第十九章 遗传病的治疗 医学遗传学的发展使临床诊断和临床检测技术迅速提高，人们对人类遗传病的研究已经取得了许多重要成果。特别是重组DNA技术在医学中的广泛应用，遗传病的治疗有了突破性的进展，已从传统的手术治疗，饮食疗法，药物疗法等跨入了基因治疗，为遗传病根治开辟了广阔的前景。 第一节 遗传病治疗的原则 一、遗传病治疗效果的评估 由于不同类型的遗传病的发病基础和机制不同，故所采用的治疗方法也不一样。对于单基因病特别是先天性代谢病的治疗按禁其所忌，去其所余和补其所缺的原则进行，即主要采用内科疗法；而多基因病往往是一些较常见的多发病及某些先天畸形，在其发病中环境因素起一定的作用，故利用药物治疗或外科手术治疗可以收到较好的效果。染色体病则是令人棘手的一类遗传病，目前不仅无法根治，改善症状也很困难。只有少数性染色体病如Klinefelter综合征在发育早期如使用睾丸酮进行治疗，可改善患者的第二特征；对于真两性畸形则可进行外科手术等。总体而言，遗传缺陷清楚的遗传病治疗效果好。有近80%的遗传病因或发病机制尚不完全清楚。即使像苯丙酮尿症这种疾病，经过多年的研究，人们已经知道了它的遗传缺陷所在，也知道了苯丙酮酸在体内堆积而对脑的发育和功能产生不良反应，但究竟是如何产生不良反应的，所知还是很少，所以对苯丙酮尿症的彻底治疗还是会产生不利的影响。统计分析表明：遗传缺陷明朗的遗传病比遗传缺陷不明了的遗传病的治疗效果好。 二、遗传病疗效的长期评估 遗传病的治疗与一般的疾病治疗的疗效不同，遗传病治疗的初期效果明显，但长期观察则达不到预期的目的。例如：前述的苯丙酮尿症可以在发病的早期（或症状前）通过饮食控制而进行预防性治疗，患者可以因此不会发生严重的智能落后，并具有正常或接近正常的智商，从近期疗效看，治疗是成功的；但随着年龄的增长，这类患者还是会表现或轻或重的学习障碍，行为紊乱，故从远期疗效来看，这种治疗又是不成功的，至少不十分成功。再如，女性半乳糖血症患者在早期的“成功”治疗后，到青春期则发现其卵巢功能早已丧失（半乳糖毒性作用）；胱氨酸病也是一样，由于胱氨酸从溶酶体排出缺陷，使胱氨酸在溶酶体内堆积，使肾功能衰竭。肾移植可以使胱氨酸病达到治疗的目的，但长期观察的结果，患者还是常因为脑组织中甲状腺组织中溶酶体内胱氨酸堆积导致功能衰竭而死亡；再如，一些遗传病的短期治疗是有效的，长期治疗则会产生一些不良反应。珠蛋白生成障碍性贫血患者经输血治疗后会使患者铁过量（iron overload）；用凝血因子治疗血友病时，患者会因此产生针对输入的凝血因子的抗体；青霉胺是一种重金属螯合剂，可用来治疗肝豆状变性这类铜中毒性遗传病，但长期用药，可能会对患者的生殖系统产生不良反应。总之，由于遗传病的特殊性，其治疗的效果需要有一个十分谨慎而长期的评价。 此外，众多多基因遗传病的治疗应重视环境条件。对于多基因遗传病来说，遗传因素和环境因素是发病的共同病因；因此在多基因病的治疗中既要考虑遗传条件，也要考虑到环境条件；而在目前状态下，环境条件的改善是多基因遗传病治疗中更为重要的一部分。如哮喘病人，过敏病人对过敏原的去除；高血压病患者，糖尿病患者对饮食的控制等等。 三、杂合子和症状前患者的治疗 对尚未出现临床表现的杂合子，症状前患者是否应该实施预防性的治疗措施不能一概而论。不少遗传病的杂合子也会表现出临床症状，严重者可致死；症状前患者则是在一定条件下会发病者，对他们治疗既取决于这类疾病的严重程度，治疗的近期、远期效果，药物不良反应大小，也取决于人们对这种问题的道德取向，不必一概而论，需要做认真细致的考虑再作决定。 四、遗传病治疗的策略 从基因突变到临床表现的出现，这其间涉及到许多过程，每一过程都可能成为遗传病治疗的着眼点。遗传病治疗包括：①针对突变基因的体细胞基因的修饰与改善；②针对突变基因转录的基因表达调控；③蛋白质功能的改善；④在代谢水平上对代谢底物或产物的控制；⑤临床水平的内、外科治疗以及心理治疗等。 第二节 传统的遗传病的治疗方法 一、手术治疗 当遗传病发展到已出现各种临床症状尤其是器官组织已出现了损伤，应用外科手术的方法对病损器官进行切除、修补或替换。可有效地减轻或改善症状。手术疗法主要包括手术矫正和器官移植两方面。 （一）手术矫正 外科手术矫正是手术治疗中的主要手段。对遗传病所造成的畸形可用手术进行矫正或修补，例如修补和缝合唇裂、腭裂，矫正先天性心脏畸形及两性畸形等。对某些先天性代谢病可以手术的方法调整体内某物质的生化水平。例如高脂蛋白血症Ⅱa型患者进行回肠-空肠旁路手术后，肠道中胆固醇吸收减少，使患者体内胆固醇水平下降。 （二）器官和组织移植 根据遗传病患者受累器官或组织的不同情况，结合免疫学研究与技术的不断深入，免疫排斥问题得到控制，有针对性地进行组织或器官的移植是治疗某些遗传病的有效方法。例如，对家族性多囊肾，遗传性肾炎等进行肾移植，肾移植也是迄今最成功的器官移植；对重型β地中海贫血和某些遗传性免疫缺陷患者施行骨髓移植术；对胰岛素依赖性糖尿病进行胰岛细胞移植术；对遗传性角膜萎缩症患者施行角膜移植术以及对粘多糖代谢障碍所致的粘多糖病患者实施白细胞或成纤维细胞移植等都可以收到一定的治疗效果。 由于成功的同种异体移植可以持续提供所缺乏的酶或蛋白质，因此，对于某些先天性代谢病进行器官移植而达到治疗目的越来越受到重视。例如，α1-抗胰蛋白酶缺乏症患者在进行肝移植治疗后，可使血中的α1-抗胰蛋白酶达到正常水平；通过肾移植可以治疗胱氨酸尿症。由于移植物能提供正常的酶原，所以这种移植又称酶移植（enzyme transplantation）。 对患者有某些遗传病的胎儿进行宫内的手术治疗是遗传病治疗领域的一种有意义的实践。例如对常导致智力障碍的脑积水症胎儿实施子宫内脑室引流术，将过多的脑积液通过塑料导管引至羊膜腔，可防止胎儿的脑组织萎缩；对于先天性尿道狭窄或尿道梗阻的胎儿可将孕妇的子宫切开，取出胎儿进行尿道修复手术，然后再放回子宫继续发育，这样可防止胎儿出现肾功能不全以及因胎尿不足，羊水量少，胎儿吞入的羊水不够所致的肺发育不全。如果在胎儿出生后再进行这类手术则患儿肾、肺等脏器将已经出现严重的功能障碍。 二、药物治疗 药物治疗可以在胎儿出生前进行，这时可以大幅度地减轻胎儿出生后的遗传病症状。例如，产前诊断如确诊羊水中甲基丙二酸尿症，该病会造成新生儿发育迟缓和酸中毒，在出生前和出生后给母体和患儿注射大量的维生素B12，能使胎儿或婴儿得到正常发育。此外，对确诊为维生素B2依赖型癫痫的胎儿，给孕妇服用维生素B2，胎儿出生后可不出现癫痫。 对于某些遗传病，采用症状前药物治疗也可以预防遗传病的病症发生而达到治疗的效果。如发现新生儿甲状腺功能低下，可给予甲状腺素制剂终生服用，以防止其发生智能和体格发育障碍。对于苯丙酮尿症、枫糖尿症、同型胱氨酸尿症或半乳糖血症等遗传病，如能通过筛查在症状出现前做出诊断，及时给予治疗，可获得最佳效果。 若在出生后，当遗传病发展到各种症状已经出现，机体器官已经受到损害，这时治疗的作用就仅限于对症。药物治疗的原则可以概括为“去其所余，补其所缺”。 （一）去其所余 对于一些因酶促反应障碍，导致体内贮积过多的代谢产物，可使用各种理化方法将过多的毒物排除或抑制其生成，使患者的症状得到明显的改善，称为去余。主要方法包括： 1．应用螯合剂　肝豆状核变性（Wilson病）是一种铜代谢障碍性疾病，应用青霉胺与铜离子能形成螯合物的原理，给患者服用青霉胺，可除去患者体内细胞中堆积的铜离子。地中海贫血患者因长期输血，易发生含铁血黄素沉积症，使用去铁胺B与铁蛋白形成螯合物可去除多余的铁。 2．应用促排泄剂　对于家族性高胆固醇血症患者可口服消胆胺（cholestyramine）治疗。消胆胺是一种不被肠道吸收的阴离子交换树脂，可结合肠道中的胆酸排出体外，从而阻止了胆酸的再吸收，并可促使胆固醇更多地转化为胆酸排出体外，使患者血中胆固醇水平降低。 3．利用代谢抑制剂　由于酶活性过高所造成的生产过剩病，可用代谢抑制剂抑制酶活性，以降低代谢率。例如，用别嘌呤醇（allopurinol）抑制黄嘌呤氧化酶，可减少体内尿酸的形成，可用于治疗原发性痛风和自毁容貌综合症（Lesch Nyhan综合症）。 4．血浆置换或血浆过滤　血浆置换（plasmapheresis）可除去大量含有毒物的血液，此法已成功应用于重型高胆固醇血症的治疗。溶酶体贮积病及某些遗传性溶血性贫血的患者，亦可通过血浆置换的方法得到治疗。血浆过滤（plasmafilter）是将患者的血液引入含有特定的亲合剂容器内，由于亲和结合剂与血浆中“毒物”选择性结合后不能通过回输滤器，而使患者的血液得到清理，在将血液重新输入患者体内后，获得治疗效果。例如，治疗家族性高胆固醇血症，将患者的血液引入含肝素-琼脂糖小球和氯化钙的输血瓶内混匀，使患者血中的低密度脂蛋白（LDL）与肝素等形成难以通过滤器的不溶性复合物，当回输时不能通过滤器进入患者体内，可使家族性高胆固醇血症患者血中胆固醇水平下降50%，疗效显著。 5．平衡清除（equilibrium depletion）法：对于某些溶酶体贮积症，由于其沉积物可弥散入血，并保持血与组织之间的动态平衡。如果把一定的酶制剂注入血液以清除底物，则平衡被打破，组织中沉积物可不断进入血液而被清除，周而复始，以达到逐渐去除“毒物”的目的。 （二）补其所缺 对于某些因X染色体畸变所引起的女性疾病，可以补充雌激素，使患者的第二性征得到发育，也可以改善患者的体格发育。垂体性侏儒患者可给予生长激素治疗。先天性肾上腺皮质增生症患者，可用类固醇激素予以治疗；糖尿病患者注射胰岛素等均可使症状得到明显的改善。但这种补充常需终生进行才能维持疗效。 对有些遗传病是因为某些酶缺乏而不能形成机体所必需的代谢产物，如给予补充，即可使症状得到明显的改善，达到治疗目的，即称补缺。例如，先天性无丙种球蛋白血症患者，给予丙种球蛋白制剂，可使感染次数明显减少；乳清酸尿症患者，因体内缺乏尿苷而引起贫血、体格和智能发育障碍，如果给予尿苷治疗，症状即可得到缓解。 （三）酶疗法　 遗传性代谢病通常是由于基因突变造成酶的缺失或活性降低，可用酶诱导和酶补充的方法进行治疗。 1．酶诱导治疗　在某些情况下，酶活性不足不是结构基因的缺失，而是其表达功能“关闭”，可使用药物、激素和营养物质使其“开启”，诱导其合成相应的酶。例如新生儿非溶血性高胆红素I型（Gilbert综合征）是常染色体显性遗传病，患者因肝细胞内缺乏葡萄糖醛酸尿苷转移酶，胆红素在血中滞留而导致黄疸，消化不良等症状，苯巴比妥能诱导肝细胞滑面内质网合成该酶，所以给予患者苯巴比妥治疗，即可使症状消失。雄激素能诱导α1-抗胰蛋白酶的合成，因而可应用于α1-抗胰蛋白酶缺乏症的治疗。 2．酶补充疗法　给患者体内输入纯化酶制剂是酶补充疗法的重要途径。如给脑苷脂病(Gaucher病)患者注射β-葡萄糖苷酶制剂，可使患者肝和血液中的脑苷脂含量降低，使症状缓解；对严重的α1-抗胰蛋白酶缺乏症患者每周用4g强化的α1-抗胰蛋白酶静脉注射，连用4周后便可获得满意的效果。用从人胎盘提取的α-半乳糖苷酶A治疗Fabry病也可取得一定的治疗疗效。 在临床上很多情况下，直接输入酶制剂，往往受到机体免疫功能的作用而被破坏，因而不能有效地发挥作用。为了降低外源酶在体内的破坏，延长酶作用的半衰期，目前采用将纯化酶制剂装入载体后再输入给患者的办法。载体容易以胞吞作用通过细胞膜进入细胞，载体所带的酶逐渐释放，发挥治疗作用，提高疗效。常用的载体是红细胞胞影和脂质体（liposome）。 目前，应用酶受体介导分子识别法（receptor-mediated molecular recognized process）补充酶已经取得临床疗效。此法是把所用的酶进行一定的改造，用靶细胞表面特殊受体的抗体包裹，注入体内后，更易为靶细胞的某些结合部位所识别并与之特异性结合。例如，治疗Ⅱ型糖原沉积病，可使α-糖苷酶与LDL结合，把酶引入肝外有LDL受体的细胞，取得了治疗效果。 （四）维生素疗法 有些遗传代谢病是酶反应辅助因子（如维生素）合成不足，或者是缺乏的酶与维生素辅助因子的亲和力降低，因此通过给予相应的维生素可以纠正代谢异常。例如，叶酸可以治疗先天性叶酸吸收不良和同型胱氨酸尿症；生物素可以用于治疗混合型羧化酶缺乏症和丙酸血症等。近年来，在临床上应用维生素C治疗因线粒体基因突变引起的心肌病有一定的疗效。 三、饮食疗法 饮食疗法治疗遗传病的原则是禁其所忌，即对因酶缺乏而造成的底物或中间产物堆积的患者，制定特殊的食谱或配以药物，以控制底物或中间产物的摄入，减少代谢产物的堆积，达到治疗的目的。 （一）产前治疗 现代医学遗传学技术已经根据系谱分析和产前诊断确诊多种遗传病胎儿，有些遗传病可以在其母亲怀孕期间就进行饮食治疗，使患儿症状得到改善。例如遗传病饮食治疗第一个获得成功的例子是对患有半乳糖血症风险的胎儿，在孕妇的饮食中限制乳糖和半乳糖的摄入量而代以其他的水解蛋白（如大豆水解蛋白），胎儿出生后再禁用人乳和牛乳喂养，患儿会得到正常发育。 （二）现症患者治疗 1953年，Bickle等首次用低苯丙氨酸饮食法治疗苯丙酮尿症患儿，治疗后患儿体内苯丙氨酸明显减少，症状得到缓解。现在经改良已有商品化的低苯丙氨酸奶粉出售，如果在出生后，立即给患儿服用这种奶粉，患儿就不会出现智力低下等症状。随着患儿年龄的增大，饮食治疗的效果就越来越差，所以要求早诊断，早治疗。目前，针对不同的代谢病已设计出100多种奶粉和食谱。 减少患者对所忌物质的吸收是饮食疗法的另一条途径，亦可减轻症状的出现，而且更易被接受。例如，在苯丙酮尿症患儿常规进食后，让其服用苯丙氨酸氨基水解酶的胶囊，这种酶在肠内释放后，可将食物消化后形成的苯丙氨酸转化成苯丙烯酸，使苯丙氨酸在未被肠道吸收前即被选择性清除；又如给家族性高胆固醇血症患者服用糠麸，也可减少肠道对胆固醇的吸收，延缓和减轻动脉粥样硬化等症状的形成。 第三节 基因治疗 基因治疗（gene therapy）作为治疗疾病的一种新手段，正愈来愈受到人们的重视和关注。所谓基因治疗就是运用重组DNA技术，将具有正常基因及其表达所需的序列导入到病变细胞或体细胞中，以替代或补偿缺陷基因的功能，或抑制基因的过度表达，从而达到治疗遗传性或获得性疾病的目的。 一、基因治疗的策略 根据宿主病变的不同，基因治疗的策略也不同，概括起来主要有下列几种： （一）基因修正 基因修正（gene correction）指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。但目前在技术上还无法做到。因为要在人基因组的某个特异部位上进行重组是一个非常复杂的过程。即使在不太复杂的模型系统中进行定位重组也不容易实现。然而原位修复的方法无疑是进行基因治疗最理想的途径和目的。 （二）基因替代 基因替代（gene replacement）指去除整个变异基因，用有功能的正常基因取代之，使致病基因得到永久地更正。传统上所谓基因治疗实际上就是指基因替代疗法，就像外科移植手术一样。 （三）基因增强 基因增强（gene augmentation）指将目的基因导入病变细胞或其他细胞，目的基因的表达产物可以补偿缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。近十年来已经发展了许多有效的方法可将目的基因导入真核细胞并获得表达，因而是目前较为成熟的方法。这一方案最适宜隐性单基因疾病的治疗。 （四）基因抑制和（或）基因失活 导入外源基因去干扰、抑制有害的基因表达。例如，向肿瘤细胞内导入肿瘤抑制基因（如Rb或p53），以抑制癌基因的异常表达。 此外利用反义技术（antisense technology）封闭某些特定基因的表达，以达到抑制有害基因表达的目的。反义技术是反义核酸（RNA或DNA）技术，ribozyme技术及反义ribozyme的总称。如反义RNA被誉为“基因封条”，能封闭mRNA，抑制基因的表达。再如ribozyme实际上也是一种反义RNA，与靶细胞的mRNA结合后，还能切割杂交分子，使之断裂，所以可以封闭或抑制某一基因所编码的特定蛋白质。这一新技术已被广泛用于肿瘤和病毒性疾病（如艾滋病）等的基因治疗研究中。 二、基因治疗的种类 基因治疗根据靶细胞的类型可分为生殖细胞基因治疗和体细胞基因治疗。从理论上讲，将受精卵早期胚胎细胞作为目标进行生殖细胞的基因治疗是可行的。但由于受精卵或早期胚胎细胞的遗传改变势必影响后代，伦理学障碍和技术上的困难使生殖细胞治疗目前仍为禁区。体外受精的发展也许可以推动人类生殖细胞基因治疗的研究。体细胞基因治疗只涉及体细胞的遗传转变，不影响下一代，现已被广泛接受作为严重疾病的治疗方法之一，在现代伦理道德上是可行的。方法上易于施行，而且已取得了可喜的成果。 基因转移是基因治疗的关键和基础。基因转移的途径有两类：一类是in vivo，称为直接活体转移；另一类为ex vivo，称为回体转移。前者指将含外源基因的重组病毒、脂质体或裸露的DNA直接导入体内。后者指外源基因克隆至一个合适的载体，首先导入体外培养的自体或异体（有特定条件）的细胞，经筛选后将能表达外源基因的受体细胞重新输回受试者体内。ex vivo法比较经典、安全，而且效果较易控制，但是步骤多、技术复杂难度大、不容易推广；in vivo法操作简便、容易推广，但尚不成熟，存在疗效短、免疫排斥及安全性等问题，它是基因转移研究的方向，只有in vivo基因转移方法成熟了，基因治疗才能真正走向临床。 对于遗传病而言，理想的基因治疗是将遗传物质高效率转移到个体细胞中，并且能整合到细胞基因组中，在细胞中长期表达。但是目前的基因转移方法很难满足理想基因转移方法的全部要求，因此探索理想的基因转移方法是基因治疗的一项重要内容。基因转移方法可分为物理、化学和生物学等方法。 三、适于基因治疗的遗传病 常被选择的，已经在临床上经过基因治疗获得疗效的少数几种疾病，如ADA、血友病B、家族性高胆固醇血症和囊性纤维变性等，尚有一类作为基因治疗候选疾病，如PKU，半乳糖血症、Gaucher病，α-抗胰蛋白酶血症等。对于进行成功的基因治疗来说，必要条件是：①选择合适的疾病；②掌握该病分子缺陷的本质；③矫正遗传病的治疗（或正常）基因得到克隆；④克隆基因的有效表达；⑤克隆基因的有效调节；⑥可利用的动物模型。 Minimal Requirement for Gene Transfer Therapy of A Genetic Disorder  Identification of the affected locus. A complementary DNA (cDNA) clone of the gene. A substantial disease burden and a favorable risk-benefit ratio in comparison with alternative therapy. Sufficient knowledge of the biochemical basis of the disease to be confident that the gene transfer is likely to correct the biochemical pathology and to prevent or reverse critical phenotypic abnormalities. An appropriate target cell with sufficiently defined biology and, ideally, a long half-life or good replicative potential in vivo. 6．Adequate data from cultured cell and animal studies to suggest that the vector, gene construct, and target cell are suitable.   对于某一疾病进行基因治疗的价值需要进行几方面的估价：①人群中的发病率；②疾病对病人的危害性；③患者对家庭和社会的影响；④其它治疗方面的可用性。 总之，开展基因治疗有待克服的问题是：把足够的治疗（外源）性基因导入合适的靶组织或靶细胞，外源基因的表达调节和建立合适的动物模型。人类基因组计划的成果和对一些疾病生化及分子生物学基础的阐明，必将大大推动基因治疗的开展。基因治疗除用于上述遗传病外，对于癌症、心血管病、呼吸疾病、创伤愈合、神经性疾病等方面具有不可估量的应用前景。 四、转基因治疗的技术考虑 （一）靶细胞选择 转基因治疗中的靶细胞选用应该是在体内能保持相当长的寿命或者具有分裂能力的细胞，这样才能使被转入的基因能有效地、长期地发挥“治疗”作用。因此干细胞、前体细胞都是理想的转基因治疗靶细胞。以目前的观点看，骨髓细胞是惟一满足以上标准的靶细胞，而骨髓的抽取、体外培养、再植入等所涉及的技术都已成熟；另一方面，骨髓细胞还构成了许多组织细胞（如单核巨噬细胞）的前体，因此，不仅一些累及血液系统的疾病如ADA缺乏症、珠蛋白生成障碍性贫血、镰状细胞贫血、CGD等以骨髓细胞作为靶细胞，而且一些非血液系统疾病如苯丙酮尿症、溶酶体贮积病等也都以此作为靶细胞。除了骨髓以外，肝细胞、神经细胞、内皮细胞、肌细胞也可作为靶细胞来研究或实施转基因治疗。 （二）载体选择 目前用于转基因的载体有许多，最常用的有质粒、病毒载体。在选择载体时，需要考虑的是载体对机体的毒性、载体所携带的转录启动子启动转录的效率、载体对靶细胞的转染效率等。为了能够携带一些较大的基因（如DNA基因），近年来也探索了一些用较大的质粒（如人工酵母染色体：YAC）来实现大Kb基因的转染。 （三）转基因过程中注意事项 转基因过程中应注意：①必须考虑到被转基因在靶细胞中具有适当的表达效率。尽管在某些遗传病，正常基因2%～5%的表达量就可能不会发病，但像地中海贫血等疾病则需要较高的表达水平；②被转基因的表达必须受到严格的调控，做到这一点虽然很难，但在某些疾病，过少的基因表达不能达到治疗目的，而过多的表达又会引起不良反应，因此，这就需要严格的体外试验和动物试验；③大片段基因的转染以及不分裂细胞的转染都需要特别的考虑，否则难以达到预期效果。 五、基因治疗的临床应用 迄今为止，只有20种遗传病被列为基因治疗的主要对象，其中部分疾病研究已进入了临床试验阶段（表19-1）。 表19-1 目前临床试用的基因治疗遗传性疾病 疾 病 传递的基因或产物 靶细胞或组织 载 体  α-抗胰蛋白酶缺乏症 α-抗胰蛋白酶 呼吸道 脂质体  慢性肉芽肿 P47PHoX 骨髓细胞 逆转录病毒  囊性纤维化 囊性纤维化跨膜 调节蛋白 呼吸道 腺病毒、脂质 体腺伴随病毒  家族性高胆固醇血症 低密度脂蛋白受体 肝细胞 逆转录病毒  范可尼综合征 互补组C基因 造血祖细胞 逆转录病毒  高雪病 葡糖脑苷脂酶 周围血细胞或造血干细胞 逆转录病毒  享特综合征 艾杜糖醛酸-2-硫酸 淋巴细胞 逆转录病毒  腺苷脱氨酶缺乏引起的免疫缺陷病 腺苷脱氨酶 淋巴细胞 逆转录病毒   （一）遗传病 1．腺苷脱氨酶（adenylate deaminase，ADA）缺乏症　这是一种AR病，因ADA缺乏，致脱氨腺苷酸增多，改变了甲基化的能力，产生毒性反应，患者T淋巴细胞受损，引起反复感染等症状。 Anderson等提出了一项关于ADA缺乏症的临床基因治疗方案，该方案得到了NIH（美国国家卫生研究院）重组DNA咨询委员会（RAC）批准。具体内容是：先分离病人外围血T淋巴细胞，在体外培养；在培养时，用IL-2等促细胞生长因子刺激它生长，一旦T淋巴细胞分裂后就用含正常ADA基因的逆转录病毒载体LASN导入这种细胞，然后回输病人，以达到用正常的ADA基因替代有缺陷的ADA基因的目的，实现基因治疗（图19-1）。 图19-1 ADA基因治疗中应用的ADA转移和表达载体结构（LASA） ADA示ADA基因的CDNA；NEO示新霉素抗性基因；（A）n示多聚腺苷酸；ψ+示包装信号；SV示SV40启动子和增强子 该方案分别于1990年和1991年，对两例ADA缺乏症女孩进行临床基因治疗。第一个病人在10.5月内接受了7次基因治疗，第二个女孩接受了11次基因治疗；经ADA基因治疗的这两名患者，未见明显的副作用，导入的正常ADA基因已表达，ADA水平已由原来的相当于正常人的1%上升至25%。病孩由原来行动困难到能够上学。这一实例表明了遗传病的基因治疗首次获得成功，足以说明基因治疗是可行的。 2．血友病B　本病是XR遗传病，病人因子Ⅸ缺乏，基因定位于Xq26.3～q27.2。主要临床特征是易出血，凝血时间长，外伤后常出血不止。发病率1/3万。 我国复旦大学应用逆转录病毒载体转移因子Ⅸ基因到培养的中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中，得到了较好的表达。1990年又将该基因转移至病人皮肤成纤维细胞中，产生了高滴度有凝血活性的因子Ⅸ蛋白。1991年又通过上述方法，将因子Ⅸ基因转入2名患者体外培养的细胞中，然后回植入病人皮内，已检测到导入体内的因子Ⅸ基因表达产物，病人症状也有所改善，获得了初步疗效。 图19-2 凝血因子ⅨcDNA转移和表达载体结构图（PXL-ⅨJ） SO为SV40病毒复制起始点；PBO为PBR322复制起始点 3．囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）　囊性纤维化（CF）是累及少数器官系统的常见的AR遗传性综合征，该致病基因已被识别并克隆。该基因产物为一种跨膜离子转导调节因子（CFTR）。CF引起的慢性肺病的发病率和死亡率高。应用腺病毒载体输入正常的CFTR基因到达呼吸道上皮的多基因治疗的试验已经成功，并取得进展。CF也累及胃肠道、胰腺和肝胆系统，研究提示应用腺病毒把CFTR基因转移到体内胆管上皮细胞内后，即可使转移基因最初全部在肝内胆管上皮细胞表达。 4．α-抗胰蛋白酶缺乏　这是另一种累及多器官的遗传病。因α-抗胰蛋白酶缺乏引起的肺病是目前应用基因治疗的焦点。应用腺病毒运载体把α-抗胰蛋白酶基因转移到呼吸道上皮细胞，已可阻止慢性阻塞性肺病的发展。 5．LDL受体缺乏　纯合低密度脂蛋白（LDL）受体缺乏可导致家族性高胆固醇血症（FH）和相关性动脉粥样硬化心血管疾病的早期发生。尽管LDL受体在大多数细胞中表达，但是正是这些受体的肝内表达，调节了体内胆固醇的稳定性。把LDL受体基因转移到肝细胞治疗FH是一种更实用的方法。对人类的临床研究已经实施，应用逆转录病毒载体和体外方法已经把LDL受体基因转移到FH患者的肝细胞中。动物模型的研究表明，将人LDL受体基因输送到WHHL家兔的肝细胞，可致20%的细胞感染；受试动物血清总胆固醇可降低30%～50%，而且至少持续4个月。 （二）免疫缺陷 原发性免疫缺陷多有遗传背景，如淋巴细胞功能协同抗原（LFA-1）缺损是近年来发现的免疫分子缺损，LFA-1缺损是一种白细胞粘附分子缺损（LAD）。LFA-1存在于淋巴细胞，单核细胞及粒细胞表面，由α、β链以非共价键连接而成。LFA-1缺损是β链基因突变所致。Hibbs等采用二步法把含β链的cDNA输给LAD患者的B细胞，B细胞可表达LFA-1分子，Northern印迹证实细胞内含大量外源性β链mRNA，功能试验证明LFA-1可与其配体分子相互作用，说明LFA-1缺损已得到纠正。 （三）肿瘤的基因治疗 对肿瘤的基因治疗分为对宿主细胞的修饰和对肿瘤细胞的修饰。对宿主细胞的修饰包括①将一些对细胞毒药物有抗性的基因转移至造血前体细胞以降低治疗药物对骨髓的毒性,这样就可以用高剂量的药物杀伤肿瘤细胞而不破坏骨髓细胞。例如向造血干细胞中导入二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，可使细胞获得对氨甲蝶呤的抗性；②涉及免疫系统，如果抗肿瘤应答（如CTL、TIL等）已经存在，导入细胞因子的基因有可能扩大抗肿瘤效应。 对肿瘤细胞的修饰是达到以下三个目标：①改正肿留细胞的基因突变，降低其生长率，诱导肿瘤消退。对此目前研究最多的抑制基因。许多研究表明，如果细胞内抑癌基因丢失、失活或突变将会导致细胞恶变。野生型p53基因（wt p53）所编码的蛋白具有抗肿瘤活性，在P53缺失或突变的许多肿瘤细胞系中，导入wt p53基因后，其表达能明显抑制瘤细胞的增殖。将正常的Rb转移到视网膜母细胞瘤细胞或骨瘤细胞后，可逆转瘤细胞的恶性生长和形态特点；②导入酶药物前体（pro-drug），形成肿瘤特异的敏感性。其主要原理是让病毒基因编码合成的酶在细胞中的表达依赖于细胞中某些蛋白质的诱导，所表达的酶能使无毒的药物前体转变成有毒的药物，从而杀伤肿瘤，而不伤及正常细胞。此方法的优点是不需要所有肿瘤细胞都被转导，因为有旁观者效应（by-stander effect），但缺点是必须确认只有肿瘤细胞被转导，而正常细胞不被转导；③导入目的基因以增强肿瘤的免疫原性，从而被机体的免疫系统所识别。随着多种细胞因子（IL-1、IL-2、TNF-α、GM-CST、IFN）基因的克隆化，将这些基因以各种基因转移方法导入各种类型的靶细胞，并在细胞内进行表达，直接发挥杀伤肿瘤细胞的功能，或是诱导淋巴细胞成为LAK细胞，或是诱导主要组织相容性复合物（MHC）抗原的表达，增加双识别抗肿瘤的免疫功能。也可将MHCⅠ型和Ⅱ型抗原的基因，导入到肿瘤细胞中，使MHC抗原表达较弱的肿瘤细胞膜上表达足够量的MHC抗原，刺激机体肿瘤抗原的MHC抗原双识别的免疫应答，提高机体抗肿瘤免疫的功能。加强肿瘤细胞膜表面抗原性的另一重要手段，就是利用基因转移技术，将某些病毒的基因导入到肿瘤细胞中，细胞膜上出现病毒的某些抗原，增强肿瘤细胞的异质性。流感病毒、单纯疱疹病毒基因转移与表达及其与免疫抗肿瘤的作用和机制已进行了研究。 （四）艾滋病的基因治疗 艾滋病是由HIV感染引起的。HIV是一反转变病毒，与靶细胞膜上的CD4分子结合后进入细胞，HIV基因组RNA在反转录酶的作用下，反转录成cDNA，然后整合至宿主染色体。 HIV感染的基因治疗策略主要有抗病毒基因治疗（细胞内免疫）和基因免疫治疗两方面。前者指将人工构建的一个重组基因导入易感细胞内，该重组的基因可在转染细胞中表达病毒基因的反义核酸或病毒蛋白的突变体，以便有效地干扰野生病毒的复制和增殖。后者包括体内直接注射DNA（基因免疫接种），以及转移针对HIV-1抗原特异性的携带自杀基因的CD8+T细胞，以治疗HIV感染。此外，阻断HIV和CD4结合也是治疗HIV感染的策略之一，即将重组的可溶性CD4基因直接注射或导入体外培养的人T细胞再输回体内。 （五）乙型肝炎的基因治疗 HBV慢性感染的发病率和死亡率很高。尽管α-干扰素用于许多乙肝病例是有效的，但是迄今为止，尚没有特异的治疗方法。某些前瞻性的工作表明，乙肝的基因治疗是一种可行的治疗方法。用无唾液酸基血清类粘蛋白与多聚-L-赖氨酸结合，把特异双链DNA或者单链DNA（反义顺序）输入到具有无唾液酸基粘蛋白受体的肝细胞。应用反义寡胱脱氧核苷酸已经成功地抑制了体内HBV的复制，把反义序列经静脉注射到感染的北京鸭体内，与对照组比较，发现用2种不同的反义寡脱胱氧核苷酸，对病毒复制的抑制都超过90%。 （六）血管疾病的基因治疗 把外源性基因成功地转移到动脉血管壁细胞，给动脉性疾病的病理生理学研究带来了一线曙光。在一个特定的部位把转移基因转移到血管壁细胞，转移基因所编码的重组蛋白在该处持续地表达，从而产生有意义的生物学效应，最终达到治疗的效果。自Nabel在动脉性疾病领域应用基因转移以来，这项技术近5年来有了突飞猛进的发展。在血管成形术中，目前可应用局部导管经皮进行基因转移。重组DNA技术的发展，已经设计出了一些新的载体，以较高的转化率将DNA导入血管内皮和导管肌细胞内。 六、转基因治疗的问题与危险性 （一）导入基因的持续表达 由于外周血淋巴细胞和皮肤成纤维细胞都有一定寿命限制，所以需不断地给患者回输含目的基因的细胞。目前有许多实验室在研究生命较长的靶细胞，如造血干细胞和骨髓细胞。 （二）导入基因的高效表达 迄今所有导入细胞的目的基因表达率都不十分高，这与基因转移方法、靶细胞的选择等有关。已有一些实验室正在研究将高效启动于构建入逆转录病毒载体，如人巨细胞病的启动子，但由于存在组织特异性的问题，并非一个启动子适于所有基因的高效表达，所以还要进一步的研究以解决临床上导入基因的高效表达。 （三）安全性问题 安全性问题是基因治疗临床试验前应该首先重视的问题。虽然已有的临床试验还未出现野生型病毒感染现象，但逆转录病毒基因转移系统的安全性问题仍然必须重视；另一方面，目前基因治疗研究尚未发展到重点整合、置换有缺陷或有害基因这一阶段，治疗基因在基因组中随机整合，有可能激活原癌基因或失活抑癌基因，而引起细胞恶性转化。 虽然作为转基因治疗的载体大都经过严格的安全控制，但转染靶细胞后插入核DNA这一事件是随机的，一般认为如果插入到癌基因或肿瘤抑制基因位点则可能导致肿瘤的形成，尽管这不可能是一种常见的现象，但这种危险性总是存在的；另一种情况是被转基因插入到另一个基因的位置，这虽然会导致该细胞该基因的缺陷，但受影响的仅仅是这个细胞本身，不至于对机体产生严重危害。 然而，如果以生殖细胞作为靶细胞，情况会发生变化，也就是说当被转基因插入到生殖细胞（或受精卵）基因组某一基因时，受影响的就仅仅是这个细胞本身（如果这个生殖细胞参与受精，并形成受精卵发育成胚胎的话），而可能影响整个个体，甚至影响由该个体遗传下去的世世代代。 由此，也就引起另外一些关于转基因治疗的伦理学争论。一些宗教信仰者，人权团体常对此提出异议，认为这违反了人类发展的自然规律；一些政治家们以及法律学人士也对这一工作的合法性产生怀疑。总之，体细胞的转基因治疗并没太多的争议，而生殖细胞或受精卵的遗传操作就必须谨而慎之了。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（岳凤珍）