1 3.051/BE.340 第 21 讲 组织工程 组织工程： 在组织或器官范围内，通过人工处理、操作细胞方式借助于细胞外环境寻找一 种可以取代、修复或增强生物功能的研究领域。 目标： 1． 完成生物性机械作用（骨，软骨） 2． 代替生理功能 (肝脏，神经 ) 3． 输送分泌物（胰岛素） 4． 上述目标的综合 3 种主要途径： 1． 体外 /细胞囊封化（ 3） 2． 体外 合成（ 1-4） 3． 体内 合成（ 1-4） 2 3.051/BE.340 1． 体外 /细胞囊封化 方法： 1． 把需要的细胞密封在半透膜中 2． 植入密封装置或与体内连接 3． 细胞分泌物 ? 治疗 4． 当治疗完成时装置取出或断开连接 优点： ? 从活细胞角度的天然治疗方案 ? 非宿主细胞的使用—免疫隔离 不足： ? 有来自补体蛋白吸收所造成的潜在的、不希望的免疫反应（类似于血液滤膜） ? 有血栓形成的可能性（体内处理过程中使用的抗凝血） ? 存在植入装置破裂的可能性 半透膜 氧，营养物 二氧化碳， 排泄物 治疗分子 悬浮在溶胶中 的细胞 免疫系统： Ab,T 细 胞 , B 细胞 3 3.051/BE.340 应用研究： ? 糖尿病治疗 * ? 慢性病 * ? 神经变性疾病： ALS（ Lou Gehrig 病，神经肌肉） ，帕金森， Alzheimer’s, 亨廷顿病 （渐进性脑坏死） ? 矮小症 ? 贫血 /血友病 ? 斑点恶化（失明） ? 癌症 ? 肝功能衰竭 * *=临床试用 装置实例 胰岛微囊化（胰岛技术公司 ， St Paul, MN） 细胞帽 ：用于葡萄糖控制的可植入性膜包裹胰岛 细胞： 产生胰岛素的胰岛 用途： 糖尿病的长期治疗 装置： 限制胰岛的海藻盐膜 治疗： 胰岛被植入于患者胰腺中，或通过膜于病人的血液中，胰岛监测葡萄糖水平的 变化并通过胰岛素的分泌加以响应 状态： 临床使用前的试用（胰岛植入已在临床试用） 胰岛细胞 海藻膜 4 3.051/BE.340 Arbio Systems 公司 （最近从 Circe 生物医药处获得） Hepat Assist 系统 ： 一种体外的，人造的生物肝脏支持系统 细胞： 主要猪的肝细胞 用途： 移植给需求人提供暂时性肝功能 装置： 空心纤维生物反应器，氧发生器，泵 治疗 ：通过生物反应器等离子循环并且与血细胞重新结合 状态 ： I 期试验完成 5 3.051/BE.340 2． 体外 合成 方法： 1． 体外细胞接种在支架装置上 2． 细胞培养、扩增群体并进行组织工程（在静态培养或生物反应器中） 3． 被植入的装置上建立起细胞群 4． 装置降解，支架被重塑组织取代 6 3.051/BE.340 优点： ? 从活组织出发的天然治疗对策 ? 永久治疗 ? 允许控制和量化，而这在体内是不易进行的 不足： ? 细胞源 - 可能的排异 - 肿瘤—细胞系 ? 器官功能的全部恢复还有挑战（如：皮肤） 应用研究： ? 脉管系统（可吸收和不可吸收性的） ? 肝组织 ? 神经组织 ? 软组织 * ? 角膜 * ? 膀胱 * ? 皮肤 * ? 骨 ? 韧带 ? 腱 ? 肌肉 ? 心脏阀 ? 心脏 最新统计的公司： 先进组织科学公司， La Jolla. CA： 破产文档 第十一章 02 年十月 器官形成， Canton, MA： 破产文档 第十一章 02 年九月 由 Novartis 要求的应用接枝形 人工皮肤技术 7 3.051/BE.340 3．体内合成 方法： 优点： ? 来源于活细胞的自然治疗对策 ? 永久性治疗 ? 无细胞源问题 问题： ? 对植入支架的不可控制的生物学反应 应用研究： ? 脉管系统 ? 皮肤 * ? 骨 * ? 神经 * ? 韧带 * ? 软骨（膝盖半月板） 1． 植入多孔支架装置 2． 细胞在体内生长 3． 支架被重塑组织取代 8 3.051/BE.340 组织生长支架 目的：取代外基质的功能（ ECM） ECM 的功能： 1． 细胞寄生 2． 细胞定位 3． 细胞生长 4． 新组织机械性完整 5． 组织微环境 6． 细胞分化 7． 隔绝，储存和呈现可溶性调节蛋白 8． 设计组织的蓝本（如：生物矿化组织） ECM 类型： 基片 (基膜 )： 直接位于上皮细胞之上，包括薄层，胶原，血清纤维结合蛋白，体外连接蛋白 基本组织（间隙基材） ： 提供结构完整性；包括基材 -分泌细胞（成纤维细胞，成骨细胞） ， 胶原，弹性蛋白，纤维蛋白，血清纤维结合蛋白，体外连接蛋白， GAGs, 醣蛋白，调节蛋 白 基片 基本组织 9 3.051/BE.340 可吸收性组织工程支架： 1． 胶原基 如：人工皮肤 不足：产生免疫性 2． 生物可降解聚合物： PLA， PGA， PLGA 如：软骨 不足：无附着点（能在 RGD 上构建） ３．羟基磷灰石，生物玻璃 如：骨再生 不足：脆，强度低 组织工程装置的加工 Ａ．设计问题 １．细胞密度 应该足够高，以确保组织的形成，达到治疗目的 ２．营养／氧／排泄物的传输 营养物必须能够到达在支架／囊封在装置内的细胞中 10 3.051/BE.340 血管支架 支架／微囊化装置 距营养物的有限距离可从 Thiele ratio, S 中测量（提供消耗的比值） D=营养物在装置中的扩散努力 （ cm 2 /sec） Co=营养物初始浓度 （ mol/cm 3 ） κ =细胞吸收养分的速率常数 （ mol/sec/cell） ｘ =到营养源的距离（血流） （ cm） ρ=在装置中的细胞密度 （cells/cm 3 ） S>>1? 细胞消耗远大于可传输的量 S<<1? 供远大于需 S=1 ? 供需平衡；在装置设计时的定量估计 在设计组织工程装置中的 经验 : ｘ max= 500 微米 11 3.051/BE.340 3． 机械支撑 - 对于硬组织支架至关重要的问题 - 受影响于 ? 选择的材料 ? 加工方法(材料和复合物的取向) 4． 组织工程蓝图 细胞迁移引导 化学和形态因素（化学/络合点/细胞运动） 细胞图形 微接触印刷，微平板印刷术 多种细胞类型的空间组合 - 大多数是多于一种细胞类型的器官 - 基于不同配位体，配位体密度，配位体亲和力 B．支架制备 目标： 连续，高表面积支架 1． 织物 ? 织物/非织物纤维 ? 机械连锁 ? 柔韧的，三维基材 ? 多孔性并且孔尺寸大体上可控 12 3.051/BE.340 2. 键合纤维 ? PGA 纤维浸在 PLLA/CH 2Cl2溶液中 ? 在高于 PGA的玻璃化温度、 低于 PLLA 熔点的温度对纤维进行热处理， 使PDA与PGA 键合 ? 溶出PLLA ? 通过织物提高机械性能；类似孔结构 3．冻干膜 ? 聚合物溶液浸没在液氮中 ? 相分离 ? 被冻的溶剂升华后产生有孔支架 ? 孔结构～λ旋节线分解 ? 可控孔结构 4．盐滤膜 ? 聚合物溶液与均一的盐晶混合 ? 溶剂挥发后形成固体的聚合物/盐复合物 ? 浸没在水中去除盐 ? 可控孔隙率达 93%（厚度<2mm） 13 3.051/BE.340 5. 3D 印刷 ? 浇铸聚合物粉基础（如：PLGA） ? 按希望的分布点“印”微米体积的溶剂液滴（氯仿） ? 当溶剂挥发时凝结的粉固化 ? 重复以上操作，建立 3D结构 ? 摇出未凝结的粉 ? 精确性结构型微孔聚合物或陶瓷支架 C．囊封法 1． 微囊化微球 ? 细胞附于聚合物微球的表面 ? 涂敷细胞的球粒悬浮在弱聚阳离子中（多熔素—NH 3 + ） ? 加入聚阴离子（如：海藻酸钠，-COO - ） ? 聚电解质形成沉淀，围绕细胞的孔联合体（联合体凝聚） ? 单一的微珠包含几百个细胞（治疗需要成千上万） 14 3.051/BE.340 2．密封膜 ? 浇铸浓溶液于底材（平板或管状） ? 底材浸没于非溶剂浴中 ? 非对称膜凝结而成 ? 细胞悬浮在凝胶中，凝胶被封在膜管（长度～3cm）或盘中（直径～2-3cm） 600-1200μm 浇铸液 医生用的调刀 凝固浴 热处理浴 微孔基础层 （机械刚性，高通量） 致密表面层（双面） （半渗透性） 凝胶和细胞 半透膜 15 3.051/BE.340 ? 膜性能 - 分子量截断：典型～30-70kg/mol (孔直径 <100nm ) 注意：Ab～150kg/mol 分子/部分 尺寸 氧，水，盐 2-3 ? 脂体，葡萄糖 10 ? 血清蛋白，内毒素 100 ? 病毒 1000 ? 细菌 10 4 ? 白细胞，血小板 10 5 ? - 基材：多聚糖，藻酸盐/壳聚糖凝聚体，胶原 - 实体:PAN-PVC,PP,聚碳酸酯，硝酸纤维素，丙烯酸 - 形状和尺寸：盘 或管 16 3.051/BE.340 盘状 管状 质量传输 极易 尺寸受限 易凝血性 高表面积增加凝血倾向 极易 细胞# 50-100M 5M 所需细胞# 糖尿病 10 9 凝血因子 10 7 -10 8 CNS 治疗 10 6 -10 7 D．面临的挑战 1．微机械效应 细胞分化、生长（尤其是承载组织）受由支架传来的微机械应力影响 2． 细胞功能退化 3． 对其它区域的交叉应用（基因疗法，药物传输） 4． 多细胞组织和器官 - 复杂、多组份结构（脉管组织） - 再生引导因子（蛋白）仅知道用于血液和骨 17 3.051/BE.340 基本组织细胞种类和功能 细胞类型 组织功能 举例 上皮细胞 覆盖在外部（如，皮肤）和内部（如，肠， 血管）器官的表面 内皮细胞 结缔组织 支撑其它身体组织；神经和血管寄生处 成纤维细胞（ ECM 产生） ，软 骨，骨 肌肉 专为挛缩 光滑，骨骼，心脏 神经 产生电信号并且分泌神经传递素 脑细胞，外围神经 皮肤细胞 结缔组织细胞 肌肉细胞 微粒细胞 骨细胞 软骨细胞 18 3.051/BE.340 细胞再生能力 种类 正常复制率 对伤害的响应 举例 再生 /易变 高；通过干细胞分化 温和 ↑ 皮肤，黏膜，骨髓 扩张 /稳定 低 大量 ↑ 内皮，成纤维细胞，肝 细胞，造骨细胞 静止 /永久 无 无复制；被疤痕组织取代 心肌细胞，神经细胞