第十八章　遗传疾病的诊断 在当前绝大多数遗传疾病和遗传相关性疾病还没有理想的治疗方法状况下，其诊断（特别是产前诊断和杂合体检出）就显得特别重要。遗传疾病的诊断是进行遗传疾病预防和治疗的前提，它既有与其他疾病相同的诊断方法，也有其特殊的诊断方法。 在分子水平上，遗传疾病是与基因相关的疾病，在人类基因组计划全部完成的今天，确定致病基因及其致病机制成为今后基因学研究的重要内容。越来越多致病基因的确认，丰富了人类对自身基因的认识，也为遗传病的诊断特别是分子诊断奠定了坚实的基础。 遗传疾病的诊断是一项复杂的工作，几乎涉及到各个临床学科。所以要求一个医师精通所有这些学科是不可能的。因此遗传疾病的诊断需要各个学科的配合，需要高水平的综合性医院和专业人员与实验室。由于目前在许多疾病发生过程中，对遗传因素作用的机制了解甚少，使得对临床症状上已确诊的患者仍不能进行满意的遗传分析，该领域仍旧存在相当多的空白。 第一节 遗传病的常规诊断 这里所说的常规诊断是指除分子诊断之外，所有可用于进行遗传疾病诊断的一般临床方法和遗传学特殊方法。 一、遗传疾病诊断的主要内容 （一）病史采集 对于遗传疾病来说病史的采集比其他疾病更重要，因为遗传疾病的家族聚集性和其传递的规律性决定了病史采集可能会获得更有用的信息，对后续的分析工作可能会有很大的帮助。病史采集的关键是材料的真实性和完整性。病史采集主要通过采集对象的描述和有关个体的病案查询。实践中还应注意不同个体描述是否可以相互映证，以确定资料的可信度。对于发病原因、过程、时间、地点、治疗情况等也应详细记录。 （二）症状与体症 症状和体症是患者就诊的主要原因，也是遗传疾病诊断的重要线索。通过症状和体症的了解，有助于提示患者可能的疾病类型，甚至基本判断所罹患的疾病，如白化病。但是绝大多数遗传疾病必须通过进一步检查才能确定。例如痴呆面容提示可能为Down综合征，但必须通过染色体检查才能确定，以防可能为22三体或18三体。临床上也经常遇到看似21三体而染色体检查并非21三体的病例。 （三）家系分析 家系分析是诊断遗传疾病的重要步骤，从先证者入手，尽可能多的调查其亲属的患病情况，这有助于判断是单基因还是多基因遗传、是显性还是隐性遗传、是常染色体还是性染色体遗传。在采集中，应重点记录家族史、婚姻史和生育史，另外对于收养、过继、近亲婚配和非婚生育等情况予以特别注意。进行家系分析时必须注意以下几个问题：①资料必须可靠，个体的文化程度、家系成员的分散程度、被调查者的年龄、记忆和判断能力等，都是影响资料准确度的因素；②涉及家庭成员的隐私问题，应说服被调查者积极配合；③对不同患者患病程度的度量应尽量准确一致，最好能提供医院的诊断资料，仅依某一个人的描述往往产生较大的偏差；④应尽可能地扩大家系范围，以便更准确地判断；⑤注意外显不全、延迟显性、新突变基因、动态突变、易位基因、基因组印迹等问题，还要充分考虑主基因和遗传背景、基因和环境综合作用等问题；⑥观察指标的不同，可能遗传方式也不同。家系分析的结果对于发病风险率的计算将产生重要影响。 （四）染色体检查 染色体病是遗传病中的一大类疾病，而染色体检查（或称核型分析）是针对该类疾病诊断的有效手段，是确诊染色体病的主要依据。但是在临床应用上，由于染色体检查的指征很难掌握，因此异常核型的检出率常常比较低。 1．染色体检查的指征　一般情况下，染色体检查的指征包括：①明显生长发育异常、多发畸形、智力低下者；②多发性流产和不育的夫妇；③性腺以及外生殖器发育异常者；④原发性闭经；⑤35岁以上的高龄孕妇；⑥已经生有染色体异常患儿的夫妇；⑦身材高大，性情粗暴的男性；⑧恶性血液病患者；⑨长期接受X线、电离辐射的人员。 2．染色体检查技术　染色体检查技术经历了几十年的发展，技术上相对成熟，方法相对固定。理论上讲，只要有分裂细胞，就能够制备染色体；但实践中使用最多的是材料是外周血。 人外周血小淋巴细胞，通常都处在G1期（或G0期），一般情况下不进行分裂。如果在体外培养时，在培养液中加入植物血凝素（PHA），则可刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。经一段时间的培养后，加入秋水仙素处理，即可得到大量处于分裂中期的细胞。人体的1ml外周血内一般含有约1×106～3×106个小淋巴细胞，足够染色体标本制备和分析之用（详细内容见第九章和医学遗传学实验指导）。 除外周血可以制备染色体外，骨髓、胸腹水、活检组织（如绒毛膜、手术取材的肿瘤等）、组织培养物（如原代培养的细胞、建系的细胞等）、羊水等都可以作为检查材料。虽然组织细胞的处理各有所不同，但制备染色体的过程基本相似。 （五）生化检查 生化检查主要是对蛋白质和酶结构或功能活性的检测。该方法特别适用于分子病、先天性代谢缺陷、免疫缺陷等遗传病的检查。此外生化检查和还包括了反应底物、中间产物、终产物和受体与配体的检查。生化检查的材料主要有血液、活检组织、尿、粪便、脱落细胞、阴道分泌物等。随着人类对遗传病发病机理认识的深入和检测方法的改进，越来越多的单基因病，特别是代谢缺陷性疾病的诊断将更加迅速，更加简便。表18-1列举了部分可以通过酶活性检测的遗传代谢缺陷病；表18-2列举了部分通过血清或尿液检测的遗传代谢缺陷病。 表18-1 常见通过酶活性检测的遗传代谢缺陷病 疾病名称 检查的酶 材料  白化病 酪氨酸酶 毛囊  精氨酸琥珀酸尿症 精氨酸代琥珀酸裂解酶 红细胞  胱硫醚尿症 胱硫醚酶 肝、白细胞、成纤维细胞  组氨酸血症 组氨酸酶 指（趾）甲屑  同型脱氨酸尿症 胱硫醚合成酶 肝、白细胞、成纤维细胞  酮性高甘氨酸血症 丙酰辅酶A羧化酶 肝、白细胞、成纤维细胞  枫糖尿病 支链酮酸脱羧酶 肝、白细胞、成纤维细胞  苯丙酮尿症 苯丙氨酸羟化酶 肝  酪氨酸血症I 对羧苯丙酮酸羟化酶 肝、肾  酪氨酸血症 II 酪氨酸氨基转移酶 肝  半乳糖血症 半乳糖磷酸尿苷转移酶 红细胞  黑朦性痴呆 氨基己糖酶 白细胞  高血病 β葡萄糖苷酶 皮肤成纤维细胞  腺苷脱氨酶缺乏症 腺苷脱氨酶 红细胞  糖原贮积病I型 葡萄糖-6-磷酸酶 肠粘膜  糖原贮积病II型 α-1,4-葡萄糖苷酶 皮肤成纤维细胞  糖原贮积病III型 红细胞脱支酶 红细胞  糖原贮积病IV型 支化酶 白细胞、皮肤成纤维细胞  糖原贮积病VI型 肝磷酸化酶 白细胞  氨酰脯氨酸缺乏症 氨酰脯氨酸酶 白细胞  高苯丙氨酸血症 二氢喋啶还原酶 皮肤成纤维细胞  瓜氨酸血症 精氨酰琥珀酸合成酶 皮肤成纤维细胞  进行性肌营养不良 肌酸磷酸激酶 血清   表18-2 部分通过血清和尿液检测的遗传代谢缺陷病 疾病名称 血清检测物 尿液检测物  精氨酸琥珀酸尿症  精氨酸代琥珀酸  瓜氨酸血症 瓜氨酸 瓜氨酸  胱硫醚尿症  胱硫酸  胱氨酸尿症  胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸  胱氨酸病 胱氨酸 胱氨酸、其它氨基酸  同型胱氨酸尿症 甲硫氨酸 同型胱氨酸  羟脯氨酸血症 羟脯氨酸 羟脯氨酸  高甘氨酸血症 甘氨酸及其它有机酸 甘氨酸  高赖氨酸血症 赖氨酸 赖氨酸、鸟氨酸、γ-氨基丁酸  高脯氨酸血症 脯氨酸 脯氨酸、羟脯氨酸、甘氨酸  低磷酸血症  磷酸乙醇胺  枫糖尿病 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸 酮衍生物  苯丙酮尿症 苯丙氨酸 苯丙酮酸  酪氨酸血症 酪氨酸 酪氨酸、苯丙氨酸衍生物  组氨酸血症 组氨酸 组氨酸   目前已经能够使用滤纸片或显色反应进行血液和尿液的检查，方法简便，非常适用于初检和普查。 皮纹分析液可以作为某些遗传病，特别是某些染色体病的辅助诊断手段，但是绝大多数的遗传病并没有皮纹的变化，所以该方法用途并不广泛。关于这方面内容读者可以参考医学遗传学实验指导或其它资料。 关于分子诊断（基因诊断）的内容将在第二节中详细介绍。 二、对已出现症状的患者的诊断 了解和掌握了遗传病的诊断方法，就可以有针对性的对遗传病患者进行诊断。对于大多数的遗传病，下一个明确的临床诊断不难办到，但有很多已经明确诊断的疾病，确定其遗传规律还需要进一步的研究分析。由于遗传异质性，临床上相同或相似的疾病（或不同亚型）可能有不同的遗传方式，这对于估算患者后代发病风险率将产生重要影响。例如血友病一般认为是X连锁隐性遗传，但实际上，只有甲型和乙型血友病为X连锁隐性遗传，而丙型血友病和其他与血液凝固相关因子（Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅻ）缺陷所导致的血友病却表现出常染色体隐性遗传；Alzheimer病（又称为早老性痴呆）只有一部分表现出常染色体显性遗传，大多数表现出散发的特点；家族性重症肌无力肯定与遗传有关，多数人认为属于多基因遗传，但也有人提出为常染色体显性遗传或隐性遗传。 遗传病患者大多理解该类型疾病的性质，因此患者与遗传工作者一样，最关心的是他（她）所患的病对其子女将产生的影响，准确地回答这个问题是非常困难的。一是没有哪一个遗传工作者通晓所有遗传病，二是人类对致病基因的认识还很有限，即便拥有大量的资料和强大的检索系统，对许多遗传病的解释还是不能令人满意。只能期待生命科学与医学的发展早日解决这些问题。 三、携带者的检出 携带者是指表现型正常，但携带有致病遗传物质的个体。与单基因隐性遗传中的携带者相比，这里的携带者概念已经扩大，具体指：①携带有隐性致病基因，本人表现正常的个体；②携带有显性致病基因，但没有外显的正常个体；③携带有致病基因，迟发个体；④染色体平衡易位或倒位的个体。 携带者的检出对遗传病的预防具有积极的意义。虽然许多隐性遗传病的发病率并不高，但人群中的杂合子（携带者）的频率却相当高。按照Hardy-Weinberg定律，当某种遗传病的发病率为1/10000时，即q2=1/10000时，q=0.01，p=0.99，2pq=2×0.99×0.01=0.02，也就是说人群中该病的携带者频率为2%。检出这些携带者对于指导他们的婚姻和生育，防止遗传病患儿的出生具有重要意义。染色体平衡易位或倒位的正常个体，出生染色体不平衡患儿的可能性较大，检出这些个体同样具有重要意义。 如果在某一个群体中某种遗传病的发病率较高，则进行携带者筛查具有较大的意义。但是在实际工作中，由于大多数遗传病的发病率较低，大面积的筛查至少目前还不现实，所以大多数携带者的检查是在已经出现遗传病患者的家系中进行，通过家系成员血缘关系和检测分析，确定携带者，再针对性地检查携带者地配偶，进行生育指导。 携带者地检出方法，大致可分为临床水平、细胞水平、酶与蛋白质水平和基因水平。 酶与蛋白质的检查基础是根据基因剂量效应的理论：即杂合子的基因表达水平应该是介于两类纯合子（AA与aa）之间，也就是说为正常人的一半。但是由于基因表达受多种体内外因素的调控，加上检测技术的原因，使得许多杂合子携带者仍不能用这种方法。对于酶与蛋白质的检测，大致存在三种情况：①基因表达完全决定基因数量，例如过氧化氢酶血症，杂合子红细胞中的过氧化氢酶含量为正常人的一半。对于有些遗传病，酶活性虽然是正常人的一半，但不一定是杂合子，有些酶的变异体活性表现出“正常人”的一半，但该个体却是纯合子，例如半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶的Duarte型就是这样。②只能查出部分杂合子，因为在人群中，杂合子基因表达量的分布与纯合子有重叠，如G6PD缺乏症。③不能依靠这种方法检查出杂合子。 临床水平的检查只能提供线索，不能确诊。例如部分血友病基因的杂合子具有损伤后轻度出血倾向；有些红细胞酶缺陷的携带者具有轻度溶血性贫血表现。 细胞水平的检测包括染色体检查、细胞培养和组织化学测定等。 基因诊断对单基因病携带者的检查具有独特的优势，它直接检测等位基因类型，或检测与致病基因紧密连锁的具有多态性的遗传标记，从而能够准确判断携带者，该方法是检测携带者技术的发展方向。 四、产前诊断 出生前宫内的诊断称为产前诊断（prenatal diagnosis）。遗传病的产前诊断可以追溯到1966年，Steele和Berg发现胎儿的染色体可以通过羊水细胞的培养来进行。随着影像诊断、生化诊断和分子诊断的发展，产前诊断得到越来越广泛的应用。 产前诊断主要从三个方面进行：①遗传学检查，如细胞培养、染色体检查、分子诊断等；②生化检查，如特殊蛋白质、酶、代谢底物、中间产物和终产物等；③物理诊断，如B超、X线、胎儿镜、电子监护等。 根据遗传病的严重程度和发病率的高低，可将产前诊断的对象排列如下：①夫妇之一有染色体畸变，特别是平衡易位携带者，或者夫妇染色体正常，但出生过染色体异常的患儿的夫妇；②35岁以上的高龄孕妇；③夫妇之一有开放性神经管畸形，或出生过这种畸形患儿的夫妇；④夫妇之一有先天性代谢缺陷，或出生过这种患儿的夫妇；⑤X连锁遗传病基因携带者孕妇；⑥原因不明的习惯性流产的孕妇；⑦羊水过多的孕妇；⑧夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇；⑨具有遗传病家族史，又系近亲婚配的孕妇。虽然具备了上述条件，但如果出现先兆流产、妊娠时间过长、有出血倾向者，则不宜做产前诊断，另外应拒绝仅要求仅做胎儿性别的检查。 胎儿的遗传学检查和生化诊断都需要取胎儿细胞和羊水，这是与其他诊断区别最大的地方。而取材后的检查技术则与前述的方法差别不大。目前主要取材的方法有： （一）羊膜穿刺法 该方法是在B超的监视下，用注射器经孕妇腹壁、子宫到羊膜腔抽取胎儿羊水（见图18-1）。羊水中含有一定数量的胎儿脱落细胞，多为成纤维样细胞和上皮细胞，可以通过体外培养达到增殖的目的，因此能够实现胎儿的染色体检查、生化检查和分子诊断的目的。抽出的羊水还可以进行某些生化测定而辅助判断胎儿患病信息。例如当羊水中甲胎蛋白(AFP)浓度过高时，可能意味着胎儿无脑、开放性脊柱裂、脊髓脊膜膨出和脑积水等；或为死胎、先天性肾病综合症、脐膨出、某些染色体病等。某些脂类代谢病、粘多糖病、氨基酸病糖原累积病等也可通过羊水检查判断。 图18-1 羊膜穿刺示意图 羊膜穿刺的最佳时间是在妊娠16周～20周之间，此时羊水量较多，成功率高。羊膜穿刺的危险性相对较小，引起流产的风险为0.5%，母体感染、Rh溶血和其它妇科合并症发生率更低。羊水抽取量一般为20～30ml，应为淡黄色，混浊，且无母血污染。 进行羊水细胞染色体分析的技术关键在于细胞培养的成功与否。胎儿脱落细胞中虽然含有一部分活细胞，但是培养的成功率比外周血培养低，一般要培养10天以上才可供染色体制备，除了严格的无菌操作外，培养操作者的经验非常重要。对于分子诊断则无需培养，只要细胞结构完整，DNA、RNA没有降解就可以。 （二）绒毛取样法 绒毛取样法又称为绒毛吸取术，是通过特制的取样器，经孕妇阴道、宫颈进入子宫，达到胎盘处后吸取一定数量的胎儿绒毛组织（见图18-2）。由于绒毛组织中含有大量的处于分裂期的细胞，所以可以用来直接制备染色体，或经短期培养后制备染色体。也可以直接用于生化分析和分子诊断。该方法的优点是可以在妊娠早期（9～12周）进行，需要作出选择性流产时，给孕妇带来的损伤和痛苦较小。缺点是引起流产的风险比较高，是羊膜穿刺的两倍，而且标本容易被细菌、霉菌污染，不宜进行长期培养。有时标本中可能含有母体细胞，影响分析。另外绒毛组织直接制备染色体的质量不容易控制，影响染色体核型分析。 图18-2 绒毛取样法示意图 （三）脐带穿刺 脐带穿刺法是在B超的监视下，用细针经腹壁、子宫进入胎儿脐带，抽取一定数量的胎儿血液。穿刺时间最好在妊娠18周左右，所获得的胎儿血液相当于从遗传病患者体内抽取的血样，特别方便进行染色体分析，当然也可以进行多种其它诊断分析。本技术也用于因错过绒毛取样或羊膜穿刺的时机或羊水培养失败的补救措施。 （四）胎儿镜检查 该方法又称为羊膜腔镜或宫腔镜检查。它可以直接观察胎儿的外形，性别和发育状况，又可以抽取羊水或胎血，还可以进行宫内治疗。因此理论上时一种最佳方法。但由于操作困难，并容易引发多种并发症，目前还不易被医护人员所接受。胎儿镜检查的最佳时间是妊娠18周～20周。 （五）孕妇外周血胎儿细胞富集 前述获取胎儿细胞的方法对于母胎都可能有一定的损伤，都有流产和感染等风险。而从孕妇外周血中获取胎儿细胞的方法则是一个十分安全的方法。1893年就有人发现母体中含有胎儿细胞，1964年发现孕妇外周血中含有未成熟的胎儿红细胞。1969年在22个孕有男胎的孕妇外周血中, 发现19例46，XY细胞，说明从孕妇外周血中分离胎儿细胞进行产前诊断是可能的。并随着技术进步，该方法正向着实用性发展，成为非损伤性产前诊断的发展方向。但目前这项技术还不很成熟，还没有成为产前诊断的主流方法。研究较多的富集方法有：①流式细胞仪分离技术，即利用特殊荧光抗体标记胎儿细胞，进行流式细胞仪分离。常用胎儿细胞表面特有抗体是转铁蛋白受体（CD71）、凝血酶反应素受体（CD36）、B淋巴细胞的CD19、CD23、T淋巴细胞的CD3、CD4、CD5等；②磁式细胞分选技术，即将磁珠与抗体偶联，使磁珠与分离细胞结合达到分离目的；③细胞培养法，即将细胞置体外培养系统中，诱导滋养层细胞和有核红细胞分裂，达到富集的目的。由于用这些方法富集的胎儿细胞含量仍很低，因此需要应用高灵敏的技术方法进行下一步检测，目前常用的方法是PCR。 其它产前检查方法如物理影像、植入前诊断等这里不再介绍。 Indications for Prenatal Diagnosis  The generally accepted guidelines for eligibility of pregnant women for prenatal diagnosis by amniocentesis or chorionic villus sampling (CVS) are based on evidence that the risk that the fetus is abnormal is at least as great as the risk of miscarriage from the procedure itself. As the scope of prenatal diagnosis expands and technology improves, the guidelines are sure to change, but at present the chief criteria are the following: Advanced maternal age (often at least 35 years at the expected date of confinement): If there is no previous history of a chromosome abnormality, it is only in the advanced maternal age range that the risk of a chromosomally abnormal fetus exceeds the risk of miscarriage due to the procedure itself. The age cutoff used varies somewhat among different prenatal genetics centers but is usually at least 31 to 32 years of age. Previous child with a de novo chromosome abnormality: If the parents of a child with a chromosome abnormality have normal chromosomes themselves, there may nevertheless be a risk of the same abnormality in a subsequent child. For example, if a woman under 30 years of age has a child with Down syndrome, the recurrence risk is about 1/100, in comparison with a general population risk of about 1/800. Prenatal mosaicism is possible explanation of the increased risk. Presence of structural chromosome abnormality in one of the parents: Here the risk of an abnormal child is usually 20% or less, but it may be higher. Family history of some genetic defect that may be diagnosed or ruled out by biochemical or DNA analysis: Most of these disorders are caused by single-gene defects and have risks of 25% or 50% in sibs of affected children. Cases in which the parents have been diagnosed as carriers after a population screening test rather than after the birth of an affected child are also in this category. Even before DNA analysis entered the picture, numerous biochemical disorders could be identified prenatally, and DNA analysis has greatly increased the number. Family history of an X-linked disorder for which there is no specific prenatal diagnostic test: When there is no alternative method, the parents may use fetal sex determination to help them decide whether to continue or terminate the pregnancy. With the development of DNA analysis for prenatal diagnosis of X-linked disorders such as Duchenne muscular dystrophy and hemophilia A and B, first the fetal sex is determined, and then DNA analysis is performed if the fetus is male. Risk of a neural tube defect (NTD): Only first-and second-degree relatives of NTD patients are eligible for amniocentesis because of a significantly increased risk of having a child with an NTD, but many fetuses with open NTDs can now be detected by other tests.   第二节 分子诊断 应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出的或辅助临床诊断的技术，称为分子诊断（molecular diagnosis），又称为基因诊断（gene diagnosis）。基因诊断的材料应包括DNA、RNA和蛋白质，DNA用于分析基因的结构，RNA和蛋白质用于分析基因的功能。目前基因诊断的原理和技术不仅适用于遗传病，而且已广泛应用于感染性疾病、法医、肿瘤等方面。这些是分子生物学在临床应用方面迅速发展的一个领域。 目前发现的人类遗传性疾病中染色体病只占其中一小部分，大部分为基因病。生化分析技术因为个体发育阶段性、基因表达的组织特异性而不能检测所有的基因异常。由于所有细胞中基因组的组成完全一致（免疫球蛋白、T细胞受体基因和肿瘤细胞例外），所以基因诊断没有个体发育阶段性和基因表达的组织特异性，只要获得有核细胞，基因缺陷都可以检测。 一、分子诊断学的发展 自从1978年，美籍华裔科学家Yuet Wai Kan首次应用限制性酶切长度多态性（RFLP）技术检测出胎儿镰状细胞贫血（βS）以来，基因诊断技术得到了空前高速的发展。从分子生物学早期的核酸杂交到目前的基因芯片，手段不断丰富。从第一代遗传标志（RFLP）到第二代遗传标志（STR），信息量不断增加；而第三代遗传标志（SNP）已经浮出水面，它被认为是目前信息量最大的遗传标志，必将在基因诊断中发挥巨大的作用。 人类基因组计划为分子诊断的发展提供了一个更加广泛的空间，功能基因组学的研究将大大推动人类对自身基因（包括致病基因）的认识。1999年3月，美国医学委员会（ABMS）批准了美国医学遗传学委员会（ABMG）和美国病理学委员会（ABP）创立一项旨在推动美国分子诊断的认证资格培训计划：分子遗传病理学（MGP）。该计划要求MGP的地位必须等同于医学及人类遗传学和病理学，申请MGP培训的医师必须拥有MD或DO博士学位，并已获得医学专业委员会颁发的行医资格认证等。1999年11月，美国病理学会创办的《Journal of Molecular Diagonostics》杂志正式出版，标志着分子诊断的发展掀开了新的一页。 二、分子诊断的策略和常用技术 （一）基因诊断的策略 遗传性疾病发病的根本原因是组织细胞中行使生命基本功能的蛋白质的异常，而这种异常主要表现在四个方面：结构、种类、数量和消长时间。中心法则表明蛋白质结构最终由DNA序列所决定。因此DNA的检测是确定蛋白结构和种类的有效方法。目前的分子诊断（基因和蛋白的诊断）主要集中在结构和种类诊断上，也就是说进行基因突变的检测。广义的基因突变包括单碱基突变（缺失、插入、置换）、片段缺失、片段重复、易位和动态突变等结构性改变，基因组中基因的这些变化导致结构蛋白或酶的功能改变；也有些突变发生在基因的调控区域，扰乱或破坏了这些基因的表达。突变基因的检测必须在所检测的基因序列完全明了的情况下进行，然而目前许多致病基因结构还不清楚，还不能对这些基因直接检测，只能通过其他间接方法进行。 mRNA检测也是基因诊断的一个方面，主要用于基因表达（数量和消长时间）的检测，同时它还特别适用于内含子拼接不稳定的融合基因产物（如bcr-abl）或一些特大基因（如DMD）基因产物的检测。基因表达的检测还可以考虑检测蛋白质和酶的量与活性，以及代谢产物量的检测。 对致病基因已知、并且定位基本确定但其结构序列还不清楚的疾病，可以考虑采取基因连锁检测方法进行基因诊断。基因连锁检测是选择致病基因附近序列中的某些遗传标志进行的分析方法。所谓遗传标志是群体中存在多态性而遗传上遵循孟德尔规律的，同时不受环境影响而改变的特征物，如染色体上的某些结构、HLA类型以及特征性的DNA序列等。经典的连锁分析主要是使用限制性酶切片段长度多态性（RFLP）作为遗传标志。这种多态性在人群中广泛存在，并呈孟德尔式遗传。近年来发展起来的短片段串联重复序列（STR）和单核苷酸多态性（SNP）作为遗传标志，逐渐取代了RFLP。它们具有高度的多态杂合性，信息量明显大于RFLP，结合PCR技术，可以很方便的进行连锁分析。由于减数分裂时的交换，使连锁分析产生一定的误差，但事实表明，除个别情况外，一般染色体重组率所致错误率小于1%。因此连锁分析通常是可靠的，并且可以选取多个标记进行检测。 基因诊断除了应用于遗传病外，后天基因突变引起的疾病也可以进行，这方面最典型的例子就是肿瘤。虽然肿瘤的发病机理尚未完全明了，但人们可以初步认为肿瘤的发生是由于某些细胞基因突变而引起的细胞无限增殖。无论是抑癌基因发生突变还是癌基因发生突变，如果确定这些改变的发生，都有可能进行基因诊断；此外基因诊断技术也广泛地应用于病原体（细菌、病毒、寄生虫等）检测、个体识别、亲子关系判定、法医物证等方面。 （二）基因诊断的基本技术 从理论上说所有检测基因水平或结构的方法都应可用于基因诊断，这里简要介绍几种常用的基本技术。 1．核酸杂交　是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹杂交（Southern blot）、RNA印迹杂交（Northern blot）、点杂交和原位杂交。其基本过程包括下列几个步骤。 2．聚合酶链反应　核酸杂交反应是一对一的反应，即膜上有一个被检测分子时，相应就有一个标记的探针分子与它杂交。所以整个实验敏感性主要取决于标记探针的质量和杂交后的检测方法。在优化的条件下，核酸杂交可检测到pg水平的靶分子，约相当于106个分子。但是，在许多临床情况下，无法得到这样的样品量。这时可以用聚合酶链反应来扩增靶分子以特异性地增加靶分子量，达到提高敏感性的目的。 3．DNA测序　测定DNA的核苷酸序列是分析基因结构与功能关系的前提。从小片段重叠法到加减法、双脱氧链终止法、化学降解法、自动测序，DNA测序技术发展很快。目前在实验室手工测序常用Sanger双脱氧链终止法。Sanger法就是使用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸序列的方法。它要求使用一种单链的DNA模板或经变性的双链DNA模板和一种恰当的DNA合成引物。其基本原理是DNA聚合酶利用单链的DNA模板，合成出准确互补链，在合成时，某种dNTP换成了ddNTP（2′，3′-双脱氧核苷三磷酸），这时，DNA聚合酶使ddNTP渗入到寡核苷酸链的3′末端，导致无3′-OH的核苷酸无法继续与其它核苷酸连接而终止了DNA链的生长。双脱氧核苷酸的种类不同，掺入的位置不同，就造成了在不同的位置终止的长度不等的互补链。通过掺入的放射性核苷酸结合聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可读出模板DNA的互补链序列。 4．基因芯片技术　基因芯片技术是近年来发展十分迅速的大规模、高通量分子检测技术。其基本原理是核酸杂交，其基本过程是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，形成矩阵点。现在的技术可以做到在1cm2上排列成千上万个“点”。样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后按碱基配对原理进行杂交，再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号做出比较和检测，得出所要的信息。 基因芯片可以进行微量化、大规模、并行化、高度自动化地处理感兴趣的生物样品，精细地研究各种状态下分子结构变异，了解组织细胞基因表达情况。即可以检测基因的多态性，也能检测基因突变，特别适用于多个基因、多个位点的同时检测，大大节约了诊断时间。但目前基因芯片检测费用较高，还没有在临床上广泛使用。随着技术的成熟和费用的降低，临床诊断的前景十分广阔。 5．其它常用的技术　 （1）PCR-RFLP是将聚合酶链反应与RFLP方法结合的一种检测技术。由于DNA序列的差异，造成了内切酶位点的变化，或是新的酶切位点的产生；或是原酶切位点的消失等，通过酶切后电泳图谱的判断，达到确定检测结果。该方法包括①PCR。即利用一对或数对特异性引物，将目标DNA扩增；②酶切。即利用某些限制性内切酶消化PCR产物，如PCR产物中含有相应的酶切位点序列，DNA链则被切开；③电泳。即利用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶分离酶切后的PCR产物，根据电泳图谱判断结果。 如果某DNA序列已经全部确定，则可以通过计算机辅助设计特异性PCR引物；扩增DNA片断和进行酶切位点分析，该方法简便易行，精确度也很高。但是该方法也有一定的局限性，如果多态性位点的DNA序列没有相应的内切酶，则该方法不适用。 （2）PCR-ASO：ASO为等位基因特异性寡核苷酸（Allele-specific oligonucleotide，ASO）的简称。PCR-ASO是基于核酸杂交的一种方法，它使用只有几十个核苷酸的探针，检测被检DNA中的同源序列。由于探针比较短，当被检DNA序列与探针不完全互补，甚至只要有一个碱基的差异，杂交分子就不能稳定形成，因此该方法的灵敏度非常高，特异性也非常好。该方法包括①PCR。即利用一对或数对特异性引物，将目标DNA扩增；②杂交。即利用标记的ASO探针与PCR产物杂交，根据杂交信号进行HLA多态性判断。如果PCR产物中的序列与探针序列完全配对，则出现典型的杂交信号，如果不完全配对，杂交信号都将明显减弱甚至消失。通常进行ASO探针杂交时，选用一系列序列差异的探针，以求准确判定等位基因类型（图18-3）。 图18-3　ASO探针杂交原理示意图 应该说PCR-ASO方法本身并不复杂，但杂交过程耗时较多，不利于快速出结果。另外每一个探针检测范围只有几十个碱基，跨度太小，这些都是该方法的缺陷。 （3）PCR-SSCP：SSCP是单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism，SSCP)的缩写。其原理是当双链DNA变性为两条单链后，各自会在中性条件下形成各自特定的空间构象，因而在电泳时将在不同的位置上出现各自电泳条带。如果DNA序列发生变化，甚至只有一个碱基变化，空间构象也有可能发生变化，电泳条带也随之变化。也就是说在相同的条件下，当被检DNA电泳条带与已知序列的对照DNA电泳条带不一致时，可以认为被检DNA的序列与对照DNA不同（图18-4）。 图18-4 SSCP原理示意图 该方法包括①PCR。即利用一对或数对特异性引物，将目标DNA扩增；②变性。即将PCR产物在变性缓冲液中加热变性；③电泳。即将已变性的PCR产物加载到中性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，根据电泳条带的位置判断DNA序列是否发生变化。 三、分子诊断技术的应用 （一）基因诊断在遗传病中的应用 1．镰状细胞贫血的基因诊断　镰状细胞贫血的基因诊断原理在于它的血红蛋白中的(珠蛋白基因（( globin，(6）发生了突变，其谷氨酸残基（密码子GAG）变为缬氨酸（密码子GTG）。基于A(T的变换，改变了限制性内切酶的位点，因此在酶解正常人DNA和患者DNA后再用标记的(珠蛋白基因为探针作Southern杂交时，就会出现不同的DNA条带。限制性内切酶MstⅡ切割的序列是CCTNAGG（其中N是任何一种核苷酸），切割正常DNA产生1.1kb (珠蛋白的DNA片段；若切割患者DNA时，由于A(T破坏了MstⅡ的位点，便形成1.3kb (珠蛋白的DNA片段（图11-5）。 2．血友病A的基因诊断　甲型血友病是最常见的由遗传性凝血功能障碍所致的出血性疾病，表现为X连锁隐性遗传。该病的根源是凝血因子Ⅷ（FactorⅧ，FⅧ）基因的缺陷，其中大范围的基因重排（如缺失、插入和重复）只占5％，主要突变类型为碱基取代或少数碱基的缺失和插入，这些突变产物可能是不完整的、无活性的或不稳定的因子Ⅷ肽链，导致临床症状轻重不一。采用基因诊断方法可以检出携带者和进行早期产前检查，降低该病的发生率。由于FⅧ基因组织结构庞大，分子病理学改变复杂，对该基因的产前诊断可以通过RFLP连锁分析进行。在因子FⅧ基因内侧及旁侧有多组RFLP位点可供产前诊断。目前多采用PCR技术与RFLP相结合的方法。首先用PCR技术将包含突变DNA的片段扩增出来，然后用识别该位点的限制酶来酶解，电泳后直接检测多态性位点的状态。 （二）基因诊断在肿瘤中的应用 人类恶性肿瘤的演变过程复杂，是多步骤、多基因参与的分子事件，涉及多个癌基因的激活和抗癌基因（或称肿瘤抑制基因）的丢失。现以人大肠癌为例说明这一演变过程，进而提供基因诊断的依据。正常肠上皮细胞经腺瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级最终发展成为恶性肿瘤—大肠癌，并依其解剖部位分为结肠癌、直肠癌。在肠癌癌变的过程中存在抗癌基因FAP（family adenomatous polyposis）基因、DCC基因、p53基因的丢失，p53基因的突变、癌基因K-ras的点突变、C-myc的过量表达等现象。 1．ras基因突变的检测　ras基因突变的检测可采用PCR-ASO方法进行。已知ras基因突变的热点在12、13及61密码子，可人工合成的位于待测点两侧的引物，分别扩增含12、13及61位点的基因片段，然后将扩增产物结合在尼龙膜上分别与ras癌基因密码子12、13及61所有可能引起氨基酸改变的碱基突变寡核苷酸探针杂交。杂交后，经严格的洗膜，仅允许完全相配的杂交双链存在。探针结合处在X光胶片上呈阳性斑点，从而判断突变类型。 ras基因突变的检测还可以采用PCR-SSCP方法。其方法是首先将肿瘤细胞或正常细胞待测的ras基因进行扩增，以放射性寡核苷酸引物或［(-32P］dCTP作为底物标记扩增产物，在6％非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳后，放射自显影分析结果。已有报道用此法曾在66例腺癌标本中检出14例激活的K-ras基因。 DNA测序是检测ras癌基因点突变的最直接、最根本的方法。DNA测序的自动化，使ras基因的突变检测更为简便、准确。 2．p53基因的检测　近年来发现细胞基因组中存在肿瘤抑制基因。肿瘤抑制基因参与了细胞周期调控、信息传递、血管生成以及发育调控等过程。目前研究较多的抗癌基因有p53基因、Rb基因等十余种。 人的p53基因长度为20kb，定位于17号染色体，具有11个外显子，mRNA长度为2.5kb。该基因的表达产物是53000的核磷酸蛋白质，含有393个氨基酸。已有大量证据表明，p53基因的缺失、突变、失活是许多肿瘤发生的原因，这些肿瘤包括成骨肉瘤、肺癌、结（直）肠癌、神经纤维肉瘤。脑瘤、乳腺癌等。该基因的突变可引起蛋白质功能的突变，导致细胞转化或癌变。p53基因也是许多恶性肿瘤常见的基因损伤靶位，其结构改变与表达异常似乎是这些肿瘤发生的重要环节之一。 目前常用PCR法进行检测p53突变的热点是外显子5-8，一般可先选用外显子5-8的引物进行扩增，其后再进行突变位点的详尽分析，甚至测序。另一初步检测p53基因突变的方法为PCR-SSCP，然后测序。 （三）DNA分型 DNA分型也分子诊断的重要内容，特别是在研究检测HLA类型、T细胞受体类型等方面具有重要意义，而分型的结果对研究疾病关联的基因类型和疾病易感性基因等方面具有较大的价值。DNA分型的技术详见本节中分子诊断的策略和基本技术，DNA分型的应用参见本书第15章中关于HLA DNA分型的内容。 （四）帕金森病基因诊断的研究进展 基因诊断的目的不仅仅在于“诊断”，还为今后的治疗，特别是遗传物质缺陷性疾病的治疗打开通路。基因诊断与治疗的进展有赖于对疾病发病机理的研究成果，这也是后基因组计划的重要内容之一。这里介绍帕金森病（Parkinson's disease，PD）研究的进展，从这里对疾病基因研究的过程和进展可见一斑。 1．家系研究　国内外均有家族性PD的报道。我国正式报道的PD家系有10多个，从其报道的家系图谱分析，支持常染色体显现遗传，但外显率较低。应当说明家族性PD是用来描述与典型PD临床特征相似的一系列疾病。有些家族性病例符合PD的所有诊断标准，但有些家族病例的临床特征是不典型的，甚至不符合PD的诊断标准。后者是首先在日本报道的呈常染色体隐性遗传的少年型PD（AR-JP），以及迅速出现PD和痴呆的命名为桥脑-苍白球-黑质变性的一个家系。在这两个家系的病例中，黑质变性并不伴随Lewy体的形成。明确这些家系遗传缺陷的原因对了解黑质变性的分子机理有重要价值，因为临床和病理改变的差异并不能排除其发病机理有共同之处。显然，研究那些与散发性PD临床和病理改变相似的家系对揭示散发性PD的病因更有价值。 2．连锁基因的研究　近年来在基因及遗传标志与PD的连锁研究方面取得了一系列进展，为研究其发病机制及其分子诊断奠定了基础。 （1）4号染色体相连锁的呈常染色体显性遗传的PD（PARKI）：1996年Polymeropoulos等对一个呈常染色体显性遗传的意大利PD大家系进行研究，应用微卫星连锁技术将其致病基因定位在4q21-q23。这一家系有典型的PD临床特征，只是发病年龄相对较早（平均46岁，散发性PD约为59.7岁），从发病到死亡的时间短，患者中出现痴呆的多。病理改变有黑质神经元变性，脑干神经核有Lewy体形成。继之，对这一PD家系和3个希腊籍呈常染色体显性遗传的早发性PD家系的进一步研究发现，这些PD患者在位于4q21-q23区间的Q-synuclein基因均有一个点突变（G209A），这一突变导致a-synuclein蛋白发生一个氨基酸的转换（Ala53Thr），破坏了α螺旋，导致蛋白沉积。根据目前发表的单倍型资料尚不能肯定这一突变在所有这些PD家系中存在相同的遗传背景。但是结合历史的发展，由于意大利南部和希腊西部毗邻，这些PD家系存在一个共同的基因突变是可能的。最近Kruger等对德国一个小的PD家系的研究发现a-synuclein基因的另一个突变（Ala39Pro），进一步支持该基因突变可能直接参与某些家族性PD的发病。 为了评价a-synuclein基因突变与其他家族性PD发病的关系，国外进行了一系列研究。Gasser等采用跨越PD1位点的多态标记物对13个呈常染色体显性遗传的多病例PD家系进行连锁分析，结果只有2个PD家系显示LOD积分弱阳性。继之对所有这些PD家系进行的a-synuclein基因的核苷酸序列分析也未发现在其编码区有任何特异性突变。Vaushan等对其他PD家系的研究也得到同样的结果。提示a-synuclein基因突变可能是家族性PD一个罕见的病因。有趣的是a-synuclein似乎是Lewy体的重要组分。推测基因突变造成的a-synuclein蛋白结构的改变可能会导致蛋白的异常加工和积聚，最终导致Lewy体的形成以及多巴胺神经元的死亡。 （2）6号染色体相连锁的呈常染色体隐性遗传的少年型PD（PARK2）：早发性PD定义为发病年龄在40岁以前，而少年型PD定义为发病年龄在20岁以前。但是，发病年龄并不是一个可靠的鉴别标准，因为具有典型和不典型临床及病理改变的PD患者在两个年龄组内均可见到。一些家族性早发病例（在30多岁和40多岁发病）有典型的Lewy体并呈显性遗传方式，另一些（通常在20多岁和30多岁发病）则呈隐性遗传方式。后者首先在日本报道，称为AR-JP，病理特征为选择性的黑质多巴胺神经严重缺失，但无Lewy体形成。这些患者表现为L-dopa反应性的PD综合征，较早出现严重的L-dopa诱导的运动障碍和运动波动，符合早发性PD的临床特征。 AR-JP致病基因定位在6q25.2-27，被命名为parkin基因，其结构有一部分像ubiquitin。后者运送有缺陷的或已失活的蛋白到蛋白体，再将其分解。parkin基因突变似乎是一种丧失其正常功能的突变，与隐性遗传方式相一致。Parkin蛋白中ubiquitin样结构的缺陷可能会影响蛋白的降解，导致毒性蛋白的积聚。AR-JP除在日本有报道外，最近在美国、欧洲、中东和北非也有报道，并在欧洲和北非的家系中发现有parkin基因的纯合子缺失。新近Leroy等对1个希腊早发PD家系的研究发现，有两个患者存在parkin基因第5、6、7号外显子的缺失，提示parkin基因突变也可能与其他的早发性PD的发病有关。 （3）第2号染色体相连锁的呈常染色体显性遗传的PD（PARK3）：最近Gasser等将另一个呈常染色体显性遗传并有Lewy体病理改变的家族性PD（PARK3）的致病基因定位在2p13，但尚未明确具体的致病基因。这些家族性PD的临床特征与散发性PD相似，发病年龄平均为59岁。所有6个PD家系的最大点LOD值为3．96，其中4个PD家系显示LOD值阳性。有2个PD家系的突变外显率约为40％，提示其在散发性PD的发病中也可能起一定作用。所有这些PD家系均来自德国北部和丹麦南部一个相对狭小的地区，并且在连锁区内的7个标志物有一个共同的单倍型，提示这些PD家系可能存在一个共同的发病基础。 3．散发性PD遗传易感性的研究　没有明确家族史的散发性PD并不符合孟德尔遗传方式。但是，其一级亲属患病的相对危险度是对照组的2～3倍。因此，推测遗传易感性与内外源性毒素的相互作用是导致其发病的原因。 遗传和环境因素相互作用的机理可能与解毒酶基因缺陷有关。研究这些解毒酶基因变异与散发性PD易感性的关系是国外PD研究的一个热点。过去，研究的焦点集中在异哇胍4-羟化酶。初期的研究表明，该酶基因（CYP2D6）的特定突变（CYP2D6B）可能导致PD易感性的增高。 PD其它的易感基因包括多巴胺转运载体、多巴胺受体和N-甲基转移酶等。但是已有的研究结果大多缺乏可重复性。其原因可能为抽样误差造成的假阳性结果、或是样本量相对较小、或是遗传异质性、或是疾病异质性所致，对此尚需多中心大样本的研究才能得出定论。 上述对PD的研究提示，遗传病的研究与基因诊断是一个非常艰巨的工作，即使同一种遗传病，也会存在着不同的遗传机制与基因功能的改变。所以，遗传病基因诊断用于临床时，对一个病例的诊断往往需要通过多种不同的基因诊断方法，诊断基因位点，并且有时也可能会得到阴性结果却又不能否认病例病情的存在。 四、疾病分子诊断的展望 任何疾病的发生都是遗传物质和环境因素相互作用的结果。人类疾病基因和相关基因的定位、分离和克隆，为现代医学带来了空前的机遇。一般而言，某一致病基因被发现后，几个月内即可用于诊断，而疾病相关基因一般也只需要2～3年就可被用于评估患病风险。疾病基因突变谱，尤其是SNP图谱的建立，势必为分子诊断提供强有力的工具。 分子诊断的发展趋势是：一方面应用现有的DNA分折技术不断地扩大可进行分子诊断的疾病的病种；另一方面更突出地加强对疾病发病的分子基础的研究。这不仅表现在DNA水平上阐明疾病的分子缺陷，而且进一步探索在转录和翻译水平上疾病发生的分子病理学。因此，分子诊断应分为DNA诊断和RNA诊断两部分。DNA诊断分析静态的基因结构，RNA诊断检测动态的基因功能。 未来的分子诊断将朝着三个主要方向发展；①胚胎着床前诊断—在囊胚8个细胞期，通过对其中一个细胞的染色体核型分折和原位杂交，从而将人类的遗传缺陷控制在最早期阶段；②母体外周血中胎儿细胞分析技术；③对常见病、多发病如心血管系统疾病、糖尿病、精神疾病、神经系统疾病、恶性肿瘤、哮喘、近视眼等进行分子诊断。 分子诊断是伴随遗传学理论和细胞分子生物学理论和技术迅速发展而产生的一种新型诊断技术。在分子诊断技术发展历程中，可以预见，提高自动化程度、提高稳定性、可靠性，以及简易快速、低成本将是发展方向，最终使人类直接受益。 五、疾病分子诊断所带来的问题 分子诊断存在的问题主要是其准确性、稳定性和复杂性。仅以女性常见的乳腺癌为例，1996年美国的Myriad Cenetics公司向市场推出了检测乳腺癌易感基因DRCA1和BRCA2携带者的试剂盒BRCA Analysis，深受欢迎。但实践发现，这种预测并非万无一失，研究表明，携带乳腺癌基因并有家族史的女性，罹患乳腺癌的风险最多只有50％，而不是通常认为的85％。另外，分子诊断可能引起的基因歧视问题不容忽视，一个人的基因组信息，应属个人隐私，其中的致病基因或易感基因查出后，其结果可能被泄露出去，如果没有相应的法律加以保护，被检对象就可能在就业、婚姻、保险等方面受到歧视。随着分子诊断的广泛应用和社会制度的不断完善，相信这些问题会得到解决。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（谭湘陵）