上海中医药大学《实验中医学》教案（7） 课程名称 实验中医学（理论部分） 总学时数 36 专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤 内容 实验中医学常用的实验研究方法及其在中医研究中的应用 时数 16  本次课目的要求 1．掌握不同学科实验研究方法的特点和优势。 2．掌握如何根据实验研究的要求选择实验研究方法（包括一种或几种方法）。 3．了解各学科的主要实验研究方法。 4．了解各学科实验研究方法在中医药研究中的应用。 5．了解了解各学科研究中医药学的现状。  本次课的重点难点 第一节 解剖学方法及其在中医研究中的应用 1．大体解剖学的主要方法。 2．大体解剖学方法研究中医的现状。 第二节 组织学方法及其在中医研究中的应用 1．组织学的主要研究方法。 2．组织学方法研究中医的现状。 第三节 电镜技术及其在中医研究中的应用 1．电子显微镜及电子显微术概况。 2．电子显微术研究中医的现状。 第四节 生物化学方法及其在中医研究中的应用 1．生物化学的主要方法。 2．生物化学方法研究中医的现状。 第五节 生理学方法及其在中医研究中的应用 1．生理学的主要方法。 2．生理学方法研究中医的现状。 第六节 免疫学方法及其在中医研究中的应用 1．免疫学的主要方法。 2．用免疫学方法研究中医的现状。 第七节 核医学方法及其在中医研究中的应用 1．核医学的主要研究方法。 2．用核医学方法研究中医的现状。 第八节 分子生物学方法及其在中医研究中的应用 1．分子生物学的主要技术和方法。 2．用分子生物学方法研究中医的现状。  本次课的应用教具  多媒体设备。   第七节 核医学方法及其 在中医研究中的应用 （2学时） 核医学是研究核素、核射线及其在医学领域中应用的学科。 根据核医学的研究内容、研究手段和研究对象的不同，又可以将核医学分为：临床核医学、实验核医学（又称基础核医学）和分子核医学三个大类。临床核医学主要是应用核素、核射线和核仪器对病人进行诊断和治疗；基础核医学是应用核素、核射线和核仪器进行医学基础理论和药物作用机理研究；而分子核医学根据核素的“分子”示踪原理，从细胞结构、生物化学反应及代谢等方面，在分子生物学、分子遗传学等分子医学水平上，揭示疾病的病因、病机、治疗及疗效和机理。临床核医学、实验核医学、分子核医学之间虽然有差异，但是，他们的共同点都是以原子核物理为基础。为此，他们相互依存、相互渗透，共同构成了核医学的整体。在中医的临床和基础研究中最早引用，并在实际中广泛应用的是实验核医学和分子核医学。 由于微电子技术、分子生物学技术、基因工程和结构生物学等高新科学技术的发展，电子计算机、单克隆抗体等的出现，核仪器和试剂等有关核医学技术和方法迅速更新。核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）、正电子发射计算机断层（Positron Emission Computed Tomegraphy，PECT）、放射免疫显影（Radioimmune Image，RII）、放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）、免疫放射分析（Immunoradiometric Assay，IRMA）等新仪器、新技术和新方法的建立和发展，使核医学对疾病早期诊断、早期治疗的优点更加突出。核医学在分子水平、基因水平上对疾病的诊断和治疗，使诊断更加迅速、灵敏和准确，使治疗更加有效，使基础医学研究如虎添翼。 6．7．1核医学的主要研究方法 目前核医学应用和研究的范畴主要有临床核医学、实验核医学和分子核医学三个方面。限于篇幅，本章重点介绍中医基础理论和临床研究中经常使用的实验核医学和分子核医学的主要方法及其原理。 6．7．1．1实验核医学 在中医临床和基础理论研究中，经常使用的核医学方法有：放射免疫分析（RIA）、免疫放射分析（IRMA）、受体放射性配基结合分析（Receptor Radio-ligand Banding Assay, RRLBA）、放射自显影（Autoradiography, ARG）、同位素视踪（Isotopic, IT）等技术，以及以IT为原理而建立的同位素渗入法测定细胞免疫功能等各种方法。这里重点介绍RIA、IRMA 和RRLBA的基本原理。 1．放射免疫分析的基本原理 RIA属于竞争免疫分析法，也称“标记分析物”技术（Ekins,1987）。其原理是：放射性标记抗原与非标记抗原同时竞争抗体上的有限位点，然后将结合与未结合的游离抗原分离，用液体闪烁仪或γ-计数仪测定其放射性分布，绘制标准曲线，从标准曲线中计算待测样本的含量。RIA的基本原理通常可以用以下公式表示： Ag*+Ab ? Ag*-Ab （1） + Ag ? Ag-Ab 式（1）中Ag*为标记抗原，Ab为特异性抗体，Ag*-Ab为标记抗原和特异性抗体结合的复合物，Ag是非标记抗原，可以是标准品，也可以是与标准品相似的被测物。在RIA反应体系中抗体的结合位点是有限的，Ag*与Ag和Ab的结合能力是相同的。Ag*与Ab的结合与Ag的含量密切相关，遵守化学反应中的质量作用定律。也就是说，随着Ag量的增加，Ag-Ab结合增加，Ag*-Ab结合必然减少。Ekins等人建立了RIA的数学模式，推导出RIA的反应式： K1 Ag+Ab ? AgAb （2） K-1 式（2）中K1为结合速率常数，K-1为解离速率常数。当反应达到平衡时， K=K1/K-1=(AgAb)/(Ag)(Ab) （3） 式（3）中K为亲和常数，将式（2）代入式（3）中，推导出： b/f=(AgAb)/(Ag)=K(Ab) （4） b/f=K(AbT-B) （5） 式（4）中b/f为结合抗原与游离抗原的比率，式（5）中AbT=Ab+AgAb，为抗体的总浓度，AgT=Ag+AgAb（式5中未见，原稿同），为抗原的总浓度，B为结合的抗原浓度。从式（5）中导出：b/f与结合抗原B的浓度之间存在线性关系。若以抗原浓度为横坐标，以b/f或抗原结合率为纵坐标即可绘制RIA的标准曲线。现在出售的液体闪烁仪和γ-计数仪都带有RIA的各种计算软件，即可以由计算机绘制标准曲线，并直接给出样本的数据。 2．免疫放射分析法基本原理 IRMA与RIA的基本原理相似，其不同之处是RIA是用同位素标记抗原，而IRMA是标记抗体。尤其是单克隆抗体的出现，使IRMA迅速发展。由于标记的抗体可以与固体支持物以物理方法结合，使IRMA在分离结合与游离的抗原抗体复合物时变得简单、快速、准确，提高了工作效率和测量结果的精密度。 3．受体放射性配基结合分析的基本原理 受体是细胞膜或细胞内一些能与生物活性分子，如神经递质、激素、蛋白质抗原以及药物或毒素等相互作用的大分子。它们是一类具有结合和识别能力、信号传导能力并产生生物效应的多肽或蛋白质。受体的概念早在1878年Langkey就提出了。但是，直到20世纪30年代，Clark研究乙酰胆碱对蛙心的作用，发现了剂量-效应曲线，才初步确定了受体反应的基本原理。其反应方程式如下： K1 R+L? RL （6） K-1 式（6）中R代表受体分子，是Receptor的缩写。L代表与R结合的配基，是Ligand的缩写。K1是结合速度常数，K-1是解离速度常数。当反应达到平衡时， K=K1/K-1=(RL)/(R)(L) （7） 式（7）中K为亲和常数，表示受体与配基的结合，与RIA一样，也遵守质量作用规律。因为受体的数目是有限的，可以被非放射性配基所饱和，因此在一定范围内，受体的数目可以由其与放射性配基的结合量计算出。 由于受体的放射性配基大多是氚标记物，因此，常用液体闪烁仪测量其放射性分布。新的液体闪烁仪都带有各种受体放射性配基结合分析的软件，可以由计算机直接给出数据。如果测定每个样本的饱和曲线，可以计算出该受体的结和容量（Rt）。当样本量少，可用单点法测量样本的Rt值。受体的单点测量公式如下： Rt=（样本管平均cpm-NSB管平均cpm )/(仪器测量效率%×配基比活度×样本蛋白质含量×样本反应体积) （8） 单位以fmol/mg蛋白表示。 式（8）中cpm为放射性配基每分钟脉冲数；NSB为非特异性结合管；配基比活度可以从所购放射性配基说明书中查出；仪器测量效率由标准品测量参数给出；蛋白质含量是样本工作液的实际蛋白质含量，可按常用生化方法测量；反应体积是指反应样本管的总体积。Rt值一般以fmol/mg蛋白表示。 4．标记免疫分析进展 RIA和RRLBA所用的标记物是同位素，所用的结合物是抗体和受体。由于同位素标记物对环境造成的污染不容忽视，促使科技工作者寻找其灵敏度可与同位素标记物媲美，而又不造成或减少环境污染的标记物。在这期间科学家使用酶标记技术、荧光标记技术及荧光偏振等标记技术。这些标记技术在用于标记免疫分析时，大大减少了放射性核素对环境的污染。但是，因为测量的灵敏度和稳定性较RIA、RRLBA差，以及许多生物活性物质还不能用酶标记及荧光标记技术测量，又给科学家提出了寻找新标记技术的课题。1976年Schroeder用化学发光标记技术建立了竞争性蛋白结合法测定生物素后，次年他和Halman又分别用化学发光免疫分析测定了甲状腺素（T4）。此后，化学发光免疫分析迅速发展。尤其是利用蛋白质工程及基因工程生产出单克隆抗体和抗体结合片段后，使化学发光免疫分析扩大到分析小分子抗原，尤其是甾体激素测定的所有样本。化学发光免疫分析技术体现了灵敏度高、稳定性好、重复性佳等优点，又增加了样本测量的全自动化进程。由于操作简单、样本用量少、测量速度快等优点，很受临床研究及临床检验单位的欢迎。 化学发光免疫分析可分为竞争性和非竞争性发光免疫分析，它们的原理可用以下公式表示： Ag+Ag-L+Ab? Ag-Ab+Ag-Ab-L （9） 式（9）中Ag代表抗原，Ab代表抗体，而Ag-Ab为抗原抗体复合物，Ag-L为发光物质标记的抗原，L为发光物质，Ag-Ab-L为抗原抗体发光物质的复合物。 非竞争性化学发光免疫分析原理： sp-Ab+Ag?sp-Ab-Ag （10） sp-Ab-Ag+Ab-L?sp-Ab-Ag-L （11） 式（10）和（11）中，sp为固相载体，sp-Ab代表将Ab与固相载体偶联，sp-Ab-Ag代表抗原抗体结合后仍与固相载体偶联，而Ab-L为发光物质标记的抗体，sp-Ab-Ag-L 为抗原抗体与发光物质复合物与固相载体偶联。 6．7．1．2分子核医学 分子核医学领域中最重要的技术是核素的示踪技术，它是分子核医学在医学、生物学中应用的最基本方法之一。在此基础上建立起来的核酸分子杂交、基因探针及基因诊断在临床及基础研究中得到广泛应用。 6．7．2用核医学方法研究中医药的现状 6．7．2．1中医、中药基础理论中应用 1．肾藏精的研究 《素问，上古天真论》说，肾者，受五脏六腑之精而藏之。肾所藏之精与人体的生长、发育、衰老密切相关。肾精既禀受于父母的先天之精，又有赖于后天之精，来源于饮食水谷之精微的充养。因此，肾精既与父母的遗传基因有关，又受到生活习惯和饮食的影响。依据肾精的主要生理功能，核医学主要采用RIA技术，检测了雌二醇(E2)、睾丸酮（T）、雌三醇（E3）、双氢睾酮（DHT）等性激素，促卵泡激素(FSH?)、促黄体生成素（LH）、促绒毛膜素（HCG）等促性腺激素、甲状腺激素(T3、T4、rT3、rT4、FT3和FT4)、促甲状腺激素(TSH)和肾上腺激素（皮质醇、皮质酮）以及促肾上腺激素(ACTH)等。观察到随着增龄，肾精亏虚，许多内分泌激素会发生紊乱。例如：随增龄引起的性功能减退，在男性主要表现在T含量明显下降，E2明显上升；在女性E2明显下降，T明显上升。最终改变E2/T比值，产生性腺和促性腺功能紊乱。可喜的是，许多补肾、益气中药都可以通过影响E2和T的分泌，及至涉及到促性腺激素的分泌，纠正性腺激素、促性腺激素分泌紊乱，产生延缓衰老的作用。 2．肾开窍于耳的研究 曾兆麟等观察到：醛固酮对提高听力有明显作用。醛固酮是肾上腺皮质分泌的理盐激素，何以提高听力？根据药理理论，药物产生药理作用，其中一个重要原因是被该药作用的靶器官或靶组织内具有该药的受体。因此，欲弄清醛固酮的作用，必须了解醛固酮能否透过血耳屏障到达耳蜗的内淋巴和与听力密切相关的血管纹细胞。为此，项目组采用同位素示踪技术，用氚标记醛固酮，分别在静脉注入3H-醛固酮后的5min.、10min.、15min.、30min.、1hour、2hour……到24hour，处死动物，取耳蜗内淋巴和血管纹细胞，检测发现，3H-醛固酮于用药5min.即进入耳蜗内淋巴和血管纹细胞。内淋巴与血管纹细胞放射性强度于15min.达峰值。初步证实，肾上腺皮质分泌的醛固酮是肾和耳之间联系的物质，这一研究为“肾开窍于耳”提供了实验依据。鉴于利尿酸有引起耳聋的副作用，莫启忠等的进一步实验证明醛固酮和利尿酸在耳蜗的血管纹细胞上有共同的受体。 3．冰片、麝香芳香开窍机理研究 “芳香开窍”指一类有芳香味的中药，流窜性很强，可以用来治疗惊风癫痫、中风等病的猝然昏厥症候，或治疗由热病引发起的神志昏迷等内闭证。莫启忠等的研究表明，冰片和麝香酮经不同给药途径给药后，经血或淋巴循环很快分布到全身各个组织器官，并迅速透过血脑屏障，在2min.-5min.内即可到达大脑皮层，这是冰片和麝香酮能醒脑的物质基础。经过72小时后，冰片和麝香酮在机体绝大多数组织细胞和器官内已消失，但是，在呼吸中枢所在的延脑中的蓄积量仍相当高，这为“芳香开窍 ”提供了实验依据。 6．7．2．2中医中药防治疾病机理研究 核医学方法在中医、中药防病、治病机理研究方面起了很大的作用。尤其是从细胞水平、分子水平阐明中药的药理作用，显示出独特的优越性。现举例如下： 1．在中医药生殖系统疾病研究中的应用 周俊等在探讨软坚散结、化瘀消肿中药治疗子宫肌瘤；以及活血化瘀中药治疗子宫内膜异位症等疾病时，采用RIA、RRLBA法测定了中药对血清中E2、T、DHT及孕酮(P)等性激素含量，以及血清中FSH、LH和HCG等促性腺激素含量，并测定了子宫肌瘤（开刀病人的肌瘤组织）、子宫内膜中的E2受体、DHT受体，证明中药能通过纠正性激素紊乱，调节子宫肌瘤组织和子宫内膜细胞膜和细胞核中的E2和DHT等受体数量，产生明显的治疗作用。在这些研究中揭示出：P分泌的紊乱是患子宫肌瘤的主要原因之一。 2．在中医药防治肿瘤疾病中的应用 中药治疗肿瘤的疗效已被公认，尤其是晚期癌症患者或手术后的恢复以及放疗和化疗后的病人，中药对延长病人生命，减轻痛苦，改善体质，提高白细胞计数，增强免疫功能等，都有显著的疗效。为探讨中药治疗肿瘤的机理，已广泛采用同位素掺入法，测定淋巴细胞转化、自然杀伤细胞(NK)等细胞免疫功能；用RIA测定肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-2或白细胞介素-6（IL-2或IL-6）等细胞因子含量；用RRLBA测定肿瘤组织中受体功能。从中药对免疫功能、对内分泌系统的影响，观察到中药可以提高免疫功能，纠正内分泌的紊乱，改善患者的内环境，增强抗肿瘤的能力。 3．在中医药治疗呼吸系统疾病中的应用 呼吸系统的疾病除肺癌、肺结核、肺气肿、肺积水等外，由呼吸道感染引起的老年性慢性支气管炎、成年人和儿童的哮喘病也是常见病和多发病。用扶正固本类中药治疗肺癌、用补肾益气类中药治疗老慢支或哮喘病，都取得了较好疗效。鉴于呼吸系统的疾病与呼吸时肺支气管的通气功能有关，而支气管的扩张和收缩又与肺组织中环-磷酸腺苷（cAMP）和环-磷酸鸟苷（cGMP）含量及cAMP/cGMP的比值密切相关，为探讨中药治疗呼吸系统疾病的机理，已广泛采用RIA方法观察血浆、肺组织和支气管内cAMP、cGMP含量，计算cAMP/cGMP比值，探讨中药药理机制。RRLBA测定肺组织中β受体的Rt值，在中药药理研究中也已引起重视。 此外，核技术方法在探讨中医、中药治疗内分泌疾病、心脑血管疾病、高脂血症及抗衰老等方面都有较好疗效。近年来随着RIA技术的普及，受体分析方法的建立、基因探针的合成和标记技术的完善，逐步揭示出中药防病、治疗的机理。 6．7．3用核医学方法研究中医的范例 二十一世纪是脑的世纪。在医学领域，随着世界人口老龄化加速，老年痴呆（AD）发病率急剧上升。我国北京、上海等大城市及江苏、山东等省已经进入了老年社会，60岁以上老人占总人口的8-10%，AD的发病率也迅速增加。因此，我国政府将心脑血管病、AD列入重点研究范围，希望能从中药、中医的防病、治病宝库中筛选出防治AD的新中药。 上海中医药大学的宫斌、莫启忠等在对中、西医文献的调查基础上，开展了中医药防治AD机理的研究（国家自然科学基金资助项目，项目批准号：39170876）。 6．7．3．1老年痴呆症的文献调研 1．中医文献的调研 中医文献中没有AD的记载，但是，中医对肾虚、健忘的丰富描述与AD有许多相似之处。指出：健忘是脑力衰弱，记忆力减退，遇事善忘的一种病证。并指出本病多由心脾不足、肾精虚衰而引起。治疗一般以养心血、补脾肾为主。根据健忘常用中药的出现频率，对那些出现频率高的单味中药有效成分、药理作用研究，按君、臣、佐、使方剂配伍原则组成新的小复方，用于补肾中药防治脑组织衰老的机理研究，以探讨补肾中药防治AD的机理。 2．西医文献的调研 1）生物化学研究 研究发现，AD患者脑细胞产生的神经递质有许多缺损，其中以乙酰胆碱（Ach）能系统神经递质缺损最明显。观察到：AD患者Ach减少可能是因合成Ach的胆碱乙酰化转移酶（Choline Acetylase Transacebylase，ChAT）活性减少，分解Ach的乙酰胆碱酯酶（Acetylase Choline Esterase，AchE）活性明显增加所致。除Ach系统外，肾上腺（NA）、5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA）及-氨基丁酸等神经递质含量，相应的神经递质受体的结合容量（Rt），如M、α、β、5-HT、DA和GABA受体的Rt值均明显减少。该研究为临床上采用AchE抑制剂治疗AD提供了依据。但是，AchE抑制剂的作用并不十分理想，有些药物容易产生副作用和抗药性。对AD患者脑组织的蛋白质斑块进行分析，发现其主要成分是淀粉样蛋白（Amyloid Protein, β-AP）以及过磷酸化的Tau蛋白。而β-AP来源于淀粉样蛋白的前体蛋白（Amyloid Precuser Protein, APP）。APP对神经细胞有双重作用，在低浓度时，对未分化、不成熟的神经元有营养作用；在高浓度时，对已分化、成熟的神经元有毒副作用，可引起神经纤维退行性病变。APP是否转化成β-AP又取决于APP的分解代谢途径。由分解酶代谢的α-途径不产生β-AP，而由溶解酶分解的β-途径能产生β-AP，并导致脑神经细胞内淀粉样蛋白斑块的沉积。 2）遗传学研究 研究者发现：患有唐氏综合症（Down’s syndrome）的婴儿如果能活到中年，所产生的神经退行症状与AD临床症状很相似。基因遗传学研究证实：患唐氏综合症的婴儿第21号染色体发生变异，而 AD患者产生β-AP的基因正是在21号染色体上。β-AP的产生是因21号染色体上717/670/671位的氨基酸序列突变所致。同时，有的研究揭示出，早期突发AD病变与14号染色体病变关系更密切；在心脏病患者中所发现的E基因突变，尤其是携带E4基因的患者，不仅得心脏病得机会比携带E2、E3基因的患者明显增加，而患AD的比例甚至高于患心脏病。美国杜克大学的Duke教授调查过42个具有晚发性（65岁以上）的AD家族中的243人，发现凡是携带2个E4基因的个体，患AD的机率较携带2个E2、2个E3或E2、E3混合型的个体高8倍。最近加拿大的学者又报道，AD患者19号染色体上也发现基因突变。这些研究表明：患者多种染色体上基因突变可能是造成AD患者病因复杂的主要原因。对AD患者基因突变的深入研究，例如：现在美国宾夕法尼亚大学等已用基因工程克隆制备出21号染色体上717位氨基酸的单克隆抗体；明尼苏达大学的Karen教授成功制备出APP转基因小鼠AD动物模型等。这些研究成果不仅深入的揭示出AD的病因，而且为研制防治AD的有效药物提供了客观依据和可靠指标。 3）毒物学研究 研究人员发现：若干无机盐类物质和某些有机化学物质也可以引起脑神经细胞的中毒死亡。例如：铝能否引起AD目前仍有争论。但是，在AD患者脑部尸解发现，患者脑中含有很高的铝却是不争的事实。铝是AD的致病原因，还是AD患者脑内对铝代谢改变产生的结果，目前还不完全清楚。但是，用氯化铝溶液口服和腹腔注射能制备记忆力明显减退的拟痴呆AD动物模型，并测定其脑组织中ChAT、AchE活性，M受体的Rt值，其变化规律与老年动物及临床病人一致。 此外，对汞、硒、锌等无机物，谷氨酸盐、天冬氨酸盐类等有机物进行研究，观察这些物质也可以使脑神经细胞中毒而发生AD。 4）其他方面的研究 除上述研究外，对病毒学、内分泌激素学、神经免疫学等方面也进行了探讨。有些报道指出：由病毒引起的Creutz-feldt Takob disease、杰斯综合症（Gerstmam-Strausaler syndrom）和克鲁病（Kuru）也有痴呆症状，推测病毒也会引起AD。美国南加洲大学恒德教授（Dr.Victor Henderson）对2418名妇女进行调查研究，一部分停经后补充雌性激素，一部分不给雌激素，10年后，补充雌激素的老年妇女患AD的比例较未补充性激素者减少40%。在神经免疫学研究中观察到：白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6）等细胞因子，在消除神经细胞炎症时，防止了AD的形成。我们给青年和老年大鼠腹腔注入绵羊红细胞（SRBC），由SRBC外来抗原对神经-内分泌的负反馈抑制作用，使动物记忆力明显降低，与记忆有关的神经递质及其相应神经递质受体的功能也显著下降。 6．7．3．2 补肾中药延缓脑组织衰老和防治老年痴呆机理的研究 采用自然衰老的老年小鼠、老年大鼠和SRBC免疫青年大鼠、SRBC免疫老年大鼠、氯化铝溶液制备的小鼠拟痴呆模型以及电损伤制备大鼠拟痴呆动物模型进行研究。动物的分组（以老年大鼠为例），分为青年对照组、老年对照组、西药对照组、补肾中药Ⅰ组（临床用量10倍）、补肾中药Ⅱ组（临床用量30倍）。常规饲养，除青、老年对照组外，西药组加用临床有效西药，用量均为临床用量的30倍。喂药一至六个月（视观察指标而定），上述各组的一半，腹腔注入SRBC，另一半不用SRBC免疫。SRBC免疫五天时，与未免疫的动物，都按相同的方法进行各项测定。 1．神经递质的测定 根据文献调研，脑的记忆功能除与Ach系统有关外，与NA、5-HT、DA、GABA及Glu等神经递质也有密切关系。首先选择HPLC等方法，分别测定了青年大鼠、老年小鼠、老年大鼠、电损伤制备的拟痴呆大鼠和氯化铝溶液制备的小鼠拟痴呆动物模型脑不同分区组织中的E、NE、5-HT、5-HIAA、5-HTP、5-HAD、DA、HVA、Glu和GABA等神经递质含量。并按课题设计，测定用SRBC免疫后青年和老年大鼠大脑皮层、海马和纹状体中上述神经递质的含量，比较研究补肾中药对神经递质含量的影响。 2．神经递质受体的测定 基于测定脑组织中受体的功能，即神经递质与受体的结合容量（Rt），解离常数（Kd），也可以反应脑的记忆功能，研究采用核医学常用的RRLBA，测定相关神经递质受体的Rt值和Kd值。在补肾中药延缓脑组织衰老，防治AD的机理研究中，先后测定了各组动物大脑皮层、海马、纹状体等组织和免疫器官—胸腺、脾脏中的α1、β、M、5-HT、DA和GABA等神经递质受体的Rt值及Kd值。 3．神经递质的合成或分解酶活性测定 神经递质含量的变化与其自身的合成或分解酶的活性密切相关。例如：在80年代初，研究发现：脑组织中的单胺氧化酶（MAO）活性随增龄明显增加，尤其是MAO-B被认为是脑老化相关酶。研究发现：老年动物脑组织中ChAT活性显著降低，AchE活性明显增加，因而使脑组织中Ach含量明显降低。采用放射酶分析法，测定ChAT和AchE活性，以此为指标观察补肾中药延缓脑组织衰老，防治老年痴呆的机理。 4．内分泌激素的测定 实验观察到雌激素可使老年妇女AD的发病率大大降低，但是，到目前为止还未见用性激素治疗AD的报道。在研究补肾中药延缓脑组织衰老和防治AD的机理时，项目组采用RIA测定动物血清中E2、T等性激素和FSH、LH和HCG等促性腺激素的含量。这些激素虽然与AD发生无直接关系，但是与机体的整体调节及内环境的稳定密切相关。 5．免疫功能的测定 免疫功能的测定可分为用同位素掺入淋巴细胞的细胞核中DNA、RNA的合成，直接观察细胞免疫功能；以及用RIA方法测定细胞因子，尤其是像IL-2、IL-6等淋巴细胞分泌的白介素系列因子。我们曾用3H-胸腺嘧啶掺入法，测定淋巴细胞DNA合成能力；用125I-尿嘧啶掺入法测定淋巴细胞RNA合成能力；用14C-亮氨酸掺入法测定淋巴细胞蛋白质合成能力，计算其掺入率，作为细胞免疫指标。也用125I-尿嘧啶掺入法测定自然杀伤细胞（NK）及3H-胸腺嘧啶掺入法测定LAK细胞等细胞免疫功能。在补肾中药延缓脑组织衰老及防治AD机理的研究中，采用M受体的激动剂刺激淋巴细胞，通过测定淋巴细胞中环核苷酸的含量，推测补肾中药对淋巴细胞膜上M受体表达的影响。 6．活性基因的检测 研究发现：动物脑等器官、组织中的细胞核，普遍存在活性基因。可以将大分子的DNA降解为小片段DNase对活性基因不发生作用。而活性基因随增龄逐渐减少，可以作为脑组织衰老程度的指标。我们采用该指标测老年大鼠脑组织、肝脏中的活性基因，从电泳图谱上明显看到：老年动物活性基因减少，而灌喂补肾中药的老年大鼠，活性基因明显增加，与青年对照组基本相似。 7．原位杂交检测与放射自显影术 M受体为Ach能受体，其与放射性配基的结合能力，以及在脑组织中的分布及表达，为研究补肾中药延缓脑组织衰老，防治AD的机理，从分子生物学水平提供了客观的指标。 经研究M受体有几种亚型，其中M1受体的结构已经清楚，可以人工合成。为此，采用M1受体基因片段，用32P或35S进行标记，制成M1受体标记探针，将动物脑片进行原位杂交，放射自显影，光密度计数仪计数，计算机处理，观察补肾中药对M1受体mRNA在大脑皮层、海马和纹状体中转录量的影响。实验表明：补肾中药可明显增加老年大鼠脑不同分区组织中M1受体mRNA的密度，为补肾中药显著增加老年大鼠记忆功能提供了实验依据。 用上述冰冻切片的脑片，以3H-QNB（M受体的放射性配基）与切片中的M受体进行结合反应，洗去未结合的3H-QNB，将片子与氚片合片，或用核4乳胶涂片，在暗室中曝光，经显影、定影，用光密度计数仪计数，计算机处理，结果与原位杂交方法所得结果基本一致。表明：补肾中药能促进M受体转录和表达，达到防治AD的药效。 6．7．4 展望 凡是在基础和临床研究中采用同位素做示踪剂的实验方法、临床诊断和治疗等新技术，都可以归纳到核医学的范畴。作为标记技术的放射性核素以其对被标记物生物性能影响小、灵敏度高，至今仍在生命科学研究中发挥着重要的作用。近些年，非放射性核素的化学发光标记技术的突破，进一步推动了标记技术的发展，其重要性已经在生命科学研究中显现出来。 核医学在中医、中药基础研究中发展较快，可以预计，在今后的中医药研究和发展中必将发挥出愈来愈重要的作用。 6．7．5 附录：核医学工作中放射性污染的防护 实验核医学工作中的核素多为半衰期较短、能量较低的125I、3H、14C、35S和32P等，它们都是开放性的放射源。在工作过程中可因容器的破碎、放射性物质的散落、放射性气体的外溢及放射性废物的排放等造成工作场所及周围环境的污染。对放射性核素的卫生防护是根据核素射线的性质确定的。 1．减少外照射的方法 外照射对人体的损伤与机体受照射的累积剂量、放射源的活度及受照射的时间呈正比，与照射距离平方成反比。根据该原则，对外照射的防护有以下三个方面： 1）缩短照射时间 在满足工作需要的条件下，尽量减少与核素的接触时间。要求工作人员技术熟练、准确，动作迅速无误，减少照射的累积。 2）增大与放射源的距离 在操作放射性物质时，不要直接接触放射源。可以用镊子及机械手完成的实验，尽量用这些工具代替，如此，不仅能防止放射源对手的污染，而且增大了放射源与人体的距离，大大减少照射的累积量。 3）屏蔽防护 由于工作条件限制，为缩短照射时间和增大与放射源的距离，可以在人和放射源之间设置合理的屏蔽物质吸收和降低射线的照射剂量。屏蔽材料的选择和厚度的确定是根据射线的性质，屏蔽材料的性能而确定。α射线穿透能力极小，只要戴上橡皮手套就可以防护。β射线，特别是高能量的β射线需要用铝、有机玻璃、透明塑料等原子序数较低的物质做屏蔽材料。 2．避免内照射的方法 避免内照射的方法主要是防止放射性物质进入体内。其方法有以下四个方面： 1）围封 按放射性水平分为不同结构和要求的房间和工作区域，使放射性工作操作在相应的区域内进行。例如：低活性区进行一般性放射性测定、试剂配制、放免分析等。操作可在铺有吸水纸的搪瓷盘中进行。在高活性区内进行示踪实验、病人检察、动物实验、开瓶分装、核素标记、污染物洗涤及废物的储存。核素标记最好能在通风橱和手套箱内进行，尽量减少和限制同位素的污染范围。现将放射性物质污染表面的推导出来的限制数值（导出限值）列于表1，仅供参考。 表1 放射性物质污染表面的导出限值 污染表面 α放射性物质Bq/cm-2 β放射性物质Bq/cm-2 手、皮肤、内衣、工作袜 3．7*10-2 3.7*10-1 工作服、手套、工作鞋 3．7*10-1 3.7*100 设备、地面、墙壁 3．7*100 3.7*101 上表说明：固定污染比松散污染可放宽5-10倍，低毒类或中毒类核素控制水平可放宽10倍。无论哪种污染，采用水清洗污染的方法基本可以驱除污染。所以，一旦放射性物质洒落到手上、皮肤或工作服上，只要立即用水清洗即可驱除污染。若洒在地板或墙上，可用镊子夹住脱脂棉球搓拭，再用湿棉球搓洗数次即可。将被污染的棉球即刻放入放射线核素污物桶，以备集中处理。 2）安全操作 熟练掌握操作技术，必要时在放射性操作前进行“冷实验”练习。严格遵守操作规程，避免与放射性物质直接接触，减少进入体内的机会。 3）保洁去污 注意防止放射性污染，在开瓶分装、液体配制时，防止易挥发性气体或粉末状核素的扩散，应在通风橱或手套箱内操作，保持环境、工作用品和人体表面的清洁。发现污染及时处理，对放射性废物应集中处理，妥善处理。 4）做好个人防护 穿戴适当的个人防护衣具，如工作服、鞋、帽、口罩、手套以及围裙、套袖等。不在工作场所进食、吸烟。工作结束后进行卫生清洗，并做污染监测。