第三章 高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography,HPLC
液相色谱仪（ 1）
液相色谱仪（ 2）
液相色谱仪（ 3）
? 高压液相色谱对于挥发性低、热稳定性差、分子量大
的高分子化合物以及离子型化合物的分离尤为有利。
如氨基酸、多肽、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、类
脂、维生素、抗菌素等均可进行分离分析定量。生物
材料和生物体液是目前所知道撮复杂的化学物质的混
合物，所含成分在一万种以上，其分子量从 18到几百
万，而且其中有意义的化学成分的含量又往往很低，
因此，必须要有一种高分辨、高灵敏度的分离鉴定手
段，气相色谱和高压液相色谱具有以上特点，它们可
通过对生物样品和生物体液样品的有关成分的提取、
分离、分析定量，进行对疾病的早期快速诊断的研究，
病理病因的研究，以及药物在体内代谢的研究 …… 等。
它们将以高选择性、高分离效能、高灵敏度、高速度
等特点，为您提供准确可靠的研究指标。尤其是高灵
敏度方面，它们可以检测出 10-910-12克的痕量物质，
能达到这个检测量的分析方法并不多见。因此，气相
色谱和高压液相色谱是从事生物科学和医学研究的一
个很有用的手段。
第一节 高效液相色谱法概述
一、理论基础,速率理论
Cu
u
B
AH ???
A为涡流扩散项
B/u分子扩散项
Cu项即传质阻力项
二,HPLC技术
采用高压输液泵，高效微粒固定相
和高灵敏度检测器。
三,HPLC特点
高压、高速、高效、高灵敏度、样品
回收方便。
㈠ 经典 LC与 HPLC比较
经典 LC HPLC
柱之内径
1~5cm
~0.4cm
长度
50~100cm
15~50cm
填充材料粒度
150μm~200μm
4μm~10μm
使用压力
1~10atm
50~200atm
分离时间
0.5h~天
~10min
㈡ 与气相色谱法比较,HPLC的优点
1.分析对象广
气相色谱只限于分析气体和沸点较低的
化合物； HPLC不受样品挥发性和热稳定
性的限制, 适用于高沸点, 热稳定性差,
摩尔质量大的物质 。 原则上讲, 几乎可以
分析除永久气体外所有的有机和无机化合
物 。
⒉ 流动相对分离起作用
气相色谱的流动相仅起运载作用，对
组分不产生相互作用力； HPLC的流动相
对组分产生相互作用力，相当于增加了一
个控制和改进分离条件的参数。
⒊ 经常在室温条件下操作
气相色谱法一般在较高温度下进行
缺点, 仪器设备费用昂贵, 操作严格 。
第二节 HPLC的主要类型
一,液一液分配色谱法（ LLPC）
在液 -液色谱中,流动相和固定相都是
液体,它能适用于各种样品类型的分离和分
析，无论是极性的和非极性的，水溶性和
油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。
1,分离原理
液液分配色谱的分离原理基本与液
液萃取相同,都是根据物质在两种互不相
溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分
配系数。 所不同的是液液色谱的分配是在
柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次
进行，造成各组分的差速迁移，提高了分
离效率，从而能分离各种复杂组分。
2.固定相
液液色谱的固定相由载体和固定液
组成。常用的载体有下列几类,
（ 1） 全多孔型载体：由硅胶、硅藻土
等材料制成，直径约 100 ?m的全多孔型
颗粒。
这类固定相由于颗粒很细，孔仍然
较浅，传质速率快，易实现高效、高速。
特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
（ 2） 表面多孔型载体（薄壳型微珠载
体）：由直径为 30 ~ 40?m的实心玻璃球
和厚度约为 1 ~ 2 ?m的多孔性外层所组
成。目前，这种载体粒度为 5 ~ 10 ?m。
这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相
对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，
渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平
衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，
最大允许量受限制。
⑶ 化学键合固定相, 它是将各种不同有机
基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。
它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产
生对液相色谱法迅速发展起着重大作用,可以
认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破 。
它是目前应用最广泛的一种固定相。
据统计，约有 3/4以上的分离问题是在化
学键合固定相上进行的。
3．流动相
根据所使用的流动相和固定相的极性程
度, 将其分为 正相分配色谱 和 反相分配色谱 。
正相分配色谱,流动相的极性小于固定相的极性,
它适用于极性化合物的分离 。 其
流出顺序 是极性小的先流出, 极
性大的后流出 。
反相分配色谱,流动相的极性大于固定相的极性,
它适用于非极性化合物的分离,
其 流出顺序与正相色谱恰好相反
二、液一固吸附色谱法 (LSAC)
液一固吸附色谱是以固体吸附剂
作为固定相，吸附剂通常是些多孔的
固体颗粒物质，在它们的表面存在吸
附中心。 液固色谱实质是根据物质在
固定相上的吸附作用不同来进行分离
的。
1．分离原理
当流动相通过固定相 （ 吸附剂 ） 时, 吸附
剂表面的活性中心就要吸附流动相分子 。 同时,
当试样分子 （ X） 被流动相带入柱内, 只要它们
在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当
的已被吸附的流动相溶剂分用 ） 于是, 在固定
相表面发生竞争吸附,
X + nSad = Xad + nS
达平衡时,有
n
ad
n
ad
ad
SX
SX
K
]][[
]][[
?
其中 Kad为吸附平衡常数,值大表示组分在吸附剂
上保留强，难于洗脱。 Kad值小,则保留值弱，易
于洗脱。试样中各组分据此得以分离。 Kad值可通
过吸附等温线数据求出。
2．固定相
液－固吸附色谱所用固定相多是一些
吸附活性强弱不等的吸附剂, 如硅胶, 氧
化铝, 聚酸胶等 。 由于硅胶的优点较多,
如线性容量较高, 机械性能好, 不溶胀,
与大多数试样不发生化学反应等, 因此,
以硅胶用得最多 。
目前最广泛使用的还是 5～ 10 ?m的
全多孔型微粒填料 。
3.流动相
一般把吸附色谱中 流动相 称作 洗脱剂。
在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极
性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性
弱的洗脱剂。
三、离子交换色谱法（ IEC）
此法是利用 离子交换原理和液相色谱
技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子
的一种分离分析方法 。凡在溶液中能够电
离的物质，通常都可用离子交换色谱法进
行分离。它不仅适用无机离子混合物的分
离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、
核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用
范围较广。
1．离子交换原理
离子交换色谱法是利用不同待测离
子对固定相亲和力的差别来实现分离的 。
其固定相采用离子交换树脂, 树脂上分布
有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子 。
当待分析物质电离后产生的离子可与树脂
上可游离的平衡离子进行可逆交换, 其交
换反应通式如下,
阳离子交换,
R S O 3 - H + + M + R S O 3 - M + + H +
阴离子交换,
R N R 3 + C l - + X - R N R 3 + X - + C l -
一般形式,R一 A＋ B ＝ R－ B＋ A
达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应
的选择系数）,
r
r
AB AB
AB
K
]][[
][][
/ ?
式中 [A]r,[B]r 分别代表树脂相中洗脱剂离子
（ A）和试样离子（ B）的浓度,[A],[B]则代表
它们在溶液中的浓度。
KB/A越大，说明 B离子交换能力越大，越易保
留而难于洗脱。一般说来,B离子电荷越大，水
合离子半径越小,KB/A值就越大 。
2.固定相
（ l） 多孔型离子交换树脂
它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交
联聚合物, 直径约为 5～ 20μ m,有微孔型
和大孔型之分 。
（ 2）薄膜型离子交换树脂
它是在直径约对 30μ m的固体惰性核上,
凝聚 1～ 2μ m厚的树脂层 。
（ 3） 表面多孔型离子交换树脂
它是在固体情性核上, 覆盖一层微球硅
胶, 再在上面涂一层很薄的离子交换树脂 。
（ 4）离子交换键合固定相
它是用化学反应将离子交换基团键合
到惰性载体表面。它也分为两种类型。
一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。
另一种是键合微粒载体型，它的载体是
多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子
交换固定相，它的优点是机械性能稳定，
可使用小粒度固定相和高柱压来实现快
速分离。
3.流动相
离子交换色谱法所用流动相大都是 一定
pH和盐浓度 （或离子强度）的缓冲溶液。通
过改变流动相中盐离子的种类、浓度和 pH值
可控制 k值，改变选择性。
有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同
水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择
性，并改善样品的溶解度。
盐离子的浓度影响,
如果增加盐离子的浓度，则可降低
样品离子的竞争吸附能力，从而降低其
在固定相上的保留值。
要视不同情况而定。例如，分离有机酸
和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改
变流动相的 pH值来控制。增大 pH值会使酸
的电离度增加，使碱的电离度减少；降低
PH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，
只要电离度增大，就会使样品的保留增大。
pH值的影响,
四、离子对色谱法（ IPC）
离子对色谱法是分离分析强极性有机
酸和有机碱的极好方法。
离子对色谱法是将一种（或数种）与
溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反
离子）加到流动相或固定相中，使其与溶
质离子结合形成离子对，从而控制溶质离
子保留行为的一种色谱法。
假如有一离子对色谱体系，固定相为非极
性键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一
种电荷与组分离子 A-相反的离子 B+,B+离子由
于静电引力与带负电的 A-组分离子生成离子对
化合物 A-B+。离子对生成反应式,
K A B
A - 水 相? + A - B + 有 机 相B + 有 机 相
由于离子对化合物 A-B+具有疏水性，
因而被非极性固定相（有机相）提取。组
分离子的性质不同，它与反离子形成离子
对的能力大小不同以及形成的离子对流水
性质不同，导致各组分离子在固定相中滞
留时间不同，因而出峰先后不同。这就是
离子对色谱法分离的基本原理。
流动相,加有平衡离子（反离子）的极性
溶液通过改变流动相的 pH、平
衡离子的浓度和种类可改变分离
的选择性。
固定相,非极性的疏水键合相
五、离子色谱法（ IC）
抑制型,抑制柱型, 连续抑制型
分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在
0.01～ 0.05毫摩尔 /克干树脂
非抑制型, 当进一步降低分离柱中树脂的交换容
量 (0.007～ 0.07毫摩尔 /克干树脂 ),使用低浓度、
低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲
酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，
不需抑制柱。
⒈ 离子色谱装置类型
⒉ 离子色谱连续抑制装置图,
通过 分离柱 后的样品再经过 抑制柱, 使具
有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流
动相, 从而用电导检测器可直接检测各种离子
的含量 。
若样品为阳离子, 用无机酸作流动相, 抑
制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂 。 当试样
经阳离子交换剂的分离往后, 随流动相进入抑
制柱, 在抑制柱中发生两个重要反应,
R+－ OH＋ H+Cl- -→R +－ Cl十 H2O
R+一 OH-＋ M+Cl--→ M+OH－ ＋ R+－ Cl-
由反应可见：经抑制柱后, 一方面将大
量酸转变为电导很小的水, 消除了流动相本
底电导的影响 。 同时, 又将样品阳离子 M+
转变成相应的碱, 由于 OH-离子的浓度为 Cl-
离子的 2,6倍, 提高了所 测阳离子电导的检
测灵敏度 。 对于阴离子样品也有相似的作用
机理 。
⒊ 离子色谱的应用,
阴离子分析,
双 柱, 薄 壳 型 阴 离 子 交 换 树 脂 分 离 柱
(3× 250mm),
流动相,0.003mol·L-1 NaHCO3 / 0.0024 mol·L-1
Na2CO3,流量 138 mL/hr。
七种阴离子在 20分钟内基本上得到完全分离,
各组分含量在 3～ 50 ppm。
六、空间排阻色谱法（ SEC）
主要用于较大分子的分离 。 与其他液相色
谱方法原理不同, 它不具有吸附, 分配和离子
交换作用机理, 而是 基于试样分子的尺寸和形
状不同来实现分离的 。
1.固定相
排阻色谱固定相种类很多，一般可
分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。
所谓凝胶，指含有大量液体（一般
是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一
种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。
（ 1） 软性凝胶 如葡聚糖凝胶, 琼脂糖凝胶都
具有较小的交联结构, 其微孔能吸入大量的溶
剂, 并能溶胀到它们干体的许多倍 。 它们适用
以水溶性溶剂作流动相, 一般用于 小分子质量
物质的分析, 不适宜用在高效液相色谱中 。
（ 2） 半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯
（ Styragel） 比软性凝胶稍耐压, 溶胀性不如软
性凝胶 。 常以有机溶剂作流动相 。 用于高效液
相色谱时, 流速不宜大 。
（ 3）刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既
可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可
在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小
于 7MPa，流速＜ 1cm3·s-1；否则将影响凝胶孔径，
造成不良分离。
2．流动相
排阻色谱所选用的流动相必须能 溶解样品，
并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝
胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须 能溶胀凝
胶 。
溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限
制分子扩散作用而影响分离效果。
常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、
二甲基酸胺和水等。
3．分离原理
空间排阻色谱是按分子大小顺序进行
分离的一种色谱方法。
凝胶内具有一定大小的孔穴,体积大
的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较
早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗
透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色
谱柱。
4.特点,
⑴ 保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供
分子结构的某些信息。
⑵保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵
敏度较低的检测器。
⑶固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由
于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。
⑷不能分辨分子大小相近的化合物，相对分
子质量差别必须大于 10％才能得以分离。
液相色谱分离类型选择参考表
第三节 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪由 高压输液系统、进
样系统、分离系统、检测系统、记录系统
等五大部分组成 。
1.储液瓶 （ 输液管
入口端安装有过滤
器 ） ； 2.高压输液
泵； 3.混合器和阻
尼器； 4,进 样 器
（ 阀 ） ； 5.色谱柱；
6.检测器； 7.废液
瓶； 8.数据处理和
控制系统
HPLC仪器结构示意图
贮液器
输液泵
梯度装置
进样装置 分离柱
控温装置
检测器
首先高压泵将贮液器中流动相溶剂
经过进样器送入色谱柱, 然后从控制器
的出口流出 。 当注入欲分离的样品时,
流经进样器贮液器的流动相将样品同时
带入色谱柱进行分离, 然后依先后顺序
进入检测器, 记录仪将检测器送出的信
号记录下来, 由此得到液相色谱图 。
工作过程,
一、高压输液系统
高压输液系统由 溶剂贮存器、高压
泵、梯度洗脱装置和压力表 等组成。
1.溶剂贮存器
溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或
氟塑料制成，容量为 1到 2 L，用来贮存
足够数量、符合要求的流动相。
2.高压输液泵
高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件
之一，其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高
压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色
谱柱中完成分离过程。
对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流
量恒定、无脉动，流量精度和重复性为 0.5%
左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。
高压输液泵，按其性质可分为 恒压泵
和恒流泵 两大类。
恒流泵 是能给出恒定流量的泵，其流
量与流动相粘度和柱渗透无关。
? 恒压泵 是保持输出压力恒定，而流量随
外界阻力变化而变化，如果系统阻力不
发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。
3,梯度洗脱装置
梯度洗脱 就是在分离过程中使两种或
两种以上不同极性的溶剂按一定程序连
续改变它们之间的比例，从而使流动相
的强度、极性,pH值或离子强度相应地
变化，达到提高分离效果，缩短分析时
间的目的。
仅用弱溶剂 仅用强溶剂
梯度洗提
梯度洗脱装置分类
一类是 外梯度装置 （又称低压梯度），
流动相在常温常压下混合，用高压泵压至
柱系统，仅需一台泵即可。
一类是 内梯度装置 （又称高压梯度），
将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件
设置的程序，注入梯度混合室混 合，再输
至柱系统。
二、进样系统
进样系统包括进样口、注射器和进样
阀等，它的作用是把分析试样有效地送入
色谱柱上进行分离。
通常使用耐高压的六通阀进样装置,其结构如图所示,
三、分离系统
色谱柱是液相色谱的 心脏部件,它包
括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、
不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的
其他金属。
柱管材料,耐腐蚀耐压
内径,2.0,3.0,4.1,4.6mm
长度,5,10,15,25cm等
固定相,颗粒细, 圆, 均一, 刚性强
一般在分离前备有一个前置柱，前置
柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使
淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相
饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中
固定相，保证分离技的性能不受影响 。
柱子装填得好坏对柱效影响很大。
对于细粒度的填料（＜ 20μm）一般采用
匀浆填充法装柱,先将填料调成匀浆，然
后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗
脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。
柱温一般为室温或接近室温。
四、检测系统
检测器是液相色谱仪的关键部件之一。
对检测器的要求是,灵敏度高，重复性好、
线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的
变化不敏感等 。
在液相色谱中，有两种类型的检测器,
一类是 溶质性检测器,它仅对被分
离组分的物理或物理化学特性有响应。属
于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检
测器等；
一类是 总体检测器,它对试样和洗
脱液总的物理和化学性质响应。属于此类
检测器有示差折光检测器等。
㈠ 紫外光度检测器
⒈ 作用原理
依据被分析试样组分对待定波长紫外
光的选择吸收性，组分浓度与吸光率的关
系遵守比尔定律。
⒉ 工作过程
透镜将光源射来的光束变成平行光，
经过遮光板变成一对细小的平行光束，分
别通过测量池与参比池，然后用紫外滤片
滤掉非单色光，通过双紫外光敏电阻，根
据输出信号差进行检测。
⒊ 特点
⑴ 灵敏度高，检测浓度可达到 10-9g/ml；
⑵结构简单，对温度和流速不敏感；
⑶溶剂的选用受限制。
㈡ 荧光检测器
物质受紫外光激发后，能辐射出比紫外
光波长较长的荧光，可用荧光检测器检测，
而某些不发射荧光的物质也可通过化学衍生
转变成能发射荧光德物质而得到检测。
? 优点：是一种选择性强、灵敏度高，比
紫外检测器高 2?3个数量级，可达 pg量
级或更低，可用于梯度淋洗。
? 缺点：样品适用范围有限，定量分析的
线性范围较窄 (104-105)。
㈢ 示差折光检测器
借连续测定流通池中溶液折射率德方法来
测定试样浓度的检测器 。 分为偏转式和反射式
两种类型 。
是一种通用型检测器, 灵敏度可达 10-7
g?cm-3。 缺点是对温度变化敏感, 不能用于梯
度淋洗 。
㈣ 电导检测器
是离子色谱法应用最多的检测器，依据
物质在某些介质中电离后所产生电导变化来
测定电离物质的含量。受温度的影响较大，
需放在恒温箱中。 pH>7时不够灵敏。
High Performance Liquid Chromatography,HPLC
液相色谱仪（ 1）
液相色谱仪（ 2）
液相色谱仪（ 3）
? 高压液相色谱对于挥发性低、热稳定性差、分子量大
的高分子化合物以及离子型化合物的分离尤为有利。
如氨基酸、多肽、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、类
脂、维生素、抗菌素等均可进行分离分析定量。生物
材料和生物体液是目前所知道撮复杂的化学物质的混
合物，所含成分在一万种以上，其分子量从 18到几百
万，而且其中有意义的化学成分的含量又往往很低，
因此，必须要有一种高分辨、高灵敏度的分离鉴定手
段，气相色谱和高压液相色谱具有以上特点，它们可
通过对生物样品和生物体液样品的有关成分的提取、
分离、分析定量，进行对疾病的早期快速诊断的研究，
病理病因的研究，以及药物在体内代谢的研究 …… 等。
它们将以高选择性、高分离效能、高灵敏度、高速度
等特点，为您提供准确可靠的研究指标。尤其是高灵
敏度方面，它们可以检测出 10-910-12克的痕量物质，
能达到这个检测量的分析方法并不多见。因此，气相
色谱和高压液相色谱是从事生物科学和医学研究的一
个很有用的手段。
第一节 高效液相色谱法概述
一、理论基础,速率理论
Cu
u
B
AH ???
A为涡流扩散项
B/u分子扩散项
Cu项即传质阻力项
二,HPLC技术
采用高压输液泵，高效微粒固定相
和高灵敏度检测器。
三,HPLC特点
高压、高速、高效、高灵敏度、样品
回收方便。
㈠ 经典 LC与 HPLC比较
经典 LC HPLC
柱之内径
1~5cm
~0.4cm
长度
50~100cm
15~50cm
填充材料粒度
150μm~200μm
4μm~10μm
使用压力
1~10atm
50~200atm
分离时间
0.5h~天
~10min
㈡ 与气相色谱法比较,HPLC的优点
1.分析对象广
气相色谱只限于分析气体和沸点较低的
化合物； HPLC不受样品挥发性和热稳定
性的限制, 适用于高沸点, 热稳定性差,
摩尔质量大的物质 。 原则上讲, 几乎可以
分析除永久气体外所有的有机和无机化合
物 。
⒉ 流动相对分离起作用
气相色谱的流动相仅起运载作用，对
组分不产生相互作用力； HPLC的流动相
对组分产生相互作用力，相当于增加了一
个控制和改进分离条件的参数。
⒊ 经常在室温条件下操作
气相色谱法一般在较高温度下进行
缺点, 仪器设备费用昂贵, 操作严格 。
第二节 HPLC的主要类型
一,液一液分配色谱法（ LLPC）
在液 -液色谱中,流动相和固定相都是
液体,它能适用于各种样品类型的分离和分
析，无论是极性的和非极性的，水溶性和
油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。
1,分离原理
液液分配色谱的分离原理基本与液
液萃取相同,都是根据物质在两种互不相
溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分
配系数。 所不同的是液液色谱的分配是在
柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次
进行，造成各组分的差速迁移，提高了分
离效率，从而能分离各种复杂组分。
2.固定相
液液色谱的固定相由载体和固定液
组成。常用的载体有下列几类,
（ 1） 全多孔型载体：由硅胶、硅藻土
等材料制成，直径约 100 ?m的全多孔型
颗粒。
这类固定相由于颗粒很细，孔仍然
较浅，传质速率快，易实现高效、高速。
特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
（ 2） 表面多孔型载体（薄壳型微珠载
体）：由直径为 30 ~ 40?m的实心玻璃球
和厚度约为 1 ~ 2 ?m的多孔性外层所组
成。目前，这种载体粒度为 5 ~ 10 ?m。
这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相
对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，
渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平
衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，
最大允许量受限制。
⑶ 化学键合固定相, 它是将各种不同有机
基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。
它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产
生对液相色谱法迅速发展起着重大作用,可以
认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破 。
它是目前应用最广泛的一种固定相。
据统计，约有 3/4以上的分离问题是在化
学键合固定相上进行的。
3．流动相
根据所使用的流动相和固定相的极性程
度, 将其分为 正相分配色谱 和 反相分配色谱 。
正相分配色谱,流动相的极性小于固定相的极性,
它适用于极性化合物的分离 。 其
流出顺序 是极性小的先流出, 极
性大的后流出 。
反相分配色谱,流动相的极性大于固定相的极性,
它适用于非极性化合物的分离,
其 流出顺序与正相色谱恰好相反
二、液一固吸附色谱法 (LSAC)
液一固吸附色谱是以固体吸附剂
作为固定相，吸附剂通常是些多孔的
固体颗粒物质，在它们的表面存在吸
附中心。 液固色谱实质是根据物质在
固定相上的吸附作用不同来进行分离
的。
1．分离原理
当流动相通过固定相 （ 吸附剂 ） 时, 吸附
剂表面的活性中心就要吸附流动相分子 。 同时,
当试样分子 （ X） 被流动相带入柱内, 只要它们
在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当
的已被吸附的流动相溶剂分用 ） 于是, 在固定
相表面发生竞争吸附,
X + nSad = Xad + nS
达平衡时,有
n
ad
n
ad
ad
SX
SX
K
]][[
]][[
?
其中 Kad为吸附平衡常数,值大表示组分在吸附剂
上保留强，难于洗脱。 Kad值小,则保留值弱，易
于洗脱。试样中各组分据此得以分离。 Kad值可通
过吸附等温线数据求出。
2．固定相
液－固吸附色谱所用固定相多是一些
吸附活性强弱不等的吸附剂, 如硅胶, 氧
化铝, 聚酸胶等 。 由于硅胶的优点较多,
如线性容量较高, 机械性能好, 不溶胀,
与大多数试样不发生化学反应等, 因此,
以硅胶用得最多 。
目前最广泛使用的还是 5～ 10 ?m的
全多孔型微粒填料 。
3.流动相
一般把吸附色谱中 流动相 称作 洗脱剂。
在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极
性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性
弱的洗脱剂。
三、离子交换色谱法（ IEC）
此法是利用 离子交换原理和液相色谱
技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子
的一种分离分析方法 。凡在溶液中能够电
离的物质，通常都可用离子交换色谱法进
行分离。它不仅适用无机离子混合物的分
离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、
核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用
范围较广。
1．离子交换原理
离子交换色谱法是利用不同待测离
子对固定相亲和力的差别来实现分离的 。
其固定相采用离子交换树脂, 树脂上分布
有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子 。
当待分析物质电离后产生的离子可与树脂
上可游离的平衡离子进行可逆交换, 其交
换反应通式如下,
阳离子交换,
R S O 3 - H + + M + R S O 3 - M + + H +
阴离子交换,
R N R 3 + C l - + X - R N R 3 + X - + C l -
一般形式,R一 A＋ B ＝ R－ B＋ A
达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应
的选择系数）,
r
r
AB AB
AB
K
]][[
][][
/ ?
式中 [A]r,[B]r 分别代表树脂相中洗脱剂离子
（ A）和试样离子（ B）的浓度,[A],[B]则代表
它们在溶液中的浓度。
KB/A越大，说明 B离子交换能力越大，越易保
留而难于洗脱。一般说来,B离子电荷越大，水
合离子半径越小,KB/A值就越大 。
2.固定相
（ l） 多孔型离子交换树脂
它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交
联聚合物, 直径约为 5～ 20μ m,有微孔型
和大孔型之分 。
（ 2）薄膜型离子交换树脂
它是在直径约对 30μ m的固体惰性核上,
凝聚 1～ 2μ m厚的树脂层 。
（ 3） 表面多孔型离子交换树脂
它是在固体情性核上, 覆盖一层微球硅
胶, 再在上面涂一层很薄的离子交换树脂 。
（ 4）离子交换键合固定相
它是用化学反应将离子交换基团键合
到惰性载体表面。它也分为两种类型。
一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。
另一种是键合微粒载体型，它的载体是
多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子
交换固定相，它的优点是机械性能稳定，
可使用小粒度固定相和高柱压来实现快
速分离。
3.流动相
离子交换色谱法所用流动相大都是 一定
pH和盐浓度 （或离子强度）的缓冲溶液。通
过改变流动相中盐离子的种类、浓度和 pH值
可控制 k值，改变选择性。
有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同
水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择
性，并改善样品的溶解度。
盐离子的浓度影响,
如果增加盐离子的浓度，则可降低
样品离子的竞争吸附能力，从而降低其
在固定相上的保留值。
要视不同情况而定。例如，分离有机酸
和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改
变流动相的 pH值来控制。增大 pH值会使酸
的电离度增加，使碱的电离度减少；降低
PH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，
只要电离度增大，就会使样品的保留增大。
pH值的影响,
四、离子对色谱法（ IPC）
离子对色谱法是分离分析强极性有机
酸和有机碱的极好方法。
离子对色谱法是将一种（或数种）与
溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反
离子）加到流动相或固定相中，使其与溶
质离子结合形成离子对，从而控制溶质离
子保留行为的一种色谱法。
假如有一离子对色谱体系，固定相为非极
性键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一
种电荷与组分离子 A-相反的离子 B+,B+离子由
于静电引力与带负电的 A-组分离子生成离子对
化合物 A-B+。离子对生成反应式,
K A B
A - 水 相? + A - B + 有 机 相B + 有 机 相
由于离子对化合物 A-B+具有疏水性，
因而被非极性固定相（有机相）提取。组
分离子的性质不同，它与反离子形成离子
对的能力大小不同以及形成的离子对流水
性质不同，导致各组分离子在固定相中滞
留时间不同，因而出峰先后不同。这就是
离子对色谱法分离的基本原理。
流动相,加有平衡离子（反离子）的极性
溶液通过改变流动相的 pH、平
衡离子的浓度和种类可改变分离
的选择性。
固定相,非极性的疏水键合相
五、离子色谱法（ IC）
抑制型,抑制柱型, 连续抑制型
分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在
0.01～ 0.05毫摩尔 /克干树脂
非抑制型, 当进一步降低分离柱中树脂的交换容
量 (0.007～ 0.07毫摩尔 /克干树脂 ),使用低浓度、
低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲
酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，
不需抑制柱。
⒈ 离子色谱装置类型
⒉ 离子色谱连续抑制装置图,
通过 分离柱 后的样品再经过 抑制柱, 使具
有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流
动相, 从而用电导检测器可直接检测各种离子
的含量 。
若样品为阳离子, 用无机酸作流动相, 抑
制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂 。 当试样
经阳离子交换剂的分离往后, 随流动相进入抑
制柱, 在抑制柱中发生两个重要反应,
R+－ OH＋ H+Cl- -→R +－ Cl十 H2O
R+一 OH-＋ M+Cl--→ M+OH－ ＋ R+－ Cl-
由反应可见：经抑制柱后, 一方面将大
量酸转变为电导很小的水, 消除了流动相本
底电导的影响 。 同时, 又将样品阳离子 M+
转变成相应的碱, 由于 OH-离子的浓度为 Cl-
离子的 2,6倍, 提高了所 测阳离子电导的检
测灵敏度 。 对于阴离子样品也有相似的作用
机理 。
⒊ 离子色谱的应用,
阴离子分析,
双 柱, 薄 壳 型 阴 离 子 交 换 树 脂 分 离 柱
(3× 250mm),
流动相,0.003mol·L-1 NaHCO3 / 0.0024 mol·L-1
Na2CO3,流量 138 mL/hr。
七种阴离子在 20分钟内基本上得到完全分离,
各组分含量在 3～ 50 ppm。
六、空间排阻色谱法（ SEC）
主要用于较大分子的分离 。 与其他液相色
谱方法原理不同, 它不具有吸附, 分配和离子
交换作用机理, 而是 基于试样分子的尺寸和形
状不同来实现分离的 。
1.固定相
排阻色谱固定相种类很多，一般可
分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。
所谓凝胶，指含有大量液体（一般
是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一
种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。
（ 1） 软性凝胶 如葡聚糖凝胶, 琼脂糖凝胶都
具有较小的交联结构, 其微孔能吸入大量的溶
剂, 并能溶胀到它们干体的许多倍 。 它们适用
以水溶性溶剂作流动相, 一般用于 小分子质量
物质的分析, 不适宜用在高效液相色谱中 。
（ 2） 半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯
（ Styragel） 比软性凝胶稍耐压, 溶胀性不如软
性凝胶 。 常以有机溶剂作流动相 。 用于高效液
相色谱时, 流速不宜大 。
（ 3）刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既
可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可
在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小
于 7MPa，流速＜ 1cm3·s-1；否则将影响凝胶孔径，
造成不良分离。
2．流动相
排阻色谱所选用的流动相必须能 溶解样品，
并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝
胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须 能溶胀凝
胶 。
溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限
制分子扩散作用而影响分离效果。
常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、
二甲基酸胺和水等。
3．分离原理
空间排阻色谱是按分子大小顺序进行
分离的一种色谱方法。
凝胶内具有一定大小的孔穴,体积大
的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较
早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗
透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色
谱柱。
4.特点,
⑴ 保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供
分子结构的某些信息。
⑵保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵
敏度较低的检测器。
⑶固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由
于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。
⑷不能分辨分子大小相近的化合物，相对分
子质量差别必须大于 10％才能得以分离。
液相色谱分离类型选择参考表
第三节 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪由 高压输液系统、进
样系统、分离系统、检测系统、记录系统
等五大部分组成 。
1.储液瓶 （ 输液管
入口端安装有过滤
器 ） ； 2.高压输液
泵； 3.混合器和阻
尼器； 4,进 样 器
（ 阀 ） ； 5.色谱柱；
6.检测器； 7.废液
瓶； 8.数据处理和
控制系统
HPLC仪器结构示意图
贮液器
输液泵
梯度装置
进样装置 分离柱
控温装置
检测器
首先高压泵将贮液器中流动相溶剂
经过进样器送入色谱柱, 然后从控制器
的出口流出 。 当注入欲分离的样品时,
流经进样器贮液器的流动相将样品同时
带入色谱柱进行分离, 然后依先后顺序
进入检测器, 记录仪将检测器送出的信
号记录下来, 由此得到液相色谱图 。
工作过程,
一、高压输液系统
高压输液系统由 溶剂贮存器、高压
泵、梯度洗脱装置和压力表 等组成。
1.溶剂贮存器
溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或
氟塑料制成，容量为 1到 2 L，用来贮存
足够数量、符合要求的流动相。
2.高压输液泵
高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件
之一，其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高
压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色
谱柱中完成分离过程。
对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流
量恒定、无脉动，流量精度和重复性为 0.5%
左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。
高压输液泵，按其性质可分为 恒压泵
和恒流泵 两大类。
恒流泵 是能给出恒定流量的泵，其流
量与流动相粘度和柱渗透无关。
? 恒压泵 是保持输出压力恒定，而流量随
外界阻力变化而变化，如果系统阻力不
发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。
3,梯度洗脱装置
梯度洗脱 就是在分离过程中使两种或
两种以上不同极性的溶剂按一定程序连
续改变它们之间的比例，从而使流动相
的强度、极性,pH值或离子强度相应地
变化，达到提高分离效果，缩短分析时
间的目的。
仅用弱溶剂 仅用强溶剂
梯度洗提
梯度洗脱装置分类
一类是 外梯度装置 （又称低压梯度），
流动相在常温常压下混合，用高压泵压至
柱系统，仅需一台泵即可。
一类是 内梯度装置 （又称高压梯度），
将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件
设置的程序，注入梯度混合室混 合，再输
至柱系统。
二、进样系统
进样系统包括进样口、注射器和进样
阀等，它的作用是把分析试样有效地送入
色谱柱上进行分离。
通常使用耐高压的六通阀进样装置,其结构如图所示,
三、分离系统
色谱柱是液相色谱的 心脏部件,它包
括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、
不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的
其他金属。
柱管材料,耐腐蚀耐压
内径,2.0,3.0,4.1,4.6mm
长度,5,10,15,25cm等
固定相,颗粒细, 圆, 均一, 刚性强
一般在分离前备有一个前置柱，前置
柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使
淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相
饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中
固定相，保证分离技的性能不受影响 。
柱子装填得好坏对柱效影响很大。
对于细粒度的填料（＜ 20μm）一般采用
匀浆填充法装柱,先将填料调成匀浆，然
后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗
脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。
柱温一般为室温或接近室温。
四、检测系统
检测器是液相色谱仪的关键部件之一。
对检测器的要求是,灵敏度高，重复性好、
线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的
变化不敏感等 。
在液相色谱中，有两种类型的检测器,
一类是 溶质性检测器,它仅对被分
离组分的物理或物理化学特性有响应。属
于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检
测器等；
一类是 总体检测器,它对试样和洗
脱液总的物理和化学性质响应。属于此类
检测器有示差折光检测器等。
㈠ 紫外光度检测器
⒈ 作用原理
依据被分析试样组分对待定波长紫外
光的选择吸收性，组分浓度与吸光率的关
系遵守比尔定律。
⒉ 工作过程
透镜将光源射来的光束变成平行光，
经过遮光板变成一对细小的平行光束，分
别通过测量池与参比池，然后用紫外滤片
滤掉非单色光，通过双紫外光敏电阻，根
据输出信号差进行检测。
⒊ 特点
⑴ 灵敏度高，检测浓度可达到 10-9g/ml；
⑵结构简单，对温度和流速不敏感；
⑶溶剂的选用受限制。
㈡ 荧光检测器
物质受紫外光激发后，能辐射出比紫外
光波长较长的荧光，可用荧光检测器检测，
而某些不发射荧光的物质也可通过化学衍生
转变成能发射荧光德物质而得到检测。
? 优点：是一种选择性强、灵敏度高，比
紫外检测器高 2?3个数量级，可达 pg量
级或更低，可用于梯度淋洗。
? 缺点：样品适用范围有限，定量分析的
线性范围较窄 (104-105)。
㈢ 示差折光检测器
借连续测定流通池中溶液折射率德方法来
测定试样浓度的检测器 。 分为偏转式和反射式
两种类型 。
是一种通用型检测器, 灵敏度可达 10-7
g?cm-3。 缺点是对温度变化敏感, 不能用于梯
度淋洗 。
㈣ 电导检测器
是离子色谱法应用最多的检测器，依据
物质在某些介质中电离后所产生电导变化来
测定电离物质的含量。受温度的影响较大，
需放在恒温箱中。 pH>7时不够灵敏。
