1 3.051/BE.340 第十三讲 细胞行为的定量分析 1. 细胞培养 a. 为何采用细胞培养？ 体内（活体） 体外（如 玻璃，培养基） 利 1. 天然的三维环境 2. 所有相关信号均存在 1. 简化的模型系统 2. 可独立研究各个参数 3. 观察过程是时间的函数 弊 1. 多变量—噪音数据 2. 需考虑到动物权利等问题 1. 非天然的二维环境 2. 可能会缺少重要的信号 b. 细胞培养的类型 原代培养： 直接来源于活体 ? 对真实生物体的功能性反射 null 细胞会最终死亡 null 一些种类的细胞不易分化（神经细胞） 细胞系 ： 来源于原代细胞（非克隆） ? 被更改的基因 ? 可长期存活 null 被隔离的自发性突变 null 肿瘤细胞 null 病毒性致癌基因的传染 原代培养 时间 细胞系 时间 2 3.051/BE.340 2.细胞功能的评价 null 附着 null 迁移 null 繁殖 null 分化（显型变化，如血液干细胞 ? 白细胞） null 分泌（蛋白产物） a. 细胞附着测试 重要性： 对于细胞的其它功能而言，细胞附着是必须的—它可提供生物物理和生物化学的刺 激。 null 沉降测试： 1. 在体外，细胞以给定的密度（面积）被种植在适宜表面一定时间。 2. 轻轻地冲洗表面，并保持细胞计数，如通过光学显微镜法或 Coulter 计数法（细胞分离， 悬浮并测定流过狭窄通道的电阻变化 达到“计数”目的） 。 3. 为了测定细胞的阻抗，细胞种植在含有血清的培养基中比无蛋白溶液中更准确。 粘 附 率 （ %） 处理过的表面 TCPS（控制） 提示：血浆与血清 血浆—血液的液体部分（细胞被除去） 血清—除去凝血剂的血浆（如： FGN） 3 3.051/BE.340 ? 沉淀测试 不能给出粘附强度方面的数据 null 细胞铺展测试 1. 细胞以给定密度种植在适宜表面一段时间 2. 测量投影表面积的增加（光学显微镜法） null 离心试验（正交力） 1. 细胞被种植在有盖 24 眼孔板中一段时间 2. 孔板放入离心机，由于力的作用细胞粘附并可被检测出 距水平仪较近，但仍不是 对粘附性的直接测量 铺展表示焦点接触的形成 —代谢活动 4 3.051/BE.340 null 流动小室测试： （剪切力） 1. 细胞种植在平行的平板小室内 2. 流体流动的速度梯度在细胞键合表面产生剪切力—通俗地讲像是“皱纹” 法向力 （离心分离） 剪切力（流动腔） 剪切 法向 细胞 残余 量 外加力 便于对比采用公制 5 3.051/BE.340 b. 细胞迁移测试 重要性： null 组织培养（胚胎） null 免疫和炎性应答（白血球的趋化性） null 脉管基因－内皮细胞迁移形成脉管系统 null 患处愈合—成纤维细胞迁移形成结缔组织 null 肿瘤转移 细胞如何迁移？ 肌动蛋白 结合在细胞骨架上 ? “薄层集落 ”扩张 在肌动蛋白微丝上产生收缩力 通过 焦点接触 ，力被传递给培养基 ? 转录 短期： 细胞有 方向性 运动 长期： 细胞运动类似于 扩散 过程 （非化学梯度或物理屏障） 焦点接触 层聚集 肌蛋白丝 6 3.051/BE.340 量化途径： 1. 单个细胞的测量 2. 细胞群体的迁移 null 单个细胞的测试 延时电视显微镜 跟踪表面细胞的运动（在流体或凝胶下方） ，该运动是时间变化的函数 1.测量从起点 pt.行径的距离 (d), 该距离是时间的函数（ t） 2.拟合数据模型得到 化学反应速度 （ S） 和 持续时间 （ P） （细胞依赖性） P： 最初方向的记忆时间 (通常 min-hrs) S： 测量单位时间内质心的位移（通常 1-50μm/h） 自由行程模型： ?d(t) 2 ? = n S 2 [Pt – P 2 (1-e –t/P )] 维数（ 2） 式中 2 1 1 2 )()( tdtd M i iM ∑ = = M = 测量的数目 提示： <d(t)> ≡ 0, t >>P 为什么？ 7 3.051/BE.340 M = 假如每次停顿被用作一个单独的数据点时的细胞数 细胞 1 号路经 细胞 2 号路经 为了达到较好的统计结果需要测量较多的细胞路经（较为枯燥！ ！ ） 间隔地，也可利用 同一细胞 的不同数据： 策略（ⅰ） ： 把在其轨迹上的每个点作为一个“起始点” （所有的样品点是等量的） 策略（ⅱ） ： 阻断进入 N/M 的迁移路经（ N = 样品间隔△ t 的总和） 8 3.051/BE.340 拟合成随机行走模型 ?d(t) 2 ? = n S 2 [Pt – P 2 (1-e –t/P )] 对于短时间内 t<P： 对于长时间内 t>P： 2222 )( PnSPtnStd ?= 穿行距离 = 速度 × 时间 （有向运动） 时间（ min） ?d(t) 2 ? (μm) ?d(t) 2 ? 对 t 作图： 斜率 = nS 2 P Y-截距 = - nS 2 P ? P 和 S 的值 9 3.051/BE.340 对于 t >>P： ?d(t) 2 ? = nS 2 Pt 或 ?d(t) 2 ? 1/2 = S nPt 类似于原子和分子的扩散系数（ D） ，对于细胞，我们可以定义运动系数 μ： μ = S 2 P/n ? ?d(t) 2 ? = n 2 μt 或 <d 2 > 1/2 = tμ4 (两天 ) 持续时间（ P） （ min） 比较在同一培养 基上不同类型细 胞迁移的 P 和 S… 速度如何与炎性响 应的发生顺序相 关？ 速度（ S） （ μm/min） 摘自 D.A.Lauffenburger 和 J.J.Linderman, 《受体： 结合模型， 传输与信号》 ， Oxford U. Press, 1993 穿行距离 ~ 时间 1/2 （扩散运动） 代表型值范围： μ~ 10 -9 -10 -8 cm 2 /sec 10 3.051/BE.340 趋化性 假如趋化性或趋触性（表面绑定信号）介质存在，平均位移 <d(t)> 非零。 我们可以定量迁移的趋化性的 趋化指数 ， CI： 式中 <d(t)> 是沿着浓度梯度的平均位移，并且 L path 是 细胞路经长度的总量 。 在 x 方向上趋化介质的浓度梯度 对于短期（ t<P） ： 对于长期（ t>>P） ： 11 3.051/BE.340 null 细胞群体的迁移 — 细胞被种植在培养基（一般上面覆有凝胶）上，并从中迁移。 — 不同时间以变换的距离测量细胞密度（ c,细胞 /面积或细胞 /体积） 。 细胞孔 兴趣表面 化学诱导孔 控制细胞密度， c (细胞 /面积 )： χ 与单一细胞性能相关，通过： 式中 Jc 是细胞通量（细胞 /距离 -时间） L = 趋化介质的浓度（ mol/liter） χ = 趋化系数（面积 /时间 -M） 随机游 走运动 μ-依赖于趋化 介质的浓度 与趋化介质 的定向偏差 12 3.051/BE.340 当 μ 表示出浓度依赖性的任何情况下，在细胞会显示出趋化性。 用适于模型的细胞数据解上述方程得到合适的边界条件。 举例：对于持续补充细胞的随机运动： 巨噬细胞的运动系 数 μ 依赖于 C5a 的 浓度 摘自 D.A.Lauffenburger 和 J.J.Linderman, 《受体：键 合模型：传输与信号》 ， Oxford U.Press,1993 可从 c (x,t) 数据中测 得 μ