上海中医药大学《实验中医学》教案（7） 课程名称 实验中医学（理论部分） 总学时数 36 专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤 内容 实验中医学常用的实验研究方法及其在中医研究中的应用 时数 16  本次课目的要求 1．掌握不同学科实验研究方法的特点和优势。 2．掌握如何根据实验研究的要求选择实验研究方法（包括一种或几种方法）。 3．了解各学科的主要实验研究方法。 4．了解各学科实验研究方法在中医药研究中的应用。 5．了解了解各学科研究中医药学的现状。  本次课的重点难点 第一节 解剖学方法及其在中医研究中的应用 1．大体解剖学的主要方法。 2．大体解剖学方法研究中医的现状。 第二节 组织学方法及其在中医研究中的应用 1．组织学的主要研究方法。 2．组织学方法研究中医的现状。 第三节 电镜技术及其在中医研究中的应用 1．电子显微镜及电子显微术概况。 2．电子显微术研究中医的现状。 第四节 生物化学方法及其在中医研究中的应用 1．生物化学的主要方法。 2．生物化学方法研究中医的现状。 第五节 生理学方法及其在中医研究中的应用 1．生理学的主要方法。 2．生理学方法研究中医的现状。 第六节 免疫学方法及其在中医研究中的应用 1．免疫学的主要方法。 2．用免疫学方法研究中医的现状。 第七节 核医学方法及其在中医研究中的应用 1．核医学的主要研究方法。 2．用核医学方法研究中医的现状。 第八节 分子生物学方法及其在中医研究中的应用 1．分子生物学的主要技术和方法。 2．用分子生物学方法研究中医的现状。  本次课的应用教具  多媒体设备。   第八节 分子生物学方法 及其在中医研究中的应用 （2学时） 分子生物学是本世纪中叶才诞生并迅速发展起来的学科，被誉为本世纪最伟大的科学成就。如今，分子生物学技术已成为医学领域中使用最为广泛的技术，在揭示新的生命现象、认识和战胜种种疾病等方面起着愈来愈重要的作用，并成为医药学研究的领先学科。 中医学的实验研究在近一二十年来取得了突飞猛进地发展，中医药，包括针灸、推拿、气功在防治疾病方面的作用已被大量的实验所证实、重复，在此基础之上，中医的实验研究已深入到探讨不同组织基因转录、表达调控的层次上来。与此同时，以分子生物学技术支持的基因工程、生物工程在中药及其有效成分生产上显示出辉煌的前景。 一．中医药实验研究为什么要采用分子生物学技术 1．一些不同的认识 有人认为中医是宏观的，讲整体的，讲辨证的，讲阴阳平衡的。微观的分子生物学是没有办法来研究中医的，不能研究中医的。也有人担心采用现代技术研究中医，中医会被西医吃掉；或者认为中医的灵魂在临床。于是一些人对此技术格格不入，学不进去。 这里就有这样一些疑问，持这些观点的人是否真正了解中医药的发展历史，是否了解分子生物学及其技术，是否了解当今医学研究发展的现状？回答大多是否定的。 回顾历史，教训是很多的。中医药一度比较发达的解剖、麻醉、化学药物合成，这些有时早已丧失；宋以来的人痘人工免疫、明以来的疠气学说、当代的水蛭素等，优势已经或还在不断地丧失！医学存在客观上存在的竞争。面对这样的竞争，怎么办？此外，中医药还要不要发展、要不要创新，采用什么手段去发展和创新？ 一边是深深的忧患意识，一边却是动嘴不动手的妄加评判。我们不赞成这样的做法。 2．中医药实验研究采用分子生物学技术的必要性 40年来，中医现代化实验研究从无到有，经历了临床验证性研究，初步的机理研究，以及全方位展开的深入的机理研究和探索，包括采用先进的分子生物学技术，研究实现了与世界医学实验研究的接轨。在研究中大家逐渐认识到，加强分子生物学研究中医药是新时期中医药发展的迫切需要！这是因为： 1）振兴中医的重要机遇。分子生物学、细胞生物学以其实验条件便于控制、实验稳定、重复性好、实验周期短、仪器试剂（包括各类试剂盒）发展快，手段丰富、国际研究普遍（使新方法、新技术层出不穷）、研究积累快、参考文献丰富，可以观察人体的不同组织的细胞、分子（这又强于动物实验），给应用该方法技术研究创造了绝佳的条件；同时，业已进行的研究揭示和开拓出生命科学广大的未知领域。也由于分子生物学新兴、发展快，给国内外、中西医创造了同等的发展和应用的机会，再次使中、西医有可能站到同一起跑线上。抓住这个千载难逢的机会，充分利用它、驾御它，必将给中医学注入强大的生命。 2）保持中医药优势的需要。几千年来，中医在运用天然药物方面积累了丰富的经验。比如其中一些天然动植物药物的粗制品，比如水蛭素、蛇毒抗栓酶类粗制品已经作为我国的传统医药产业。但是当国外采用了分子生物学技术和生物工程，生产出水蛭素、类凝血酶素，既降低了成本，又提高了质量的稳定性。反销我国和国际市场，对我国传统医药产业形成了巨大竞争。有识之士开始呼吁不能坐视祖国医学优秀遗产的优势失去，主张抓紧采用分子生物学研究天然中药的有效成分，开发新药，不然势将失去优势。通过几十年的研究，中药所面临的问题已经暴露得十分清楚，比如中药材的质量稳定、占用耕地、有效成分和若干有效成分最佳组合的探索、有效成分得率需要提高，以及服用的安全、方便等均有赖于大量的中药学基础研究，而已有的研究表明，分子生物学是十分重要、有效的研究手段。中药的研究有赖于中医基础的研究，而不加强分子生物学技术对中医基础的研究，没有强大的基础研究的积累和支撑，药物的研究、开发将成为无本之木。 3）继承和发展中医基础理论的需要。中医药的作用发挥，脏腑病机的变化、不同治法（具体落实到中药复方及其有效成分，针灸、推拿等治疗方法）的作用环节和最终作用的发挥，均落实到人体基因转录与表达的调控。已有的研究表明，中医药的取效，往往是通过对基因的转录与表达调控实现的。甚至，一些基因缺失或突变所引起的疾病，中医药通过对其它有关基因的转录调控，进行补偿，达到治疗疾病的目的。深入研究对于阐明中医药的作用机制、阐明生命的调控原理，均具有重要的科学意义。作为对中医学优秀遗产的继承和发展，这部分的研究具有广阔的天地，是中医基础理论研究的重头。另一方面，还应该看到，证的临床研究局限性与困难日益明显。主要表现在限于种种困难，证治的动态演变观察研究难以深入；临床证治的干扰因素多且复杂，严重影响到证治疗效的观察、评估；由于受到实验室检查经费昂贵、病员顾虑，不予配合等因素的限制，临床病人证治的实验室检查、复查均有困难，观察难以完整，广种薄收；由于创伤性检查在在我国目前临床上难以展开，因此细胞水平、分子水平，尤其是细胞、分子的调控研究无法进行，致使研究深入不下去。而采用分子生物学、细胞生物学技术能在很大程度上弥补其不足。 3．分子生物学的发展历程 1871年，首次发现DNA（鲑精DNA）。 1943年，证明DNA为遗传分子，而不是蛋白（1944，O T Avery）。 1953年，DNA双螺旋模型提出（J D Watson（美）和F H C Crick（英），1962年或诺贝尔生理学、医学奖）。从而为分子生物学这一学科奠基。 1961年，合成mRNA，破译第一个遗传密码（M W Nirenberg（美），1968年获诺贝尔生理学、医学奖）。 1970年，分离出第一个限制性内切酶（W Arber（瑞士），1978年获诺贝尔医学奖）。 1976年，重组DNA成功（H Boyer（美）和S N Colen（美？），1981年获诺贝尔化学奖），强调其科学精神。 有人统计，自1957~1982的25年间，从事核酸研究而获得诺贝尔奖的有29位！ 1982年，美国一制药公司在2000升发酵液中提取出100克精制胰岛素！相当于从1600磅动物胰腺中的提取量。 后来居上的事例是，荷兰最早把分子生物学产品“猪牛痢疾疫苗”投放市场，比以上美国的胰岛素早半年！这对后来的中医基础研究很有启迪意义。 那么，如果学习的话，用在哪，如何用？ 二．分子生物学技术在中医药研究中的实例 但是，如何运用分子生物学方法技术来研究中医，如何把两者紧密结合起来，这些技术对中医学术发展有什么帮助，如何找到最佳的切入点，等等，诸如此类的问题、困惑还萦绕在许多中医工作者和学生的脑中。归结起来，如何用、怎样用的问题并没有得到普遍地解决。为此，我们先以中医药延缓衰老的理论和研究发展为例，看看分子生物学在中医研究中的应用。 早在《黄帝内经》时代，中医学对人体的衰老和防治已经积累了丰富的经验，并在理论上把衰老归结为五脏精气虚，最终导致肾气虚、天癸竭，生殖系统衰老而丧失生殖能力。此后，预防和延缓衰老主要从补五脏、补肾入手。但是补有不同的补法，各有家传不同、门户之异，就中药复方而言，仅补肾便有平补、温补、凉补、阴阳并补、填精等区别，还有滋阴泻火、温肾祛寒、数法兼用，等等。用药讲究君臣佐使、轻重缓急，即便同一治法，用药还会有很大的区别。发展到了唐宋，已经积累起大大小小、许许多多的延缓衰老的单方和复方，面对如此众多的处方，临床应该如何选择，有没有最好的？金元后期，朱丹溪提出阳常有余，阴常不足，治疗主张滋阴泻火，留有著名的大补阴丸。在明代李时珍《本草纲目》“黄柏”条下，也记载有长期服用单味黄柏以延缓衰老的论述。然而，明末的张介宾则极力反对，认为阳气是人体的大宝，不应该采用寒性药物大肆克伐，而力主温补。就这样，中医界寒温之争持续了几百年。几百年来，临床上有人禀承丹溪学说，也有人推衷景岳学说，没有定论。 当现代临床实验研究方法引入中医临床观察以后，发现同样是老年人，激素水平、神经递质水平存在显著差别，这些递质、激素在部分人群当中可以长期维持在一个较高的水平，而部分人群随着衰老则明显下降。其中，这些年大量实验研究所观察到的与寒证、热证有明显关系的儿茶酚胺类递质在老年人中波动就很大。我们采用动物实验研究中药二仙汤及其寒温两个拆方的作用机理时发现，温肾药对老年和去势大鼠下丘脑-垂体-性腺（去势动物观察肾上腺）轴兴奋作用突出，而滋阴泻火药对这些轴的延缓衰老和保护作用突出，部分揭示出寒、温治法的差别。联系到临床研究结果，显然，对那些激素、神经递质水平高、热象明显的老年人，补肾以偏重于滋阴泻火为妥；而对于那些激素、神经递质水平低、寒象明显的老年人，补肾以偏重于温肾壮阳为妥。这些中医基础理论研究丰富了中医学延缓衰老的理论和方法，对临床上延缓衰老的辨证论治起到了积极的指导作用。 生物医学研究表明，生殖的发生和衰老与下丘脑-垂体-性腺轴的发育成熟和衰老有关。在下丘脑水平，促性腺激素释放激素（GnRH）释放的一定数量和频率对于保持正常生殖能力是十分必要的。GnRH是由下丘脑位于弓状核和视前区的GnRH神经元所分泌。为了进一步了解二仙汤的作用机制，我们采用了分子生物学实验技术观察了二仙汤对老年大鼠下丘脑、垂体GnRH含量的变化。研究发现，24月龄老年大鼠下丘脑GnRH mRNA含量（Northern blot）较5月龄青年大鼠下降、垂体GnRH（下丘脑合成的GnRH通过垂体门脉系统直接释放到垂体）含量也下降；而经过二仙汤的治疗，同龄老年大鼠下丘脑GnRH mRNA含量、垂体GnRH含量较老年对照大鼠增加，表明二仙汤治疗更年期综合征取效的部分机制与该处方延缓下丘脑GnRH神经元的衰老，并增进其功能有关。上海第二医科大学进而采用细胞生物学的研究方法，发现与若干常用经典温肾中药复方相比，二仙汤能使GnRH细胞系GT1-7的GnRH分泌峰提前，并维持时间最长。这些研究采用了细胞生物学和分子生物学技术加深了我们对中药复方作用机制的认识。如果不借助分子生物学、细胞生物学的技术和方法，我们便难以高效、准确、深入地观察到中药复方作用的分子机制，也就无从开展更进一步的深入研究，并在此基础上发展和丰富中医药学。 医学和生命学科的研究探索是没有止境的。近十年来所采用的分子生物学技术研究表明，GnRH基因有3000bp左右的启动子，在这些启动子上一些区域在特定的细胞系中对于GnRH基因的高表达十分重要，被称之为增强子。GnRH细胞在胚胎初始由鼻小坑向下丘脑迁徙，并逐步分化成熟。研究发现来源于不同部位的GnRH细胞系，对GnRH的表达数量有着很大的区别，比如GT1-7（来源于发生在前脑的肿瘤，接近GnRH细胞迁徙的终点）可以高表达GnRH，而Gn10（来源于GnRH细胞迁徙途中的肿瘤）则GnRH表达甚微。鉴此，研究人员推测两个细胞系中调节GnRH基因启动子的核蛋白构成会有所不同，由于这些核蛋白的构成不同，导致两个细胞系GnRH表达的多寡。我们采用分子生物学足迹法（Footprint）技术发现，来源于GT1-7和Gn10两个细胞系的核蛋白在GnRH启动子，尤其是其增强子上结合的数量以及所结合的DNA序列确实有所异同，可以推测，这些不同的结合蛋白可能是调节GnRH表达数量多寡的重要蛋白，由此也提示两个细胞系中基因的表达有所差异。 我们采用另一项新近发展起来的DDPCR技术进一步研究证实，GT1-7和Gn10两个细胞系中确实有许多基因表达不同，有的是仅仅在其中一个细胞系中表达，而另一细胞系中阙如；大多基因在两个细胞系中表达的数量明显不同。在这些差异表达的基因中，有一个基因产物称之为Ark，仅仅在Gn10中表达，之前的研究表明Ark是一个跨膜蛋白，但是采用报道基因技术研究发现，一旦使Ark基因在GT1-7细胞中表达增加，便会明显地抑制GnRH基因的表达。该现象不但新观察到Ark的新功能，同时也提示同一基因产物在细胞中可能存在的多功能。我们进一步采用cDNA Array研究发现，有许多基因在GT1-7和Gn10两个GnRH细胞系中表达差异。其中哪些基因，或哪些基因组合对GnRH表达多寡会发生作用，目前尚不清楚，研究正在进行之中。这些研究已经是GnRH研究的国际前沿工作。 那么我们自然要问，中药复方和其它中医药治法，比如二仙汤是否对以上这些调节GnRH表达的基因产物发生影响，影响了哪些，是哪些中药有效部位或有效成分所起的作用，这些有效成分的量效关系如何，有没有最佳的组合，与已知西药的作用异同如何，等等。这样的研究势将把中医药延缓衰老的研究引向深入。 以上研究揭示出单一细胞内生物调控现象的混沌复杂，而位于组织和机体中的细胞还受到周边细胞、组织、其它系统的影响，因而变化就更复杂、更微妙，这就在细胞、分子水平印证了中医学的整体观、恒动观，丰富了中医学的整体观、恒动观。澳大利亚的一研究发现，刺激下丘脑某一特定核团可以促使GnRH的释放，但是随着研究的深入，发现不同实验动物，对相同的刺激反应表现却不同。这一结果令人联想到中医的体质学说和证的变化。延伸出去，这些变化，就有可能是体质、证在基因、细胞、组织层次的表现，而辨证论治有可能在改变这些环节而发生作用。 所以，中医延缓衰老的深入研究要求采用以上的这些分子生物学技术，推而广之，其他中医药领域的研究也要求采用以上这些分子生物学技术，在这些研究的基础上，结合临床有效中药复方的疗效优势，给予进一步干预研究，了解作用于那些基因、调整了那些蛋白产物，与已知中西药的作用异同，等等。如此，可以极大地提高研究的效率、研究的深度、研究的可靠性、研究的竞争性。这样的研究不仅将有利于进一步揭示中药复方的作用机制，丰富中医藏象学说、辨证论治理论、治则治法学说，以及中药新药的开发、中药产品的升级换代、加强中医药产业国际的竞争力，还将发现新的生命及其调控现象，拓展人类对生命学科的认识。因此，加大分子生物学方法技术在中医药研究中的应用，是新世纪发展中医学的重要途径。 三．中医药研究经常使用的分子生物学技术 综合目前中医药研究中常用的分子生物学技术，以及将有可能普遍涉及到的技术，主要包括以下内容： 1．中医药对基因组（DNA）作用的研究 人类基因组计划的人类基因测序工作已接近尾声。一些实验动物、植物，包括中药植物的测序工作正在展开，或计划展开。鉴于中医药研究中这方面开展的研究不多，主要包括基因组DNA提取、Southern blot（观察DNA的变化，方法大体接近以后我们要介绍的Northern blot）、PCR技术、点突变PCR（研究DNA的功能及其意义）、DNA测序等。 2．中医药对某个已知基因转录（mRNA）水平调整作用的研究 主要包括提取总RNA，做Northern blot或RTPCR。 以上实验涉及到多项分子生物学常用技术和方法，包括：重组质粒、转化宿主细菌、筛选阳性克隆、扩增细菌、从细菌中制备已扩增了的DNA、利用限制性内切酶切开重组插入的DNA片段和载体、电泳分离插入DNA片段和载体、回收插入并放大的DNA基因片段、标记探针，以及制备组织或细胞的RNA，RNA电泳、把RNA 转移到硝酸纤维素膜上（印迹转移）、固定，Northern杂交、放射自显影，等等。我们详细介绍和实验操作。 3．中医药对多个已知基因转录（mRNA）水平调整作用的研究 cDNA列阵（cDNA Array）和基因芯片（Micro Array）这些在九十年代迅速发展起来的技术效率最高。这些实验所提供的信息量大，一个实验，可以观察多至1万个以上的基因变化，给研究复杂的中医药调控机制和变化提供了强有力的武器。鉴于基因芯片研究目前还需要专门的仪器设备，在一般实验室内无法开展，所以我们在第四章中详细介绍cDNA Array技术。 4．中医药对广泛未知基因差异转录（mRNA）作用的研究 该实验主要采用DDPCR技术。相关的还有cDNA库建立、基因全序列cDNA库筛选，RACE PCR技术。 5．观察中医药对某一已知蛋白表达水平的调整作用：比较常用的方法是ELISA技术、免疫组化和Western blot等技术。还有单克隆抗体制备技术。 6．观察中医药对若干已知或未知蛋白表达水平的调整作用：蛋白双向电泳和蛋白芯片技术。 7．中医药对某基因转录调控的研究：包括Footprint技术、凝胶阻滞实验、报道基因技术、功能基因插入哺乳类细胞表达载体技术、基因转移技术，等等。 四．推荐的参考书籍 有关分子生物学方法技术的书籍有许多，以下一些书籍我们经常参考，因此推荐给读者。 方肇勤主编《分子生物学技术在中医药研究中的应用》，上海科学技术出版社，2002年6月，第1版 金冬雁等译《分子克隆实验指南》，科学技术出版社，1992年10月，第2版。 颜子颖等译《精编分子生物学实验指南》，科学技术出版社，1998年 6月，第1版 李永明等著《实用分子生物学方法手册》，科学技术出版社，1998年6月，第1版 五．分子生物学的主要技术和方法 1989年，美国冷泉港出版了《分子克隆实验指南》（第二版），该书比较全面地介绍了有关方法与技术，以下主要摘要介绍一些该著的基本概念与方法，另外再补充一些新近发展起来且使用较广的方法，具体内容可查阅参考文献所列举的原著或原作。由于分子生物学技术与方法发展十分迅速，日新月异，因此，我们建议在研究中应及时追踪最新的研究报道，以及各有关公司最新产品介绍。 6．8．1．1 载体 载体的使用目的： 1．重组基因，以便放大某一基因片段，用于探针、基因功能检测、报道基因研究等。方法是：把某一DNA片段插入到相应的载体（比如质粒、噬菌体、哺乳类细胞表达载体等），给予扩增，用以标记探针、测序、cDNA库建立、基因功能检测等多种分子生物学实验。因此重组质粒就成为中医药实验研究中最为常规的实验。 通常，扩增目的DNA主要借助两类方法，即PCR技术和载体重组技术，鉴于PCR技术受到酶的性能和方法学等多方面的限制，某些DNA和超过一定长度DNA的扩增会有困难，所以载体重组技术倍受青睐。 2．DDPCR产物的克隆和测序。 3．RACE PCR产物的克隆和测序。 4．构建基因库、cDNA库，等。 5．基因功能检测。 6．基因工程（包括基因治疗之类）。 以上一一介绍。 1）质粒。质粒是一类双链、闭环的DNA分子，长度为3kb左右，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造，使实验室常用质粒具备了以下几种特性：1）含有多克隆位点区域，可方便的插入目的DNA片段。2）对细菌的可转移性，即在实验中，可将质粒诱导入细菌。3）选择标记。常用的有抗生素抗性基因。这样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代，如此，便于鉴定质粒诱导入细菌成功与否。4）在细菌体内可获得较高的拷贝数，例如一种叫pUC的质粒，在单一细菌体中的拷贝数可达500-700个。因此质粒已成为分子生物学中应用最为广泛的载体。 2）λ噬菌体。λ噬菌体的基因组是一组长度约为50kb的双链DNA分子。在λ噬菌体颗粒内，该DNA为一双链分子，其末端为长12个核苷酸的互补单链(粘端)。当λ噬菌体进入宿主细胞后，其粘端通过碱基配对而结合，形成环状分子，相隔12bp有两个交错切口。宿主体内的DNA连接酶很快将切口封闭而形成闭环DNA分子，该DNA分子在感染早期充当转录模板。实验用λ噬菌体，在其DNA的中部有一可取代区，含多克隆位点，供插入DNA之用。λ噬菌体较质粒的优点在于可插入较大的DNA片段，如有的λ噬菌体可插入长达20000bp的外源性DNA。 此外还有粘粒载体、单链丝状噬菌体等等。 6．8．1．2 分子克隆常用酶 1．限制性内切酶（限制酶）。限制酶能特异性地结合于一段该酶能识别的特殊DNA序列之上或这一DNA附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。切割结果可产生两类末端： 1）粘端。许多限制酶在二重对称轴的5′侧切割底物DNA的每条链，则双链DNA交错割开，产生带突出的粘端的DNA片段。例如，PstI识别双链DNA的这样一段序列并切割如下： ↓ 5’N N N N N C T G C A G N N N N N3’ 3’N N N N N G A C G T C N N N N N5’ 切割后产生两片段： ↑ 5’N N N N N C T G C A pG N N N N N3’ 3’N N N N N Gp A C G T C N N N N N5’ 这类限制酶主要有：BamH I、BglⅡ、EcoR I、Hind Ⅲ、Kpn I、Pst I等等。 2）平端。有些限制酶在二重对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生带平端的DNA片段。例如：HaeⅢ识别双链DNA的这样一段序列，并切割如下： ↓ 5’N N N N N N G G C C N N N N N N3’ 3’N N N N N N C C G G N N N N N N5’ ↑ 切割后产生平端的片段： 5’N N N N N N G G pC C N N N N N N3’ 3’N N N N N N C Cp G G N N N N N N5’ 这类限制酶主要有：HaeⅢ、Mst I、Sca I、Sma I等等。 目的在于方便地剪贴DNA。 2．DNA聚合酶。DNA聚合酶主要用于催化DNA 体外合成反应。这些酶作用时大多需要模板，合成产物的序列与模板互补。最常用DNA聚合酶有PCR用的Taq酶、大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）和大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）等。 3．连接酶。连接酶用于将两段DNA拼接起来，最常用的是T4噬菌体连接酶。 4．脱氧核糖核酸酶I。DNA酶I为内切核酸酶。它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA 。产物为5′端带磷酸基团的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。在Mg2+存在下，DNA酶I可独立地存在于每条DNA链且切割位点随机分布。 5．反转录酶。这类酶可以将RNA作为模板合成互补DNA链。 6．8．1．3 重组载体（目的同前面在载体中所介绍的） 有了载体、酶和DNA片段，便可以重组载体。采用某限制酶切割开载体，用DNA连接酶将载体DNA片段与拟插入的目的DNA片段重新连接成一个环状的DNA分子。连接时，插入片段的平端与载体的平端对接，插入片段的粘端与载体的粘端对接，两个粘端的序列互补。实现载体重组。然后转化特定的大肠杆菌，转化成功的大肠杆菌可以在载体所含抗生素抗性基因相应的抗生素培养皿中传代，形成菌落。可以采用原位杂交或扩增阳性单菌落，小量制备DNA，限制酶酶切鉴定重组成功与否。取成功者用于各有关实验。 6．8．1．4 DNA的凝胶电泳 为了鉴别或分离分子量不同大小的DAN或RNA片段，最常用的方法就是凝胶电泳。常用的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。前者作水平电泳，可分离200bp-50kb的DNA，在溴乙锭染色下，可清晰地辨别少至50ng的DNA，甚至1-10ngDNA也能辨别得出来，分子生物学中常用此分离和鉴定RNA和DNA；后者作垂直电泳，多用于分离5-500bp的DNA，精密到可以分离开仅差一个核苷酸的DNA，所以常用来测序、DDPCR、Footprint等，分离蛋白也常用此胶。 6．8．1．5 真核细胞RNA的制备 目的： 1．了解某一特定组织或细胞某一特定mRNA转录量的变化，如RT-PCR、Northern blot等。 2．了解某一特定组织或细胞全部mRNA转录量的变化，如DD-PCR、基因芯片等。 3．获得某一特定组织或细胞全部mRNA，以便建立cDNA库等。 4．获得某一特定组织或细胞全部RNA，作其他用途。 真核细胞RNA的制备方法有多种，还有许多种商品试剂盒出售，性能稳定，重复性好。实验室比较常用的是制备总RNA一步法。该方法操作简便，一次可以分离大量的RNA，原理是采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍等，抑制RNA的降解，并使RNA与蛋白质分离进入溶液，离心后，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相，之后被异丙醇沉淀。提取的RNA可用于Northern blot和过Oligo dT柱。后者用于分离mRNA。 6．8．1．6 Northern blot 目的： 1）定量分析某一特定基因mRNA的转录与否，以及转录的水平。 2）比较两个或两个以上不同组织某一已知基因转录的差异。 3）比较两个或两个以上不同组织某一未知基因转录的差异。 Northern blot 是RNA的印迹杂交，是常用的分析RNA的方法。近似的还有RNA的斑点杂交和狭缝杂交。此外还有DNA的印迹杂交（Southern blot），蛋白的印迹杂交（Western blot），分别用以分析DNA和蛋白，这些都是分子生物学常用的杂交方法。 Northern blot有这样一些用途：1．大致鉴定某一已知基因是否有所转录，有则可见杂交带；2．比较两个或两个以上不同组织某一基因转录量的差异；3．通过光密度扫描，对某一基因转录的情况作定量分析。在中医药实验中通常以此来判别某一中医药方法对某一基因转录的调控作用。方法是采用琼脂糖凝胶电泳，使RNA分子由小到大排列于凝胶之中。应用虹吸原理，将RNA转移至硝酸纤维素膜上，烘干，使RNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上。与放射性标记的探针杂交，杂交后，洗去未被杂交上的探针和游离的同位素，放射自显影，使胶片上出现对应于相应分子量的数量不等的mRNA的条带。 6．8．1．7 标记DNA或RNA探针 目的：满足分子杂交需要。 分子杂交需要探针。把已知DNA或RNA作为模板，用一些特定的方法把一些易于检测的化学物质标记到合成的另一条核酸链上，以便检测之用，称之为标记探针。通过杂交，使探针与被检测的样本DNA或RNA结合，使痕量的DNA或RNA得以显示出来。虽然近年来发展出一些非放射性标记方法，但常用的仍是放射性标记法。因为该方法灵敏度高，通过放射性自显影可以显示出极其微量的DNA或RNA。由于RNA易被到处存在的RNA酶降解，实验难度大，而标记的DNA探针可用于DNA或RNA杂交，因此标记DNA探针更为常用。 6．8．1．8 cDNA文库构建 目的：以便获得某一细胞或组织完整的cDNA序列。 把目的细胞所有的带聚腺苷酸的mRNA[poly（A）+mRNA]经酶促反应转变为双链DNA，进而将此DNA导入原核载体，扩增，回收扩增了的DNA，这一工作称之为构建cDNA文库。构建文库对RNA质量要求高，既要保证不污染，又要保证mRNA的完整性。构建的文库主要用于识别或分离某一或若干特定的cDNA全部序列。目前若干公司已发展出构建cDNA文库的不同试剂盒，方便、可靠，可以在一二周内构建一个cDNA文库。 6．8．1．9 真核细胞DNA的提取 目的：目前主要为基因组测序，了解不同生物的详细的基因情况，意义十分重大。前面介绍过，最早纯化的是鲑精DNA。 提取真核细胞DNA有不同的方法，通常在含有EDTA和SDS一类去污剂的溶液中，用蛋白酶K消化细胞，再用酚抽提得到高分子量（100-150kb）的DNA。适用于Southern blot分析和构建DNA文库。 6．8．1．10 DNA文库构建 目的：保留完整的某一样本的全部基因，以便于放大、测序。 对所提取的DNA用一至多种限制酶消化（基因组DNA分子量太大，难以建库），使消化后的DNA片段在一定的长度内，适合所用的载体。载体多用λ噬菌体。重组载体及随后的工作与cDNA文库建立方法相似。 6．8．1．11 Southern blot 目的：分析基因的变化，比如基因的缺失等。 Southern blot 是DNA的印迹杂交，是常用的分析DNA的方法。方法是用一种或多种限制酶消化DNA，琼脂糖凝胶电泳把大小不等的DNA分开，应用虹吸原理，将DNA转移至硝酸纤维素膜上，烘干，使DNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上。与放射性标记的探针杂交，杂交后，洗去未被杂交上的探针和游离的同位素，放射自显影，使胶片上出现对应于相应分子量的数量不等的DNA的条带。 Southern blot主要用于基因组DNA特定序列定位。 6．8．1．12 DNA的测序 目的：了解目的基因的序列。 DNA的测序有多种方法，近几年开发出了不同的自动测序仪，测序速度快和准确，但试剂，尤其是设备十分昂贵，如果不是有大量的测序工作，可以采用双脱氧链终止法测序。该方法是应用较多的测序方法，有现成的试剂盒供应。其原理是采用了2’,3’ddNTP，在3’位置上缺少一个羟基，当这些ddNTP掺入到正在延长的DNA链上，由于缺乏3'羟基，后继的dNTP不能与之形成磷酸二酯键，从而使DNA链终止延伸。于是，在DNA合成反应混合物的4种dNTP中加入少量的一种ddNTP，将得到一系列不同长度的核苷酸链，其长度取决于引物末端到过早出现链终止位置之间的距离。在四组独立的反应体系中，加入4种不同的ddNTP（和一种经标记的dNTP），结果将产生4组长度不均的寡核苷酸，分别终止于模板链的每一个A、C、G或T的位置上。然后采用能分辩长度仅差一个核苷酸的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，把四组反应液加样于凝胶顶部若干相邻的泳道上，电泳分离之后，从凝胶的放射自显影片上可直接读出DNA上的核苷酸序列。 6．8．1．13 PCR、DDPCR和RT-PCR PCR是Polymerase chain reaction的缩写，译作聚合酶链式反应。其特点是可以在几小时内方便、快捷地将微量DNA（含由RNA反转录成的微量DNA）扩增达106 倍，得到ug级的DNA！该技术发明于八十年代中期，到了八十年代末，由于引用了耐热DNA聚合酶，使这一技术得以蓬勃发展，成为分子生物学中应用最为广泛的技术之一，发挥着日益重要的作用。 DDPCR技术是九十年代以来，建立在PCR技术之上发展起来的新技术。DDPCR是Differential display PCR的缩写，有人译作“差异展示PCR”或作“异呈PCR”。这一技术主要用于快速呈现两个或两个以上细胞系或组织基因转录的差异，并快速扩增那些不同转录的基因片段。 PCR的原理是选用两段引物，分别与拟扩增的模板DNA两条链上各一段序列互补，且分别位于模板DNA中拟扩增DNA片段两条链的3'端。加热使模板DNA变性，降温时，两段引物分别与靶序列发生退火，然后两引物在DNA聚合酶的作用下延伸。在摩尔数大大过量的两段引物和4种dNTP的反应体中，位于两段引物间的DNA在反复变性、退火、延伸的循环里，每一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，使其产物增加一倍。经过30-40个循环，目的DNA可由原来的1pg扩增到1ug。 DDPCR的原理是取无DNA污染的总RNA，分别加入三个锚引物，H-T11 -C、H-T11 -G和H-T11 -A，三个引物的11个T（胸苷）选择性地结合到mRNA的A（腺苷）尾上，在反转录酶的作用下，将所有的mRNA反转录成cDNA。再以这一含cDNA的反应液为模板，分别加入以上三个锚引物，和若干随机引物，如AAGCTTGATTGCC，AAGCTTCGACTGT等，PCR放大位于某一特定锚引物与随机引物相应序列的所有cDNA，反应体中加入α[33P]dATP或α[35S]dATP。把两个或两个以上细胞系或组织锚引物与随机引物相一致的PCR产物相邻上样于变性测序凝胶上，电泳，放射自显影，曝光。两个或两个以上细胞系或组织相同mRNA所反转录的cDNA在X片上会出现并列的显影条带，而不同mRNA所反转录的cDNA会出现独特的显影条带。 目前RT-PCR（反转录PCR）技术使用得十分频繁，在判断、比较不同组别某一mRNA转录与否或转录多少等方面十分便捷，与Northern blot相比，程序简单、快，但灵敏度差些，重复性亦差些，对mRNA提取质量要求高。其原理是先用寡聚胸苷作为引物，反转录所有mRNA成cDNA，再用拟扩增片段两端的两段引物，PCR扩增该段cDNA。为校正样本RNA含量组间可能存在的误差，通常在同一试管内一并扩增β肌动蛋白的cDNA。上样电泳，并染色后，拍照，激光光密度计扫描定量，用β肌动蛋白校正拟扩增的基因片段灰度值，统计分析。此外，还有原位PCR等等由PCR演变而来的技术。 6．8．1．14 DNA的定点诱变 目的：主要在于观察定点诱变后DNA表达蛋白的结构与功能的变化。 采用酶和化学试剂切割DNA，或合成含有缺失或插入的引物，PCR放大，再通过连接、转化等手段，造成目的DNA的缺失或插入。 6．8．1．15 克隆化基因在大肠杆菌和哺乳动物培养细胞中表达 将目的基因重组入相应的，分别可以在原核或真核细胞中进行表达的载体，采用物理或化学方法将重组后的载体导入真核或原核细胞，使目的基因得以表达出所需的蛋白，用以研究或作为产业生产。 6．8．1．16 克隆化基因所表达蛋白质的检测和分析 此项实验包括两个部分。其一，单克隆抗体的制备和纯化，即分离出6.8.1.15介绍表达出的蛋白，例如采用电泳分离方法，以此蛋白作为抗原,激发兔免疫系统产生单抗，再予以纯化。其二，应用此抗体检测靶组织相应蛋白（抗原）是否存在，及其含量。这类方法主要包括免疫沉淀法、固相放射免疫测定（RIA）法和固定化蛋白质的免疫学测定（Western blot法）。 其他比较热门的技术： 1．基因类 （1）cDNA Array 和 Micro Array （2）基因全序列cDNA库筛选 （3）RACE PCR 2．蛋白类 （1）Western blot （2）ELISA （3）免疫组织化学 （4）单克隆抗体制备技术 （5）双向等电聚焦凝胶电泳 （6）蛋白芯片技术 3．基因功能类 （1）报道基因 （2）基因功能检测 （3）Footprint （4）凝胶阻滞分析 六．用分子生物学方法研究中医的现状 6．8．2．1 分子生物学技术在中医基础理论研究中的应用 肾本质的研究。中医基础理论认为“肾为先天之本”、“肾藏精”、“肾主生长发育”，肾在人体生命过程中起着极其重要的作用，因此有人把分子生物学技术引入到肾的本质研究中。 沈自尹等用RT-PCR技术发现肾阳虚证与下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素释放激素（CRF）的mRNA转录受抑有关，从而将肾阳虚证定位到下丘脑。这一点似与肾为人体各脏器的调节中心有所契合。 可以展开讨论： 1）这样的结论合理与否，合理的部分和依据，不合理的部分和依据 2）如果你将进一步研究，计划如何着手？ 6．8．2．2 分子生物学技术在中医临床上的应用（以下依据教材上介绍） 6．8．2．3 分子生物学技术在针灸研究中的应用 6．8．2．4 分子生物技术在方药研究中的应用 6．8．3用分子生物学方法研究中医的范例 6．8．4 展望 还是在几年前的九十年代初，在申报国家自然科学基金中医药实验研究的项目申请书中还很少见到采用分子生物学技术，仅仅若干年后，几乎每一份标书中均计划采用分子生物学技术，而且有些技术是国外九十年代中期才发展成熟起来的最新技术。这标志着中医药研究的门户开放，标志着中医药研究水平的迅速上升，也还标志着中医药研究跨入了当今世界医学研究的主流。可以预计，分子生物学技术在中医实验研究中将扮演愈来愈重要的作用。 传统的、经典的研究方法已满足不了实验中医学认识生命现象的需要，中医药对基因转录、表达的调控作用已一再被实验所验证，进一步的研究必将深入到中医药对某些目的基因启动子的调控、某些核酸的剪切和某些蛋白的修饰等层次上。中医实验将不断吸收最新的研究方法、最新的研究技术。 由于中药复方和其它中医治法往往具有多靶点、多层次、多系统作用的特征，在缺乏强有力的多手段的实验支持下，采用单一技术，哪怕是十分先进的技术，诸如本章所介绍的分子生物学技术，亦将难以揭示出中医治法的作用机制，难以揭示出复杂的生命调控现象。因此，实验研究要讲究循序渐进，讲究积累，讲究指标的合理配置，要避免盲目跟风，贪图指标的先进，在缺乏可靠的前期实验基础的情况下，择取一二个先进的分子生物学指标，仓促实验，结果往往事倍功半，说明不了问题。这是中医药实验研究的大忌，应予避免。