第十三章 高效液相色谱法第一节 概述高效液相色谱法,以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法一,HPLC与经典 LC区别二,HPLC与 GC差别三,高效液相色谱仪流程图四,特点一,HPLC与经典 LC区别
主要区别：固定相差别,输液设备和检测手段
1,经典 LC：仅做为一种分离手段柱内径 1~3cm,固定相粒径 >100μm 且不均匀常压输送流动相柱效低 （ H↑,n↓）
分析周期长无法在线检测
2,HPLC：分离和分析柱内径 2~6mm,固定相粒径 <10μm（ 球形,匀浆装柱 ）
高压输送流动相柱效高 （ H↓,n↑）
分析时间大大缩短可以在线检测二,HPLC与 GC差别
相同：兼具分离和分析功能,均可以在线检测
主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
1,分析对象
GC：能气化,热稳定性好,且沸点较低的样品,
高沸点,挥发性差,热稳定性差,离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的 20%
HPLC：溶解后能制成溶液的样品,
不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大,难气化,热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛,占有机物的 80%
续前
2,流动相差别
GC：流动相为惰性气体
组分与流动相无亲合作用力,只与固定相作用
HPLC：流动相为液体
流动相与组分间有亲合作用力,为提高柱的选择性,
改善分离度增加了因素,对分离起很大作用
流动相种类较多,选择余地广
流动相极性和 pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性
3,操作条件差别
GC：加温操作
HPLC：室温；高压 （ 液体粘度大,峰展宽小 ）
三、高效液相色谱仪流程图
1,贮液罐 （ 滤棒,可滤去颗粒状物质 ）
2,高压泵 （ 输液泵 ）
3,进样装置
4,色谱柱 —— 分离
5,检测器 —— 分析
6,废液出口或组分收集器
7,记录装置续前四,HPLC的特点和应用
“三高,,一快,,一广,
高柱效 ——n=104片 /米,柱效高 （ 远高于一般 LC）
高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛 （ 可分析 80%有机化合物 ）
第二节 基本理论和条件选择热力学理论：塔板理论 ——平衡理论 基础动力学理论：速率理论 ——Vander方程一、塔板理论二、速率理论三,HPLC法中分离条件的选择一、塔板理论理理 nLH /? 22
21
2 )(16)(54.5)(
W
t
W
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理
effeff nLH /? 2
21
'
2
'
)(54.5)(16 W tWtn RRe f f
0
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t
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1( k
knn
e ff 理二、速率理论（与 GC对比）
（填充柱）,uCuBAHGC /
（毛细管柱）或 uCuBH /
dpA2 dpA
gm DDB 22 gR DBtB,
M
TDTD
gg 或?
llgsm CCCCCC
l
l D
dfC 2?
TD
L?
1.
续前
2）涡流扩散项及其影响 next
uCAHH P L C：
mDB2?
TD
m?
相忽略大低，流动相柱温 BT
RtnHu
uHscmu
，但柱效，
时，/1
m i n/1 mlu 选择兼顾柱效和分析时间，
2.
讨论：
1）流动相流速对 HPLC板高的影响（与 GC对比） next
dpA2 dpA
柱效，,nHAdp?
图示
back
续前
3）传质阻抗项及其影响
）（忽略固定相传质阻抗 smmssmm CCCCCC
忽略固定相传质阻抗态流动相的传质阻抗注：只考虑流动相和静
uCuCAHH P L C smm,
m
smm D
dpCC 2
mD
dpC 2?
TD
m?
柱效,nHCdp
柱效,nHD m?
，柱阻，
，但易产生气泡
m
m
DT
CDT
图示三,HPLC法中分离条件的选择
1,固定相与装柱方法的选择：
选粒径小的、分布均匀的球形固定相（ dp≤10μm）
首选化学键合相，匀浆法装柱
2,流动相及其流速的选择：
选粘度小、低流速的流动相 ——甲醇,1ml/min
3,柱温的选择：
选室温 250C左右第三节 各类高效液相色谱法一、液固吸附色谱法（ LSC）
二,液液分配色谱法 （ LLC）
三,化学键合相色谱法 （ BPC）
一、液固吸附色谱法（ LSC）
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异
分离前提,K不等或 k不等
)1(0
m
R V
SKtt
mV
SKk
续前
2．固定相：与 LC比，固定相粒径不同（ <10μm）
（ 2） 高分子多孔小球,YSG
原理：吸附 +分配蒹小孔凝胶作用特点：柱选择性好,峰形好,柱效低适用：分离弱极性化合物
（ 1）硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶）
全多孔硅胶 无定形 YWG 5~6μm 5× 104
球形 YQG 3~4μm 8× 108
堆积硅珠 YQG 3~4 μm 8× 108 理想原理：吸附特点：峰易拖尾适用：分离极性化合物续前
3,流动相：底剂 （ 烷烃 ） + 有机极性调节剂
例,正己烷或庚烷 + 氯仿 - - -
4,影响 k的因素：与 固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性 ↑,洗脱能力 ↓,k↑,tR↑
溶剂系统极性 ↑,洗脱能力 ↑,k↓,tR↓
注：调节溶剂极性,可以控制组分的保留时间
5,出柱顺序：强极性组分后出柱,弱极性组分先出柱
6,硅胶吸水量 ↑,LSC→LLC
硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大
硅胶含水量 >17% 分配色谱 硅胶失活 → 载体吸附的水 → 固定液二、液液分配色谱法（ LLC）
1,分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异
2,固定相：载体 +固定液 （ 物理或机械涂渍法 ）
缺点：系统内部压力大,易流失,不实用固定液 ——极性 → NLLC
固定液 ——非极性 → RLLC
3,正相色谱 ——固定液极性 > 流动相极性 （ NLLC）
极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱
适于分离极性组分反相色谱 ——固定液极性 < 流动相极性 （ RLLC）
极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱
适于分离非极性组分三、化学键合相色谱法（ BPC）
（一）化学键合相
（ 二 ） 反相键合相色谱
（ 三 ） 正相键合相色谱
（ 四 ） 离子对色谱和离子抑制色谱
（一）化学键合相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面
1,分离机制：分配 + 吸附 （ 以 LLC为基础 ）
2,特点：
1） 不易流失
2） 热稳定性好
3） 化学性能好
4） 载样量大
5） 适于梯度洗脱
（二）反相键合相色谱
1,分离机制：疏溶剂理论正相 ——流动相与溶质排斥力强,作用时间 ↑
k↑,组分 tR↑
反相 ——流动相与溶质排斥力弱,作用时间 ↓，
k↓,组分 tR↓
2,固定相：极性小的烷基键合相
C8柱,C18柱 （ ODS柱 ——HPLC约 80%问题 ）
3,流动相：极性大的甲醇 -水或乙腈 -水流动相极性 > 固定相极性底剂 + 有机调节剂 （ 极性调节剂 ）
例：水 + 甲醇,乙腈,THF
续前
4,流动相极性与 k的关系：
流动相极性 ↑,洗脱能力 ↓,k↑,组分 tR↑
5,出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱
6,适用：非极性 ~中等极性组分 （ HPLC80%问题 ）
（三）正相键合相色谱
1,分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力,
诱导力,或氢键作用力
2,固定相：极性大的氰基或氨基键合相
3,流动相：极性小 （ 同 LSC）
底剂 + 有机极性调节剂
例：正己烷 + 氯仿 -甲醇,氯仿 -乙醇续前
4,流动相极性与 k的关系：
流动相极性 ↑,洗脱能力 ↑,组分 tR↓,k↓
5,出柱顺序：结构相近组分,极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱
6,适用：
氰基键合相与硅胶的柱选择性相似 （ 极性稍小 ）
分离物质也相似
氨基键合相与硅胶性质差别大,碱性分析极性大物质,糖类等
（四）离子对色谱和离子抑制色谱
1．反相离子对色谱法
2．反相离子抑制色谱
1．反相离子对色谱法（ IPC或 PIC）
反相色谱中,在极性流动相中加入离子对试剂,使被测组分与其中的反离子形成中性离子对,增加 k和 tR,以改善分离
1） 离子对试剂：烷基磺酸钠 →分析碱四丁基季胺盐 →分析酸
2） 影响 k的因素
a,与 m的极性有关 （ 同反相色谱 ）
b,与 R的链长有关,R↑长,极性 ↓小,tR↑,k↑
3） 适用：较强的有机酸,碱
2．反相离子抑制色谱在反相色谱中,通过加入缓冲溶液调节流动相 pH值,抑制组分解离,增加其 k和 tR,以达到改善分离的目的
1） 离子抑制剂：弱酸,弱碱性物质
pH一定的缓冲溶液
2） k的影响因素,与流动相极性有关,还与 pH值有关
选择流动相：应同时考虑极性及 pH值酸性物质 ——加入酸 HAc tR↑,k↑
碱性物质 ——加入碱 NH3·H 2O tR↑,k↑
调节 pH范围,3.0~8.0
pH>8.0 破坏键合相与载体的结合
pH<3.0 腐蚀柱子
3） 适用：极弱酸碱物质
pH=3~7弱酸； pH=7~8弱碱；两性化合物第四节 影响分离的因素
1
,2
2
1
1
4 k
knR
uCAH
流动相采用粘度小、低流速的匀的固定相：采用粒度小、填充均n
'
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小）的配比（受柱温影响较：调整流动相和固定相k
续前
2,对流动相的要求：
1） 与固定液不反应
2） 对样品有良好溶解度
k=1~10
k=2~5 最理想的
3） 与检测器匹配：
UV（ 常用,测定波长应大于溶剂的截止波长 ）
荧光,电化学
4） 使用粘度小,纯度高的流动相 （ 甲醇,乙腈 ）
使用前过滤,脱气续前
3．洗脱方式
1） 等度洗脱 （ 恒组成溶剂洗脱 ）
以固定配比的溶剂系统洗脱组分 （ 一个泵 ）
类似 GC的等温度洗脱
2） 梯度洗脱：
在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性 （ 两个泵 ）
适于分析极性差别较大的复杂组分类似 GC的程序升温 （ 沸程较长样品 ）
图示第五节 高效液相色谱仪
1,泵：
恒压泵：流量精度不稳恒流泵：常用
2,进样装置
1） 隔膜进样 （ 高分子有机硅胶垫 →进样室 ）
GC系统压力较小,可以
HPLC系统压力太大,必须停泵进样 （ 早期 ）
2） 阀进样：不必停泵,六通阀续前
3,色谱柱：直径 4~6mm,柱长 10~30cm
柱效评价：色谱系统适应性试验
R,n,fs（ 拖尾因子 ）
柱再生：维护,保养,柱子的冲洗
4,检测器
1） 紫外检测器：适于吸收紫外光的物质
2） 荧光检测器：只能分析自身发光的物质灵敏度高
3） 示差折光检测器：利用折光率的差别灵敏度低,温度要求严格
4） 电化学检测器
5） 化学发光
主要区别：固定相差别,输液设备和检测手段
1,经典 LC：仅做为一种分离手段柱内径 1~3cm,固定相粒径 >100μm 且不均匀常压输送流动相柱效低 （ H↑,n↓）
分析周期长无法在线检测
2,HPLC：分离和分析柱内径 2~6mm,固定相粒径 <10μm（ 球形,匀浆装柱 ）
高压输送流动相柱效高 （ H↓,n↑）
分析时间大大缩短可以在线检测二,HPLC与 GC差别
相同：兼具分离和分析功能,均可以在线检测
主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
1,分析对象
GC：能气化,热稳定性好,且沸点较低的样品,
高沸点,挥发性差,热稳定性差,离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的 20%
HPLC：溶解后能制成溶液的样品,
不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大,难气化,热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛,占有机物的 80%
续前
2,流动相差别
GC：流动相为惰性气体
组分与流动相无亲合作用力,只与固定相作用
HPLC：流动相为液体
流动相与组分间有亲合作用力,为提高柱的选择性,
改善分离度增加了因素,对分离起很大作用
流动相种类较多,选择余地广
流动相极性和 pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性
3,操作条件差别
GC：加温操作
HPLC：室温；高压 （ 液体粘度大,峰展宽小 ）
三、高效液相色谱仪流程图
1,贮液罐 （ 滤棒,可滤去颗粒状物质 ）
2,高压泵 （ 输液泵 ）
3,进样装置
4,色谱柱 —— 分离
5,检测器 —— 分析
6,废液出口或组分收集器
7,记录装置续前四,HPLC的特点和应用
“三高,,一快,,一广,
高柱效 ——n=104片 /米,柱效高 （ 远高于一般 LC）
高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛 （ 可分析 80%有机化合物 ）
第二节 基本理论和条件选择热力学理论：塔板理论 ——平衡理论 基础动力学理论：速率理论 ——Vander方程一、塔板理论二、速率理论三,HPLC法中分离条件的选择一、塔板理论理理 nLH /? 22
21
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2.
讨论：
1）流动相流速对 HPLC板高的影响（与 GC对比） next
dpA2 dpA
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图示
back
续前
3）传质阻抗项及其影响
）（忽略固定相传质阻抗 smmssmm CCCCCC
忽略固定相传质阻抗态流动相的传质阻抗注：只考虑流动相和静
uCuCAHH P L C smm,
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TD
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柱效,nHCdp
柱效,nHD m?
，柱阻，
，但易产生气泡
m
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CDT
图示三,HPLC法中分离条件的选择
1,固定相与装柱方法的选择：
选粒径小的、分布均匀的球形固定相（ dp≤10μm）
首选化学键合相，匀浆法装柱
2,流动相及其流速的选择：
选粘度小、低流速的流动相 ——甲醇,1ml/min
3,柱温的选择：
选室温 250C左右第三节 各类高效液相色谱法一、液固吸附色谱法（ LSC）
二,液液分配色谱法 （ LLC）
三,化学键合相色谱法 （ BPC）
一、液固吸附色谱法（ LSC）
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异
分离前提,K不等或 k不等
)1(0
m
R V
SKtt
mV
SKk
续前
2．固定相：与 LC比，固定相粒径不同（ <10μm）
（ 2） 高分子多孔小球,YSG
原理：吸附 +分配蒹小孔凝胶作用特点：柱选择性好,峰形好,柱效低适用：分离弱极性化合物
（ 1）硅胶 表孔硅胶（薄壳硅胶）
全多孔硅胶 无定形 YWG 5~6μm 5× 104
球形 YQG 3~4μm 8× 108
堆积硅珠 YQG 3~4 μm 8× 108 理想原理：吸附特点：峰易拖尾适用：分离极性化合物续前
3,流动相：底剂 （ 烷烃 ） + 有机极性调节剂
例,正己烷或庚烷 + 氯仿 - - -
4,影响 k的因素：与 固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性 ↑,洗脱能力 ↓,k↑,tR↑
溶剂系统极性 ↑,洗脱能力 ↑,k↓,tR↓
注：调节溶剂极性,可以控制组分的保留时间
5,出柱顺序：强极性组分后出柱,弱极性组分先出柱
6,硅胶吸水量 ↑,LSC→LLC
硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大
硅胶含水量 >17% 分配色谱 硅胶失活 → 载体吸附的水 → 固定液二、液液分配色谱法（ LLC）
1,分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异
2,固定相：载体 +固定液 （ 物理或机械涂渍法 ）
缺点：系统内部压力大,易流失,不实用固定液 ——极性 → NLLC
固定液 ——非极性 → RLLC
3,正相色谱 ——固定液极性 > 流动相极性 （ NLLC）
极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱
适于分离极性组分反相色谱 ——固定液极性 < 流动相极性 （ RLLC）
极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱
适于分离非极性组分三、化学键合相色谱法（ BPC）
（一）化学键合相
（ 二 ） 反相键合相色谱
（ 三 ） 正相键合相色谱
（ 四 ） 离子对色谱和离子抑制色谱
（一）化学键合相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面
1,分离机制：分配 + 吸附 （ 以 LLC为基础 ）
2,特点：
1） 不易流失
2） 热稳定性好
3） 化学性能好
4） 载样量大
5） 适于梯度洗脱
（二）反相键合相色谱
1,分离机制：疏溶剂理论正相 ——流动相与溶质排斥力强,作用时间 ↑
k↑,组分 tR↑
反相 ——流动相与溶质排斥力弱,作用时间 ↓，
k↓,组分 tR↓
2,固定相：极性小的烷基键合相
C8柱,C18柱 （ ODS柱 ——HPLC约 80%问题 ）
3,流动相：极性大的甲醇 -水或乙腈 -水流动相极性 > 固定相极性底剂 + 有机调节剂 （ 极性调节剂 ）
例：水 + 甲醇,乙腈,THF
续前
4,流动相极性与 k的关系：
流动相极性 ↑,洗脱能力 ↓,k↑,组分 tR↑
5,出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱
6,适用：非极性 ~中等极性组分 （ HPLC80%问题 ）
（三）正相键合相色谱
1,分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力,
诱导力,或氢键作用力
2,固定相：极性大的氰基或氨基键合相
3,流动相：极性小 （ 同 LSC）
底剂 + 有机极性调节剂
例：正己烷 + 氯仿 -甲醇,氯仿 -乙醇续前
4,流动相极性与 k的关系：
流动相极性 ↑,洗脱能力 ↑,组分 tR↓,k↓
5,出柱顺序：结构相近组分,极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱
6,适用：
氰基键合相与硅胶的柱选择性相似 （ 极性稍小 ）
分离物质也相似
氨基键合相与硅胶性质差别大,碱性分析极性大物质,糖类等
（四）离子对色谱和离子抑制色谱
1．反相离子对色谱法
2．反相离子抑制色谱
1．反相离子对色谱法（ IPC或 PIC）
反相色谱中,在极性流动相中加入离子对试剂,使被测组分与其中的反离子形成中性离子对,增加 k和 tR,以改善分离
1） 离子对试剂：烷基磺酸钠 →分析碱四丁基季胺盐 →分析酸
2） 影响 k的因素
a,与 m的极性有关 （ 同反相色谱 ）
b,与 R的链长有关,R↑长,极性 ↓小,tR↑,k↑
3） 适用：较强的有机酸,碱
2．反相离子抑制色谱在反相色谱中,通过加入缓冲溶液调节流动相 pH值,抑制组分解离,增加其 k和 tR,以达到改善分离的目的
1） 离子抑制剂：弱酸,弱碱性物质
pH一定的缓冲溶液
2） k的影响因素,与流动相极性有关,还与 pH值有关
选择流动相：应同时考虑极性及 pH值酸性物质 ——加入酸 HAc tR↑,k↑
碱性物质 ——加入碱 NH3·H 2O tR↑,k↑
调节 pH范围,3.0~8.0
pH>8.0 破坏键合相与载体的结合
pH<3.0 腐蚀柱子
3） 适用：极弱酸碱物质
pH=3~7弱酸； pH=7~8弱碱；两性化合物第四节 影响分离的因素
1
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流动相采用粘度小、低流速的匀的固定相：采用粒度小、填充均n
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小）的配比（受柱温影响较：调整流动相和固定相k
续前
2,对流动相的要求：
1） 与固定液不反应
2） 对样品有良好溶解度
k=1~10
k=2~5 最理想的
3） 与检测器匹配：
UV（ 常用,测定波长应大于溶剂的截止波长 ）
荧光,电化学
4） 使用粘度小,纯度高的流动相 （ 甲醇,乙腈 ）
使用前过滤,脱气续前
3．洗脱方式
1） 等度洗脱 （ 恒组成溶剂洗脱 ）
以固定配比的溶剂系统洗脱组分 （ 一个泵 ）
类似 GC的等温度洗脱
2） 梯度洗脱：
在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例即不断改变其极性 （ 两个泵 ）
适于分析极性差别较大的复杂组分类似 GC的程序升温 （ 沸程较长样品 ）
图示第五节 高效液相色谱仪
1,泵：
恒压泵：流量精度不稳恒流泵：常用
2,进样装置
1） 隔膜进样 （ 高分子有机硅胶垫 →进样室 ）
GC系统压力较小,可以
HPLC系统压力太大,必须停泵进样 （ 早期 ）
2） 阀进样：不必停泵,六通阀续前
3,色谱柱：直径 4~6mm,柱长 10~30cm
柱效评价：色谱系统适应性试验
R,n,fs（ 拖尾因子 ）
柱再生：维护,保养,柱子的冲洗
4,检测器
1） 紫外检测器：适于吸收紫外光的物质
2） 荧光检测器：只能分析自身发光的物质灵敏度高
3） 示差折光检测器：利用折光率的差别灵敏度低,温度要求严格
4） 电化学检测器
5） 化学发光
