40，在
24l～250nm范围内不得超过O·20，在251～300nm范围内不得超过0．10，在300nm以
上时不得超过O．05。
测定法
测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照，采
用1 CM的石英吸收池，在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸光度，或
由仪器在规定波长附近自动扫描测定，以核对供试品的吸收峰波长位置是否
正确。除另有规定外，吸收峰波长应在该品种项下规定的波长±2nml以内，并
以吸光度最大的波长作为测定波长。一般供试品溶液的吸光度读数，以在
0．3～O．7之间的误差较小。仪器的狭缝波带宽度应小于供试品吸收带的半宽
度的十分之一，否则测得的吸光度会偏低；狭缝宽度的选择，应以减小狭缝宽
度时供试品的吸光度不再增大为准。由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，
因此测定供试品的吸光度后应减去空白渎数，或由仪器自动扣除空白读数后再
计算含量。
当溶液的pH值对测定结果有影响时，应将供试品溶液和对照品溶液的pH值
调成一致。
1．鉴别和检查分别按各品种项下规定的方法进行。
2．含量测定 一般有以下几种。
(1)对照品比较法按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，
对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分规定量的100％±10％，
所用溶剂也应完全一致，在规定的波长处测定供试品溶液和对照品溶液的吸光
度后，按下式计算供试品中被测溶液的浓度：
Cx=(Ax／AR)CR
式中cx为供试品溶液的浓度；
Ax为供试品溶液的吸光度；
cR为对照品溶液的浓度；
AR为对照品溶液的吸光度。
(2)吸收系数法按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其
吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时，吸收
系数通常应大于100，并注意仪器的校正和检定。
(3)计算分光光度法计算分光光度法有多种，使用时均应按各品种项下规定的
方法进行。当吸光度处在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定时，波长的
微小变化可能对测定结果造成显著影响，故对照品和供试品的测试条件应尽可
能一致。计算分光光度法一般不宜用作含量测定。
(4)比色法供试品本身在紫外一可见区没有强吸收，或在紫外区虽有吸收但为
了避免干扰或提高灵敏度，可加入适当的显色剂显色后测定，这种方法为比
色法。
用比色法测定时，由于显色时影响显色深浅的因素较多，应取供试品与对照
品或标准品同时操作。除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶
剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方
法处理。在规定的波长处测定对照品和供试品溶液的吸光度后，按上述(1)法
计算供试品浓度。
当吸光度和浓度关系不呈良好线性时，应取数份梯度量的对照品溶液，用溶
剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度与相应的浓
度绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并
求出其含量。
页码数,2005版药典附录第31页
附录ⅥE组胺人免疫球蛋白中
游离磷酸组胺测定法
本法系依据磷酸组胺与邻苯二甲醛在碱性条件下生成荧光衍生物，以此测
定组胺人免疫球蛋白中游离磷酸组胺含量。
磷酸组胺对照品溶液的制备 取磷酸组胺对照品7mg，精密称定，置25ml量瓶
中，用O．1m01／L。盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为磷酸组胺贮备
液，一20℃贮存备用。试验当天准确量取磷酸组胺贮备液O．1ml，置100ml量瓶
中，用O．1mol／L盐酸溶液稀释至刻度，即为磷酸组胺对照品溶液。
供试品溶液的制备 取供试品O．5ml，加水1．2ml，混匀，加25％三氯醋酸溶
液0．3ml，混匀，每分钟4000转离心10分钟，取上清液，即为供试品溶液。
测定法 取供试品溶液1．6ml置试管中，加氯化钠1.5g，再加正丁醇4．0ml、
2．5mol／l氢氧化钠溶液0·2ml，立即混匀5分钟，静置后，取出正丁醇相3．6ml
加到已装有O．1mol／L盐酸溶液1．2ml和正庚烷2．0ml的试管内，震荡5分钟，弃
有机相，取盐酸相1．0ml，加入等体积水，再加0．4mol／L氢氧化钠溶液0．5ml，
混匀并迅速加入0．1％邻苯二甲醛一甲醇溶液O．1ml，立即混匀，置21～22℃
10分钟，加O．5tmol／L盐酸溶液0．5ml终止反应，取终止反应后的溶液200~1，加
入酶标板孔中，用荧光酶标仪，在激发波长350nm和发射波长450nm处测荧光强
度。
准确量取磷酸组胺对照品溶液1．0ml、0．8ml、0·6ml、0·4ml、O．2ml、O．1ml、
O．05ml、O．025ml，分别置试管中，各以0．1mol／L盐酸溶液补足至1．0ml向各
管中加水O．5ml、25％三氯醋酸溶液0．1ml，混匀，加氯化钠1．5g，自"加正丁
醇4．0ml※’起，同法操作。
将磷酸组胺对照品溶液的浓度对其相应的荧光强度作直线回归，将供试品
溶液的荧光强度代人直线回归方程，求出供试品溶液碱基含量(G)，按下式计
算供试品游离组胺含量(ng／m1)=G×2．76×2．5(稀释倍数)
【附注】 磷酸组胺相对分子质量为307．148，对照附录ⅥF o一乙酰基测定
法品溶液浓度按碱基计，碱基与磷酸组胺相对分子质量比为1：2．76。
页码数,2005版药典附录第27页
附录V D融变时限检查法
本法系用于检查栓剂、阴道片等固体制剂在规定条件下的融化、软化或溶
散情况。
一、栓剂
仪器装置由透明的套筒与金属架组成(如图1)。
图1（图略）
透明套筒 为玻璃或适宜的塑料材料制成，高为60mm，内径为52mm，及适当
的壁厚。
金属架 由两片不锈钢的金属圆板及3个金属挂钩焊接而成。每个圆板直径
为50mm，具39个孔径为4mm的圆孔(如图2)；两板相距30mm，通过3个等距的挂钩
焊接在一起。
检查法取供试品3粒，在室温放置1小时后，分别放在3个金属架的下层圆板
上，装入各自的套筒内，并用挂钩固定。除另有规定外，将上述装置分别垂直
浸入盛有不少于4L的37．0℃±O．5℃水的容器中，其上端位置应
单位：mm
图2（图略）
在水面下90mm处。容器中装一转动器，每隔10分钟在溶液中翻转该装置一次。
结果判定除另有规定外，脂肪性基质的栓剂3粒均应在30分钟内全部融化、
软化或触压时无硬心；水溶性基质的栓剂3粒均应在60分钟内全部溶解。如有
1粒不符合规定，应另取3粒复试，均应符合规定。
二、阴道片
仪器装置 同上述栓剂的检查装置，但应将金属架挂钩的钩端向下，倒置于
容器内，如图3示意。
图3（图略）
1一阴道片；2一玻璃板；3一水面
检查法调节水液面至上层金属圆盘的孔恰为均匀的一层水覆盖。取供试品
3片，分别置于上面的金属圆盘上，装置上盖一玻璃板，以保证空气潮湿。
结果判定除另有规定外，阴道片3片，均应在30分钟内全部溶化或崩解溶散
并通过开孔金属圆盘，或仅残留少量无硬心的软性团块。如有1片不符合规定，
应另取3片复试，均应符合规定。
页码数,2005版药典附录第40页
附录ⅦH枸橼酸离子测定法
第一法比色法
枸橼酸钠对照品溶液的制备取经减压干燥至恒重的枸橼酸钠
(C6H5Na3 07·2HzO)O．6g，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇
匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用5％三氯醋酸稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备 精密量取供试品0．5ml与水4．5ml，加10％三氯醋酸溶液
5ml，混匀，置60℃水浴加热5分钟，以每分钟4000转离心20分钟，取上清液备用。
测定法精密量取供试品溶液lml，置25ml具塞试管中，精密加吡啶1．3ml，混
匀，再精密加醋酸酐5·7ml，立即混匀并置31~C土I~C的水浴中，准确放置35分钟
后，照紫外-可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长425nm处测定吸光度。另精密量
取枸橼酸钠对照品溶液0·25ml、O．50ml、O．75ml、1．0ml，分别置于具塞试管中，
各精密加5％三氯醋酸溶液0．75ml、O．50ml、0．25ml、O·00ml(其相对应的枸橼酸
离子含量为O．5mmol／L、1．0mmol／L、1．5mmol／L、2．0mmol／L)，自“精密加
吡啶1．3ml※’起，同法操作。
用对照品溶液枸橼酸离子浓度和对应的吸光度作直线回归，求得回归方程，
计算出供试品溶液中的枸橼酸离子含量(mmol／L)，再乘以供试品稀释倍数(20)，
即为供试品枸橼酸离子含量(mmol／L)。-
第二法高效液相色谱法
照高效液相色谱法(附录ⅢB)测定。
色谱条件用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为基质的阳离子交换色谱柱(H+)，粒
度9μm或8μm，内径7．8mm，柱长300mm；柱温为50℃；流动相为0．004mol／L硫酸
溶液，流速为每分钟0．8ml，示差折光检测器。
测定法 精密称取经减压干燥至恒重的枸橼酸钠(C6H5Na3 07·2H20)0．735g，置
100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，精密量取5．0ml、10．0ml、15·0ml，分别
置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得相对应的5．0mmol／L、10．0
mmol／L、15．0mmol／L枸橼酸离子对照品溶液。分别精密量取20μl，注入液相色
谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液lml，置15 m1离心管中，精密加
1．5％磺基水杨酸溶液lml，混匀。室温下以每分钟2000转离心10分钟。取上清
液，同法测定。
用对照品溶液的枸橼酸离子浓度对峰面积进行直线回归，求得回归方程，
计算出供试品溶液枸橼酸钠含量(mmol／L)，再乘以供试品稀释倍数(2)，计算出
供试品枸橼酸离子含量(mmol／L)。
【附注】 (1)根据供试品枸橼酸离子含量，可适当调整枸橼酸离子对照品溶液
浓度。
(2)直线回归相关系数应不低于0．999。
(3)不同厂家的阳离子交换色谱柱(H+)的流速、流动相、柱温等会有所不同，
可根据色谱柱说明书对色谱条件进行适当调整。
页码数,2005版药典附录第43页℃
附录ⅧE肽图检查法
本法系通过蛋白酶或化学物质裂解蛋白质后，采用适宜的分析方法鉴定蛋
白质一级结构的完整性和准确性。
第一法胰蛋白酶裂解一反相高效液相色谱法
照高效液相色谱法(附录ⅢB)测定。
色谱条件用蛋白质与多肽分析用辛烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合
硅胶为填充剂；柱温为30℃±5℃，供试品保存温度为4℃±O．5℃；以O．1％三氟
乙酸的水溶液为流动相A液，以O．1％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B液，流速
为每分钟lml，梯度洗脱70分钟(A液从100％至30％，B液从O至70％)，检测波长为
214nm。
检查法取供试品溶液及对照品溶液(均为每lml中含lmg的溶液，如供试品和对
照品浓度不够，则应浓缩至相应的浓度)，分别用1％碳酸氢铵溶液充分透析，
按1：50(mg／mg)加入胰蛋白酶溶液[取甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理过的(或序列
分析纯)胰蛋白酶适量，加1％碳酸氢铵溶液溶解，制成每lml中含O．1mg的溶液]
到供试品溶液与对照品溶液中，在37~C保温24小时后，按1：10加入50％醋酸溶
液，以每分钟10000转离心5分钟，精密量取上清液(或用O．45μm滤膜滤过)100μ1，
分别注入液相色谱仪，梯度洗脱，记录色谱图。将供试品溶液与对照品溶液的
图谱进行比较，即得。
第二法溴化氰裂解法
检查法取供试品与对照品适量(约相当于蛋白质50μg)，用水透析16小时，冷
冻干燥，加溴化氰裂解液[取溴化氰O．3g，加甲酸(70—100)lml使溶解]20μl溶解，室
温放置24小时，裂解物加水180μ1，再冷冻干燥。冻干的裂解物用水复溶至适当
浓度。照SDS-聚丙酰胺凝胶电泳法(附录ⅣC)(胶浓度20％)进行电泳，用银染法染
色。
将供试品图谱与对照品图谱进行比较，即得。
135种
页码数,2005版药典附录第44页
附录VI G A群脑膜炎球菌多糖
第一法测磷法(仲裁法)
本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数(KD)和多糖在规定KD值以前的回收率。
试剂 (1)流动相取氯化钠11．7g、叠氮钠0．1g，加水使溶解成1000ml，混匀，
用O．1mol／L氢氧化钠溶液调节pH至7．O。
(2)蓝色葡聚糖2000溶液 取蓝色葡聚糖2000 20mg，加流动相使溶解成10ml。
(3)维生素B12溶液称取10mg维生素B12，加流动相使溶解成10ml。
色谱柱的制备取琼脂糖4B凝胶或琼脂糖CL-4B凝胶约200ml，加流动相400ml充分搅拌，放置约1小时使其沉淀，倾去上层含悬浮颗粒的悬液。如此反复3～5次后，加流动相200ml，混匀，抽去凝胶中的空气，装于1．5cm×90cm色谱柱中，约
87cm高，．用流动相洗脱，流速为每小时15～20ml，以2～3倍柱床体积的流动相洗脱(约500m1)，使柱床平衡。
色谱柱的标定取蓝色葡聚糖2000溶液lml加于已平衡的色谱柱中，以流动相洗脱，流速每小时15～20ml，用组分收集器收集洗脱液，每管收集3～5ml，照紫外
-可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长260nm处测定各管洗脱液的吸光度，以吸光度为纵坐标，洗脱液体积(m1)为横坐标分别作图，260nm波长处的峰顶洗脱液体积为空流体积V0。
取维生素B12溶液lml，自“加于已平衡的色谱柱中起，同法操作，370nm波长处的峰顶洗脱液体积为柱床体积Vi。
测定法取供试品约lml(含多糖抗原3～5mg，如为冻干制品可用流动相溶解)，加于已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，用组分收集器收集洗脱液，每管收集5ml，
照磷含量测定法(附录ⅦA)测定每管洗脱液的磷含量。以供试品每管洗脱液的磷含量为纵坐标，洗脱液体积(m1)为横坐标作图，主峰峰顶洗脱液体积为Ve。
按下式计算
KD=ve-v0/Vi-V0。
式中KD为供试品分配系数；
Ve为供试品洗脱液体积，ml；
V0为空流体积，ml；
Vi为柱床体积，ml。
计算供试品在KD值<0．5的多糖回收率
Rx(％)=Ax/At×100％
式中Rx为KD值<O．5供试品的多糖回收率；
Ax为供试品在KD值<O．5各管洗脱液的磷含量 之和；
At为供试品所有管洗脱液的磷含量之和。
第二法仪器法
试剂与色谱柱的制备同第一法。
色谱柱的标定取蓝色葡聚糖2000溶液lml与维生素B12溶液0．2ml，混匀后加于已平衡的色谱柱中，以流动相洗脱，流速每小时15～20ml，检测波长206nm，用组分收集器收集洗脱液，记录色谱图，色谱图中，第一峰为蓝色葡聚糖2000峰，
峰顶的洗脱液体积为空流体积V0；第二峰为维生素B12的峰，峰顶的洗脱液体积为柱床体积Vi。
测定法取供试品约lml(含多糖抗原3～5mg，如为冻干制品可用流动相溶解)，
加于已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，流速为每小时15～20 ml，检测波长
206nm，用组分收集器收集洗脱液，记录色谱图，即得。
按下式计算
KD=Ve-V0/Vi-V0
式中KD为供试品分配系数；
V为供试品洗脱液体积，ml,
K为空流体积，m1；
Ⅵ为柱床体积，ml。
计算供试品在KD值<O．5多糖回收率
Rx(％)=Ax/At*100％
式中凡为KD值<O．5供试品的多糖回收率(％)；
Ax为供试品在KD值<O．5的色谱图面积；
A0为供试品色谱图总面积。
【附注】 过柱操作在10～20℃进行。
书页号：2005版药典三部附录71页
附录Ⅺ K IgG含量测定法
(紫外-可见分光光度法)
本法系依据免疫球蛋白G(IgG)与相应的抗体特异性结合后，在适宜的电解质、温度、pH条件下，产生凝集反应，形成抗原抗体复合物，根据供试品的吸光度求出供试品中IgG的含量。
试剂 (1) 缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.42g、氯化钠9g、聚乙二醇
(PEG 6000)50g、牛血清白蛋白(BSA)1g、叠氮钠(NaN3)1g，加水溶解，用1.0mol/L盐酸调
pH至7.4，加水稀释至1000ml。
(2) 抗人IgG血清 按说明书要求将冻干抗人IgG血清复溶，按标示效价取一定量抗人IgG血清，加缓冲液稀释至抗体最终效价为1：4(例如，抗人IgG血清效价为
1：100，取原液2ml加抗体缓冲液48ml)，充分混匀，0.45μm膜过滤。4℃保存备用。
IgG标准品溶液的制备 用生理氯化钠溶液将IgG标准品在每1ml含0.2～6.0mg范围内做适当的系列稀释(通常做5个稀释度)。
供试品溶液的制备 用生理氯化钠溶液将供试品稀释成高、中、低3个稀释度，其IgG含量均应在标准曲线范围内。
测定法 取供试品溶液10μl，加已预热至37℃的抗体液1ml，混匀，每个稀释度做2管，37℃水浴中保温1小时，充分混匀，照紫外-可见分光光度法(附录Ⅱ A)，
于波长340nm处分别测定吸光度。
用IgG标准品溶液10μl替代供试品溶液，同法操作。
计算标准品和供试品不同稀释度溶液的吸光度的均值。将标准品溶液的IgG
含量的对数对其相应的吸光度的对数进行直线回归，相关系数应不低于0.99；然后将供试品溶液吸光度的对数值代入回归方程，求得值的反对数，再乘以稀释倍数，求取每1ml供试品溶液IgG含量(g/L)，再由供试品各稀释度IgG含量求平均值，
即为供试品IgG含量(g/L)。
【附注】 (1) 全部反应管必须在10分钟内测量完毕。
(2) 设置紫外分光光度计狭缝宽度(Slit Width)为2nm。
(3) 每次测定可根据供试品IgG含量，适当调整标准品溶液中IgG含量范围。
页码数,2005版药典附录第32页
附录ⅥF 0一乙酰基测定法
试剂 (1)2mol／L盐酸羟胺溶液 称取盐酸羟胺13．9g，加水溶解并稀释至lOO
ml，冷处保存。
(2)3．5mol／L氢氧化钠溶液称取氢氧化钠14．Og，加水使溶解并稀释至100ml。
(3)4mol／L盐酸溶液量取盐酸33．3ml，加水稀释至lOOml的溶液。
(4)0．37mol／L三氯化铁一盐酸溶液 称取三氯化铁(FeCl3·6H20)10．Og，加
O．1mol／L盐酸溶液溶解并稀释至100ml。
(5)碱性羟胺溶液 取等体积的盐酸羟胺溶液(2mol／L)与氢氧化钠溶液
(3．5mol／L)混合。3小时内使用。
对照品溶液的制备精密称取已干燥至恒重的氯化乙酰胆碱22．7mg(或溴化乙酰胆碱28．3mg)，置50ml量瓶中，加0．001mol／L醋酸钠溶液(pH4．5)溶解并稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液的制备 取供试品，用水稀释成O-乙酰基浓度为O．5～2．5mmol／L
的溶液。
测定法精密量取氯化乙酰胆碱(或溴化乙酰胆碱)对照品溶液O．2ml、0．4ml、
O．6ml、O．8ml、1_Oml，分别置试管中，补加水至lml，加新鲜配制的碱性羟胺溶液2ml，摇匀，于室温放置4分钟，加4mol／L盐酸lml，调pH值至1．2±O．2，摇匀，加O．37mol／L三氯化铁一盐酸溶液lml，摇匀，照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长540nm处测定吸光度。另精密量取上述相应的系列对照品溶液，
自“补加水至lml※’起，除加酸与加碱性羟胺的次序颠倒外，同法操作，用作对应的空白对照。
精密量取供试品溶液Iml置试管中，自“加新鲜配制的碱性羟胺溶液2ml※’起，同法操作。并取供试品溶液Iml，同法操作，用作供试品的空白对照。
将标准管各吸光度分别减去相应的空白对照管的吸光度，以标准管中所含的对照品溶液的体积与对应的吸光度作直线回归，将供试品的吸光度减去供试品溶液空白吸光度代入直线回归方程，计算出每Iml供试品相当于对照品溶液的体积(E，m1)。
供试品中O-乙酰基含量(mm01／L)=E×2．5式中2．5为对照品溶液中乙酰胆碱的含量(mmol／L)。
页码数,2005版药典附录第22页
附录ⅣC SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法
大多数蛋白质与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
仪器恒压或恒流电源，垂直板或圆盘电泳槽和制胶模具。
试剂 (1)水(电阻率不低于18．2MΩ．cm)
(2)A液 1．5mol／L三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲 液。称取三羟甲基氨基甲烷18．15g，加适量水溶解，用 盐酸调pH值至8．8，加水稀释至100ml。
(3)B液 30％丙烯酰胺一0．8％N，N’一亚甲基双丙烯酰胺溶液(避光保存)。
(4)C液1％十二烷基硫酸钠溶液。
(5)D液10％四甲基乙二胺溶液。
(6)E液10％过硫酸铵溶液，临用前配制。
(7)F液 O．5mol／L三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液。称取三羟甲基氨基甲烷6．05g加适量水溶解，用盐酸调pH值至6．8，加水稀释至100ml。
(8)电极缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷3g、甘氨酸14.4g、十二烷基硫酸钠1g，
加适量水溶解，用盐酸调pH值至8．3，加水稀释至1000ml。
(9)供试品缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷O．303g、溴酚蓝2mg、十二烷基硫酸钠O．8g，量取盐酸0．189ml、甘油4ml，加水溶解并稀释至10ml，此溶液用于非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，如用于还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，则再加
β-巯基乙醇2ml。
(10)分子量标准供试品的分子量应包括在使用的分子量标准范围之内。
(11)固定液量取甲醇250ml、冰醋酸60ml，加水稀释至500ml。
(12)漂洗液量取乙醇100ml、冰醋酸50ml，加水稀释至1000m|。
(13)辅染液称取重铬酸钾10g，量取硝酸2ml加适量水溶解并稀释至200ml。用前40倍稀释。
(14)银染液称取硝酸银2．04g，加水溶解并稀释至1000ml。
(15)显色液称取碳酸钠30g加适量水溶解，加甲醛O．5ml，并稀释至1000ml。
(16)终止液量取冰醋酸10ml加水稀释至1000ml。
(17)考马斯亮蓝染色液称取考马斯亮蓝R250 1g，加入甲醇200ml、冰醋酸
50ml、水250ml混匀。
页码数,2005版药典附录第50页
附录ⅨH SV40核酸序列检查法
本法系通过设计两对特异引物扩增SV40 VPl 100bp(2220～2319)和大T抗原C-末端
451bp(2619～3070)两个片段，采用聚合酶链反应(PCR)检查供试品中是否存在SV40核酸序列。
供试品溶液及对照溶液的制备取供试品400μ1，加2％蛋白酶K溶液25μ1、10％
SDS溶液50μl、O．05mol／L EDTA溶液(pH8．O)10μ1，56℃培养1小时，用等体积的酚
-三氯甲烷(1：1)混合液抽提后，再用等体积的三氯甲烷抽提，加2倍体积的乙醇，
-20℃放置16小时，以每分钟10000转离心15分钟，沉淀用75％乙醇溶液洗涤干燥，
加无DNA酶和RNA酶的水10μl，使溶解。阳性及阴性对照按上述方法与供试品同时处理。
引物
VPl上游引物：2220 5※_ACA CAG CAA CCA CAG TGG TTC-3’2240
VPl下游引物：2319 5※_GTA AAC AGC CCA CAA ATG TCA AC-3’2297
T抗原C_末端上游引物：3070 5※-GAC CTG TGG CTG AGT TTG CTC A-3’3049
T抗原c_末端下游引物：2619 5’一GCT TTA TTT GTA ACC ATT ATA AG-3’2641
检查法 (1)每个待扩增的供试品引物加量为30×10-12 mol，DNA模板加量为1μl，总体积50μl。在PCR仪上以94℃先变性3分钟；94℃变性20秒、50℃C退火20秒、72℃延伸40秒共进行40个循环；72℃延伸3分钟。
(2)扩增产物电泳检查：2％琼脂糖凝胶(每lml含1μg溴化乙锭)，缓冲液为1×TAE，
在100V条件下电泳40分钟，检查扩增片段。VPl扩增片段为100bp，大T抗原C_末端片段为451bp。
(3)以同样模板重复扩增VPl片段，排除污染因素导致的非特异扩增；或将扩增产物及对照从胶上移至Hybond N尼龙膜上，与VPl探针进行免疫印迹试验以证明所扩增片段确为VPl片段。
(4)以自动测序仪对供试品及阳性对照的大T抗原C_末端扩增产物进行序列测定。
结果判定 阳性对照应得到特异产物，阴性对照应无相应片段，则试验成立。
若未能扩出VPl片段，则结果判定为未检出SV40核酸序列。
若扩增出VPl片段，可重复试验1次，仍未扩增出VPl片段者，判定为未检出
SV40核酸序列。
若重试仍能扩增出VPl片段，则应扩增大T抗原C-末端片段，如扩增出大T抗原
C-末端片段，则其扩增产物和阳性对照扩增产物进行测序并比较，核酸序列一致判定为检出SV40核酸序列；如未扩增出大T抗原C-末端片段，则可按上述步骤
(1)～(3)重复试验1次，如仍未扩增出大T抗原C_末端片段，则可判定为未检出
SV40核酸序列。
页码数,2005版药典附录第24页
附录V
除另有规定外，水溶液的pH值应以玻璃电极为指示电极、饱和甘汞电极为参比电极的酸度计进行测定。酸度计应定期进行计量检定，并符合国家有关规定。测定前，应采用下列标准缓冲液校正仪器，也可用国家标准物质管理部门发放的标示pH值准确至0．01pH单位的各种标准缓冲液校正仪器。
1．仪器校正用的标准缓冲液
(1)草酸盐标准缓冲液精密称取在54~C±3~C干燥4～5小时的草酸三氢钾12．71g，
加水使溶解并稀释至1000ml。
（2）苯二甲酸盐标准缓冲液 精密称取在115℃± 5℃干燥2～3小时的邻苯二甲酸氢钾10．21g，加水使溶解并稀释至1000ml。
(3)磷酸盐标准缓冲液 精密称取在115℃士5℃干燥2～3小时的无水磷酸氢二钠
3．55g与磷酸二氢钾3．40g，加水使溶解并稀释至1000ml。
(4)硼砂标准缓冲液精密称取硼砂3．81g(注意避免风化)，加水使溶解并稀释至1000ml，置聚乙烯塑料瓶中，密塞，避免空气中二氧化碳进入。
(5)氢氧化钙标准缓冲液 于25℃，用无二氧化碳的水制备氢氧化钙的饱和溶液，取上清液使用。存放时应防止空气中二氧化碳进入。一旦出现浑浊，应弃去重配。
上述标准缓冲溶液必须用pH值基准试剂配制。不同 温度时各种标准缓冲液的pH值如下表（表略）。
2．注意事项
测定pH值时，应严格按仪器的使用说明书操作，并注意下列事项。
(1)测定前，按各品种项下的规定，选择二种pH值约相差3个pH单位的标准缓冲液，并使供试液的pH值处于二者之间。
(2)取与供试液pH值较接近的第一种标准缓冲液对仪器进行校正(定位)，使仪器示值与表列数值一致。
(3)仪器定位后，再用第二种标准缓冲液核对仪器示值，误差应不大于±0．02pH
单位。若大于此偏差，则应小心调节斜率，使示值与第二种标准缓冲液的表列数值相符。重复上述定位与斜率调节操作，至仪器示值与标准缓冲液的规定数值相差不大于0．02pH单位。否则，需检查仪器或更换电极后，再行校正至符合要求。
(4)每次更换标准缓冲液或供试液前，应用纯化水充分洗涤电极，然后将水吸尽，也可用所换的标准缓冲液或供试液洗涤。
(5)在测定高pH值的供试品和标准缓冲液时，应注意碱误差的问题，必要时选用适当的玻璃电极测定。
(6)对弱缓冲液(如水)的pH值测定，先用苯二甲酸盐标准缓冲液校正仪器后测定供试液，并重取供试液再测，直至pH值的读数在1分钟内改变不超过±0·05止；然后再用硼砂标准缓冲液校正仪器，再如上法测定；二次pH值的读数相差应不超过O．1，取二次读数的平均值为其pH值。
(7)配制标准缓冲液与溶解供试品的水，应是新沸过并放冷的纯化水，其pH值应为5．5～7．0。
(8)标准缓冲液一般可保存2～3个月，但发现有浑浊、发霉或沉淀等现象时，
不能继续使用。
页码数,2005版药典附录第67页
附录ⅪE白喉抗毒素效价测定法(家兔皮肤试验法)
本法系根据抗毒素能中和毒素的作用，将供试品与标准品进行对比试验，
推算出每lml供试品中所含抗毒素的国际单位数(IU／m1)。
试剂 稀释液(硼酸盐缓冲盐水) 称取氯化钠8．5g、硼酸4．5g、四硼酸钠
(Na2 B4()7·10H20)O．5g，加水使溶解至1000ml，过滤，灭菌后pH值为7．O～7．2。
白喉抗毒素标准品溶液的制备取白喉抗毒素标准品适量，稀释至每lml含
1／5 IU，即与毒素等量混合后每 O．1ml注射量中含1／300 IU。白喉抗毒素标准品原液的一次吸取量应不低于0．5ml。
供试品溶液的制备将供试品稀释成数个稀释度，使每lml含抗毒素约
1／15 IU，其稀释度间隔约为5％～10％。
测定法 将毒素稀释至每lml含20个试验量(1／300 Lr)，即与抗毒素等量混合后每O．1ml注射量中含1个试验量(1／300 Lr)。定量吸取稀释后的抗毒素标准品溶液及不同稀释度的供试品溶液分别加入小试管中，每管加入等量的稀释毒素溶液，混合均匀，加塞，37℃结合1小时后，立即注射。
选用体重2～3kg的健康白皮肤家兔，试验前1日用适宜方法进行背部脱毛，
凡皮肤有发炎或大量斑点现象者不应使用。每份供试品溶液注射2只家兔，每只家兔不能超过4份供试品溶液。每稀释度注射O．1ml于家兔皮内(应在近背脊两侧)。每只家兔至少应包括3个不同注射部位(前、中、后)的对照试验。标准品溶液与供试品溶液不得用同一支注射器注射。
结果判定试验家兔于注射后48小时及72小时各观察1次，并测量反应面积。
以48～72小时结果作最后判定。注射对照部位一般于48～72小时内轻度发红，其直径应为10～14mm。供试品之效价应以与多数对照的反应强度相同之最高稀释度判定之，但反应强度不得超过对照。有下列情况之一者应重试：
(1)对照反应不符合规定标准；
(2)供试品的稀释度过高或过低；
(3)反应不规则。
【附注】毒素由国家药品检定机构提供，亦可自行制备，但应选经保存1年以上、毒力适宜的毒素。试验用的毒素须以国家药品检定机构分发的标准抗毒素准确标定其试验量(1／300 Lr)，并应每3个月复检一次。毒素应保存于2～8℃避光处，并加入甲苯或其他适宜防腐剂。
页码数,2005版药典附录第34页
附录ⅥM苯酚测定法
本法系依据溴酸盐溶液与盐酸反应产生溴，遇苯酚生成三溴苯酚，过量的溴与碘化钾反应释出碘，析出的碘用硫代硫酸钠滴定液滴定，根据硫代硫酸钠滴定液的消耗量，可计算出供试品中苯酚的含量。
测定法精密量取供试品lml，置具塞锥型瓶中，加水50ml，精密加人
0．02mol／L溴溶液(取溴酸钾O．56g，加溴化钾3g，加水溶解并稀释成1000m1)15～
25ml(供试品含苯酚量0．3％～0．5％时加25ml，小于O．3％则加15 m1)，沿瓶壁加入6mol／L盐酸溶液lOml，摇匀，密塞，在暗处放置30分钟后，加25％碘化钾溶液
2ml于具塞锥型瓶颈口，稍启瓶塞，使流下，密塞，摇匀。以少量水洗瓶颈，用硫代硫酸钠滴定液(O．02mol／L)滴定至近终点时，加淀粉指示液约O．5ml，滴定至蓝色消失。并将滴定的结果用空白试验校正。
按下式计算
苯酚含量(％)=(Vo-V1)*c*15．69*100/1000
式中VO为空白试验消耗硫代硫酸钠滴定液的体积，ml；
V1为供试品消耗硫代硫酸钠滴定液的体积，ml；
c为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol／L；
15．69为苯酚相对分子质量的1／6。
【附注】 (1)硫代硫酸钠滴定液(O．1mol／L)的制备及标定取硫代硫酸钠26g与无水碳酸钠0·20g，加新沸过的冷水适量溶解并稀释成1000ml，摇匀，放置1个月后滤过。取在120~C干燥至恒重的基准重铬酸钾O·15g，精密称定，置碘瓶中，加水50ml溶解，加碘化钾2·Og，轻轻振摇使溶解，加稀硫酸(5．7—100)40ml，摇匀，
密塞；在暗处放置10分钟后，加水250ml稀释，用本液滴定至近终点时，加淀粉指示液(取可溶性淀粉O·5g，加水5ml混悬后，缓缓倾入100ml沸水中，随加随搅拌，继续煮沸2分钟，冷却，倾取上层清液。本液应临用配制)3ml，继续滴定至蓝色消失而显亮绿色，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml硫代硫酸钠滴定液(O·lmol／L)相当于4．903mg重铬酸钾。根据本液的消耗量与重铬酸钾的取用量，算出本液的浓度，即得。
(2)硫代硫酸钠滴定液(0．02mol／L)的制备 精密量取硫代硫酸钠滴定液
(o．1mol／L)100ml，加水准确稀释至500ml，摇匀。
(3)可做限度测定。
页码数,2005版药典附录第26页
附录V C崩解时限检查法
本法系用于检查曰服固体制剂在规定条件下的崩解情况。
崩解系指口服固体制剂在规定条件下全部崩解溶散或成碎粒，除不溶性包衣材料或破碎的胶囊壳外，应全部通过筛网。如有少量不能通过筛网，但已软化或轻质上漂且无硬心者，可作符合规定论。
凡规定检查溶出度、释放度或融变时限的制剂，不再附录V C崩解时限检查法进行崩解时限检查。
一、片剂
仪器装置采用升降式崩解仪，主要结构为一能升降的金属支架与下端镶有筛网的吊篮，并附有挡板。
升降的金属支架上下移动距离为55mm±2mm，往返频率为每分钟30～32次。
吊篮 玻璃管6根，管长77．5mm±2．5mm，内径21．5mm，壁厚2mm；透明塑料板2块，直径90mm，厚6mm，板面有6个孔，孔径26mm不锈钢板1块(放在上面一块塑料板上)，直径90mm，厚lmm，板面有6个孔，孔径22mm;不锈钢丝筛网1张(放在下面一块塑料板下)，直径90mm，筛孔内径2．0mm；以及不锈钢轴1根(固定在上面一块塑料板与不锈钢板上)，长80mm。将上述玻璃管6根垂直置于2块塑料板的孔中，并用3只螺丝将不锈钢板、塑料板和不锈钢丝筛网固定，即得(如图1)。
单位：mm
图1 （图略）
挡板为一平整光滑的透明塑料块，相对密度1．18～1．20，直径20．7mm±
0．15mm，厚9．5mm±O．15mm；挡板共有5个孔，孔径2mm，中央1个孔，其余4个孔距中心6mm，各孔间距相等；挡板侧边有4个等距离的V形槽，V形槽上端宽
9．5mm，深2．55mm，底部开口处的宽与深度均为1．6mm(如图2)。
检查法将吊篮通过上端的不锈钢轴悬挂于金属支架单位：mm
图2（图略）
上，浸入1000ml烧杯中，并调节吊篮位置使其下降时筛网距烧杯底部25mm，烧杯内盛有温度为37~C土1℃的水，调节水位高度使吊篮上升时筛网在水面下
15mm处。
除另有规定外，取供试品6片，分别置上述吊篮的玻璃管中，启动崩解仪进行检查，各片均应在15分钟内全部崩解。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
薄膜衣片，按上述装置与方法检查，并可改在盐酸溶液(9一lOOO)中进行检查，应在30分钟内全部崩解。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
糖衣片，按上述装置与方法检查，应在1小时内全部崩解。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
肠溶衣片，按上述装置与方法，先在盐酸溶液(9-1000)中检查2小时，每片均不得有裂缝、崩解或软化现象；继将吊篮取出，用少量水洗涤后，每管加入挡板1块，再按上述方法在磷酸盐缓冲液(pH6．8)中进行检查，1小时内应全部崩解。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
含片，除另有规定外，按上述装置和方法检查，各片均应在30分钟内全部崩解或溶化。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
舌下片，除另有规定外，按上述装置和方法检查，各片均应在5分钟内全部崩解并溶化。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
可溶片，除另有规定外，水温为15～25~C，按上述装置和方法检查，各片均应在3分钟内全部崩解并溶化。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
结肠定位肠溶片，除另有规定外，按上述装置照品种项下规定检查，各片在盐酸溶液(9—1000)及pH6．8以下的磷酸盐缓冲液中均应不释放或不崩解，而在
pH7．8～8．o的磷酸盐缓冲液中1小时内应全部释放或崩解，片心亦应崩解。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
泡腾片，取1片，置250ml烧杯中，烧杯内盛有200ml水，水温为15～25~C，有许多气泡放出，当片剂或碎片周围的气体停止逸出时，片剂应溶解或分散在水中，无聚集的颗粒剩留。除另有规定外，同法检查6片，各片均应在5分钟内崩解。如有1片不能完全崩解，应另取6片复试，均应符合规定。
二、胶囊剂
硬胶囊剂或软胶囊剂，除另有规定外，取供试品6粒，按片剂的装置与方法
(如胶囊漂浮于液面，可加挡板)检查。硬胶囊应在30分钟内全部崩解，软胶囊应在1小时内全部崩解。软胶囊可改在人工胃液中进行检查。如有1粒不能完全崩解，应另取6粒复试，均应符合规定。
肠溶胶囊剂，除另有规定外，取供试品6粒，按上述装置与方法，先在盐酸溶液(9一lOOO)中检查2小时，每粒的囊壳均不得有裂缝或崩解现象；继将吊篮取出，用少量水洗涤后，每管加入挡板，再按上述方法，改在人工肠液中进行检查，1小时内应全部崩解。如有1粒不能完全崩解，应另取6粒复试，均应符合规定。
三、滴丸剂
按片剂的装置，但不锈钢丝网的筛孔内径应为O．425mm；除另有规定外，取供试品6粒，按上述方法检查，应在30分钟内全部溶散，包衣滴丸应在1小时内全部溶散。如有1粒不能完全溶散，应另取6粒复试，均应符合规定。
以明胶为基质的滴丸，可改在人工胃液中进行检查。
【附注】人工胃液取稀盐酸16．4ml，加水约800ml与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000ml，即得。
人工肠液即磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH 6．8)(见二部附录XV D缓冲液)。
书页号：2005版药典三部附录11页
附录I L鼻用制剂
鼻用制剂系指直接用于鼻腔，发挥局部或全身治疗作用的生物制品。鼻用
制剂可分为鼻用液体制剂(滴鼻剂、洗鼻剂和鼻用喷雾剂)、鼻用半固体制剂(鼻
用软膏剂、鼻用乳膏剂和鼻用凝胶剂)、鼻用同体制剂(鼻用散剂、鼻用粉雾剂
和鼻用棒剂)等。
鼻用制剂在生产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产及质量控制应符合相关品种
要求。
二、鼻用制剂通常含有如调节黏度、控制pH值、增加活性成分溶解、提高
制剂稳定性或能够赋形的辅料。除另有规定外，多剂量水性介质鼻用制剂应
添加适宜浓度的抑菌剂。制剂本身如有足够抑菌性能，可不加抑菌剂。
三、鼻用制剂多剂量包装容器应配有完整的滴管或适宜材料组合成套，一
般应配有橡胶乳头或塑料乳头的螺旋盖滴管。容器应无毒并清洗干净，不应
与药物或辅料发生理化作用，容器的瓶壁要有一定的厚度且均匀，除另有规
定外，装量应不超过10m1或5g。
四、鼻用溶液制剂应澄清，不得有沉淀异物；鼻用混悬液可能含沉淀物，
但经振摇易分散；鼻用乳液可能有油水相分离，但经振摇易恢复成乳液。
五、鼻用制剂应无刺激性，对鼻黏膜及其纤毛不应产生副作用。如为水性
介质的鼻用制剂应等渗。
六、除另有规定外，鼻用制剂还应符合相应剂型制剂通则项下有关规定，
如鼻用喷雾剂应符合喷雾剂的规定。
除另有规定外，鼻用制剂应置2～8℃避光贮存和运输。
鼻用制剂应进行以下相应检查。
【重量差异或装量差异】 除另有规定外，单剂量包装的鼻用固体制剂或半
固体制剂重(装)量差异限度应符合规定。
检查法取供试品20个，分别称量内容物，计算平均重量，超过平均重量的
±10％者，不得过2个，并不得有超过平均重量的±20％者。
凡规定检查含量均匀度的鼻用制剂，可不作重(装)量差异的检查。
【装量】 除另有规定外，单剂量包装的鼻用液体制剂应符合规定。
取供试品10个，分别将内容物倾尽，测定其装量，均不得少于其标示量。
多剂量包装的鼻用制剂，照最低装量检查法(附录VF)检查，应符合规定。
【微生物限度】 除另有规定外，照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符
合规定。
凡规定进行无菌检查的鼻用制剂可不进行微乍物限度检查。
【无菌】 凡标签注明为无菌者，照无菌检查法(附录ⅫA)检查，应符合规定。
书页号：2005版药典三部附录76页
附录Ⅻ C 病毒外源因子检查法
病毒类制品在毒种选育和生产过程中，经常使用动物或细胞基质培养，因
此，有可能造成外源因子(特别是外源病毒因子)的污染。为了保证制品质量，需
要对毒种和细胞进行外源因子的检测。
病毒种子批外源因子检查
对病毒主种子批或工作种子批，应抽取足够检测试验需要量的供试品进行
病毒外源因子检测。在试验前应用非人源和非猴源(特殊情况除外)的特异性抗体
中和本病毒。制备抗血清(或单克隆抗体)所用的免疫原应采用与生产疫苗(或制
品)不同种而且无外源因子污染的细胞(或动物)制备。如果病毒曾在禽类组织或细
胞中繁殖过，则抗体不能用禽类来制备。若用鸡胚，应来自SPF鸡群。
1．动物试验法
(1) 小鼠试验法 取15～20g小鼠至少10只，用经抗血清中和后的病毒悬液，每
只脑内接种0.03ml，同时腹腔接种0.5ml。至少观察21天。在观察期内至少有80%最
初接种的小鼠存活，试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染，为符合要求。
解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠，直接肉眼观察其病理改变，
并将有病变的相应的组织悬液通过脑内和腹腔接种另外至少5只15～20g小鼠，并
观察21天，如果没有小鼠出现病毒感染，则符合要求。
(2) 乳鼠试验法 取出生后24小时内的乳鼠至少10只，用经抗血清中和后的病
毒悬液，脑内接种0.01ml，同时腹腔接种至少0.1ml。每天观察，至少14天。在观察
期内至少有80%最初接种的乳鼠存活，试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染，
为符合要求。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的乳鼠，直接肉眼观察
其病理改变，并取有病变的相应的组织和脑、脾制备成悬液通过脑内和腹腔接
种另外至少5只出生后24小时内的乳鼠，并每天观察至接种后第14天，如果没有
乳鼠出现病毒感染，则符合要求。
2．细胞培养法
(1) 非血吸附病毒检查 用经抗血清中和后的病毒悬液，分别接种于人源、猴
源和生产用的同种细胞。用人二倍体细胞生产的，还应接种另外一株人二倍体
细胞。每种细胞至少接种6瓶，每瓶病毒悬液接种量不少于培养液总量的25%。
于36℃±1℃培养，观察14天，必要时可更换细胞培养液，未见细胞病变为阴性，
符合要求。
(2) 血吸附病毒检查 上述接种病毒的各种细胞于第6～8天和第14天，每种细
胞各取出2瓶进行血吸附病毒检查。用0.2%～0.5%鸡和豚鼠红细胞混合悬液覆盖于
细胞表面，置2～8℃ 30分钟，然后置20～25℃ 30分钟，分别进行镜检，观察红细
胞吸附情况，结果应均为阴性。
3．鸡胚检查法
在禽类组织或细胞中繁殖过的病毒种子需用鸡胚检查禽类病毒的污染。选
用9～11日和5～7日龄两组SPF鸡胚，每组至少5只，分别于尿囊腔和卵黄囊接种经
抗血清中和后的病毒悬液，每胚0.5ml。孵育7日后，取尿囊液用豚鼠和鸡红细胞
混合悬液做血球凝集试验，应为阴性。被接种的鸡胚至少80%存活7天，试验有
效。
生产用细胞外源因子检查
1．非血吸附病毒检查
(1) 细胞直接观察 每批生产用细胞应留取5%(或不少于500ml)细胞悬液不接种
病毒，作为对照细胞加入与疫苗生产相同的细胞维持液，置与疫苗生产相同的
条件下培养，观察14天，在显微镜下观察是否有细胞病变出现，无细胞病变出现
者为阴性，符合要求。在观察期末至少有80%的对照细胞培养物存活，试验有效。
(2) 细胞培养试验 上述试验观察期末，收取上清液混合后，取适量接种于猴
源和人源的细胞培养物，如果疫苗病毒在非猴源或非人源其他细胞系上生产，
还应接种于同种不同批细胞。接种量应不少于总量的25%。每种细胞至少检查
5ml上清混合液，置与生产相同的培养条件下培养。无细胞病变者为阴性，符合
要求。
2．血吸附病毒检查
对上述细胞直接观察及细胞培养试验的细胞培养物在观察期末取至少25%的
细胞培养瓶进行血吸附病毒检查(方法同病毒种子批外源因子检查的血吸附病毒
检查)。
页码数,2005版药典附录第20页
附录ⅣA醋酸纤维素薄膜电泳法
试剂 (1)巴比妥缓冲液(pH8．6) 称取巴比妥2·76g、巴比妥钠15．45g，加水溶
解使成1000ml。
(2)氨基黑染色液称取氨基黑10B O．5g，溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的
混合液中。附录ⅣC SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
(3)漂洗液量取乙醇45mi、冰醋酸5ml及水50ml，混匀。
(4)透明液 量取冰醋酸25ml、无水乙醇75ml，混匀。
测定法取醋酸纤维素薄膜，裁成2cmX 8cm膜条，将无光泽面向下，浸入巴比
妥缓冲液(pH8．6)中，待完全浸透，取出夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液
后，将膜条无光泽面向上，置含巴比妥缓冲液(pH8．6)的电泳槽架上，通过滤
纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH8．6)中。于膜条上距负极端2cm处，条状滴加蛋白含
量约5％的供试品溶液2～3ffl，在O．4～O．6mA／cm[总电流量=电流量(mA／cm)×
每条膜的宽度(cm)×膜条数]电流条件下电泳；同时取新鲜人血清作对照，电泳时
间以白蛋白与丙种球蛋白之间的电泳展开距离约2cm为宜。电泳完毕，将膜条
取下浸于氨基黑染色液中，2～3分钟后，用漂洗液浸洗数次，直至脱去底色为
止。将洗净并完全干燥的膜条浸于透明液中，待全部浸透后，取出平铺于洁净
的玻板上，干燥后即成透明薄膜，可供测定纯度和作标本长期保存。将干燥的
醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪采用反射(未透明薄膜)或透射(已透明薄膜)方式在
记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图，以人血清作对照，按峰面积计算各蛋白
组分的含量(％)。
页码数,2005版药典附录第47页
附录ⅨC大肠杆菌菌体蛋白残留量测定法
本法系采用酶联免疫法测定大肠杆菌表达系统生产的重组制品中残留菌体
蛋白含量。
试剂 (1)包被液(pH9．6碳酸盐缓冲液) 称取碳酸钠O．32g、碳酸氢钠0．586g，
置200ml量瓶中加水溶解并稀释至刻度。
(2)磷酸盐缓冲液(pH 7．4) 称取氯化钠8g、氯化钾0．2g、磷酸氢二钠l.44g、磷
酸二氢钾0．24g，加水溶解并稀释至500ml，121℃灭菌15分钟。
(3)洗涤液(pH 7．4) 取聚山梨酯20 0．5ml，加磷酸盐缓冲液至500ml。
(4)稀释液(pH 7．4) 称取牛血清白蛋白0．5g，加洗涤液溶解并稀释至100ml。
(5)浓稀释液称取牛血清白蛋白1．0g，加洗涤液溶解并稀释至100ml。
(6)底物缓冲液(pH5．0枸橼酸一磷酸盐缓冲液) 称取磷酸氢二钠
(Na2 HP04·12H20)1．84g、枸橼酸O．51g，加水溶解，并稀释至100ml。
(7)底物液取邻苯二胺8mg，30％过氧化氢30μ1，溶于底物缓冲液20ml中。(临用
时现配。)
(8)终止液1mol／L硫酸溶液标准品溶液的制备按菌体蛋白标准品说明书加水
复溶，精密量取适量，用稀释液稀释成每lml中含菌体蛋白500ng、250ng、125ng、
62．5ng、31．25ng、15．625ng、7．8125ng的溶液。
供试品溶液的制备取供试品适量，用稀释液稀释成每lml中约含250μg的溶液。
如供试品每lml中含量小于500μg时，用浓稀释液稀释一倍。
测定法取兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体适量，用包被液溶解并稀释成每lml中含
10μg的溶液，以100μl／孔加至96孔酶标板内，4℃放置过夜(16～18小时)。用洗涤
液洗板3次；用洗涤液制备1％牛血清白蛋白溶液，以200μl／孔加至板内，37℃放
置2小时；将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次；以100μ1／孔加入标准品溶液和
供试品溶液，每个稀释度做双孔，同时加入两孔空白对照(稀释液)，37℃(3放置
2小时；用稀释液稀释辣根过氧化酶(HRP)标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体1000
倍，以100μl孔加至板内，37℃放置1小时，用洗涤液洗板10次，以100μl／孔加入底
物液，37℃避光放置40分钟，以50μ1／孔加入终止液终止反应。用酶标仪在492nm
波长处测定吸光度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工
作图法计算。
以标准品溶液吸光度对相应的浓度作标准曲线，并以供试品溶液吸光度在
标准曲线上得到相应菌体蛋白含量，按以下公式计算
供试品菌体蛋白残留含量(％)= c*D*100%/T*1000000
式中 c为供试品溶液中菌体蛋白质含量，ng／ml；
D为供试品稀释倍数；
T为供试品蛋白质含量，mg／ml。
页码数,2005版药典附录第29页
附录ⅥA氮测定法
(半微量法)
本法系依据含氮有机物经硫酸消化后，生成硫酸铵，硫酸铵被氢氧化钠分
解释放出氨，后者借水蒸气被蒸馏人硼酸液中生成硼酸铵，最后用强酸滴定，
依据强酸消耗量可计算出供试品的氮含量。
试剂(1)消化剂 称取硫酸铜(CuS04·5H20)10g、硫酸钾lOOg，置乳钵内，共同研
细，混匀。
(2)混合指示液0．2％溴甲酚绿乙醇溶液5份与O．1％甲基红乙醇溶液2份混合
配成。
(3)2％硼酸吸收液称取硼酸20g，加水溶解并稀释成1000ml，加混合指示液10ml，
混匀。
(4)硫酸滴定液(O．05mol／L) 取硫酸3ml，缓缓注入适量水中，冷却至室温，
加水稀释至1000ml，摇匀。
取在270～300℃干燥至恒重的基准无水碳酸钠约O．15g，精密称定，加水50ml
使溶解，加甲基红-溴甲酚绿混合指示剂10滴，用本液滴定至溶液由绿色转变为
紫红色时，煮沸2分钟，冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。每
lml硫酸滴定液(O．05tool／L)相当于5．30mg的无水碳酸钠。根据本液的消耗量与
无水碳酸钠的取用量，算出本液的浓度，即得。
(5)硫酸滴定液(0．005tool／L)的配制 精密量取硫酸滴定液(0．05 tool／L)lOOml，
置于1000ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
测定法精密量取一定体积的供试品(约相当于含氮量1．0～2．Omg)，置凯氏
定氮瓶中，加消化剂约0．3g，硫酸lml消化至澄明，呈蓝绿色，继续消化约60分
钟。
取2％硼酸吸收液10ml置lOOml锥形瓶内，将凯氏蒸馏器冷凝管末端浸入硼酸
吸收液内，将消化好的供试品移入凯氏蒸馏器内，用水洗定氮瓶3～4次，将洗
液移入蒸馏器内，再加入50％氢氧化钠溶液5ml，然后进行蒸馏，待接收液总体
积约35～50ml，将冷凝管末端移出液面，使蒸汽继续冲洗约1分钟，用水淋洗尖
端后停止蒸馏。接收液用硫酸滴定液(O．005mol／L)进行滴定，至溶液由蓝绿色
变为灰紫色，并将滴定的结果用空白试验校正。
按下式计算
氮含量(mg／m1)=(Vx-Vo)*c*14．01*n*2/V
式中Vx为供试品消耗酸滴定液的体积，ml；
V0为空白消耗酸滴定液的体积，ml；
c为硫酸滴定液的浓度，mol／L；
n为供试品的稀释倍数；
V为供试品溶液的体积，ml；
14．Ol为氮的相对原子质量。
【附注】 (1)蒸馏前应蒸洗蒸馏器15分钟以上。
(2)蒸汽发生瓶内应加数滴硫酸及甲基红指示剂至呈明显红色。
(3)也可用全自动凯氏定氮仪测定。
页码数,2005版药典附录第29页
附录ⅥB蛋白质测定法
第一法凯氏定氮法
本法系通过测定供试品的总氮含量以及经钨酸沉淀去除蛋白的供试品滤液
中的非蛋白氮含量，计算出蛋白质的含量。
供试品溶液的制备 (1)总氮测定溶液的制备精密量取供试品lml，用生理氯化
钠溶液准确稀释至每lml含氮量约lmg。
(2)非蛋白氮测定溶液的制备 精密量取供试品2ml，加水14ml、10％钨酸钠溶
液2ml、硫酸溶液(1．86-100)2ml，摇匀，静置30分钟过滤，取滤液测定。
测定法精密量取总氮测定溶液lml，置凯氏定氮瓶中，照氮测定法(附录ⅥA)
测定供试品中总氮含量。同时做空白对照。
精密量取非蛋白氮测定溶液5ml，置凯氏定氮瓶中，照氮测定法(附录ⅥA)测
定供试品中非蛋白氮含量。
按下式计算
CTN(mg／m1)=(Vx1-Vo)*C*14．01*n*2/v1
CNPN(mg／m1)=(Vx2-Vo)*c*14．01*n*2/v2
CPN(mg/ml)=CTN-CNPN
供试品蛋白质含量(％，g／m1)=CPN*6．25*100/1000
式中CTN为供试品溶液总氮含量，mg／ml；
CNPN为供试品溶液非蛋白氮含量，mg／ml；
Vxl为供试品总氮测定溶液消耗酸滴定液的体积，ml；
Vx2为供试品非蛋白氮测定溶液消耗酸滴定液的体积，ml；
V0为空白试验消耗酸滴定液的体积，ml；
c为硫酸滴定液的浓度，mol／L；
CPN为供试品蛋白氮含量，mg／ml；
n为供试品的稀释倍数；
V1为供试品总氮测定溶液的体积，ml；
V2为供试品非氮测定溶液的体积，ml；
14．01为氮的相对原子质量；
6．25为常数(1g氮相当于6．25g蛋白质)。
【附注】 (1)供试品蛋白质含量如超过10％(g／m1)，除蛋白质时应适当加大供
试品稀释倍数，10％钨酸钠溶液及硫酸溶液用量相应地按比例增加，使溶液中
的钨酸浓度仍保持1％。
(2)总氮测定和非蛋白氮测定可用同一空白对照。
第二法Lowry法
本法用于微量蛋白质的含量测定。蛋白质在碱性溶液中可形成铜一蛋白质
复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm处
的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质
含量。
试剂(1)酚试剂 取钨酸钠(NazW04·2HzO)100g、钼酸钠(NazM004·2H20)25g，置1500ml
蒸馏瓶中，加入700ml水、85％磷酸50ml、盐酸100ml，上连回流管(使用木塞或锡纸
包裹的橡皮塞)微沸回流10小时。取下回流管，加入硫酸锂150g、水50ml、溴液几
滴，煮沸约15分钟，驱除过量的溴。冷却，加水至1000ml，过滤，为酚试剂贮备
液。
酚试剂贮备液用氢氧化钠滴定液(O．5mol／L)测定酸浓度，然后加水稀释至
相当于1mol／L盐酸浓度。
(2)碱性铜溶液 取0．1mol／L酒石酸钾溶液与O．04mol／L硫酸铜溶液各0．5 ml，
4％碳酸钠溶液与O．8％氢氧化钠溶液各25 m1，摇匀，即得。本液应临用配制。
(3)氢氧化钠滴定液(O．5mol／L)的配制及标定 取氢氧化钠适量，加水搅拌使
溶解成饱和溶液，冷却后，置聚乙烯塑料瓶中，静止数日，澄清后，取澄清的
氢氧化钠饱和溶液28ml，加新煮沸后冷却的水，使成1000ml，摇匀。
取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约3g，精密称定，加新沸过的冷
水50ml，振摇，使其尽量溶解；加酚酞指示剂2滴，用本液滴定；在接近终点
时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。每lml氢氧化钠滴定
液相当于102．1mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的
取用量，算出本液的浓度。
标准蛋白质溶液的制备取人血白蛋白标准品一支，用水定量稀释至每lml含
lmg，作为贮备液。精密量取贮备液2．5ml置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇
匀，即为每lml含100μg的标准蛋白质溶液。
测定法 精密量取一定体积供试品(含蛋白质50μg左右)置试管内，加水至lml，
加碱性铜溶液5ml，摇匀，室温放置10分钟，快速加入酚试剂O．5 ml，摇匀，室
温放置30分钟，显色后，照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长650nm处测
定吸光度(呈色后，如发现浑浊，经每分钟3000转离心15分钟后，取上清液测定)。
精密量取标准蛋白质溶液0．2ml、O．4ml、O．6ml、0．8ml、1．0m1分别置于试管
中，自"加水至Iml"0，同法操作。准确量取水lml，自“加碱性铜溶液5ml”起，同法
操作，作空白对照。以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度，求直线回归方
程；将测得供试品的吸光度代入直线回归方程，即得供试品的蛋白质含量。
第三法双缩脲法
本法系依据蛋白质肽键在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色深
浅与蛋白质含量成正比，利用标准蛋白质溶液作对照，采用紫外一可见分光光
度法测定供试品蛋白质含量。
试剂 双缩脲试剂。取硫酸铜(CuS04·5HzO)3．Og、酒石酸钾钠
(KNaC4H4 06·4HzO)9．0g、碘化钾5．Og、氢氧化钠24g，加水溶解并稀释至1000ml，
摇匀，即得。
标准蛋白质溶液的制备精密量取人血白蛋白标准品适量，用水定量稀释成
每lml含50mg的溶液。
供试品溶液的制备 精密量取适量的供试品，加水制成每lml约含50mg的溶液。
测定法 分别精密量取供试品溶液与标准蛋白质溶液各0．05ml置玻璃试管中，
分别加双缩脲试剂4．0ml，混匀，置37℃水浴中30分钟，照紫外一可见分光光
度法(附录ⅡA)，在波长540nm处测定吸光度。另精密量取水0．05ml，自"加双缩
脲试剂4．0ml"起，同法操作，作为空白对照。
按下式计算
蛋白质含量(mg／m1)=A1*C*n/A2
式中 A1为供试品溶液的吸光度；
A2 为标准蛋白质溶液的吸光度；
c为标准蛋白质溶液的浓度，mg／ml；
n为供试品稀释倍数。
【附注】 本法的测定范围为1～10mg。
页码数,2005版药典附录第22页
附录ⅣD等电聚焦电泳法
两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所
带的电荷与介质的pH值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，
当到达其等电点(此处的pH值使相应的蛋白质不再带电)时，电流达到最小，不
再移动。本法用于检测蛋白类供试品的等电点。
第一法等电聚焦垂直板电泳
试剂 (1)水(电阻率不低于18．2MΩ·cm)
(2)A液称取丙烯酰胺29．1g、亚甲基双丙烯酰胺0．9g，加适量水溶解，并稀
释至100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B液10％过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4倍浓度) 量取甘油8ml、40％两性电解质(pH3～10)溶液4ml，
加水至20ml。加0．1％甲基红溶液20μl。,
(5)固定液 称取三氯醋酸34．5g，磺基水杨酸10．4g，加水溶解并稀释至300
ml。
(6)脱色液(平衡液) 量取95％乙醇500ml、冰醋酸160ml，加水稀释至2000ml。
(7)染色液 称取考马斯亮蓝G250(或R250)0．35g，加脱色液300ml，在60～70℃水
浴中加热，使溶解。
(8)保存液 量取甘油30ml，加脱色液300ml，混匀。
(9)正极液(O．01mol／L磷酸溶液) 量取磷酸lml，加水至1800ml。
(10)负极液(0．01mol／L氢氧化钠溶液) 称取氢氧化钠0．4g，加少量水溶解
后，加水至1000ml。
供试品溶液的制备供试品对水透析(或用其他方法)脱盐后，与供试品缓冲液
按3：1混匀(供试品溶液最终浓度应在每lml含0．5mg以上，如供试品浓度太低，
则需要采用适当方法浓缩)。
测定法装好垂直平板电泳槽，压水，于玻璃板和玻璃 纸之间加入60％甘油
lml。取水12ml、甘油2ml、A液4．0ml、两性电解质(pH3～10)溶液(或其他两性电解
质)1．0ml，混匀，脱气，再加B液72μl，N，N，N※，N※一四甲基乙二胺3μl，混
匀后注入槽内聚合1小时。每孔加供试品缓冲液20μl，接通冷却循环水，于lo℃
250v(约10mA)条件下电泳30分钟。每孔加样20μl。于10~C 500V(约10mA)，上限电压
2000V条件下，电泳约3．5小时。同时做等电点标准。电泳结束后，即将凝胶放
入固定液中固定20分钟以上，取出，放入平衡液中20～30分钟，再放人染色液中
40～60分钟，然后用脱色液浸洗至背景无色，取出放人保存液中30分钟。亦可做
成干胶保存。根据标准品的等电点(pI对其相应的迁移距离作直线回归，将供试
品的迁移距离代入直线回归方程，求出供试品的等电点。
第二法等电聚焦水平板电泳
试剂 (1)水(电阻率应不低于18MΩ·cm)附录V A pH值测定法
(2)A液称取丙烯酰胺29．1g、亚甲基双丙烯酰胺O．9g，加适量水溶解，并稀
释至100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B液10％过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)固定液 称取三氯醋酸34．5g、磺基水杨酸10．4g，加水溶解并稀释至
300ml。
(5)脱色液(平衡液) 量取95％乙醇500ml、冰醋酸160ml，加水稀释至2000ml。
(6)染色液 称取考马斯亮蓝G250(或R250)0．35g，加脱色液300ml，在60～70℃水
浴中加热，使溶解。
(7)保存液 量取甘油30ml，加脱色液300ml，混匀。
(8)正极液(O．5tool／L磷酸溶液) 量取磷酸50ml，加水至1800ml。
(9)负极液(O．2mol／L氢氧化钠溶液) 称取氢氧化钠8g，加水溶解并稀释至
1000ml。
供试品溶液的制备将供试品对水透析(或用其他方法)脱盐，并使蛋白质含量
调节至每lml含0．5mg以上附录V A pH值测定法(如供试品蛋白浓度太低，则需采
用适当方法浓缩)。
测定法取A液6．25ml，pH3～10两性电解质(或其他两性电解质)1_5ml，水
17．1ml，抽气5～10分钟，加B液175 μl，N，N,N※N※一四甲基乙二胺20μl，混匀
后缓慢地注入水平模具内，室温下聚合。将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放在冷却
板上，其间涂以液体石蜡或煤油并避免产生气泡。用正极液与负极液分别润湿
正极与负极电极条，然后分别放于阳极与阴极上，将加样滤纸放在凝胶上。加
供试品溶液5～30μl。将电极对准电极条的中心，加盖，在上限电压2000V、上
限电流50mA、功率为每1cm胶1W、温度4℃的电泳条件下，开始电泳，电泳
2．5小时，同时做等电点标准。电泳30分钟后去掉加样滤纸，电泳结束后，即
将凝胶放入固定液中固定20分钟以上，取出放入平衡液20～30分钟，再放人染色
液40～60分钟，然后用脱色液浸洗至背景无色，取出放人保存液中30分钟，晾
干。亦可做成干胶永久保存。根据标准品的等电点(pI)对其相应的迁移距离作直
线回归；将供试品的迁移距离代入直线回归方程，求出供试品的等电点。
页码数,2005版药典附录第20页
附录IV电泳法
电泳法是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋
酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中，在电场的作用下，带电粒子
按各自的速度向极性相反的电极方向进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，
用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量的方法。除另有规定外，
各电泳法，照下述方法操作。
书页号：2005版药典三部附录12页
附录Ⅱ 分光光度法
分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度
或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
常用的波长范围为,(1)200～400hm的紫外光区；(2)400～760hm的可见光区；
(3)2．5～25μm(按波数计为4000～400cm-1)的红外光区。所用仪器为紫外分光光度
计、可见分光光度计(或比色计)、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为
保证测量的精密度和准确度所用仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定，
定期进行校正检定。
单色光辐射穿过被测物质溶液时，在一定的浓度范围内被该物质吸收的量
与该物质的浓度和液层的厚度(光路长度)成正比，其关系如下式：
A=1g1/T=ECL
式中A为吸光度；
T为透光率；
E为吸收系数，采用的表示方法是E1％1CM，其物理意义为当溶液浓度为1％
(g／m1)，液层厚度为lcm时的吸光度数值；
C为100ml溶液中所含被测物质的重量(按干燥品或无水物计算)，g；
L为液层厚度，cm。
物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。
当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试品配成溶
液，测定其吸光度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，
除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在一定条件下加入
显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称比色分析。
页码数,2005版药典附录第19页
附录ⅢD分子排阻色谱法
分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。
分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅
胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶(Sephadex)和聚丙烯酰胺凝胶(Sepharose)等为
填充剂，这些填充剂表面分布着不同尺寸的孔径，药物分子进入色谱柱后，它
们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔径内，大于所有孔径的分子不能进
入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现
为保留时间较短；小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在
色谱柱中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被
洗脱。
1．对仪器的一般要求
分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法，液相色谱泵一
般分常压、中压和高压。在药物分析中，尤其是分子量或分子量分布测定中，
通常采用高效分子排阻色谱法(HPSEC)。应选用与供试品分子大小相适应的色谱
柱填充剂。使用的流动相通常为水溶液或缓冲液，溶液的pH值不宜超出填充剂
的耐受力，一般pH值在2～8范围。流动相中可加入适量的有机溶剂，但不宜过
浓，一般不应超过30％，流速不宜过快，一般每分钟为0．5～1．0ml。
2．系统适用性试验
高效分子排阻色谱法的系统适用性试验中色谱柱的理论板数(n)、分离度、重
复性、拖尾因子的测定方法，在一般情况下，同高效液相色谱法项下方法，但
在高分子杂质检查时，某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线分离时，
其分离度的计算公式为,R=二聚体的峰高/单体与二聚体之间的谷高
除另有规定外，分离度应大于2．0。
3．测定法
（l）分子量测定法
一般适用于蛋白质多肽的分子量测定。按各品种项下规定的方法，选用与
供试品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的对照品，除另有规定外，
对照品与供试品均需使用二硫苏糖醇(DTT)和十二烷基硫酸钠(SDS)处理，以打
开分子内和分子间的二硫键，并使分子的构型与构象趋于一致，经处理的蛋白
质和多肽分子通常以线性形式分离，以对照品分子量(Mw)的对数值对相应的保
留时间(tR)制得标准曲线的线性回归方程lgMw=a+btR，供试品以保留时间由标准
曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。
(2)生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法
生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和胶原蛋白等具有分子大小不均一
的特点，故生物大分子聚合物分子量与分子量分布是控制该类产品的关键指
标。在测定生物大分子聚合物分子量与分子量分布时，选用与供试品分子结
构与性质相同或相似的对照品十分重要。
按各品种项下规定的方法，除另有规定外，同样采用分子量对照品和适宜
的GPC软件，以对照品重均分子量(Mw)的对数值对相应的保留时间(tR)制得标准
曲线的线性回归方程lgMw—a+btR，供试品采用适宜的GPC软件处理结果，并按下
列公式计算出供试品的分子量与分子量分布。
Mn=∑RIi／∑(RIi／Mi)
Mw=∑(RIiMi)／∑RL
D=Mw/Mn。
式中Mn为数均分子量；
Mw为重均分子量；
D为分布系数；
RLi为供试品在保留时间i时的峰高；
舰为供试品在保留时间i时的分子量。
(3)高分子杂质测定法
高分子杂质系指供试品中含有分子量大于药物分子的杂质，通常是药物在
生产或贮存过程中产生的高分子聚合物或在生产过程中未除尽的可能产生过敏
反应的高分子按各品种项下规定的色谱条件进行分离。
定量方法
①主成分自身对照法同高效液相色谱法项下规定。
一般用于高分子杂质含量较低的品种。
②面积归一化法 同高效液相色谱法项下规定。
③限量法除另有规定外，规定不得检出保留时间小于对照品保留时间的组
分，一般用于混合物中高分子物
④自身对照外标法一般用于Sephadex G-lO凝胶色谱系统中β内酰胺抗生素中
高分子杂质的检查。在该分离系统中，除部分寡聚物外，β内酰胺抗生素中高
分子杂质在色谱过程中均不保留，即所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰，
以供试品自身为对照品，按外标法计算供试品中高分子杂质的相对百分含量。
【附注】 Sephadex G-IO的处理方法
色谱柱的填装装柱前先将约15g葡聚糖凝胶Sepha—dex G-lO用水浸泡48小时，使
之充分溶胀，搅拌除去空气泡，徐徐倾人玻璃柱，一次性装填完毕，以免分
层，然后用水将附着玻璃管壁的Sephadex G-lO洗下，使色谱柱面平整，新填装的
色谱柱要先用水连续冲洗4～6小时，以排出柱中的气泡。
供试品的加入进样可以采用自动进样阀，也可以直接将供试品加在床的表
面(此时，先将床表面的流动相吸干或渗干，立即将供试品溶液沿着色谱管壁
转圈缓缓加入，注意勿使填充剂翻起，待之随着重力的作用渗入固定相后，再
沿着色谱管壁转圈缓缓加入3～5ml流动相，以洗下残留在色谱管壁的供试品溶
液)。
页码数,2005版药典附录第56页
附录X C干扰素生物学活性测定法(细胞病变抑制法)
本法系依据干扰素可以保护人羊膜细胞(WISH)受水泡性口炎病毒(VSV)破坏的
作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，于波长570nm处测定其吸光可得到干
扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测干扰素生物学活性。
试剂 (1)MEM或RPMI 1640培养液取MEM或RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，
加水溶解并稀释至1000ml，加青霉素10 5 IU和链霉素10 5 IU，再加碳酸氢钠2．1g，
溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。
(2)完全培养液 量取新生牛血清10ml，加MEM或RPMI 1640培养液90ml。4℃保存。
(3)测定培养液量取新生牛血清7ml，加MEM或RPMI 1640培养液93ml。4℃保存。
(4)攻毒培养液量取新生牛血清3ml，加MEM或RPMI 1640培养液97ml。4℃保存。
(5)消化液 取乙二胺四乙酸二钠O．2g、氯化钠8．Og、氯化钾0．2g、磷酸氢
二钠1．152g、磷酸二氢钾0．2g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃ 15分钟灭菌。
(6)染色液取结晶紫50mg，加无水乙醇20ml溶解后，加水稀释至100ml，即得。
(7)脱色液取无水乙醇50ml、乙酸O．1ml，加水稀释至100ml。
(8)PBS取氯化钠8．Og、氯化钾0．20g、磷酸氢二钠1．44g、磷酸二氢钾O．24g，
加水溶解并稀释至1000ml，经121℃(2 15分钟灭菌。
标准品溶液的制备 取人干扰素生物学活性测定的国家标准品，按说明书复
溶后，用测定培养液稀释至每lml含1000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀
释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。
供试品溶液的制备将供试品按标示量溶解后，用测定培养液稀释成每lml约含
1000IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个
孔。在无菌条件下操作。
测定法 使WISH细胞在培养基中贴壁生长。按1：2～1：4传代，每周2～3次，
于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗2次后消化和收集细
胞，用完全培养液配制成每lml含2．5×10 5～3．5×10 5个细胞的细胞悬液，接种于
96孔细胞培养板中，每孔100ul。于37℃、5％二氧化碳条件下培养4～6小时。将配
制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种WISH细胞的培养板中，每孔加入
100μ1。于37℃、5％二氧化碳条件下培养18～24小时。弃去细胞培养板中的上清
液。将保存的水泡性口炎病毒(VSV，一70℃保存)用攻毒培养液稀释至100CCID50，
每孔100μ1。于37℃、5％二氧化碳培养24小时(镜检标准品溶液的50％病变点在
1IU／m1)。然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入染色液50μ1，室温放置30
分钟后，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100ul，室
温放置3～5分钟。混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸
光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试
验结果
供试品生物学活性(IU／m1)=Pr×Ds*Es/Dr*Er
式中Pr为标准品生物学活性，1U／ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效稀释倍数。
页码数,2005版药典附录第41页
附录ⅦL干燥失重测定法
取供试品，混合均匀(如为较大的结晶，应先迅速捣碎使成2mm以下的小粒)，
取约1g或各品种项下规定的重量，置与供试品相同条件下干燥至恒重的扁形称
量瓶中，精密称定，除另有规定外，在105℃干燥至恒重。由减失的重量和取样
量计算供试品的干燥失重。
供试品干燥时，应平铺在扁形称量瓶中，厚度不可超过5mm，如为疏松物
质，厚度不可超过10mm。放入烘箱或干燥器进行干燥时，应将瓶盖取下，置称
量瓶旁，或将瓶盖半开进行干燥；取出时，须将称量瓶盖好。置烘箱内干燥的
供试品，应在干燥后取出置干燥器中放冷，然后称定重量。
供试品如未达规定的干燥温度即融化时，应先将供试品于较低的温度下干
燥至大部分水分除去后，再按规定条件干燥。
当用减压干燥器或恒温减压干燥器时，除另有规定外，压力应在2．67kPa
(20mmHg)以下；干燥器中常用的干燥剂为无水氯化钙、硅胶或五氧化二磷；恒
温减压干燥器中常用的干燥剂为五氧化二磷，除另有规定外，温度为60℃。干
燥剂应保持在有效状态。
页码数,2005版药典附录第54页
附录ⅨP肝素含量测定法 (凝固法)
本法系依据硫酸鱼精蛋白能中和抗凝剂肝素，从而影响血浆凝固时间的原
理，测定供试品中肝素含量。
试剂(1)缺血小板人血浆 无菌采集人全血于3．8％枸橼酸钠抗凝剂(9：1)中，
混匀，以每分钟1500转在4℃离心30分钟，用塑料注射器取上层2／3的血浆，以每
分钟3500转在4℃离心30分钟，取上层2／3血浆，分装于塑料管中，每支3ml，保
存-40℃备用。
(2)三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH7．5)取三羟甲基氨基甲烷7．27g、氯化钠
5．27g，加水溶解并稀释至1000ml(用盐酸调节pH至7．5)。
(3)脑磷脂混悬液冻干脑磷脂加水复溶，取适量，用生理氯化钠溶液稀释，稀
释后的脑磷脂混悬液应使空白凝固时间在200～300秒。
(4)O．025 mol／L氯化钙溶液 取氯化钙(CaCl2·2H2 0)147g溶于1000ml水中，制成
1mol／L氯化钙贮备液。临用时，用水将1mol／L氯化钙贮备液稀释40倍。
(5)硫酸鱼精蛋白溶液取硫酸鱼精蛋白适量，用pH7．5 Tris缓冲液溶解并稀释
成每lml含1～20 mg的溶液。
供试品溶液的制备于每支含不同浓度的硫酸鱼精蛋白溶液10μl的塑料管中，
分别加入按标示量复溶后的供试品0．5ml，混匀。
测定法在已含有缺血小板人血浆0．1ml的塑料管中，加人脑磷脂混悬液
O．1ml，混匀，37℃放置1分钟，加供试品溶液0．1ml、已预热至37℃的
0．025 mol／L氯化钙溶液0．1ml，记录凝固时间。用Tris缓冲液(pH7．5)O．1ml替
代供试品溶液，同法操作作空白对照。空白对照凝固时间不低于200秒试验成
立。取凝固时间最短的供试品管，作为硫酸鱼精蛋白中和0．5ml供试品中的肝素
量。硫酸鱼精蛋白10μg中和1IU肝素。例如凝固时间最短的供试品管中含硫酸鱼
精蛋白30μg，则中和供试品O．5ml中的肝素量则为3IU，即供试品每lml含6IU肝
素。
【附注】直接与血和血浆接触的器具应为塑料制品或硅化的玻璃制品。
页码数,2005版药典附录第17页
附录ⅢB高效液相色谱法
高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱
柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在
柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色
谱信号。
1．对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符
合有关规定。
(1)色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性
填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的
硅烷键合硅胶(如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等)也有使用。正相色谱系
统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色
谱；凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用
于对映异构体的拆分分析。
填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖
度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和
分离效果。孔径在15nm(1nm一10A)以下的填料适合于分析分子量小于2000的化合
物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。
以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用pH2~8的流动相。当pH大于8时，
可使载体硅胶溶解；当pH小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色
谱系统中需使用pH大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶
为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机一无机杂化
填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH小于2的流动相时，应选用耐酸的填充
剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十
八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。
(2)检测器最常用的检测器为紫外检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检
测器(DAD)、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器
和质谱检测器等。
紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅
与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；示差折光检测器和蒸发光散
射检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结
构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可
以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱鉴定
和色谱峰的纯度检查。
紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待附录ⅢB高效液相色谱
法测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测
溶液的浓度通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。
不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应至
少符合紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)项下对溶剂的要求；采用低波长检测
时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸
发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。
(3)流动相 由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷
键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于
5％，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。
各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变
外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流
动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适
应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。但对某些品种，必须用特定
牌号的填充剂方能满足分离要求者，可在该品种项下注明。
2．系统适用性试验
色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四
个指标。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数。
按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系
统进行试验，应符合要求。如达不到要求，可对色谱分离条件作适当的调整。
(1)色谱柱的理论板数(n)在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下
规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留
时间tR以分钟或长度计，下同，但应取相同单位)和半高峰宽(Wh／z)，按
n=5．54(tR／Wh／2)2计算色谱柱的理论板数。
(2)分离度(R) 无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标
峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。分离度的计算公式为：
R=2(tR2tRl)/w1+w2
式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；
tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；
W1及W2为此相邻两峰的峰宽(如图,图略）
除另有规定外，定量分析时分离度应大于1·5。
(3)重复性取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面
积测量值的相对标准偏差应不大于2．0％。也可按各品种校正因子测定项下，
配制相当于80％、100％和120％的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3
种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差
应不大于2·0％。
(4)拖尾因子(T) 为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否
符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为：
T=W0.05h/2d1
式中Wo．05h为5％峰高处的峰宽；
d1为峰顶点至峰前沿之间的距离(如图,图略)。
除另有规定外，峰高法定量时T应在0·95～1．05之间。峰面积法测定时，T值偏
离过大，也会影响小峰的检测和定量的准确度。
3．测定法
(1)内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量按各品种项下的规
定，精密称(量)取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成
校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和
内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：
校正因子(f)=As/Cs／AR/CR
式中As为内标物质的峰面积或峰高；
AR为对照品的峰面积或峰高；
cs为内标物质的浓度；
cR为对照品的浓度。
再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测
量供试品中待测成分(或其杂质)和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：
含量(cX)=f.Ax/A※s/c※s
式中Ax为供试品(或其杂质)峰面积或峰高；
Cx为供试品(或其杂质)的浓度；
A※s为内标物质的峰面积或峰高；
c※s为内标物质的浓度；
f为校正因子。
当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液，使用等量
同一浓度的内标物质溶液时，cs=c※s,则配制内标物质溶液不必精密称(量)取。
(2)外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量
按各品种项下的规定，精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密
取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分
的峰面积(或峰高)，按下式计算含量：
含量(cx)=cR.Ax/AR
式中各符号意义同上。
由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或
主成分含量时，以定量环或自动进样器进样为好。
(3)加校正因子的主成分自身对照法
测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，
按各品种项下的规定，精密称(量)取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配
制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述(1)法计算杂质的校正
因子。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些
需作校正计算的杂质，通常以主成分为参照采用相对保留时间定位，其数值
一并载入各品种项下。
测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂
质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节检测灵敏度(以噪音水平可接受为
限)或进样量(以柱子不过载为限)，使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量
程的10％～25％或其峰面积能准确积分[通常含量低于O．5％的杂质，峰面积的
相对标准偏差(RSD)应小于10％；含量在0．5％～2％的杂质，峰面积的RSD应小
于5％；含量大于2％的杂质，峰面积的RSD应小于2％]。然后，取供试品溶液和
对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间，除另有规定外，应为
主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分
别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含
量。
(4)不加校正因子的主成分自身对照法
当没有杂质对照品时，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上
述(3)法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分
别进样，前者的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，
测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，
计算杂质含量。
若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶
液的色谱图I，再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。色谱图工上杂质峰的总面积(
包括溶剂峰),减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然
后依法计算。
(5)面积归一化法
由于峰面积归一化法测定误差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供试品
中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。方法是测量各
杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积及其之
和占总峰面积的百分率。
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附录ⅦM固体总量测定法
本法系在一定温度下，使供试品的液体成分蒸发，用剩余的固体成分计算
供试品的固体总量。
测定法
第一法105℃干烤法
精密量取一定体积供试品于干燥至恒重的适宜的玻璃称量瓶中，置干烤箱
中于105℃烘至恒重。
第二法50℃干烤法
精密量取一定体积供试品于干燥至恒重的适宜的玻璃称量瓶中，置干烤箱中
于50℃烘至恒重。
按下式计算
Cx(％，g／m1)一—W*100/v
式中cx为供试品的固体总量，g／ml；
W为供试品恒重后的重量，g；
V为供试品的体积，m1。
书页号：2005版药典三部附录72页
附录Ⅺ L 猴体神经毒力试验
本法用于脊髓灰质炎减毒活疫苗检定。
应使用体重1.5kg以上的健康猕猴，猴血清经1：4稀释后应证明不含同型别病
毒中和抗体。试验用猴必须经选择和检疫，并未做过其他试验，其隔离检疫应
不少于6周，应无结核、B病毒感染及其他急性传染病，血清中foamy病毒抗体应
为阴性。凡有严重化脓灶、赘生物以及明显的肝肾病理改变者不得用于试验。
可采用脊髓注射方法或脑内注射方法。
脊髓法 (1) 猴的数量 猴体试验必须设立参考品。评价Ⅰ、Ⅱ型供试品及其
参考品最少应各使用11只有效猴，评价Ⅲ型供试品应至少有18只有效猴。猴子的
大小和性别应随机分配到各试验组。同型参考品可用于测试1批以上疫苗。
有效猴系指脊髓灰质炎病毒引起中枢神经系统的特异性神经元损伤的猴子。
供试品组有效猴不足时，允许补足，但参考品组应同时补充相同数量的猴。
如需补足参考品组有效猴，则供试品组亦须同时补充相同数量猴。如试验需要2
个工作日，则每1个工作日用供试品和同型参考品接种的猴只数应相等。为了保
证有效猴只数，通常要相应地增加接种猴只数。
(2) 供试品和参考品的病毒滴度 供试品和参考品的病毒含量应调整到尽可能
接近，每只猴于腰髓第一、二椎间隙注射0.1ml(病毒含量6.5～7.5 lg CCID50/ml)，仅用
1个病毒浓度接种动物。
(3) 检查法 全部猴子应观察17～22天。在接种24小时后死亡猴应做尸体解剖，
检查是否系因脊髓灰质炎引起的死亡。因其他原因死亡的猴子在判定时可以剔
除。在观察期内存活的猴数不低于80%时，试验成立。呈濒死状态或严重麻痹的
猴子应处死进行尸检。
每只猴子取中枢神经系统切片进行组织学检查。切片厚度为10～15μm，没食
子蓝染色检查切片数如下：
腰膨大12个切面；
颈膨大10个切面；
延髓2个切面；
桥脑和小脑各1个切面；
中脑1个切面；
大脑皮层左右侧和丘脑各1个切面。
应由同一人员统一采用4级计分法判断其病变严重程度：
1级 仅有细胞浸润(这不足以认为是有效猴)；
2级 细胞浸润伴有少量的神经元损害；
3级 细胞浸润伴有广泛的神经元损害；
4级 大量的神经元损害，伴有或无细胞浸润。
切片中有神经元损害，但未见针迹者应视为有效猴。切片中由外伤引起的
损害，而又无特异的病理改变则不视为有效猴。
严重程度的分值是由腰髓、颈髓和脑组织切片的整个切片的计分累计而成
的。每只有效猴的病变分值(LS)为
(腰髓分值总和/半个切片数+颈髓分值总和/半个切片数
+脑分值总和/半个切片数)／3
再计算每组有效猴的平均分值。
参考品的平均病变分值在上限与下限之间时，才能根据C1、C2、C3值判定疫
苗合格与否。判定标准如下：
疫苗的平均病变分值(X〈〔test〕〉)与参考品的平均病变分值(X〈〔ref〕〉)
相比较
合格 Xtest－Xref<C1
不合格 Xtest－Xref>C2
重试Ⅰ C1<Xtest－Xref<C2(仅限1次)
重试Ⅱ 同一次试验中，疫苗组平均分值与参考组平均分值之差小于Cl时，
而疫苗组中如单只猴最高分值等于或高于2.5，并大于参考组单只猴最高分值的2
倍时，本批疫苗应重试。
重试合格
(X〈〔(test1+test2)〕〉－X〈〔(ref1+ref2)〕〉)／2<C3
重试不合格
(X〈〔(test1+test2)〕〉－X〈〔(ref1+ref2)〕〉)／2>C3
脑内法 取健康猴20只。麻醉后在两侧视丘分别注入0.5ml原倍供试品(应不低
于7.0 lg CCID50/ml)及10〈－1〉供试品各10只，观察21天，到期存活动物数应不低于
80%，有效猴数应不低于16只，试验有效，否则应补足。注射后48小时内死亡或
出现非特异性麻痹症状者剔除不计，中途死亡及到期处死动物，做中枢神经系
统病理组织学检查，判定标准如下。
(1) 合格标准 凡符合下列情况之一者判为合格：
① 中枢神经系统无脊髓灰质炎病理组织学改变；
② 有2只猴发生轻度及其以下病变；
③ 1只猴发生中度及其以下病变。
(2) 不合格标准
① 1只猴有中度病变，同时1只猴有轻度以上病变者；
② 1只猴有重度以上病变者。
(3) 重试标准 数个亚批疫苗合并试验结果不合格者，可以分批重试，并按上
述标准判定。
页码数,2005版药典附录第54页
附录ⅨO活化的凝血因子活性检查法
本法系依据活化的凝血因子在脑磷脂存在下，使缺血小板人血浆发生凝固
的原理。将供试品和缺血小板人血浆及脑磷脂混合，测定凝固时间，根据凝固
时间判定供试品是否含有活化的凝血因子。
试剂(1)缺血小板人血浆 无菌采集人全血于3．8％枸橼酸钠抗凝剂(9：1)中，
混匀，以每分钟1500转在4℃离心30分钟，用塑料注射器取上层2／3的血浆，以每
分钟3500转在4℃离心30分钟，取上层2／3血浆，分装于塑料管中，每支3ml，保
存-40℃备用。
(2)三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH7．5)取三羟甲基氨基甲烷7．27g、氯化
钠5．27g，加水溶解并稀释至1000ml(用盐酸调节pH至7．5)。
(3)脑磷脂混悬液冻干脑磷脂加水复溶，量取适量用生理氯化钠溶液稀释，稀
释后的脑磷脂混悬液应使空白凝固时间在200～300秒。
(4)O．025 mol／L氯化钙溶液 取氯化钙(CaCl2·2H20)147g溶于1000ml水中，制成
lmol／L氯化钙贮备液。临用时，用水将lmol／L氯化钙贮备液稀释40倍。
(5)硫酸鱼精蛋白溶液取硫酸鱼精蛋白适量，用pH7．5的Tris缓冲液溶解并稀
释成适宜浓度的溶液。
供试品溶液的制备取复溶后的供试品，根据测得的肝素含量(附录ⅨP)加硫
酸鱼精蛋白溶液适量中和供试品中的肝素(10μg硫酸鱼精蛋白中和1IU肝素)，再
用Tris缓冲液(pH7．5)稀释10倍和100倍。
测定法取缺血小板人血浆O．1ml，加脑磷脂混悬液0．1ml，混匀，37℃放置1
分钟，加供试品溶液(10倍或100倍稀释液)0．1ml、已预热至37℃的O．025 mol／L氯
化钙溶液O．1ml，记录凝固时间。用Tris缓冲液(pH7．5)O．1ml替代供试品溶液，
同法操作，作空白对照。
结果判定空白对照凝固时间不低于200秒，试验成立。1：10和1：100供试品稀
释液凝固时间均应不低于150秒。
【附注】(1)直接与血和血浆接触的器具应为塑料制品或硅化的玻璃制品。从
供试品稀释到测定完毕应在30分钟内完成。
(2)供试品每个稀释度做2管。
书页号：2005版药典三部附录15页
附录III A纸色谱法
某些含碱金属或碱土金属元素的供试品溶液用喷雾装。置以气溶胶
形式引入火焰光源中，靠火焰的热能将供试品元素原子化并激发出它们的特征
光谱，通过光电榆测系统测量出待测l元素特征光谱的发光强度可求出供试品中
待测元素的含量。通常借比较对照品溶液和供试品溶液的发光强度，求得供试
品中待测元素的含量。
对仪器的一般要求
所用仪器为火焰光度计，由燃烧系统、单色器和检测系统等部件组成。
燃烧系统由喷雾装置、燃烧灯、燃料气体和助燃气体的供应等部分所组成。
燃烧火焰通常是用空气作助燃气，用煤气或液化石油气等作燃料气组成的火
焰，即空气煤气或空气液化石油气火焰。
仪器某些lT作条件(如火焰类型、火焰状态、空气压缩机供应压力等)的变化
可影响灵敏度、稳定程度和F扰情况，应按各品种项下的规定选用。
测定法
火焰光度法用于含量测定及杂质限度检查时，照原子吸收分光光度法(附录
IIB)中第一法、第二法进行测定
页码数,2005版药典附录第49页
附录ⅨF激肽释放酶原激活剂测定法
本法系采用显色底物法(或显色基质法)测定供试品中激肽释放酶原激活剂
(PKA)含量。
试剂 (1)0．05m01／L三羟甲基氨基甲烷-O．15mol／L氯化钠溶液(TNB) 用lmol／L
盐酸调节pH值至8．0。
(2)2mmol／L激肽释放酶显色底物(S-2302)溶液称取S-2302 12．5mg，加10ml水溶解。
(3)前激肽释放酶(PK) 采用适宜方法提纯PK，小体积分装，-30℃以下保存备
用。
PKA标准溶液的制备 取PKA标准品适量，用0．85％氯化钠溶液稀释成每lml中
含10．0IU、20．0IU、30．0IU、40．0IU、50．0 IU的溶液。按每次用量，小体积
分装，一30℃保存备用，用前融化(仅允许冻融1次)，并用TNB稀释10倍。
供试品溶液的制备 取供试品适量，用TNB稀释10倍。
测定法取供试品溶液20μl加至96孔微量滴定板孔内，加PK 20μl，振荡1分钟，加
盖置25～30℃放置30分钟(或37℃ 10分钟)后，加2mmol／L S-2302溶液20μ1，振荡1分
钟，加盖置25～30℃放置15分钟(或37℃ 10分钟)，加50％醋酸溶液20μl，振荡1分钟
后，照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长405nm处测定吸光度。同时以
TNB 20μl代替PK 20μ1，同法操作，作为空白对照。用PKA标准溶液20μl替代供试品
溶液，同法操作。将标准品溶液PKA活性的对数对其相应的吸光度对数进行线
性回归，求出回归方程，计算出供试品PKA活性。
【附注】 (1)每个标准溶液和供试品做3孔，其中2个测定孔、1个对照孔，两个
测定孔吸光度差值应小于0．020。
(2)每次测定可根据供试品PKA含量，适当调整PKA标准溶液的范围。
(3)线性回归的相关系数应不低于0．99。
(4)加PK、S-2302及50％醋酸溶液时，各孔的间隔时间应相同，加液的顺序要一
致，尽可能使各孔处于同一反应条件下。
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附录ⅦI钾离子测定法
本法系用火焰光度法测定供试品中钾离子含量。
测定法精密量取供试品2ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，即为供试品
溶液。照火焰光度法(附录ⅡD)测定，在波长769nm处测定供试品溶液的发光强
度。另精密称取于110℃干燥至恒重的氯化钾56．0mg，置500ml量瓶中，用水溶解
并稀释至刻度，再精密量取该溶液1．0ml、2．0ml、3．0ml、4．0ml、5．0ml，分
别置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，制成O·03mmol／L、0．06mmol／L、0．09
mmol／L、0．12mmol／L、O．15mmol／L的系列标准钾溶液，同法测定。
用系列标准钾溶液的浓度对其相应的发光强度作直线回归处理，将供试品溶
液发光强度代入回归方程，求得供试品溶液钾离子浓度(mmol／L)，再乘以供试
品的稀释倍数(25)，计算出供试品钾离子含量(mmol／L)。
页码数,2005版药典附录第48页
附录ⅨD假单胞菌菌体蛋白残留量测定法
本法系采用酶联免疫法测定假单胞菌表达系统生产的重组制品残留菌体蛋
白含量。
试剂 (1)包被液(pH9．6碳酸盐缓冲液) 精密称取碳酸钠O．32g、碳酸氢钠
0.586g，置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。
(2)磷酸盐缓冲液 称取氯化钠8．Og、氯化钾O．20g、磷酸氢二钠1．44g、磷
酸二氢钾0．24g，置500ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，121℃灭菌15分钟。
(3)洗涤液取聚山梨酯20 O．5ml，加磷酸盐缓冲液至500ml。
(4)浓稀释液 称取牛血清白蛋白1．0g，加洗涤液使溶解成100ml。
(5)稀释液 浓稀释液与水等体积混合。
(6)底物缓冲液(0．005mol／L醋酸钠-枸橼酸缓冲液) 称取醋酸钠O．68g、枸橼
酸(C6H8o7·H20)1．05g，加水溶解并稀释至1000ml，调节pH至3．6。
(7)底物液A称取3，3’，5，5’一四甲基联苯胺(TMB)0．08g，加二甲基亚砜40ml
溶解，加甲醇60ml，混匀，加底物缓冲液100ml，避光搅拌2小时至完全溶解，室
温静置4小时。
(8)底物液B取1．5％过氧化氢溶液3．2ml，加底物缓冲液至1000ml。
(9)底物液临用前取底物液A、B等体积混合。
(10)终止液2mol／L硫酸溶液。
标准品溶液的制备按试剂盒使用说明书用稀释液溶解菌体蛋白标准品，精
密量取适量，用稀释液稀释成每lml中含菌体蛋白20ng、10ng、5ng、2．5ng、
1．2ng、O．6ng、O．3ng的溶液。
供试品溶液的制备取供试品适量，用稀释液稀释成每lml中约含蛋白100μg的
溶液。如供试品每lml中含蛋白量小于200μg时，用浓稀释液将供试品稀释1倍。
测定法取包被抗体，用包被液稀释至适宜的浓度(稀释倍数参见试剂盒说明
书)，以100μ1／孔加至96孔酶标板内，在2～8℃放置16～20小时；用洗涤液洗板3
次；用洗涤液制备1％牛血清白蛋白溶液，以200μ1／孔加至板内，置室温振荡(
每分钟200～300转)1小时，用洗涤液洗板3次；以100μ1／孔加入标准品溶液和供试
品溶液，每个稀释度做双孑L，同时加入两孔空白对照(稀释液)，置室温振荡(每
分钟200～300转)1小时；用洗涤液洗板3次；按试剂盒说明书用稀释液稀释一抗至
适宜的浓度，以100μl／孔加至板内，置室温振荡(每分钟200~300转)1小时；用洗涤
液洗板3次；然后按试剂盒说明书用稀释液稀释辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗至
适宜的浓度，以100μl／孔加至板内，置室温振荡(每分钟200～300转)30分钟，用洗
涤液洗板8次；以100μ1／孔加入底物液，置室温避光反应10～15分钟，以
100μ1／孔加入终止液终止反应。用酶标仪在450nm波长处测定吸光度，应用计算
机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作图法计算。
以标准品溶液吸光度对相应的浓度作标准曲线，并以供试品溶液吸光度在
标准曲线上得到相应菌体蛋白含量，按以下公式计算
供试品菌体蛋白质残留含量(％)=c*D*100%/T*1000000
式中c为供试品溶液中菌体蛋白质含量，ng／ml,
D为供试品稀释倍数；
T为供试品蛋白质含量，mg／ml。
页码数,2005版药典附录第35页
附录ⅥN 间甲酚测定法
本法系依据4一氨基安替比林、铁氰化钾在碱性条件下与苯酚反应生成一种
红色物质，用比色法测定供试品中间甲酚含量。
测定法精密量取一定体积的供试品，置试管中，定量稀释50倍，即为供试
品溶液。量取供试品溶液1·0ml，加水5．0ml，混匀，依次加pH 9．8缓冲液(称取
无水碳酸钠6．36g、碳酸氢钠3．36g，加水溶解并稀释至800ml，用1 mol／L盐酸
调pH值至9．8后，再加水至1000m1)、0．3％4一氨基安替比林溶液、1．2％铁氰
化钾溶液及1mol／L磷酸二氢钾溶液各1．0ml，混匀，于室温避光放置10 分钟，
照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长510nm处测定吸光度。
精密量取间甲酚对照品溶液(取间甲酚适量，精密称定，置量瓶中，加水溶
解并稀释至每lml含10μg)1．0ml、2．0ml、3．0ml、4．0ml、5．0ml、6．0ml，分别
置试管中，加水补至6．0ml，自“依次加pH 9·8缓冲液起，同法操作，测定各管
的吸光度。
以间甲酚对照品溶液的系列浓度对相应的吸光度作直线回归，将供试品溶液
的吸光度代入回归方程，得供试品的间甲酚含量(mg／m1)。
书页号：2005版药典三部附录8页
附录I F胶囊剂
胶囊剂 系指以生物制品原液经干燥后制成的干粉为原料药物，加入适宜辅
料后，充填于空心胶囊或密封于软质囊材中的固体制剂。该药物可由一种或
多种活性成分组成。
胶囊剂根据其溶解与释放特性，可分为硬胶囊(通称为胶囊)、肠溶胶囊等。
硬胶囊 系指将原料药物或加适宜辅料制成均匀粉末、颗粒、小片或小丸等充
填于空心胶囊中制成。
肠溶胶囊 系指硬胶囊经药用高分子材料处理或其他适宜方法加工而成；可用
适宜的肠溶材料制备而得；也可用经肠溶材料包衣的颗粒或小丸填充胶囊而制
成。肠溶胶囊不溶于胃液，但能在肠液中崩解而释放活性成分。
胶囊剂在生产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产和质量控制应符合相关品种要
求。
二、胶囊剂内容物不论其活性成分或辅料，均不应造成胶囊壳的变质。
三、胶囊剂应整洁，不得有黏结、变形、渗漏或囊壳破裂现象，并应无异
臭。
四、除另有规定外，胶囊剂应置2～8℃密封贮存和运输。
胶囊剂应进行以下相应检查。
【装量差异】 胶囊剂的装量差异限度，应符合规定。
检查法除另有规定外，取供试品20粒，分别精密称定重量后，倾出内容物(
不得损失囊壳)；硬胶囊用小刷或其他适宜用具拭净，再分别精密称定囊壳重
量，求出每粒内容物的装量与平均装量。每粒的装量与平均装量相比较，超
出装量差异限度的不得多于2粒，并不得有1粒超出限度1倍。
【崩解时限】 除另有规定外，照崩解时限检查法(附录V C)检查，均应符合
规定。
【微生物限度】 除另有规定外，照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符
合规定。
凡规定进行杂菌检查的胶囊剂，可不进行微生物限度检查。
页码数,2005版药典附录第48页
附录ⅨE酵母工程菌菌体蛋白残留量测定法
本法系采用酶联免疫法测定酵母表达系统生产的重组制品残留菌体蛋白含
量。
试剂 (1)包被液(pH9．6碳酸盐缓冲液) 称取碳酸钠O．32g、碳酸氢钠0．586g，
加水溶解并稀释成200ml。
(2)PBS称取氯化钠8．Og、氯化钾0．20g、磷酸氢二钠1．44g、磷酸二氢钾
O．24g加水使溶解成1000ml，调节pH值至7．4，121℃灭菌15分钟。
(3)洗涤液(PBS-Tween20) 取聚山梨酯20 O．5ml，加PBS至1000ml。
(4)稀释液称取牛血清白蛋白0．5g，加洗涤液溶解，并稀释至100ml。
(5)底物缓冲液(0．005mol／L醋酸钠一枸橼酸缓冲液) 称取醋酸钠O．68g、枸橼
酸(C6H8O7·H20)1．05g，加水溶解并稀释至1000ml，调节pH值至3．6。
(6)底物液A 称取3，3’，5，5，_四甲基联苯胺(TMB)0．08g，加二甲基亚砜40ml
溶解，加甲醇60ml，混匀，加底物缓冲液100ml，避光搅拌2小时至完全溶解，室
温静置4小时。
(7)底物液B取1．5％过氧化氢溶液3．2ml，加底物缓冲液至1000ml。
(8)底物液 临用前取底物液A、底物液B等体积混匀。
(9)终止液lmol／L硫酸溶液。
标准品溶液的制备按试剂盒使用说明书加水复溶，精密量取适量，用稀释
液稀释成每lml中含菌体蛋白质1000ng、500ng、250ng、125ng、62．5ng的溶液。
供试品溶液的制备取供试品适量，用稀释液稀释成适当浓度。
测定法 取豚鼠抗酵母工程菌蛋白抗体适量，用包被液稀释成适当浓度，以
100μl／孔加至酶标板内，用保鲜膜封好，4℃放置过夜；用洗涤液洗板3次，用
洗涤液制备1％牛血清白蛋白溶液，以200μl／孔加至板内，37℃放置2小时；将
封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次；以100μ1／孔加入标准品溶液及供试品溶液，
每个稀释度做双孔，同时加入两孔空白对照(稀释液)，封板，37℃放置1小时；
用洗涤液洗板6次；按试剂盒使用说明书，取兔抗酵母工程菌蛋白抗体适量，用
稀释液稀释成适当浓度，以100μ1／孔加至酶标板内，封板，37℃放置1小时；用
洗涤液洗板6次；用稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体溶液(IgG-HRP)
至适当浓度，以100μl／孔加至酶标板内，用保鲜膜封好，37℃放置1小时；用洗
涤液洗板6次，以100μ1／孔加入底物液，室温避光放置5～10分钟；以100ul／孔加
入终止液终止反应。用酶标仪以630nm波长为参比波长，在450nm波长处测定吸光
度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作图法计算。
以标准品溶液吸光度对相应的浓度作标准曲线，并以供试品溶液吸光度在
标准曲线上得到相应菌体蛋白含量，按以下公式计算
菌体蛋白质残留含量(％)=c*D*100%/T*1000000
式中c为供试品溶液中菌体蛋白质含量，ng／ml；
D为供试品稀释倍数；
T为供试品蛋白质含量，mg／ml。
页码数,2005版药典附录第32页
附录ⅥH聚山梨酯80残留量测定法
本法系依据聚山梨酯80中的聚乙氧基(Polyethoxy-lated)和铵钴硫氰酸盐反应形
成蓝色复合物，可溶于二氯甲烷，用比色法测定聚山梨酯80含量。
测定法取供试品1．0ml于离心管中，加乙醇一氯化钠饱和溶液5ml，摇匀，
每分钟3000转离心10分钟，取上清液，再用乙醇一氯化钠饱和溶液1．0ml小心冲
洗管壁，洗液与上清液合并，每分钟3000转离心10分钟，上清液置55℃水浴中，
用空气吹扫法将其浓缩至0．1～0．5ml，加lml水溶解。准确加入二氯甲烷2．0ml、
硫氰钴铵溶液(称取硝酸钴6．0g、硫氰酸铵40．0g，加水溶解并稀释至200m1)
3．0ml，加塞，混匀，室温放置过夜，每15分钟振荡1次，测定前静置半小时，
弃上层液，照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长620nm处测定下层二氯
甲烷液的吸光度。用二氯甲烷作空白对照。
精密量取聚山梨酯80对照品溶液(取聚山梨酯80约100mg，精密称定，加水溶
解后置100ml量瓶中，加水稀释至刻度)0μl、10μ1、25μl、50μ1、75μ1、100μ1，
加入预先加入lml水的离心管中混匀，准确加入二氯甲烷2．0ml、硫氰钴铵溶液
3．0ml，加塞，混匀，自"室温放置过夜"起，同法操作。
用上述聚山梨酯80系列浓度(μg／m1)与相应的吸光度作直线回归，相关系数
应不低于0．98，将供试品吸光度代入回归方程，求得供试品聚山梨酯80含量
(μg／m1)。
页码数,2005版药典附录第32页
附录ⅥG聚乙二醇残留量测定法
本法系依据聚乙二醇与钡离子和碘离子形成复合物(1：1)，用比色法测定聚
乙二醇含量。
测定法 取供试品适量，用水稀释，使蛋白质浓度不高于1％，即为供试品
溶液。精密量取供试品溶液1．Oml，加入O．5mol／L高氯酸溶液5．Oml，混匀，
室温放置15分钟，每分钟4000转离心10分钟。取上清液4ml，加入氯化钡溶液(称
取氯化钡5g，加水溶解使成lOOml)1．Oml和0．1mol／L碘溶液(称取碘化钾2．0g，
加少量水溶解，然后加碘1．3g，再加水使成50ml，摇匀)O．5ml，混匀，室温反
应15分钟，照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长535nm处测定吸光度。
同时以lml水代替供试品溶液，同法操作，即为空白对照。
另精密称取聚乙二醇(相对分子质量4000或6000)适量，加水溶解，并制成每lml
含聚乙二醇100μg的溶液，即为聚乙二醇对照品贮备溶液。
取按下表制备的每lml含10～50μg的聚乙二醇对照品溶液1．0ml，加入
O．5mol／L高氯酸溶液5．Oml，混匀，自"室温放置15分钟"起，同法操作。
┏━━━━━━━━━━━━━━┳━━━┳━━━┳━━━┳━━━┳━━━┓
┃聚乙二醇含量/ug.ml-1 ┃ 10 ┃ 20 ┃ 30 ┃ 40 ┃ 50 ┃
┣━━━━━━━━━━━━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━┫
┃聚乙二醇对照品贮备溶液／mJ ┃ O．2 ┃ O．4 ┃ O．6 ┃ O．8 ┃ 1．0 ┃
┣━━━━━━━━━━━━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━┫
┃约1％蛋白质溶液／ml ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃
┣━━━━━━━━━━━━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━╋━━━┫
┃水／ml ┃ 1．6 ┃ 1．4 ┃ 1．2 ┃ 1．O ┃ O．8 ┃
┗━━━━━━━━━━━━━━┻━━━┻━━━┻━━━┻━━━┻━━━┛
用聚L-"醇对照品溶液的浓度(μg／m1)与相应的吸光度作直线回归，将供试
品溶液吸光度代入直线回归方程，计算出供试品溶液聚乙二醇含量F(μg／m1)，
按下式计算
供试品聚乙二醇含量(g／L)=F*G* 10-3式中F为供试品溶液中聚乙二醇含量，
μg／ml；
G为供试品稀释倍数。
【附注】 (1)整个比色过程应在试剂加入后的15～45分钟内完成，否则将要影
响结果。
(2)本法的灵敏度随被测聚乙二醇的分子量的增加而提高。
(3)1％的蛋白质溶液系用不含聚乙二醇的蛋白质溶液配制。
页码数,2005版药典附录第51页
附录ⅨJ抗A、抗B血凝素测定法 (间接抗人球蛋白法)
本法系采用间接抗人球蛋白法(Coombs试验)，测定供试品中抗A、抗B血凝
素。
试剂 (1)红细胞悬液取A型、B型、RhD阳性的O型红细胞各3例，分别混合，
用适量生理氯化钠溶液洗涤3次，最后以每分钟2000转离心5分钟，吸取沉淀红
细胞适量，用生理氯化钠溶液制成5％(ml／m1)红细胞悬液。自红细胞采集之日
起1周内使用。
(2)抗人球蛋白血清为多价抗人球蛋白血清，使用前需标定，选择适宜的稀
释度用于试验，如生产厂商有说明，按说明书稀释后使用，也可按附注方法确
定。
测定法取供试品适量用生理氯化钠溶液进行2倍系列稀释，每个稀释度的供
试品使用两排管(75mm×12mm小试管)，每管分别加入供试品溶液O．2ml，向第一
排各管加A型5％红细胞悬液0．2ml，第二排各管加B型5％红细胞悬液0．2ml，混
匀，置37℃水浴30分钟，用适量的生理氯化钠溶液洗涤3次，每次以每分钟1000
转离心1分钟，每管加入抗人球蛋白血清0．2ml，混匀，以每分钟1000转离心1分
钟，肉眼观察结果。本试验同时设阴性、阳性及红细胞对照组。
(1)阴性对照取AB型人血清0．2ml(双份)，分别加入5％A型及B型红细胞悬液
0．2ml，混匀，自置37℃水浴30分钟”起，同法操作。
(2)阳性对照取抗D血清(IgG型)O．2ml，加入5％RhD阳性O型红细胞0．2ml，混
匀，自置37℃(3水浴30分钟”起，同法操作。
(3)红细胞对照取生理氯化钠溶液O．2ml(双份)，分别加入5％A型及B型红细胞
悬液O．2ml，混匀，自‘‘置37℃水浴30分钟"起，同法操作。
结果判定阴性对照及红细胞对照结果均呈阴性，阳性对照结果不低于"+++"，
试验成立。
抗A、抗B血凝素滴度以产生“+”凝集的供试品最高稀释倍数计算，不计红细
胞悬液及抗人球蛋白血清的体积。
【附注】 (1)供试品为凝血因子Ⅷ制剂时，需先用生理氯化钠溶液预稀释成
每lml中含4IU后，再进行测定。
(2)抗人球蛋白血清的标定：将抗人球蛋白血清和抗D血清分别用生理氯化钠
溶液进行2倍系列稀释，每管0．2ml，于稀释的抗D血清管中加入5％RhD阳性的0
型压积红细胞悬液0．1ml，混匀后置37℃水浴中30分钟，用生理氯化钠溶液洗3次
并配成2％的细胞悬液，取每个稀释度致敏红细胞悬液O．2ml，分别加入一排稀
释的抗人球蛋白血清中，混匀，以每分钟1000转离心1分钟，判定结果。用等量
未致敏人RhD阳性0型红细胞替代致敏红细胞，同法操作，作为阴性对照。阴性
对照成立，以出现"+"血凝反应的抗D血清的最高稀释倍数所对应的抗人球蛋白
血清的最高稀释倍数为最适稀释度。
(3)红细胞凝集判定标准如下：
++++一个结实的凝集块；
+++几个大的凝集块；
++ 中等大的凝集块，背景清晰；
+小凝集块，背景浑浊；
阴性 无凝集和溶血。
(4)阴性、阳性、红细胞对照与供试品试验应同步进行。
页码数,2005版药典附录第51页
附录ⅨK抗补体活性测定法
本法系采用免疫溶血反应作指示系统，根据供试品消耗补体所反映出的溶
血率变化，测定供试品的抗补体活性。
试剂 (1)镁-钙贮备液取氯化钙1．103g、氯化镁(MgCl2·6H2 O)5．083g，加水溶解
并稀释至25ml。
(2)巴比妥缓冲液贮备液取氯化钠41．5g、巴比妥钠5．1g，加水800ml溶解。用
lmol／L盐酸溶液调pH值至7．3，加镁一钙贮备液2．5ml，加水稀释至1000ml，用
0．22μm膜滤过，4℃保存备用。
(3)明胶巴比妥缓冲液(GVB) 取明胶0．625g，加水30ml煮沸使溶解，加巴比妥缓
冲液贮备液100ml，再加水稀释至500ml，新鲜制备，当天使用。
(4)阿氏液(Alsever※s液) 取枸橼酸0．5g、枸橼酸钠8．Og、葡萄糖20．5g、氯化
钠4．2g，加水溶解并稀释至1000ml(pH6．2左右)。根据一次采羊血需要量将该溶
液分装于采血瓶中，116℃蒸汽灭菌10分钟(灭菌后，尽快释放蒸汽)。放冷后置
4℃冰箱保存备用。
(5)绵羊红细胞 由绵羊颈静脉无菌采集全血适量，与等体积的阿氏液混合，
无菌分装，4℃保存一周后方可使用。
(6)溶血素兔抗羊红细胞血清。
(7)豚鼠血清(补体)取10只以上豚鼠血清，混合，4℃离心除去血细胞，分装，
一70℃保存，也可冻干保存。豚鼠血清每lml中的补体总活性应不低于200CH50。
5％羊红细胞悬液制备取绵羊红细胞适量，用明胶巴比妥缓冲液至少洗3次
后，悬浮于适量明胶巴比妥缓冲液中。取O．2ml红细胞悬液，加至2．8ml水中，
待红细胞完全溶解后照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)在波长541nm处测定吸光
度，根据下列公式，将该溶液的吸光度调节至0．62±0．01(每lml红细胞悬液含红
细胞1×109个)。
Vf=Vi*A/0.62
式中Vi为稀释前红细胞悬液体积，ml；
A为稀释前红细胞溶解液吸光度；
Vf为稀释后红细胞悬液体积，ml。
溶血素滴定按表1稀释溶血素。从1：75稀释的溶血素开始，1．0ml不同稀释
度的溶血素分别与5％羊红细胞悬液1．0ml混合，37℃放置30分钟后，取O．2ml，
加明胶巴比妥缓冲液1．10ml，稀释的豚鼠补体溶液(如150倍稀释补体)0．2ml，
37℃放置60分钟后，以每分钟2000转离心5分钟，吸取上清液，照紫外-可见分光
光度法(附录ⅡA)于波长541nm处测定各管吸光度。每个稀释度做2管。同时再做
3管未溶血对照管(明胶巴比妥缓冲液1．4ml，加5％羊红细胞悬液O．1m1)，3管全
溶血管(水1．4ml加5％羊红细胞O．1m1)，同法操作。按下式计算各管溶血率(y)，
以y值为纵坐标，以不同溶血素稀释度为横坐标作图，从而确定敏化羊红细胞
所用的溶血素的稀释度。选择增加溶血素的量也不影响y值的溶血素的稀释度，
为每lml含1个最大溶血单位(即每lml含1MHU)。最大溶血率应在50％～70％范围，否
则试验不成立。
y=各管吸光度-未溶血对照管吸光度*100%/全溶血管吸光度-未溶血对照管吸光度
表1溶血素稀释 （表略）
最适敏化的羊红细胞(EA)的制备量取每lml含2MHU的溶血素(A)适量，缓慢注
入等体积的5％羊红细胞(E)悬液中，37℃放置15分钟后，2～8℃保存，6 小时内使
用。
滴定豚鼠血清中补体活性用明胶巴比妥缓冲液适当稀释豚鼠血清，然后按
表2滴定补体。以补体用量的对数对Y／(1一y)的对数作直线回归，从而求出直
线回归方程的截距(a)、斜率(b)和相关系数(r)，补体活性按下式计算
补体活性(CHso／m1)=1/x*补体稀释倍数/5
式中1／X为a值反对数的倒数。
抗补体活性测定根据测得的豚鼠血清补体活性，用明胶巴比妥缓冲液稀释成
每lml含100CH50溶液，按表3制备培养混合物。表3中静注人免疫球蛋白(IVIG)是按
每lml含50mg浓度计算的。如果IVIG的浓度不是每
附录52
表2补体滴定
┏━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━┳━━━━┳━━━━┳━━━━┳━━━━┳━━━━━━┓
┃ ┃ 1 ┃ 2 ┃ 3 ┃ 4 ┃ 5 ┃ 6 ┃ 7 ┃
┣━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━━━┫
┃ GVB／ml ┃ 1．2 ┃ 1_1 ┃ 1．0 ┃ O．9 ┃ O．8 ┃ O．7 ┃ O．6 ┃
┃ 适当稀释的 ┃ O．1 ┃ O．2 ┃ O．3 ┃ O．4 ┃ O．5 ┃ O．6 ┃ O．7 ┃
┃补体／ml ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃
┃ EA／ml ┃ 0．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ 0．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃
┣━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━━━┫
┃ ┃ 8 ┃ 9 ┃ 10 ┃ 11 ┃ 12 ┃ 13 ┃ 14 ┃
┣━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━╋━━━━━━┫
┃ GVB／ml ┃ O．5 ┃ O．4 ┃ O．3 ┃ 0．2 ┃ O．1 ┃ 1．3 ┃ 1．3(水,┃
┃ 适当稀释的 ┃ O．8 ┃ O．9 ┃ 1．O ┃ 1．1 ┃ 1．2 ┃ _—— ┃ ┃
┃补体／ml ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃ ┃
┃ EA／ml ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃ O．2 ┃
┗━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━┻━━━━━━┛
37℃培养60分钟一冰浴中冷却一每分钟2000转离心5分钟→取上清液测吸光度
lml含50mg时，则按下式计算IVIG的加量(V)。然后再根据IVIG的实际取量计算明胶
巴比妥缓冲液的加量，但要保持供试品加缓冲液的总量为0．8ml。将此混合物在
37℃放置60分钟后，取0．2ml加9．8ml明胶巴比妥缓冲液(50倍稀释)，测定剩余补
体活性。
V(m1)=10mg/供试品每1ml中IgG含量（mg)
表3供试品及补体对照管制备
┏━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━━━━┓
┃ ┃ 供试品管／ml ┃补体对照管／ml ┃
┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━━━┫
┃ 供试品(50mg／m1) ┃ O．2· ┃ ┃
┃ 明胶巴比妥缓冲液 ┃ O．6 ┃ O．8 ┃
┃ 补体(100CHso／m1) ┃ O．2 ┃ O．2 ┃
┗━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━┻━━━━━━━━┛
按下式计算供试品抗补体活性。D为每lml含80～120 CH50时，试验成立。
供试品抗补体活性(％)=D-G/D×100％
式中D为补体对照管剩余补体活性，CHso／ml；
G为供试品管剩余补体活性，CHso／m1。
【附注】 (1)洗红细胞时，务必将白细胞弃掉。
(2)敏化红细胞时一定要慢慢轻摇。
(3)仅允许使用澄清明胶溶液。
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附录ⅧF抗毒素F(ab)2测定法
本法系依据电泳法的原理，采用薄层扫描定量检测供试品组分的含量。
试剂 (1)丙烯酰胺溶液取丙烯酰胺14g与双丙烯酰胺O．367g，加水使溶解成
50ml。
(2)磷酸盐缓冲液 取磷酸二氢钠(Nail2P04·2H20)17．8g、磷酸氢二钠
(Na2 HP04·12H20)103g与十二烷基硫酸钠4g，加水使溶解成2000ml。
(3)10％十二烷基硫酸钠溶液(SDS)
(4)供试品结合液量取10％SDS溶液4ml，磷酸盐缓冲液0．2ml与甘油10ml，加水
至20ml。
(5)电极缓冲液取上述磷酸盐缓冲液稀释1倍。
(6)固定液量取甲醇400ml，冰醋酸70ml，加水配制成1000ml。
(7)染色液取考马斯亮蓝2．5g，加甲醇500ml与冰醋酸70ml，再加水使溶解成
1000ml。
(8)脱色液量取冰醋酸70ml与甲醇50ml，加水至1000ml。
(9)干燥液 量取甘油30ml与甲醇200ml，加水至1000ml。
供试品溶液的制备取含一定蛋白质浓度的供试品0．1ml，加供试品结合液
0．1ml，置100℃水浴加热2分钟或37℃ 2小时，冷却。
测定法在凝胶溶液中[磷酸盐缓冲液一丙烯酰胺溶液-水-1．5％过硫酸铵溶液
(2：1：O．8：O．25)]加四甲基L胺(TEMED)1～2滴，混匀后立即加入电泳槽的玻
璃板间，要避免产生气泡。于每一供试品孔内加入经处理的供试品25μg蛋白
质，电泳。电泳条件为每一个供试品孔的电流恒定为2～3mA。当溴酚蓝电泳至
底部时停止电泳。
电泳完毕后，将胶板放人固定液中过夜。于染色液中 染色1～2小时，然后
置脱色液中进行脱色，直至底色成为无色，用扫描仪于波长575nm处对每一供试
品进行扫描，得出(或计算出)供试品中F(ab)2的含量。
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附录Ⅺ J 抗狂犬病血清效价测定法
本法系根据抗狂犬病血清能中和狂犬病病毒的作用，将供试品与标准品做
系列稀释，分别与狂犬病病毒悬液结合，小鼠脑内注射，在规定时间内观察小
鼠存活和死亡情况，以测定供试品效价。
试剂 (1) 2%小牛血清磷酸盐缓冲液 称取磷酸二氢钾1.2g、磷酸氢二钠
(Na2HPO4·12H2O)20.8g，加注射用水溶解并稀释至1000ml，溶解后过滤，调pH至7.6。
灭菌后pH值应为7.2～8.0。于磷酸盐缓冲液98ml中，加入2ml灭能小牛血清，临用前
配制。
(2) 20%小牛血清磷酸盐缓冲液 称取磷酸二氢钾1.2g、磷酸氢二钠
(Na2HPO4·12H2O)20.8g，加注射用水溶解并稀释至1000ml，溶解后过滤，调pH至7.6。
灭菌后pH值应为7.2～8.0。于磷酸盐缓冲液80ml中，加入20ml灭能小牛血清，临用
前配制。
中和用病毒悬液的制备 (1) 病毒悬液的制备 取CVS毒种(一般为冻干毒种)制
成10〈-2〉悬液，制法见本法(2)项，脑内接种体重10～12g小鼠每只0.03ml，待发病
后取鼠脑再制成10〈-2〉悬液，接种于小鼠脑内进行传代，一般传2～3代。选用
第5天发病并麻痹的鼠脑以脱脂牛乳研磨稀释成20%的脑悬液，按0.5ml分装安瓿，
冻干后真空封口，制成冻干中和用病毒，－30℃冻存待用；或用第5天发病并麻
痹的鼠脑用20%小牛血清磷酸盐缓冲液研磨稀释成10〈-1〉悬液，以每分钟2000转
离心20分钟，取上清液混匀后分装小管，－70℃冻存待用。
(2) 病毒悬液毒力的预测
① 冻干病毒的预测。 取含20%脑悬液的冻干病毒，启开后加入2%小牛血清
磷酸盐缓冲液1.0ml，吹打均匀后加入4.0ml 2%小牛血清磷酸盐缓冲液与病毒液充分
混匀，以每分钟1500转离心10分钟，取上清液与等量的2%小牛血清磷酸盐缓冲液
混合即为10〈-2〉悬液，然后再稀释至10〈-3〉、10〈-4〉、10〈－5〉、10〈－6〉
,从10〈－6〉至10〈－2〉的稀释液中各取0.5ml置于5个小管内，每管再加入2%小
牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml，置37℃水浴1小时。用体重10～12g小鼠30只，分成5组，
每组6只，用经37℃作用的10〈-6〉至10〈-2〉病毒悬液接种小鼠，每个稀释度接
种6只小鼠，每只小鼠脑内接种0.03ml，每天观察小鼠发病死亡情况，观察14天，
接种后4天内死亡的小鼠按非特异性死亡计。以接种5天后的发病死亡小鼠统计
LD50。
② －70℃冻存病毒的预测。取含10%脑悬液的冰冻病毒融化后即为10〈-1〉
悬液，然后再稀释至10〈-2〉～10〈-7〉。从10〈-7〉至10〈-3〉各取0.5ml加至5个小
管内，每管再加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml，置37℃水浴l小时。用体重10～
12g小鼠30只，分成5组，每组6只，用经37℃作用的10〈-7〉至10〈-3〉病毒悬液接
种小鼠，每个稀释度接种小鼠6只，每只小鼠脑内接种0.03ml，每天观察小鼠发病
死亡情况，观察14天。接种后4天内死亡的小鼠按非特异性死亡计。以接种5天后
的发病死亡小鼠统计LD50。
(3) 中和用病毒悬液的制备 按病毒悬液预测的100个LD50的病毒稀释度作为中
和用病毒悬液稀释倍数，用于小鼠中和试验。要求中和用病毒悬液经37℃水浴
作用1小时的病毒量在32～320LD50之间。
抗狂犬病血清标准品溶液的制备 由国家药品检定机构提供，或用经国家药
品检定机构认可的各生产单位工作用标准品。配制方法按使用说明书进行。
供试品溶液的制备 用2%小牛血清磷酸盐缓冲液将供试品进行2倍稀释，一般
可采用1：800、1：1600、…、1：102 400，但可根据供试品实际效价适当降低或提
高最低稀释倍数，如采用上述8个稀释倍数，则按稀释液2.7ml加入供试品0.3ml作为
1：10供试品溶液，然后再用稀释液3.5ml加入混匀的1：10的供试品溶液0.5ml作为
1：80供试品溶液，再按稀释液2.7ml加入1：80的供试品溶液0.3ml作为1：800供试品
溶液(1)。再按0.5ml加0.5ml做倍比稀释制备供试品溶液(2)～(8)，它们的稀释倍数依
次为1：1600、1：3200、1：6400、1：12 800、l：25 600、1：51 200和1：102 400。
测定法 取8个稀释度的供试品溶液(1)～(8)各0.5ml置8支小试管中，另取8个稀
释度的抗血清标准品溶液各0.5ml置8支小试管中，共16支小试管，分别加入中和
用病毒悬液0.5ml，放置37℃水浴1小时，供注射小鼠用。另用相同体重的小鼠测
定中和用病毒悬液的实际LD50。其方法可将中和用病毒悬液作为原倍再稀释
10〈0〉、10〈-1〉、10〈-2〉、10〈-3〉等共4个稀释度，以上4个稀释度各加入
0.5ml于小管内，每管再加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml，同样放置37℃水浴1小
时作为中和病毒对照。将已中和的供试品和标准品的不同稀释度的悬液以及病
毒对照分别接种小鼠，供试品和标准品按从浓到稀的倍数接种小鼠，而病毒对
照则按从稀到浓的倍数接种小鼠。小鼠体重10～12g，每只小鼠脑内接种0.03ml。
每稀释度注射6只小鼠。
每天记录小鼠的发病死亡情况，共观察14天，接种后4天内死亡的小鼠作为
非特异性死亡计。
供试品效价(IU/ml)=(B1/B2)×D
式中 B1为供试品ED50的倒数；
B2为抗血清标准品ED50的倒数；
D为抗血清标准品的国际单位，IU/ml。
页码数,2005版药典附录第64页
附录X Q抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(E玫瑰花环形成抑制试验)
本法系依据抗人T细胞免疫球蛋白与人淋巴细胞E受体结合后，可阻止绵羊
红细胞与淋巴细胞E受体特异性结合，根据其结合抑制率测定供试品抗人T淋巴
细胞免疫球蛋白效价。
试剂 (1)淋巴细胞分离液(Ficoll※s液)
(2)Hank’s液
(3)20％胎牛血清Hank’s液试验当天取适量灭菌的Hank’s液，加入经56℃ 30分钟
灭能及羊红细胞吸收过的胎牛血清，配成20％浓度。用0．5mol／L碳酸氢钠溶
液或稀盐酸调pH至7．2～7．4。
(4)1％羊红细胞悬液 颈静脉采羊血于Alsever※s液中，可保存2周。试验前取适
量羊红细胞用生理氯化钠溶液洗3次，用20％胎牛血清Hank※s液配成1％羊红细胞
悬液。
(5)淋巴细胞悬液取肝素抗凝新鲜人静脉血加等量生理氯化钠溶液混匀后，
缓慢加至等量淋巴细胞分离液液面上，以每分钟2000转离心20分钟，吸出淋巴细
胞层细胞，加适量生理氯化钠溶液清洗，以每分钟1200转离心 10分钟，弃上清
液，沉淀加入适量20％胎牛血清Hank※s液，摇匀，为淋巴细胞原液；用1％醋酸
蓝液将淋巴细胞原液稀释20倍，镜检计数淋巴细胞。根据计数结果，用20％胎
牛血清Hank’s液将淋巴细胞原液稀释成每lml含5×10 6个淋巴细胞，即为淋巴细胞
悬液。
供试品溶液的制备 根据供试品效价，用20％胎牛血清Hank’s液将供试品稀释
至几个适宜浓度。
测定法 取供试品溶液100μl加入淋巴细胞悬液100μl，摇匀，置37℃水浴30分
钟；加入1％羊红细胞悬液100p．1，混匀，室温放置15分钟。每分钟500转离心5
分钟后放冰箱过夜，每稀释度供试品溶液做2管。次日取出各管，加入当天稀释
的0．2％台盼蓝溶液100μl，轻轻摇匀，镜检计数花环形成率(％)。取20％胎牛血
清Hank’s液100μl，加入淋巴细胞悬液100μl，自"摇匀，置37℃水浴30分钟”起，同
法操作，作对照组。计算花环抑制率(％)，以花环抑制率在25％以上的供试品的
最高稀释倍数为花环抑制效价。
页码数,2005版药典附录第64页
附录X R抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(淋巴细胞毒试验)
本法系依据抗人T细胞免疫球蛋白与人淋巴细胞结合，在补体存在下破坏淋
巴细胞，根据淋巴细胞死亡率测定供试品抗人T细胞免疫球蛋白效价。
试剂 (1)淋巴细胞分离液(Ficoll’s)
(2)Hank※s液
(3)20％胎牛血清Hank’s液试验当天取适量经消毒保存的Hank※s液，加入经56℃
30分钟灭能的胎牛血清，配成20％浓度。用O．5mol／L碳酸氢钠溶液或稀盐酸
调pH至7．2～7．4。
(4)淋巴细胞悬液取肝素抗凝新鲜人静脉血加等量生理氯化钠溶液混匀后，
缓慢加至等量淋巴细胞分离液液面上，以每分钟2000转离心20分钟，吸出淋巴细
胞层细胞，加适量生理氯化钠溶液清洗，以每分钟1200转离心10分钟，弃上清
液，沉淀加入适量20％胎牛血清Hank’液，摇匀，为淋巴细胞原液；用1％醋酸蓝
液将淋巴细胞原液稀释20倍，镜检计数淋巴细胞。根据计数结果，用20％胎牛
血清Hank※s液将淋巴细胞原液稀释成每lml含5×10 6个淋巴细胞，即为淋巴细胞悬
液。
(5)补体正常家兔血清。作补体用的兔血清要求对试验用的靶细胞无明显的
毒性，因此家兔血清要预先进行选择，方法如下：取淋巴细胞悬液0．05ml，
加1：5稀释的家兔血清O．05ml，置37℃1小时后，加0．5％台盼蓝盐水溶液
O．05ml，置37℃ 5分钟后镜检计数淋巴细胞，死亡细胞率在10％以下者方可作补
体用。
(6)O．5％台盼蓝生理氯化钠溶液
(7)2．5％戊二醛溶液(用Hank’s液稀释) 供试品溶液的制备 根据供试品效价，
用20％胎牛血清Hank※s液将供试品稀释至几个适宜浓度。
阳性对照溶液的制备将经人T淋巴细胞免疫的猪血浆或兔血清在60℃加热10
分钟后，用生理氯化钠溶液稀释10倍。
阴性对照溶液的制备 将正常猪血浆或兔血清在60℃加热10分钟后，用生理]
氯化钠溶液稀释10倍。
测定法 取供试品溶液O．05ml，加淋巴细胞悬液O．05ml，置37℃ 1小时，加
1：5稀释的家兔血清O．05ml，置37℃ 30分钟后加0．5％台盼蓝生理氯化钠溶液
0．05ml，置37℃，5分钟，立即镜检计数淋巴细胞，计算死亡细胞率，一般数
100个淋巴细胞。取阳性对照溶液O．05ml，加淋巴细胞悬液0．05ml，自置37℃，
1小时起，同法操作，作阳性对照。取阴性对照溶液0．05ml，加淋巴细胞悬液
O．05ml，自“置37℃，1小时起，同法操作，作阴性对照。
结果判定 阳性对照组的死亡淋巴细胞率大于20％，且阴性对照组的死亡淋
巴细胞率小于10％试验成立。以(+)为判定终点，出现(+)供试品的最高稀释度为
该供试品的淋巴细胞毒效价。
【附注】(1)试验组死亡淋巴细胞率
小于10％ (一) 41％～60％ (++)
10％～20％ (±) 61％～80％ (+++)
21％～40％ (+) 不低于81％ (++++)
(2)如供试品较多或来不及看结果时，为避免试验误差，可在抗原、抗体、补
体作用后加0．5％台盼蓝生理氯化钠溶液O．05ml，置37℃ 5分钟后，立即加
2．5％戊二醛溶液0．05ml，留待适当时候镜检；或先加2．5％戊二醛溶液
O．05ml，室温放置10分钟后，加入0．5％台盼蓝生理氯化钠溶液0．05ml，置
37℃，5分钟后留待适当时候镜检。
页码数,2005版药典附录第70页
附录Ⅺ I 抗蛇毒血清效价测定法 (小鼠试验法)
本法系根据抗蛇毒血清能中和蛇毒的作用，将供试品与标准品做系列稀
释，分别与定量蛇毒相混合，注射小鼠后，比较标准品组和供试品组的小鼠死
亡时间和数量，计算出供试品的效价。
试剂稀释液称取氯化钠8．5g、硼酸4．5g、四硼酸钠(Na2 B4 07·10H20)O．5g，用
注射用水溶解并稀释至1000ml，过滤，灭菌后pH值应为7．0～7．2。
抗蛇毒血清标准品溶液的制备将抗蛇毒血清标准品用稀释液稀释至每lml含
5U(抗银环蛇、抗蝮蛇毒血清)、5IU(抗眼镜蛇毒血清)或10U(抗五步蛇毒血清)，即
与5个相应蛇毒试验量混合后每O．4ml注射量分别含相应抗蛇毒血清效价1U或
2U。
蛇毒溶液的制备蛇毒须以国家药品检定机构分发的抗蛇毒血清标准品准确
标定其试验量(蝮蛇、眼镜蛇及银环蛇1个L+，五步蛇2个L+)，将蛇毒稀释至其5
个试验量不高于O．8ml体积。即在与抗蛇毒血清混合后，补加稀释液至2ml时，
每0．4ml注射量中含1个试验量。
供试品溶液的制备 将供试品稀释成数个稀释度，使每lml含抗蝮蛇、抗眼镜
蛇或抗银环蛇毒血清效价约5U,抗五步蛇毒血清效价约10U。各稀释度间隔
5％～10％。
测定法量取不同稀释度供试品溶液各1．0ml、抗蛇毒血清标准品溶液lml作为
对照①、抗蛇毒血清标准品溶液1．2ml作为对照②，将上述抗蛇毒血清分别置
小试管中，每管加入5个试验量与供试品溶液相应的蛇毒溶液，补加稀释液至
2ml(即供试品每0．4ml注射量中含1个试验量或2个试验量)，混合均匀，加塞，置
37℃结合45分钟后立即注射小鼠。
将每个稀释度的供试品溶液、对照①及对照②各注射体重18～20g小鼠4只，
每只腹腔注射0．4ml。
结果判定每日观察1次试验小鼠，观察48～72小时，并记录发病及死亡情况。
对照①小鼠死亡不低于50％，对照②小鼠应比对照①死亡晚、死亡只数少或不
死亡。供试品溶液之效价为与对照①小鼠死亡情况(时间、数量)相同之最高稀
释度。
试验小鼠死亡情况发生倒置或对照不成立，应重试。
【附注】(1)注射动物要做到量准、部位准，同时要防止注射液流出。
(2)使用干燥毒素时，须精密称定，每次称量应不低于5mg，溶解后应在3天内
(保存于2～8℃)用完。干燥毒素应封存于装有干燥剂的真空器皿中。亦可将冻干
蛇毒配成液体蛇毒，即将蛇毒复溶后与中性甘油(116℃ 10分钟灭菌)等量混合。
每lml至少含50个试验于2～8℃避光处。
页码数,2005版药典附录第45页
附录IXA 抗生素残留量检查法
本法系依据在琼脂培养基内抗生素对微生物的抑制作用，比较对照品与供
试品对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，检查供试品中氨苄西林或四环素残
留量。
磷酸盐缓冲液(pH 6．0)的制备 称取磷酸二氢钾8．Og、磷酸氢二钾2．Og，
加水溶解，使成1000ml，经121℃灭菌30分钟。
抗生素Ⅱ号培养基的制备称取胨6g、牛肉提取粉1．5g、酵母浸出粉6g，加
入适量水溶解后，加入琼脂13～14g，加热使之溶胀，滤过除去不溶物，加入葡
萄糖1g，溶解后加水至1000ml，调节pH值使灭菌后为6．5～6．6；分装于玻璃管
或锥形瓶中，经115℃灭菌30分钟，4℃保存。
对照品溶液的制备 取氨苄西林对照品适量，用0．01mol／L盐酸溶解并稀释
成每lml中含氨苄西林10mg的溶液，精密量取适量，用磷酸盐缓冲液稀释成每10ml
中含1．0／lg的溶液。
取四环素对照品适量，用生理氯化钠溶液溶解并稀释成每lml中含O．125μg的
溶液。
菌悬液的制备 (1)金黄色葡萄球菌(Staphylo—COCCUS aureus)悬液用于检测氨苄
西林。取金黄色葡萄球菌(CMCC 26003)营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜
面上，35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或O．9％无菌氯化钠溶液将
菌苔洗下，备用。
(2)藤黄微球菌(Micrococcus luteus)悬液用于检测四环素。取藤黄微球菌
[CMCC(B)28001]营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，置于26～27℃培
养24小时。临用时，用0．9％无菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
检查法取直径8cm或10cm的培养皿，注入融化的抗生素Ⅱ号培养基15～20ml，
使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。取抗生素Ⅱ号培养基
10～15ml置于1支50~C水浴预热的试管中，加入O．5％～1．5％(ml／m1)的菌悬液
300μl混匀，取适量注入已铺制底层的培养皿中，放置水平台上，冷却后，在每
个培养皿上等距离均匀放置钢管(内径6～8mm、壁厚1～2mm、管高10～15mm的不
锈钢管，表面应光滑平整)，于钢管中依次滴加供试品溶液、阴性对照液(磷酸
盐缓冲液)及对照品溶液。培养皿置37℃培养18～22小时。
结果判定对照品溶液有抑菌圈，阴性对照液无抑菌圈。供试品溶液抑菌圈
的直径小于对照品溶液抑菌圈的直径时判为阴性；否则判为阳性。
【附注】 本试验应在无菌条件下进行，使用的玻璃仪器，钢管等应无菌。
书页号：2005版药典三部附录9页
附录I J颗粒剂
颗粒剂 系指以生物制品原液经干燥后制成的干粉为原料药物，与适宜的辅
料混合制成具有一定粒度的干燥颗粒状制剂；原料药物可由一种或多种活性
成分组成。颗粒剂可分为可溶颗粒(通称为颗粒)、混悬颗粒、肠溶颗粒等。供
口服用。
混悬颗粒系指难溶性原料药物与适宜的辅料混合后制成一定粒度的干燥颗
粒剂。临用前加水或其他适宜的液体，振摇即可分散成混悬液，供口服。
除另有规定外，混悬颗粒应进行溶出度检查。
肠溶颗粒系指采用肠溶材料包裹颗粒或其他适宜方法制成的颗粒剂。
肠溶颗粒耐胃酸而在肠液中释放活性成分，可防止药物在胃内分解失效，
避免对胃的刺激或控制药物在肠道内定位释放。
除另有规定外，肠溶颗粒应进行释放度检查。
颗粒剂在生产与贮藏期间均应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产及质量控制应符合相关品种
要求。
二、原料药物与辅料应均匀混合；凡属挥发性药物或遇热不稳定的药物在
制备过程应注意控制温度，凡遇光不稳定的药物应避光操作。
三、颗粒剂应干燥，粒径应均一，色泽一致，无吸潮、软化、结块、潮解
等现象。
四、如有必要，颗粒剂制备时，叮加入适宜的矫味剂、芳香剂、着色剂、
分散剂和防腐剂等添加剂。
五、除另有规定外，颗粒剂应置2～8℃避光干燥处密封贮存和运输。
颗粒剂应进行以下相应检查。
【粒度】 除另有规定外，照粒度测定法(附录V G)
检查，不能通过一号筛(2000μm)与能通过五号筛(180μm)的总和不得超过供试量
的15％。
【干燥失重】 除另有规定外，照十燥失重测定法(附录ⅦL)测定，于105℃干
燥至恒重，含糖颗粒在80℃减压十燥，减失重量不得过2．0％。
【溶化性】 除另有规定外，可溶颗粒照下述方法检查，应符合规定。
取供试品lOg，加热水200ml，搅拌10分钟，可溶颗粒应全部溶化或轻微浑
浊，但不得有异物。
混悬颗粒或已规定检查溶出度或释放度的颗粒剂，可不进行溶化性检查。
【装量差异】 单剂量包装的颗粒剂的装量差异限度，应符合规定。
检查法取供试品10包(瓶)，除去包装，分别精密称定每包(瓶)内容物的重
量，求出每包(瓶)内容物的装量与平均装量。每包(瓶)装量应与平均装量相比较
[凡无含量测定的颗粒剂，每包(瓶)装量应与标示装量比较]，超出装量差异限
度的不得多于2包(瓶)，并不得有1包(瓶)超出装量差异限度l倍。
凡规定检查含量均匀度的颗粒剂，可不进行装量差异的检查。
【装量】 多剂量包装的颗粒剂，照最低装量检查法(附录V F)检查，应符合
规定。
【微生物限度】 除另有规定外，照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符
合规定。
凡规定进行杂菌检查的颗粒剂，可不进行微生物限度检查。
页码数,2005版药典附录第24页
附录V B可见异物检查法
(灯检法)
可见异物是指存在于注射剂中，在规定条件下目视可以观测到的任何不溶
性物质。
实验室检测时应避免引入可见异物。当复溶冻干制剂时，或盛装供试品的容
器(如不透明、不规则形状容器等)不适于检测，需转移至洁净透明的适宜容器
中时，均应在100级洁净环境(如层流净化台)中进行。
检查装置如下图所示，图略。
图中A为带有遮光板的日光灯光源。光照度可在1000～3000 1x范围内调节。用
于无色溶液检查，光照度应为1000～1500 1x；用于透明塑料容器或有色溶液检
查，光照度应为2000～3000 lx。B为不反光的黑色背景。C为不反光的白色背景和
底部(供检查有色异物)。D为反光的白色背景(指遮光板内侧)。
检查人员条件远距离和近距离视力测验，均为4·9或4．9以上(矫正后视力应
为5．0或5．O以上)；应无色盲。
检查法除另有规定外，取供试品，除去容器标签，擦净安瓿(瓶)外壁污痕，
放室温静置一定时间(人血白蛋白和人免疫球蛋白类制品一般放置过夜)，在避
光室内或暗处，手持瓶颈部于伞棚边缘处，在明视距离(指供试品至人眼的距
离，通常为25cm)，分别在黑色和白色背景下，轻轻旋转和翻转容器使药液中可
能存在的可见异物悬浮(注意不使药液产生气泡)，用目检视，检查时限为20秒。
供试品装量每支(瓶)在10ml以下的每次检查拿取2支(瓶)；10ml以上的每次检查拿
取1瓶(支)。50ml或50ml以上注射液按直、横、倒三步法旋转检视。
(1)注射液除另有规定外，取供试品20支(瓶)，照上述方法检查，检出可见异
物的应不得超过1支(瓶)。如检出可见异物的有2支(瓶)，应另取20支(瓶)同法复
试，均不得检出。初试和复试均不得检出玻璃屑、纤维、色点、色块及其他外
来异物。
(2)注射用冻干制剂除另有规定外，取供试品5支(瓶)。将供试品和溶解液的温
度平衡至各品种规定的溶解温度，再沿瓶壁缓缓注入溶解液，旋转轻摇溶解。
有真空的供试品，待供试品即将全部溶解时，破其真空，照上述方法检查；
无真空度的供试品，待供试品全部溶解后照上述方法检查，应不得检出可见异
物。如检出可见异物的有1支(瓶)，应另取5支(瓶)同法复试，均不得检出。初试
和复试均不得检出玻璃屑、纤维、色点、色块及其他外来异物。
【附注】 (1)检查时发现瓶盖松动或有微量沉积物的供试品需做无菌检查。
(2)冻干制剂需按各品种规定的温度及方式复溶。
页码数,2005版药典附录第50页
附录ⅨI类A血型物质测定法
(血凝抑制法)
本法系用标准类A血型物质和供试品分别与抗A血型血清反应，通过比较血
凝反应终点，测定供试品中类A血型物质含量。
1％A型人红细胞悬液6人份A型血等量混合，加适量生理氯化钠溶液混匀，以
每分钟2000转离心10分钟，倾去上清液，用生理氯化钠溶液洗3次，吸取沉积红细
胞lml，加生理氯化钠溶液99ml，混匀，制成1％红细胞悬液。
标准类A血型物质溶液的制备 由国家药品检定机构分发或经其认可。将标准
品制成每lml中含lmg的标准溶液。取1组10支直径9mm的试管，将标准溶液用生理
氯化钠溶液进行2倍系列稀释，体积为O．1ml，由1／100稀释度(每lml含0．01mg)开
始。
供试品溶液的制备取1组10支直径9mm的试管，将供试品用生理氯化钠溶液进
行2倍系列稀释，体积为O．1ml，由原倍供试品开始。
抗A血型血清试验剂量的测定取1组10支直径9mm的试管，将抗A血型血清用生
理氯化钠溶液进行2倍系列稀释，体积为0．1ml，由1／2稀释度开始，加1％A型
人红细胞悬液0．1ml。同时取生理氯化钠溶液0．1ml与1％A型人红细胞O．1ml作
为阴性对照。摇匀，室温放置15分钟，以每分钟1500转离心1分钟，按细胞沉降
压缩情况观察凝集程度。以呈现完全凝集(++++)的抗A血型血清的最高稀释度为
1个抗体试验剂量。
测定法在每稀释度供试品及标准类A血型物质溶液中分别加含2个抗体试验剂
量的抗A血型血清0．1ml。摇匀，36．5～37．5℃放置10分钟，再于上述各管中分
别加入1％A型人红细胞悬液O．1ml，摇匀，36．5～37．5℃放置15分钟，以每分
钟1500转离心1分钟，按红细胞沉降压缩情况观察凝集程度。
结果判定供试品呈现完全血凝抑制(终点)的最高稀释倍数乘以对照组呈现相
似血凝抑制的最高倍稀释管的血型物质含量，即为每lml供试品所含类A血型物质
的质量(mg)。
页码数,2005版药典附录第67页
附录ⅪD类毒素絮状单位测定法
本法系根据类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度、反应时间等
条件下，可在试管中发生抗原抗体结合，产生肉眼可见的絮状凝集反应。根据
抗毒素絮状反应标准品可测定供试品的絮状单位(Lf)值。
试剂硼酸盐缓冲液称取四硼酸钠(Na2B407·10H20)O．5g、硼酸4．5g、氯化钠
8．5g，加水1000ml，使之完全溶解。pH值为7．0～7．2。
标准品溶液的制备精密量取白喉或破伤风抗毒素絮状反应国家标准品，用
硼酸盐缓冲液准确稀释至每lml含100Lf的溶液。
供试品溶液的制备取供试品适量，加硼酸盐缓冲液稀释至适宜絮状单位。
测定法精密量取每lml含100Lf的抗毒素絮状反应标准品溶液0．3ml、0．4ml、
0．5ml、0．6ml、0．7ml，分别加入絮状反应管，精密量取供试品溶液lml快速准
确加入上述各反应管内，摇匀，置45℃水浴中，连续观察，并记录絮状出现次
序和时间。再取5支反应管，重复上述试验，将最先出现絮状之管放中间，前
后各加两管不同量标准抗毒素絮状反应标准品溶液，每管间隔O．05ml，再向
各管中加入供试品lml，观察絮状出现情况。根据结果，再重复试验一次，将最
先出现管放中间，前后各加两管不同量抗毒素絮状反应标准品溶液，每管间
隔O．02ml，同上法观察并记录结果，以2～3次相同值为最终测定值。
按下式计算
供试品絮状单位(Lf／m1)=E* F*100
式中E为最先出现絮状时使用的每lml含100Lf的抗毒素絮状反应标准品溶液的体
积，ml；
F为供试品稀释倍数。
页码数,2005版药典附录第27页
附录V G粒度测定法
本法用于测定原料药和药物制剂的粒子大小或粒度分布。其中第一法、第
二法用于测定药物制剂的粒子大小或限度，第三法用于测定原料药或药物制剂
的粒度分布。
第一法(显微镜法)
本法中的粒度，系以显微镜下观察到的长度表示。目镜测微尺的标定用以
确定使用同一显微镜及特定倍数的物镜、目镜和镜筒长度时，目镜测微尺上
每一格所代表的长度。
将镜台测微尺置于显微镜台上，对光调焦，并移动测微尺于视野中央；取
下目镜，旋下接目镜的目镜盖，将目镜测微尺放入目镜筒中部的光栏上(正面
向上)，旋上目镜盖后返置镜筒上。此时在视野中可同时观察到镜台测微尺的
像及目镜测微尺的分度小格，移动镜台测微尺和旋转目镜，使两种量尺的刻
度平行，并令左边的0刻度重合；寻找第二条重合刻度，记录两条刻度的读数；
并根据比值计算出目镜测微尺每小格在该物镜条件下所相当的长度(μm)。由
于镜台测微尺每格相当于lOμm，故目镜测微尺每1小格的长度为：
10*相重区间镜台测微尺的格数 /相重区间目镜测微尺的格数
当测定时要使用不同的放大倍数时，应分别标定。
测定法 取供试品，用力摇匀，黏度较大者可按品种项下的规定加适量甘油
溶液(1→2)稀释，照该剂型或品种项下的规定，量取供试品，置载玻片上，覆
以盖玻片，轻压使颗粒分布均匀，注意防止气泡混入，半固体可直接涂在载
玻片上，立即在50～100倍显微镜下检视盖玻片全附录V H渗透压摩尔浓度测定
法部视野，应无凝聚现象，并不得检出该剂型或品种项下规定的50μm及以上
的粒子。再在200～500倍的显微镜下检视该剂型或品种项下规定的视野内的总
粒数及规定大小的粒数，并计算其所占比例(％)。
第二法(筛分法)
1．单筛分法
称取各品种项下规定的供试品，置规定号的药筛内，筛上加盖并在筛下配
有密合的接收容器。按水平方向旋转振摇至少3分钟，并不时在垂直方向轻叩
筛。取筛下的颗粒及粉末，称定重量，计算其所占比例(％)。
2．双筛分法
取单剂量包装的5包(瓶)或多剂量包装的1包(瓶)，称定重量，置该剂型或品种
规定的药筛中，保持水平状态过筛，左右往返，边筛动边拍打3分钟。取不能
通过小号筛和能通过大号筛的颗粒及粉末，称定重量，计算其所占比例(％)。
页码数,2005版药典附录第36页
附录VII A 磷测定法
本法系将有机磷转变为无机磷后进行磷含量测定。磷酸根在酸性溶液中与
钼酸铵生成磷钼酸铵，遇还原剂即生成蓝色物质(三氧化钼和五氧化钼的混合
物)，称之为"钼蓝"，用比色法测定供试品中磷含量。
测定法精密量取供试品适量(约含磷4～20μg)置附录ⅦC硫酸铵测定法试管
中，加4滴硫酸(约O．08m1)加热至炭化，再加2滴高氯酸(约O．06m1)消化至无色
澄清，消化完全后稍置片刻，立即加水2ml，加O．04mol／L钼酸铵溶液(称取
钼酸铵5g，加水溶解并稀释至lOOml)O．4ml，混匀；加-还原剂(称取亚硫酸氢钠
6g、亚硫酸钠1．2g、1-氨基-2-萘酚4-磺酸0．1g，置棕色瓶中，加水至50ml，一周
内使用)0．2ml，混匀；加水至6ml，15～20分钟后，照紫外-可见分光光度法(附录
ⅡA)，在波长820nm处测定吸光度。
精密量取标准磷溶液(精密称取干燥至恒重的磷酸二氢钾439．3mg，置l00ml量
瓶中，加水溶解并稀释至刻度；再精密量取2ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻
度，即得每lml含磷20μg的标准磷溶液)O．2ml、O．4ml、O．6ml、O．8ml、1．Oml，
分别置试管中，各补加水至lml，自“加4滴硫酸”起，同法操作，测定各管的吸光
度。
以标准磷溶液的系列浓度对吸光度作直线回归，然后将供试品溶液的吸光度
代入直线回归方程，求出其相应体积(ml)。
磷含量(μg／m1)=V*CR／vx
式中 v为供试品溶液吸光度相对于标准磷溶液的体积，ml；
cR为标准磷溶液的浓度，μg／ml,
Vx为供试品的体积，m1。
【附注】 (1)加高氯酸消化时，必要时可加1～2滴30％过氧化氢，但最后必须将
过氧化氢除尽。
(2)加高氯酸消化后，如在冷却后加水，须再加热。
(3)测定A群脑膜炎球菌多糖疫苗成品磷含量时，至少取3支安瓿溶解后混合
备用。
页码数,2005版药典附录第33页
附录ⅥJ磷酸三T酯残留量测定法
本法系用气相色谱法测定供试品中磷酸三丁酯残留量。
照气相色谱法(附录ⅢC)测定。
色谱条件与系统适用性试验 用酸改性聚乙二醇(20M)毛细管柱，柱温140℃，
气化室温度190℃，火焰离子化检测器或氮磷检测器，检测器温度210℃，载气
(氮气)流速为每分钟60ml，或根据仪器选择检测条件。理论板数按磷酸三丁酯峰
计算应不低于5000，磷酸三丁酯峰与磷酸三丙酯峰的分离度应不小于1．5，磷
酸三丁酯对照品溶液连续进样5次，所得磷酸三丁酯峰与磷酸三丙酯峰面积之
比的相对标准偏差(RSD)应不大于5％。
内标溶液的制备取磷酸三丙酯适量，用正己烷溶解并定量稀释制成每lml中约
含400μg的溶液。
测定法精密量取供试品3ml，置具塞玻璃离心管中，精密加内标溶液50μl与
1．5mol／L高氯酸溶液O．75ml，振荡1分钟，置37℃水浴保温10分钟后，再加
正己烷4ml，振荡2分钟，以每分钟2000转离心20分钟。小心吸取上层正己烷，用
空气流将其浓缩至约o．2ml(不能加热)，取0．1μ1注入气相色谱仪。另取磷酸三
丁酯对照品适量，精密称定，加正己烷溶解并定量稀释制成每lml中约含600μg的
溶液；精密量取该溶液10μ1、20μ1、40μ1、60μ1、80μl，分别置已精密加水3ml的具
塞玻璃离心管中，再向各对照品管精密加内标溶液50μ1，自“振荡1分钟”起，同
法操作。以各磷酸三丁酯对照品峰面积与内标峰面积比，对磷酸三丁酯对照
品溶液浓度作直线回归，求得回归方程。计算出供试品中磷酸三丁酯含
量(μg／m1)。
【附注】 (1)对照品溶液与供试品溶液的溶剂挥发的速度应尽量保持一致；
若离心后，乳化仍未完全破除，可在振荡器上稍微振摇一下，再离心一次。
(2)直线回归相关系数应不低于O．99。
页码数,2005版药典附录第37页
附录ⅦB硫柳汞测定法
本法系依据汞有机化合物经强酸消化成无机汞离子，与双硫腙溶液形成橙
黄色化合物，根据双硫腙滴定液的消耗量，可计算出供试品中硫柳汞含量。
试剂 (1)双硫腙滴定液 精密称取双硫腙50mg，置lOOml量瓶中，加三氯甲烷溶
解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。
临用前，精密量取贮备液2．5ml，置100ml量瓶中，加四氯化碳稀释至刻度，
摇匀，即得双硫腙滴定液，保存于冷暗处。
(2)标准汞溶液取置硫酸干燥器中干燥至恒重的氯化高汞约O．135g，精密称
定，置lOOml量瓶中，加0．5mol／L硫酸溶解并稀释至刻度，摇匀，即为标准汞
贮备液。
临用前，精密量取标准汞贮备液适量，置lOOml量瓶中，加0．5mol／L硫酸溶
液稀释至刻度，摇匀，即为每Iml相当于50μg Hg的标准汞溶液。
测定法 (1)消化精密量取供试品适量(约相当于含汞量50μg)，置150ml圆底磨口
烧瓶(附长40cm回流管)中，加硫酸2ml，8．Omol／L硝酸溶液O．5ml混匀后，置电
炉上加热回流15分钟(或置于3cmX 24cm试管中，加盖置85～90℃水浴加热1小时)，
冷却后加水40ml，加20％盐酸羟胺溶液5ml。
(2)滴定用水40ml将上述消化后溶液分数次冲洗入125m1分液漏斗中，用双硫腙
滴定液滴定，开始时每次可加入2ml左右，以后逐渐减少至每次O．5ml，最后还
可少至O．2ml。每次加入滴定液后，振摇10秒钟，静置分层，弃去四氯化碳层，
继续滴定，直至双硫腙液的绿色不变，即为终点。
(3)双硫腙滴定液的标化 精密量取标准汞溶液1ml，置125m1分液漏斗中，加硫
酸2ml，加水80ml和20％盐酸羟胺溶液5ml，自“用双硫腙滴定液滴定”起，同法操
作。
按下式计算
硫柳汞含量(％)=V1*O．05*2．02*100/V2*V3*1000
式中V1为供试品消耗双硫腙滴定液的体积，ml；
V2为标准汞溶液消耗双硫腙滴定液的体积，ml；
V3为供试品的体积，ml；
O．050为标准汞溶液的浓度，mg／ml；
2．02为常数(1g汞相当于2．02g硫柳汞)。
【附注】 (1)抗毒素及免疫球蛋白供试品用水浴消化法滴定时会出现少量絮
状物，但不影响结果。
(2)可做限度测定。
页码数,2005版药典附录第37页
附录ⅦC硫酸铵测定法
本法系依据硫酸铵被氢氧化钠分解释放出氨，并被硼酸吸收生成硼酸铵，
用酸滴定液滴定。根据酸滴定液的消耗量可计算出供试品中硫酸铵含量。
供试品溶液的制备除蛋白质方法同蛋白质含量测定
(附录ⅥB第一法)。
测定法精密量取除蛋白质滤液lOml，置凯氏蒸馏器内，加4％氢氧化钠溶液
lml，加少量水，照氮测定法(附录ⅥA)进行蒸馏、滴定。并将滴定的结果用空
白试验校正。
按下式计算
硫酸铵含量(％)=(Vl-Vo)*C*14．01*4．715*2×100/1000
式中v1为供试品消耗硫酸滴定液的体积，ml,
V0为空白对照消耗硫酸滴定液的体积，ml；
c为硫酸滴定液的浓度，mol／L；
页码数,2005版药典附录第39页
附录ⅦG氯化钠测定法
本法系用硝酸破坏供试品中的蛋白质后，再加入过量的硝酸银，使供试品
中的氯离子与硝酸银完全反应，生成氯化银沉淀析出，过量的硝酸银用硫氰
酸铵滴定液滴定，根据硫氰酸铵滴定液消耗的量，可计算出供试品中氯化钠
的含量。
测定法精密量取供试品1．0ml，精密加入O·lmol／L硝酸银溶液(称取硝酸银
17．0g，加水溶解并稀释成1000m1)5ml(若蛋白质含量较高者，加2ml饱和高锰酸
钾溶液)，混匀，加8．0mol／L硝酸溶液10ml，加热消化至溶液澄清，冷却，加水
50ml，8％硫酸铁铵指示液lml，用硫氰酸铵滴定液(0．05mol／L)滴定至溶液呈淡棕
红色，振摇后仍不退色，即为终点。并将滴定的结果用空白试验(可不消化)校
正。
按下式计算
氯化钠含量(g／L)=(V0一Vx)×c×58·45
式中 V0为空白试验消耗硫氰酸铵滴定液的体积，ml；
Vx为供试品消耗硫氰酸铵滴定液的体积，ml；
c为硫氰酸铵滴定液浓度，mol／L；
58．45为氯化钠的相对分子质量。
【附注】 (1)硫氰酸铵滴定液(0．1mol／L)的制备及滴定取硫氰酸铵8．0g，加
水溶解并稀释成1000ml，摇匀。精密量取硝酸银滴定液(O．1mol／L)25ml，加水
50ml、硝酸2ml与8％硫酸铁铵指示液2ml，用本液滴定至溶液微显淡棕红色；经
剧烈振摇后仍不退色，即为终点。根据本液的消耗量算出本液的浓度。
(2)硫氰酸铵滴定液(O．05mol／L)制备 精密量取硫氰酸铵滴定液(O．1mol／L)
100ml，加水准确稀释至200ml，摇匀。
页码数,2005版药典附录第43页
附录ⅧD免疫电泳法
本法系将供试品通过电泳分离成区带的各抗原，然后与相应的抗体进行双
相免疫扩散，当两者比例合适时形成可见的沉淀弧。将沉淀弧与已知标准抗
原、抗体生成的沉淀弧的位置和形状进行比较，即可分析供试品中成分及其
性质。
试剂 (1)巴比妥缓冲液(pH8．6) 取巴比妥4．14g与巴比妥钠23．18g，加适量
水，加热使溶解，冷却至室温，再加叠氮钠0．15g，加水使溶解成1500ml。
(2)O．5％氨基黑染液取氨基黑10B 0．5 g，加甲醇50ml、冰醋酸10ml与水40 ml的
混合液，溶解。
(3)1．5％琼脂糖溶液 取琼脂糖1．5g，加水50ml与巴比妥缓冲液50ml，加热使
溶胀完全。
(4)脱色液量取乙醇45ml、冰醋酸5ml与水50ml混合均匀。
(5)溴酚蓝指示液 取溴酚蓝50mg，加水使溶解成100ml。
对照品正常人血清或其他适宜的对照品。
供试品溶液的制备用生理氯化钠溶液将供试品蛋白质浓度稀释成0．5％。
检查法将1．5％琼脂糖溶液倾倒于大小适宜的水平玻板上，厚度约3mm，静
置，待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层后，于琼脂板负极1／3处的上下各打一
孔，孔径3mm，孔距10～15mm。测定孔加供试品溶液10μl和溴酚蓝指示液1滴，对
照孔加正常人血清10μl和溴酚蓝指示液1滴。用3层滤纸搭桥和巴比妥缓冲液(电
泳缓冲液)接触，100V恒压电泳约2小时(指示剂迁移到前沿)。电泳结束后，在两
孔之间距离两端约3～5mm处挖宽3mm槽，向槽中加入血清抗体，槽满但不溢出。
放湿盒中37℃扩散24小时。扩散完毕后，用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂板，
以除去未结合蛋白质。将浸泡好的琼脂板放入0．5％氨基黑溶液染色，再用脱
色液脱色至背景基本无色。用适当方法保存或复制图谱。与对照品比较，供试
品的主要沉淀线应为待测蛋白质。
注意事项 (1)电泳时应有冷却系统，否则琼脂糖会出现干裂。
(2)用生理氯化钠溶液浸泡应充分，否则背景不清晰。
页码数,2005版药典附录第43页
附录ⅧC免疫双扩散法
本法系在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别加入抗原
与抗体，若抗原、抗体互相对应，浓度、比例适当，则一定时间后，在抗原
与抗体孔之间形成免疫复合物的沉淀线，以此对供试品的特异性进行检查。
供试品溶液的制备用生理氯化钠溶液将供试品的蛋白质浓度稀释至适当浓
度。
试剂 (1)O．5％氨基黑染色剂 取氨基黑10B0．5g，加甲醇50ml、冰醋酸10ml与
水40ml的混合液，溶解，即得。
(2)脱色液量取乙醇45 ml、冰醋酸5 ml与水50ml混合均匀，即得。
检查法将完全溶胀的1．5％琼脂糖溶液倾倒于水平玻板上(每平方厘米加
0．19ml琼脂糖)，凝固后，按下图打孔，直径3mm，孔距3mm(方阵型)。根据需要
确定方阵型图数量。中央孔加入抗血清，周边孔加入供试品溶液，并留1孔加
入相应阳性对照血清。每孔加样20μ1。然后置水平湿盒中，37℃水平扩散24小
时。用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂板，以除去未结合蛋白质。将浸泡好的
琼脂板放入O．5％氨基黑溶液中染色。用脱色液脱色至背景无色，沉淀线呈清
晰蓝色为止。用适当方法保存或复制图谱。
O
O O O
O
图方阵型
结果判定各阳性对照出现相应的沉淀线则试验成立，供试品与人血清(血浆)
抗体之间应出现相应沉淀线，表示两者为同源性。
页码数,2005版药典附录第42页
附录ⅧA免疫印迹法
本法系以供试品与特异性抗体结合后，抗体与酶标抗体特异性结合，通过
酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。
试剂 (1)TG缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷15．12g与甘氨酸72g，加水溶解并稀
释至500ml。4℃保存。
(2)EBM缓冲液取TG缓冲液20ml与甲醇40ml，加水稀释至200ml。4℃保存。
(3)TTBS缓冲液取三羟甲基氨基甲烷6．05g与氯化钠4．5g，取聚山梨酯80
0．55ml，加适量水溶解，用盐酸调pH至7．5，加水稀释至500ml。4℃保存。
(4)底物缓冲液 取3，3’一二氨基联苯胺盐酸盐15mg，加甲醇5ml与30％过氧化
氢15μl，加TTBS缓冲液25ml使溶解，即得。临用现配。
检查法 照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(附录ⅣC)，供试品与阳性对照品上样
量应大于100ng。取出凝胶，切去凝胶边缘，浸于EBM缓冲液中30分钟。另取与
凝胶同样大小的厚滤纸6张、硝酸纤维素膜1张，用EBM缓冲液浸透。用半干胶
转移仪进行转移：在电极板上依次放上湿滤纸3张、硝酸纤维素膜1张、电泳凝
胶、湿滤纸3张，盖上电极板，按O．8mA／cm2硝酸纤维素膜恒电流转移45分钟。
取出硝酸纤维素膜浸入封闭液(10％小牛血清的TT—KS缓冲液，或其他适宜
封闭液)封闭60分钟。弃去液体。加入TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的供试品
抗体(参考抗体使用说明书的稀释度稀释)，室温过夜。硝酸纤维素膜用TTBS缓
冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟。弃去液体，再加入TTBS缓
冲液10ml，摇动加入适量的生物素标记的第二抗体，室温放置40分钟。硝酸纤维
素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟。弃去液体，
更换TTBS缓冲液10ml，摇动，加入适量的亲和素溶液和生物素标记的辣根过氧
化物酶溶液，室温放置60分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS
缓冲液浸洗4次，每次8分钟。弃去液体，加入适量底物缓冲液，置于室温避光
条件下显色，显色程度适当时水洗终止反应。
结果判定 阳性结果应呈现明显色带。阴性结果不显色。
书页号：2005版药典三部附录97页
附录ⅩⅤ 灭菌法
灭菌法系指用适当的物理或化学手段将物品中活的微生物杀灭或除去的方
法。本法适用于制剂、原料、辅料及医疗器械等物品的灭菌。
无菌物品是指物品中不含任何活的微生物。对于任何一批灭菌产品来说，
绝对无菌既无法保证也无法用试验来证实。实际生产过程中，灭菌是指将物品
中污染的微生物残存概率下降至一定水平，以无菌保证水平SAL(sterility assurance
level)表示。最终灭菌的产品微生物存活概率不得高于10〈-6〉。已灭菌产品达到
的无菌保证水平可通过验证确定。
灭菌产品的无菌保证不能依赖于最终产品的无菌检验，而是取决于生产过
程中采用合格的灭菌工艺、严格的GMP管理和良好的无菌保证体系。灭菌工艺的
确定应综合考虑被灭菌物品的性质、灭菌方法的有效性和经济性、灭菌后物品
的完整性等因素。
灭菌程序的验证是无菌保证的必要条件。灭菌程序经验证后，方可交付正
式使用。验证内容包括：
(1) 撰写验证方案及制定评估标准。
(2) 确认灭菌设备技术资料齐全、安装正确，并能处于正常运行(安装确认)。
(3) 确认关键控制设备和仪表能在规定的参数范围内正常运行(运行确认)。
(4) 采用被灭菌物品或模拟物品进行重复试验，确认灭菌效果符合规定(性能
确认)。
(5) 汇总并完善各种文件和记录，撰写验证报告。
日常生产中，应对灭菌程序的运行情况进行监控，确认关键参数(如温度、
压力、时间、湿度、灭菌气体浓度及吸收的辐照剂量等)均在验证确定的范围
内。灭菌程序应定期进行再验证。当灭菌设备或程序发生变更(包括灭菌物品装
载方式和数量的改变)时，应进行再验证。
产品的无菌保证与灭菌前产品被污染的程度及污染菌的特性相关。因此，
应严格监控被灭菌品灭菌前的微生物污染水平及污染菌的耐受性，并在生产的
各个环节采取各种措施降低污染，确保微生物污染控制在规定的限度内。
灭菌冷却阶段，应采取措施，防止已灭菌物品被再次污染。任何情况下，
都应要求容器及其密封系统确保产品在有效期内符合无菌要求。
灭菌方法
常用的灭菌方法有湿热灭菌法、干热灭菌法、辐射灭菌法、气体灭菌法和
过滤除菌法。可根据被灭菌物品的特性采用一种或多种方法组合灭菌。只要产
品允许，应尽可能选用最终灭菌法灭菌。若产品不适合采用最终灭菌法，可选
用过滤除菌法或无菌生产工艺达到无菌保证要求，只要可能，应对非最终灭菌
的产品作补充性灭菌处理(如流通蒸汽灭菌)。
一、湿热灭菌法
本法系指将物品置于灭菌柜内利用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微
生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。该法灭菌能力强，
为热力灭菌中最有效、应用最广泛的灭菌方法。药品、容器、培养基、无菌衣、
胶塞以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损坏的物品，均可采用本法灭菌。流
通蒸汽不能完全杀灭细菌孢子，一般可作为不耐热无菌产品的辅助灭菌手段。
湿热灭菌条件通常采用121℃×15min、121℃×30min或116℃×40min的程序，也可采
用其他温度和时间参数，但必须保证物品灭菌后的SAL≤10〈-6〉。对热稳定的物
品，可采用过度杀灭法，其SAL应≤10〈-12〉。热稳定性较差产品的标准灭菌时间
F〈〔0〕〉[指灭菌温度为121.1℃，生物指示菌的耐热参数D值为1分，灭菌温度系
数z值为10.0℃时的标准灭菌时间(121.1℃下计算的微生物等效灭活率)]一般不低于
8min。如产品的热稳定性很差时，可允许湿热灭菌的F〈〔0〕〉低于8，此情况
下，应在生产全过程中，对产品中污染的微生物严加监控，并采取各种措施降
低微生物污染水平，确保被灭菌产品达到无菌保证要求。
采用湿热灭菌时，被灭菌物品应有适当的装载方式，不能排列过密，以保
证灭菌的有效性和均一性。
湿热灭菌法应确认灭菌柜在不同装载时可能存在的冷点。当用生物指示剂
进一步确认灭菌效果时，应将其置于冷点处。本法常用的生物指示剂为嗜热脂
肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus)。
二、干热灭菌法
本法系指将物品置于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中，利用干热空气达
到杀灭微生物或消除热原物质的方法。适用于耐高温但不宜用湿热灭菌法灭菌
的物品灭菌，如玻璃器具、金属材质容器、纤维制品、固体试药、液状石蜡等
均可采用本法灭菌。
干热灭菌条件一般为160～170℃×120min以上、170～180℃×60min以上或250℃×
45min以上，也可采用其他温度和时间参数。应保证物品灭菌后的SAL≤10〈-6〉。
干热过度杀灭后物品的SAL应≤10〈-12〉，此时物品一般无需进行灭菌前污染微生
物的测定。250℃×45min的干热灭菌也可除去无菌产品包装容器及有关生产灌装用
具中的热原物质。
采用干热灭菌时，被灭菌物品应有适当的装载方式，不能排列过密，以保
证灭菌的有效性和均一性。
干热灭菌法应确认灭菌柜中的温度分布符合设定的标准及确定最冷点位置
等。常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus Subtilis)。细菌内毒素
灭活验证试验是证明除热原过程有效性的试验。一般将不小于1000单位的细菌内
毒素加入待去热原的物品中，证明该去热原工艺能使内毒素至少下降3个对数单
位。细菌内毒素灭活验证试验所用的细菌内毒素一般为大肠埃希菌内毒素
(Escherichia coli endoxin)。
三、辐射灭菌法
本法系指将灭菌物品置于适宜放射源辐射的γ射线或适宜的电子加速器发生
的电子束中进行电离辐射而达到杀灭微生物的方法。本法最常用的为〈60〉Co-γ
射线辐射灭菌。医疗器械、容器、生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成
品等均可用本法灭菌。
采用辐射灭菌法灭菌后的产品其SAL应≤10〈-6〉。γ射线辐射灭菌所控制的参
数主要是辐射剂量(指灭菌物品的吸收剂量)。该剂量的制定应考虑灭菌物品的适
应性及可能污染的微生物最大数量及最强抗辐射力，事先应验证所使用的剂量
不影响被灭菌物品的安全性、有效性及稳定性。常用的辐射灭菌吸收剂量为
25kGy。对最终产品、原料药、某些医疗器材应尽可能采用低辐射剂量灭菌。灭
菌前，应对被灭菌物品微生物污染的数量和抗辐射强度进行测定，以评价灭菌
过程赋予该灭菌物品的无菌保证水平。
灭菌时，应采用适当的化学或物理方法对灭菌物品吸收的辐射剂量进行监
控，以充分证实灭菌物品吸收的剂量是在规定的限度内。如采用与灭菌物品一
起被辐射的放射性剂量计，剂量计要置于规定的部位。在初安装时剂量计应用
标准源进行校正，并定期进行再校正。
〈60〉Co-γ射线辐射灭菌法常用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子(Spores of
Bacillus pumilus)。
四、气体灭菌法
本法系指用化学消毒剂形成的气体杀灭微生物的方法。常用的化学消毒剂
有环氧乙烷、气态过氧化氢、甲醛、臭氧(O3)等，本法适用于在气体中稳定的物
品灭菌。采用气体灭菌法时，应注意灭菌气体的可燃可爆性、致畸性和残留毒
性。
本法中最常用的气体是环氧乙烷，一般与80%～90%的惰性气体混合使用，
在充有灭菌气体的高压腔室内进行。该法可用于医疗器械，塑料制品等不能采
用高温灭菌的物品灭菌。含氯的物品及能吸附环氧乙烷的物品则不宜使用本法
灭菌。
采用环氧乙烷灭菌时，灭菌柜内的温度、湿度、灭菌气体浓度、灭菌时间
是影响灭菌效果的重要因数。可采用下列灭菌条件：
温度 (54±10)℃
相对湿度 (60±10)%
灭菌压力 8×10〈5〉Pa
灭菌时间 90min
灭菌条件应予验证。灭菌时，将灭菌腔室先抽成真空，然后通人蒸汽使腔
室内达到设定的温湿度平衡的额定值，再通入经过滤和预热的环氧乙烷气体。
灭菌过程中，应严密监控腔室的温度、湿度、压力、环氧乙烷浓度及灭菌时间。
必要时使用生物指示剂监控灭菌效果。本法灭菌程序的控制具有一定难度，整
个灭菌过程应在技术熟练人员的监督下进行。灭菌后，应采取新鲜空气置换，
使残留环氧乙烷和其他易挥发性残留物消散。并对灭菌物品中的环氧乙烷残留
物和反应产物进行监控，以证明其不超过规定的限度，避免产生毒性。
采用环氧乙烷灭菌时，应进行泄漏试验，以确认灭菌腔室的密闭性。灭菌
程序确认时，还应考虑物品包装材料和灭菌腔室中物品的排列方式对灭菌气体
的扩散和渗透的影响。生物指示剂一般采用枯草芽孢杆菌孢子(Spores ofBacillus
subtilis)。
五、过滤除菌法
本法系利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理以除去气体或液体中微生物
的方法。常用于热不稳定的药品溶液或原料的除菌。
除菌过滤器采用孔径分布均匀的微孔滤膜作过滤材料，微孔滤膜分亲水性
和疏水性两种。滤膜材质依过滤物品的性质及过滤目的而定。药品生产中采用
的除菌滤膜孔径一般不超过0.22μm。过滤器不得对被滤过成分有吸附作用，也不
能释放物质，不得有纤维脱落，禁用含石棉的过滤器。滤器和滤膜在使用前应
进行洁净处理，并用高压蒸汽进行灭菌或作在线灭菌。更换品种和批次应先清
洗滤器，再更换滤膜。
过滤过程中无菌保证与过滤液体的初始生物负荷及过滤器的对数下降值
LRV(log reduction value)有关。LRV系指规定条件下，被过滤液体过滤前的微生物数
量与过滤后的微生物数量比的常用对数值。即：
LRV=lgN〈0〉－lgN
式中 N〈0〉为产品除菌前的微生物数量；
N为产品除菌后的微生物数量。
LRV用于表示过滤器的过滤除菌效率，对孔径为0.22μm的过滤器而言，要求
每1cm〈2〉有效过滤面积的LRV应不小于7。因此过滤除菌时，被过滤产品总的污
染量应控制在规定的限度内。为保证过滤除菌效果，可使用两个过滤器串连过
滤，或在灌装前用过滤器进行再次过滤。
在过滤除菌中，一般无法对全过程中过滤器的关键参数(滤膜孔径的大小及
分布，滤膜的完整性及LRV)进行监控。因此，在每一次过滤除菌前后均应作滤器
的完整性试验，即气泡点试验或压力维持试验或气体扩散流量试验，确认滤膜
在除菌过滤过程中的有效性和完整性。除菌过滤器的使用时间应进行验证，一
般不应超过一个工作日，否则应进行验证。
过滤除菌法常用的生物指示剂为缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta)。
通过过滤除菌法达到无菌的产品应严密监控其生产环境的洁净度，建议在
无菌环境下进行过滤操作。相关的设备、包装容器、塞子及其他物品应采用适
当的方法进行灭菌，并防止再污染。
六、无菌生产工艺
无菌生产工艺系指必须在无菌控制条件下生产无菌制剂的方法，无菌分装
及无菌冻干是最常见的无菌生产工艺。后者在工艺过程中须采用过滤除菌法。
无菌生产工艺应严密监控其生产环境的洁净度，并应在无菌控制的环境下
进行过滤操作。相关的设备、包装容器、塞子及其他物品应采用适当的方法进
行灭菌，并防止被再次污染。
无菌生产工艺过程的无菌保证应通过培养基无菌灌装模拟试验验证。在生
产过程中，应严密监控生产环境的无菌空气质量、操作人员的素质、各物品的
无菌性。
无菌生产工艺应定期进行验证，包括对环境空气过滤系统有效性验证及培
养基模拟灌装试验。
生物指示剂
生物指示剂系一类特殊的活微生物制品，可用于确认灭菌设备的性能、灭
菌程序的验证、生产过程灭菌效果的监控等。用于灭菌验证中的生物指示剂一
般是细菌的孢子。
1．制备生物指示剂用微生物的基本要求
不同的灭菌方法使用不同的生物指示剂，制备生物指示剂所选用的微生物
必须具备以下特性：
(1) 菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能污染菌的耐受性。
(2) 菌种应无致病性。
(3) 菌株应稳定。存活期长，易于保存。
(4) 易于培养。若使用休眠孢子，生物指示剂中休眠孢子含量要在90%以上。
2．生物指示剂的制备
生物指示剂的制备应按一定的程序进行，制备前，需先确定所用微生物的
特性，如D值(微生物的耐热参数，系指一定温度下，将微生物杀灭90%所需的时
间，以分表示)等。菌株应用适宜的培养基进行培养。培养物应制成悬浮液，其
中孢子的数量应占优势，孢子应悬浮于无营养的液体中保存。
生物指示剂中包含一定数量的一种或多种孢子，可制成多种形式。通常是
将一定数量的孢子附着在惰性的载体上，如滤纸条、玻片、不锈钢、塑料制品
等；孢子悬浮液也可密封于安瓿中；有的生物指示剂还配有培养基系统。生物
指示剂应选用合适的材料包装，并设定有效期。载体和包装材料在保护生物指
示剂不致污染的同时，还应保证灭菌剂穿透并能与生物指示剂充分接触。载体
和包装的设计原则是便于贮存、运输、取样、转移接种。
有些生物指示剂可直接将孢子接种至液体灭菌物或具有与其相似的物理和
化学特性的替代品中。使用替代品时，应用数据证明二者的等效性。
3．生物指示剂的应用
在灭菌程序的验证中，尽管可通过灭菌过程某些参数的监控来评估灭菌效
果，但生物指示剂的被杀灭程度，则是评价一个灭菌程序有效性最直观的指标。
可使用市售的标准生物指示剂，也可使用由日常生产污染菌监控中分离的耐受
性最强的微生物制备的孢子。在生物指示剂验证试验中，需确定孢子在实际灭
菌条件下的耐受性，并测定孢子的纯度和数量。验证时，生物指示剂的微生物
用量应比日常检出的微生物污染量大，耐受性强，以保证灭菌程序有更大的安
全性。在最终灭菌法中，生物指示剂应放在灭菌柜的不同部位。并避免指示剂
直接接触到被灭菌物品。生物指示剂按设定的条件灭菌后取出，分别置培养基
中培养，确定生物指示剂中的孢子是否被完全杀灭。
过度杀灭产品灭菌验证一般不考虑微生物污染水平，可采用市售的生物指
示剂。对灭菌手段耐受性差的产品，设计灭菌程序时，根据经验预计在该生产
工艺中产品微生物污染的水平，选择生物指示剂的菌种和孢子数量。这类产品
的无菌保证应通过监控每批灭菌前的微生物污染的数量、耐受性和灭菌程序验
证所获得的数据进行评估。
4．常用生物指示剂
(1) 湿热灭菌法 湿热灭菌法最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子
(Spores of Bacillus stearother-mophilus，如NCTC 10007、NCIMB 8157、ATCC 7953)。D值为
1.5～3.0min，每片(或每瓶)活孢子数5×10〈5〉～5×10〈6〉个，在121℃、19min下应
被完全杀灭。此外，还可使用生孢梭菌孢子(Spores of Clostridium sporogenes，如
NCTC 8594、NCIMB 8053、ATCC 7955)，D值为0.4～0.8min。
(2) 干热灭菌法 干热灭菌法最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子(Spores
of Bacillus subtilis，如NCI-MB 8058、ATCC 9372)。D值大于1.5min，每片活孢子数
5×10〈5〉～5×10〈6〉个。去热原验证时使用大肠埃希菌内毒素(Escherichia coli
endoxin)，加量不小于1000细菌内毒素单位。
(3) 辐射灭菌法 辐射灭菌法最常用的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子(Spores
of Bacillus pumilus，如NCTC 10327、NCIMB 10692、ATCC 27142)。每片活孢子数10〈7〉
～10〈8〉，置于放射剂量25kGy条件下，D值约3kGy。但应注意灭菌产品中所负载
的微生物可能比短小芽孢杆菌孢子显示更强的抗辐射力。因此短小芽孢杆菌孢
子可用于监控灭菌过程，但不能用于灭菌辐射剂量建立的依据。
(4) 气体灭菌法 环氧乙烷灭菌最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子
(Spores of Bacillus subtilis，如NCTC 10073、ATCC 9372)。气态过氧化氢灭菌最常用的生
物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillusstearothermophilus，如NCTC 10007、
NCIMB 8157、ATCC 7953)。每片活孢子数1×10〈6〉～5x10〈6〉个。环氧乙烷灭菌中，
枯草芽孢杆菌孢子D值大于2.5min，在环氧乙烷浓度为600mg/L，相对湿度为60%，
温度为54℃下灭菌，60min应被杀灭。
(5) 过滤除菌法 过滤除菌法最常用的生物指示剂为缺陷假单胞菌(Pseudomonas
diminuta，如ATCC 19146)，用于滤膜孔径为0.22μm的滤器；黏质沙雷菌(Serratin
marcescens)(ATCC 14756)用于滤膜孔径为0.45μm的滤器。
页码数,2005版药典附录第41页
附录ⅦJ钠离子测定法
本法系用火焰光度法测定供试品中钠离子含量。
测定法精密量取供试品0．5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，即为供试
品溶液。按火焰光度法(附录ⅡD)测定，在589nm波长处测定供试品溶液的发光
强度。另精密称取于110℃干燥至恒重的氯化钠0．293g，置100ml量瓶中，用水稀
释至刻度，再精密量取该溶液O．9ml、1．1ml、1．3ml、1．5ml、1．7ml，分别置
50ml量瓶中，用水稀释至刻度，制成0．9mmol／L、1．1mmol／L、1．3mmol／L、
1．5mmol／L、1．7mmol／L的系列标准钠溶液，同法操作。
用系列标准钠溶液的浓度对其相应的发光强度作直线回归处理，将供试品
溶液发光强度代人回归方程，求得供试品溶液钠离子浓度为(mmol／L)，再乘以
供试品的稀释倍数(100)，计算出供试品钠离子含量(mmol／L)。
页码数,2005版药典附录第53页
附录ⅨM逆转录酶活性检查法
本法系以雀麦草花叶病毒RNA为模板，采用RT-PCR法扩增特定片段并用
ELISA法检测特异片段与探针的杂交信号，从而测定供试品中逆转录酶活性。
试剂 (1)供试品稀释液(A液) 每1L A液含三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris—HCl，
pH7．5)25mmol、氯化钾50mmol、二硫苏糖醇(DTT)5mmol、四甲基乙二胺(EDTA)
O．25tmmol、TritonX-100 25ml、甘油500ml。
(2)供试品保存液(B液) 每1L A液中含亮抑蛋白酶肽lmg、抑胃肽0．7mg及抑蛋
白酶肽lmg。
(3)引物及探针序列
上游引物：5’Biotin-CGTGGTTGACACGCAGAC -CTCTTAC-3※
下游引物：5’一TCAACACTGTACGGCACCCGCAT-TC-3’
探针：5※_NH2 ATTATCT~GAGAGTTAC-TC※UFFG-3’
(4)模板雀麦草花叶病毒RNA(BMV RNA)。
(5)反转录缓冲液每1L反转录缓冲液含Tris-HCl(pH8．3)50mmol、氯化钾40mmol、
氯化镁6mmol、DTT lOmmol、脱氧核糖核苷酸200mmol、下游引物O．8×10 3mmol。
(6)扩增缓冲液 每1L扩增缓冲液含Tris-HCl (pH8．8)25mmol、氯化钾40mmol、氯化
镁2mmol、脱氧腺嘌呤核糖核苷酸200μmol、脱氧胞嘧啶核糖核苷酸200μmol、脱
氧鸟嘌呤核糖核苷酸200μmol及脱氧尿嘧啶核糖核苷酸200μmol，上、下游引物
各O．4×10-3mmol，核糖核酸酶A O．8g，Taq DNA聚合酶6×104U，尿嘧啶N-糖基化
酶(LING)4×10 4u。
(7)封闭液3％牛血清白蛋白或0．5％酪蛋白溶液。
(8)变性缓冲液 0．2mol／L氢氧化钠，5mmol／L EDTA溶液。,
(9)包被液O．05mol／L磷酸氢二钠溶液(pH8．5)。
供试品、阳性对照及灵敏度对照的制备 (1)取供试品200μ1，每分钟5000转
离心5分钟，取上清液100μ1，加入B液100μl和用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的5％
Triton X-100 2μL，混匀后，置冰浴15分钟后，置一70％保存备用。
(2)阳性对照 用SP2／O细胞培养上清液作阳性对照，同上处理后，按单次
使用量分装，一70℃保存备用。
(3)灵敏度对照 取鼠源白血病病毒逆转录酶(MMLV)适量，用A液系列稀释至
10-8 U／μl，充分混匀，按单次使用量分装，一70℃保存备用。
检查法
(1)反转录将已处理的供试品及阳性对照用A液10倍稀释。
反转录反应管中加入反转录缓冲液20．8ul、500mg／LBMV-RNA O．2ul，混匀
后，标记，70％放置10分钟，置冰浴。
在相应的反转录反应管中分别加入4μl已稀释的供试品、阳性对照及灵敏
度对照，以A液作阴性对照。反转录反应体系为25μL。37℃反应90分钟。
(2)PCR扩增取反转录产物5ul加至PCR扩增缓冲液20μl中，PCR扩增反应体系
为25μl。混匀后，按下列条件进行扩增：37℃ 30分钟，预变性94℃ 5分钟，94℃
45秒，56℃ 45秒，72％45秒，进行35个循环，72℃延伸5分钟。
(3)杂交检测用经包被液适当稀释的探针100μl包 附录ⅨN人凝血酶活性检查
法被DNA结合板，4℃过夜；次日，用封闭液200bd 37℃封闭60分钟，用洗涤液洗
涤3次，备用；扩增结束后，每个反应管中加入变性液25μ1，混匀；在封闭洗
涤后的包被板上每孔加入供试品25μA，再加入杂交液100μ1，混匀后，37℃反
应60分钟，用洗涤液洗涤5次；每孔中加入链亲和素标记的辣根过氧化物酶
100μl，37℃反应30分钟；用洗涤液洗涤5次；每孔加入显色液100μl，37℃显色
10分钟；每孔加入终止液100μl终止反应。用酶标仪以630nm 为参比波长，在波
长492nm处测定吸光度。
结果判定Cutoff值为阴性对照的吸光度加0．2。
阴性对照吸光度应不高于0．2，如小于0．05按0．05计。
阳性对照应为阳性，其吸光度应不低于1．5。
灵敏度对照应为阳性，其吸光度应不低于o．8。
供试品吸光度大于Cutoff值者为阳性。
注意事项 (1)如供试品为培养细胞，则将细胞传代后，培养3～4天长成单层，
取上清液检测，取供试品前不得换液。
(2)试验中所有试剂及吸头均需灭菌。与RNA操作有关的试剂及材料均需经过
焦碳酸二乙酯(DEPC)处理。
(3)加供试品区、扩增区及PCR产物检测区及其所用加样枪及服装应严格区分。
(4)定期对各区进行消毒，PCR产物及其加供试品吸头应及时进行有效处理。
书页号：2005版药典三部附录11页
附录I M 凝胶剂
凝胶剂 系指以生物制品原液或经干燥后制成的干粉为原料药物，与能形成
凝胶的辅料制成均,混悬或乳液型的稠厚液体或半固体制剂。除另有规定
外，凝胶剂限局部用于皮肤及体腔如鼻腔、阴道和直肠。乳液型凝胶剂又
称为乳胶剂。小分子无机药物(如氢氧化铝)凝胶剂是由分散的药物胶体小粒子
以网状结构存在于液体中，属两相分散系统，也称}昆悬型凝胶剂。混悬型凝
胶剂具有触变性，静止时形成半固体而搅拌或振摇时成为液体。
凝胶剂基质属单相分散系统，有水性与油性之分。水性凝胶基质一般由水、
甘油或内二醇与纤维素衍生物、卡波姆和海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、淀粉
等构成；油性凝胶剂基质由液状石蜡与聚氧乙烯或脂肪油与胶体硅或铝皂、
锌皂构成。
凝胶剂在生产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产和质量控制应符合相关品种
要求。
二、混悬型凝胶剂中胶粒应分散均匀，不应下沉、结块。
三、凝胶剂应均匀、细腻，在常温时保持胶状，不干涸或液化。
四、凝胶剂必要时可加人保湿剂、防腐剂、抗氧剂、乳化剂、增稠剂和透
皮促进剂等。
五、凝胶剂基质不应与药物发生理化作用。
六、混悬型凝胶剂在标签上注明“用前摇匀”。
七、凝胶剂用于严重损伤的皮肤、鼻腔和阴道内应无菌。
八、凝胶剂所用内包装材料不应与药物或基质发生理化作用。
九、除另有规定外，凝胶剂应置密闭容器中，于2～8℃避光贮存和运输，
并应防止冻结。
凝胶剂应进行以下相应检查。
【粒度】 除另有规定外，混悬型凝胶剂取适量的供试品，涂成薄层，薄层
面积相当于盖玻片面积，共涂3片，照粒度测定法(附录V G第一法)检查，均不得
检出大于180μm的粒子。
【装量】 照最低装量检查法(附录V F)检查，应符合规定。
【微生物限度】 照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符合规定。
凡规定进行无菌检查的凝胶剂，可不进行微生物限度检查。
【无菌】 有无菌要求的凝胶剂照无菌检查法(附录ⅫA)检查，应符合规定。
书页号：2005版药典三部附录9页
附录I H喷雾剂
喷雾剂 是以一种或一种以上生物制品原液为原料药物，加入适宜稳定剂或
辅料后，填充于特制的装置中制成的液体制剂。使用时借用手动泵的压力、
高压气体、超声振动或其他方法将内容物呈雾状物释出。用于直接喷至皮肤
的制剂，也称外用喷雾剂。按给药定量与否，喷雾剂可分为定量喷雾剂和非
定量喷雾剂。
喷雾剂在生产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液半成品和成品的生产和质量控制应符合相关品种要求。
二、喷雾剂制备应控制温度，制备完成后应立即置于规定的温度下贮存，减
少温度对药物的活性成分的影响。
三、喷雾剂配制时，根据需要可加入溶剂、助溶剂、抗氧剂、表面活性剂或
其他附加剂，所有附加剂均应对皮肤无刺激性。
四、溶液型喷雾剂药液应澄清；乳液型喷雾剂液滴在液体介质中应分散均匀；
混悬型喷雾剂应将药物和附加剂充分混匀制成稳定的混悬剂。
五、喷雾剂装置中各组成部件均应采用无毒、无刺激性、性质稳定、与药物
不起作用的材料制备。
除另有规定外，喷雾剂应置2～8℃避光保存和运输。
喷雾剂应进行以下相应检查。
【每瓶总喷次】 多剂量喷雾剂按下述方法检查，每瓶总喷次应符合规定。
检查法 取供试品4瓶，分别除去帽盖，精密称重(W1)，充分振摇，在通风橱
内按使用说明书操作，向已加入适量吸收液的容器内喷射最初10喷，用溶剂洗
净套口，充分干燥后，精密称重(W2)；振摇后向上述容器内连续喷射10次，用
溶剂洗净套口，充分干燥后，精密称重(W3)；打开储液罐，弃去药液，用溶剂
洗净供试品容器，干燥后，精密称重(W4)，按下式计算每瓶总喷次，均应不少
于每瓶标示总喷次。
总喷次=10×(W1一W4)/(W2一W3)
【每喷喷量】 除另有规定外，定量喷雾剂照下述方法检查，每喷喷量应符
合规定。
检查法取供试品4瓶，按使用说明书操作，分别试喷数次后，擦净，精密称
定，再连续喷射3次，每次喷射后均擦净，精密称定，计算每次喷量，连续喷
射10次，擦净，精密称定，再按上述方法测定3次喷量，再连续喷射10次后，
按上述方法再测定4次喷量，计算每瓶10次喷量的平均值。除另有规定外，均
应为标示喷量的80％～120％。
凡规定测定每喷主药含量的喷雾剂，不再进行每喷喷量的测定。
【每喷主药含量】 除另有规定外，定量喷雾剂照下述方法检查，每喷主药
含量应符合规定。
检查法取供试品1瓶，照使用说明书操作，试喷5次，用溶剂洗净喷口，充分
干燥后，喷射10次或20次(注意喷射每次间隔5秒并缓缓振摇)，收集于一定量的
吸收溶剂中，转移至适宜量瓶中并稀释至刻度，摇匀，测定。所得结果除以10
或20，即为平均每喷主药含量，每喷主药含量应为标示含量的80％～120％。
【装量差异】 除另有规定外，单剂量喷雾剂装量差异应符合规定。
检查法除另有规定外，取供试品20个，照各品种项下规定的方法，求出每
个内容物装量与平均装量。每个装量与平均装量相比较，超出装量差异限度
的不得多于2个，并不得有1个超出限度1倍。
【装量】 多剂量喷雾剂照最低装量检查法(附录VF)检查，应符合规定。
【微生物限度】 除另有规定外，照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符
合规定。
凡规定进行无菌检查的喷雾剂可不进行微生物限度检查。
【无菌】 用于烧伤、严重损伤或溃疡的喷雾剂照无菌检查法(附录ⅫA)检
查，应符合规定。
书页号：2005版药典三部附录7页
附录I E 片剂
片剂系指以生物制品原液经干燥后制成的干粉为原料药物，与适宜的辅料
混匀压制而成的圆片状或异形片状的固体制剂；该原料药物可由一种或多种
活性成分组成。
片剂以口服普通片为主，另有泡腾片、肠溶片等。
普通片 系指原料药物与适宜辅料混匀压制成的普通片剂，非包衣的片剂多
为此类片剂，重量一般为0．1～0.5g。
泡腾片 系指含有碳酸氢钠和有机酸、遇水可产生气体而呈泡腾状的片剂。
泡腾片中的药物一般应是易溶性的，加水产生气泡后应能溶解。有机酸一
般用枸橼酸、酒石酸、富马酸等。
肠溶片 系指用肠溶性包衣材料进行包衣的片剂。
为防止药物在胃内分解失效、避免对胃的刺激或控制药物在肠道内定位释
放，可对片剂包肠溶衣；为治疗结肠部位疾病，可对片剂包结肠定位肠溶衣。
片剂在牛产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的牛产及质量控制应符合相关品种
要求。
二、原料药与辅料应混合均匀，药物含量应准确。含药量小的片剂，应采用
适宜方法使药物分散均匀。
三、凡属挥发性或对光、热不稳定的药物，在制片过程中应避光、避热，以
避免成分损失或失效。
四、压片前的半成品应按相关品种要求控制水分。根据需要可加入矫味剂、
芳香剂和着色剂。
五、为增加药物稳定性、掩盖药物小良臭味、改善片剂外观等，可对片剂进
行包薄膜衣。
六、片剂外观应完整光洁，色泽均匀。有适宜的硬度和耐摩擦性。除另有规
定外，对于非包衣片，应符合片剂脆碎度检查法的要求，防止包装贮运过程中
发生磨损或破碎。
七、除另有规定外，片剂应置2～8℃或适宦湿度下密封贮存和运输。
片剂应进行以下相应检查。
【重量差异】 片剂重量差异的限度，应符合规定。
检查法取供试品20片，精密称定总重量。求得平均片重后，再分别精密称定
每片的重量，每片莺量与平均片重相比较(凡尢含量测定的片剂，每片重量应
与标示片重相比较)，超出限度的药片不得多于 2片，并不得有1片超出限度1倍。
薄膜衣片应在包薄膜衣后检查重量差异，并符合规定。
【崩解时限】 除另有规定外，照崩解时限检查法(附录V C)检查。应符合规
定。
凡规定检查溶出度、释放度或融变时限的片剂，不再进行崩解时限检查。
【微生物限度】 除另有规定外，照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符
合规定。
凡规定进行杂菌检查的片剂，可不进行微生物限度
页码数,2005版药典附录第68页
附录Ⅺ F 破伤风抗毒素效价测定法(小鼠试验法)
本法系根据抗毒素能中和毒素的作用，将供试品与标准品进行对比试验，
推算出每lml供试品中所含抗毒素的国际单位数(IU／m1)。
试剂 硼酸盐缓冲盐水 称取氯化钠8·5g、硼酸4·5g、四硼酸钠
(Na2 B4 07·10H20)O．5g，加水至1000ml，过滤，灭菌后pH值为7．0～7．2。
标准品溶液的制备(1)破伤风抗毒素标准品的稀释抗毒素标准品用硼酸盐缓
冲盐水稀释至每lml含o．5 Iu，即与毒素等量混合后每0．4ml注射量中含1／10 Iu。
抗毒素标准品原液的1次吸取量应不低于O．5ml。
(2)破伤风毒素的稀释毒素用硼酸盐缓冲盐水稀释至每lml含5个试验量
(1／10 L+)，即与抗毒素等量混合后每0．4ml注射量中含1个试验量(1／10 L+)。试
验用的毒素须以国家药品检定机构颁发的抗毒素标准品准确标定其试验量
(1／10 L+)，并须每3个月复检一次。
供试品溶液的制备用硼酸盐缓冲盐水将供试品稀释成数个稀释度，使每lml
含抗毒素约O．5IU，即与毒素等量混合后每0．4ml注射量中含抗毒素约1／10 Iu。
稀释度的间隔约为5％。
测定法定量吸取稀释后的抗毒素标准品溶液及不同稀释度的供试品溶液分
别加入小试管中，每管加入等量的稀释毒素溶液，混合均匀，加塞，37℃结合
1小时后，立即注射。
于17～19g小鼠腹部或大腿根部皮下注射O．4ml，应注意勿使注射液流出，
标准品及供试品的每个稀释度各注射小鼠至少3只。标准品溶液与供试品溶液
不得用同一支注射器注射。同一供试品的不同稀释度溶液可用同一支注射器
注射。由高稀释度向低稀释度依次注射。在更换稀释度时应用下一稀释度溶液
洗2～3次。每日上、下午至少观察试验小鼠1次，连续5日，并记录其发病及死
亡情况。
结果判定对照小鼠应于72～120小时内全部死亡。
供试品的效价为与对照小鼠同时死亡或出现破伤风神经毒症状最重的最高
稀释度。
有下列情况之一者应重试：
(1)供试品的稀释度过高或过低；
(2)对照试验小鼠在72小时前或120小时后死亡；
(3)死亡不规则以及在同一稀释度的小鼠中有2只以上属非特异死亡。
【附注】使用干燥毒素时，须精密称定，每次称取量应不低于10mg。毒素溶
解后应一次用完。剩余的干燥毒素应封存于装有干燥剂的真空器皿中。亦可用
干燥毒素制成液体毒素，即干燥毒素以生理氯化钠溶液溶解，与中性甘油
(经116℃ 10分钟灭菌)等量混合，每lml至少含20个试验量。毒素应保存于2～8℃避
光处。
页码数,2005版药典附录第19页
附录ⅢC气相色谱法
气相色谱法系采用气体为流动相(载气)流经装有填充剂的色谱柱进行分离测
定的色谱方法。物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分
先后进入检测器，用记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。
1．对仪器的一般要求
所用的仪器为气相色谱仪，气相色谱仪由载气源、进样部分、色谱柱、柱温
箱、检测器和数据处理系统组成。进样部分、色谱柱和检测器的温度均在控
制状态。
(1)载气源气相色谱法的流动相为气体，称为载气，氦、氮和氢可用作载气，
可由高压钢瓶或高纯度气体发生器提供，经过适当的减压装置，以一定的流速
经过进样器和色谱柱；根据供试品的性质和检测器种类选择载气，除另有规定
外，常用载气为氮气。
(2)进样部分进样方式一般可采用溶液直接进样或顶空进样。
溶液直接进样采用微量注射器、微量进样阀或有分流装置的气化室进样；
采用溶液直接进样时，进样口温度应高于柱温30～50~C；进样量一般不超过数
微升；柱径越细，进样量应越少，采用毛细管柱时，一般应分流以免过载。
顶空进样适用于固体和液体供试品中挥发性组分的分离和测定。将固态或
液态的供试品制成供试液后，置于密闭小瓶中，在恒温控制的加热室中加热至
供试品中挥发性组分在非气态和气态达至平衡后，由进样器自动吸取一定体积
的顶空气注入色谱柱中。
(3)色谱柱色谱柱为填充柱或毛细管柱。填充柱的材质为不锈钢或玻璃，内径
为2～4mm，柱长为2～4m，内装吸附剂、高分子多孔小球或涂渍固定液的载体，
粒径为O．25～0．18mm、O．18～O．15mm或O．15～0．125mm。
常用载体为经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高分子多孔小球，常用固定液有
甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛细管柱的材质为玻璃或石英，内壁或载体经涂
渍或交联固定液，内径一般为0．25mm、O．32mm或0．53mm，柱长5～ 60m，固定
液膜厚O．1～5．0um，常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例组成的苯基甲
基聚硅氧烷、聚乙二醇等。
新填充柱和毛细管柱在使用前需老化以除去残留溶剂及低分子量的聚合物，
色谱柱如长期未用，使用前应老化处理，使基线稳足。
(4)柱温箱由于柱温箱温度的波动会影响色谱分析结果的重现性，因此柱温
箱控温精度应在±1℃，且温度波动小于每小时o．1℃。温度控制系统分为恒温
和程序升温两种。
(5)检测器适合气相色谱法的检测器有火焰离子化检测器(FID)、热导检测器
(TCD)、氮磷检测器(NPD)、火焰光度检测器(FPD)、电子捕获检测器(ECD)、质谱
检测器(MS)等。火焰离子化检测器对碳氢化合物响应良好，适合检测大多数的
药物；氮磷检测器对含氮、磷元素的化合物灵敏度高；火焰光度检测器对含
磷、硫元素的化合物灵敏度高；电子捕获检测器适于含卤素的化合物；质谱检
测器还能给出供试品某个成分相应的结构信息，可用于结构确证。除另有规定
外，一般用火焰离子化检测器，用氢气作为燃气，空气作为助燃气。在使用火
焰离子化检测器时，检测器温度一般应高于柱温，并不得低于150℃，以免水气
凝结，通常为250～350℃。
(6)数据处理系统可分为记录仪、积分仪以及计算机工作站等。
各品种项下规定的色谱条件，除检测器种类、固定液品种及特殊指定的色
谱柱材料不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体牌号、粒度、固定液涂
布浓度、载气流速、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适
应具体品种并符合系统适用性试验的要求。一般色谱图约于30分钟内记录完
毕。
2．系统适用性试验
除另有规定外，应照高效液相色谱法(附录ⅢB)项下的规定。
3．测定法
(1)内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成 分含量
(2)外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量
(3)面积归一化法
上述(1)～(3)法的具体内容均同高效液相色谱法
(附录ⅢB)项下相应的规定。
(4)标准溶液加入法测定供试品中某个杂质或主成分
精密称(量)取某个杂质或待测成分对照品适量，配制成适当浓度的对照品溶
液，取一定量，精密加入到供试品溶液中，根据外标法或内标法测定杂质或主
成分含量，再扣除加入的对照品溶液含量，即得供试液溶液中某个杂质和主成
分含量。
也可按下述公式进行计算，加入对照品溶液前后校正因子应相同，即：
Ais/Ax=Cx+△cx／cx
则待测组分的浓度cx可通过如下公式进行计算：
cx=△cx/(Ais/Ax)-1
式中cx为供试品中组分x的浓度；
Ax为供试品中组分x的色谱峰面积；
△cx为所加入的已知浓度的待测组分对照品的浓度；
Ais为加入对照品后组分x的色谱峰面积。
气相色谱法定量分析，当采用手工进样时，由于留针时间和室温等对进样
量的影响，使进样量不易精确控制，故最好采用内标法定量；而采用自动进样
器时，由于进样重复性的提高，在保证进样误差的前提下，也可采用外标法定
量。当采用顶空进样技术时，由于供试品和对照品处于不完全相同的基质中，
故可采用标准溶液加入法以消除基质效应的影响；当标准溶液加入法与其他定
量方法结果不一致时，应以标准加入法结果为准。
页码数,2005版药典附录第68页
附录Ⅺ G 气性坏疽抗毒素效价
本法根据抗毒素能中和毒素的作用，将供试品与标准品做系列稀释，分别
与相应毒素结合，注入小鼠体内，在规定的时间内，比较小鼠存活和死亡情
况，以测定供试品效价。
试剂 (1)稀释液 称取氯化钠8．5g、硼酸4．5g、四硼酸钠(Na2 B4()7·10H20)
0．5g，用水溶解并稀释至1000ml，过滤。灭菌后pH值应为7．0～7．2。
(2)气性坏疽毒素溶液 由国家药品检定机构提供，亦可自备。试验用的气性
坏疽毒素须以国家药品检定机构分发的气性坏疽抗毒素标准品准确标定其试验
量(见测定参数表)，并每3个月复检1次。使用前将毒素用稀释液稀释至每lml含5个
(水肿型为20个)毒素试验量。
气性坏疽抗毒素效价测定参数表（表略）
气性坏疽抗毒素标准品溶液的制备气性坏疽(产气荚膜、水肿、败毒、溶组
织)抗毒素标准品由国家药品检定机构提供。于2～8℃处避光保存。使用时，将
抗毒素标准品溶液用稀释液稀释至每lml含测定参数表所示效价。抗毒素标准品
原液的1次吸取量应不低于0．5ml。
供试品溶液的制备将供试品用稀释液稀释成数个稀释度，使每lml约含5个试
验量(水肿型为20个试验量)。各稀释度之间的间隔约为5％～10％。
测定法 精密量取气性坏疽抗毒素标准品溶液O．8ml、1．0ml、1．2m1分别置
小试管中，按管序分别补加稀释液O．7ml、0．5ml、0．3ml。精密量取不同稀释
度的供试品溶液各1．0m1分别加入小试管中，每管补加稀释液0．5ml(可在抗毒素
之前加入)。以上各管分别加入气性坏疽毒素溶液1．0ml(水肿型为O．5m1)，混合
均匀，加塞，20～25℃结合1个小时，按测定参数表所示剂量与途径，立即注射
17～19g小鼠。每稀释度注射小鼠4只。
结果判定每天上、下午各观察试验动物1次，并记录发病及死亡情况，连续
3天。标准品组动物在3天内，抗毒素量最少(即O．8m1)的4只动物中至少应有2只
以上死亡。对比标准品组与供试品组动物死亡情况，推算供试品的效价。
有下列情况之一者应重试：
(1)标准品组动物在3天内全部死亡或者全无死亡，或者抗毒素量最少的4只动
物死亡不足半数，抗毒素量最多的4只动物死亡超过半数；
(2)供试品组动物在3天内全部死亡或者全无死亡；
(3)动物死亡数极不规则，以致无法进行判定；
(4)每稀释度注射的动物中有2只以上属非特异死亡。
【附注】(1)自备气性坏疽毒素的制法(包括菌种、培养基、培养条件及干燥方
法等)应与国家药品检定机构分发者相同。
(2)使用干燥气性坏疽毒素时，须精密称定，每次称取量应不低于10mg，溶解
后应一次用完。剩余的干燥毒素应封存于装有干燥剂的真空器皿中。亦可用干
燥毒素制成液体毒素，即干燥毒素以生理氯化钠溶液溶解，与中性甘油(经116℃
10分钟灭菌)等量混合，每lml至少含50个试验量。毒素应保存于2～8℃避光处。
页码数,2005版药典附录第39页
附录ⅦF氢氧化铝(或磷酸铝)测定法
本法系依据过量的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)与铝离子发生反应，再用锌滴
定液滴定剩余的EDTA，根据锌滴定液的消耗量，可计算出供试品中氢氧化铝
(或磷酸铝)的含量。
测定法 精密量取供试品适量(约相当于含铝1～lOmg)，置250 ml锥形瓶中，加
磷酸溶液(6—100)1．5ml，使完全溶解。必要时于水浴中加温(难于溶解时尚可适
当增加磷酸量)。精密加入乙二胺四乙酸二钠滴定液(0．05mol／l)10ml，醋酸一醋
酸铵缓冲液(pH4．5)(称取醋酸铵7．7g，加水50ml溶解后，加冰醋酸6ml与适量的
水稀释成100m1)0ml，置沸水浴上加热10分钟，取出冷至室温，加二甲酚橙指示
液lml，用锌滴定液(0．025mol／I)进行滴定，当溶液由亮黄色变为橙色，即为终
点。并将滴定的结果用空白试验校正。
按下式计算
氢氧化铝含量(mg／m1)=(Vo-V1)*c*78．01/V2
磷酸铝含量(mg／m1)=(Vo-Vl)*c*l21.95/V2
铝含量(mg／m1)=(Vo-V1)*c*26．98/V2
式中 V0为空白试验消耗锌滴定液的体积，ml；
Vl为供试品消耗锌滴定液的体积，ml；
c为锌滴定液的浓度，mol／L；
V2为供试品的体积，ml；
78．01、121．95、26．98分别为氢氧化铝、磷酸铝,铝的相对分子质量或相
对原子质量。
【附注】 (1)锌滴定液(O．05mol／L)的制备与滴定取硫酸锌15g(相当于锌约
3．3g)，加稀盐酸(23．4→100)lOml，适量水溶解并稀释至1000ml，摇匀。精密量取
本液25ml，加0．025％甲基红的乙醇溶液1滴，滴加氨试液至溶液显微黄色，加
水25ml、氨-氯化铵缓冲液(pill0．0)10ml与铬黑T指示剂少量，用乙二胺四乙酸二
钠滴定液(0．05mol／L)滴定至溶液由紫色变为纯蓝色，并将滴定的结果用空白
试验校正。根据乙二胺四乙酸二钠滴定液(0．05tool／L)的消耗量，算出本液的
浓度，即得。
(2)锌滴定液(0．025mol／L)的制备 精密量取锌滴定液(0．05mol／L)lOOml，加水
准确稀释至200ml，摇匀，即得。
(3)乙二胺四乙酸二钠滴定液(O．05tool／L)的制备与滴定取乙二胺四乙酸二钠
19g，加适量的水溶解并稀释成1000ml，摇匀。取于约800℃灼烧至恒重的标准氧
化锌0．12g，精密称定，加稀盐酸(23．4→100)3ml使溶解，加水25ml，加O．025％
甲基红的乙醇溶液1滴，滴加氨试液至溶液显微黄色，加水25ml与氨一氯化铵缓
冲液(pHl0．O)10ml，再加铬黑T指示剂少量，用本液滴定至溶液由紫色变为纯蓝
色，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml乙二胺四乙酸二钠滴定液
(0．05mol／L)相当于4．069mg的氧化锌。根据本液的消耗量与氧化锌的取用量，
算出本液的浓度，即得。
页码数,2005版药典附录第21页
附录lV B琼脂糖凝胶电泳法
试剂 (1)巴比妥缓冲液(pH8．6) 称取巴比妥4·14g、巴比妥钠23．18g，加水适
量，加热使之溶解，放冷至室温，再加叠氮钠O．15g，溶解后，加水稀释成
1500ml。
(2)1．5％琼脂糖溶液称取琼脂糖1．5g，加水50ml和巴比妥缓冲液(pH8．6)50ml，
加热使完全溶胀。
(3)0·5％氨基黑溶液称取氨基黑10B 0．5g，溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml
的混合液中。
(4)脱色液量取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混匀。
(5)溴酚蓝指示液 称取溴酚蓝50mg，加水使之溶解，并稀释成100ml。
对照品正常人血清或其他适宜的对照品。
供试品溶液的制备用生理氯化钠溶液将供试品稀释成蛋白质浓度为1％～2％
的溶液。
测定法趁热将1．5％琼脂糖溶液倾倒于大小适宜的水平玻板上，其厚度约
3mm，静置，待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层后，于琼脂板负极端的1／3处打
孔，孔径2～3mm。置含有巴比妥缓冲液(pH8．6)的电泳槽架上，测定孔加适量
供试品溶液和1滴溴酚蓝指示液，对照孔加适量对照品及1滴溴酚蓝指示液。用
3层滤纸搭桥与巴比妥缓冲液(pH8．6)接触，100V恒压条件下电泳2小时(指示剂迁
移到前沿)。电泳结束后，用O．5％氨基黑溶液染色，再用脱色液脱色至背景无
色。
书页号：2005版药典三部附录77页
附录Ⅻ D 热原检查法
本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家
兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。
供试用家兔 供试用的家兔应健康，体重1.7～3.0kg，雌兔应无孕。预测体温
前7日即应用同一饲料饲养，在此期间内，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等
不得有异常现象。未曾用于热原检查的家兔，应在检查供试品前3～7日内预测体
温，进行挑选。挑选的条件与检查供试品相同，仅不注射药液，每隔30分钟测量
体温1次，共测8次，8次体温均在38.0～39.6℃的范围内，且最高与最低体温差不超
过0.4℃的家兔，方可供热原检查用。用于热原检查后的家兔，若供试品判定为
符合规定，至少应休息48小时后可重复使用；对血液制品、抗毒素和其他同一过
敏原的供试品在5天内可重复使用1次。若供试品判定为不符合规定，则组内全部
家兔不再使用。
试验前准备热原检查前1～2日，供试验用家兔应尽可能处于同一温度的环境
中，实验室和饲养室的温度相差不得大于5℃，实验室的温度应在17～25℃，热原
检查全过程中，应注意室温变化不得大于3℃；并应保持安静，避免强光照射，
避免噪声干扰和引起动物骚动。家兔在检查前至少1小时开始停止给食并置于适
宜的装置中，直至检查完毕。家兔体温应使用精密度为±0.1℃的测温装置。测温
探头或肛温计插入肛门的深度和时间各兔应相同，深度一般约6cm，时间不得少
于1.5分钟。每隔30分钟测量体温1次，一般测量2次，两次体温之差不得超过0.2℃，
以此两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔，正常体温应在
38.0～39.6℃的范围内，同组兔间正常体温之差不得超过1℃。
检查用的注射器、针头及一切与供试品接触的器皿，应置干烤箱中用250℃
加热30分钟，也可用其他适宜方法除热原。
检查法 供试品或稀释供试品的无热原稀释液，在注射前应预热至38℃。供
试品的注射剂量按各制品规程的规定。但家兔每1kg体重注射体积不得少于0.5ml，
不得大于10ml。
取适用的家兔3只，测定其正常体温后15分钟内，自家兔耳静脉缓缓注入规
定剂量并预热至38℃的供试品溶液，然后每隔30分钟按前法测量其体温一次，共
测6次，以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温升高的温度。如3
只家兔中，有1只家兔体温升高0.6℃或0.6℃以上；或3只家兔体温升高均低于0.6℃
,但体温升高的总和达1.4℃或1.4℃以上，应另取5只家兔复试，检查方法同上。
结果判定 在初试3只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高
总和低于1.4℃；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔仅有1
只，并且初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或3.5℃以下，均认为供
试品的热原检查符合规定。
在初试的3只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只；或在复试的
5只家兔中，体温升高0.6℃或0.6℃以上的家兔超过1只；或在初试、复试合并8只
家兔的体温升高总和超过3.5℃，均认为供试品的热原检查不符合规定。
当家兔升温为负值时，均以0℃计。
页码数,2005版药典附录第55页
附录ⅨQ人红细胞抗体测定法(微量板法)
本法系依据红细胞与红细胞抗体结合后发生凝集的原理，通过比较血凝反
应终点，测定供试品中人红细胞抗体效价。
试剂1％O型红细胞悬液取3例或3例以上O型抗凝血混合，采血后7日内使用。
用前以生理氯化钠溶液洗涤3次，末次以每分钟2000转离心10分钟，取压积红
细胞适量，用生理氯化钠溶液制成1％浓度备用。
测定法在"V"形、底角呈90。的96孔微量板上，用生理氯化钠溶液将供试品做
2倍系列稀释，每个供试品做两排，每孔加入50ul。再向每孑L加入1％O型红细胞
悬液50μl，轻拍微量板30秒混匀。室温静置3小时观察结果，同时用生理氯化钠
溶液替代供试品，同法操作作阴性对照。
结果判定将微量板置于白色背景之上，将供试品孔与阴性对照孔比较，红细
胞沉于底部成一规则的圆点而孔壁未粘有红细胞判为阴性；孔壁上均匀附着一
层红细胞，或红细胞未全部沉于底部，部分附着于孔壁上均判为阳性。以供试
品出现阳性的最高稀释倍数为其红细胞抗体的效价。如同批供试品前后排结果
相差在1个以上稀释度时应重试。相差1个稀释度时，则以两排结果中出现阳性
的最高稀释度为该供试品的红细胞抗体效价。
页码数,2005版药典附录第63页
附录X P人免疫球蛋白Fc段生物学活性测定法
本法系依据特异性抗体(免疫球蛋白)Fab段与红细胞上已包被的相应抗原结
合，抗体暴露出Fc段补体Clq的结合位点，从而激活后续的补体各成分，最终导
致红细胞的细胞膜受到攻击、破裂，释放出血红蛋白。通过溶血反应动力学曲
线，计算人免疫球蛋白激活补体活性的功能指数(JFc)，以此测定供试品Fc段生
物学活性。
试剂 (1)PBS(pH7．2) 取无水磷酸氢二钠1．02g、无水磷酸二氢钠0．34g、氯化
钠8．77g，加适量水溶解，用lmol／L氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节pH至7．2，再
加水稀释至1000ml。
(2)钙镁贮备液 取氯化钙1．10g、氯化镁5．08g，加水25ml使溶解。
(3)巴比妥一钙镁贮备液 取氯化钠5L 85g、巴比妥钠6．37g，加1000ml使溶解，
加入钙镁贮备液3．125ml，用lmol／L盐酸溶液调节pH至7．3，再加水稀释至
1250ml。除菌过滤后4℃保存备用。
(4)牛白蛋白一巴比妥缓冲液取牛血清白蛋白0．15g于巴比妥贮备液20ml中，加
水溶解并稀释至100ml。本液应临用前配制。
(5)1．3mg／L鞣酸PBS(pH7．2)溶液 A液称取鞣酸lmg加PBS(pH7．2)10ml，使溶解；
B液量取A液O．1ml加PBS(pH7．2)7．5ml，混匀，即得，临用前配制。
(6)10％氯化铬溶液称取氯化铬5g，加生理氯化钠溶液50ml使溶解，4℃保存(可
保存半年)。
(7)1％氯化铬溶液 取10％氯化铬溶液O．1ml，加生理氯化钠溶液O．9ml，混
匀。临用前配制。
敏化红细胞的制备
A液取健康人抗凝的0型血3人份以上混合，用PBS洗涤3次，最后一次于每分
钟2000转离心10分钟分离红细胞。取适量压积红细胞悬浮于1．3mg／L鞣酸
PBS(1:40)，置37℃水浴中轻摇30分钟后再用PBS洗涤3次，最后用PBS制备成2．5％
红细胞悬浮液。
B液用PBS适当稀释的白喉类毒素或流行腮腺炎病毒与1％氯化铬溶液O．25ml
混合(10：1)后，置37℃水浴中轻摇15分钟。
将A液、B液按1：4混合，置37℃水浴中轻摇30分钟。离心，去上清液，用PBS
将沉淀(敏化红细胞)洗涤3次，用牛白蛋白一巴比妥缓冲液悬浮红细胞，调节至
适宜浓度，使其在波长541nm处的吸光度为1．O±O．1。
参考品溶液的制备用1mol／L氢氧化钠溶液将参考品pH调至6·8～7．O，再用
牛白蛋白一巴比妥缓冲液将参考品IgG浓度稀释至每lml含40mg。
供试品溶液的制备用lmol／L氢氧化钠溶液将供试品pH调至6．8～7．O，再用
牛白蛋白一巴比妥缓冲液将供试品IgG浓度稀释至每lml含40mg。
测定法 取供试品溶液0．9ml加敏化红细胞悬液O·lml，混匀，置37℃水浴中轻
摇30分钟。离心，去上清液，用牛白蛋白一巴比妥缓冲液lml洗涤红细胞，共洗
3次。末次离心后弃上清液800μl，向沉淀中加入600μl预热到37℃的牛白蛋白一
巴比妥缓冲液，充分混匀，2分钟后再加入已稀释至每lml含150 CH50的补体
200μl，混匀后立即照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)在波长541nm处测定起始
吸光度(A。)，之后，每隔1分钟测定1次，即得供试品在波长541nm处的吸光度与
时间的溶血反应动力学曲线。当吸光度越过了曲线的内曲点后即可停止测量。
分别取参考品及阴性对照(牛白蛋白一巴比妥缓冲液)O·9ml，自“加敏化红细胞悬
液O．1ml※’起，同法操作。按公式(1)分别计算出参考品、供试品和阴性对照曲线
斜率。按公式(2)计算供试品激活补体的功能指数(IFc)。
S※=Sexp/As (1)
IFc=Sc※-Sc※/Sr※-Sc※ *100% (2)
式中S※为用As修正Sexp得到曲线斜率；
As分别为供试品、参考品、阴性对照在波长
541nm处测定的起始吸光度；
Sexp分别为供试品、参考品及阴性对照各自的溶血反应动力学曲线分别计算出
的相邻三点间的曲线最大斜率；
IFc为供试品激活补体的功能指数；
Ss※为供试品曲线斜率;
Sr※为参考品曲线斜率；
Sc※为阴性对照曲线斜率。
页码数,2005版药典附录第36页
附录ⅥR人免疫球蛋白类制品IgG单体加二聚体测定法
本法系用分子排阻色谱法测定人免疫球蛋白类制品IgG单体加二聚体含量。
照分子排阻色谱法(附录ⅢD)测定。
色谱条件和系统适用性试验用亲水硅胶高效体积排阻色谱柱(SEC，排阻极
限300kD，粒度10#m)，柱直径7．5mm，长60cm。以含1％异丙醇的pH 7．O O．
2mol／L磷酸盐缓冲液[取0．5mol／L磷酸二氢钠200ml、O．5mol／L磷酸氢二钠
420m1、异丙醇15．5ml及水914．5ml，混匀]为流动相，检测波长为280nm，流速为
每分钟O．6ml。取每lml含蛋白质为4mg的白蛋白溶液20μ1，注入色谱柱，记录色
谱图，白蛋白单体峰与二聚体峰间的分离度应大于1．5，拖尾因子按白蛋白单
体峰计算应为O．95～1．40。
测定法取供试品适量，用流动相稀释成每lml约含蛋白质4mg的溶液，取20μ1，
注入色谱柱，记录色谱图60分钟。按面积归一法计算，色谱图中单体加二聚体
峰的含量，即为IgG单体加二聚体含量。图谱各峰的界限为两峰间最低点到基
线的垂直线。主峰为IgG单体；相对保留时间约0．85的峰为二聚体。
页码数,2005版药典附录第63页
附录X o人免疫球蛋白中白喉抗体效价测定法
本法系依据绵羊红细胞经醛化和鞣酸化处理后，具有较强的吸附蛋白质的
能力，能将白喉类毒素吸附于红细胞表面上，若遇到供试品中相应抗体，会发
生抗原抗体结合，产生特异性凝集，通过比较凝集反应终点测定供试品中白喉
抗体效价。
试剂 (1)1％兔血清生理氯化钠溶液无菌采集兔全血，分离血清，置56℃ 30分
钟灭能。取O．5ml兔血清加49．5ml生理氯化钠溶液，混匀。
(2)白喉抗体诊断红细胞悬液用1％兔血清生理氯化钠溶液复溶冻干白喉抗体
诊断红细胞至5％悬液。
白喉抗体标准品溶液的制备用1％兔血清生理氯化钠溶液将白喉抗体标准品
稀释至每lml含O．2 HAU。
供试品溶液的制备用1％兔血清生理氯化钠溶液将供试品稀释4倍。
测定法在UV型血凝板上，用1％兔血清生理氯化钠溶液将供试品溶液做2倍
系列稀释，每孔留25μ1，再向每孔加25μ1白喉抗体诊断红细胞悬液，置振荡器
混匀30～60秒，放湿盒内37℃结合1小时。
在UV型血凝板上，用1℃兔血清生理氯化钠溶液将白喉抗体标准品溶液做2倍
系列稀释，每孔留25μl，自再向每孔加25／11白喉抗体诊断红细胞悬液起，同法
操作。
在UV型血凝板上，加1％兔血清生理氯化钠溶液25tμ1，自再向每孔加25pl白喉
抗体诊断红细胞悬液起，同法操作，为阴性对照。
阴性对照孔呈典型的"-",”，否则试验不成立，应重试。以出现"++"为判定终
点。按下式计算供试品白喉抗体效价
供试品白喉抗体效价(HAU／g)=E*D/F
式中E为出现"++"的最高稀释倍数的标准品的白喉
抗体效价，HAU／ml；
D为出现“++”的供试品的最高稀释倍数；
F为静注人免疫球蛋白供试品IgG含量(g／m1)；
或人免疫球蛋白供试品蛋白含量(g／m1)。
【附注】(1)判定标准
"-"红细胞集中在孔底中央，呈一边缘光滑致密的小红点；
"+"大部分红细胞沉于孔底中央，周围有少量的红细胞；
"++"红细胞部分凝集，孔底中央有一疏松的小红圈；
"+++"大部分红细胞凝集呈均匀分布，孔底中央有很弱的小红圈；
"++++"红细胞凝集呈均匀分布。
(2)血凝板孔要保持清洁干净，避免表面磨损，否则红细胞不易下沉，易出现
假阳性。
页码数,2005版药典附录第54页
附录ⅨN人凝血酶活性检查法
本法系依据凝血酶能使人纤维蛋白原凝固原理，将供试品和人纤维蛋白原
混合，观察是否产生凝块，以此判定供试品是否具有凝血酶活性。
试剂 (1)0．5％纤维蛋白原溶液用生理氯化钠溶液将复溶的冻干人纤维蛋白
原溶液稀释成每lml含5mg的溶液。
(2)人凝血酶溶液用生理氯化钠溶液将复溶的冻干人凝血酶稀释成每lml中含
0．5IU的溶液。
测定法取供试品O．2ml，加0．5％纤维蛋白原溶液O．2ml，37℃放置24小时，
观察有无凝块或纤维蛋白析出。放置期间至少观察2次。同时做阴性及阳性对
照。
(1)阴性对照 用O．2ml生理氯化钠溶液替代供试品，同法操作。
(2)阳性对照用O．2ml凝血酶溶液(每lml含O．5IU)替代供试品，同法操作。
结果判定阴性对照无任何凝块或纤维蛋白析出，阳性对照应有凝块或纤维
蛋白析出，则试验成立。肉眼观察供试品应无凝块或纤维蛋白析出。
【附注】含肝素的供试品应根据肝素含量，用适量的硫酸鱼精蛋白中和供试
品内的肝素(按10μg硫酸鱼精蛋白中和IIU肝素进行)，再取供试品照上述方法检
查。
页码数,2005版药典附录第60页
附录X J人凝血因子Ⅱ效价测定法(一期法)
本法系用人凝血因子Ⅱ缺乏血浆为基质血浆，采用一期法测定供试品人凝
血因子Ⅱ效价。
试剂 (1)稀释液取巴比妥钠11．75g、氯化钠14．67g溶于适量水中，用lmol／L
盐酸溶液调pH值至7．3，再加水稀释至2000ml。临用前，加适量20％人血白
蛋白至终浓度为1％。
(2)含钙促凝血酶原激酶(Thromboplastin)
(3)人凝血因子Ⅱ缺乏血浆人凝血因子Ⅱ含量低于1％的人血浆或人工基质血
浆。
人凝血因子Ⅱ标准溶液的制备用 人凝血因子Ⅱ缺乏血浆将标准品稀释成
每lml含1IU凝血因子Ⅱ，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰
浴备用。
供试品溶液的制备用人凝血因子Ⅱ缺乏血浆将供试品稀释成每lml约含IIU凝
血因子Ⅱ，再用稀释液进行10倍、20倍或40倍稀释，置冰浴待用。
测定法取供试品溶液O．1ml，加人凝血因子Ⅱ缺乏血浆0．1ml，混匀，置37℃
水浴中保温一定时间(一般3分钟)，然后加已预热至37℃含钙促凝血酶原激酶溶
液0．2ml，记录凝固时间。
用不同稀释度的人凝血因子Ⅱ标准溶液O．1ml替代供试品溶液，同法操作。
将人凝血因子Ⅱ标准溶液效价(IU／m1)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数
进行直线回归处理，求出直线回归方程，计算供试品溶液人凝血因子Ⅱ效价，
再乘以稀释倍数，即为供试品人凝血因子Ⅱ效价(IU／m1)。
【附注】(1)直线回归相关系数应不低于O．98。
(2)测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10％，否则
重测。
(3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。
(4)采用全自动凝血仪操作，按仪器使用说明书进行。
页码数,2005版药典附录第61页
附录X K人凝血因子Ⅶ效价测定法(一期法)
本法系用人凝血因子Ⅶ缺乏血浆为基质血浆，采用一期法测定供试品人凝
血因子Ⅶ效价。
试剂 (1)稀释液 取巴比妥钠11．75g、氯化钠14．67g，溶于适量水中，用
1mol／L盐酸溶液调pH值至7．3，再加水至2000ml。临用前加适量20％人血白蛋白
至终浓度为1％。
(2)含钙促凝血酶原激酶(Thromboplastin)
(3)人凝血因子Ⅶ缺乏血浆人凝血因子Ⅶ含量低于1％的人血浆或人工基质血
浆。
人凝血因子Ⅶ标准溶液的制备用人凝血因子Ⅶ缺乏血浆将标准品稀释成每
1ml含IIU凝血因子Ⅶ，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰浴
备用。
供试品溶液的制备用人凝血因子Ⅶ缺乏血浆将供试品稀释成每1ml约含1IU凝
血因子Ⅶ，再用稀释液进行10倍、20倍或40倍稀释，置冰浴待用。
测定法取供试品溶液0．1ml，加人凝血因子Ⅶ缺乏血浆O．1ml，混匀，置37℃
水浴保温一定时间(一般3分钟)，然后加入已预热至37℃含钙促凝血酶原激酶溶
液0．2ml，记录凝固时间。
用不同稀释度的人凝血因子Ⅶ标准溶液O．1ml替代供试品溶液，同法操作。
将标准溶液人凝血因子Ⅶ效价(IU／m1)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数
进行直线回归处理，求出直线回归方程，计算供试品溶液人凝血因子Ⅶ效价，
再乘以稀释倍数，即为供试品人凝血因子Ⅶ效价(IU/m1)。
【附注】(1)直线回归相关系数应不低于0．98。
(2)测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10％，否则重
测。
(3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。
(4)采用全自动凝血仪操作，按仪器使用说明书进行。
页码数,2005版药典附录第62页
附录X N人凝血因子Ⅷ效价测定法(一期法)
本法系用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆为基质血浆，采用一期法测定供试品人凝
血因子Ⅷ效价。
试剂 (1)3．8％枸橼酸钠溶液 取无水枸橼酸钠9．5g，加水溶解并稀释至250ml。
(2)咪唑缓冲液(pH 7．3)取咪唑O．68g和氯化钠1．17g，加水使溶解成r00ml，加
入O．1mol／L盐酸溶液42．2ml，再加水稀释至200ml，即得。
(3)稀释液取1体积的3．8％枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20％
人血白蛋白至终浓度为1％。
(4)激活的部分凝血活酶(APTT)试剂
(5)人凝血因子Ⅷ缺乏血浆为人凝血因子Ⅷ含量低于1％的人血浆或人工基质
血浆。
(6)O．05mol／L氯化钙溶液 取氯化钙(CaCl2·2H20)147g，加水溶解并稀释至
1000ml，配制成1mol／L氯化钙贮存液，用前用水稀释20倍，配制成O．05mol／L
氯化钙溶液。
人凝血因子Ⅷ标准溶液的制备用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将标准品稀释成每
lml含1IU凝血因子Ⅷ，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰
浴待用。
供试品溶液的制备用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将供试品稀释成每lml约含1IU凝
血因子Ⅷ，再用稀释液进行10倍和20倍或40倍稀释，置冰浴待用。
测定法取激活的部分凝血活酶试剂O．1ml，置37℃水浴保温一定时间(一般4
分钟)，加人凝血因子Ⅷ缺乏血浆0．1ml、供试品溶液0．1ml，混匀，置37℃水浴
保温一定时间(一般5分钟)，加已预热至37℃ 0．05mol／L氯化钙溶液0．1ml，记录
凝固时间。
用不同稀释度的人凝血因子Ⅷ标准溶液O．1ml替代供试品溶液，同法操作。
将标准溶液人凝血因子Ⅷ效价(IU／m1)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数进
行直线回归处理，求出直线回归方程。计算供试品溶液人凝血因子Ⅷ效价，再
乘以稀释倍数，即为供试品人凝血因子Ⅷ效价(IU／m1)。
【附注】(1)直线回归相关系数应不低于0．98。
(2)测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10％，否则重
测。
(3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。
(4)采用全自动凝血仪操作，按仪器使用说明书进行。
页码数,2005版药典附录第61页
附录X L人凝血因子Ⅸ效价测定法(一期法)
本法系用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆为基质血浆，采用一期法测定供试品人凝
血因子Ⅸ效价。
试剂 (1)3．8％枸橼酸钠溶液称取无水枸橼酸钠9．5g，加水溶解并稀释至
250ml。
(2)咪唑缓冲液(pH 7．3)称取咪唑O．68g、氯化钠1．17g，溶于100ml水中，加
入0．1mol／L盐酸溶液42．2ml，再加水稀释至200ml，即得。
(3)稀释液取1体积的3．8％枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液，混合，加适量
20％人血白蛋白至终浓度为1％。
(4)激活的部分凝血活酶(APTT)试剂
(5)人凝血因子Ⅸ缺乏血浆为人凝血因子Ⅸ含量低于1％的人血浆或人工基质
血浆。
(6)0．05mol／L氯化钙溶液 取氯化钙(CaCl2·2H2 O)147g，加水溶解并稀释至
1000ml，配制成lmol／L氯化钙贮存液。临用前，用水稀释20倍，配制成
0．05mol／L氯化钙溶液。
人凝血因子Ⅸ标准溶液的制备 用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆将标准品稀释成每
lml含1IU凝血因子Ⅸ，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰
浴待用。
供试品溶液的制备若供试品中含有肝素，先用硫酸鱼精蛋白中和供试品中的
肝素。测定时先用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆稀释成每lml约含1IU凝血因子Ⅸ，再用
稀释液进行10倍、20倍或40倍稀释，置冰浴待用。
测定法取激活的部分凝血活酶试剂0．1ml，置37℃水浴中保温一定时间(一般
4分钟)，加人凝血因子Ⅸ缺乏血浆0．1ml、供试品溶液0．1ml，混匀，置37℃水浴
中保温一定时间(一般5分钟)，加已预热至37~C的0．05mol／L氯化钙溶液0．1ml，
记录凝固时间。
用不同稀释度的人凝血因子Ⅸ标准溶液O．1ml替代供试品溶液，同法操作。
将标准溶液人凝血因子Ⅸ效价(IU／m1)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数
进行直线回归处理，求出直线回归方程，计算供试品溶液人凝血因子Ⅸ效价，
再乘以稀释倍数，即为供试品人凝血因子Ⅸ效价(IU/m1)。
【附注】(1)直线回归相关系数应不低于0．98。
(2)测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10％，否则重
测。
(3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。
(4)采用全自动凝血仪操作，按仪器使用说明书进行。
页码数,2005版药典附录第62页
附录X M人凝血因子X效价测定法(一期法)
本法系用人凝血因子X缺乏血浆为基质血浆，采用一期法测定供试品人凝血
因子X效价。
试剂 (1)稀释液 取巴比妥钠11．75g、氯化钠]4．67g，溶于适量水中，用lmol／L
盐酸溶液调pH至7．3，再加水稀释至2000ml。临用前加适量20％人血白蛋白至终
浓度为1％。 ’
(2)含钙促凝血酶原激酶(Thromboplastin)
(3)人凝血因子X缺乏血浆人凝血因子X含量低于1％的人血浆或人工基质血浆。
人凝血因子X标准溶液的制备用人凝血因子X缺乏血浆将标准品稀释成每lml
含1IU凝血因子X，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰浴
备用。
供试品溶液的制备用人凝血因子X缺乏血浆将供试品稀释成每lml约含1IU凝
血因子X，再用稀释液进行10倍和20倍或40倍稀释，置冰浴待用。
测定法取供试品溶液0．1ml，加人凝血因子X缺乏血浆O．1ml，混匀，置3℃
水浴中保温一定时间(一般3分钟)，然后加入已预热至37℃含钙促凝血酶原激酶
溶液0．2ml，记录凝固时间。
用不同稀释度的人凝血因子X标准溶液0．1ml替代供试品溶液，同法操作。
将标准溶液人凝血因子X效价(IU／m1)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数
进行直线回归处理，求出直线回归方程，计算供试品溶液人凝血因子X效价，
再乘以稀释倍数，即为供试品人凝血因子X效价(IU／m1)。
【附注】(1)直线回归相关系数应不低于O．98。
(2)测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10％，否则
重测。
(3)直接与标准品、供试品和血浆接触的器皿应为塑料制品或硅化玻璃制品。
(4)采用全自动凝血仪操作，按仪器使用说明书进行。
页码数,2005版药典附录第36页
附录ⅥQ人血白蛋白多聚体测定法
本法系用分子排阻色谱法测定人血白蛋白多聚体含量。
照分子排阻色谱法(附录ⅢD)测定。
色谱条件与系统适用性试验用亲水硅胶高效体积排阻色谱柱(SEC，排阻极
限300kD，粒度10μm)，柱直径附录Ⅶ A磷测定法7．5mm，长30cm或60cm；以含1％
异丙醇的pH7．O O．2mol／L磷酸盐缓冲液[取0．5mol／L磷酸二氢钠200ml、
0．5mol／L磷酸氢二钠420ml、异丙醇15．5ml及水914．5ml，混匀]为流动相；检测
波长为280nm；流速为每分钟0．6ml。取每lml含蛋白质为4mg的白蛋白溶液20μ1，
注入色谱柱，记录色谱图，白蛋白单体峰与二聚体峰间的分离度应大于1．5，
拖尾因子按白蛋白单体峰计算应为O．95～1．40。
测定法取供试品适量，用流动相稀释成每lml约含蛋白质4mg的溶液，取20μl，
注入色谱柱，记录色谱图30分钟(色谱柱长30cm)或60分钟(色谱柱长60cm)。
按面积归一法计算，色谱图中未保留(全排阻)峰的含量(％)除以2，即为人血
白蛋白多聚体含量。
页码数,2005版药典附录第41页
附录ⅦK人血白蛋白铝残留量测定法
本法系用原子吸收分光光度法测定人血白蛋白制品中残留的铝含量。
测定法按表1精密量取供试品、100ng／ml标准铝溶液(精密量取100μg／m1标准
铝溶液O．1ml，置100ml量瓶中，用O．15mol／L硝酸溶液稀释至刻度)，分别制备
空白对照溶液、供试品溶液和标准铝加供试品的混合溶液。照原子吸收分光
光度法(附录ⅡB)测定，选择铝灯，测定波长为309．3nm、狭缝为O．7nm。按表
2设置石墨炉的干燥、灰化、原子化等炉温程序，精密量取空白对照溶液、供
试品溶液和标准铝加供试品的混合溶液各30bd，分别注入仪器，读数。按下式
计算
供试品铝含量(μg／L)=20*(S0一B)×12．5/S-S0
式中 B为空白对照溶液读数；
S0为供试品溶液读数；
S为标准铝加供试品的混合溶液读数；
20为标准铝加供试品的混合溶液中标准铝的含量,μg／L；
12．5为供试品稀释倍数。
表1空白、供试品及混合溶液的制备
┏━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━┓
┃ ┃空白对照溶液┃供试品溶液 ┃混合溶液 ┃
┣━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃供试品／ml ┃ ┃ O．2 ┃ O．2 ┃
┃标(100 ng／m1)／ml ┃ —— ┃ _—— ┃ O．5 ┃
┃ O．3mol／L HN03／rnl ┃ 2．5 ┃ 2．3 ┃ 1．8 ┃
┗━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━┛
表2炉温控制程序
┏━━━━┳━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━━┓
┃ ┃ ┃ ┃ 时间／秒 ┃
┃ 程序 ┃ 步骤 ┃ 温度／℃ ┃ ┃
┃ ┃ ┃ ┃ 爬坡时间+保持时间 ┃
┃ 1 ┃ 预热 ┃ 80 ┃ 0+10 ┃
┃ 2 ┃ 干燥 ┃ 220 ┃ 120+5 ┃
┃ 3 ┃ 灰化 ┃ 1200 ┃ 10+20 ┃
┃ 4 ┃ 原子化 ┃ 2600 ┃ 0+5 ┃
┃ 5 ┃ 清除 ┃ 2650 ┃ 0+5 ┃
┗━━━━┻━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━━┛
【附注】 (1)供试品和标准铝取量可根据仪器性能进行适当调整，使读数在所
用仪器可准确读数范围内。
(2)表2列出的炉温控制程序可根据仪器性能作适当调整。
(3)尽量避免使用玻璃容器。
页码数,2005版药典附录第55页
附录ⅨR 人血小板抗体测定法
本法系采用血小板与血小板抗体结合后，使血小板发生凝集的原理。通过
比较凝集反应终点测定供试品中人血小板抗体效价。
试剂(1)5％乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝剂取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)
0．365g、磷酸二氢钾O．875g、氯化钠2．125g、7-胺四乙酸二钠(EDTA-Na2．
2H2 O)12．5g，加水溶解并稀释至250ml。
(2)O．33％EDTA溶液称取磷酸氢二钠(Na2HPO4．12H2 0)0．73g、磷酸二氢钾
1．75g、氯化钠4．25g、乙二胺四乙酸二钠(EUFA-Na2·2H2O)1．65g、加水溶解并稀
释至500ml。
(3)血小板稀释液取3人份以上AB型血清混合，56℃灭能30分钟，按AB型血清
每100ml加硫酸钡50g的比例加人硫酸钡，置37℃吸附1小时，随时搅动，然后以每
分钟3000转离心30分钟，弃去沉淀，吸上清液备用。
试验当天按1份血清加3份生理氯化钠溶液配成血小板稀释液(注意AB型血清
中不得混有红细胞及溶血)。
(4)血小板悬液的制备采集人静脉血20ml，按5％EDTA溶液与全血以1：9的比例
混合，在20℃以每分钟800转离心15分钟，取上层血浆加0．33％EDTA溶液至原全
血体积，于20℃每分钟1500转离心10分钟，弃去上清液，如此再重复用O．33％
EDTA洗涤2次，弃上清液，向沉淀中加血小板稀释液0．5ml，混匀，计数并将血
小板浓度调至2．5×103～3．5×10 5／mm3即可(注意：计数时血小板悬液应在计数
板上静置2～3分钟，并在10分钟内计数完)。
供试品溶液的制备用生理氯化钠溶液将供试品进行2倍系列稀释至1：16。
阳性对照溶液的制备 取经人血小板免疫的猪血浆(或兔血清)0．5ml 60℃灭能
10分钟，用硫酸钡0．05g于37℃吸附15分钟后，以每分钟3000转离心20分钟，取
上清液备用。
阴性对照溶液 生理氯化钠溶液及血小板稀释液。
测定法取不同稀释度供试品溶液各O．1ml，分别加血小板悬液0．1ml，在37℃
保温30分钟后，滴到计数板上，静置2～3分钟，在20～40倍显微镜下观察结果。
本试验同时设阴性、阳性对照组。
(1)阳性对照取阳性对照溶液0．1ml，自“加血小板悬液O．1ml※’起，同法操作。
(2)阴性对照取阴性对照溶液0．1ml，自“加血小板悬液0．1ml”起，同法操作。
结果判定阳性对照为“++”；阴性对照为“-”试验成立。以“+”为判定终点，即以
供试品出现“+”的最高稀释度为该供试品的血小板抗体效价。
【附注】(1)“-”无凝块或偶见2～3个血小板成串。
(2)‘‘+’’小凝块，3～5个血小板凝集，游离血板少。
(3)“++’’大凝块，6个以上血小板聚集，几乎游离血小板。
页码数,2005版药典附录第36页
附录ⅥP人血液制品中糖及糖醇测定法
本法系用高效液相色谱法测定人血液制品中糖及糖醇含量。
照高效液相色谱法(附录ⅢB)测定。
色谱条件与系统适用性试验用苯乙烯一二乙烯基苯共聚物为基质的阳离子
交换色谱柱(H+)，粒度9μm或8μm，内径7．8mm，柱长300 mm；柱温50℃(测定蔗
糖含量时，柱温为20～30℃)；流动相为O．004mol／L硫酸溶液，流速为每分钟
O．8 m1；示差折光检测器。取2％麦芽糖lml和1．5％磺基水杨酸lml的混合物
20μ1，注入色谱柱，记录色谱图，麦芽糖与磺基水杨酸两峰间的分离度应大
于1．5，拖尾因子按麦芽糖峰计算应为O·95～1·20。
对照品溶液的制备 (1)麦芽糖对照品溶液分别取经减压干燥至恒重的麦芽糖
对照品1·Og、2·0g、3·og，精密称定，各置100ml量瓶中，分别加水溶解并稀释至
刻度，摇匀，即得。
(2)葡萄糖对照品溶液分别取经减压干燥至恒重的葡萄糖对照品0．5g、
1．Og、1．5g，精密称定，各置100ml 量瓶中，分别加水溶解并稀释至刻度，摇
匀，即得。
(3)山梨醇对照品溶液分别取经减压干燥至恒重的山梨醇对照品0．5g、
1．Og、1．5g，精密称定，各置100ml 量瓶中，分别加水溶解并稀释至刻度，摇
匀，即得。
(4)蔗糖对照品溶液分别取经减压干燥至恒重的蔗糖对照品1．Og、2．0g、
3．0g，精密称定，各置100ml量瓶中，分别加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即
得。
供试品溶液的制备精密量取供试品lml，加1．5％磺基水杨酸4．0ml，混匀，
室温放置至少2小时，以每分钟3000转离心10分钟，取上清液，即得。
测定法精密量取对照品溶液与供试品溶液，分别注.入液相色谱仪，记录色
谱图；进样量为20μ1。
以各对照品溶液浓度(mg)对峰面积作直线回归，求得回归方程，计算出供试
品溶液中糖或糖醇含量(A)，再按下列公式计算
供试品糖或糖醇含量(g／L)=A*n/进样量（ml）
式中 A为供试品溶液中糖或糖醇含量；
n为供试品稀释倍数。
【附注】 (1)根据供试品的糖含量，对照品和供试品的取量可作适当调整。
(2)直线回归相关系数应不低于O．999。
(3)不同厂家的阳离子交换色谱柱(H+)的流速、流动相、柱温等会有所不同，
可根据色谱柱说明书对色谱条件进行适当调整。
页码数,2005版药典附录第65页
附录ⅪA人用狂犬病疫苗效价测定法(NIH法)
本法系将供试品免疫小鼠后，产生相应的抗体，通过小鼠抗体水平的变化
测定供试品的免疫原性。
试剂 稀释液(PBS) 量取0．9％磷酸二氢钾溶液75ml、2．4％磷酸氢二钠
(Na2HP()4·12H20)溶液425ml、8．5％氯化钠溶液500ml，混合后加水至5000ml，调pH值
至7．2～8．O。
攻击毒株CVS制备启开毒种，稀释成10-2悬液，接种11～13g小鼠，不少于8只，
每只脑内接种0．03ml，连续传2～3代，选择接种4～5天有典型狂犬病症状的小
鼠脑组织，研磨后加入含2％马血清或小牛血清制成20％悬液，经每分钟1000转
离心10分钟，取上清液经病毒滴定(用10只18～20g小鼠滴定)及无菌检查符合规定
后作攻击毒用。
参考疫苗的稀释 参考疫苗用PBS稀释成1：25、1：125和1：625等稀释度。
供试品溶液的制备供试品用PBS做5倍系列稀释，一般稀释成
1：5、1：25、1：125和1：625等稀释度。
测定法用不同稀释度的供试品及参考疫苗分别免疫14～16g小鼠16只，每只
小鼠腹腔注射0．5ml，间隔1周再免疫1次。
小鼠于第一次免疫后14天，用经预先测定的含5～100个LD50的病毒量进行脑
内攻击，每只0．03ml。同时将攻击毒稀释成1、10-1、10-2和10-3进行毒力滴定，
每个稀释度均不少于8只小鼠。小鼠攻击后逐日观察14天，并记录死亡情况，统
计第5天后死亡和呈典型脑症状的小鼠。
页码数,2005版药典附录第69页
附录ⅪH肉毒抗毒素效价测定法(小鼠试验法)
本法系根据抗毒素能中和毒素的作用，将供试品与标准品做系列稀释，分
别与肉毒毒素结合后，注入小鼠体内，在规定时问内观察小鼠存活和死亡情
况，以测定供试品效价。
试剂稀释液称取磷酸二氢钾0．7g、磷酸氢二钠(Na2 HP04·12H20)2．4g、氯化
钠6．8g，用注射用水溶解并稀释至1000ml，加明胶2．0g，溶解后过滤。灭菌后
pH值应为6．2～6．8。
肉毒抗毒素标准品溶液的制备将肉毒抗毒素标准品用生理氯化钠溶液溶解
后，与中性甘油(经116℃ 10分钟灭菌)等量混合，稀释至一定浓度，于2～8℃避
光处保存。使用前，将肉毒抗毒素标准品溶液用稀释液稀释至每lml含效价如测
定参数表所示。原液的一次吸取量应不低于0．5ml。
肉毒毒素溶液的制备 肉毒毒素由国家药品检定机构提供，亦可自备。试验
用的肉毒毒素须以国家药品检定机肉毒抗毒素效价测定参数表构分发的肉毒抗
毒素标准品准确标定其试验量(见测定参数表)，并每3个月复检1次。使用前，将
肉毒毒素用稀释液稀释至每lml含5个毒素试验量。
供试品溶液的制备供试品用稀释液稀释成数个稀释度，使每lml约含测定参数
表所示单位。稀释度之间隔约为5％～10％。
测定法精密量取肉毒抗毒素标准品溶液O．8ml、1．0ml、1．2m1分别加入小试
管中，再依次分别补加稀释液O-7ml、O．5ml、O．3ml。精密量取不同稀释度的供
试品溶液各1．0m1分别加入小试管中，每管补加稀释液0．5ml。以上各管分别加
入肉毒毒素稀释液1．0ml，混合均匀，加塞，37℃结合45分钟，按测定参数表所
示剂量与途径，立即注射体重14～16g小鼠，每稀释度注射小鼠4只。
结果判定注射后，每天上、下午各观察试验动物1次，并记录发病及死亡情
况，连续4天。以标准品组动物50％死亡终点比较供试品组动物的50％保护终
点，推算供试品的效价。
有下列情况之一者应重试：
(1)标准品组动物无死亡或全死亡，而无法计算50％死亡终点；
(2)供试品组动物无死亡或全死亡，而无法计算50％保护终点；或死亡极不规
律或死亡极不规律
(3)每稀释度注射的动物中有2只以上属非特异死亡。
【附注】(1)自备毒素的制法(包括菌种、培养基、培养条件及干燥方法等)应
与国家药品检定机构分发者相同。
(2)使用干燥毒素时，须精密称定，每次称量应不低于10mg，溶解后应一次用
完。剩余的干燥毒素应封存于装有干燥剂的真空器皿中。亦可用干燥毒素制成
液体毒素，即干燥毒素以生理氯化钠溶液溶解，与中性甘油(经116℃ 10分钟灭
菌)等量混合，每lml至少含20个试验量。毒素应保存于2～8℃避光处。
页码数,2005版药典附录第8页
附录I G软膏剂、乳膏剂
软膏剂系指以生物制品原液或经干燥后制成的干粉为原料药物，与油脂性
或水溶性基质混合制成的半固体外用制剂。因药物在基质中分散状态不同，有
溶液型软膏剂和混悬型软膏剂之分。溶液型软膏剂为药物溶解(或共熔)于基质
或基质组分中制成的软膏剂；混悬型软膏剂为药物细粉均匀分散十基质中制成
的软膏剂。
乳膏剂 系指以生物制品原液或经十燥后制成的干粉为原料药物，分散或溶
解于乳液型基质中形成均匀的半固体外用制剂。乳膏剂由于基质不同，可分为
水包油型乳膏剂与油包水型乳膏剂。
软膏剂、乳膏剂在生产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产和质量控制应符合相关品种
要求。
二、软膏剂、乳膏剂选用基质应根据各剂型的特点、药物的性质、制剂的
疗效和产品的稳定性。基质也可由不同类型基质混合组成。
软膏剂的基质可分为油脂性基质和水溶性基质，油脂性基质常用的有凡士
林、石蜡、液状石蜡、硅油、蜂蜡、硬脂酸、羊毛脂等。水溶性基质主要有聚
乙二醇。
乳膏剂基质可分为水包油型乳化剂与油包水型乳化剂。水包油型乳膏剂常
用乳化剂有钠皂、三乙醇胺皂类、脂肪醇硫酸(酯)钠类(十二烷基硫酸钠)和聚山
梨酯类。油包水型乳膏剂常用乳化剂有羊毛脂、单甘油酯、脂肪醇等。
三、软膏剂与乳膏剂基质应均匀、细腻，涂于皮肤或黏膜上应无刺激性。
混悬型软膏剂中不溶性固体药物成分，应预先用适宜的方法磨成细粉，确保粒
度符合规定。
四、软膏剂与乳膏剂根据需要可加入保湿剂、防腐剂、增稠剂、抗氧剂及
透皮促进剂。
五、软膏剂、乳膏剂用于大面积烧伤及严重损伤的皮肤时，基质与产品
均应进行无菌处理。
六、软膏剂、乳膏剂应具有适当的黏稠度。应易涂布于皮肤或黏膜上，
不融化，黏稠度随季节变化应很小。
七、软膏剂与乳膏剂应无酸败、异臭、变色、变硬，乳膏剂不得有油水
分离现象。
八、软膏剂、乳膏剂所用内包装材料，不应与药物或基质发生物理化学
变化，无菌产品的内包装材料应无菌。
九、除另有规定外，软膏剂、乳膏剂应置2～8℃避光密闭保存和运输。
软膏剂、乳膏剂应进行以下相应检查。
【粒度】 除另有规定外，混悬型软膏剂取适量的供试品，涂成薄层，薄
层面积相当于盖玻片面积，共涂三片，照粒度测定法(附录V G)检查，均不得检
出大于180μm的粒子。
【装量】 照最低装量检查法(附录V F)检查，应符合规定。
【微生物限度】 照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符合规定。
凡规定进行无菌检查的软膏剂、乳膏剂可不进行微生物限度检查。
【无菌】 除另有规定外，软膏剂与乳膏剂用于大面积烧伤及严重损伤的
皮肤时，照无菌检查法(附录ⅫA)检查，应符合规定。
页码数,2005版药典附录第35页
附录Ⅵo三氯甲烷测定法
本法系将三氯甲烷经乙醚提取后，加入碱性吡啶，水浴加温生成红色化合
物，用比色法测定供试品中三氯甲烷含量。
测定法精密量取供试品lml，置5ml量瓶中，加水稀释至刻度，即为供试品
溶液。精密量取供试品溶液O．5ml，置具塞试管中，加无过氧化物的乙醚18ml，
猛烈振摇3分钟，静置。精密量取乙醚提取液5ml置具塞试管中，加碱性吡啶[取
20％氢氧化钠溶液与吡啶以2：5(ml／m1)混合，振摇至呈碱性，放置分层，取上
清液，如吡啶显红色，需重蒸馏。临用配制]5ml，混匀，置80~C水浴中加热8分
钟，取出后用水冷却，加水至12ml,充分振摇，静置分层，倾去上层液，照紫
外一可见分光光度法(附录ⅡA)在波长520nm处测定吸光度。
精密量取三氯甲烷lml，置100ml量瓶中，用乙醇稀释至刻度，临用前，用水
定量稀释至0．1％，即为对照品溶液。精密量取三氯甲烷对照品溶液0·lml、
0·2ml、O．3ml、O．4ml、O．5ml，分别置于5支具塞试管中，加水至o．5ml，自"加
无过氧化物的乙醚18ml"起，同法操作，测定各管的吸光度。
以三氯甲烷对照品溶液的系列浓度对相应的吸光度作直线回归，将供试品
溶液的吸光度代人回归方程，测定供试品中三氯甲烷含量。
【附注】 (1)配制碱性吡啶的氢氧化钠须不含碳酸钠，否则有浑浊现象。
(2)可用于限量试验。
书页号：2005版药典三部附录10页
附录I K散剂
散剂 系指以生物制品原液经干燥后制成的干粉为原料药物或加入适宜辅料
经粉碎、均匀混合制成的干燥粉末状制剂。
口服散剂一般溶于或分散于水、稀释液或其他液体小服用，亦可直接用水
送服。
散剂在生产和贮藏期间应符合卜列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产及质量控制应符合相关品种
要求。
二、供制散剂的成分应经干燥、制成干粉并粉碎成细粉。散剂应干燥、疏
松、混合均匀、色泽一致。
三、散剂中可含有或不含辅料。口服散剂需要时亦可加矫味剂、芳香剂、
着色剂等。
四、为防止胃酸对散剂中活性成分的破坏，散剂稀释剂中可调配中和胃酸
的成分。
五、散剂可单剂量包装也可多剂量包(分)装，多剂量包装者应附分剂量的用
具。
六、含挥发性药物或可吸潮药物的散剂应采用防潮材料包装。
七、除另有规定外，散剂应置2～8℃密封贮存和运输。
散剂应进行以下相应检查。
【粒度】 除另有规定外，取供试品10 g，精密称定，置七号筛(125μm)，筛上
加盖，并在筛下配有密合的接受容器。照粒度测定法(附录V G)单筛分法检查。
精密称定通过筛网的粉末重量，应不低于95％。
【外观均匀度】 取供试品适量，置光滑纸上，平铺约5cFn2，将其表面压平，
在亮处观察，应呈现均匀的色泽、无花纹与色斑。
【干燥失重】 除另有规定外，取供试晶照干燥失重测定法(附录ⅦL)测定，
在105℃干燥至恒重，减失重量不得过2．0％。
【装量差异】 单剂量包装的散剂装最差异限度，应符合规定。
检查法取散剂10包(瓶)，除去包装，分别精密称定每包(瓶)内容物的重量，
求出内容物的装量与甲均装量，每包(瓶)装量与甲均装量相比较r凡无含量测
定的散剂，每包(瓶)装量应与标示装量相比较]，超出装量差异限度的散剂小
得多于2包(瓶)．并不得有1包(瓶)超出装量差异限度的1倍。
凡规定检查含量均匀度的散剂，检查。
【装量】 多剂量包装的散剂，(附录V F)检查，应符合规定。可不进行装量
差异的照最低装量检查法
【微生物限度】 除另有规定外，照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符
合规定。
凡规定做杂菌检查的散剂不进行本项检查。
页码数,2005版药典附录第15页
附录Ⅲ 色谱法
色谱法根据其分离原理可分为：吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法
与排阻色谱法等。吸附色谱法是利用被分离物质在吸附剂上吸附能力的不同，
用溶剂或气体洗脱使组分分离；常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸
附活性的物质。分配色谱是利用被分离物质在两相中分配系数的不同使组分分
离，其中一相被涂布或键合在固体载体上，称为固定相，另一相为液体或气
体，称为流动相；常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。
离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上交换能力的不同使组分分
离；常用的树脂有不同强度的阳离子交换树脂、阴离子交换树脂，流动相为水
或含有机溶剂的缓冲液。分子排阻色谱法又称凝胶色谱法，是利用被分离物质
分子大小的不同导致在填料上渗透程度不同使组分分离；常用的填料有分子
筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，根据固定相和供试品的
性质选用水或有机溶剂作为流动相。
色谱法又可根据分离方法分为：纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色
谱法、高效液相色谱法等。所用溶剂应与供试品不起化学反应，纯度要求较
高。分析时的温度，除气相色谱法或另有规定外，系指在室温操作。分离后各
成分的检出，应采用各品种项下所规定的方法。采用纸色谱法、薄层色谱法或
柱色谱法分离有色物质时，可根据其色带进行区分；分离无色物质时，可在短
波(254nm)或长波(365nm)紫外光灯下检视，其中纸色谱或薄层色谱也可喷以显色剂
使之显色，或在薄层色谱中用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光猝灭法检
视。柱色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法可用接于色谱柱出口处的各种检
测器检测。柱色谱法还可分部收集流出液后用适宜方法测定．
页码数,2005版药典附录第45页
附录ⅧH伤寒Vi多糖分子大小测定法
本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数(KD)和多糖在规定KD值
以前的回收率。
试剂、色谱柱的制备与色谱柱标定 同附录ⅧG第二法。
测定法取供试品约lml(含多糖抗原3～5mg)，加于已标定的色谱柱中，用流动
相洗脱，流速为每小时15～20 m1，用组分收集器收集洗脱液，每管3～5ml。照
O-乙酰基含量测定法(附录ⅥF)，测定每管洗脱液中O-乙酰基的含量，求出O-乙
酰基含量最高时的洗脱体积，即为多糖主峰峰顶洗脱体积Ve。
按下式计算
KD=Ve-Vo/Vi-V0
式中KD为供试品分配系数；
Ve为供试品洗脱液体积，ml；
Vo为空流体积，ml；
Vi为柱床体积，ml。
计算供试品在KD值≤0．25的多糖回收率
Rx(％)=Ax/At×100％
式中Rx为KD值≤0．25供试品的多糖回收率(％)；
Ax为供试品在KD值≤0．25各管洗脱液等体积合并液的O-乙酰基含量；
At为供试品所有管洗脱液等体积合并液的0-乙酰基含量。
【附注】 过柱操作在10～20℃进行。
页码数,2005版药典附录第28页
附录V H渗透压摩尔浓度测定法
溶剂通过半透膜由低浓度溶液向高浓度溶液扩散的现象称为渗透，阻止渗
透所需施加的压力，称为渗透压。生物膜，例如人体的细胞膜或毛细血管壁，
一般具有半透膜的性质。在制备注射剂、滴眼剂等药物制剂时，必须考虑其渗
透压。对静脉输液、营养液、电解质或渗透利尿药(如甘露醇注射液)，应在标
签上注明溶液的渗透压摩尔浓度，以提供临床医生参考。
渗透压摩尔浓度的单位，通常以每千克溶剂中溶质的毫渗透压摩尔来表示，
可按下列公式计算毫渗透压摩尔浓度(mOsmol／kg)：
毫渗透压摩尔浓度(mOsmol／kg)一[每千克溶剂中
溶解溶质的克数／分子量]*n * 1000
式中，n为一个溶质分子溶解时形成的粒子数。在理想溶液中，例如葡萄糖
n=1，氯化钠或硫酸镁n=2，氯化钙n=3，枸橼酸钠n=4。
在生理范围及很稀的溶液中，其渗透压摩尔浓度与理想状态下的计算值偏差
较小；随着溶液浓度的增加，与计算值比较，实际渗透压摩尔浓度下降。例如
0．9％氯化钠注射液，按上式计算，毫渗透压摩尔浓度是2×1000×9／
58．4=308mOsmol／kg，而实际上在此浓度时氯化钠溶液的n稍小于2，其实际测得
值是286mOsmol／kg；复杂混合物，如水解蛋白注射液的理论渗透压摩尔浓度不
容易计算，因此通常采用实际测定值表示。
仪器 通常采用测量溶液的冰点下降来间接测定其渗透压摩尔浓度。在理想
的稀溶液中，冰点下降符合△Tf=Kf·m的关系，式中，△Tf为冰点下降，Kf为冰
点下降常数(当水为溶剂时为1．86)，m为重量摩尔浓度。而渗透压符合P0=Ko·m
的关系，式中，P。为渗透压，K。为渗透压常数，m为溶液的重量摩尔浓度。
由于两式中的浓度等同，故可以用冰点下降法测定溶液的渗透压摩尔浓度。
常用的所谓渗透压计即是采用冰点下降的原理设计的。
渗透压计由一个供试溶液测定试管、带有温度调节器的冷却装置和一对热
敏电阻组成。测定时将探头浸入试管的溶液中心，并降至冷却部分同时启动
冷却装置，使溶液结冰，仪器具有将被测得的温度(冰点)转换为电信号并显示
测量值的系统。
毫渗透压摩尔浓度的测定用一定体积(按仪器说明书规定)的水(新鲜制备)调
节零点，由下表选择两种校正用标准液(它们的渗透压摩尔浓度应跨于供试品
预计值的两侧)校正仪器，再测定供试溶液的毫渗透压摩尔浓度(或冰点下降)。
当供试溶液的毫渗透压摩尔浓度大于仪器的测定范围时，用适宜的溶剂稀释至
可测定的毫渗透压摩尔浓度范围内；供试品若为固体，先溶解于适宜的溶剂
中，再进行测定。
渗透压计校正用标准溶液的制备 按照表中所列数据，精密称取经500～650℃
干燥40～50分钟并置干燥器(硅胶)中放冷的氯化钠(基准试剂)一定量，加水lkg
溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。
┏━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━━━━┓
┃ 每lkg水中氯化 ┃毫渗透压摩尔浓度 ┃ 冰点下降 ┃
┃ 钠的重量／g ┃ ／mOsmol·kg-1 ┃ ／℃ ┃
┣━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━━━━┫
┃ 3．087 ┃ 100 ┃ O．186 ┃
┃ 6．260 ┃ 200 ┃ O．372 ┃
┃ 9．463 ┃ 300 ┃ O．558 ┃
┃ 12．684 ┃ 400 ┃ O．744 ┃
┃ 15．916 ┃ 500 ┃ O．930 ┃
┃ 19．147 ┃ 600 ┃ 1．116 ┃
┃ 22．380 ┃ 700 ┃ 1．302 ┃
┗━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━━━━━┛
毫渗透压摩尔浓度比的测定 供试品与0．9％(g／m1)氯化钠溶液的毫渗透压
摩尔浓度比率称为毫渗透压摩尔浓度比。用渗透压计分别测得供试品与标准溶
液的毫渗透压摩尔浓度OT与0s，并用下列公式计算毫渗透压摩尔浓度比：
毫渗透压摩尔浓度比=OT/OS
毫渗透压摩尔浓度比测定用标准溶液的制备 精密称取经500～650~C干燥
40～50分钟并置干燥器(硅胶)中放冷的氯化钠(基准试剂)0．900g，置100ml量瓶中，
加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
注射剂、滴眼剂等制剂处方中的氯化钠，其作用若主要为调节制剂的渗透
压，则可通过渗透压摩尔浓度的测定取代氯化钠的定量测定。
页码数,2005版药典附录第93页
附录XIIIC实验动物寄生虫学检测要求
本标准(引自GB 14922．1—2001)适用于地鼠、豚鼠、兔、犬、猴和清洁级及以
上小鼠、大鼠。
1．实验动物寄生虫学等级
(1)普通级动物Conventioml(CV)Animal不携带所规定的人兽共患寄生虫。
(2)清洁动物clean(CL)Animal 除普通动物应排除的寄生虫外，不携带对动物危害
大和对科学研究干扰大的寄生虫。
(3)无特定病原体动物Specific Pathogen Free(SPF)Animal除普通动物，清洁动物应排
除的寄生虫外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的寄生虫。
(4)无菌动物Garm Free(GF)Animal无可检出的一切生命体。
2．检测要求
(1)外观指标动物应外观健康，无异常。
(2)寄生虫学指标寄生虫学指标见表1、表2和表3。
表1小鼠和大鼠寄生虫学检测指标
动物等级 应排除寄生虫项目 动物种类
小鼠大鼠
无无 清 体外寄生虫(节肢动物)Ectoparasites ●●
菌特 洁 弓形虫Toxoplasma gondii ●●
动定 动 兔脑原虫Encephalitozoon cuniculi O O
物病 物 卡氏肺孢子虫Pneumocystis carinii O O
原 全部蠕虫All Helminths ●●
体 鞭毛虫Flagellates ●●
动 纤毛虫Ciliates ● ●
物
无任何可检测到的寄生虫 ● ●
注：●必须检测项目，要求阴性；o必要时检测项目，要求阴性。
表2豚鼠、地鼠和兔寄生虫学检测指标
动物等级 应排除寄生虫项目 动物种类
无无清 体外寄生虫(节肢动物)Ectopara- ● ●●
菌特洁 sites
动定动 弓形虫Toxoplasma gondii ● ●●
物病物 兔脑原虫Encephalitozoon cuniculi o o
原 爱美尔球虫Eimaria spp,o o
体 卡氏肺孢子虫Pneumocystis carinii ●
全部蠕虫 All Helminths ● ●●
鞭毛虫Flagellates ● ●●
纤毛虫Ciliates ●
无任何可检测到的寄生虫
注：●必须检测项目，要求阴性；o必要时检测项目，要求阴性。
表3犬和猴寄生虫学检测指标
动物等级 应排除寄生虫项目 动物种类
犬猴
无 普 体外寄生虫(节肢动物)Ectoparasites ●●
特 通 弓形虫Toxoplasma gondii ●●
定 动 全部蠕虫All Helminths ●●
病 物 溶组织内阿米巴 Entamoeba spp,O ●
原 疟原虫Plasmodium spp,●
体 鞭毛虫Flagellates ●●
注：●必须检测项目，要求阴性；o必要时检测项目，要求阴性。
页码数,2005版药典附录第92页
附录ⅫB实验动物微生物学检测要求
本标准(引自GB 14922．2—2001)适用于豚鼠、地鼠、兔、犬、猴和清洁级及以
上小鼠、大鼠。
1．实验动物微生物学等级分类
(1)普通级动物Conventional(CV)Animal 不携带所规定的人兽共患病病原和动物烈
性传染病的病原。
(2)清洁动物C1earl(CL)Animal除普通动物应排除的病原外，不携带对动物危害大
和对科学研究干扰大的病原。
(3)无特定病原体动物Specfic Pathogen Free(SPF)Animal除清洁动物应排除的病原外，
不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原。
(4)无菌动物Germ Free(GF)Anirnal无可检出的一切生命体。
2．检测要求
(1)外观指标动物应外观健康、无异常。
(2)病原菌指标 病原菌指标见表1、表2和表3。
(3)病毒指标病毒指标见表4、表5和表6。
附录92
表1小鼠、大鼠病原菌检测项目
动物等级 病 原 菌 动物种类
无无清 小鼠大鼠
菌特洁 沙门菌Salmonella spp,● ●
动定动 单核细胞增生性李斯特杆菌Listeria mono—o o
物病物 cytogenes
原 假结核耶尔森菌Yersinia pseudotuberculosis o o
体 小肠结肠炎耶尔森菌Yersinia enterocolitica o o
动 皮肤病原真菌Pathogenicdermal fungi o o
物 念珠状链杆菌Streptobacillusmoniliformis o o
支气管鲍特杆菌Bordetellabronchiseptica ●
支原体Mycoplasma spp,● ●
鼠棒状杆菌Corynebacterium kutscheri ● ●
泰泽病原体Tyzzer’s orgamnism ● ●
大肠埃希菌0115 a，C，K(B)Escherchia coli o
0115 a,C,K(B)
嗜肺巴斯德杆菌Pasteurella pneumtropica ● ●
肺炎克雷伯杆菌Klebsiella pneumomae ● ●
金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ● ●
肺炎链球菌Streptococcus pnemoniae o o
乙型溶血性链球菌Streptococcushemdytis-β o o
绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa o o
无任何可查到的细菌 ● ●
注：●必须检测项目，要求阴性；o必要时检查项目，要求阴性。
表2豚鼠、地鼠、兔病原菌检测项目
动物等级 病原菌 动物种类
豚鼠地鼠兔
无 无清普 沙门菌Salmonella spp,● ●●
菌 特 洁通 单核细胞增生性李斯特杆菌Liste o o o
动 定动级 ria monocytogenes
物 病 物动 假结核耶尔森菌Yersinia pseudo- o o o
原 物 tuberculosis
体 小肠结肠炎耶尔森菌Yersinia e- o o o
动 terocolitica
物 皮肤病原真菌Pathogenk"dental fungi o o o
念珠状链杆菌Strepto~llus monili— o o
formis
多杀巴斯德杆菌Pasteurella multocida ● ●
支气管鲍特杆菌Bordetella bron- ●
chiseptica
泰泽病原体Tyzzer’s organism ● ●●
嗜肺巴斯德杆菌Pasteurella pneumo- ● ●●
opica
肺炎克雷伯杆菌Klebsiella pnewmoniae ● ●●
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ● ●●
肺炎链球菌Streptococcus pnemoniae o o o
乙型溶血性链球菌Streptococcus hem- ● o o
dytis-β
绿脓杆菌Pseudomoms aeruginosa ● ●●
无任何可查到的细菌 ● ●●
注：●必须检测项目，要求阴性；O必要时检查项目，要求阴性。
表3犬、猴病原菌检测项目
动物等级 病原菌 动物种类
无普 犬猴
特通 沙门菌Salmonella spp,●●
定级 皮肤病原真菌Pathogenic dermal fungi ●●
病动 布鲁杆菌Brucella spp,●
原物 钩端螺旋体Leptospira spp,△
体 志贺菌Shigella spp,●
动 结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis ●
物
钩端螺旋体1）Leptospira spp,●
小肠结肠炎耶尔森菌Yersinia enterocolitica o o
空肠弯曲杆菌CamPYlobaceter jeiuni o o
注：●必须检测项目，要求阴性；o必要时检测项目，要求阴
性；△必要时检测项目，可以免疫。1)不能免疫，要求阴性。
表4小鼠、大鼠病毒检测项目
动物等级 病 毒 动物种类
小鼠大鼠
无无清 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒Lymphocytic O
菌特洁 Choriomeningitis Virus(LCMV)
动定动 汉坦病毒 Hanta Virus(HV) O●
物病物 鼠痘病毒 Ectromelia Hepatitis Virus(MHV) ●
原 小鼠肝炎病毒Mouse HepatitisVirus(MHV) ●
体 仙台病毒sendai Virus(SV) ●●
动
物
小鼠肺炎病毒Pneumon Virus of Mice ●●
(PVM)
呼肠孤病毒Ⅲ型Reovirus TypeⅢ(Reo_3) ●●
小鼠细小病毒Minute Virus of MIce(MVM) ●
小鼠脑脊髓炎病毒Theiler※s Mouse Encepha- O
lomyelitis Virus(TMEV)
小鼠腺病毒Mouse Adenovirus(Mad) O
多瘤病毒Rolyoma Virus(POLY) O
大鼠细小病毒RV珠Rat Parvovirus(KRV) ●
大鼠细小病毒H-1株RatParvovirus(H-1) ●
大鼠冠状病毒／大鼠涎泪腺炎病毒Rat Coro- ●
navirus(RCV)/Sialodacryoadenitis Virus(SDAY)
无任何可查到的病毒 ●●
注：●必须检测项目，要求阴性；O必要时检查项目，要求阴性。
表5豚鼠、地鼠、兔病毒检测项目
动物等级 病 毒 动物种类
豚鼠地鼠兔
无 无清普 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒Lympho- ●●
菌特 洁通 cytic Choriomeningtis Virus(LCMV)
动定动动 兔出血症病毒Rabbit H~rrhagic Dis-
物病物物 物easeⅥms(RHDV) ▲
原 仙台病毒Sendai Vmas(SV) ●●
体 兔出血症病毒1)Rabbit Hemorrhagic Dis ●
动 ease Virus(RHDV)
物 仙台病毒Sendai Virus(SV) ●
小鼠肺炎病毒Pneumonia Virus of Mice ●●
(PVM)
呼肠孤病毒Ⅲ型Reovirus TypeⅢ(Reo-3) ●●
轮状病毒Rotavirus(RRV)
无任何可查到的病毒 ●●●
注：●必须检测项目，要求阴性；▲必须检测项目，可以免疫。
1)不能免疫，要求阴性。
表6犬、猴病毒检测项目
动物等级 病 毒 动物种类
无 普 犬 猴
特 通 狂犬病病毒Rabies Virus(RV) ▲
定 级 犬细小病毒Canine Parvovirus(CPV) ▲
病 动 犬瘟热病毒Canine Distemper virus(CDV) ▲
原 物 传染性犬肝炎病毒Infectious Canine Hepati- ▲
体 tis Virus(ICHV)
动 猕猴疱疹病毒1型(B病毒)Cercopithecine ●
物 Herpesvirus Type 1(BV)
猴逆转D型病毒Simian Retrovirus D(SRV) ●
猴免疫缺陷病毒Simian Immunodeficiency ●
Virus(SIV)
猴T细胞趋向性病毒I型Simian T Lympho- ●
tropic Virus Type 1(STLV-1)
猴痘病毒Simian Pox Virus(SPV) ●
上述4种犬病毒不免疫 ●
注：●必须检测项目，要求阴性；▲必须检测项目，要求免疫。
页码数,2005版药典附录第52页
附录ⅨL 鼠IgG残留量测定法
本法系用酶联免疫法测定经单克隆抗体亲和层析方法纯化的重组制品中残
留鼠IgG含量。
试剂 (1)包被液(pH9．6碳酸盐缓冲液) 取碳酸钠0．32g、碳酸氢钠O．586g，
加水溶解并稀释成200ml。
(2)PBS(pH7．4) 取氯化钠8．Og、氯化钾0．20g、磷酸氢二钠1．44g、磷酸二氢
钾O．24g加水溶解并稀释成1000ml，121℃灭菌15分钟。
(3)洗涤液(PBS-Tween20) 量取聚山梨酯20O．5ml，加PBS至1000ml。
(4)稀释液取牛血清白蛋白O．5g，加洗涤液溶解并稀释成100ml。 -
(5)底物缓冲液(枸橼酸PBS) 取磷酸氢二钠(Na2 HP04·12H2 0)1．84g、枸橼酸
O．51g，加水溶解并稀释成100ml。
(6)底物液 取邻苯二胺8mg、30％过氧化氢溶液30μl，溶于底物缓冲液20ml
中。(用前配制。)
标准品溶液的制备按使用说明书用适量水复溶鼠IgG标准品。精密量取适
量，用稀释液稀释成每lml中含100ng、50ng、25ng、12．5ng、6．25ng、3．13ng的溶
液。
供试品溶液的制备取供试品适量，用稀释液稀释成每lml中含一个成品剂量
(如未能确定制剂的规格，则按成品的最大剂量计算)的溶液。
测定法取山羊抗鼠IgG抗体适量，用包被液稀释成每lml含10μg的溶液；以
100μ1／孔加至96孔酶标板内，40C放置过夜(16～18小时)，用洗涤液洗板3次；用
洗涤液制备l％牛血清白蛋白溶液，以200／11／孔加至板内，37℃封闭2小时，将
封闭好的酶标板用洗涤液洗3次，以lOOμl／孔加标准品溶液和供试品溶液，
37℃放置1小时，将封闭好的酶标板用洗涤液洗3次；按使用说明书用稀释液稀
释辣根过氧化物酶标记的绵羊抗鼠]gG抗体，以100μ1／孔加至板内，37℃放置
30分钟，用洗涤液洗板3次；以50ul／孔加入底物液，37℃避光放置20分钟，以
50μl／孔加入终止液(1mol／L硫酸溶液)终止反应。用酶标仪在波长492nm处测定
吸光度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工作图法计
算。
以标准品溶液吸光度对相应的浓度作标准曲线，线性回归的相关系数应大
于O．995。以供试品溶液吸光度在标准曲线上读出相应的鼠IgG残留量。
供试品的鼠IgG残留量(ng／剂量)=C*D*F/T
式中 c为供试品溶液鼠IgG残留量，ng／ml，
D为供试品溶液的稀释倍数；
F为成品的剂量规格，IU／剂量或μg/剂量；
T为供试品的效价或主成分蛋白含量，IU／m1或 μg／ml。
书页号：2005版药典三部附录89页
附录XII H 鼠源性病毒检查法
鼠源性单抗体制品具有潜在病毒污染，如流行性出血热病毒、淋巴细胞脉
络丛脑膜炎病毒、3型呼肠孤病毒、仙台病毒、脱脚病病毒、小鼠腺病毒、小
鼠肺炎病毒、逆转录病毒等。其中前四种病毒属I组，为能够感染人与灵长类
动物的病毒；后四种属Ⅱ组，为目前尚无迹象表明感染人的病毒，但能在体外
培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类具有潜在危险陛，这些病毒应
作为重点进行检测。
本法用于杂交瘤细胞株及鼠源性单抗制品的鼠源性病毒检测。通过细胞试
验、动物抗体产生试验、鸡胚感染试验等检测活病毒抗原及病毒抗体。
试剂(1)0．01mol／L pH7．4 PBS称取磷酸氢二钠(Na2 HP04·12H20)2．9g、磷酸二氢
钠0．2g、氯化钠8．Og、氯化钾0．2g，加水溶解并稀释至1000ml。
(2)pH9．6包被缓冲液称取碳酸钠1．59g、碳酸氢钠2．93g、叠氮钠O．20g，
加水溶解并稀释至1000ml。
(3)O．01mol／L pH7．4 PBS洗液称取磷酸氢二钠(Na2 HP04·12H20)2．9g、磷酸二
氢钠O．295g、氯化钠8．5g、聚山梨酯80 5ml，加水溶解并稀释至1000ml。
(4)底物缓冲液 称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)12．9g、枸橼酸3．26g，加水溶
解，并稀释至700ml。
(5)底物溶液称取邻苯二胺4mg，溶于底物缓冲液10ml中，再加入30％过氧化氢
4μl。
(6)终止液lmol／L硫酸溶液。
供试品的制备供试品包括杂交瘤细胞株、腹水和单抗半成品或成品。杂交
瘤细胞株应进行细胞试验、动物抗体产生试验和鸡胚感染试验；腹水和单抗半
成品或成品应进行动物抗体产生试验和鸡胚感染试验。
(1)细胞试验用的供试品取3瓶生长良好的杂交瘤细胞，于一40℃反复冻融3次
后，在无菌条件下合并分装小管，每管3ml，换上胶塞，一40℃保存。
(2)动物抗体产生试验用的供试品单抗腹水、半成品或成品，不需处理，-20℃
保存。而杂交瘤细胞按下述步骤进行处理后使用。
取7瓶生长良好的杂交瘤细胞，弃去培养液，用PBS轻轻将细胞吹打下来，移
入小管，再用PBS冲洗细胞瓶，以收集残余的细胞。于小管中洗涤，每分钟1000
转离心10分钟，弃去上清液，用PBS重新悬浮细胞，以上步骤重复2次。细胞集
中后，悬浮于4mlPBS中。冻融3次，超声波处理。每分钟10 000转离心30分钟，吸
取上清液，每分钟40 000转离心4小时，弃上清液，将沉淀溶于适量的PBS中，即
为动物抗体产生试验用抗原。一40℃保存。
检查法检查方法包括细胞试验、动物抗体产生试 验、鸡胚感染试验等。
1．细胞试验
用已知病毒抗体检查供试品中未知病毒抗原。
(1)细胞培养根据被检的病毒，选择其敏感的细胞。每种细胞6瓶，细胞应生长
良好。用O．01mol／LpH7．4 PBS洗细胞2次。每瓶接种供试品O．3m|，每批供试
品接种4瓶，另外2瓶为对照。37℃吸附1小时，弃去吸附的供试品液体，加入细
胞维持液。每天观察细胞形态，并记录结果。接种后每隔3～4天换一次液。第
一代细胞应维持10～14天。冻融3次后，将对照组2瓶、供试品组4瓶分别合并。
将收获的对照组和供试品组的细胞悬液分别接种同种细胞，接种后，每隔3～4
天，换一次液。
(2)涂片 培养至10～14天，吸出维持液，再用PBS洗细胞2次，每瓶加消化液
O．15ml，使细胞分散、脱壁，吸出细胞悬液，再用PBS洗涤2次。用适量的PBS
悬浮细胞，将对照组的正常细胞涂在抗原片的第一行，供试品组的细胞涂在第
二行，吹干，丙酮固定,-40℃保存，即为供试品细胞涂片。
(3)间接免疫荧光法检测制备已知病毒抗原片，将已知特异性阳性血清和阴性
血清进行1：5～1：20的稀释；应用制备的已知病毒抗原片作为血清对照，检查
供试品细胞涂片。将涂有供试品细胞的玻片，加经PBS 10倍稀释的已知阳性血
清、阴性血清，置湿盒中，37℃放置30分钟后，用PBS洗涤3次，每次浸泡5分
钟，待干燥后，滴加荧光抗体，37℃保温30分钟后，用PBS洗涤3次，每次浸泡
5分钟，再用水洗1次，待干燥后，加50％甘油，用盖玻片封好，镜检。
(4)结果判定在已知病毒抗原片上，阴性对照血清与正常细胞孔、病毒细胞孔
无荧光，阳性对照血清与正常细胞孔无荧光、与病毒细胞孔有荧光；在供试品
细胞涂片上，阴性对照血清与正常细胞孔、供试品细胞孔无荧光，阳性对照血
清与正常细胞孔无荧光时，试验成立。阴性对照血清与正常细胞孔和供试品细
胞孔有荧光反应或阳性对照血清与正常细胞孔有荧光反应，试验不成立。供试
品细胞涂片上，阳性对照血清与供试品细胞孔有荧光判为阳性。
2．动物抗体产生试验
(1)供试品抗体的制备每批供试品按下表参数注射无特定病原体小鼠
(BALB／c或KM)共50只。
(2)血清学检查对经肌内注射和腹腔注射的供试品组和对照组小鼠分别采血，
分离血清后用ELISA法检测抗体。包被病毒抗原和正常细胞抗原，每孔O．1ml，
置37℃ l小时后，放4℃过夜，用洗液充分洗涤，拍干。每份供试品分别加入病
毒抗原孔和正常细胞抗原孔各1个，37℃培养1小时，用洗液充分洗涤，拍干。
加酶结合物，37℃培养1小时，用洗液充分洗涤，拍干。每孔加入底物溶液
O．1ml，37℃培养10～20分钟，当阳性血清对照孔出现颜色，阴性对照孔无颜色
时，每孔加入1mol／L硫酸液0．1m1终止反应，测吸光度。
(3)结果判定P／N值不小于2．1为阳性；
P／N值在1．5～2．O为可疑；
P／N值小于1．5为阴性。
P为供试品免疫小鼠血清与病毒抗原的吸光度减去供试品免疫小鼠血清与正
常细胞抗原的吸光度；
N为对照组动物血清与病毒抗原的吸光度减去对照组动物血清与正常细胞抗
原的吸光度。
3．鸡胚感染试验
于接种前24小时观察鸡胚。活鸡胚具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还
可看到胚动。死胚血管暗昏模糊，没有胚动。接种前用检卵灯再次检查鸡胚活
力，并标出气室和胚胎的位置。按无菌操作要求，以卵黄囊、尿囊腔和绒毛尿
囊膜途径接种供试品。接种后，每日观察，培养5天。无菌操作收卵黄囊、绒毛
尿囊膜和尿囊液。卵黄囊和绒毛尿囊膜经研磨后，离心，取上清液，与尿囊液
分别用豚鼠或鸡红细胞做血凝试验。
取每排8孔微量血凝反应板，从第2孔～第8孔每孔加生理氯化钠溶液50μl。
第1、2孔各加经上述处理的供试品50μl，然后从第2孔吸取50μl至第3孔，第3孔
吸取50μ1至第4孔(以此类推)进行倍比稀释，至第7孔时丢弃50μl。第8孔为对照
孔。第1孔～第8孔各加1％豚鼠红细胞悬液50μl，混匀。做两块反应板，分别静
置于4℃和室温，至对照孔呈现明显阴性时判定结果。
结果判定：
++++红细胞均匀铺于孔底；
+++红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整齐，有下滑趋向；
++ 红细胞于孔底形成小环，但周围有小凝集块；
+红细胞于孔底形成小团，边缘可见少许凝集块；
-红细胞集中在孔底中央，呈一边缘致密的红点。
以凝集反应出现++，或++以上者判为阳性。
书页号：2005版药典三部附录6页
附录I B栓剂
栓剂 系指以生物制品原液经干燥后制成的干粉为原料药物，与适宜基质制成
供腔道给药的固体制剂。
栓剂因施用腔道的不同，分为直肠栓、阴道栓和尿道栓。直肠栓为鱼雷形、
圆锥形或圆柱形等；阴道栓为鸭嘴形、球形或卵形；尿道栓一般为棒状。
栓剂在生产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产和质量控制应符合相关品种要
求。
二、栓剂常用基质为半合成脂肪酸甘油酯、可可豆脂、聚氧乙烯硬脂酸酯、
聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、氢化植物油、甘油明胶、聚乙二醇类或其他适宜
物质。
因油脂性基质如可可豆脂在阴道内不能被吸收而形成残留物，不作阴道栓用
基质。常用水溶性或水能混溶的基质制备阴道栓。
三、除另有规定外，供制栓剂用的固体药物，应预先用适宜方法制成细粉，
根据施用腔道和使用目的的不同，制成各种适宜的形状。
四、根据需要可加入表面活性剂、稀释剂、吸收剂、润滑剂和防腐剂等。
五、栓剂中的药物与基质应混合均匀，栓剂外形要完整光滑；塞入腔道后应
无刺激性，应能融化、软化或溶化，并与分泌液混合，逐渐释放出药物，产生
局部或全身作用；并应有适宜的硬度，以免在包装或贮藏时变形。
六、栓剂所用内包装材料应无毒性，并不得与药物或基质发生理化作用。
七、除另有规定外，栓剂应置2～8℃下避光贮存和运输，防止因受热、受潮
而变形、发霉变质。
栓剂应进行以下相应检查。
【重量差异】 栓剂重量差异的限度，应符合规定。
检查法取供试品10粒，精密称定总重量，求得平均粒重后，再分别精密称定
各粒的重量。每粒重量与平均粒重相比较，超出重量差异限度的不得多丁1粒，
并不得超出限度1倍。
【融变时限】 除另有规定外，照融变时限检查法(附录V D)检查，应符合规定。
【微生物限度】 除另有规定外，照微生物限度检查法(附录ⅫG)检查，应符合
规定。
页码数,2005版药典附录第38页
附录ⅦD水分测定法
第一法(费休氏法)
A．容量滴定法
本法是根据碘和二氧化硫在吡啶和甲醇溶液中能与水起定量反应的原理以测
定水分。所用仪器应干燥，并能避免空气中水分的侵入；测定操作宜在干燥处
进行。
费休氏试液的制备与标定
(1)制备称取碘(置硫酸干燥器内48小时以上)110g，置干燥的具塞锥形瓶中，加
无水吡啶160ml，注意冷却，振摇至碘全部溶解后，加无水甲醇300ml，称定重
量，将锥形瓶置冰浴中冷却，在避免空气中水分侵入的条件下，通入干燥的二
氧化硫至重量增加72g，再加无水甲醇使成1000ml，密塞，摇匀，在暗处放置24小
时。
本液应遮光，密封，置阴凉干燥处保存。临用前应标定浓度。
(2)标定用水分测定仪直接标定。或取干燥的具塞玻瓶，精密称人重蒸馏水
约30mg，除另有规定外加无水甲醇2～5ml，在避免空气中水分侵入的条件下，
用本液滴定至溶液由浅黄色变为红棕色，或用永停滴定法(二部附录ⅦA)指示终
点；另作空白试验，按下式计算：
F=W/A-B
式中 F为每lml费休氏试液相当于水的重量，mg；
W为称取重蒸馏水的重量，mg；
A 为滴定所消耗费休氏试液的容积，ml；
B为空白所消耗费休氏试液的容积，m1。
测定法精密称取供试品适量(约消耗费休氏试液1～5m1)，除另有规定外，溶
剂为无水甲醇，用水分测定仪直接测定。或将供试品置干燥的具塞玻瓶中，加
溶剂2～5ml，在不断振摇(或搅拌)下用费休氏试液滴定至溶液由浅黄色变为红棕
色，或用永停滴定法(二部附录ⅦA)指示终点；另作空白试验，按下式计算：
供试品中水分含量(％)=(A-B)F/W×100％
式中A为供试品所消耗费休氏试液的容积，ml；
B为空白所消耗费休氏试液的容积，m1；
F为每lml费休氏试液相当于水的重量，mg；
W为供试品的重量，mg。
B．库仑滴定法
本法仍以卡尔一费休氏(Karl Fischer)反应为基础，应用永停滴定法(二部附录
ⅦA)测定水分。与容量滴定法相比，库仑滴定法中滴定剂碘不是从滴定管加
入，而是由含有碘离子的阳极电解液电解产生。一旦所有的水被滴定完全，
阳极电解液中就会出现少量过量的碘，使铂电极极化而停止碘的产生。根据
法拉第定律，产生的碘的量与通过的电量成正比，因此可以用测量滴定过程中
流过的总电量的方法测定水分总量。本法主要用于测定含微量水分
(0．0001％～O．1％)的物质，特别适用于测定化学惰性物质如烃类、醇类和酯
类中的水分。所用仪器应干燥，并能避免空气中水分的侵入；测定操作宜在干
燥处进行。
费休氏试液按卡尔一费休氏库仑滴定仪的要求配制或购置滴定液。本法无
须标定滴定液。
测定法先将系统中的水分预滴定除去，而后精密量取供试品适量(含水量约
为0．5～5mg)，迅速转移至阳极电解液中，用卡尔-费休氏库仑滴定仪直接测
定，以永停滴定法(二部附录ⅦA)指示终点，从仪器显示屏上直接读取供试品
中水分的含量，其中每lmg水相当于10．72库仑的电量。
第二法(甲苯法)
仪器装置如图（图略）。A为500ml的短颈圆底烧瓶；B为水分测定管；C为直
形冷凝管，外管长40cm。使用前，全部仪器应清洁，并置烘箱中烘干。
测定法取供试品适量(约相当于含水量1～4m1)，精密称定，置A瓶中，加甲
苯约200ml，必要时加入干燥、洁净的无釉小瓷片数片或玻璃珠数粒，将仪器各
部分连接，自冷凝管顶端加入甲苯至充满B管的狭细部分。将A瓶置电热套中或
用其他适宜方法缓缓加热，待甲苯开始沸腾时，调节温度，使每秒钟馏出2滴。
待水分完全馏出，即测定管刻度部分的水量不再增加时，将冷凝管内部先用
甲苯冲洗，再用饱蘸甲苯的长刷或其他适宜方法，将管壁上附着的甲苯推下，
继续蒸馏5分钟，放冷至室温，拆卸装置，如有水黏附在B管的管壁上，可用蘸
甲苯的铜丝推下，放置使水分与甲苯完全分离(可加亚甲蓝粉末少量，使水染
成蓝色，以便分离观察)。检读水量，并计算成供试品的含水量(％)。
【附注】 甲苯须先加水少量充分振摇后放置，将水层分离弃去，经蒸馏后
使用。
页码数,2005版药典附录第31页
附录ⅥC唾液酸测定法
(间苯二酚显色法)
本法系用酸水解方法将结合状态的唾液酸变成游离状态，游离状态的唾液
酸与间苯二酚反应生成有色化合物，再用有机酸萃取后，测定唾液酸含量。
唾液酸对照品溶液(200μg／m1)的制备 精密称取唾液酸对照品10．52mg(1μg
唾液酸相当于3．24nm01)，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀，即为
唾液酸贮备液(1mg／m1)，按一次使用量分装，-70℃贮存，有效期1年。仅可冻
融1次。4℃保存使用期为2周。精密量取唾液酸贮备液lml，置5ml量瓶中，加水
至刻度，即为每lml含200μg的唾液酸对照品溶液，用前配制。
测定法取供试品适量，加水稀释至蛋白质浓度约为每lml含O．2～O．4mg，
作为供试品溶液。按下表取唾液酸对照品溶液、水及供试品溶液于10ml玻璃试
管中，混匀，每管再加入间苯二酚一盐酸溶液(分别量取2％间苯二酚溶液
2．5ml、0．1tool／L硫酸铜溶液62．5μl、25％盐酸溶液20ml，加水稀释至25ml，混
匀。试验前4小时内配制)lml，加盖，沸水煮沸30分钟(水浴面高于液面约2cm)，
取出置冰浴中3分钟(同时振摇)后，每管加乙酸丁酯一丁醇液(取乙酸丁酯4份与
丁醇1份混匀，室温下保存，12小时内使用)2ml，充分混匀，室温放置10分钟，
照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长580nm处测定吸光度。(图表略）
用唾液酸对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归(相关系数应不
低于O．99)，由直线回归方程求出5μg唾液酸的吸光度，再按下式计算
供试品唾液酸含量A2*5*3．24*W*D/A1×PXl00
(mol／mol蛋白质)
式中A1为5μg唾液酸的吸光度；
A2为供试品的吸光度；
D为供试品稀释倍数；
P为供试品蛋白质含量，μg／μl；
W为1nmol促红素的量(不包括糖成分量)，相当于18．2μg。
书页号：2005版药典三部附录7页
附录I D外用溶液剂
外用溶液剂系指以生物制品原液为原料药物，加入适宜稳定剂或其他辅料制
成的无菌澄明溶液。供刨伤面涂抹治疗用。
外用溶液剂在生产和贮藏期间应符合下列有关规定。
一,所用生物制品原液、半成品和成品的生产和质量控制应符合相关品种
要求。
二、外用溶液剂中所含药物可被创面所吸收，使用时需加在棉签或柔软物料
上，轻轻涂抹患处，所用物料必须洁净、灭菌，不得污染微生物。
三、外用溶液剂不得有酸败、异臭、变色等异常现象，必要时可加适宜防腐
剂或抗氧剂。
四、除另有规定外，外用溶液剂应置2～8℃避光贮存和运输。
外用溶液剂应进行以下相应检查。
【装量】 除另有规定外，照附录I A中装量项进行。应符合规定。
【无菌】 照无菌检查法(附录ⅫA)检查，应符合规定。
页码数,2005版药典附录第46页
附录ⅨB外源性DNA残留量测定法
供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可
与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。将特异性单链
DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物
相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供
试品中外源性DNA的含量。
试剂 (1)DNA标记和检测试剂盒
(2)DNA杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜。
(3)2％蛋白酶K溶液称取蛋白酶K O．20g，溶于灭菌水10ml中，分装后储藏于
-20℃备用。
(4)3％牛血清白蛋白溶液 称取牛血清白蛋白O．30g，溶于灭菌水10ml中。
(5)lmol／L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液(pH8．0) 用盐酸调pH值至8．O。
(6)5．0mol／L氯化钠溶液
(7)0．5mol／L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8．0) 用10mol／L氢氧化钠溶液调节pH
至8．O。
(8)20％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液 用盐酸调pH至7．2。
(9)蛋白酶缓冲液(pH8．0) 量取lmol／L Tris溶液1．0ml(pH8．O)，5mol／L氯化钠溶
液2．Oml，0．5mol／L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8．O)2．Oml，20％SDS溶液2．5
ml，加灭菌水至lOml。
(10)TE缓冲液(pH8．0) 量取1mol／L Tris溶液(pH8．O)10ml，0．5mol／L乙二胺四乙
酸二钠溶液(pH8．0)2ml，加灭菌水至1000ml。
(11)1％鱼精DNA溶液 精密称取鱼精DNA0．10g，置10ml量瓶中，用TE缓冲液溶
解并稀释至刻度，摇匀，用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子，分装后贮
藏于-20℃备用。
(12)DNA稀释液取1％鱼精DNA溶液50μd，加TE缓冲液至10ml。
用于探针标记和阳性对照的DNA制备用于探针标记和阳性对照的DNA，由生
产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴定可
参考下述推荐方案进行，具体方法可参考《分子克隆实验指南》([美]J．萨姆布
鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002)或《精编分子生物学实验指南》(
[美]F．奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，科学出版社，1998)。
将待提取的细胞基质悬液的细胞浓度调整为每lml含107个细胞，如果为细
菌，则将其浓度调整为每lml含108个细胞。取悬液lml，离心，在沉淀中加裂解
液400μ1混匀，37℃作用12～24小时后，加入饱和酚溶液450μ1，剧烈混合，以每分
钟10000转离心10分钟，转移上层液体，以饱和酚溶液450μd重复抽提一次；转移
上层液体，加入三氯甲烷450μ1，剧烈混匀，以每分钟10000转离心10分钟；转移
上层液体，加入pH 5．2的3mol／L醋酸钠溶液40μl，充分混合，再加人-20℃以下
的无水乙醇lml，充分混合，-20℃以下作用2小时，以每分钟15000转离心15分钟；
用适量-20℃ 70％乙醇溶液洗涤沉淀1次，以每分钟15000转离心15分钟，弃上清
液，保留沉淀，吹至干燥后，加适量灭菌TE缓冲液溶解，RNase酶切，酚／三
氯甲烷抽提，分子筛纯化DNA，即得。
用1％琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法鉴定阳性对照品的DNA纯度：应无RNA
和寡核苷酸存在；Az60／Az80比值应在1．8～2．0之间(测定时将供试品稀释至
A260为O．2～1．O)。
用于阳性对照和标记探针的DNA在使用前应进行酶切或超声波处理，使其片
断大小适合于DNA杂交和探针标记。
阳性对照品的DNA浓度根据下式计算DNA浓度(ng／μ1)=50*A260
阳性对照品可分装于适宜的小管中，-20℃以下保存，长期使用。
探针的标记按试剂盒使用说明书进行。
测定法 (1)蛋白酶K预处理 按下表对供试品、阳性和阴性对照进行加样，混
合后37℃保温4小时以上，以保证酶切反应完全。
┏━━━━┳━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━┳━━━━━━┳
┃ 加样量 ┃2％蛋白酶 ┃ 蛋白酶 ┃3％牛血清白 ┃加水至
┃ ┃ K溶液 ┃ 缓冲液 ┃ 蛋白溶液 ┃ 终体积
┣━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━━╋
┃供试品 ┃ lOOμ1 ┃ 1μl ┃ 20μ1 ┃ ┃200μ
┃ D1 ┃ lOOμ1 ┃ 1ul ┃ 20μ1 ┃ 适量 ┃ 200μ1 ┃
┃ D2 ┃ lOOμ1 ┃ 1μ1 ┃ 20μ1 ┃ 适量 ┃ 200μ1 ┃
┃ D3 ┃ lOOμ1 ┃ 1μ1 ┃ 20μ1 ┃ 适量 ┃ 200μ1 ┃
┃ 阴性 ┃ lOOμ1 ┃ 1μL ┃ 20μ1 ┃ 适量 ┃ 200ul ┃
┗━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━┻━━━━━━┻
注意事项：供试品的稀释
根据成品最大使用剂量，用DNA稀释液将供试品(原液)稀释至每100μ1含1人份
剂量；如成品最大使用剂量较大，而供试品的蛋白含量较低，可用DNA稀释液
将供试品稀释至每100μ1含1／10人份剂量或每100μ1含1／100人份剂量。
Dl、D2、D3为稀释的阳性DNA对照。用DNA稀释液稀释至每lml中含DNA 1000ng。
然后依次10倍稀释成10ng／100／μ1(D1)、lng／100μl(D2)、100pg／100μl(D3)三个稀释
度；如成品使用剂量较大，而且DNA限量要求(100pg／剂量)较严格时，则需要
提高DNA检测灵敏度，相应的阳性DNA对照应稀释成100pg／100μl(D1)、10pg／
100μl(D2)、lpg／100μl(D3)三个稀释度。阴性对照为DNA稀释液，空白对照为未进
行蛋白酶K预处理的TE缓冲液。
当供试品1／100人份剂量大于100μ1时，终体积也随之增大，一般终体积为供
试品体积的一倍左右，供试品体积和终体积相差过小，可能会影响蛋白酶K的
活性。
2％蛋白酶K溶液和蛋白酶缓冲液的比例为1／20，蛋白酶缓冲液和终体积的
比例为1／10。
加入3％牛血清白蛋白溶液适量，是为了使阳性对照和阴性对照中含有一定
的蛋白质与供试品(通常为蛋白质)的酶切条件保持一致；如供试品为其他物质，
则应改用其他相应物质。
若预处理后的供试品溶液中的蛋白质干扰本试验，可用上述饱和酚溶液抽
提法或其他适宜方法提取供试品DNA(阳性对照、阴性对照也应再次提取DNA，
与供试品溶液平行)。
(2)点膜用TE缓冲液浸润杂交膜后，将预处理的供试品、阳性对照、阴性对照
与空白对照置100℃水浴加热10分钟，迅速冰浴冷却，以每分钟8000转离心5秒。
用抽滤加样器点样于杂交膜(因有蛋白质沉淀，故要视沉淀多少确定加样量，以
避免加入蛋白质沉淀。所有供试品与阳性对照、阴性对照、空白对照加样体积
应一致，或按同样比例加样)。晾干后置80℃真空干烤1小时以上。
(3)杂交及显色按试剂盒使用说明书进行。
结果判定 阳性对照应显色，其颜色深度与DNA含量相对应，呈一定的颜色
梯度；阴性、空白对照应不显色，或显色深度小于阳性DNA对照D3，试验成
立。将供试品与阳性对照进行比较，根据显色的深浅判定供试品中外源性DNA
的含量。
书页号：2005版药典三部附录81页
附录Ⅻ G 微生物限度检查法
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度
的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气
区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区
域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌
的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效
性及对微生物的生长和存活无影响。
除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温
度为23～28℃；控制菌培养温度为35～37℃。
检验结果以lg、1ml、10g、10ml或10cm〈2〉为单位报告。
检验量
检验量即一次试验所用的供试品量(g、m1或cm〈2〉)。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；化学膜剂为100cm〈2〉；
贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检
验量应增加10g或10ml。
检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。
供试液的制备
根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试
液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培
养基，不得超过1小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
1．液体供试品
取供试品10ml，加pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10
的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体
制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2．固体、半固体或黏稠性供试品
取供试品10g，加pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他
适宜的方法，混匀，作为1：10 的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并
置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
3．需用特殊供试液制备方法的供试品
(1)非水溶性供试品
方法1 取供试品5g(或5m1)，加至含溶化的(温度不超过45℃)5g司盘80、3g单硬脂
酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢
加入45℃的pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mI，边加边搅拌，使供试品充分
乳化，作为1：20的供试液。
方法2 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异内酯(制法见附录Ⅺ H无菌检
查法中供试品的无菌检查项下)和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四
烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的pH7．0无菌氯化
钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层
作为1：10的供试液。
(2)膜剂供试品
取供试品100cm〈2〉，剪碎，加pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml(必要时
可增加稀释液)，浸泡，振摇，作为1：10的供试液。
(3)肠溶及结肠溶制剂供试品
取供试品10g，加pH6．8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或pH7．6无菌磷酸
盐缓冲液(用于结肠溶制剂) 至100ml，置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1：10的
供试液。
(4)气雾剂、喷雾剂供试品
取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品开启部
位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓
缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7．0无菌氯化钠一蛋
白胨缓冲液(若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80)中，混匀，取相当于
10g或10ml的供试品，再稀释成1：10的供试液。
(5)具抑菌活性的供试品
当供试品有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用
的方法如下。
①培养基稀释法 取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内
的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取
同稀释级的供试液2ml，每lml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混
匀，凝固，培养，计数。每lml供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1m1的菌
落数，计算每1ml 供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检
查时，可加大增菌培养基的用量。
②离心沉淀集菌法 取一定量的供试液，每分钟3000转离心20分钟(供试液如有
沉淀，先以每分钟500转离心5分钟，取全部上清液再离心)，弃去上清液，留底
部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。
③薄膜过滤法 见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。
④中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和
剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。
细菌、霉菌及酵母菌计数
计数方法的验证
当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的
验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若
药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列
要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。
菌种 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的冷
冻干燥菌种为第O代)，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学
特性。
大肠埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44102］
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26003］
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ［CMCC(B) 63501］
白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC(F)98001］
黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98003］
菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物
至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新
鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。上述培
养物用O．9％无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数为50～100CFU的菌悬液。接种黑曲
霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7天，加入3～5ml 0．9％
无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花
或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内，用0．9％无菌氯化钠溶液制
成每lml含孢子数50～100CFU的孢子悬液。
验证方法 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每
次试验的回收率。
(1)试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液lml和50～100CFU
试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平
皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法汁数时，取规定量试验可能用的最低稀
释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～100CFU试验菌，过
滤，按薄膜过滤法测定其菌数。
(2)菌液组 测定所加的试验菌数。
(3)供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
(4)稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化，中和、离心或薄膜过滤等
特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的
程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为
每lml供试液含50～100CFU，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌
数。
结果判断 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率(稀释剂对照
组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70％。若试验组的
菌回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的
平均菌落数的百分率)均不低于70％，照该供试液制备方法和计数法测定供试品
的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70％，应采
用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这
些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
验证试验也可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。
检查法
计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时，按已验证的计数方法进行供
试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。
取按验证的方法制备的均匀供试液，用pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀
释成1:10、l:10〈2〉、1:10〈3〉等稀释级。
1．平皿法
采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2～3个稀释级的供试液。
取供试液lml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化
的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，
混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。
阴性对照试验 取试验用的稀释液lml，置无菌平皿中，注人培养基，凝固，
倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。
培养和计数 除另有规定外，细菌培养48小时，逐日点计菌落数，一般以48小
时的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养72小时，逐日点计菌落数，一般以72小时的
菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间至5～7天进行菌落计数并报告。菌落
蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌
落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15。
则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母
菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若
营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌．则应
分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母
菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵
母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数
为计数结果。
含蜂蜜、王浆的液体制剂，用攻瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出
粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。
菌数报告规则 宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间、霉菌平均菌落
数在30～100之间的稀释级，作为菌数报告(取两位有效数字)的依据。
(1)当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释
倍数的值报告菌数。
(2)当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值(比值为高稀释
级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值)而定。
若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大
于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比
值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应
查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。
(3)当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释
倍数的值报告菌数。
(4)如各稀释级的平板均无菌落生长。或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但
平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
2．薄膜过滤法
采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0．45μm，直径约为50mm。选择滤膜材质
时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应采
用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液
过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使
用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗
液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张
滤膜每次冲洗量为100ml。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生
物受损伤。
取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，
过滤。若供试品每1g或lml所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液lml，过
滤。用pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方
法和冲洗量同“计数方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培
养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每
种培养基至少制备一张滤膜。
阴性对照试验 取试验用的稀释液1m1，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对
照。阴性对照不得有菌生长。
培养和计数 培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过
100个。
菌数报告规则 以相当于1g或lml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落
生长，以＜1报告菌数(每张滤膜过滤1g或1m1供试品)，或＜1乘以稀释倍数的值报
告菌数。
控制茵检查
控制菌检查方法的验证
当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认
所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改
变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。
验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的
菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按
供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。
菌种 对试验菌种的要求同细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。
大肠埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44102］
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ［CMCC(B)26003］
乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)［CM-CC(B)50094］
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) ［CMCC(B)10104］
生孢梭菌(Clostridium sporogenes) ［CMCC(B)64941］
菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单
胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培
养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时。用0．9％无菌氯化钠溶液制
成每lml含菌数为10～100CFU的菌悬液。
验证方法
(1) 试验组 取规定量供试液及10～100CFU试验菌加入增菌培养基中，依相应控
制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，
试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增
菌培养基中。
(2)阴性菌对照组 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。
方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采
用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌，梭菌检查法时的阴
性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。
结果判断 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌。按此供
试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验
菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联
合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。
检查法
供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制
菌检查方法的验证。
阳性对照试验 进行供试品控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试
验的加菌量为10～100CFU，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相
应的控制菌。
阴性对照试验 取稀释液10 m1照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性
对照应无菌生长。
(1)大肠埃希茵(Escherichia coli) 取供试液10ml (相当于供试品1g、lml、lOcm〈2〉)，
直接或处理后接种至适量(不少于100m1)的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时，
必要时可延长至48小时。
取上述培养物0．2ml，接种至含5ml MUG培养基的试管内，培养，于5小时、
24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内
培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管
的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，
为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。
如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质
阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、
靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养
基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。
若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，判供
试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表1所列的菌落形态特征相符或
疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希
菌。
表l 大肠埃希菌菌落形态特征
┏━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 培养基 ┃ 菌落形态 ┃
┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落 ┃
┃ 曙红亚甲蓝 ┃中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸 ┃
┃琼脂 ┃起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属 ┃
┃ ┃光泽 ┃
┣━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色,┃
┃ 麦康凯琼脂 ┃ ┃
┃ ┃圆形，扁平．边缘整齐，表而光滑，湿润 ┃
┗━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┛
(2)大肠菌群(Coliform) 取含适量(不少于10m1)的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分
别加入1：10的供试液lml(含供试品0．1g或0．1m1)、1：100的供试液1m1(含供试品
0．0lg或0．0lml)、l：1000的供试液lml(含供试品0．001g或0．001m1)，另取1支胆盐乳
糖发酵培养基管加入稀释液1m1作为阴性对照管。培养18～24小时。
胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大
肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂
培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。
若平板上无菌落生长，或生长的菌落与表2所列的菌落形态特征不符或为非
革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长的菌落与表2所列
的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。
表2 大肠菌群菌落形态特征
┏━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 培养基 ┃ 菌落形态 ┃
┣━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色,┃
┃曙红亚甲蓝琼脂 ┃圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面 ┃
┃ ┃光滑，湿润 ┃
┣━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍 ┃
┃麦康凯琼脂 ┃ ┃
┃ ┃凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润 ┃
┗━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━┛
确证试验 从上述分离平板上挑选4～5个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵
管中，培养24～48小时。若产酸产气，判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群，否则
判未检出大肠菌群。
根据大肠菌群的检出管数，按表3报告1g或lml供试品中的大肠菌群数。
表3 可能的大肠菌群数表
┏━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━┓
┃ 各供试品量的检出结果 ┃ ┃
┃ ┃可能的大肠菌群数N ┃
┣━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┫ ┃
┃ 0．1g或 ┃ 0．01g或 ┃ 0．00lg或 ┃ (个／g或m1) ┃
┃ 0．1ml ┃ 0．0hnl ┃0．001ml ┃ ┃
┣━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━ ╋━━━━━━ ━━ ━ ┫
┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＋ ┃ ＞10 ┃
┃ ＋ ┃ ＋ ┃ － ┃10〈2〉＜N＜10〈3〉 ┃
┃ ＋ ┃ － ┃ － ┃10＜N＜10〈2〉 ┃
┃ － ┃ － ┃ － ┃ ＜10 ┃
┗━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━ ━ ┻━━━━━━━━━┛
注：＋代表检出大肠菌群；一代表未检出大肠菌群。
(3)沙门菌(Salmonella) 取供试品l0g或l0ml，直接或处理后接种至适量(不少于
200m1)的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养18～24小时。
取上述培养物lml，接种于lOml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24小时
后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂(或沙门、志贺菌属琼脂)培养基和麦康凯琼脂
(或曙红亚甲蓝琼脂)培养基的平板上，培养18～24小时(必要时延长至40～48小时)。
若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于表4所列的特征，判供试品未检出
沙门菌。
若平板上生长的菌落与表4所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选
2～3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养
18～24小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判供
试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生
化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门菌。
表4 沙门菌菌落形态特征
┏━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 培养基 ┃ 菌落形态 ┃
┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 无色至浅橙色，半透明，菌落中心带 ┃
┃胆盐硫乳琼脂 ┃ ┃
┃ ┃黑色或全部黑色或无黑色 ┃
┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 无色至淡红色，半透明或不透明，菌 ┃
┃沙门、志贺菌属琼脂 ┃ ┃
┃ ┃落中心有时带黑褐色 ┃
┣━━━━━━━━━━ ╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 无色至浅橙色，透明或半透明，光滑 ┃
┃曙红亚甲蓝琼脂 ┃ ┃
┃ ┃湿润的圆形菌落 ┃
┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 无色至浅橙色，透明或半透明，菌落 ┃
┃麦康凯琼脂 ┃ ┃
┃ ┃中心有时为暗色 ┃
┗━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┛
(4)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 取供
试液l0ml(相当于供试品1g、lml、l0cm〈2〉)，直接或处理后接种至适量(不少于l00ml)
的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。取上述培养物，划线接种于溴化十六
烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。
铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，
周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特
征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板生长的菌落与上述菌落形态特
征相符或疑似，应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养
18～24小时。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验。
氧化酶试验 取洁净滤纸片置于半皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤
纸片上，滴加新配制的1％二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉
红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。
若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未
检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试验。
绿脓菌素(Pyocyanin)试验 取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上，培养
24小时，加三氯甲烷3～5ml全培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将
三氯甲烷相移至另一试管中，加入lmol／L盐酸试液约1ml，振摇后，静置片刻，
观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则为阴性。同时用未接
种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。
若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判
供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及
绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的生化试验，确认是否为铜绿假单胞菌。
(5)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 取供试液10ml(相当于供试品lg、lml、
10cm〈2〉)，直接或处理后接种至适量(不少于lOOml)的亚碲酸钠(钾)肉汤(或营养
肉汤)培养基中，培养18～24小时，必要时可延长至48小时。取上述培养物，划线
接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24～
72小时。若甲板上无菌落生长或生长的菌落不同于表5所列特征，判供试品未检
出金黄色葡萄球菌。
表5金黄色葡萄球菌菌落形态特征
┏━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓
┃ 培养基 ┃ 菌落形态 ┃
┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 金黄色．圆形凸起．边缘整齐，外围 ┃
┃甘露醇氯化钠琼脂 ┃ ┃
┃ ┃有黄色环，菌落直径0．7～1mm ┃
┣━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━━┫
┃ ┃ 金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围 ┃
┃卵黄氯化钠琼脂 ┃有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径 ┃
┃ ┃l～2ram ┃
┗━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━━┛
若平板上生长的菌落与表5所列的菌落特征相符或疑似，应挑选2～3个菌
落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时。取营养琼脂培养基的
培养物进行革兰染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养18～24小时，作血浆凝
固酶试验。
血浆凝固酶试验 取灭菌小试管3支，各加入血浆和无菌水混合液(1：1)
0．5ml，再分别加入可疑菌株的营养肉汤培养物(或由营养琼脂培养基斜面培养
物制备的浓菌悬液)0．5ml、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物(或由营养琼脂培养
基斜面培养物制备的浓菌悬液)0．5ml、营养肉汤或0．9％无菌氯化钠溶液0．5ml，
即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。将3管同时培养，3小时后开始观察直
至24小时。阴性对照管的血浆应流动自如，阳性对照管血浆应凝固，若试验管
血浆凝固者为血浆凝固酶试验阳性，否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管
不符合规定时，应另制备血浆，重新试验。
若上述疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性，判供试品未检出
金黄色葡萄球菌。
(6)梭菌(cIostridium) 取供试液10ml(相当于供试品1g、lml)2份，其中1份置80℃保温
10分钟后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后分别接种至100ml的0．1％新鲜
庖肉培养基中。各培养基管在厌氧条件下培养72～96小时。如试验管不出现浑
浊、产气、消化碎肉、臭气等现象，判供试品未检出梭菌；否则，应取上述培
养物0．2 m1，涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比业琼脂培养基平板上，在厌氧条
件下培养48～72小时。若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上有
菌落生长，应挑选2～3个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。
过氧化氢酶试验 取上述平板上的菌落，置洁净玻片上，滴加3％过氧化氢试
液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。
若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌．有或无卵圆形或球形的芽孢，过氧化氢酶
阴性，判供试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。
结果判断
供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。
供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，
应从同一批样品中随机抽样．独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数。
眼用制剂检出霉菌和酵母菌数时，须以两次复试结果均不得长菌，方可判供
试品的霉菌和酵母菌数符合该品种项下的规定。
若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数及控制菌三项检验结果均符合该品种
项下的规定．判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，
判供试品不符合规定。
稀释液
稀释液配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
1．pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 照无菌检查法(附录ⅪH)制备。
2．pH6．8无菌磷酸盐缓冲液、pH7．6无菌磷酸盐缓冲液 按缓冲液(二部附
录ⅩⅤ D)配制后，过滤，分装，灭菌。
如需要，可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。
3．0．9％无菌氯化钠溶液 取氯化钠9．0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分
装，灭菌。
培养基及其制备方法
培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养
基。配制后．应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
1．营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁
培养基及改良马丁琼脂培养基
照无菌检查法(二部附录Ⅺ H)制备。
2．玫瑰红钠琼脂培养基
胨 5．0g玫瑰红钠 0．0133g
葡萄糖 10．0g琼脂 14．0g
磷酸二氢钾 1．0g水 1000ml
硫酸镁 0．5g
除葡萄糖、玫瑰红钠外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，加入葡萄
糖、玫瑰红钠，分装，灭菌。
3．酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)
胨 10．0g琼脂 l4．0g
酵母浸出粉 5．0g水 1000ml
葡萄糖 20．0g
除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，加入葡萄糖，分装，
灭菌。
4．胆盐乳糖培养基(BL)
胨 20．0g磷酸二氢钾 1．3g
乳糖 5．0g牛胆盐 2．0g
氯化钠 5．0g(或去氧胆酸钠) (0．5g)
磷酸氢二钾 4．0g水 1000ml
除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶解，调节
pH值使灭菌后为7.4±0．2，煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分
装，灭菌。
5．胆盐乳糖发酵培养基
取未灭菌的胆盐乳糖培养基1000ml，加入 0．04％溴甲酚紫指示液25ml，根据
要求的用量分装于含倒管的试管中。灭菌。所用倒管的规格应保证产气结果的
观察。
6．曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)
营养琼脂培养基 100ml曙红钠指示液 2ml
20％乳糖溶液 5ml亚甲蓝指示液 1．3～1．6ml
取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60℃，按无菌操作加入灭菌的其他
3种溶液．摇匀，倾注平皿。
7．麦康凯琼脂培养基(MacC)
陈 20．0g 1％中性红指示液 3ml
乳糖 10．0g琼脂 14．0g
牛胆盐 5．0g水 1000ml
氯化钠 5．0g
除乳糖、1％中性红指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分，混合，微温
溶解，调节pH值使灭菌后为7．2±0．2，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各
成分，摇匀，分装，灭菌，冷至约60℃，倾注平皿。
8．4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-methylumbelliferyl-β-D- glucuronide，MUG)培养基
胨 l0．0g磷酸二氢钾(无水) 0．9g
硫酸锰 0．5mg磷酸氢二钠(无水) 6．2g
硫酸锌 0．5mg亚硫酸钠 40mg
硫酸镁 0．1g去氧胆酸钠 1．0g
氯化钠 5．0g MUG 75mg
氯化钙 50mg水 1000ml
除MUG外，取上述成分．混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为7．3±
0．1，加入MUG，溶解，每管分装5ml，灭菌。（未完待续《微生物限度检查
法2》
(续） 附录Ⅻ G 微生物限度检查法
书页号：2005版药典三部附录81页
9．三糖铁琼脂培养基(TSI)
胨 20．0g硫酸亚铁 0．2g
牛肉浸出粉 5．0g硫代硫酸钠 0．2g
乳糖 10．0g 0．2％酚磺酞指示液 l2．5ml
蔗糖 10．0g琼脂 12．0g
葡萄糖 1．0g水 1000ml
氯化钠 5．0g
除三种糖、0．2％酚磺酞指示液、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶
解，调节pH值使灭菌后为7．3±0．1，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成
分，摇匀，分装，灭菌，制成高底层(2～3cm)短斜面。
10．四硫磺酸钠亮绿培养基(TTB)
胨 5．0g硫代硫酸钠 30.0g
牛胆盐 1．0g水 1000ml
碳酸钙 10．0g
取上述成分，混合．微温溶解，灭菌。
临用前，取上述培养基，每10ml加入碘试液0．2ml 和亮绿试液0．1ml，混匀。
11．沙门、志贺菌属琼脂培养基(ss)
胨 5．0g硫代硫酸钠 8．5g
牛肉浸出粉 5．0g中性红指示液 2．5ml
乳糖 l0．0g亮绿试液 0．33ml
牛胆盐 8．5g琼脂 l6．0g
枸橼酸钠 8．5g水 1000mI
枸橼酸铁铵 1．0g
除乳糖、中性红指示液、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节
pH值使灭菌后为7．2±0．1，滤过，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余各成
分，摇匀，火菌，冷至60℃，倾注平皿。
12．胆盐硫乳琼脂培养基(DHL)
胨 20．0g 枸橼酸钠 1．0g
牛肉浸出粉 3．0g 枸橼酸铁铵 1．0g
乳糖 10．0g 中性红指示液 3ml
蔗糖 l0．0g 琼脂 l6．0g
去氧胆酸钠 1．0g 水 1000ml
硫代硫酸钠 2．3g
除糖、指示液及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭
菌后为7.2±0．1，加入琼脂，加热溶化后，再加入其余成分，摇匀，冷至60℃，
倾注平皿。
13．溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基
胨 10．0g 溴化十六烷基三甲铵 0.3g
牛肉浸出粉 3．0g 琼脂 14.0g
氯化钠 5．0g 水 1000ml
除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解．调节pH值使灭菌后为
7．5±0．1，加入琼脂，加热溶化后，分装，灭菌，冷至60℃，倾注平皿。
14．亚碲酸盐肉汤培养基
临用前，取灭菌的营养肉汤培养基，每100ml中加入新配制的1％亚碲酸钠
(钾)试液O．2ml，混匀，即得。
15．卵黄氯化钠琼脂培养基
胨 6．0g 10％氯化钠卵黄液 100ml
牛肉浸出粉 1．8g 琼脂 14．0g
氯化钠 30．0g 水 650ml
除10％氯化钠卵黄液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌
后为7．6+0．1，灭菌，待冷至约60℃，以无菌操作加入10％氯化钠卵黄液，充分
振摇，倾注平皿。
10％氯化钠卵黄液的制备 取新鲜鸡蛋1个，以无菌操作取出卵黄，放入l0％
无菌氯化钠溶液100ml中，充分振摇，即得。
16．甘露醇氯化钠琼脂培养基
胨 10．0g 酚磺酞指示液 2．5ml
牛肉浸出粉 1．0g 琼脂 14．0g
甘露醇 10．0g 水 1000ml
氯化钠 75．0g
除甘露醇、酚酞磺指示液及琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节
pH值使灭菌后为7．4±0．2，加入琼脂，加热溶化后，滤过，分装，灭菌，冷至
60℃，倾注平皿。
17．乳糖发酵培养基
胨 20．0g 乳糖 10．0g
0．04％溴甲酚紫指示液 水 1000ml
25ml
除0．04％溴甲酚紫指示液外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使
灭菌后为7．2+0．2，加入指示液，分装于含倒管的小试管中，每管3ml。灭菌。
18．绿脓菌素(pyocyanin)测定用培养基(PDP琼脂培养基)
胨 20．0g 甘油 10ml
氯化镁(无水) 1．4g 琼脂 14．0g
硫酸钾(无水) 10．0g 水 1000ml
取胨、氯化镁、硫酸钾和水混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为
7．3±0．1，加入甘油及琼脂，加热溶化，混匀，分装于试管，灭菌，置成斜面。
19．庖肉培养基
牛肉碎块的制备 取新鲜牛肉，除去脂肪和筋腱，加蒸馏水煮沸约10分钟，
切成约5mm〈3〉的小块，称重，按1：3(肉：水)加蒸馏水，置4～lO℃浸18～20小
时后，煮沸1小时，用白布过滤(滤液即为1：3牛肉浸液)，肉渣用自来水漂洗2
次，然后加入适量氢氧化钠溶液，搅拌，使pH在8．4左右，浸泡过夜，次日倾
去上层水，用蒸馏水冲洗2～3次，放在纱布上，自动沥干(不要挤压)。将肉渣铺
在搪瓷盘上，灭菌，于80～100℃烘干，筛去碎屑，装瓶，保持干燥，备用。
庖肉培养基的制备 将上述碎肉块装入合适的容器中，再加入营养肉汤培养
基．碎肉的量约为1．5％，调节pH使灭菌后为7．3±0．1。灭菌。
20．哥伦比亚琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物 10．0g 肉胃酶消化物 5．0g
心胰酶消化物 3．0g 酵母浸出粉 5．0g
玉米淀粉 1．0g 氯化钠 5．0g
琼脂 15．0g 水 1000ml
除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH值使灭菌后为
7．3±0．2，加入琼脂，加热溶化，滤过，分装，灭菌，冷45～50℃，加入相当于
20mg庆大霉素的无菌硫酸庆大霉素，混匀，倾注平皿。
试 药
十四烷酸异丙酯lsopropyl Myristate[C〈［17］〉H〈［34］〉O〈［2］〉
＝270．46］
本品为无色液体。溶于乙醇、乙醚、丙酮、三氯甲烷或甲苯，不溶于水、
甘油或丙二醇。约208℃分解。
二盐酸二甲基对苯二胺 N，N-Dimethyl-p-Pheny- lenediamine Dihydrochloride
［C〈［8］〉 H〈［12］〉 N〈［2］〉·2HCI＝209．12］
本品为白色或灰白色结晶性粉末；置空气中色渐变暗；易吸潮。在水或乙
醇中溶解。
牛肉浸出粉 Beef Extract Powder
本品为米黄色粉末，在水中溶解。
牛胆盐Ox Bile Salt
本品为淡黄色或黄棕色粉末．味苦而甜，具吸湿性。在水或醇中易溶。
4-甲基伞形酮葡糖苷酸 4-Methylumbelliferyl-β-D- Glucuronide，MUG［C〈［18］〉
H〈［16］〉O〈［9］〉＝376．3]
本品为白色针状结晶。在水、乙醇或乙醚中溶解。在稀氢氧化钠溶液中分
解。
玫瑰红钠(四氯四碘荧光素钠) Rose Bengal Sodium Salt［C〈［20］〉H〈［2］〉
CI〈［4］〉I〈［4］〉Na〈［2］〉O〈［5］〉＝1017．6]
本品为棕红色粉末。在水中溶解，溶液呈紫色，无荧光；在硫酸中溶解，
溶液为棕色。
单硬脂酸甘油酯Glycerol Monostearte［C〈［21］〉H〈［42］〉O〈［4］〉＝
358．56］
本品为白色或黄色蜡状。在热有机溶剂或矿物油中溶解，在水中不溶，但
与水能乳化。
枸橼酸铁铵Ammonium Ferric Citrate［C〈［12］〉H〈［22］〉FeN〈［3］〉
O〈［14］〉＝488．16］
本品为棕红色或绿色鳞片或粉末，易潮解，见光易还原成亚铁。在水中溶
解，在醇或醚中不溶。
胰蛋白胨 Tryptone
本品为米黄色粉末。在水中溶解。
液状石蜡 Paraffin Liquid
本品为无色油状液体。在水和醇中不溶。能与醚、苯、三氯甲烷、二硫化
碳和油类相混溶。
酪蛋白胰酶消化物(胰酪胨或酪胨)Pancreatic Di-gest of Casein
本品为黄色或浅黄色颗粒。以干酪素为原料经胰酶水解、活性炭脱色处理、
精制而成。
试 液
二盐酸二甲基对苯二胺试液 取二盐酸二甲基对苯二胺0．1g，加水10ml，即
得。临用时少量配制，于冷处避光保存，如试液变成红褐色，不可使用。
亚碲酸钠(钾)试液 取亚碲酸钠(钾)0．1g，加新鲜煮沸后冷全50℃的水10ml使溶
解。
玫瑰红钠试液 取玫瑰红钠0．1g，加水使溶解成75ml。
亮绿试液 取亮绿0．1g，加水100ml使溶解。
盐酸试液 取盐酸8．4ml，加水使稀释成100ml。
靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛5．0g，加人戊醇(或丁醇)75ml，充分振摇，
使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽
变深，或取对二甲氨基苯甲醛1．0g，加入95％乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解
后，取盐酸20ml徐徐滴入。
碘试液 取碘6g与碘化钾5g，加水20ml使溶解。
过氧化氢试液 取浓过氧化氢溶液(30％)，加水稀释成3％的溶液。临用时配
制。
指示液
中性红指示液 取中性红1．0g，研细，加95％乙醇60ml使溶解，再加水至
100ml。
变色范围pH6．8～8．0(红→黄)。
亚甲蓝指示液 取亚甲蓝0．5g，加水使溶解成100ml。
酚磺酞指示液 取酚磺酞1．0g，加lmol／L氢氧化钠溶液2．82ml，使溶解，再
加水至100ml。
变色范围pH6．8～8．4(黄→红)。
溴甲酚紫指示液 取溴甲酚紫1．6g，加95％乙醇使溶解成100ml。
变色范围pH5．2～6．8(黄→紫)。
曙红钠指示液 取曙红钠2．0g，加水使溶解成100ml。
微生物限度标准
非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径及对患者健康潜在的
危害而制订的。药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料的检验，
新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，
其微生物限度均以本标准为依据。
1．制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂 应符合无菌检
查法规定。
2．口服给药制剂
细菌数 每1g不得过1000个。每lml不得过100个。
霉菌和酵母菌数 每lg或1ml不得过100个。
大肠埃希菌 每1g或1ml不得检出。
3．局部给药制剂
3．1用于手术、烧伤及严重创伤的局部给药制剂 应符合无菌检查法规定。
3．2 眼部给药制剂
细菌数 每1g或1ml不得过10个。
霉菌数和酵母菌数 每1g或1ml不得检出。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌 每1g或1ml不得检出。
3．3 耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂
细菌数 每1g、1m1或10cm〈2〉不得过100个。
霉菌和酵母菌数 每1g、1ml或10cm〈2〉不得过10个。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 每1g、1ml或10cm〈2〉不得检出。
大肠埃希菌 鼻及呼吸道给药的制剂，每1g、1ml或10cm〈2〉不得检出。
3．4阴道、尿道给药制剂
细菌数 每lg或Iml不得过100个。
霉菌数和酵母菌数 每1g或1ml应小于10个。
金黄色葡萄球菌、铜绿似单胞菌 每lg或1ml不得检出。
3．5直肠给药制剂
细菌数 每lg不得过1000个。每1ml不得过100个。
霉菌和酵母菌数 每1g或1ml不得过100个。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌 每1g或lml不得检出。
3．6其他局部给药制剂
细菌数 每1g、lml或10cm〈2〉，不得过100个。
霉菌和酵母菌数 每1g、1ml或10cm〈2〉不得过100个。
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 每1g、1ml或10cm〈2〉不得检出。
4．含动物组织(包括提取物)的口服给药制剂 每10g或10ml还不得检出沙门菌。
5．有兼用途径的制剂 应符合各给药途径的标准。
6．霉变、长螨者 以不合格论。
7．原料及辅料 参照相应制剂的微生物限度标准执行。
书页号：2005版药典三部附录73页
附录Ⅻ A 无菌检查法
无菌检查法系用于确定要求无菌的生物制品、原料、辅料及要求无菌的其
他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明供试品
在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在环境洁净度10 000级和局部洁净度100级的单向流空气区域内或
隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流
空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉
降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进
行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
除另有规定外，稀释液、冲洗液、培养基、实验器具等灭菌时，采用验证合
格的灭菌程序灭菌。
各种生物制品的无菌检查，除另有规定外，均应照本法进行。
当供试品为新的产品或供试品的生产工艺改变时，应进行方法验证，以确
认供试品在该试验条件下无抑菌活性或抑菌活性可忽略不计。
一、培养基及其制备方法
培养基应适合需氧菌、厌氧菌或真菌的生长，可按以下处方制备，亦可使
用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。
(一) 硫乙醇酸盐流体培养基(用于培养需氧菌、厌氧菌)
胰酪蛋白胨(或酪素胰酶消化液，总氮含量为2000mg) 15.0g
酵母浸出粉(或酵母透析液200ml) 5.0g
葡萄糖 5.0g
氯化钠 2.5g
L-胱氨酸(或半胱氨酸盐酸盐) 0.5g
硫乙醇酸钠(或硫乙醇酸 0.6m1) 0.5g
琼脂 0.65～0.75g
刃天青 0.001g
水 1000ml
除葡萄糖和刃天青外，称取上述成分加入水中，微温溶解后，调节pH为弱
碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为
7.1±0.2。
在供试品接种前，氧化层的颜色(粉红色)不得超过培养基深度的1/3，否则，
须经水浴煮沸加热至粉红色消失(不超过20分钟)，迅速冷却。培养基只限加热一
次，并防止被污染。
(二) 改良马丁培养基(用于培养真菌)
蛋白胨 5.0g
酵母浸出粉(或酵母透析液100ml) 2.0g
葡萄糖 20.0g
磷酸氢二钾 1.0g
硫酸镁(MgS04·7H2O) 0.5g
水 1000ml
除葡萄糖外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节pH值约为6.8，煮沸，
加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2。
(三) 营养琼脂培养基(用于培养需氧菌)
蛋白胨 10.0g 琼脂 14.0g
牛肉浸粉 5.0g 水 1000ml
氯化钠 5.0g
取上述成分加入水中，微温溶解后，调节pH值为弱碱性，煮沸，滤清，调
节pH值使灭菌后为7.2±0.2。
以上培养基一般分别按10ml、40ml、100ml、200ml(或其他适宜体积)分装于试管
或其他容器中(装量为试管或容器高度的2/5)，随后采用验证合格的灭菌程序灭
菌。灭菌后，培养基需经无菌检查合格。合格的培养基应保存在2～25℃，并防
止被污染；使用期限不得超过3周。
二、培养基灵敏度检查
(一) 菌种
由国家药品检定机构分发。
需氧菌
乙型溶血性链球菌 (Streptococcus hemdytis-β) [CMCC (B) 32210]
短芽孢杆菌 (Bacillus brevis 7316株)
厌氧菌
生孢梭菌(Clostridium sporogenes) [CMCC (B) 64941]
真菌
白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC (F) 98001]
(二) 菌液制备
将乙型溶血性链球菌、生孢梭菌、短芽孢杆菌新鲜培养物分别接种于被检
的培养基中，经30～35℃培养一定时间(乙型溶血性链球菌和生孢梭菌培养24～48
小时，短芽孢杆菌培养18～20小时)后，将乙型溶血性链球菌和短芽孢杆菌分别刮
入0.9%无菌氯化钠溶液内制成均匀菌液；将生孢梭菌菌液吸入灭菌的试管内，用
0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀菌液；白色念珠菌接种在土豆培养基上，置
20～25℃培养5～7天后，用0.9%无菌氯化钠溶液洗下菌苔制成均匀菌液，再将以
上菌液稀释至与标准比浊管(由国家药品检定机构分发)相同之浓度，然后用0.1%
蛋白胨水作10倍系列稀释。
(三) 培养基接种
取稀释度为10〈-6〉～10〈-8〉的短芽孢杆菌菌液、10〈-6〉～10〈-8〉生孢梭
菌菌液、10〈-7〉～10〈-9〉乙型溶血性链球菌菌液和10〈-5〉～10〈-7〉白色念珠
菌菌液各1ml，分别接种到每管装量为9ml的被检培养基中(用于厌氧菌的培养基在
试管中装量高度不得低于7cm)。每个稀释度菌液至少接种3管，并用未接种的培
养基作对照，将接种乙型溶血性链球菌、生孢梭菌的培养基置30～35℃培养3天，
接种短芽孢杆菌的培养基置30～35℃培养5天，接种白色念珠菌的培养基置
20～25℃培养5天，逐日记录结果。
(四) 结果判定
以接种后培养基管数的2/3以上呈现生长的最高稀释度为该培养基的灵敏度，
在3次试验中，以2次达到的最高灵敏度为判定标准。
培养基灵敏度 乙型溶血性链球菌应达到10〈-8〉，短芽孢杆菌和生孢梭菌应
达到10〈-7〉，白色念珠菌应达到10〈-6〉。
(五) 注意事项
(1) 不应在同一洁净室内同时操作两个菌株，以防止交叉污染。
(2) 无菌检查用培养基应每批进行灵敏度检查，合格后方可使用。
三、各种培养基的采用
(一) 检查需氧性和厌氧性杂菌，应采用硫乙醇酸盐流体培养基。
(二) 检查活疫苗时，可适当增加琼脂含量，做成斜面。
四、抽样量及抽验瓶数
(一) 原液及半成品
原液及半成品抽验量应至少为0.1%，但不得少于10ml。如原液及半成品除菌
过滤后分装于多个容器内，则每个容器抽验量不得少于10ml。原液及半成品每开
瓶一次，应如上法抽验。体外用诊断制品半成品每批抽验量至少3ml。
(二) 成品
每亚批均应进行无菌检查。供试品应随机抽取，具有代表性(包括分装过程
的前、中、后抽样或冻干柜中不同板层的抽样)。成品抽验量分出厂制品抽验量
和上市制品监督抽验量两种。
1．出厂制品抽验量
(1) 分装量在100支(瓶)或100支(瓶)以下者抽验不少于5支，101～500支(瓶)者抽验
不少于10支(瓶)，500支(瓶)以上者抽验不少于20支(瓶)。
(2) 每瓶装量在20ml以上的冻干血液制品，每柜冻干200瓶以下者抽验2瓶，200
瓶或以上者抽验4瓶。每瓶装量6～20ml抽验数量加倍。5ml和5ml以下者按“1.出厂制
品抽检量”的(1)抽验。
2．上市制品监督抽验量
(1) 除血液制品外，其他生物制品每批抽验8支(瓶)。
(2) 血液制品每瓶装量在50ml以下者抽验6瓶，50ml或50ml者以上抽2瓶。
3．需要复核结果的送检制品，其无菌检查的抽验量同上市制品监督抽检
量。
4．每支(瓶)抽验量
(1) 直接接种法 按下表抽取。
┏━━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━┳━━━━━┳━━━━
┃每支(瓶)制品装量V/ml ┃V＜0.5 ┃0.5≤V＜5 ┃ 5≤V＜20 ┃ 20≤V＜100
┣━━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━
┃每支(瓶)抽验量/ml ┃全量 ┃ 0.5 ┃ 1.0 ┃ 5.0
┗━━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━┻━━━━━┻━━━━
(2) 薄膜过滤法 每瓶装量100ml或100ml以下者取全量，100ml以上者取半量。
五、检查法
无菌检查法包括直接接种法及薄膜过滤法。除另有规定外，如供试品允许，
应优先采用薄膜过滤法。
(一) 直接接种法
(1) 含防腐剂的供试品，应先增菌培养。按成品抽样量及抽验瓶数的要求抽
取的供试品逐瓶取样，并按每20支安瓿混合后接种。应接种培养基瓶数依供试
品混合总量(全部接种)而定。接种量与培养基的比例：用苯酚或三氯甲烷作防腐
剂者至少为1：20；用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛、抗生素者至少为1：50。
将混合供试品先按此比例接种于硫乙醇酸盐流体培养基(不得少于200ml)内增菌。
于20～25℃培养3～4天后移种至硫乙醇酸盐流体培养基、营养琼脂斜面、改良马
丁培养基各2管，每管10ml培养基接种0.5ml。将硫乙醇酸盐流体培养基、营养琼脂
斜面各1管置30～35℃培养，其余各管置20～25℃培养；同时以0.9%无菌氯化钠溶
液代替供试品，同法操作作阴性对照。增菌管及移种管培养时间全程不得少于
14天。
(2) 不含防腐剂供试品，不需增菌培养。按成品抽样量及抽验瓶数的要求将
每批(或亚批)抽检的供试品逐瓶(支)取样混合，装量在5.0ml或5.0ml以下者每10瓶(安
瓿)混合，装量在5.0ml以上者，每7瓶(安瓿)混合，应接种培养基管数依供试品混
合总量(全部接种)而定。混合后的供试品接种量按不超过培养基体积10%(ml/m1)直
接接种于硫乙醇酸盐流体培养基、营养琼脂斜面及改良马丁培养基，三种培养
基接种支数之比为1：1：1。接种后的硫乙醇酸盐流体培养基及营养琼脂斜面按
各自总数的1/2置30～35℃培养，其余置20～25℃培养；改良马丁培养基置20～25℃
培养。同时以0.9%无菌氯化钠溶液代替供试品，同法操作做阴性对照。培养时间
不得少于14天。
(3) 供试品浑浊和(或)接种后不能判定结果的制品，可按上表取规定量的供试
品，按直接接种的增菌法做无菌检查。
(4) 体外诊断制品 只需做半成品无菌检查，即半成品除菌过滤后，在加防腐
剂之前留样做无菌检查，用直接接种法，培养8天，观察结果；如有菌生长，制
品需除菌处理后再做无菌检查，若再有菌生长应废弃。如半成品加防腐剂后除
菌，则应留样按直接接种的增菌法作无菌检查，但增菌管及移种管培养时间全
程不得少于8天。
(二) 薄膜过滤法
采用全封闭式薄膜过滤器，薄膜孔径不大于0.45μm，膜直径约47mm。
取规定抽验供试品数(如供试品少于10ml，则先加入100ml 0.9%无菌氯化钠溶液
或适宜的无菌溶剂)，立即在无菌条件下导人无菌薄膜过滤器内，加压或减压过
滤。含汞类等防腐剂的供试品，在供试品过滤后，用0.9%无菌氯化钠溶液或其他
适宜的无菌溶剂冲洗滤膜3次，每次100ml。过滤后，两个滤器中加硫乙醇酸盐流
体培养基各100ml，另一个滤器加改良马丁培养基100ml。一个装硫乙醇酸盐流体培
养基的滤器置30～35℃培养，其余置20～25℃培养，培养时间不少于14天。同时以
0.9%无菌氯化钠溶液代替供试品同法操作，作阴性对照。
(三) 结果判定
如硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基均为澄清，或虽显浑浊但经证
明并非有菌生长，营养琼脂斜面培养基未见菌生长，判供试品符合规定；如硫
乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营养琼脂斜面培养基中任何一管确证
有菌生长，并证明生长的微生物为供试品所含有，判供试品不符合规定。当满
足下列至少一个条件时，判试验结果无效：
(1) 对无菌检查相关设施的微生物监控数据表明其不符合规定；
(2) 对无菌检查过程的回顾，揭示了本操作程序是错误的；
(3) 阴性对照管有菌生长；
(4) 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证微生物生长是因无菌检查中使
用的物品和(或)无菌操作技术不当引起的。
试验如经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，如
无菌生长，判供试品符合规定；如有菌生长，判供试品不符合规定。
页码数,2005版药典附录第91页
附录XIII A 无特定病原体鸡胚质量检测要求
无特定病原体(SPF)鸡系指在严格控制饲养条件下，符合所规定的微生物学
检测要求的鸡。无特定病原体鸡胚是指SPF鸡生产的受精卵，在符合生物制品
生产的条件下，经孵化后所生成的鸡胚。通过对SPF鸡蛋和SPF鸡群病原微生物
的检测，使SPF鸡胚质量得以控制。
检测项目与方法SPF鸡胚病原微生物检测项目和检测方法见下表。（表略）
【附注】●必须检测项目，要求阴性；o必要时检测项目，要求阴性；SPA血清平板凝集试验；IA病原菌分类，AGP琼
脂扩散试验；HI血凝抑制试验；ELISA酶联免疫吸附试验；EST胚敏感试验；SN血清中和试验；TA试管凝集试验；IFA
间接免疫荧光试验。
检测要求 (1)取样禽淋巴白血病病毒和禽脑脊髓炎病毒的检测均应取新鲜鸡
蛋。其他病原微生物检测一律检测血清，每份供试品血清量应不少于lml。必须
按无菌操作程序取样，防止污染。
(2)取样数量淋巴白血病病毒检测，每个鸡群取鸡蛋200枚(少于200只的鸡群从
全群中取样)，每只鸡取蛋1枚。禽脑脊髓炎病毒检测，每个鸡群取鸡蛋不少于
50枚(少于50只鸡的鸡群应从全群中取样)，每只鸡取蛋1枚。其他病原微生物感染
检测，应采取随机方式取样，抽取每个鸡群的5％，少于200只鸡的鸡群应按
10％～15％抽样。
(3)供试品的保存与运输 取样后应尽快将供试品送往检测实验室检验。不能
及时运送的供试品，血清须在-15℃以下保存，鸡蛋应在4～10℃保存。保存时间
应不超过1周。供试品应有明显的编号标志，并附送检单，写明鸡群名称、鸡群
数量、供试品名称及数量。供试品在运送过程中应避免温度上升，防止破损。
结果判定检测结果如有1项不符合SPF鸡胚微生物学检测指标，则此批送检的
鸡胚判为不合格。
页码数,2005版药典附录第33页
附录ⅥI戊二醛残留量测定法
本法系依据戊二醛与2，4一二硝基苯肼反应生成正戊醛二硝基苯肼，用高
效液相色谱法，测定供试品中戊二醛含量。
照高效液相色谱法(附录ⅢB)测定。
色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂(SGl20，S-5μm，直径4．6mm，长
250mm)；以70％乙腈溶液为流动相；流速为每分钟1．2ml；检测波长为360nm；
记录时间为30分钟。
测定法取戊二醛对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释成每lml中约
含10μg的溶液；精密量取该溶液O．2ml、0．4ml、O．6ml、O．8ml、1．0ml，分
别置试管中，各加水至1．0ml，精密加流动相lml与2，4-二硝基苯肼溶液(取2，4-
二硝基苯肼2．4g，加30％高氯酸溶液，溶解成100m1)O．1ml，立即于混合器上混
匀，用O．45μm膜滤过。另取供试品适量，以每分钟3000转离心10分钟，精密
量取上清液lml，自“加流动相lml※’起，同法操作。分别精密量取对照品溶液与供
试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
以戊二醛对照品溶液的浓度对峰面积作直线回归，求得回归方程；计算出
供试品溶液中戊二醛含量。
【附注】 (1)配制戊二醛对照品溶液用的戊二醛用量0．1 g(系经色谱纯度测定
后折算其含量为100％)。
(2)直线回归相关系数应不低于O．99。
本法系用气相色谱法测定供试品中磷酸三丁酯残留量。
页码数,2005版药典附录第66页
附录ⅪC吸附白喉疫苗效价测定法
第一法豚鼠毒素攻击法(仲裁法)
本法系用白喉毒素攻击经供试品与标准品分别免疫后的豚鼠，比较其存活
率，计算出供试品的效价。
标准品和供试品溶液的制备将标准品和供试品用生理氯化钠溶液按等比间
隔稀释3～5个稀释度，使中间藕释度在攻毒后必须能保护约半数动物。
测定法用稀释好的标准品和供试品溶液分别免癌250～350g豚鼠，每个稀释度
至少免疫10只。另取5只不免疫豚鼠同时饲养作为对照。
免疫4周后，每只免疫豚鼠皮下注射100LD50白喉茜素1·0ml。对照组豚鼠注射
经100倍稀释之上述毒素，每只皮下注射1．0ml。攻毒后观察5天，每日记录动物
死亡情况。根据第5天存活率，以标准品的效价为标准，用平行线法计算供试
品的效价。供试品的效价为每1人用剂量应不低于30IU。如95％可信限大于
50％～200％，则95％可信限的低限效价应大于30IU／人用剂量。
【附注】试验成立的条件：
(1)供试品的最低稀释度能保护半数以上动物；
(2)供试品的最高稀释度能保护半数以下动物；
(3)对照组动物应部分死亡而不全部死亡；
(4)供试品和标准品的剂量反应曲线在平行性及直线性上的差异无显著意义。
第二法小鼠Vero细胞法
本法系用Vero细胞法测定经供试品与标准品分别免疫后的小鼠血清中的白喉
抗毒素水平，计算出供试品的效价.
试剂 (1)MEM培养液临用时于MEM培养液中加入小牛血清、3％谷氨酰胺、青
霉素、链霉素适量，使其终浓度分别为10％、O．03％、100IU／ml和100IU／m1。
用7％碳酸氢钠溶液调pH至7．0～7．2．
(2)无Ca2+、Mg2+缓冲液称取氯化钠8．Og、氯化钾O·2g、磷酸氢二钠1．15g，
加水溶解并稀释至1000ml。
(3)O·25％胰酶溶液称取胰酶2．5g、乙二胺四乙酸二钠O·2g，用无CaZ+、Mg2+
缓冲液溶解，并稀释至 1000ml，用7％碳酸氢钠溶液调pH至7．0。
Veto细胞悬液的制备 将Vero细胞培养于150cm2培养瓶中，待单层细胞长满至
80％～100％时，弃去上层培养液，加人O．25％胰酶溶液10ml，置37℃消化数分
钟，弃去胰酶，加入10ml培养液，分散细胞进行计数,用培养液调整细胞浓度
至每lml含2．5×10 5个细胞。
标准品及供试品溶液的稀释用生理氯化钠溶液将吸附白喉类毒素标准品和供
试品分别以2倍系列稀释法稀释成3～5个适当稀释度。
测定法 (1)免疫与采血用吸附白喉类毒素标准品和供试品的每一稀释度分别
免疫10～14g NIH小鼠8只，每只小鼠皮下注射0．5ml。免疫5周后，采血，分离血
清，56℃ 30分钟灭能，置-20℃保存。
(2)阳性对照小鼠血清用吸附白喉疫苗免疫1批小鼠，免疫5周后采血，分离血
清，56℃ 30分钟灭能，分装小管，冷冻干燥，保存于-20℃。
(3)毒素试验量测定 Vero细胞测定白喉抗体试验时毒素浓度采用1／10 000 Lcd。
在96孔培养板中用MEM培养液将毒素做2倍系列稀释，每孔50μl，然后向各孔
中加入标准白喉抗毒素(O．0001IU)50μ1，加盖，室温放置1小时后，加入Vero细
胞悬液50／11，加盖，用封板膜封板，置37℃二氧化碳孵箱培养6～7天后，观察
结果，使细胞死亡的最大毒素稀释度(红色)即1／10 000 Lcd。
1／10 000 Lcd的毒素量相当于1×10-4 Lf的毒素，适合本试验。
(4)抗体滴定于96孔微量培养板中测定。
①向每孔加人50μl培养液，但A11、A12孔和Hll、H12孔不加，而G11、G12孔加
100μ1培养液。
②取8份待检血清，分别加入A1至H1孔各50μl，横向进行2倍系列稀释，直至
A10和Hlo孔。
③将标准白喉抗毒素稀释至每lml含0．008IU，加入All、A12、B11和B12孔各
50μl，从B11和B12孔开始竖向做2倍稀释至Dll和D12孔。
④Hll和H12孔加入阳性对照小鼠血清50μ1。
⑤除Gll和G12孔外，向其余各孔中加入毒素(1／10 000 Lcd)50μl，轻轻转动培养
板，混匀，加盖后，置室温1小时。
⑥收集Vero细胞，进行计数，并稀释成每lml含2．5×10 5个细胞的悬液。
⑦室温放置1小时之培养板，每孔立即加入50μl Vero细胞悬液，加盖，用封板
膜封板后，置37℃二氧化碳孵箱培养6～7天。
⑧取出培养板，根据培养液颜色变化记录结果，黄色为(+)，红色(一)，颜色
不明显者则可用显微镜观察，如单层细胞完整无损为(+)，否则记录(一)。最终
结果用以2为底的指数表示，终点为变成黄色的最高稀释度孔的指数。例如，变
黄的最后1孔稀释倍数是256，即为2 8，则结果记为8。
用平行线分析法进行结果计算。供试品和标准品的剂量反应曲线在平行性及
直线性上的差异无显著意义。供试品的效价每1人用剂量应不低于30IU。如95％
可信限大于50％～200％，则95％可信限的低限效价每1人用剂量应大于30IUo
【附注】试验要求：
(1)Ell、E12、Fit和F12孔代表毒素量和Vero细胞敏感度，应出现(一)，如果出
现(+)，则毒素量和细胞敏感度都很低，应重试；
(2)细胞孔G11、G12和阳性对照孔Hll、H12都必须是(+)，如出现(一)，应重试；
(3)如毒素用量准确(1／10 000 Lcd)，则All、A12和B11、B12孔均应为(+)，而Cn、
C12和D11、D12均应为(一)，否则应重试；
(4)细胞计数应准确。
页码数,2005版药典附录第66页
附录ⅪB吸附破伤风疫苗效价测定法
本法系用破伤风毒素攻击经供试品与标准品分别免疫后的小鼠(或豚鼠)，比
较其存活率，计算出供试品的效价。
标准品和供试品溶液的制备用生理氯化钠溶液将破伤风类毒素标准品和供试
品以适当比例稀释成3～5个稀释度(居中的稀释度必须在攻毒后能保护约半数动
物)。
测定法用每一稀释度的破伤风类毒素标准品和供试品溶液分别免疫体重
14～16g NIH小鼠至少14只(或250～350g豚鼠至少10只)，每只小鼠皮下注射O．5ml
(或每只豚鼠皮下注射lml)。另外10只未注射的小鼠作为对照(或另外未注射的5只
豚鼠作为对照)。免疫4周后，每只免疫小鼠皮下注射50LD50破伤风毒素O．5ml(
或每只免疫豚鼠皮下注射100 LD50破伤风毒素1．0m1)。对照组每只小鼠皮下注射
1LD50破伤风毒素O．5ml(或对照组每只豚鼠注射1LD50破伤风毒素1．0m1)。攻击
后观察5天，每日记录结果。根据第5日存活率的剂量反应曲线，用平行线法计
算结果。95％可信限应不大于效价的50％～200％，否则95％可信限的低限应大于
相应品种中要求的效价规格。
【附注】试验成立应具备的条件：
(1)供试品的最低稀释度能保护半数以上动物；
(2)供试品的最高稀释度能保护半数以下动物；
(3)供试品和标准品的剂量反应曲线在平行性及直线性上的差异无显著意义；
(4)对照组动物应部分死亡而不全部死亡。
书页号：2005版药典三部附录78页
附录Ⅻ E 细菌内毒素检查法
本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断
供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法
和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结
果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、
仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用
于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。
光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005EU/ml。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法
是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方
法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无
内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。
供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成
供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱
或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液(或其稀释液)的pH值，可使用酸、
碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌
内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒
素和干扰因子。
内毒素限值的确定 药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确
定：
L=K/M
式中 L 为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U(活性单位)表示；
K 为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg·h)表示，注射
剂K=5EU/(kg·h)，放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg·h)，鞘内用注射剂
K=0.2EU/(kg·h)；
M 为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)或
U/(kg·h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。
按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况
做必要调整，但需说明理由。
确定最大有效稀释倍数(MVD) 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被
允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。
用以下公式来确定MVD：
MVD=cL/λ
式中 L 为供试品的细菌内毒素限值；
c 为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或
EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原
料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L；
λ 为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)，或是在光度测定法中所使用的
标准曲线上最低的内毒素浓度。
方法1 凝胶法
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素
的方法。
鲎试剂灵敏度复核试验 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内
毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试
剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复
核试验。
根据鲎试剂灵敏度的标示值(λ)，将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工
作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成
2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上
混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的
鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个
内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将
试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分
钟±2分钟。
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不
变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管
壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，
试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的
测定值(λc)。
λc=lg〈-1〉(∑X/4)
式中 X 为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度
中最后一个呈阳性结果的浓度。
当λc在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度
λ为该批鲎试剂的灵敏度。
干扰试验 按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内
毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操
作。
只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结
果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的
反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)。
Es=lg〈-1〉(∑Xs/4)
Et=lg〈-1〉(∑Xt/4)
式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值(lg)。
当Es在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es～2Es(包括0.5Es和2Es)时，认为供试品在
该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应
将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
表1 凝胶法干扰试验溶液的制备
┏━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━┳━━┳━━━━┳━━━
┃ 编号 ┃内毒素浓度／配制┃稀释用液 ┃稀释┃所含内毒┃平行
┃ ┃ 内毒素的溶液 ┃ ┃倍数┃素的浓度┃管数
┣━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━ ╋━━╋━━━━╋━━━
┃ A ┃ 无/供试品溶液 ┃ — ┃ — ┃ — ┃ 2
┣━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━ ╋━━╋━━━━╋━━━
┃ B ┃ 2λ/供试品溶液 ┃ 供试品溶液 ┃ 1 ┃ 2λ ┃ 4
┃ ┃ ┃ ┃ 2 ┃ 1λ ┃ 4
┃ ┃ ┃ ┃ 4 ┃ 0.5λ ┃ 4
┃ ┃ ┃ ┃ 8 ┃ 0.25λ ┃ 4
┣━━━╋━━━━━━━━╋━━━ ━━ ╋━━╋━━━━╋━━━
┃ C ┃ 2λ/检查用水 ┃ 检查用水 ┃ 1 ┃ 2λ ┃ 4
┃ ┃ ┃ ┃ 2 ┃ 1λ ┃ 4
┃ ┃ ┃ ┃ 4 ┃ 0.5λ ┃ 4
┃ ┃ ┃ ┃ 8 ┃ 0.25λ ┃ 4
┣━━━╋━━━━━━━━╋━━━ ━ ━╋━━╋━━━━╋━━━
┃ D ┃ 无/检查用水 ┃ — ┃ — ┃ — ┃ 2
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注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系
列；D为阴性对照。
可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、
透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不
会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液
进行干扰试验。
当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检
查法时，须进行干扰试验。
当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能
影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
检查法
(1) 凝胶限量试验
按表2制备溶液A、B、c和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试
品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表2 凝胶限量试验溶液的制备
┏━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━┓
┃ 编号 ┃内毒素浓度／配制内毒素的溶液 ┃ 平行管数 ┃
┣━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━┫
┃ A ┃ 无／供试品溶液 ┃ 2 ┃
┣━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━┫
┃ B ┃ 2λ／供试品溶液 ┃ 2 ┃
┣━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━┫
┃ C ┃ 2λ／检查用水 ┃ 2 ┃
┣━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━┫
┃ D ┃ 无／检查用水 ┃ 2 ┃
┗━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━━┛
注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。
结果判断 保温60分钟±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴
性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳
性，试验有效。
若溶液A的两个平行管均为阴性，判供试品符合规定；若溶液A的两个平行
管均为阳性，判供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另
一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为
阴性，判供试品符合规定；否则判供试品不符合规定。
(2) 凝胶半定量试验
本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按表3制备
溶液A、B、C和D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表3 凝胶半定量试验溶液的制备
┏━━━┳━━━━━━━━┳━━━ ━┳━━┳━━━━┳━━
┃ 编号 ┃内毒素浓度／配制┃稀释用液 ┃稀释┃所含内毒 ┃平行
┃ ┃ 内毒素的溶液 ┃ ┃倍数┃素的浓度 ┃管数
┣━━━╋━━━━━━━━╋━━━ ━╋━━╋━━━ ━╋━━
┃ A ┃ 无／供试品溶液 ┃ 检查用水┃ 1 ┃ — ┃ 2
┃ ┃ ┃ ┃ 2 ┃ — ┃ 2
┃ ┃ ┃ ┃ 4 ┃ — ┃ 2
┃ ┃ ┃ ┃ 8 ┃ — ┃ 2
┣━━━╋━━━━━━━━╋━━━ ━╋━━╋━━ ━━╋━━
┃ B ┃ 2λ／供试品溶液 ┃ ┃ 1 ┃ 2λ ┃ 2
┣━━━╋━━━━━━━━╋━━ ━━╋━━╋━━ ━━ ╋━━
┃ C ┃ 2λ／检查用水 ┃ 检查用水┃ 1 ┃ 2λ ┃ 2
┃ ┃ ┃ ┃ 2 ┃ 1λ ┃ 2
┃ ┃ ┃ ┃ 4 ┃ 0.5λ ┃ 2
┃ ┃ ┃ ┃ 8 ┃ 0.25λ ┃ 2
┣━━━╋━━━━━━━━╋━━━ ━ ╋━━╋━ ━ ━━╋━━
┃ D ┃ 无／检查用水 ┃ — ┃ — ┃ — ┃ 2
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注：A为不超过MYD并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀
释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀释倍数不得超过
MVD。
B为2λ浓度标准内毒素的溶液A(供试品阳性对照)。
C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。
D为阴性对照。
结果判断 若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平
行管均为阳性，系列溶液c的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ～2λ之间，试验有
效。
系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点
浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度[按
公式cE=lg〈-1〉(∑X/2)]。如果检验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液
内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。
如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于λ(如果
检验的是稀释过的供试品，则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀释
倍数)。如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等
于最大的稀释倍数乘以λ。
若内毒素浓度小于规定的限值，判供试品符合规定。若内毒素浓度大于或
等于规定的限值，判供试品不符合规定。
方法2 光度测定法
光度测定法分为浊度法和显色基质法。
浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量
的方法。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据
反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率)之间存在
着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到
达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。
显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底
物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显
色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终
止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态
显色法是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，
或检测色度增长速度的方法。
光度测定试验需在特定的仪器中进行，温度一般为37℃±1℃。
供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照
所用仪器和试剂的有关说明进行。
为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及
供试品的干扰试验。
标准曲线的可靠性试验 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能
会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。
用标准内毒素配成溶液，制成至少3个浓度的稀释液(相邻浓度间稀释倍数不
得大于10)，最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀
时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照。当阴性对
照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归分
析。
根据线性回归分析，标准曲线的相关系数(r)的绝对值应大于或等于0.980，试
验方为有效。否则须重新试验。
干扰试验 选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度(设为λm)，作为供
试品干扰试验中添加的内毒素浓度。按表4制备溶液A、B、C和D。
表4 光度测定法干扰试验溶液的制备
┏━━━┳━━━━━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━┓
┃ ┃ ┃ 配制内毒 ┃ ┃
┃编号 ┃ 内毒素浓度 ┃ 素的溶液 ┃ 平行管数 ┃
┣━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃ A ┃ 无 ┃ 供试品溶液 ┃ 不少于2个 ┃
┣━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃ ┃ 标准曲线的中点(或附 ┃ ┃ ┃
┃ B ┃ ┃ 供试品溶液 ┃不少于2个 ┃
┃ ┃ 近点)的浓度(设为Xm) ┃ ┃ ┃
┣━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃ ┃ 至少3个浓度(最低一 ┃ ┃ 每一浓度 ┃
┃ C ┃ ┃ 检查用水 ┃ ┃
┃ ┃ 点设定为λ) ┃ ┃ 不少于2个 ┃
┣━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃ D ┃ 无 ┃ 检查用水 ┃ 不少于2个 ┃
┗━━━┻━━━━━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━┛
注：A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液；
B为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的，且与溶液A
有相同稀释倍数的供试品溶液；
C为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒
素溶液；
D为阴性对照。
按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液
的内毒素含量c〈〔t〕〉和c〈〔s〕〉，再按下式计算该试验条件下的回收率
(R)。
R=(c〈〔s〕〉－c〈〔t〕〉)/λm×100%
当内毒素的回收率在50%～200%之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不
存在干扰作用。
当内毒素的回收率不在指定的范围内，须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除
干扰因素。并重复干扰试验来验证处理的有效性。
当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何
有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
检查法
按“光度测定法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。
使用系列溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。
试验必须符合以下三个条件方为有效：
(1) 系列溶液C的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求；
(2) 用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的内毒素
的回收率要在50%～200%的范围内；
(3) 溶液D的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。
结果判断若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小
于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，
判供试品不符合规定。
注：本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。
页码数,2005版药典附录第94页
附录XlV 细菌生化反应培养基
下列各类培养基常用于测定细菌的糖类代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试
验、碳源和氮源利用试验等生化反应。
1．糖、醇发酵培养基
(1)成分
基础液
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
0．5％酸性品红指示液 10ml
(或O．4％溴麝香草酚蓝指示液) (6m1)
水 1000ml
糖、醇类 每100ml基础液内各加0．5g
(2)制法 取蛋白胨和氯化钠加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为
7．3土0．1，加入指示液混匀。每100m1分别加入一种糖、醇或糖苷，混匀后分
装于小管中(若需观察产气反应，在小管内另放置杜汉小倒管)。于116℃灭菌1
5分钟。
常用的糖、醇或糖苷：阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、
半乳糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、蕈糖、纤维二糖、蜜二糖、棉子糖、松三糖、
菊糖、糊精、淀粉、甘露醇、卫矛醇、山梨醇、肌醇、甘油、水杨素、七叶苷
等。
(3)用途 鉴别各种细菌对糖类的发酵生化反应，发酵者产酸，培养基变色(加
酸性品红者由无色至红色或再至黄色；加溴麝香草酚蓝者由蓝色至黄色)；产气
时，小倒管内有小气泡。
2．七叶苷培养基
(1)成分
蛋白胨 5g 七叶苷3g
磷酸氢二钾 1g 水1000ml
枸橼酸铁 O．5g
(2)制法除七叶苷外，取上述成分混合，微温使溶解，加入七叶苷混匀，调节
pH值使灭菌后为7．3±0．1，分装于试管中，121℃灭菌15分钟。
(3)用途用于鉴别细菌对七叶苷的水解试验，产生棕黑色沉淀为阳性反应。
3．磷酸盐葡萄糖胨水培养基
(1)成分
蛋白胨 7g 葡萄糖 5g
磷酸氢二钾 3．8g 水 1000ml
(2)制法取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7．3±0．1，分装
于小试管中，121℃灭菌15分钟。
(3)用途用于鉴别细菌的甲基红试验(M-R反应)和乙酰甲基甲醇试验(V-P反应)。
①甲基红试验(M-R反应) 取可疑菌落或斜面培养物，接种磷酸盐葡萄糖胨水
培养基中，于35℃培养2～5日，于培养管内加入甲基红指示液(取甲基红0．1g，
加95％乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml)数滴，立即观察，呈鲜红色或橘红色
为阳性，呈黄色为阴性。
②乙酰甲基甲醇生成试验(V-P反应)取可疑菌落或斜面培养物，接种磷酸盐葡
萄糖胨水培养基中，于35℃培养48小时，取2ml培养液，加入a-萘酚乙醇试液(取
α-萘酚5g，加无水乙醇溶解使成100m1)lml，混匀，再加40％氢氧化钾溶液O．4ml，
充分振摇，立刻或数分钟内出现红色，即为阳性反应；无红色反应为阴性，如
为阴性反应，置35℃水浴4小时后再观察。
4．蛋白胨水培养基
(1)成分
蛋白胨 10g 水 1000ml
氯化钠 5g
(2)制法 取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7．3±0．1，分
装于小试管，121℃灭菌15分钟。
(3)用途用于鉴别细菌能否分解色氨酸而产生靛基质的生化反应。
①靛基质试验取可疑菌落或斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，于35℃
培养24～48小时，必要时培养4～5日，沿管壁加入靛基质试液数滴，液面呈玫瑰
红色为阳性，呈试剂本色为阴性。
②靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛5g，加入戊醇(或异戊醇)75ml，充分振摇，
使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色
泽变深。或取对二甲氨基苯甲醛1g，加入95％乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解
后，再取浓盐酸20ml徐徐滴入。
5．三糖铁琼脂培养基
(1)成分
蛋白胨 20g 硫酸亚铁 O．2g
牛肉浸出粉 5g 硫代硫酸钠 O．2g
乳糖 10g 0．2％酚磺酞指示液 12．5ml
蔗糖 10g 琼脂 12～15g
葡萄糖1g 水 1000ml
氯化钠5g
(2)制法除乳糖、蔗糖、葡萄糖、指示液、琼脂外，取上述成分，混合，加热
使溶解，调pH值使灭菌后为7．3±0．1，加入琼脂，加热溶胀后，再加入其余成
分，摇匀，分装，121℃灭菌15分钟。置成高底层(2～3cm)短斜面。
(3)用途用于初步鉴别肠杆菌科细菌对糖类的发酵反应和产生硫化氢试验。
方法和结果观察：取可疑菌落或斜面培养物，做高层穿刺和斜面划线接种，
于35℃培养24～48小时观察结果。培养基底层变黄色为葡萄糖发酵阳性，斜面
层变黄色为乳糖、蔗糖发酵阳性；底层或整个培养基呈黑色表示产生硫化氢。
6．克氏双糖铁琼脂培养基
(1)成分
蛋白胨20g 枸橼酸铁 0．3g
牛肉浸粉 3g 硫代硫酸钠 0．3g
酵母浸粉3g 0．2％酚磺酞指示液12．5ml
乳糖10g 琼脂 12～15g
葡萄糖1g 水 1000ml
氯化钠 5g
(2)制法除乳糖、葡萄糖、指示液、琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶
解，调pH值使灭菌后为7．3土0．1，加入琼脂，加热溶胀后，再加入其余成分，
摇匀，分装，121℃灭菌15分钟。置成高底层(2～3cm)短斜面。
(3)用途用于初步鉴别肠杆菌科细菌对糖类的发酵反应和产生硫化氢试验。
方法和结果观察：取可疑菌落或斜面培养物，做高层穿刺和斜面划线接种，
于35℃培养24～48小时，观察结果。培养基底层变黄色为葡萄糖发酵阳性，斜面
层呈黄色为乳糖发酵阳性，斜面层呈红色为乳糖发酵阴性；底层或整个培养基
呈黑色表示产生硫化氢。
7．脲(尿素)培养基
(1)成分
蛋白胨 1g 0．2％酚红溶液 6ml
葡萄糖lg 20％无菌脲溶液 100ml
氯化钠 5g 水1000ml
磷酸氢二钾 2g
(2)制法 除脲溶液外，取上述成分，混合，调节pH值使灭菌后为6．91± 0．1，
混匀后，121℃灭菌15分钟，冷至 50～55 ℃，加入无菌脲溶液(经膜除菌过滤)，混
匀，分装于灭菌试管中。
(3)用途用于鉴别细菌的尿素酶反应。
方法和结果观察：取可疑菌落或少量斜面培养物接种于培养基内，于35℃培
养24小时观察结果，若培养基变为红色为尿素酶阳性；不变色者为阴性，阴性
者需延长观察至一周。
8．苯丙氨酸琼脂培养基
(1)成分
磷酸氢二钠 1g 氯化钠 5g
酵母浸膏3g 琼脂 12～15g
DL-苯丙氨酸(DL-phenylalanine) 2g 水 1000ml
(或L-苯丙氨酸) (1g)
(2)制法除琼脂外，取各成分溶于水，调节pH值使灭菌后为7．3±0．1，再加入
琼脂，加热溶胀，分装试管，121℃灭菌15分钟，制成长斜面。
(3)用途用于鉴别细菌的苯丙氨酸脱氨酶试验(也称苯丙酮酸试验)。
方法和结果观察：取斜面培养物，大量接种于苯丙氨酸琼脂斜面，置35℃培
养4小时或18～24小时，取4～5滴10％三氯化铁溶液试剂，由斜面上部流下，若出
现墨绿色，即为苯丙氨酸脱氨酶阳性。倘若不变色则为阴性。
9．氨基酸脱羧酶试验培养基
(1)成分
①基础液
蛋白胨 5g 1.6％溴甲酚紫指示液lml
酵母浸出粉 3g 水 1000ml
葡萄糖 1g
②氨基酸
L-赖氨酸 O．5g (需加碱溶液溶解)
L_鸟氨酸 0．5g (需加碱溶液溶解)
L-精氨酸 0．5g (不需加碱溶液溶解)
(2)制法先配制基础液备用；将溶解后的三种氨基酸，各分别加至100ml基础液
(使氨基酸的终浓度为0·5％)，混匀，调节pH值使灭菌后为6．8。分装于小试管
中，每管2．5ml并滴加一层液体石蜡。同时分装一部分基础液于小试管，作为
对照培养基，均置116℃灭菌10分钟。
(3)用途用于鉴别细菌的脱羧酶、双水解酶试验。
方法和结果观察：取疑似菌斜面培养物分别接种于上述三种培养基及基础液
对照培养基，置35℃培养24～48小时。在培养初期由于待检细菌发酵葡萄糖产
酸，试验培养基和对照培养基应呈黄色，继续培养时，试验培养基如呈紫色或
紫红色，即为阳性反应；如至培养末期，培养基仍同对照管呈黄色则判为阴性
反应。
10．明胶培养基
(1)成分
蛋白胨 5g 明胶 120g
牛肉浸出粉3g 水1000ml
(2)制法取上述成分加入水中，浸泡约20分钟，加热溶解，调节pH值使灭菌后
为7．3±0．1，分装于小试管中，121℃灭菌15分钟。
(3)用途用于细菌的明胶液化试验。
方法和结果观察：取少量待检菌斜面培养物穿刺接种于明胶培养基内，置
35℃培养24小时，取出置冰箱内10～20分钟。如培养基仍呈溶液状，则为阳性；
培养基重新凝固，则为阴性。细菌液化明胶之作用有时甚为缓慢，如未见液
化，需继续培养1～2周方可确定阴性。
11．丙二酸钠培养基
(1)成分
酵母浸出粉 1g 磷酸二氢钾 O．4g
氯化钠2g 丙二酸钠 3g
葡萄糖0·25g 0．4％溴麝香草酚蓝指示液6ml
硫酸铵 2g 水 1000ml
磷酸氢二钾0．6g
(2)制法 除指示液外，将上述成分溶解，调节pH值使灭菌后为6．8，再加入
指示液。分装小管中，121℃灭菌15分钟。
(3)用途用于鉴别细菌能否利用丙二酸钠作为碳源而生长繁殖。
方法和结果观察：取斜面或肉汤培养物接种于培养基内。35℃培养48小时。
于24小时和48小时后各观察一次结果。培养基颜色由绿色变成蓝色为阳性反应；
无颜色变化，或由绿色变成黄色，则为阴性反应。
12．枸橼酸盐培养基
(1)成分
氯化钠5g 枸橼酸钠(无水) 2g
硫酸镁O·2g 1．0％溴麝香草酚蓝指示液lOml
磷酸氢二钾1g 琼脂 14g
磷酸二氢铵1g 水 1000ml
(2)制法除指示液和琼脂外，取上述成分，混合，微温使溶解，调节pH值使灭
菌后为6．9±0．1，加入琼脂，加热溶胀，然后加入指示液，混匀，分装于小试
管中，121℃菌15分钟，制成斜面。
(3)用途用于鉴别细菌能否利用枸橼酸盐作为碳源和氮源而生长繁殖。
方法和结果观察：取可疑菌落或斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基的斜面
上，一般培养48～72小时，凡能在培养基斜面生长出菌落，培养基即由绿色变成
蓝色者为阳性反应；无菌落生长，培养基仍绿色者为阴性反应，阴性反应者应
继续培养观察至7天。
13．硝酸盐胨水培养基
(1)成分
蛋白胨 10g 硝酸钾 2g
酵母浸出粉 3g 水 1000ml
(2)制法 取上述成分，加热溶解，调节pH值使灭菌后为7．3±0．1，分装于小
试管中，121℃灭菌15分钟。
(3)用途 用于鉴别细菌能否还原硝酸盐成亚硝酸盐。
方法和结果观察：取待检菌培养物接种于硝酸盐胨水培养基中，于35℃培养
24小时。将下列甲液和乙液于用前等量混合，每个培养物加混合物O．1ml，产
生红色为阳性反应，不产生红色为阴性反应。
甲液：取α-萘胺5g溶解于5mol／L醋酸1000ml中。
乙液：取磺胺酸(对氨基苯磺酸)8g溶解于5mol／L醋酸1000ml中。
14．石蕊牛奶培养基
(1)成分
脱脂奶粉 10g 水 100ml
10％石蕊溶液 O．65ml
(2)制法 取上述成分混匀后，分装于小试管中，116℃灭菌10分钟。
(3)用途用于检查细菌对牛奶的凝固和发酵作用。
15．半固体琼脂
(1)成分
蛋白胨10g 琼脂4g
牛肉浸出粉3g 水1000ml
氯化钠 5g
(2)制法除琼脂外，取上述成分，混合，微温使溶解，调pH使灭菌后为7．2±
O．2，再加入琼脂，加热溶胀，分装于小管中，121℃灭菌15分钟后，直立放
置。待凝固后备用。
(3)用途用于观察细菌的动力；也可用于一般菌种的保存。
细菌动力检查：取疑似菌斜面培养物穿刺接种于半固体营养琼脂培养基中，
35℃培养24小时，细菌沿穿刺外周扩散生长，为动力阳性；否则为阴性。阴性
者，应再继续培养观察2～3天。
页码数,2005版药典附录第94页
附录ⅫD小牛血清检测要求
蛋白质含量应为3．5％～5．0％(附录ⅥB第一法)。
无菌检查依法检查，应符合规定(附录ⅫA)。
细菌内毒素每lml应不高于1OEU(附录ⅫE凝胶限量试验)。
牛腹泻病毒 采用下述培养法(或其他适宜的方法)检测，不得有牛腹泻病毒
污染。
培养法 牛肾原代细胞以MEM培养基制成细胞悬液，接种等量供试品，37℃培
养5～7天观察细胞病变，同时设立阴性、阳性对照。
血红蛋白 用氰化高铁法或其他适宜的方法测定。应不高于O．02％。
大肠杆菌噬菌体 采用噬斑法和增殖法检测。不得有噬菌体污染。
支原体 采用培养法和DNA染色法(附录ⅫB)测定，不得有支原体污染。
支持细胞增殖检查 用Sp2／0-Agl4或适宜的非贴壁传代细胞进行。
(1)细胞生长曲线的测定取供试品按10％浓度配制细胞培养液，按每lml含10 4的
细胞浓度接种细胞，每天计数活细胞，连续观察一周，并绘制生长曲线，细胞
的最大增殖浓度应不低于每lml含10 6。
(2)细胞倍增时间的测定按生长曲线计算细胞的倍增时间。取细胞峰值前一天
的细胞计数(y)、接种细胞数(X)及生长时间(T)计算。
倍增时间=T/A A=1og2Y/x
Sp2／0-Ag14细胞的倍增时间应不超过20小时。
(3)克隆率的测定 按有限稀释法将细胞稀释，并按每孔1个细胞的浓度接种于96
孔细胞培养板，于37℃、5％二氧化碳培养1周后计算克隆率。
克隆率=A/BX100％
式中A为细胞生长阳性孔数；
B为接种细胞的总孔数。
页码数,2005版药典附录第33页
附录ⅥK辛酸钠测定法
本法系用气相色谱法测定供试品中辛酸钠含量。
照气相色谱法(附录Ⅲc)测定。
色谱条件与系统适用性试验 用酸改性聚乙二醇(20M)毛细管柱，柱温160℃，
火焰离子化检测器，检测器温度230℃，气化室温度230℃，载气(氮气)流速为每
分钟35ml。辛酸峰与庚酸峰的分离度应大于1．5，辛酸峰的拖尾因子应为
O．95～1．20，辛酸对照品溶液连续进样5次，所得辛酸峰与庚酸峰面积之比的
相对标准偏差(RSD)应不大于5％。
内标溶液的制备取庚酸，加三氯甲烷制成每lml中含10mg的溶液，即得。
测定法取供试品用水准确稀释成每升含蛋白质40～50g的溶液，即为供试品
溶液，精密量取供试品溶液O．5ml，加内标溶液30μ1与1．5mol／L高氯酸溶液
O．2 ml，于振荡器上混合1分钟，加三氯甲烷4ml，加盖，于振荡器上剧烈混合
2分钟，以每分钟3000转离心20分钟，除去上层水相，小心将三氯甲烷层倾入
10ml试管中，将三氯甲烷挥发至干，加三氯甲烷100~1溶解残渣，取0．1μ1注入
气相色谱仪。另取辛酸对照品约O．15mg，精密称定，置10ml量瓶中，用三氯甲
烷溶解并稀释至刻度，即为辛酸对照品溶液。精密量取辛酸对照品溶液10μl、
20μl、30μl、40ul、50μl，各精密加内标溶液30μl，于振荡器上混合1分钟，加
三氯甲烷4ml，将三氯甲烷挥发至干，各加三氯甲烷lOOul溶解残渣，同法操作。
以各辛酸对照品溶液峰面积与内标峰面积比对各辛酸对照品溶液辛酸量(μg)
作直线回归，求得回归方程，计算出供试品溶液辛酸绝对量(A)，再按下式计算
供试品辛酸钠含量
辛酸钠含量(mmol／g蛋白质)=A*N/144．22*B*C*l000
式中A为供试品溶液辛酸绝对量，μg；
B为取样量，即为O．5ml；
N为供试品稀释倍数；
c为供试品蛋白质含量，g／ml；
144．22为辛酸的相对分子质量。
【附注】 (1)lmmol辛酸相当于lmmol辛酸钠。
(2)对照品溶液与供试品溶液的溶剂挥发的速度应尽量保持一致。
(3)直线回归相关系数应不低于0．99。
页码数,2005版药典附录第39页
附录ⅦE亚硫酸氢钠测定法
本法系依据亚硫酸氢钠与过量的碘反应，用硫代硫酸钠滴定液滴定多余的
碘，根据硫代硫酸钠滴定液的消耗量，可计算出供试品中亚硫酸氢钠的含量。
测定法精密量取供试品适量(约相当于含亚硫酸氢钠量2．5mg)，置具塞锥形
瓶中，精密加入0．05mol／L碘溶液(称取碘13．0g，加碘化钾36g与水50ml溶解后，
加盐酸3滴与水适量使成1000ml，摇匀，用垂熔玻璃滤器滤过)20ml，放置5分钟，
沿瓶壁加入盐酸溶液(5→10)2．Oral，摇匀。用硫代硫酸钠滴定液(O．Imol／L)滴
定至近终点时，加0．5％淀粉指示液约O．5ml，滴定至蓝色消失，并将滴定的
结果用空白试验校正。
按下式计算
亚硫酸氢钠含量(％)—(Vo-V1)．*c*52．03*100/V2*1000
式中v0为空白试验消耗硫代硫酸钠滴定液的体积，ml；
v1为供试品消耗硫代硫酸钠滴定液的体积，ml；
V2为供试品的体积，ml；
c为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mool／L。
【附注】 硫代硫酸钠滴定液(O．1m01／L)的制备及滴定称取硫代硫酸钠26g与
无水碳酸钠O．20g，加新沸过的冷水适量使溶解成1000ml，摇匀，放置1个月后
滤过。
精密称取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾0．15g，置碘瓶中，加水50ml使
溶解，加碘化钾2．0g，轻轻振摇使溶解，加稀硫酸(5．7一100)40ml，摇匀，密
塞，在暗处放置10分钟后，加水250ml稀释，用本液滴定至近终点时，加淀粉指
示液(取可溶性淀粉0．5g，加水5ml搅匀后，缓缓倾入lOOml沸水中，随加随搅拌，
继续煮沸2分钟，冷却，倾取上层清液。本液应临用配制)3ml，继续滴定至蓝色
消失而显亮绿色，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml硫代硫酸钠滴定液相
当于4．903mg的重铬酸钾。根据本液的消耗量与重铬酸钾的取用量，算出本
液的浓度，即得。
书页号：2005版药典三部附录6页
附录I C眼用制剂
眼用制剂 系指直接用于眼部发挥治疗作用的生物制 品。眼用制剂可分为眼
用液体制剂(滴眼剂、洗眼剂、眼 内注射溶液)、跟用半固体制剂(眼膏剂、眼用
乳膏剂,眼用凝胶剂)等。
眼用制剂在生产与贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产及质量控制应符合相关品种要
求。
二、除另有规定外，滴眼剂应与泪液等渗，并应进行渗透压摩尔浓度测定。
三、滴眼剂每个容器的装量，除另有规定外，应不超过10ml。
四、眼膏剂的基质应过滤并灭菌。眼膏剂应均匀、细腻、无刺激性，易涂布
于眼部，便于药物分散和吸收。
五、包装容器应不易破裂，并清洗干净及灭菌，其透明度应不影响可见异物
检查。
六、除另有规定外，眼用制剂应置2～8℃避光、密封贮存和运输。
七、多剂量包装的眼用制剂在启用后最多可使用4周。 ·
眼用制剂应进行以下相应检查。
【可见异物】 除另有规定外，滴眼剂照町见异物检查法(附录V B)检查，应符
合规定。
【金属性异物】 除另有规定外，眼用半固体制剂按以下方法检查，金属性异
物检查应符合规定。
检查法 取供试品10支，分别将全部内容物置于底部平整光滑、无可见异物和
气泡、直径为6cm的平底培养皿中，加盖，置85℃保温2小时，使供试品摊布均
匀，室温放冷至凝固后，倒置于适宜的显微镜台上，用聚光灯从上方以45℃角
的入射光照射皿底，放大30倍，检视不小于50 μm且具有光泽的金属性异物数。
10个供试品中金属性异物超过8粒者，不得过1个，且其总数不得超过50粒；如不
符合上述规定，应另取20个复试；初、复试结果合并计算，30个中每个内含金
属性异物超过8粒者不得多于3个，且其总数不得超过150粒。
【重量差异或装置差异】 除另有规定外，单剂量包装的眼用半固体制剂应符
合规定。
检查法取供试品20个，分别称量内容物，计算平量，超过半均重量的±10％者
不得过2个，并不得有超过平均重量±20％者。
【装量】 除另有规定外，单剂量包装的眼用液体制剂装量应符合规定。
取供试品1个，分别将内容物倾尽，测定其装量，每个装量均不得少于其标
示量。
多剂量包装的眼用制剂，照最低装量检查法(附录VF)检查，应符合规定。
【无菌】 眼内注射溶液及供眼部手术、伤口、角膜穿通伤用的眼用制剂，照
无菌检查法(附录ⅫA)检查，应符合规定。
【微生物限度】 除另有规定外，照微生物限度检查法(附录Ⅻ(G)检查，应符合
规定。
凡规定进行无菌检查的眼用制剂，可不进行微生物限度检查。
页码数,2005版药典附录第31页
附录ⅥD乙醇残留量测定法
(康卫皿扩散法)
本法系依据乙醇在饱和碳酸钠溶液中加热逸出，被重铬酸钾硫酸溶液吸收
后呈黄绿至绿色，用比色法测定血液制品中乙醇残留量。
测定法在康卫皿外圈的凸出部位均匀涂抹凡士林，准确量取重铬酸钾一硫
酸溶液(称取重铬酸钾3．7g，加水150ml，充分溶解后缓慢加入硫酸280ml，放冷，
加水至500ml，摇匀)，2．0ml加入内圈中，量取饱和碳酸钠溶液[称取碳酸钠
(NazC03·10H20)适量，加等重量的水，充分摇匀，取上清液]1．5ml和精密量取的
供试品溶液1·5ml，加入外圈中，立即加盖玻璃板(粗糙面向下)密封扩散皿，摇
匀，80℃反应30分钟后，取内圈溶液，照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在
波长650nm处测定吸光度(A1)。精密称取无水乙醇适量，加水制成每lml中含乙醇
O·25mg的溶液，即为对照品溶液，精密量取对照品溶液1．5ml替代供试品，同法
操作，测定吸光度(A2)。A1读数不得大于A2。
书页号：2005版药典三部附录81页
附录Ⅻ F 异常毒性检查法
本法系生物制品的非特异性毒性的通用安全试验，检查制品中是否污染外
源性毒性物质以及是否存在意外的不安全因素。
检查法除另有规定外，异常毒性试验应包括小鼠试验和豚鼠试验。
(1) 小鼠试验法 除另有规定外，每批供试品用5只小鼠，注射前每只小鼠称
体重，应为18～22g。每只小鼠腹腔注射供试品0.5ml，观察7天。观察期内，小鼠
应全部健存，且无异常反应，到期时每只小鼠体重应增加，供试品判为合格。
如不符合上述要求，可用10只小鼠复试一次，判定标准同前。
(2) 豚鼠试验法 除另有规定外，每批供试品用2只豚鼠，注射前每只豚鼠称
体重，应为250～350g。每只豚鼠腹腔注射供试品5.0ml，观察7天。观察期内，豚
鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只豚鼠体重应增加，供试品判为合格。
如不符合上述要求，可用4只豚鼠复试一次，判定标准同前。
书页号：2005版药典三部附录14页
附录ⅡC荧光分析法
某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧
光。物质的激发光谱和荧光发射光谱，可以用作该物质的定性分析。当激发
光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其
发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用作定量分析。荧光分
析法的灵敏度一般较紫外可见分光光度法为高，但浓度太高的溶液会有“自熄
灭”作用，以及由于在液面附近溶液会吸收激发光，使发射光强度下降，导致
发射光强度与浓度不成正比，故荧光分析法应在低浓度溶液中进行。
测定法
所用的仪器为荧光计或荧光分光光度计，按各品种项下的规定，选定激发
光波长和发射光波长，并制备对照品溶液和供试品溶液。
通常荧光分析法都是在一定条件下，用对照品溶液测定荧光强度与浓度的
线性关系。当线性关系良好时，可在每次测定前，用一定浓度的对照品溶液
校正仪器的灵敏度；然后在相同的条件下，分别渎取对照品溶液及其试剂
空白的荧光强度与供试品溶液及其试剂空白的荧光强度，用下式计算供试品浓
度：
cx=Rx-Rxb/Rr-Rrb *Cr
式中cx为供试品溶液的浓度；
Cr为对照品溶液的浓度；
Rx为供试品溶液的荧光强度；
Rxb为供试品溶液试剂空白的荧光强度；
Rr为对照品溶液的荧光强度；
Rrb为对照品溶液试剂空白的荧光强度。
因荧光分析法中的浓度与荧光强度的线性较窄，故(Rx—Rxb)／(Rr一Rrh)应为
O．5～2；如有超过，应在调节溶液浓度后再测。偏离线性时应改用工作曲线
法。
对易被光分解或弛豫时间较长的品种，为使仪器灵敏度定标准确，避免因激
发光多次照射而影响荧光强度，可选择一种激发光和发射光波长与之近似而对
光稳定的物质配成适当浓度的溶液，作为基准溶液，例如蓝色荧光可用硫酸奎
宁的稀硫酸溶液，黄绿色荧光可用荧光素钠水溶液，红色荧光可用罗丹明B水
溶液等。在测定供试品溶液时用基准溶液代替对照品溶液校正仪器的灵敏度。
注意事项
荧光分析法因灵敏度高，故干扰因素也多。
1．溶剂不纯会带入较大误差，应先作空白检查，必要时，应用玻璃磨口蒸
馏器蒸馏后再用。
2·溶液中的悬浮物对光有散射作用，必要时，应用垂熔玻璃滤器滤过或用离
心法除去。
3．所用的玻璃仪器与测定池等也必须保持高度洁净。
4．温度对荧光强度有较大的影响，测定时应控制温度一致。
5·溶液中的溶氧有降低荧光作用。必要时可在测定前通入惰性气体除氧。
6·测定时需注意溶液的pH值和试剂的纯度等对荧光强度的影响。
页码数,2005版药典附录第34页
附录ⅥL游离甲醛测定法
本法系依据品红亚硫酸在酸性溶液中能与甲醛生成紫色复合物，用比色法
测定供试品中游离甲醛含量。
对照品溶液的制备精密量取已标定的甲醛溶液适量，置500ml量瓶中，用水
稀释至刻度，摇匀，制成0．05％甲醛对照品贮备液。
临用前，精密量取甲醛对照品贮备液lOml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，
摇匀，作为甲醛对照品溶液。
测定法精密量取供试品lml，用水稀释至甲醛含量约为O．005％，即为供试品
溶液。精密量取供试品溶液lml，置50ml具塞试管中，加水4ml，加品红亚硫酸溶
液lOml，混合酸溶液(取水783ml，置烧杯内，缓缓注入盐酸42ml、硫酸175ml，混
匀)10ml，摇匀，在25~C放置3小时，照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波
长590nm处测定吸光度。
精密量取O．005％甲醛对照品溶液0．5ml、1．Oml、1．5ml、2．Oml，分别置
50ml具塞试管中，自"加水4ml"起，同法操作。
以甲醛对照品溶液的浓度对相应的吸光度作直线回归，将供试品溶液的吸
光度代入回归方程，计算供试品中的游离甲醛含量。
【附注】 (1)品红亚硫酸溶液的制备及二氧化硫含量的标定称取碱性品红4．5g，
于3000ml锥形瓶中，加水1500ml，振摇或加温使品红全部溶解，待冷后，加亚
硫酸钠lOg，摇匀，静置5～10分钟，再加入3mol／L硫酸溶液40ml，摇匀，以橡皮
塞塞紧瓶口，放置过夜，如有颜色，加骨炭5～lOg迅速摇匀，以布氏漏斗快速
抽滤，即得品红亚硫酸溶液。品红亚硫酸溶液中的S02含量可控制在
28～48mmol／L(S02含量过多可通空气驱除，过少可通入S02)。
二氧化硫(SO2)含量测定 量取品红亚硫酸溶液10ml于锥形瓶内，加水20ml，淀
粉指示液5ml，用碘滴定液(O．05mol／L)滴定至呈浅蓝色，按下式计算S02的含量。
SO2的含量(mm01／L)=50*V*c
式中V为消耗碘滴定液(O．05mol／L)的体积，ml；
c为碘滴定液的浓度，mol／L。
(2)甲醛溶液的标定取甲醛溶液约1．5ml，精密称定，置锥形瓶中，加水10ml、
过氧化氢溶液25ml与溴麝香草酚蓝指示液2滴，滴加氢氧化钠滴定液(1mol／L)
至溶液显蓝色；再精密加入氢氧化钠滴定液(1mol／L)25ml，瓶口置一玻璃小漏
斗，置水浴中加热15分钟，不时振摇，冷却，用水洗涤漏斗，加溴麝香草酚蓝
指示液2滴，用盐酸滴定液(1mol／l)滴定至溶液显黄色，并将滴定的结果用空白
试验校正。每lml氢氧化钠滴定液(1mol／L)相当于30．03mg的甲醛。
(3)对照品溶液和供试品溶液与品红亚硫酸溶液的显色时间有时不一致，测定
时，显色慢者应酌情早加品红亚硫酸溶液。
(4)供试品中如含有酚红，标准管中应予以校正。
书页号：2005版药典三部附录100页
附录ⅩⅥ 原子量表
(〈12〉C=12.00)
(录自2001年国际原子量表)
┏━━━━┳━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━┳━━━━━━━━┓
┃中文名 ┃ 英文名 ┃ 符号 ┃ 原子量 ┃ 中文名 ┃ 英文名 ┃ 符号 ┃ 原子量 ┃
┣━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━╋━━━━━━━━┫
┃ 氢 ┃Hydrogen ┃ H ┃ 1.00794(7) ┃ 硅 ┃ Silicon ┃ Si ┃ 28.0855(3) ┃
┃ 氦 ┃ Helium ┃ He ┃ 4.002602(2) ┃ 磷 ┃ Phosphorus ┃ P ┃ 30.973761(2) ┃
┃ 锂 ┃ Lithium ┃ Li ┃ 6.941(2) ┃ 硫 ┃ Sulfur ┃ S ┃ 32.065(5) ┃
┃ 硼 ┃ Boron ┃ B ┃ 10.811(7) ┃ 氯 ┃ Chlorine ┃ Cl ┃ 35.453(2) ┃
┃ 碳 ┃ Carbon ┃ C ┃ 12.0107(8) ┃ 氩 ┃ Argon ┃ Ar ┃ 39.948(1) ┃
┃ 氮 ┃ Nitrogen ┃ N ┃ 14.0067(2) ┃ 钾 ┃ Potassium(Kalium) ┃ K ┃ 39.0983(1) ┃
┃ 氧 ┃ Oxygen ┃ O ┃ 15.9994(3) ┃ 钙 ┃ Calcium ┃ Ca ┃ 40.078(4) ┃
┃ 氟 ┃ Fluorine ┃ F ┃ 18.9984032(5) ┃ 钛 ┃ Titanium ┃ Ti ┃ 47.867(1) ┃
┃ 钠 ┃ Sodium(Natrium) ┃ Na ┃ 22.989770(2) ┃ 钒 ┃ Vanadium ┃ V ┃ 50.9415(1) ┃
┃ 镁 ┃Magnesium ┃ Mg ┃ 24.3050(6) ┃ 铬 ┃ Chromium ┃ Cr ┃ 51.9961(6) ┃
┃ 铝 ┃ Aluminium ┃ Al ┃ 26.981538(2) ┃ 锰 ┃ Manganese ┃ Mn ┃ 54.938049(9) ┃
┗━━━━┻━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━┻━━━━━━━━┛
续表
┏━━━━┳━━━━━━━━━┳━━━┳━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━━┳━━━┳━━━━━━━━┓
┃ 中文名 ┃ 英文名 ┃ 符号 ┃ 原子量 ┃ 中文名 ┃ 英文名 ┃ 符号 ┃ 原子量 ┃
┣━━━━╋━━━━━━━━━╋━━━╋━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━━╋━━━╋━━━━━━━━┫
┃ 铁 ┃Iron(Ferrum) ┃ Fe ┃ 55．845(2) ┃ 锡 ┃Tin(Stannum) ┃ Sn ┃ 118．710(7) ┃
┃ 钴 ┃Cobalt ┃ Co ┃ 58．933200(9) ┃ 锑 ┃Antimony(Stibium) ┃ Sb ┃ 121．760(1) ┃
┃ 镍 ┃ Nickel ┃ Ni ┃ 58．6934(2) ┃ 碘 ┃Iodine ┃ I ┃ 126．90447(3) ┃
┃ 铜 ┃ Copper(Cuprum) ┃ Cu ┃ 63．546(3) ┃ 碲 ┃ Tellurium ┃ Te ┃ 127．60(3) ┃
┃ 锌 ┃ Zinc ┃ Zn ┃ 65．409(4) ┃ 氙 ┃ Xenon ┃ Xe ┃ 131．293(6) ┃
┃ 镓 ┃ Gallium ┃ Ga ┃ 69．723(1) ┃ 钡 ┃ Barium ┃ Ba ┃ 137．327(7) ┃
┃ 锗 ┃ Germanium ┃ Ge ┃ 72．64(1) ┃ 镧 ┃ Lanthanum ┃ La ┃ 138．9055(2) ┃
┃ 砷 ┃ Arsenic ┃ As ┃ 74．92160(2) ┃ 铈 ┃ Cerium ┃ Ce ┃ 140．116(1) ┃
┃ 硒 ┃ Selenium ┃ Se ┃ 78．96(3) ┃ 钬 ┃ Holmium ┃ Ho ┃ 164．93032(2) ┃
┃ 溴 ┃ Bromine ┃ Br ┃ 79．904(1) ┃ 镱 ┃ Ytterbium ┃ Yb ┃ 173．04(3) ┃
┃ 锶 ┃ Strontium ┃ Sr ┃ 87．62(1) ┃ 钨 ┃ Tungsten(Wolfram) ┃ W ┃ 183．84(1) ┃
┃ 锆 ┃ Zirconium ┃ Zr ┃ 91．224(2) ┃ 铂 ┃Platinum ┃ Pt ┃ 195．078(2) ┃
┃ 钼 ┃ Molybdenum ┃ Mo ┃ 95．94(2) ┃ 金 ┃ Gold(Aurum) ┃ Au ┃ 196．96655(2) ┃
┃ 锝 ┃ Technetium ┃ Tc ┃ [99] ┃ 汞 ┃Mercury(Hydrargyrum) ┃ Hg ┃ 200．59(2) ┃
┃ 钯 ┃ Palladium ┃ Pd ┃ 106．42(1) ┃ 铅 ┃Lead(Plumbum) ┃ Pb ┃ 207．2(1) ┃
┃ 银 ┃ Silver(Argentum) ┃ Ag ┃ 107．8682(2) ┃ 铋 ┃Bismuth ┃ Bi ┃ 208．98038(2) ┃
┃ 镉 ┃Cadmium ┃ Cd ┃ 112．411(8) ┃ 钍 ┃ Thorium ┃ Th ┃ 232．0381(1) ┃
┃ 铟 ┃ Indium ┃ In ┃ 114．818(3) ┃ 铀 ┃ Uranium ┃ U ┃ 238．02891(3) ┃
┗━━━━┻━━━━━━━━━┻━━━┻━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━━━┻━━━┻━━━━━━━━┛
注：1．原子量末位数的准确度加注在其后括号内。
2．中括号内的数字是半衰期最长的放射性同位素的质量数。
书页号：2005版药典三部附录14页
附录ⅡB原子吸收分光光度法
原子吸收分光光度法的测量对象是呈原子状态的金属元素和部分非金属元
素，系由待测元素灯发出的特征谱线通过供试品经原子化产生的原子蒸气时，
被蒸气中待测元素的基态原子所吸收，通过测定辐射光强度减弱的程度，求出
供试品中待测元素的含量。原子吸收一般遵循分光光度法的吸收定律，通常借
比较对照品溶液和供试品溶液的吸光度，求得供试品中待测元素的含量。
对仪器的一般要求
所用仪器为原子吸收分光光度计，它由光源、原子化器、单色器和检测系统
等组成，另有背景校正系统、自动进样系统等。
l．光源常用待测元素作为阴极的空心阴极灯。
2．原子化器 主要有四种类型：火焰原子化器、石墨炉原了化器、氢化物
发生原子化器及冷蒸气发牛原子化器。
(1)火焰原子化器 由雾化器及燃烧灯头等主要部件组成。其功能是将供试品
溶液雾化成气溶胶后，再与燃气混合，进入燃烧灯头产生的火焰中，以干燥、
蒸发、离解供试品，使待测元素形成基态原子。燃烧火焰由不同种类的气体混
合物产生，常用乙炔空气火焰。改变燃气和助燃气的种类及比例可以控制火焰
的温度，以获得较好的火焰稳定性和测定灵敏度。
(2)石墨炉原子化器 由电热石墨炉及电源等部件组成。其功能是将供试品溶
液干燥、灰化，再通过高温原子化阶段使待测元素形成基态原子。 一般以石
墨作为发热体，炉中通入保护气，以防氧化并能输送试样蒸气。
(3)氢化物发生原子化器 由氢化物发生器和原子吸收池组成，可用于砷、硒、
锡、锑等元素的测定。其功能是将待测元素在酸性介质中还原成低沸点、易受
热分解的氢化物，再由载气导入由石英管、加热器等组成的原子吸收池，在吸
收池中氢化物被加热分解，并形成基态原子。
(4)冷蒸气发生原子化器 由汞蒸气发生器和原子吸收池组成，专门用于汞的
测定。其功能是将供试品溶液中的汞离子还原成汞蒸气，再由载气导入石英原
子吸收池，进行测定。
3．单色器其功能是从光源发射的电磁辐射中分离出所需要的电磁辐射，仪
器光路应能保证有良好的光谱分附录lIC荧光分析法辨率和在相当窄的光谱带
(O．2nm)下正常工作的能力，波长范围一般为1 90．O～900．0nm。
4·检测系统 由检测器、信号处理器和指示记录器组成·应具有较高的灵敏度
和较好的稳定性，并能及时跟踪吸收信号的急速变化。
5．背景校正系统 其作用是校正供试品原子化时蒸气相对吸收测定的干扰，
常用的背景校正系统有以下四种：连续光源(在紫外区通常用氘灯)、塞曼效应、
自吸效应、非吸收线等。
在原子吸收分光光度分析中，必须注意背景以及其他原因引起的对测定的
干扰。仪器某些工作条件(如波长、狭缝、原子化条件等)的变化可影响灵敏
度、稳定程度和干扰情况。在火焰法原子吸收测定中可采用选择适宜的测定
谱线和狭缝、改变火焰温度、加入络合剂或释放剂、采用标准加入法等方法消
除干扰；在石墨炉原子吸收测定中可采用选择适宜的背景校正系统、加入适
宜的基体改进剂等方法消除干扰。具体方法应按各品种项下的规定选用。
测定法
第一法(标准曲线法) 在仪器推荐的浓度范围内，制备含待测元素的对照品溶
液至少3份，浓度依次递增，并分别加入各品种项下制备供试品溶液的相应试
剂，同时以相应试剂制备空白对照溶液。将仪器按规定启动后，依次测定空白
对照溶液和各浓度对照品溶液的吸光度，记录读数。以每一浓度3次吸光度读数
的平均值为纵坐标、相应浓度为横坐标，绘制标准曲线。按各品种项下的规定
制备供试品溶液，使待测元素的估计浓度在标准曲线浓度范围内，测定吸光
度，取3次读数的平均值，从标准曲线上查得相应的浓度，计算元素的含量。
第二法(标准加入法) 取同体积按各品种项下规定制备的供试品溶液4份，分别
置4个同体积的量瓶中，除(1)号量瓶外，其他量瓶分别精密加入不同浓度的待
测元素对照品溶液，分别用去离子水稀释至刻度，制成从零开始递增的一系列
溶液。按上述标准曲线法自“将仪器按规定启动后”操作，测定吸光度，记录读
数；将吸光度读数与相应的待测元素加入量作图，延长此直线至与含量轴的
延长线相交，此交点与原点问的距离即相当于供试品溶液取用量中待测元素的
含量(如图，图略)。再以此计算供试品中待测元素的含量。此法仅适用于第一法标准
曲线呈线性并．通过原点的情况。
当用于杂质限度检查时，取供试品，按各品种项下的规定，制备供试品溶
液；另取等量的供试品，加入限度量的待测元素溶液，制成对照品溶液。照上
述标准曲线法操作，设对照品溶液的读数为a，供试品溶液的读数为b，b值应小
于a-b。
书页号：2005版药典三部附录75页
附录Ⅻ B 支原体检查法
主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞进行
支原体检查时，应同时进行培养法和指示细胞法(DNA染色法)。病毒类疫苗的病
毒收获液、原液采用培养法检查支原体，必要时，亦可采用指示细胞法筛选培
养基。也可采用经国家药品检定机构认可的其他方法。
第一法 培养法
推荐培养基及其处方
(1) 支原体肉汤培养基
猪胃消化液 500ml 氯化钠 2.5g
牛肉浸液(1：2) 500ml 葡萄糖 5.0g
酵母浸粉 5.0g 酚红 0.02g
pH值7.6±0.2。于121℃灭菌15分钟。
(2) 精氨酸支原体肉汤培养基
猪胃消化液 500ml 葡萄糖 1.0g
牛肉浸液(1：2) 500ml L-精氨酸 2.0g
酵母浸粉 5.0g 酚红 0.02g
氯化钠 2.5g
pH值7.1±0.2。于121℃灭菌15分钟。
(3) 支原体半流体培养基 按(1)项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂
2.5～3.0g。
(4) 支原体琼脂培养基 按(1)项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂
13.0～15.0g。
培养基灵敏度检查(变色单位试验法) (1) 菌种肺炎支原体(ATCC 15531株)，口腔
支原体(ATCC 23714株)。由国家药品检定机构分发。
(2) 操作 将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变
色，盲传两代后，将培养物接种到待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体
稀释至10〈-7〉～10〈-9〉，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至
10〈-3〉～10〈-5〉，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种3支试
管，置36℃±1℃培养7～14天观察培养基变色结果。
(3) 结果判定 以接种后培养基管数的2/3以上呈现变色的最高稀释度为该培养
基的灵敏度。
液体培养基的灵敏度：肺炎支原体(ATCC 15531株)应达到10〈-8〉，口腔支原
体(ATCC 23714株)应达到10〈-4〉。
检查法 (1) 供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查者可贮存于2～8℃；
超过24小时应置－20℃以下贮存。
(2) 检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基(或支原体琼脂
培养基)。半流体培养基(或琼脂培养基)在使用前应煮沸10～15分钟，冷却至56℃
左右，然后加入灭能小牛血清(培养基：血清为8：2)，并可酌情加入适量青霉素，
充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。
取每支装量为10ml的支原体半流体培养基(已冷至36℃±1℃)和支原体肉汤培养
基各4支，每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃±1℃培养21天。于接种后的第
7天从4支中取2支进行次代培养，每一支培养基转种支原体半流体培养基及支原
体肉汤培养基各2支，置36℃±1℃培养21天，每隔3天观察一次。
(3) 结果判定 培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试
品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，
供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。
【附注】 质量检定部门应会同培养基制造部门定期抽检支原体培养基灵敏
度。
第二法 指示细胞培养法(DNA染色法)
将供试品接种于指示细胞(无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其
他细胞)中培养后，用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体，在荧光显微镜
下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。
试剂 (1) 二苯甲酰胺荧光染料(Hoechst 33258)浓缩液 称取二苯甲酰胺荧光染料
5mg，加入100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hank※s平衡盐溶液中，在室温用磁力搅拌
30～40分钟，使完全溶解，－20℃避光保存。
(2) 二苯甲酰胺荧光染料工作液 无酚红和碳酸氢钠的Hank※s溶液100ml中加入二
苯甲酰胺荧光染料浓缩液1ml，混匀。
(3) 固定液乙酸：甲醇(1：3)混合溶液。
(4) 封片液 量取0.1mol/L枸橼酸溶液22.2ml、0.2mol/L磷酸氢二钠溶液27.8ml、甘油
50.0ml混匀，调pH至5.5。
培养基及指示细胞 (1) DMEM完全培养基
(2) DMEM无抗生素培养基
(3) 指示细胞(已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞) 取培养的Vero
细胞经消化后，制成每1ml含10〈5〉的细胞悬液，以每孔0.5ml接种6孔细胞培养板
或其他容器，每孔再加无抗生素培养基3ml，于5%二氧化碳孵箱36℃±1℃培养过
夜，备用。
供试品处理 (1) 细胞培养物 将供试品经无抗生素培养液至少传一代，然后
取细胞已长满的且3天未换液的细胞培养上清液待检。
(2) 毒种悬液 如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时，应用对支
原体无抑制作用的特异抗血清中和病毒后或用不产生细胞病变的另一种指示细
胞进行检查。
(3) 其他供试品 检查时所选用的指示细胞应为该供试品对其生长无影响的细
胞。
测定法 于制备好的指示细胞培养板中加入供试品(细胞培养上清液)2ml(毒种
或其他供试品至少1ml)，置5%二氧化碳孵箱36℃±1℃培养3～5天。指示细胞培养
物至少传代1次，末次传代培养用含盖玻片的6孔培养板培养3～5天后，吸出培养
孔中的培养液，加入固定液5ml，放置5分钟，吸出固定液，再加5ml固定液固定10
分钟，吸出固定液，使盖玻片在空气中干燥，加二苯甲酰胺荧光染料(或其他
DNA染料)工作液5ml，加盖，室温放置30分钟，吸出染液，每孔用水5ml洗3次，吸
出水，盖玻片于空气中干燥，取洁净载玻片加封片液一滴，分别将盖玻片面向
下盖在封片液上制成封片。用荧光显微镜观察。
用无抗生素培养基2ml替代供试品，同法操作，作为阴性对照。
用已知阳性的供试品标准菌株2ml替代供试品，同法操作，作为阳性对照。
结果判定 (1) 阴性对照 仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。
(2) 阳性对照 荧光显微镜下除细胞外，可见大小不等、不规则的荧光着色颗
粒。
当阴性及阳性对照结果均成立时，试验有效。
如供试品结果为阴性，则供试品判为合格；如供试品结果为阳性或可疑时，
应进行重试；如仍阳性时，供试品判为不合格。
页码数,2005版药典附录第15页
附录ⅢA纸色谱法
纸色谱法系以纸为载体，以纸上所含水分或其他物质为固定柑，用展开剂
进行展开的分配色谱。供试品经展开后，可用比移值(Rf)表示其各组成成分的
位置(比移值一原点中心至斑点中心的距离／原点中心至展开剂前沿的距离)，
但由于影响比移值的因素较多，凶而一般采用在相同实验条件下与对照物质对
比以确定其异同。作为药品的鉴别时，供试品在色谱图中所显主斑点的位置与
颜色(或荧光)，应与对照品在色谱图中所显主斑点相同。作为药品的纯度检查
时，可取一定量的供试品，经展开后，按各品种项下的规定，检视其所显杂
质斑点的个数或呈色深度(或荧光强度)。作为药品的含量测定时，将主色谱斑
点剪下洗脱后．冉用适宜的方法测定。
1．仪器与材料
(1)展开容器通常为圆形或长方形玻璃缸，缸上具 有磨口玻璃盖，应能密闭。
用于下行法时，盖上有孔，可插入分液漏斗，用以加入展开剂。在近顶端有一
用支架架起的玻璃槽作为展开剂的容器，槽内有一玻棒，用以压住 色谱滤纸；
槽的两侧各支一玻棒，用以支持色谱滤纸使其自然下垂，避免展开剂沿色谱滤
纸与溶剂槽之间发生虹吸现象。用于上行法时，在盖上的孔中加塞，塞中插入
玻璃悬钩，以便将点样后的色谱滤纸挂在钩上；并除去溶剂槽 和支架。
(2)点样器 常用具支架的微量注射器或定量毛细管，应能使点样位置正确、集
中。
(3)色谱滤纸应质地均匀平整，具有一定机械强度，不含影响展开效果的杂
质；也不应与所用显色剂起作用，以致影响分离和鉴别效果，必要时可进行处
理后再用。用于下行法时，取色谱滤纸按纤维长丝方向切成适当大小的纸条，
离纸条上端适当的距离(使色谱滤纸上端能足够浸入溶剂槽内的展开剂中，并使
点样基线能在溶剂槽侧的玻璃支持棒下数厘米处)用铅笔划一点样基线，必要
时，可在色谱滤纸下端切成锯齿形便于展开剂滴下。用于上行法时，色谱滤纸
长约25cm，宽度则按需要而定，必要时可将色谱滤纸卷成筒形；点样基线距底
边约2．5cm。
2．操作方法
(1)下行法将供试品溶解于适宜的溶剂中制成一定浓度的溶液。用定量毛细管
或微量注射器吸取溶液，点于点样基线上，溶液宜分次点加，每次点加后，俟
其自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干，样点直径为2～4mm，点间距离约为
1．5～2．0cm，样点通常应为圆形。
将点样后的色谱滤纸的点样端放在溶剂槽内并用玻棒压住，使色谱滤纸通过
槽侧玻璃支持棒自然下垂，点样基线在支持棒下数厘米处。展开前，展开缸内
用各品种项下规定的溶剂的蒸气使之饱和，一般可在展开缸底部放一装有规定
溶剂的平皿或将浸有规定溶剂的滤纸条附着在展开缸内壁上，放置一定时间，
俟溶剂挥发使缸内充满饱和蒸气。然后添加展开剂使浸没溶剂槽内的色谱滤
纸，展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸移动进行展开，展开至规定的距离后，
取出色谱滤纸，标明展开剂前沿位置，俟展开剂挥散后按规定方法检出色谱斑
点。
(2)上行法点样方法同下行法。展开缸内加入展开剂适量，放置俟展开剂蒸气
饱和后，再下降悬钩，使色谱滤纸浸入展开剂约O．5cm，展开剂即经毛细管作
用沿色谱滤纸上升，除另有规定外，一般展开至约15cm后，取出晾干，按规定
方法检视。
展开可以单向展开，即向一个方向进行；也可进行双向展开，即先向一个
方向展开，取出，俟展开剂完全挥发后，将滤纸转动90。，再用原展开剂或另
一种展开剂进行展开；亦可多次展开、连续展开或径向展开等。
书页号：附录 5
附录I 制剂通则
本通则适用于治疗用生物制品，包括血液制品、免疫血清、细胞因子、单克隆
抗体、免疫调节剂、微生态制剂等。预防用生物制品，按具体品种的要求进行。
页码数,2005版药典附录第49页
附录ⅨG质粒丢失率检查法
大肠杆菌表达系统的工程菌含有表达目的蛋白的表达质粒，质粒上一般带
有抗生素抗性基因便于筛选，在菌体传代过程中，在一定浓度的抗生素环境
下(如种子培养液)，质粒丢失后菌体便不能存活，而在不含抗生素的发酵培养
液中，随着传代代次的提高，可能有部分大肠杆菌丢失了质粒，失去了抗生素
抗性基因，也同时失去表达目的蛋白的能力。通过比较在含有或不含抗生素培
养基的菌体存活数，可以检测质粒的丢失率，考察质粒稳定性。
实际操作中一般用模拟发酵或发酵过程实时收集的发酵液，包括最后阶段(
传代最多代次)的收集液，经过适当稀释后涂布于不含抗生素的培养基上，在
37℃培养过夜；挑取不少于100个单菌落，分别接种到含抗生素和不含抗生素的
培养皿中，在37℃培养过夜。比较二者差异，一般应重复2次以上，计算质粒丢
失率。工艺验证中应规定质粒丢失率，并应在允许的范围内。
页码数,2005版药典附录第60页
附录X I重组链激酶生物学活性测定法
本法系依据链激酶和纤溶酶原形成的复合物能激活游离的纤溶酶原为有生
物学活性的纤溶酶，纤溶酶能降解人纤维蛋白为可溶性的纤维蛋白片段，在纤
维蛋白平板上出现透明的溶解圈，以此定量测定重组链激酶的生物学活性。
试剂 (1)人凝血酶溶液用生理氯化钠溶液配制成每lml含100IU，于-20℃保存。
(2)人纤溶酶原溶液用生理氯化钠溶液配成每lml含0．5mg，于-20℃保存。
(3)人纤维蛋白原溶液试验前配制，配制前将人纤维蛋白原和备用的生理氯
化钠溶液均在37℃水浴预热15分钟，然后用适量生理氯化钠溶液溶解，37℃水浴
静置保温30分钟使其完全溶解，配制成每lml含6mg溶液待用。
标准品溶液的制备按使用说明书，将重组链激酶生物学活性测定国家标准
品复溶后，用生理氯化钠溶液稀释成每lml含1000IU、250IU、62．5IU、15．6IU、
3．9IU等5个稀释度，待用。
供试品溶液的制备供试品按标示量加生理氯化钠溶液复溶后，用生理氯化
钠溶液稀释至约每lml含100 IU或1μg。
测定法取琼脂糖125mg，加生理氯化钠溶液23ml，煮沸使之溶胀，置55～60℃水
浴中平衡，加每lml含100 Iu人凝血酶溶液14μl，人纤溶酶原溶液(每lml含0．5mg)
280μ1，边加边摇匀，加每lml含6mg人纤维蛋白原溶液2．2ml，不停地摇匀，浑浊
后立即倒入直径8cm的平皿中，水平放置充分凝固后，4℃放置至少30分钟待
用(应在两天之内使用)。在含纤维蛋白平皿内打孔，孔径为2mm，在孔内分别加
入供试品溶液和标准品溶液，每孔10μl，每个稀释度做两个孔，37℃湿盒水平放
置24小时。纵向和横向量取溶圈直径，各2次，取平均值。以标准品溶液各个稀
释度的生物学活性的对数对相应的溶圈直径的对数进行直线回归，并求得回归
方程，根据供试品的溶圈直径的对数求得供试品的生物学活性。
页码数,2005版药典附录第57页
附录X D重组人白介素-2生物学活性测定法(CTLL-2细胞／MTT比色法)
本法系根据在不同白介素-2(IL-2)的浓度下，其细胞依赖株CTLL-2细胞存活率
不同，以此检测IL-2的生物学活性。
试剂(1)RPMI 1640培养液取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀
释至1000ml，加青霉素10 5 IU和链霉素10 5 IU，再加碳酸氢钠2．1g，溶解后，混
匀，除菌过滤，4℃保存。
(2)基础培养液 取新生牛血清(FBS)10ml，加RPMI 1640培养液90ml。4℃保存。
(3)完全培养液取基础培养液100ml，加重组人白介素-2至终浓度400～800IU。4℃
保存。
(4)PBS取氯化钠8．Og、氯化钾0．20g、磷酸氢二钠1．44g、磷酸二氢钾O．24g，
加水溶解并稀释至1000ml，经121℃15分钟灭菌。
(5)噻唑蓝(MTT)溶液取MTT 0．1g，加PBS溶解并稀释成20ml，经O．22μm滤膜过
滤除菌。4℃避光保存。
(6)裂解液15％十二烷基硫酸钠溶液，使用期限不得超过12个月。
CTLL-2细胞应为偏酸性、略微浑浊液体，传代后48～60小时用于重组人白介
素-2生物学活性测定。
标准品溶液的制备 取重组人白介素-2生物学活性测定的国家标准品，按使用
说明书复溶后，用基础培养液稀释至每lml含2001U。在96孔细胞培养板中，做2倍
系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔。每孔分别留50μl标准品溶液，弃
去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释成每lml约含
200IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2
孔。每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下
进行。
测定法CTLL-2细胞用完全培养液于37℃、5％二氧化碳条件下培养至足够量，
离心收集CTLL-2细胞，用RPMI 1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液中配
制成每lml含6．O×10 5个细胞的细胞悬液，置37℃5％二氧化碳条件下备用。在
加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬液50μ1，
于37~C、5％二氧化碳培养18～24小时。然后每孔加入MTT溶液20μl，于37℃，
5％二氧化碳培养4～6小时后，每孔加入裂解液150μl，于37℃、5％二氧化碳条
件下保温18～24小时。以上操作均在无菌条件下进行。混匀细胞板中的液体，
放人酶标仪，以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试
验结果
供试品生物学活性(IU／m1)=Pr*Ds*Es/Dr*Er
式中Pr为标准品生物学活性，Iu／ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
E为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效稀释倍数。
页码数,2005版药典附录第60页
附录X H重组人表皮生长因子生物学活性测定法
(细胞增殖法／MTT比色法)
本法系依据重组人表皮生长因子对小鼠胚胎成纤维细胞(Balb／c 3T3细胞)的
生长具有刺激作用，Balb／c 3T3细胞的生长状况因重组人表皮生长因子生物学
活性的不同而异，以此检测重组人表皮生长因子的生物学活性。
试剂(1)RPMI 1640培养液RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀释
至1000ml，加青霉素10 5IU和链霉素10 5Iu，再加碳酸氢钠2．1g，溶解后，混匀，
除菌过滤，4℃保存。
(2)维持培养液 量取新生牛血清4ml，加RPMI1640培养液至1000ml。
(3)完全培养液量取新生牛血清100ml，加RPMI1640培养液至1000ml。
(4)PBS取氯化钠8g、氯化钾O．2g、磷酸氢二钠1．44g、磷酸二氢钾O．24g，
加水溶解并稀释至1000ml的溶液，经121℃ 15分钟灭菌。
(5)噻唑蓝(MTT)溶液取MTT粉末0．10g，加PBS 20ml使溶解，经O．22／μm滤膜
过滤除菌。4℃避光保存。
标准品溶液的制备取重组人表皮生长因子标准品按说明书复溶后，用维持培
养液稀释至每lml含50IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，
每个浓度做2个孔。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备将供试品按标示量复溶后，用维持培养液稀释成每lml约
含50IU。在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2个
孔。以上操作在无菌条件下进行。
测定法 Balb／c 3T3细胞株用完全培养液于37℃、5％二氧化碳培养，控制细胞
浓度为每lml含1．0×10 5～5．0*10 6个细胞，传代后24～36小时用于生物学活性测
定。弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞 用完全培养液配成每lml含
5．0* 10 4～8．0×10 4个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μ1。
在37℃、5％二氧化碳条件下培养。24小时后换成维持培养液。置37℃、5％二氧
化碳培养24小时。制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和供试品溶
液，每孔100μ1。置37℃、5％二氧化碳培养64～72小时。每孔加入MTT溶液20μl，
于37℃、5％二氧化碳培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中
的液体后，向每孔中加入二甲基亚砜(DMSO)100μ1，混匀后在酶标仪上，以630nm
为参比波长，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算结果
供试品生物学活性(IU／m1)=Pr*Ds*Es/Dr*Er
式中Pr为标准品生物学活性，IU／ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效稀释倍数。
页码数,2005版药典附录第56页
附录X B 重组人促红素体内生物学 活性测定法(网织红细胞法)
本法系依据人促红素(EPO)可刺激网织红细胞生成的作用，给小鼠皮下注射
EPO后，其网织红细胞数量EPO注射剂量的增加而升高。利用网织红细胞数对红
胞数的比值变化，通过剂量一反应平行线法检测EPO体生物学活性。
试剂 (1)乙二胺四乙酸二钾抗凝剂称取乙二胺乙酸二钾100mg，加生理氯化钠
溶液10ml溶解，混匀使用时新鲜配制。
(2)稀释液取O．1g牛血清白蛋白，加生理氯化溶液溶解并稀释至100ml，即得。
标准品溶液的制备按标准品说明书，将EPO标品复溶，用稀释液将EPO标准品
稀释成高、中、低3剂量EPO标准溶液。
供试品溶液的制备 用稀释液将供试品稀释成中、低3个剂量与EPO标准溶液
单位相近的供试品溶液。
测定法 按低、中、高(如10IU／鼠、20IU／401U／鼠)3个剂量组，分别给近交系
6～8周龄小鼠 性BALB／C小鼠)或B6D2F1小鼠皮下注射EPO标准品及供试品溶液，
每组至少4只，每鼠注射量为不大于O．5ml。在注射后的第4天从小鼠眼眶采血
3～4滴，置于预先加入200μl EDTA-K2抗凝剂的采血管中。取抗凝用全自动网织红
细胞分析仪计数每只小鼠血液中的网织红细胞数对红细胞总数的比值(Ret％)。
按注射剂量(IU)对Ret％的量反应平行线测定法(二部附录XIV)计算试品体内生物学
活性。
页码数,2005版药典附录第58页
附录X E重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定法(NFS-60细胞／MTT比色法)
本法系依据小鼠骨髓白血病细胞(NFS-60细胞)的生长状况因重组人粒细胞刺
激因子(G-CSF)生物学活性的不同而不同，以此检测G-CSF的生物学活性。
试剂(1)RPMI 1640培养液取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀
释至1000ml，加青霉素10 5 IU和链霉素10 5 IU，再加碳酸氢钠2．1g，溶解后，混
匀，除菌过滤，4℃保存。
(2)基础培养液取新生牛血清100ml，加入RPMI 1640培养液900ml中。4℃保存。
(3)完全培养液基础培养液中加入重组人粒细胞刺激因子至最终浓度为每lml
含20ng或每lml含3000IU
(4)PBS取氯化钠8g、氯化钾0．2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾O．24g，加
水溶解并稀释成1000ml，经121℃ 15分钟灭菌。
(5)噻唑蓝(MTT)溶液取MTT粉末0．10g，加入PBS 20ml中，配制成每lml含5．0mg
的溶液，经0·22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。
(6)裂解液取盐酸14ml、Triton X-100溶液50ml，加异丙醇，配制成500ml的溶液。
室温避光保存。
标准品溶液的制备取重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定标准品按说明
书复溶后，用基础培养液稀释至每lml含50～100IU。在96孔细胞培养板中，进行
2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔，每孔分别留50μl标准品溶
液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释成约每lml
含50～100IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释
度做2个孔，每孔分别留50μ1供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无
菌条件下进行。
测定法NFS-60细胞株用完全培养液于37℃、5％二氧化碳培养，控制细胞浓度
为每lml含1．0* 10 5～4·0*10 5个细胞，传代后24～36小时用于生物学活性测定。将
试验所用溶液预温至37℃。取足量NFS-60细胞培养物，离心收集NFS-60细胞，用
RPMI 1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液配成每lml含2．O×10 5个细胞的
细胞悬液，置37℃备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中
每孔加入细胞悬液50ml，于37℃、5％二氧化碳培养40～48小时。每孔加入MTT
溶液20μl，于37℃、5％二氧化碳培养5小时。以上操作在无菌条件下进行。每
孔加入裂解液100μl，混匀后，放入酶标仪，以630nm为参比波长，于波长570nm
处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算结果
供试品生物学活性(IU7m1)=Pr*Ds*Es/Dr*Er
式中Pr为标准品生物学活性，IU／ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效稀释倍数。
页码数,2005版药典附录第58页
附录X F重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子生物学活性测定法
(TF_1细胞／MTT比色法)
本法系依据人红细胞白血病细胞(简称TF-1细胞)的生长状况因重组人粒细胞
巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)生物学活性的不同而不同，以此检测GM-CSF的生物
学活性。
试剂(1)RPMI 1640培养液取RPMI 1640培养基粉末1袋(规格为1L)，加水溶解并稀
释至1000ml，加青霉素10 5IU和链霉素10 5IU，再加碳酸氢钠2．1g，溶解后，混
匀，除菌过滤，4℃保存。
(2)基础培养液取新生牛血清100ml，加入RPMI1640培养液900ml中。4℃保存。
(3)完全培养液基础培养液加重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子至终浓度为每lml
含5．0ng或每lml含80IU。
(4)PBS取氯化钠8g、氯化钾0．2g，磷酸氢二钠1．44g、磷酸二氢钾O．24g，加
水溶解并稀释至1000m1，经121℃ 15分钟灭菌。
(5)噻唑蓝(MTT)溶液取MTT粉末0．10g，溶于PBS 20ml中，配制成每lml含5mg的
溶液，经O．22μm滤膜过滤除菌。4℃避光保存。
(6)裂解液取盐酸14ml、Triton X-100溶液50ml，加异丙醇配制成500ml的溶液。
标准品溶液的制备取重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子标准品按说明书复溶
后，用基础培养液稀释至每lml含10～20IU。在96孔细胞培养板中，进行2倍系列
稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2个孔。每孔分别留50μl 标准品溶液，弃去
孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释成约每lml含
10～20IU。在96孔细胞培养板中，做2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2
个孔。每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件
下进行。
测定法TF-1细胞株用完全培养液于37℃、5％二氧化碳培养，控制细胞浓度为
每lml含2．O×10 5～7．0×10 5个细胞，传代后24～36小时用于生物学活性测定。将
试验所用溶液预温至37℃。取足量TF-1细胞培养物，离心并收集TF-1细胞，用基
础培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液中配成每lml含4．0×10 5个细胞的细胞
悬液，置37℃备用。向加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中加入
细胞悬液，每孔50μl，于37℃、5％二氧化碳培养48～52小时后，每孔加入MTT
溶液20μl，于37℃、5％二氧化碳培养5小时，以上操作在无菌条件下进行。再
向上述各孔加裂解液100μl，混匀后，放入酶标仪，以630nm为参比波长，于波
长570nm处测定吸光度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算结
果
供试品生物学活性(IU／m1)=Pr*Ds*Es/Dr*Er
式中Pr为标准品生物学活性，IU／ml；
Ds 为供试品预稀释倍数；
Dr 为标准品预稀释倍数；
Es 为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er 为标准品半效稀释倍数。
页码数,2005版药典附录第56页
附录X A重组乙型肝炎疫苗(酵母)体外相对效力检查法
本法系以酶联免疫法测定供试品中的乙型肝炎表面抗原(HgsAg)含量，并以参
考品为标准，采用双平行线分析法计算供试品的相对效力。
试剂 (1)PBS(pH7．2)取氯化钠8．850g、磷酸二氢钠(NaH2P04·2H20)O．226g和磷酸
氢二钠(Na2HP04．12H2O)1．698g，加适量水溶解，调pH至7．2，加水稀释至1000ml。
(2)供试品处理液 取20％二乙醇胺1．25ml和10％Triton X-100 0．20ml，加PBS
8．55ml，混匀备用。
(3)供试品稀释液取牛血清白蛋白10．Og，加PBS溶解并稀释至1000ml，备用。
参考品溶液及供试品溶液的制备精密量取参考品及供试品O．1ml，各加入
0．1ml供试品处理液，加盖混匀，在20～28℃静置30～35分钟。将处理后的参考
品和供试品分别以供试品稀释液进行适当稀释，稀释后取1：2000、1：4000、
1：8000、1：16 000、1：32 000及其他适宜稀释度进行测定，每个稀释度做双份测
定。阴性对照为供试品稀释液(双份)，阴性和阳性对照均不需稀释。
测定法按试剂盒使用说明书进行。相同试验在3天内应重复两次。试剂盒阴
性和阳性对照的吸光度均值应在试剂盒要求范围内，试验有效。3次测定的数据
均用量反应平行线测定法(二部附录ⅪV)计算相对效力。以3次相对效力的几何均
值为其体外相对效力。以参考品为标准，供试品相对效力几何均值不小于0．5，
判为合格。
书页号：2005版药典三部附录5页
附录I A注射剂
注射剂系指以生物制品原液为原料药物，加入适宜稳定剂或其他辅料等制成
的可供注入体内的无菌溶液、乳液、混悬液及临用前用无菌溶剂复溶为溶液、
混悬液的无菌冻干制剂。
注射剂可分注射液、注射用无菌粉末。
注射液 系指注入体内的无菌溶液型注射液、乳液型注射液或混悬型注射液。
可用于皮下注射、皮内注射、肌内注射、静脉注射和静脉滴注。其中，供静脉
滴注用的大体积(除另有规定外，一般不小于50m1)注射液也称静脉输液。
注射用无菌粉末(以冷冻干燥法制备的称为注射用冻干制剂) 系指供临用前以
适宜的无菌溶液配制成澄清溶液或均匀混悬液的无菌粉末或无菌块状物。可用
适宜的注射用溶剂配制后注射，也可用静脉输液配制后静脉滴注。
注射剂在生产和贮藏期间应符合下列有关规定。
一、所用生物制品原液、半成品和成品的生产及质量控制应符合相关品种要
求。
二、所用溶剂必须安全无害，并不得影响疗效和质量。一般分为水溶性溶剂
和非水溶性溶剂。
(1)水溶性溶剂最常用的为注射用水，也可用O．9％氯化钠溶液或其他适宜的
水溶液。
(2)溶解注射用冻干制剂的无菌溶剂，通常也称注射用稀释剂，主要为灭菌注
射用水、氯化钠注射液，应符合本版药典(二部)的规定。其他注射用稀释剂，
除另有规定外，应进行无菌、热原或细菌内毒素及异常毒性检查，并应符合规
定。
三、配制注射剂时，可根据制品的性质加入适宜的附加剂。常用的有pH值调
节剂、稳定剂、增溶剂、抗氧剂、防腐剂等。所用附加剂应不影响制品的疗
效，对检验不产生干扰。
注射剂中防腐剂的浓度应加以控制，常用防腐剂如苯酚的浓度应不高于
O．5％，硫柳汞的浓度应不高于O·01％。除另有规定外，供静脉用的注射液不
得添加任何防腐剂，并慎用增溶剂。抗氧剂可增加生物学活性物质在冻干后贮
存期间的稳定性，如维生素C、维生素E、硫代硫酸钠等。赋形剂能使生物学活
性物质在冻干时和冻于后成形，不致飞扬损失，如蔗糖、山梨醇、乳糖等。
四、注射剂常用的容器有玻璃安瓿、玻璃瓶、塑料瓶及预装式注射器等，应
符合国家标准规定，瓶塞的质量亦应符合国家有关标准规定。
五、注射液的实际分装量应符合“生物制品分装和冻干规程”的规定。
除另有规定外，多剂量包装的注射剂，每一容器的装量不得超过10次注射剂
量。
六、注射剂在灌装后应立即熔封或加塞严封。要求真空或充氮封口者，容器
内应先排除空气，然后真空熔封或填充纯氮气熔封。对温度敏感的制品在灌封
过程中应控制温度，灌封完成后的注射剂应立即置于规定的温度下保存。
七、注射用冻干制剂分装后应及时冷冻干燥，采用适宜条件按“生物制品分装
和冻干规程”进行。冻干后残留水分应符合相关品种的要求。
除另有规定外，熔封或严封后的注射剂，应采用减压法或其他适宜的方法进
行容器检漏。
八、除另有规定外，应置2～8℃避光贮存和运输。
注射剂应进行以下相应检查。
【装量】 除另有规定外，注射液应符合规定。
注射液的标示装量为2ml或2ml以下者取供试品5支，2ml以上至50ml者取供试品3
支；开启时注意避免损失，将内容物分别用相应体积的干燥注射器及注射针
头抽尽，然后注入标化的按量入而设计的量具内(量具的大小应使待测体积至少
占其额定体积的40％)，在室温下检视。测定混悬液的装量时，应先摇匀，再用
干燥注射器及注射针头抽尽后，同前法操作，室温检视。每支注射液的装量均
不得少于其标示量。
标示装量为50ml以上的注射液照最低装量检查法(附录V F)检查，应符合规定。
【装量差异】 除另有规定外，注射用冻干制剂的装量差异限度，应符合规
定。
检查法 取供试品5瓶(支)，除去标签、铝盖，容器外壁用乙醇洗净，干燥，开
启时注意避免玻璃屑等异物落入容器中，分别迅速精密称定，倾出内容物，容
器可用水、乙醇洗净·在适宜条件下干燥后，再分别精密称定每一容器的重量，
求出每1瓶(支)的装量与平均装量。每1瓶(支)中的装量与平均装量相比较，应符
合下列规定。如有1瓶(支)不符合规定，应另取10瓶(支)复试，应符合规定。
【可见异物】 除另有规定外，照可见异物检查法(附录VB)检查，应符合规定。
【无菌】 照无菌检查法(附录ⅫA)检查，应符合规定。
书页号：2005版药典三部附录12页
附录ⅡA紫外一可见分光光度法
仪器的校正和检定
1．波长 由于环境因素对机械部分的影响，仪器的波长经常会略有变动，因
此除应定期对所用的仪器进行全面校正检定外，还应于测定前校正测定波长。
常用汞灯中的较强谱线237．83nm，253．65nm，275·28nm，296·73tml，313．16nm，
334．15nm，365．02nm，404．66nm，435·831nm，546．07nm与576．96nm，或用仪器中
氘灯的486·02nm与656．10nm谱线进行校正，钬玻璃在波长279·4nm，287．5nm，
333．7nm，360．9nm，418·5nm，460·Onm，484．5nm，536．2nm与637．5nm处有尖锐吸
收峰，也可作波长校正用，但因来源不同或随着时间的推移会有微小的变化，
使用时应注意。
2．吸光度的准确度可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。取在120~C干燥至恒重的
基准重铬酸钾约60mg，精密称定，用O．OO5mol／I。硫酸溶液溶解并稀释至
1000ml，在规定的波长处测定并计算其吸收系数，并与规定的吸收系数比较，
应符合表中的规定。
┏━━━━━━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━┓
┃ 波K／nm ┃ 235(／i~4、) ┃257G．~)v2) ┃31 3(最小) ┃350(~3v) ┃
┣━━━━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━┫
┃ 吸收系数(E1%1CM) ┃ 124．5 ┃ 144．0 ┃ 48．6 ┃ 106．6 ┃
┃的规定值 ┃ ┃ ┃ ┃ ┃
┃ 吸收系数(E1%) ┃ 123．O～ ┃ 142．8～ ┃ 47．O～ ┃ 105．5～ ┃
┃的许可范围 ┃ 126．O ┃ 146．2 ┃ 50．3 ┃ 108．5 ┃
┗━━━━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━┛
3．杂散光的检查 可按下表所列的试剂和浓度，配制成水溶液，置lcm石英吸
收池中，在规定的波长处测定透光率，应符合表中的规定。
┏━━━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━━━━┳━━━━━━┓
┃ 试剂 ┃NN／％(g／m1) ┃测定垌波长／nm ┃透光率／％ ┃
┣━━━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━━━━╋━━━━━━┫
┃ 碘化钠 ┃ 1．00 ┃ 220 ┃ <O．8 ┃
┃ 亚硝酸钠 ┃ 5．OO ┃ 340 ┃ <O．8 ┃
┗━━━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━━━━┻━━━━━━┛
含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末端吸收。因此，当作溶剂使
用时，它们的使用范围均不能小于截止使用波长。例如甲醇、乙醇的截止使
用波长为205nm。另外，当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸收。因此，在测定
供试品前，应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求，即
将溶剂置1 cm石英吸收池中，以空气为空白(即空白光路中不置任何物质)测定
其吸光度。溶剂和吸收池的吸光度，在220～240nm范围内不得超过0．40，在
24l～250nm范围内不得超过O·20，在251～300nm范围内不得超过0．10，在300nm以
上时不得超过O．05。
测定法
测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照，采
用1 CM的石英吸收池，在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸光度，或
由仪器在规定波长附近自动扫描测定，以核对供试品的吸收峰波长位置是否
正确。除另有规定外，吸收峰波长应在该品种项下规定的波长±2nml以内，并
以吸光度最大的波长作为测定波长。一般供试品溶液的吸光度读数，以在
0．3～O．7之间的误差较小。仪器的狭缝波带宽度应小于供试品吸收带的半宽
度的十分之一，否则测得的吸光度会偏低；狭缝宽度的选择，应以减小狭缝宽
度时供试品的吸光度不再增大为准。由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，
因此测定供试品的吸光度后应减去空白渎数，或由仪器自动扣除空白读数后再
计算含量。
当溶液的pH值对测定结果有影响时，应将供试品溶液和对照品溶液的pH值
调成一致。
1．鉴别和检查分别按各品种项下规定的方法进行。
2．含量测定 一般有以下几种。
(1)对照品比较法按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，
对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分规定量的100％±10％，
所用溶剂也应完全一致，在规定的波长处测定供试品溶液和对照品溶液的吸光
度后，按下式计算供试品中被测溶液的浓度：
Cx=(Ax／AR)CR
式中cx为供试品溶液的浓度；
Ax为供试品溶液的吸光度；
cR为对照品溶液的浓度；
AR为对照品溶液的吸光度。
(2)吸收系数法按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其
吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时，吸收
系数通常应大于100，并注意仪器的校正和检定。
(3)计算分光光度法计算分光光度法有多种，使用时均应按各品种项下规定的
方法进行。当吸光度处在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定时，波长的
微小变化可能对测定结果造成显著影响，故对照品和供试品的测试条件应尽可
能一致。计算分光光度法一般不宜用作含量测定。
(4)比色法供试品本身在紫外一可见区没有强吸收，或在紫外区虽有吸收但为
了避免干扰或提高灵敏度，可加入适当的显色剂显色后测定，这种方法为比
色法。
用比色法测定时，由于显色时影响显色深浅的因素较多，应取供试品与对照
品或标准品同时操作。除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶
剂代替对照品或供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方
法处理。在规定的波长处测定对照品和供试品溶液的吸光度后，按上述(1)法
计算供试品浓度。
当吸光度和浓度关系不呈良好线性时，应取数份梯度量的对照品溶液，用溶
剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度与相应的浓
度绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并
求出其含量。
页码数,2005版药典附录第31页
附录ⅥE组胺人免疫球蛋白中
游离磷酸组胺测定法
本法系依据磷酸组胺与邻苯二甲醛在碱性条件下生成荧光衍生物，以此测
定组胺人免疫球蛋白中游离磷酸组胺含量。
磷酸组胺对照品溶液的制备 取磷酸组胺对照品7mg，精密称定，置25ml量瓶
中，用O．1m01／L。盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为磷酸组胺贮备
液，一20℃贮存备用。试验当天准确量取磷酸组胺贮备液O．1ml，置100ml量瓶
中，用O．1mol／L盐酸溶液稀释至刻度，即为磷酸组胺对照品溶液。
供试品溶液的制备 取供试品O．5ml，加水1．2ml，混匀，加25％三氯醋酸溶
液0．3ml，混匀，每分钟4000转离心10分钟，取上清液，即为供试品溶液。
测定法 取供试品溶液1．6ml置试管中，加氯化钠1.5g，再加正丁醇4．0ml、
2．5mol／l氢氧化钠溶液0·2ml，立即混匀5分钟，静置后，取出正丁醇相3．6ml
加到已装有O．1mol／L盐酸溶液1．2ml和正庚烷2．0ml的试管内，震荡5分钟，弃
有机相，取盐酸相1．0ml，加入等体积水，再加0．4mol／L氢氧化钠溶液0．5ml，
混匀并迅速加入0．1％邻苯二甲醛一甲醇溶液O．1ml，立即混匀，置21～22℃
10分钟，加O．5tmol／L盐酸溶液0．5ml终止反应，取终止反应后的溶液200~1，加
入酶标板孔中，用荧光酶标仪，在激发波长350nm和发射波长450nm处测荧光强
度。
准确量取磷酸组胺对照品溶液1．0ml、0．8ml、0·6ml、0·4ml、O．2ml、O．1ml、
O．05ml、O．025ml，分别置试管中，各以0．1mol／L盐酸溶液补足至1．0ml向各
管中加水O．5ml、25％三氯醋酸溶液0．1ml，混匀，加氯化钠1．5g，自"加正丁
醇4．0ml※’起，同法操作。
将磷酸组胺对照品溶液的浓度对其相应的荧光强度作直线回归，将供试品
溶液的荧光强度代人直线回归方程，求出供试品溶液碱基含量(G)，按下式计
算供试品游离组胺含量(ng／m1)=G×2．76×2．5(稀释倍数)
【附注】 磷酸组胺相对分子质量为307．148，对照附录ⅥF o一乙酰基测定
法品溶液浓度按碱基计，碱基与磷酸组胺相对分子质量比为1：2．76。
页码数,2005版药典附录第27页
附录V D融变时限检查法
本法系用于检查栓剂、阴道片等固体制剂在规定条件下的融化、软化或溶
散情况。
一、栓剂
仪器装置由透明的套筒与金属架组成(如图1)。
图1（图略）
透明套筒 为玻璃或适宜的塑料材料制成，高为60mm，内径为52mm，及适当
的壁厚。
金属架 由两片不锈钢的金属圆板及3个金属挂钩焊接而成。每个圆板直径
为50mm，具39个孔径为4mm的圆孔(如图2)；两板相距30mm，通过3个等距的挂钩
焊接在一起。
检查法取供试品3粒，在室温放置1小时后，分别放在3个金属架的下层圆板
上，装入各自的套筒内，并用挂钩固定。除另有规定外，将上述装置分别垂直
浸入盛有不少于4L的37．0℃±O．5℃水的容器中，其上端位置应
单位：mm
图2（图略）
在水面下90mm处。容器中装一转动器，每隔10分钟在溶液中翻转该装置一次。
结果判定除另有规定外，脂肪性基质的栓剂3粒均应在30分钟内全部融化、
软化或触压时无硬心；水溶性基质的栓剂3粒均应在60分钟内全部溶解。如有
1粒不符合规定，应另取3粒复试，均应符合规定。
二、阴道片
仪器装置 同上述栓剂的检查装置，但应将金属架挂钩的钩端向下，倒置于
容器内，如图3示意。
图3（图略）
1一阴道片；2一玻璃板；3一水面
检查法调节水液面至上层金属圆盘的孔恰为均匀的一层水覆盖。取供试品
3片，分别置于上面的金属圆盘上，装置上盖一玻璃板，以保证空气潮湿。
结果判定除另有规定外，阴道片3片，均应在30分钟内全部溶化或崩解溶散
并通过开孔金属圆盘，或仅残留少量无硬心的软性团块。如有1片不符合规定，
应另取3片复试，均应符合规定。
页码数,2005版药典附录第40页
附录ⅦH枸橼酸离子测定法
第一法比色法
枸橼酸钠对照品溶液的制备取经减压干燥至恒重的枸橼酸钠
(C6H5Na3 07·2HzO)O．6g，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇
匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用5％三氯醋酸稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备 精密量取供试品0．5ml与水4．5ml，加10％三氯醋酸溶液
5ml，混匀，置60℃水浴加热5分钟，以每分钟4000转离心20分钟，取上清液备用。
测定法精密量取供试品溶液lml，置25ml具塞试管中，精密加吡啶1．3ml，混
匀，再精密加醋酸酐5·7ml，立即混匀并置31~C土I~C的水浴中，准确放置35分钟
后，照紫外-可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长425nm处测定吸光度。另精密量
取枸橼酸钠对照品溶液0·25ml、O．50ml、O．75ml、1．0ml，分别置于具塞试管中，
各精密加5％三氯醋酸溶液0．75ml、O．50ml、0．25ml、O·00ml(其相对应的枸橼酸
离子含量为O．5mmol／L、1．0mmol／L、1．5mmol／L、2．0mmol／L)，自“精密加
吡啶1．3ml※’起，同法操作。
用对照品溶液枸橼酸离子浓度和对应的吸光度作直线回归，求得回归方程，
计算出供试品溶液中的枸橼酸离子含量(mmol／L)，再乘以供试品稀释倍数(20)，
即为供试品枸橼酸离子含量(mmol／L)。-
第二法高效液相色谱法
照高效液相色谱法(附录ⅢB)测定。
色谱条件用苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为基质的阳离子交换色谱柱(H+)，粒
度9μm或8μm，内径7．8mm，柱长300mm；柱温为50℃；流动相为0．004mol／L硫酸
溶液，流速为每分钟0．8ml，示差折光检测器。
测定法 精密称取经减压干燥至恒重的枸橼酸钠(C6H5Na3 07·2H20)0．735g，置
100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，精密量取5．0ml、10．0ml、15·0ml，分别
置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得相对应的5．0mmol／L、10．0
mmol／L、15．0mmol／L枸橼酸离子对照品溶液。分别精密量取20μl，注入液相色
谱仪，记录色谱图；另精密量取供试品溶液lml，置15 m1离心管中，精密加
1．5％磺基水杨酸溶液lml，混匀。室温下以每分钟2000转离心10分钟。取上清
液，同法测定。
用对照品溶液的枸橼酸离子浓度对峰面积进行直线回归，求得回归方程，
计算出供试品溶液枸橼酸钠含量(mmol／L)，再乘以供试品稀释倍数(2)，计算出
供试品枸橼酸离子含量(mmol／L)。
【附注】 (1)根据供试品枸橼酸离子含量，可适当调整枸橼酸离子对照品溶液
浓度。
(2)直线回归相关系数应不低于0．999。
(3)不同厂家的阳离子交换色谱柱(H+)的流速、流动相、柱温等会有所不同，
可根据色谱柱说明书对色谱条件进行适当调整。
页码数,2005版药典附录第43页℃
附录ⅧE肽图检查法
本法系通过蛋白酶或化学物质裂解蛋白质后，采用适宜的分析方法鉴定蛋
白质一级结构的完整性和准确性。
第一法胰蛋白酶裂解一反相高效液相色谱法
照高效液相色谱法(附录ⅢB)测定。
色谱条件用蛋白质与多肽分析用辛烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合
硅胶为填充剂；柱温为30℃±5℃，供试品保存温度为4℃±O．5℃；以O．1％三氟
乙酸的水溶液为流动相A液，以O．1％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B液，流速
为每分钟lml，梯度洗脱70分钟(A液从100％至30％，B液从O至70％)，检测波长为
214nm。
检查法取供试品溶液及对照品溶液(均为每lml中含lmg的溶液，如供试品和对
照品浓度不够，则应浓缩至相应的浓度)，分别用1％碳酸氢铵溶液充分透析，
按1：50(mg／mg)加入胰蛋白酶溶液[取甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理过的(或序列
分析纯)胰蛋白酶适量，加1％碳酸氢铵溶液溶解，制成每lml中含O．1mg的溶液]
到供试品溶液与对照品溶液中，在37~C保温24小时后，按1：10加入50％醋酸溶
液，以每分钟10000转离心5分钟，精密量取上清液(或用O．45μm滤膜滤过)100μ1，
分别注入液相色谱仪，梯度洗脱，记录色谱图。将供试品溶液与对照品溶液的
图谱进行比较，即得。
第二法溴化氰裂解法
检查法取供试品与对照品适量(约相当于蛋白质50μg)，用水透析16小时，冷
冻干燥，加溴化氰裂解液[取溴化氰O．3g，加甲酸(70—100)lml使溶解]20μl溶解，室
温放置24小时，裂解物加水180μ1，再冷冻干燥。冻干的裂解物用水复溶至适当
浓度。照SDS-聚丙酰胺凝胶电泳法(附录ⅣC)(胶浓度20％)进行电泳，用银染法染
色。
将供试品图谱与对照品图谱进行比较，即得。
