第十一章野生动物保护管理中的分子生物学技术野生动物保护主要目的是应用科学解决由于人类的干扰或其他因素引起的物种、群落和生态系统问题，提供生物多样性保护的原理和工具。
同工酶研究及应用
60年代中期后，应用于基因表达、系统分类等位酶,
等位基因编码的同工酶，基因表达的直接产物，反映基因组成差别，可做为系统分类依据，其位点按孟德尔方式遗传，绝大多数位点共显性。分析等位酶位点，比较数值 ---计算等位基因、基因型频率 ---估测种内、间遗传变异水平；
LDH：
A,B二种亚基聚合成不同形式四聚体，实验步骤：动物 cell---
缓冲液 ----离心 ---取上清 ---聚丙烯胺电泳。
应用：赤狐、兔、鼬、犬科、熊科系统发育研究
RFLP遗传标记的研究和应用
（ Restriction fragment length polymorphism）：
限制性片段长度多肽性
已应用于人类遗传病的基因定位、基因诊断、法医生物物证验证、精细遗传图谱建立、遗传育种、物种进化；
RFLP的获得：基因组 DNA---已知的限制性内切酶消化 ---
电泳印迹 ----DNA探针 Southern杂交 ----DNA探针的多态性图谱；
表现；基因组中 DNA中与探针同源的 DNA序列，经限制性内切酶消化后长度的差异；
RFLP可看作遵循遗传规律的共,显性,性状，杂种 F1 代，
具有双亲的 RFLP，在 F1代自由分离,RFLP之间或与表型性状之间存在连锁,RFLP是 DNA水平上的研究 。
PCR,RAPD,AFLP技术及应用
PCR（ Polymerase chain reaction）：特异性 DNA
体外圹增技术
首先合成 2个小片段的聚核苷酸引物（ Zobp） ----二种引物分别与待扩增的 DNA片段（模板）正、负链两端互补 ----引物片段与待扩增 DNA片段混合加热变性 =>退火 =>引物片段与相应 DNA模板互补杂交，加入 4 种 dNTP和 DNA聚合酶 =>DNA扩增 =>再加热变性、退火 ----第一轮得到的 DNA扩增链又作为模板与引物片段杂交 ----进入第二轮 ----最后扩增 DNA数量
Y=(1+X)n,x：反应平均速率,n：反应轮数；
应用,微量 DNA鉴定、检测，基因分离、克隆,DNA序列分析，突变体、重组体的构造基因表达与调控，遗传病、传染病的诊断，法医鉴定 。
RAPD(Random amplified Polymorphism DNA)：
建立在 PCR基础上
用随机脱氧核苷酸序列作引物（ 10bp） ---对所研究的基因组 DNA进行 PCR扩增 ---扩增产物经琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ----染色或放射自显影检测扩增产物 DNA多态性，这些扩增 DNA片段的多态性便反映了基因组相应区域的
DNA多态性。
RAPD不需要专门设计已知序列的引物，但对于特定引物，它在基因组 DNA序列上有其特定结合位点，只要这些位点在基因组某些区域内的分布符合 PCR扩增条件，可扩增出相应的
DNA片段，如果基因组在这些区域发生 DNA片段的插入、缺失或碱基突变可导致特定位点的分布发生改变，出现扩增产物增、减或在分子量上改变，单一引物可使检测区域扩大到整个基因组，所以 RAPD可对整个基因组 DNA多态检测。
应用：遗传多样性分析，物种起源、进化、分类、育种。
AFLP（ Amplified Fragment Length
Polymorphism）
基因组总 DNA----限制性内切酶切割 ----形成分子量大小不等的随机限制性片段 ----将特定的接头接在 DNA片段两端 ----形成带接头的 DNA片段 ---通过接头序列和 PCR引物 3’
末端识别 ----特异性片段经变性、淬火和延伸周期性循环而扩增 ----电泳分离特异的限制性片段。
应用,目前未见用于动物实验 。
卫星 DNA的研究及应用
1、卫星 DNA,1— 5bp本联重复微卫星,2bp VNDR,6—
70bp 小卫星 DNA；
2、应用卫星 DNA探针检测物种 DNA的基本方法是制备 DNA指纹图
获得基因组 DNA分子或直接应用基因组文库的克隆 DNA分子，
选用不能切割卫星位点内串联重复顺序，而能在卫星位点以外进行切割的限制性内切酶，检测卫星区域长度变化，
反映出 VNTR酶切后经琼脂糖凝胶电泳，转到滤膜上，用卫星探针杂交，通过放射自显影或显色获得的 Southern印迹，
即为 DNA指纹图。
应用：测核苷酸组成，构建基因连锁图，比较物种进化，
系统分类等。
基因组文库的构建基因组文库（ genomic Library）,
含有某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体
构建过程,提纯 DNA--机械剪切或酶切 --片段 ---与适当载体（入噬菌体或 comid粘粒）相连 ---体外包装 ---转染细菌
---一组含有 DNA片段的重组噬菌体颗粒。含有感兴趣基因片段的重组子，可用标记探针与基因组文库中的重组子杂交，筛选出来，所得克隆纯化、扩增、可进一步研究。
应用,体细胞 DNA提纯、建文库得以保存；
揭示细胞分化,个体发育,再组合重建物种 。
同工酶研究及应用
60年代中期后，应用于基因表达、系统分类等位酶,
等位基因编码的同工酶，基因表达的直接产物，反映基因组成差别，可做为系统分类依据，其位点按孟德尔方式遗传，绝大多数位点共显性。分析等位酶位点，比较数值 ---计算等位基因、基因型频率 ---估测种内、间遗传变异水平；
LDH：
A,B二种亚基聚合成不同形式四聚体，实验步骤：动物 cell---
缓冲液 ----离心 ---取上清 ---聚丙烯胺电泳。
应用：赤狐、兔、鼬、犬科、熊科系统发育研究
RFLP遗传标记的研究和应用
（ Restriction fragment length polymorphism）：
限制性片段长度多肽性
已应用于人类遗传病的基因定位、基因诊断、法医生物物证验证、精细遗传图谱建立、遗传育种、物种进化；
RFLP的获得：基因组 DNA---已知的限制性内切酶消化 ---
电泳印迹 ----DNA探针 Southern杂交 ----DNA探针的多态性图谱；
表现；基因组中 DNA中与探针同源的 DNA序列，经限制性内切酶消化后长度的差异；
RFLP可看作遵循遗传规律的共,显性,性状，杂种 F1 代，
具有双亲的 RFLP，在 F1代自由分离,RFLP之间或与表型性状之间存在连锁,RFLP是 DNA水平上的研究 。
PCR,RAPD,AFLP技术及应用
PCR（ Polymerase chain reaction）：特异性 DNA
体外圹增技术
首先合成 2个小片段的聚核苷酸引物（ Zobp） ----二种引物分别与待扩增的 DNA片段（模板）正、负链两端互补 ----引物片段与待扩增 DNA片段混合加热变性 =>退火 =>引物片段与相应 DNA模板互补杂交，加入 4 种 dNTP和 DNA聚合酶 =>DNA扩增 =>再加热变性、退火 ----第一轮得到的 DNA扩增链又作为模板与引物片段杂交 ----进入第二轮 ----最后扩增 DNA数量
Y=(1+X)n,x：反应平均速率,n：反应轮数；
应用,微量 DNA鉴定、检测，基因分离、克隆,DNA序列分析，突变体、重组体的构造基因表达与调控，遗传病、传染病的诊断，法医鉴定 。
RAPD(Random amplified Polymorphism DNA)：
建立在 PCR基础上
用随机脱氧核苷酸序列作引物（ 10bp） ---对所研究的基因组 DNA进行 PCR扩增 ---扩增产物经琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ----染色或放射自显影检测扩增产物 DNA多态性，这些扩增 DNA片段的多态性便反映了基因组相应区域的
DNA多态性。
RAPD不需要专门设计已知序列的引物，但对于特定引物，它在基因组 DNA序列上有其特定结合位点，只要这些位点在基因组某些区域内的分布符合 PCR扩增条件，可扩增出相应的
DNA片段，如果基因组在这些区域发生 DNA片段的插入、缺失或碱基突变可导致特定位点的分布发生改变，出现扩增产物增、减或在分子量上改变，单一引物可使检测区域扩大到整个基因组，所以 RAPD可对整个基因组 DNA多态检测。
应用：遗传多样性分析，物种起源、进化、分类、育种。
AFLP（ Amplified Fragment Length
Polymorphism）
基因组总 DNA----限制性内切酶切割 ----形成分子量大小不等的随机限制性片段 ----将特定的接头接在 DNA片段两端 ----形成带接头的 DNA片段 ---通过接头序列和 PCR引物 3’
末端识别 ----特异性片段经变性、淬火和延伸周期性循环而扩增 ----电泳分离特异的限制性片段。
应用,目前未见用于动物实验 。
卫星 DNA的研究及应用
1、卫星 DNA,1— 5bp本联重复微卫星,2bp VNDR,6—
70bp 小卫星 DNA；
2、应用卫星 DNA探针检测物种 DNA的基本方法是制备 DNA指纹图
获得基因组 DNA分子或直接应用基因组文库的克隆 DNA分子，
选用不能切割卫星位点内串联重复顺序，而能在卫星位点以外进行切割的限制性内切酶，检测卫星区域长度变化，
反映出 VNTR酶切后经琼脂糖凝胶电泳，转到滤膜上，用卫星探针杂交，通过放射自显影或显色获得的 Southern印迹，
即为 DNA指纹图。
应用：测核苷酸组成，构建基因连锁图，比较物种进化，
系统分类等。
基因组文库的构建基因组文库（ genomic Library）,
含有某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体
构建过程,提纯 DNA--机械剪切或酶切 --片段 ---与适当载体（入噬菌体或 comid粘粒）相连 ---体外包装 ---转染细菌
---一组含有 DNA片段的重组噬菌体颗粒。含有感兴趣基因片段的重组子，可用标记探针与基因组文库中的重组子杂交，筛选出来，所得克隆纯化、扩增、可进一步研究。
应用,体细胞 DNA提纯、建文库得以保存；
揭示细胞分化,个体发育,再组合重建物种 。
