1 3.051/BE.340 第六讲 蛋白质－表面交互作用（续） 朗缪尔模型可以应用于众多可逆 吸附过程。 例子： z ＝二元混合物稀释组分的表面层析 z ＝气体的表面物理吸附（压力替代 []） z ＝ 可逆生物分子作用 （例如： 受体－配体键合 ） 对于 一般的反应 : 化学反应的 平衡常数 是： 其中 代表 的 活性 ，对于理想溶液，代 是 的摩尔分率。 代表反应的标准自由能变化： 注意这种自由能的计算只对 可逆 吸附过程 是有效的。 2 3.051/BE.340 朗缪尔模型在很多方面不能应用于蛋白吸附。 1.竞争吸附 ? 体内许多不同种类的球蛋白 ? 表面分布取决于[Pi]’s 和时间 Vroman效应 ： 最初吸附的蛋白逐渐被第二种蛋白取代 。 蛋白质 血浆浓度（mg/ml） MW(D) 人血清白蛋白 42 68,500 免疫球蛋白 28 145,000(IgG) 纤维蛋白原 3.0 340,000 血清纤维结合蛋白 0.3 240,000 体外连接蛋白 0.2 60,000 血浆中 FGN， FN， VN 吸附在聚醚聚氨酯上 时间（ min） （摘自 D.J.Fabrizius-Homan 和 S.L.Cooper,《生物材料科学》 3， 1991： 27-47） 3 3.051/BE.340 假说： At t～0： 恒定[Pi]’s ? 高浓度的蛋白质优先吸附 At t> 0： 近表面的吸附蛋白的损耗－快速扩散交换 At t>>0： 高亲和力蛋白的逐级交换 2．不可逆吸附 ? 体内或体外：蛋白通常长时间暴露在蛋白溶液中并不解吸 ? 复杂的竞争吸附 吸附了 FGN 后， 表面暴露在血浆 中 剩余 FGN 的 百分含量 FGN 吸附的时间（ min） （摘自 S.M.Slack 和 T.A.Horbett, ，《 胶体和界面学》 133， 1989： 148） 4 3.051/BE.340 生理学含义： a) 疏水表面导致更多的 变性 b) 变性的蛋白最终会被解吸（被取代） ? 非溶液固有的行为 此模型可以解释 1 & 2: S.M.Slack 和 T.A.Horbett, 《胶体和界面学》 133，1989 P.148 I.Lundstroem 和H.Eleing， 《胶体和界面学》 136，1990P.68 C.F.Lu,A.Nadarajah 和K.K.Chittur, 《胶体和界面学》 168,1994P.152 3.重建 ? 达到单层饱和的蛋白分子层能够在表面重组（例如：结晶） ，产生阶梯等温线 时间 Γ= 5 3.051/BE.340 4.多层的形成 ? 蛋白能吸附顶部的蛋白单分子层或亚分子层，得到复杂的吸附模型。 6 3.051/BE.340 吸附蛋白的测量 1.吸附蛋白的量化技术 a) 标记方法： 量化标记蛋白，使用已知的标准尺度 i) 放射性同位素标记 ? 采用放射性同位素与特殊的氨基酸残体 例如，采用 125 I； 131 I； 32 P ? 把带放射性的蛋白加入到未标记的蛋白中的比例 （较小比例的放射性蛋白加入到未标记蛋白中） ? γ代表测量和标准 cpm/μg 优点： 高信噪比 ? 可测量微含量（ng） 缺点 ： γ发射具危险性、存在废物处理、需要蛋白分离 ii)荧光标记 ? 标记物的可见光激发的荧光测量 7 3.051/BE.340 例如，荧光素异硫氰酸盐(FITC) 共价结合于胺 优点 ： 化学稳定 缺点 ： 标记会影响到吸附，需要蛋白分离、信号弱 iii)染色 ? 分子标签吸附到蛋白上 例如，有机染料；抗体（例如，FITC 标记） 优点 ： 化学稳定，无蛋白隔离/修饰 缺点 ： 染料无特异性吸附（强干扰） b）其他定量方法 i）表面 HPLC（w/UV 检测） ii） XPS 信号强度，例如，N 1s （相对调节） iii） 椭圆光度法 －吸收层厚度（干） 8 3.051/BE.340 2．研究吸收动力学的技术 a）原位椭圆光度法 ? 实验模型 ： 从固体/液体表面或检测到的单色光的、 椭圆型的偏振光 ? 吸收的蛋白质层改变了相或反射光的振幅－对于平行或垂直的偏振光有所不同 反射系数： 振幅比率： 相差： ? 椭圆光度角 ψ 和 ? 能被转换为 吸收层厚度（ df）和折射系数（ n f） 假设 3 层模型和 或菲涅耳光学 He-Ne 激光 可旋转偏光器 1/4 波长平板 样品 可现状分析器 光电探测器 9 3.051/BE.340 ? 吸收量： 优点： 无蛋白分离；快速；简单；原位；灵敏 缺点 ： 需要建立一个量化模型，需要光学平坦或反射底层；不能区分不同的蛋白质 参考文献： 1. P.Tengvall, I.Lundstrom, B.Liedburg, 《生物材料》 19，1998：407-422 2. H.G.Tompkins,《椭圆偏光显微镜的使用指导》 ，Academic Press:San Diego,1993 10 3.051/BE.340 b）表面细胞质基因共振 ? 实验模型： 偏振光反射到带有沉积金属胶片的玻璃和液体流动池之间的界面上 ? 理论基础： z ＝穿过高 n介质（玻璃）的光将反射回低 n（空气/水）的物质界面 z ＝完全内部的反射 ＝ z ＝表面细胞质基因组－电荷密度波（自由振荡电子）沿着金属和绝缘体的表面传播 （蛋白溶液） z ＝偶联短波到金属胶片上细胞质基因组，当出现 的情况： 液体 玻璃 Au 或 Ag 胶片 偏振光 2D 检测器 11 3.051/BE.340 z ＝能量传递到金属胶片降低了光的能量 z ＝当 时 ，表面吸附蛋白导致 的改变将会转换 反 射 强 度 12 3.051/BE.340 优点 ： 无蛋白质标记，控制动力学研究，灵敏 缺点 ： 需要进行“模型”表面预处理－限制了应用 摘自Bioacore website: www.biacore.co m Biacore 提供图 片，获准使用 参考文献： R.J.Green, R.A.Frazier, K.M.Shakesheff, M.C.Davies, C.J.Roberts, S.J.B.Tendler, 《生物材料》 21，2000：1823-1835. Biacore 商业化 SPR 仪器 光源 镀金膜的 传感芯片 偏振光 光学检 测单元 三棱镜 反射光 强度 角度 谐振 信号 时间 流体通道 传感图 13 3.051/BE.340 3．变性的程度 椭圆光度法 ? 随着时间推移， 吸收层的厚度（d f）和折射系数（n f） 的改变给出变性提示（非绝对） 圆二色性 ? 实验模型 ：单色的，平面偏振光通过样品溶液并进行检测 ? 理论基础 ： 手性分子 对偏振光的 R-和 L-组分的不平衡吸收（例如：蛋白质！ ） 平面偏振光分解成 R 和 L 环形光 R 的大量吸收导致 E 遵 循椭圆路径 ψ=椭圆率 14 3.051/BE.340 莫尔椭圆率： 其中c p＝溶液中蛋白质的浓度（g/cm 3 ） ? 在远紫外区由蛋白质中电子转移引起的吸收展示了 α螺旋 和 β折叠 的构造。 结构 波长（nm） 跃迁 α 螺旋 222（-） n-π* 缩氨酸 α 螺旋 208（-） π-π* 缩氨酸 α 螺旋 192（+） π-π* 缩氨酸 β 折叠 216（-） n-π* 缩氨酸 β 折叠 195（+） π-π* 缩氨酸 β 折叠 175（-） π-π* 缩氨酸 已删除的图片，展示α螺旋、β折叠和无规卷曲。 摘自 T.E.Creighton,ed., 《蛋 白：结构和分子原则》 ，W.H.Freeman & Co:NY; 1983,p.181 15 3.051/BE.340 ? 提供了测量 变性 的手段，例如，从吸附出发 优点 ： 不需要标记；模型简单 缺点 ：不能应用于胶体粒子（强信号） 参考文献： N.Berova, K. Nakanishi 和 R.W.Woody, eds., 《圆形二色性：原理和应用》 ,第二版， Wiley-VCH:NY；2000 16 3.051/BE.340 圆二色性补充： 量化结构的改变 蛋白质中的手性导致对 R-和 L-偏振光组分的不同吸收 椭圆率 ψ代表 L 和R 吸收的不同： z ＝椭圆率可以加减；取决于电子转移 ( - * vs. n- *)= z ＝在远红外区蛋白质展示不同的 α螺旋、β折叠， 和 无规卷曲 的结构。 平面偏振光分解成 R 和 L 环形光 R 的大量吸收导致 E 遵 循椭圆路径 ψ=椭圆率 （度） 式中 Beer 规律 摩尔椭圆率 Cp = 蛋白浓度（ g/cm3） ε = 摩尔消光系数（ cm2/g） I = 光径长度（ cm） Mp= 蛋白摩尔质量（ g/mol） T = 传输量 17 3.051/BE.340 对不同的蛋白质来说，椭圆率通常被定义为 单位莫尔椭圆率 （cm 2 /dmol） ，通过被蛋白质（n r） 中残基数相除 为了确定 α 螺旋、 β 折叠，和无规卷曲结构的比例，可以对蛋白溶液进行去卷积，利用同多 肽（例如：聚赖氨酸，100％ α 螺旋、 β 折叠和无规卷曲结构）得到的标准曲线进行线性 回归。 来源： 《圆二色光谱》 ，Lawrence Livermore National Laboratory, http://www_- structure.llnl.gov/cd/cdtutorial.htm. (updated January 06, 2004, accessed September 15,2004) 椭 圆 率 波数（ nm） 椭 圆 率 波数（ nm） 18 3.051/BE.340 对 α 螺旋的含量进行粗略估计，可以用以下的表达式： 参考文献： N.Greenfield 和G.D.Fasman， 《生物化学》 8 （1969）4108-4116 α-螺旋含量（ %） α-螺旋含量（ %） 在 208nm 处 [θ] mrd 数据 在 208nm 处 [θ] mrd 数据