1 3.051/BE.340 第十四讲 细胞功能的量化 c. 细胞增殖测试 重要性： z 伤口愈合 z 宿主防御 z 癌症治疗 z 组织工程 z 糖蛋白的生物加工/合成 ? 细胞计数 1.通过光学观察或Coulter 计数器计数 2.计算特定的细胞增殖速率常数： N = 在时间t时的细胞数 ? 细胞群体相 在某些情况下，我们需要知道在细胞周期中每相的细胞数量（真核细胞）： M = 有丝分裂期（~1h） G1= 细胞分裂和DNA 合成之间的 间隙（~18-72h） S = DNA 合成期（~6-8h） G2= DNA 合成和有丝分裂之间的 间隙（~2-3h） G0 = 细胞分裂静止期 2 3.051/BE.340 3 H-胸腺嘧啶脱氧核苷的吸收 1. 暴露在 3 H-胸腺嘧啶脱氧核苷脉冲中的细胞被标记成仅为S-相细胞 2. 以放射自显术 测定标记细胞的百分比（Ag沉淀在悬浮膜上，显示S-相细胞，类似于 冲洗照片用的感光乳剂*） 3. 从光学显微镜获得M%和t M 。（视觉清晰） 4. 在 3 H-胸腺嘧啶脱氧核苷标记后，通过随后标记的有丝分裂的百分含量，t G2 ,t S 和t 周 期 可被测定 → t G1 。 5. 标记的有丝 分裂的百分 含量（%） [ 3 H]胸腺 嘧啶脱氧 核苷脉冲 *蛋白鉴定时，发射自显术也与 PAGE一起使用。 3 3.051/BE.340 流式细胞仪* 1. 细胞的DNA被特异性荧光染色标记（如：吖啶黄，溴乙非啶） 2. 对于荧光计数细胞使用激光激发 3. 荧光强度~ DNA存在 G1：S：G2：M DNA（和荧光性）比率是1：1-2：2：2 优点： 不足： - 无需放射性标记 - M和G2群体结块 - 比放射自显术快 细胞# 相对DNA含量 面积 （%） *通过用荧光抗体标记，流式 细胞仪也可被用作确定特异 性细胞受体。 4 3.051/BE.340 d. 细胞分化测试 重要性： - 在显型方面的变化使得功能专一特征化 - 通过蛋白合成、基因表达和分泌方面的改变表征其特性 2D 凝胶电泳（SDS—PAGE）：细胞蛋白基于质量和电荷不同而分离— 提供一种细胞“信 号” 方法 1． 细胞溶解 2． 通过使用等离子聚焦pI(等电位=净电荷为零处的pH值)使蛋白溶液分离 3． 凝胶被贴近以交叉形式放置在由十二烷基硫酸钠组成的第二层凝胶上。 4． SDS 键合并使蛋白变性? 自然电荷可忽略 ~ 1SDS每2氨基酸。 电荷/质量≈常数 ⅰ.在E场中放入两性电解质混合物，在聚丙烯 酰胺凝胶中产生一个稳定的pH梯度 ⅱ.加入蛋白溶液，E-场被重利用 ⅲ.蛋白扩散到各自的等电位点 5 3.051/BE.340 5． 电场中加入凝胶，通过分子量差异将蛋白链分离 低分子量蛋白移动较快 SDS—PAGE：十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳 6． 比较前后信号以明晰分化。 6 3.051/BE.340 DNA微阵列： 基因表达的测试 （首先由Affymetrix公司商业化） “探针”阵列由表面键合的基因片段组成（~20碱基/片段） 方法 1． 细胞裂解得到mRNA 2． mRNA 转录合成cDNA(补体)，随即被转录合成cRNA 3． cRNA 被切割成35-200碱基大小的片段并被生物素标记（维生素H）—称“生物素化” - 2M探针/芯片 - 1000-20,000基因/芯片 ~50μm 2 探针区域= 10M DNA 片 段 生物素对于链霉胺具有极 强的键合亲和性 Ka ~ 10 15 L/mol 7 3.051/BE.340 4． cRNA 混合体加入到阵列中，与DNA片段杂交 5． 表面键合生物素的cRNA 被抗生素蛋白标记的荧光团标记 随机阵列使来自定 位损伤降到最低 抗生物素蛋白对 生物素有4个结 合袋 6．荧光空间读出器确定被表达的基因 8 3.051/BE.340 DNA阵列制备 平版印刷术曾被用作建立A-C-T-G序列 摘自S.P.A.Fodor 等，《科学》251，767（1991） 摘自S.P.A.Fodor 等，《科学》251，767（1991） 9 3.051/BE.340 e. 分泌 酶联免疫吸附法测试（ELISA）：在细胞分泌中测试特定的蛋白存在。 1． 细胞从培养基中分泌 6． 颜色的强度由分光光度计读出 7． 非特异性吸附被测定并被扣除 MAb表面是直 接吸附而成或 由随后的MAb 蛋白吸附而成 2．表面覆盖有单克隆抗 体的溶液——假如存在 的话，蛋白与MAb 结合 3．二抗（酶联）被加入 —键合到蛋白表面产生 “三明治夹层” 4．酶（如：碱基磷酸酶） 催化化合物转化成彩色 产物（放大） 颜色强度 非特异性吸附水平 细胞分泌时间