上海中医药大学《实验中医学》教案（7） 课程名称 实验中医学（理论部分） 总学时数 36 专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤 内容 实验中医学常用的实验研究方法及其在中医研究中的应用 时数 16  本次课目的要求 1．掌握不同学科实验研究方法的特点和优势。 2．掌握如何根据实验研究的要求选择实验研究方法（包括一种或几种方法）。 3．了解各学科的主要实验研究方法。 4．了解各学科实验研究方法在中医药研究中的应用。 5．了解了解各学科研究中医药学的现状。  本次课的重点难点 第一节 解剖学方法及其在中医研究中的应用 1．大体解剖学的主要方法。 2．大体解剖学方法研究中医的现状。 第二节 组织学方法及其在中医研究中的应用 1．组织学的主要研究方法。 2．组织学方法研究中医的现状。 第三节 电镜技术及其在中医研究中的应用 1．电子显微镜及电子显微术概况。 2．电子显微术研究中医的现状。 第四节 生物化学方法及其在中医研究中的应用 1．生物化学的主要方法。 2．生物化学方法研究中医的现状。 第五节 生理学方法及其在中医研究中的应用 1．生理学的主要方法。 2．生理学方法研究中医的现状。 第六节 免疫学方法及其在中医研究中的应用 1．免疫学的主要方法。 2．用免疫学方法研究中医的现状。 第七节 核医学方法及其在中医研究中的应用 1．核医学的主要研究方法。 2．用核医学方法研究中医的现状。 第八节 分子生物学方法及其在中医研究中的应用 1．分子生物学的主要技术和方法。 2．用分子生物学方法研究中医的现状。  本次课的应用教具  多媒体设备。   第二节 组织学方法及其 在中医研究中的应用 （2学时） 首先，对上一节课布置的作业进行课堂提问。课堂讨论，结论：不同血府 许多初涉中医实验研究的人，最大的问题是不知道如何着手研究，不知道观察什么指标。 比如，发现某张中药复方治疗肿瘤，比如肝癌，有效，想研究证明其疗效，分析其作用机理。怎么办。 你们说怎么办？如何入手？说说看实现的路线、步骤。 在实验研究中可以观察许多方面，看看中药治疗后在哪些方面起作用。其中形态学是最常用的观察手段。即使在分子生物学迅速发展的今天，也是如此。有许多优点，实在。 形态学方法大体有3个层次：大体解剖、光镜、电镜。 大体解剖：肉眼所见，最为基本。如果肿瘤体积在用了中药后，没有减小，再什么先进的研究也没有必要。临床所见也大体如此，比如咳嗽好了没有，骨头接上了没有。这些最基本。 光镜：但是， 电镜 建立以实验科学为前导的基础理论研究，是发展中医学的重要一环，建立动物模型可以在脏象学说的基础上开展实验研究，使中医学理论建立在可观性的结构基础上（如应用形态学研究中医理论）。从进化论观点，人与动物结构与功能有共同点，动物模型可使中医理论研究涉及多学科、多层次的形态学等方面，并以一系列的指标进行研究，使中医理论具有可验证性。如“肾虚”证无法得到人体脏器的结构资料，通过建立“肾虚模型”可在处死的动物上获得全身组织器官的组织学、组织化学与超微结构等变化的系统资料。 总之，选择中西医共同结合点——建立中医证、病动物模型+中药反证（实验性治疗）——观察机体的细胞、组织与器官的组织学、组织化学与超微结构的变化——积累、总结大量的科研资料，可以阐明中医理论的物质基础与规律性，应用于临床研究，可加速中医的发展，使之逐步现代化。因此有非常重要的理论意义和实践意义。 6．2．1组织学的主要研究方法 组织学是研究机体微细结构及其相关功能的科学。组织大致可分为两大部分，即基本组织和器官系统。机体是由细胞和细胞间质组成，细胞是组成机体的基本结构和功能单位，众多细胞由细胞间质粘合在一起，构成一个细胞群体，称为组织。几种组织相互有机结合组成器官与系统。 组织学是应用多种实验技术和染色方法以及各种显微镜对机体细胞、组织和器官的微细结构及其功能之间的关系进行深入的研究。近年随着科学技术的发展，特别是激光光学、流体喷射技术、电子学和计算机技术的发展，组织学研究方法在经典技术的基础上取得了巨大进展，不仅对细胞的形态结构及其与功能之间的关系的观察更为精细和深入，而且对细胞在功能活动中的各种酶活性和各种物质的含量变化，亦可进行精确的定位和定量。由于分子生物学，特别是核酸的原位杂交技术的改进和建立，对细胞遗传学、基因工程和在细胞分化过程中基因结构的重组，以及癌基因的定位研究取得了突破性进展。 组织学研究方法很多，并随着科学技术的发展，又不断地引用或创建新的技术，但是，无论何种研究方法，都需要应用各型显微镜观察。在应用中要根据研究目的和内容，选择相应的技术方法才能获得预期的效果。这里仅就最常用和最基本的一些方法作简单介绍（电镜方法详见有关章节）。 6．2．1．1常用光镜标本制备技术 切片标本的制备。这是最常用的方法。应用光学显微镜观察机体各部的微细结构时，首先应把所有要观察的材料制成薄片，最基本的就是切片方法，其中石蜡切片更为常用。其制备程序大致如下： 1．取材与固定。将所要观察的人体或动物的新鲜材料切成适当的小块，立即浸入固定液（如甲醛溶液等）中进行固定，防止离体后结构发生变化，使其尽可能保持活体时的结构状态。 2．脱水与包埋。为了使石蜡能浸入组织内，把固定好的材料用乙醇等脱水，经二甲苯透明后，再浸入加温溶化的石蜡中浸透包埋使组织块变硬。 3．切片与染色。将包埋的组织蜡块，用切片机切成5-10μm左右的薄片，贴在载玻片上，脱蜡后进行染色。最常用的染色法是苏木精和伊红染色，简称HE染色。 4．封固。在切片上滴加中性树胶，用盖玻片进行封固，保存备用。 在制作较硬组织（如骨组织等）或较大组织器官（如眼球）等切片，可用火棉胶代替石蜡进行浸透包埋，再进行染色。为了较好地保存细胞内酶的活性 ，可选用冰冻切片，将组织在低温条件下快速冻结，直接切片，进行染色。 6．2．1．2 涂片、铺片、磨片标本的制备 血液等液体材料，可直接在玻片上涂片，干燥后再进行固定和染色。疏松结缔组织和肠系膜等薄层组织，可在玻片撕开展平，制成铺片，待干燥后进行固定和染色。骨和牙等坚硬组织除用酸（稀硝酸等）脱钙后再按常规制成切片外，还可直接研磨成薄的磨片进行染色观察。 6．2．1．3组织化学和免疫组织化学方法 组织化学与细胞化学是应用物理、化学和免疫学方法，对组织、细胞内某些化学成分的定性、定位和定量进行研究，从而探讨与其相关的机能活动。 1．组织化学。其原理是在组织切片上或被取材料上，加某种试剂，使它与组织或细胞内某些物质起化学反应，形成最终反应产物。光镜组织化学要求其最终产物是有色的沉着物；电镜细胞化学要求其最终产物是重金属沉着物。观察其沉着物的颜色、深浅或电子密度，可对某种物质进行定性、定位和定量。 2．免疫细胞化学。是将免疫学基本理论与细胞化学技术相结合而建立起来的新技术。主要是应用抗原与抗体特异性结合的特点，检测细胞内某些肽类和蛋白质等大分子物质的分布。肽类和蛋白质种类繁多，均具抗原性。提取动物的某些肽类和蛋白质，作为抗原注入另一种动物体内，则产生与抗原相应的特异性抗体（免疫球蛋白），从血清中制备该抗体。如使抗体与荧光素结合，则形成荧光标记抗体。常用的荧光素为异硫氰酸荧光素（FITC），当用该荧光素标记抗体处理组织切片时，则与组织内相应抗原发生特异结合，在荧光显微镜下呈黄绿色荧光部分，即为抗原抗体复合物，称此为荧光标记抗体法。如抗体与辣根过氧化物酶（HRP）等酶标记，与抗原结合后呈棕红色，可在光镜或电镜下观察，此即酶标抗体法。 6．2．1．4组织培养 组织培养或细胞培养是在体外研究活组织或活细胞的形态结构和生理功能动态变化的一种很有价值的研究手段，已广泛应用于生物医学的各个领域。组织培养是在无菌条件下进行，从机体取得的活组织或活细胞，或者长期传代培养的细胞株，放入盛有营养液的培养基（天然的或人工合成的）的培养瓶（板）内保持一定温度、适宜的O2与CO2浓度、pH值等条件进行培养。可在倒置显微镜下直接观察细胞的增殖、分化、运动、吞噬等动态变化，并可用显微录像或显微电影真实地记录下活细胞的连续变化过程。 6．2．1．5放射自显影 放射自显影是研究追踪某些物质在体内或细胞内的代谢径路与结构的关系。 将放射性同位素或同位素标记的物质注入体内或组织培养的营养液内，间隔一定时间取出被检材料，制成标本切片或整体切片，并在其上涂以感光材料，置暗处曝光，继数日或数周后，再经显影、定影处理，在放射性同位素或标记物存在的部位，溴 化银被还原成微细的银粒。这样可在光镜或电镜下观察结构的同时，观察放射性同位素或其标记物的分布、数量、排泄等代谢过程，借此可判明该物质的动态变化过程及其与功能的关系。 在生物医学研究中，常用放射同位素主要是能量低、射程短、电离作用强的β射线，有3H、14C、32P、35S、125I、45Ca等及其化合物。如将125I注入体内，观察碘在甲状腺内的代谢情况。 6．2．1．6形态计量 形态计量或立体计量术是研究组织和细胞内各种有形成份的数量、体积、表面积等绝对和相对数值的方法。研究物体某些结构的立体数值的科学，称体视学。光镜结构的计量研究已积累了许多有意义的资料。近年来开始研究细胞超微结构的计量，如肝细胞中各种细胞器的数量、大小、体积、表面积等。这些数值以“量”的概念阐述了结构与功能的关系及病理状态下发生的变化。通过组织切片或照片的平面图象的测定，可将平面的测量数据按数学原理和公式推算出立体结构参数。目前常用的精密定量仪器有： 1．显微分光光度术。是显微镜技术和分光光度技术两者的结合，是定量的显微镜技术，可测出细胞内各种化学成分的含量。如测定DNA、RNA、酶、脂类和糖类的含量。 2．显微萤光光度术。是利用细胞内原有发生萤光的物质，或对细胞内各种化学成分用不同萤光素标记后，进行定性、定位和定量的测量。 3．流式细胞光度术。是一种对流体单个细胞及其它生物微粒进行快速定量分析及分选技术。同时可测量一个细胞的8个相关参数，测量速度可达5000个细胞/秒，分选纯度可高达99%以上。可获得细胞的大小、形态、细胞内颗粒的多少；经荧光染色可测量DNA、RNA、蛋白质、细胞膜上的受体和抗原等。 4．图象分析仪。又称图象分析系统，它是当代形态计量的最精密、最现代化的仪器之一。它是在计算机、显示器和数字图象处理等综合起来的一种新技术。经测定可获得组织和细胞内各种有形成分（包括切片、照片、X光片和实物等）的数量、长度、面积、体积或将二维结构转换成三维立体结构及各种物质染色后的灰度等项目的相对数值，对组织化学的有色反应产物和放射自显影的银颗粒等方面均可进行定位和定量。该仪器使用广泛，所得数据可经计算机进行统计学处理，迅速得出分析结果。 上述各种测试仪器已成为组织化学、细胞化学、病理学、免疫学和药物学以及其他生物医学各学科的重要研究工具。 6．2．1．7 显微镜 1．普通光学显微镜。光镜的机械部分由镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器和调焦螺旋等组成；光学部分包括目镜、物镜、聚光器和反光镜。目镜有放大5倍、8倍、10倍、15倍几种。物镜一般有10倍、20倍、40倍和100倍（油浸镜）几种。光镜的放大率等于物镜和目镜放大倍数的乘积。 2．暗视野显微镜。用于观察在亮视野下因反差太小或分辨率不足的微细结构或颗粒。这种显微镜主要是由一个特殊的暗视野集光器，使光线不直接进入物镜，故呈暗视野。用来观察不染色的新鲜细胞涂片或放射自显影标本中的银颗粒分布等。 3．相差显微镜。主要用于观察组织培养中的活细胞，这种不染色标本，其反差小，在一般光镜下，其结构分不清楚。相差显微镜将细胞各种结构对光线所产生的不同折射作用，转换成光密度差异，使镜下结构反差明显，影像清楚。如将这种显微镜改装成目镜在下，光源在上，则称为倒置相差显微镜。用以观察贴附于培养瓶的活细胞，效果更好。 4．荧光显微镜。用以观察有自发荧光或经荧光素染色或标记的细胞和组织。这种显微镜一般是以高压汞灯产生的短波紫外线为光源，荧光物质在紫外线照射下激发出各种颜色的荧光，借此研究该荧光物质的分布，该显微镜附有激发、吸热、阻断等滤片系统。 6．2．2 组织学方法研究中医的现状和范例 1975年，上海中医药大学组织胚胎学教研室施玉华等在国内率先应用组织学方法研究中医基础理论。二十多年来比较系统地研究“肾”的有关理论、中医药延缓衰老的机制和二十四节气对肾精的影响。在应用组织学研究中医基础理论方面有一定的代表性，现就其研究思路、方法、结论和体会简介如下： 脏象学说在中医学理论体系中占有极其重要的地位，其形成虽有一定古代解剖学知识为基础，但其发展主要是基于“有诸内，必形诸外”的观察研究方法，因而其观察分析的结果必然大大地超越了人体解剖学的脏腑范围，形成了独特的生理和病理的理论体系。因此脏象学说中的心、肺、脾、肝、肾等脏腑名称，虽与现代解剖学的脏腑名称相同，但在生理、病理的含义不尽相同。中医脏象学说中一个脏器的生理功能可能包含现代解剖学中几个脏器的生理功能，而现代解剖生理学中一个脏器的生理功能又会分散在藏象学说的几个脏腑的生理功能之中。肾的情况便是如此。 6．2．2．1 肾的研究 “肾”的学说是中医基础理论的重要内容。“肾为先天之本”，“肾主藏精之府”，“肾主生长”，“肾主生殖”，“肾主骨生髓”与“肾主水液”。历代中医经典著作均给予了高度重视。 1．“肾主生长”的研究 中医理论认为肾所藏的精气是构成人体的基本物质，也是人体生长发育及各种功能活动的物质基础，能促进机体的生长、发育和逐步具备生殖能力。现代医学认为除遗传、疾病、营养与环境影响机体的生长发育外，至少有四种激素关系到机体的生长发育：生长激素、甲状腺素、雌激素以及来自睾丸与肾上腺的雄激素。这些激素刺激蛋白质与核酸的合成代谢和骨组织所需的氮、钾、磷和钙等的潴留，加速机体的生长发育。实验以它巴唑与谷氨酸钠分别建立甲状腺机能减退幼鼠、大鼠模型与垂体功能低下的肾虚模型，以经典温肾益精中药（主要为龟龄集与右归丸等）进行实验性治疗，作为药物反证。研究垂体、甲状腺、肝与长骨等的组织学、组织化学与超微结构的变化。 1）观察温肾益精中药对甲减大鼠模型的肝、甲状腺及垂体等的组织学、组织化学和超微结构等的影响。甲减大鼠出现类似临床甲减症状，体温、氧耗明显下降。光镜与电镜观察，肝细胞肿胀透亮，嗜碱性物质减少；滑面内质网（SER）增生；粗面内质网（RER）扩张、脱颗粒；RNA含量减少；与细胞吸收核苷密切有关的5核苷酸酶（5’-Nase）活性降低；葡萄糖六磷酸脱氢酶（G6PDH）活性也降低。以上变化可引起合成核酸的原料不足，造成核酸合成障碍，进而使蛋白质合成障碍，影响细胞的生长发育与代谢过程。肝细胞细胞 色素氧化酶（CCO）降低，说明肝细胞氧化供能过程发生障碍；琥珀酸脱氢酶（SDH）活性代偿性增加。 温肾益精药使甲减大鼠活动增加，体温与氧耗量提高，肝细胞变性范围较少，程度减轻；RER排列整齐，数量增多，SER增生减少；使减少的RNA含量增多，5’Nase、G6PDH、CCO和SDH活性趋向正常，提示温肾益精中药能够调节甲减大鼠肝细胞的核酸代谢，促进RNA合成，保护细胞RER及蛋白质的合成过程，有助于细胞的分裂、生长与发育，并可能通过增加细胞色素C含量，改善呼吸链及氧化磷酸化过程，抑制无氧酵解，更有效地产生能量，使肝脏以至机体氧耗增加。 甲减大鼠甲状腺的结构与功能明显受到伤害，滤泡极度增生，滤泡腔缩小，滤泡细胞呈高柱状，微绒毛增多增高，RER扩张，甚至融合成大囊泡，线粒体增多，间质毛细血管扩张，胶质过碘酸雪夫反应（PAS反应）减弱，滤泡上皮葡萄糖-6-磷酸酶（G6P）、G6PDH酶活性下降，过氧化物酶（TPO）、SDH、5’-Nase、硫胺素焦磷酸酶（TPP）等酶活性明显上升。血总甲状腺素（T4）、三碘甲腺原氨酸（T3）水平明显下降。由于它巴唑抑制了大鼠甲状腺滤泡细胞的葡萄糖氧化，使G6P、G6PDH活性降低，而SDH活性明显上升；它巴唑还抑制了酪氨酸残基的碘化，两者必然使得甲状腺素的合成与释放障碍，血清T3、T4水平降低，而垂体促甲状腺素（TSH）反馈性地大量释放，使TPO（参与碘的活化及酪氨酸残基碘化过程）与TPP（高尔基复合体的标志酶）及SDH活性增强，但是甲状腺激素的合成过程依然受到影响。 甲减大鼠垂体前叶很少见到正常形态的TSH细胞，其RER扩张，转变成去甲状腺细胞；多种细胞线粒体髓鞘样变；血清TSH水平明显上升。表明甲减垂体前叶结构，由于甲状腺功能受到抑制而遭到严重损害。甲减大鼠垂体后叶分泌物明显减少，染色反应减弱。 温肾益精药组大鼠甲状腺仍增生，但部分滤泡细胞接近正常，其G6P、G6PDH、SDH、TPO等酶活性趋向正常，血清总T4、T3水平上升，垂体TSH、STH细胞增加，去甲状腺细胞明显减少，血清TSH水平下降。垂体后叶激素含量趋向正常。提示温肾益精药能改善甲减大鼠肝、甲状腺、垂体的形态学变化，保护垂体的结构，且能调节下丘脑旁室核与视上核的分泌作用。 2）观察温肾益精中药对甲减幼大鼠长骨、肝、甲状腺和垂体等的组织学、组织化学和超微结构的影响。甲减幼大鼠，其长骨重量减轻，骨小梁细，骺板无机焦磷酸酶反应显著降低，含无机焦磷酸酶和碱性磷酸酶（AKP）及PAS反应的骺板软骨细胞层数显著减减少，血Ca、P、Na显著下降。龟龄集使长骨重量增加，骺板无机焦磷酸酶活性显著上升，含无机焦磷酸酶、AKP反应的骺软骨细胞层数显著增加，血Ca、P、Na有上升趋势。无机焦磷酸酶与AKP有促进长骨生长发育与钙化的作用。本实验中龟龄集也能改善甲状腺、肝与垂体的超微结构与组织化学成份的作用。 3）观察温肾益精中药对垂体功能低下大鼠模型垂体、甲状腺及肝的组织学与组织化学的影响。垂体功能低下大鼠垂体和甲状腺重量明显减轻；垂体前叶TSH、STH、促卵泡激素（FSH）细胞百分比明显减少，甲状腺滤泡数量减少，滤泡细胞TPO、SDH、异柠檬酸脱氢酶（ICDH）和5-Nase等酶活性降低，肝CCO、5’-Nase活性下降，糖元含量减少，ICDH和SDH活性增加。龟龄集可使模型大鼠垂体和甲状腺重量增加，垂体前叶STH、TSH、FSH细胞百分比趋向正常，同时能改善受损害弓状核的作用，弓状核能产生促甲状腺激素释放激素（TRH），是调节TSH的重要因素。 综上所述，温肾益精中药使下丘脑—垂体—甲状腺轴，及其靶器官（肝、长骨是重要的靶器官）的结构与功能得到改善，以促进靶器官的核酸及蛋白质的合成，进而调节细胞及机体的生长、发育和代谢。本实验从形态学角度揭示“肾主生长”理论有物质基础，证明“肾主生长”与下丘脑—垂体—甲状腺及靶器官有密切的内在联系。 2．肾主生殖的研究 祖国医学的理论认为肾藏精，主生殖，《素门.金匮真言论》说：“夫精者，身之本也”。即精是构成人体的基本物质，精能化气，肾精的盛衰，关系到生殖和生长发育能力。《素问.上古天真论》说：“男子二八，肾气盛，天癸至，精气溢泻，阴阳和，故能有子……七八……天癸谒，精少，肾脏衰，形体皆极。女子二七而天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子……七七，任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也”。反映了肾的精气在人体生长、发育和生殖功能方面的重要作用。中医临床根据“肾主生殖”的理论，对于生殖机能的病证，多应用填精补肾的方药进行治疗。有鉴于此，采用LRH-A（黄体生成激素释放激素产品）和腺嘌呤建立生殖机能减退模型和老龄雌、雄大鼠模型，采用填精补肾中药进实验性治疗，对雌、雄性大鼠的下丘脑视上核与旁室核、生殖器官、肾上腺等进行组织学、组织化学与超微结构研究。 1）老龄动物的研究。 老龄大鼠下丘脑视上核、旁室核的神经内分泌细胞数量及百分比发生明显的变化，视上核、旁室核甲细胞明显增加，乙细胞明显减少。填精补肾中药固真及葆贞组大鼠甲细胞数量及百分比都较老年组明显降低，而乙细胞则明显增加。表明老年组视上核细胞分泌活动下降，填精补肾中药有促进调整核团分泌的作用。老龄组垂体前叶的促性腺激素细胞、黄体生成素（LH）和FSH细胞数量减少，部分胞核固缩，胞质内有空泡。STH细胞数也减少，染色减弱，嫌色细胞数增多。固真组STH细胞和嫌色细胞数趋向正常。 老龄组雄性动物的睾丸曲细精管出现萎缩退化现象，曲细精管缩小，生殖上皮变薄，曲细精管间结缔组织增生、间质细胞变小，其3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）反应显著降低，精母细胞及间质细胞的SDH反应亦明显减弱。固真组大鼠睾丸曲精管的萎缩退化现象较老龄组轻，间质细胞的3β-HSD和SDH反应亦较老龄组强。老龄组凝结腺上皮细胞的山梨醇脱氢酶反应显著降低，固真组的酶反应则比老龄组增强。 老龄组雌性大鼠卵泡数量显著减少，黄体数量亦减少，髓质中血管稀少，结缔组织增生较明显，间质腺较多。卵巢内3β-HSD反应很弱，黄体细胞20α-HSD反应多数为阴性。葆贞组卵巢内卵泡数量、黄体数量均较老龄组多，髓质血管较丰富，卵泡及黄体的3β-HSD、20α-HSD及卵巢G6PDH反应均比老龄组增强。 老龄组大鼠子宫内膜上皮退化，固有膜内细胞密度和腺体数量明显减少，内膜上皮的PAS反应阴性。葆真组的子宫内膜基质及细胞数量、腺体的数量均比老龄组增多，子宫内膜 上皮的PAS反应有一定程度的提高。 老龄雄性大鼠肾上腺皮质3β-HSD含量下降，尤以网状带和近髓带为显著，固真组肾上腺皮质3β-HSD反应显著增高，此与网状带产生雄激素的功能相符。 老龄小鼠卵巢皮质中主要见纤维化白体，无卵泡，还精煎组卵巢有不同发育阶段卵泡、黄体及间质细胞。老龄小鼠子宫萎缩变细，各层组织均萎缩，子宫变薄，子宫腺变细，肌层薄，血管少，子宫上皮及腺上皮AKP阴性反应；还精煎组子宫肥大变粗，数倍于老龄组子宫，腔大，各层组织均肥厚，固有层结缔组织疏松，细胞大，子宫腺粗大而长，血管丰富，子宫上皮、子宫腺及肌层AKP阳性反应。老龄小鼠睾丸大部分曲细精管萎缩，生精细胞退化，精子消失，还精煎组睾丸大多数较正常。 2）腺嘌呤诱发成年雄性大鼠肾损害模型睾丸结构的变化。 模型组睾丸萎缩，曲细精管退化变性，生殖上皮变薄，变性，结缔组织增多，间质细胞减少，3β-HSD反应明显减弱。右归丸组的睾丸退化程度与数量较模型组轻，间质细胞数量较多，3β-HSD反应有改善。模型组睾酮显著下降，右归丸组则较模型组显著上升。 3）LRH-A诱发幼龄大鼠生殖紊乱模型的变化。 模型组阴道涂片周期紊乱，周期长，动情期极短，甚至不出现。卵巢皮质内卵泡数量减少，而黄体数量增加，但体积明显缩小，黄体细胞质内有空泡出现，黄体的平均面积、周长和最大直径与正常组比较均有显著差异。卵巢的G6PDH和3β-HSD反应均增强。20α-HSD阳性反应的黄体百分率也升高。模型组子宫缩小，卵巢、子宫的重量显著减轻，子宫颈的切面面积显著变小，子宫腺体小，子宫颈部上皮细胞膨大，嗜酸性增强，电镜观察内膜腺上皮微绒毛变短、数量减少，内质网扩张和线粒体轻度肿胀。模型组垂体前叶的促性腺激素细胞数量、体积、着染程度和超微结构均无明显的改变。中药组的阴道涂片动情周期较模型组的略有规律。卵巢黄体的数量少于模型组。卵巢的G6PDH与3β-HSD反应与模型组相似，20αHSD阳性反应的黄体百分率比模型组下降。黄体的平均面积、周长和最大直径没有显著性差异。子宫的重量和切面积比模型组增加。子宫内膜上皮细胞的变化没有模型组的明显，腺上皮细胞的微绒毛的数量和长度均比模型组多和长。垂体前叶的促性腺激素细胞内的颗粒对阿利新蓝着色反应有的减弱或甚至消失，因而细胞内的颗粒主要呈现PAS阳性反应。 综上所述，老龄大、小鼠，腺嘌呤与LRH-A雌、雄模型动物生殖系统发生的组织学、组织化学与超微结构的变化均为生殖功能紊乱、降低所致，是肾精虚衰的表现，实质是下丘脑—垂体—肾上腺、性腺轴的功能低下。填精补肾中药对于该轴功能低下具有多层次、多器官、多环节的调节、保护作用，并证明“肾主生殖”与该轴有密切的内在联系。 3．肾主骨、生髓理论的研究 “肾主骨生髓”的生理功能，是肾中精气具有促进机体生长发育功能的表现。骨的生长发育，有赖于骨髓的充盈及其所提供的营养。《素问.阴阳应象大论》说：“肾主骨髓”；《素问.六节脏象论》说肾“其充在骨”，都是说肾中精气充盈，才能充养骨髓，故《素问.四时刺逆从论》说“肾主身之骨髓”。 髓，有骨髓、脊髓和脑髓之分，这三者均属于肾中精气所化生。因此，肾中精气的盛衰，也影响及脊髓和脑髓的充盈发育。 1）大鼠前脑基底核的研究。 应用电刺激损伤大鼠前脑基底核制作“类痴呆”模型，以乙酰胆碱酯酶(Ache)方法观察苍白球大神经原的反应强度，结果证明模型组基底核的核团面积缩小，神经原数量、突起、分枝数量显著减少， Ache活性反应显著降低；调理心肾中药使核团面积、神经原数量、突起、分枝数量与 Ache反应强度均得到增加与改善，表明调理心肾中药对大脑基底核大细胞的Ache活性具有调节作用。胆碱能递质系统对纹状体神经元起易化作用，可促进学习和记忆，因此调理心肾中药对老年性痴呆可能有较好的治疗作用。 2）下丘脑的研究。 氢考大鼠下丘脑视上核及旁室甲细胞分泌颗粒及百分比减少，乙细胞百分比上升。补肾中药组视上核、旁室核的甲细胞、乙细胞的百分比接近正常。提示补肾中药对视上核、旁室核的神经分泌有一定的调整作用。 3）免疫系统的研究。 （1）脾脏淋巴细胞的变化：氢考小鼠脾脏及脾小体不同程地缩小，淋巴细胞显著减少，电镜观察，注射氢考3天时，淋巴细胞核内异染色质减少，注射氢考5-10天核溶解消失。应用补肾药治疗后，淋巴细胞数量较多，其超微结构基本正常。 （2）老年小鼠淋巴结与结肠落花生凝集素阳性细胞（PNA+细胞）有不同程度减少，服用还精煎小鼠的淋巴结和降结肠内PNA+细胞数量有不同程度增加。 （3）老年组大鼠胸腺显著萎缩，只残留少量胸腺组织，其中淋巴细胞也显著减少，且有大量浆细胞和巨噬细胞，Feulgen（DNA反应）反应减弱。固真组与葆贞组胸腺亦萎缩，但残留的胸腺组织较多，其中淋巴细胞也较多，Feulgen反应增强。 （4）含IgG 浆细胞的变化：氢考小鼠小肠固有膜中含IgG浆细胞减少，中药组小肠含 IgG浆细胞增多，接近正常。 （5）腹膜细胞的变化：氢考小组腹膜细胞显著减少，I型（小淋巴细胞）、II型（单核细胞）细胞百分比及III型细胞（巨噬细胞）绝对值下降。补肾中药使腹膜细胞总和、II型细胞百分比及III型细胞绝对数均显著上升。 以上结果表明补肾中药对受氢考影响而减少的淋巴细胞、含IgG浆细胞与腹膜细胞增多，并使淋巴细胞的超微结构接近正常。提示补肾中药有增强免疫系统的作用。 （6）肥大细胞的变化：氢考小鼠舌尖及腹膜肥大细胞减少，且使腹膜肥大细胞的未成熟型（小型）百分比显著下降，释放型（大型）细胞、破裂和脱颗粒细胞则显著增加。补肾中药使肥大细胞数量上升，释放型、颗粒型比例下降。说明补肾药对肥大细胞有调整保护作用。甲减大鼠甲状腺肥大细胞的结果相似。肥大细胞含单胺类物质，参与微循环的调节，可参与甲状腺的功能调节，也能调节舌质的变化。 总结以上研究的结果以及甲减垂体的研究，证明补肾中药对大鼠前脑基底核，下丘脑视上核、旁室核及垂体均有一定的调节保护作用。中医认为肾主骨生髓，充于脑，主作强。《灵枢·海论篇》云：“脑为髓海”，说明脑由髓汇合而成。以上研究的器官确均属脑，调理心肾中药对之有调节作用。补肾药对淋巴细胞、含IgG浆细胞、腹膜细胞和肥大细胞等均有调节保护作用，这些细胞均来自骨髓，补肾中药可增强其机能，说明肾与骨髓有密切的内在联系。补肾药还可促进骨的生长发育与钙化作用。以上结果均能说明“肾主骨生髓”理论有物质基础。 4．肾主水液理论的研究 “肾主水液”主要是指肾中精气的气化功能对体内津液的输布和排泄，维持体内津液代谢的平衡起着极为重要的调节作用，所以《素问.逆调论》称“肾者水脏，主津液”。这与现代医学肾脏的功能是近似的。 观察腺嘌呤诱发大鼠模型，其体重减轻，出现多尿、低渗尿，排泄代谢废物功能低下，肾脏体积肥大，呈“大白色肾”；组织学观察肾实质呈萎缩倾向，肾小体数量明显减少，肾小管腔内和间质中有棕黑色腺嘌呤结晶沉积，结晶沉积的近曲小管上皮变薄，结缔组织增生；肾小管的组织化学观察，其PAS、AKP、G6P、G6PDH、非特异性脂酶、苹果酸脱氢酶（LMDH）等反应明显减弱。肾小管主要功能是重吸收，PAS和AKP反应的降低直接影响肾小管重吸收功能，致使水、电解质代谢紊乱。G6P和G6PDH是糖酵解过程中的主要酶，在糖代谢中起重要作用，它的活性降低影响肾小管的糖代谢。ICDH和LMDH参与三羧酸循环，在脱羧过程中产生ATP，使细胞获能，它的活性降低就会影响细胞氧化功能，非特异性脂酶主要与脂滴、SER、核膜、线粒体有关，线粒体是细胞的主要能源场所，担负着细胞呼吸的重要功能，它的活性降低直接影响脂类代谢和氧化磷酸化反应。总之以上各种酶活性的降低影响了肾小管的糖、脂肪、蛋白质以及水、电解质的代谢，从而影响了肾小管细胞能量代谢和功能。用右归丸治疗，以上各种酶活性（尤其是LCDH、LMDH、非特异性脂酶）增强，使肾小管能量代谢和功能得到改善。 甲减大鼠垂体后叶神经分泌物明显减少，表明垂体后叶神经分泌物释放增加。垂体后叶神经分泌物主要来源于下丘脑视上核与旁室核，视上核主要含产生抗利尿激素细胞，甲减患者水钠代谢紊乱、粘液性水肿发生与垂体后叶激素的大量释放有关。中医认为：肾主水液、司二阴，与机体水液代谢的正常进行有关。实验显示龟龄集与右归丸能够使甲减大鼠垂体后叶激素含量趋向正常，表明温肾益精药能够减少后叶激素的释放，以治疗肾阳不足与水液代谢紊乱。补肾药并有调节旁室核与视上核的分泌作用，故温肾益精药是通过下丘脑调节垂体后叶激素的释放，也揭示了“肾主水液”司二阴的理论与下丘脑—垂体后激素的释放—肾轴有密切的内在联系。 综上所述，通过对多系统、多组织、多细胞的组织学观察，比较系统地研究了肾的理论。补肾中药能使模型动物的以上组织的形态学变化趋向正常，说明补肾中药对机体有关组织有普遍的增强保护作用，并提示机体的神经体液调节机能（下丘脑-垂体-肾上腺、甲状腺、性腺轴，到靶器官，包括肝及长骨等），促进机体核酸、蛋白质代谢，糖及能量代谢，促进机体的生长发育、繁殖，提高机体的免疫力，以消除各种虚弱症候，增强机体素质，以致延缓衰老。这些结果还表明，肾与机体广泛的系统、器官、组织、细胞及基本结构成分有密切的关系。肾藏精、主生长、发育、生殖和主水，需要全身广泛的系统器官、组织细胞来完成，可以推测这些是中医肾的外延部分。 6．2．2．2二十四节气对大鼠内脏的影响 我们的祖先根据丰富的农业实践，在春秋时期提出了“二分二至”说，秦汉时充实完善为二十四节气。节气基本上反映了黄河流域中下游的气候变化规律，它对指导农业生产，提高生产力，有着重要的指导作用。同时，我国古代医学家也注意到人与自然有着密切的关系，节气的变化常常直接或间接地影响了人体生命活动的节律，如《灵枢》说“人与天地相应也”。《素问》说“人以天地之气生，四时之法成”，都明确指出人不能脱离自然环境而生存，要顺应四季的变化规律而生长。一年四季的气候变化经历着春温、夏热、秋凉、冬寒的规律，它对人体的脏腑、经络、气血各方面都有一定的影响。 现代生物学认为生物在进化过程中需要适应平时随机产生的和规律性出现的环境变化，后者变化主要是根据地球物理学的周期，即昼夜、潮汐、朔望、季节，机体随这四种规律变化的周期出现相应的生物节律，形成所谓“昼夜周期”、“日周期”、“月周期”、“年周期”，这些生物节律决定和影响着生物的生物习性和生理功能，这种在体内存在的生物节律系统被称为“生物钟”。这与中医“人与天地相应”理论是一致的。 使用现代医学实验方法研究节气对机体活动的影响是近几十年的事。马正立等对大鼠肾上腺皮质及睾丸间质细胞3β-HSD活性变化与大鼠胚胎及幼鼠肾上腺皮质3β-HSD活性增龄变化的二十四节气的定量研究，试图从形态学角度探索节气对机体活动与增龄变化的影响。 3β-HSD可以是类固醇生物合成的标志，此酶用组化和生化方法业已证明存在所有产生类固醇激素的组织内，如睾丸间质细胞、肾上腺皮质网状带等等，因此3β-HSD活性的升降可以看作机体内类固醇激素合成的盛衰，可反应机体的阴阳调节。 1．二十四节气对大鼠肾上腺及睾丸3β-HSD活性的影响 取雄性大鼠肾上腺与睾丸（节气后2日±1日）应用Levy等改良法进行3β-HSD组化反应，用显微分光光度计UMSP-50测定3β-HSD酶的含量。 1）肾上肾皮质弓状带的最高峰值在立冬、春分。最低在冬至及大暑。 2）束状带全年分布的最高峰值在芒种、小满，最低在冬至和大暑。 3）网状带全年分布的最高峰值在芒种、小满及春分。最低在冬至和大暑。 4）睾丸间质全年分布的最高峰值在立春，最低在清明、立冬至和大雪，特别令人注意的是在夏至、小暑和大暑时，睾丸间质细胞的3β-HSD反应是阴性。 2．大鼠胚胎及幼鼠肾上腺皮质3β-HSD活性增龄变化的定量研究 实验证明在16日胎龄的肾上腺皮质3β-HSD呈阳性反应，并且随着胚胎发育和胎龄的增长而逐渐增强，到21日胎龄反应达最高峰值。出生后1日龄、4日龄幼鼠3β-HSD比出生前略有降低，但以后即呈直线上升，10日龄达最高峰值，此时各带酶活性与成年大鼠基本相似。但是，相比较而言，出生后1日龄、4日龄、14日龄及21日龄幼鼠3β-HSD活性呈下降倾向，推测是14日龄及21日龄取材实验时分别处在雨水及立夏节气，故推论幼鼠出生后肾上腺皮质3β-HSD活性同样受到农历二十四节气的影响，其结果与成年大鼠一致。 以上结果表明，从立春以后的春季内都表现为上扬的趋势，并且在四季中达最高的平均值（除网状带略低于夏季）。表明从立春起大地阳气萌发，自然界生物都欣欣向荣、万物复苏、生气盎然，肾上腺皮质为适应节气的变化，其机能活动也相应的转为活跃。 二分二至乃阴阳气交之时，实验表明从冬至以后，酶活性渐增，阳气逐渐上升，夏至以后酶活性渐降，阳气逐渐下沉，乃至冬至肾上腺皮质各带和睾丸间质细胞的3β-HSD活性达全年最低点。 夏至处于夏季之半，“至”是极，是日影长至终极。实验观察到夏至、小暑及大暑睾丸间质细胞的3β-HSD反应为阴性，此现象可能是机体为适应炎热的气候而作出的反应，与此同时，夏季的肾上腺皮质网带的3β-HSD活性却居四季之首。可能是由于睾丸间质细胞合成睾酮的功能降低，而网状带作为补尝性增加，值得进一步证实。 6．2．3 展望 采用组织学方法研究中医基础理论，可以直观地了解有关系统、器官、组织、细胞、细胞器，乃至分子水平的变化，并能精确地定位、定量，使中医基础理论建立在可靠的结构基础之上，促进中医现代化。 同其它学科一样，随着分子生物学技术、免疫技术、标记技术、计算机图象处理技术和显微技术等的蓬勃发展，组织学研究手段得到了极大的加强，对似是而非细胞的识别能力、同一细胞不同状态的识别能力均得到加强，成为生命科学和中医药研究中不可或缺的重要技术，在中医药研究创新中必将发挥愈来愈重要的作用。