1 3.051/BE.340 第五讲 蛋白质表面相互作用 蛋白质表面相互作用的重要性 z 调节 细胞粘附 z 激发生物体系列反应 ，产生异体反应 z 诊断分析 /传感装置 的设计和使用的关键 z 激发 其他生物粘附 ：蛋白污染，细菌粘附等 关于蛋白质的基础知识： z 细胞的最大有机组成 （ ~18wt%/H 2 O=70%） ；细胞外基质和血浆（ 7wt%/H 2 O=90%） 。 z 成千上万的存在 —每一种都是 DNA 上的一个基因编码。 z 涉及细胞的所有活动 ：粘附，移动，分泌，识别，繁殖和凋亡（死亡） 。 z 在体液中可溶或不溶 不溶蛋白质— 组成结构和运动功能的部分；也能调节细胞功能（通过吸附肽） 可溶蛋白质 —通过吸附、粘附等强烈地控制细胞功能 z 分子量存在很大的范围 2 3.051/BE.340 “肽” （若干个氨基酸） ：激素，药物试剂 例如： 脑下垂体后叶荷尔蒙（催产素） ： 刺激子宫收缩（ 9 a.a.） 天 (门 )冬氨酰苯丙氨酸甲酯 ： 天然甜味剂 (2 a.a.) “多肽” （ ~ 10-100 氨基酸）激素，生长因子 例如： 胰岛素 ： 两条多肽链（ 30&21a.a.） 表皮生长因子 (45a.a) “蛋白质” （ 100’s-1000’s 氨基酸） 例如： 血清白蛋白 （ 550 a.a.） 阿朴脂蛋白 B ：胆固醇转运蛋白 (4536 a.a.) 蛋白质的作用： z 结构 /支架 ： 细胞外基质 组分，作为 细胞 物理 支持 例如： 胶原—— 纤维状，提供强度 弹性蛋白—— 为韧带提供弹性 支持蛋白：纤维连接蛋白、层粘蛋白、体外连接蛋白—— 调节细胞吸附糖蛋白 z 酶 ： 通过释放键能，降低通过稳定态的能量， 催化化学反应。 例如： 脲酶—— 催化水解尿素 3 3.051/BE.340 z 转运： 结合并 运输 特殊 分子 到达器官或者穿越细胞膜。 例如： 血色素 -运输氧气到组织 血清白蛋白 -转运脂肪酸 z 运动 ： 提供 细胞运动 机制。例如聚合（解聚）和收缩 例如：肌肉中的 肌动蛋白，肌浆球蛋白 z 防御： 蛋白质构成 免疫反应 和 凝固机制 例如： 免疫球蛋白 （抗体）一种 Y 形的蛋白质，它结合抗原（异种蛋白）诱导聚集形 成。 纤维蛋白原和凝血酶 — 通过结合血小板受体诱导产生凝血。 z 调控 ：细胞因子 —调节细胞行为。 例如： 激素：胰岛素 （调节糖代谢） ； 生长因子 4 3.051/BE.340 蛋白质结构 蛋白质有多重结构 氨基酸 α 螺旋 多肽链 组合亚组 一级结构 二级结构 三级结构 四级结构 [摘自 A.L.Lehninger, D.L.Nelson 和 M.M.Cox, 《生物化学原理》 第 171 页 ] 1．一级结构 ? 由氨基酸残基组成： ? 肽键 CONH 刚性平面（部分双键特征） ? 肽键有方向性：氨基酸是 L 立体异构 [ 摘自 A.L.Lehninger, D.L.Nelson 和 M.M.Cox,《生物化学原理》 第 115 页 ] L— 丙氨酸 D—丙氨酸 5 3.051/BE.340 ? 侧基 R 有各种特性 [摘自 A.L.Lehninger, D.L.Nelson 和 M.M.Cox, 《生物化学原理》 ] R 芳香族基团 苯基丙氨酸 F 酪氨酸 Y 色氨酸 W 非极性， R 脂肪族基团 氨基乙酸 G 丙氨酸 A 缬氨 酸 V 亮氨酸 L 异亮氨酸 I 脯氨酸 P R 正电荷基团 赖氨酸 K 精氨酸 R 组氨酸 H 极性， R 不带电荷基团 丝氨酸 S 苏氨酸 T 胱氨酸 C 甲硫氨酸 M 天冬酰胺酸 N 谷氨酸盐 O 天冬氨酸盐 D 谷氨酸盐 E R 负电荷基团 6 3.051/BE.340 2．二级结构 α 碳的单键的 ψ i & ? i 旋转角 决定了 空间构型 [摘自 P.J.Flory. 《分子链统计力学》 251页 ] （ ? i ,ψ I ） 独立于 （ ? i+1 ,ψ i+1 ） Ramachandran 作图： 表明残留氨基酸的 ψ& ?允许的范围 [摘自 A.L.Lehninger, D.L.Nelson 和 M.M.Cox,《生物化学原理》 第 171 页 ] 7 3.051/BE.340 β 折叠 ? 骨架呈之字行结构 ? 通过相邻链间的— NH 和 C=O 形成的氢键保持稳定。 [摘自 A.L.Lehninger, D.L.Nelson 和 M.M.Cox,《生物化学原理》 第 169 页 ] α—螺旋 ? 通过第 i 个氨基酸残基上的 C=O 和第 i+3 个氨基酸残基上的 -NH 形成的氢键保持 稳定。 （要求氨基酸都是 L 或都是 D 型立体异构） [摘自 P.J.Flory.《分子链统计力学》 第 287 页 ] 非平行排列 平行排列 8 3.051/BE.340 ? 自然界广泛存在 ? 在蛋白质中大多数的二级结构 ? 在 纤维蛋白中 ： α 角蛋白（毛发，皮肤 ….） ? 在 球状蛋白中 ：平均 25%是 α 折叠组成。 3．三级和四级结构 ? 三级：由二级结构单元折叠排列而成 ? 四级：由三级结构单元折排列而成 例子： 血红蛋白 [摘自 A.L.Lehninger, D.L.Nelson 和 M.M.Cox, 《生物化学原理》 第 187 页 ] 9 3.051/BE.340 合成聚合物 VS 蛋白质 性能指标 合成聚合物 多肽 分子量 Wt. 1000-10 6 g/mol 1000-10 6 g/mol(典型 <2000a.a) 分子量分布 通常＞ 1（ Mw/Mn） 通常≡1 序列 ⅰ .1-3 种重复单元 ⅱ .多种化学性质 ⅰ .多种侧链 ⅱ .通常为氨基化合物 溶液结构 无规线团或自免无规 线团 R g ~N 0.5 (θ 溶剂 ) R g ~N 0.6 (良溶剂 ) 球状—“浓缩”链 （疏水 R 基团抑制水分子的渗入） 可能的构象 ? ran ~Z N (Z=# n.n.) ? SA ~Z ’N N 1/6 <<? ran ?~1(若键合或被吸收可 ↑) 二级相互作用 范德华力， H-键，静电 力， “疏水”效应 如同合成，具有“锁—匙”拓扑 多肽可通过如下方式 转变 成无规卷曲构造： ? 转变温度 ? 改变溶液 pH 或组成（如，加入盐，脲） ? 表面吸附 ? 改变生理机能！ 10 3.051/BE.340 蛋白质在生物材料表面吸附 背景 a) 蛋白质活性在吸附状态和溶液状态不同 原因？ 1． 较高的局部浓度 —功能与浓度相关 例如：细胞粘附随多肽粘附量的增加而增加 2． 改变反应活性 -进入氨基酸序列的活性中心 ? 提高或降低反应活性 例如：纤维蛋白原：血小板在非溶液状态下吸附 3． 蛋白质变性 -蛋白质在溶液中构造发生改变 ? 产生不同的氨基酸序列 *增强或失去原有功能 *产生 额外的功能 例如： 天然聚合物作为生物材料比合成聚合物更易产 生免疫原性 11 3.051/BE. 340 b)导致蛋白吸附的因素 1. 二级键的形成 静电力 > 氢键 > 色散力 键 能 2．熵 ? 提高由靠近无极性表面的规整的水分子决定构形（疏水效应） ? 与水相比吸附蛋白质（大分子）产生较少的熵变化损失。 对于一个给定的 φ p , n p 会随着蛋白质分子量的增加而降低 ?Δ S 最大 降低 ? 变性的构型与溶液状蛋白质 取决于材料的 表面化学 12 3.051/BE.340 c） 蛋白质吸附是对生物材料生理反应的开始 ? 凝结机制 ? 补体系统的选择性方式（对比抗原 -抗体） ? 体外微量蛋白吸附实验 → 生物相容性的第一测试 蛋白质吸附模型 最简单的画面：可逆式 的 朗缪尔吸附模型 与化学反应动力学类似： [P]=蛋白质浓度 [S]=空白表面位点的密度 [PS]=被蛋白占据的位点密度 P+S? PS 假设：一个蛋白质占据一个表面位点—可包含多重次价键 假设反应遵循一级反应动力学： 吸附率 =k a [P][S] 解吸附率 = k d [PS] 假设： [P]浓度很低（在血浆中 90%是水 ） 13 3.051/BE.340 平衡时： 吸附率 =解吸附率 k a [P][S ]= k d [PS] 假设：可逆 可以定义一个关系常数 K(或 Ka)： K= k a /k d =[P][S]/[PS ] （也可称为“键合”或“缔合”常数；常用单位 =L/mol） K 由实验测定被占据的位点部分得到 V=占据的位点数 /总位点数 键合状态于 ν=1，单分子层覆盖 K 如图得到： 斜率 =1/K 14 3.051/BE.340 Ka 是吸附程度的一个指标，是 解离常数 K d 的倒数， Kd 单位是浓度 mol/L。 ? 若 [P]< Kd 占据较少表面位点 ? [P]= Kd 占据半数表面位点 第二种得到 K 的方法是 Scatchard 图 关系式重排成： 定义所有表面位点： 取代 [S]得： 如果蛋白质浓度没有随吸附显著降低的话，那么 （起始蛋白质浓度） 提供 [S] 0 的 测量方法 斯卡查德曲线 截距 斜率 15 3.051/BE.340 在吸附实验中，通常测量值是表面浓度例如 ng/cm 2 或者 ug/cm 2 —常表示成 Γ或 θ 我们假设在 Γ max 时是单层覆盖的话，我们就能计算出每个蛋白分子在表面的有效面积。 ¨ 这涉及蛋白质在表面的构型 ! 需指出： [S] 0 是每个蛋白质分子面积的倒数：