2010-5-21
第 七 章
色谱分析法
一,高效液相色谱法
的特点
二、流程及主要部件
三,影响分离的因素
四,高效液相色谱法
的主要分离类型第七节高效液相色谱法
2010-5-21
液相色谱仪（ 1）
2010-5-21
液相色谱仪（ 2）
2010-5-21
液相色谱仪（ 3）
2010-5-21
液相色谱仪（ 4）
2010-5-21
一,高效液相色谱法的特点
特点：高压、高效、高速
高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
2010-5-21
二、流程及主要部件
1.流程
2010-5-21
2.主要部件
(1) 高压输液泵
?主要部件之一, 压力,150～ 350× 105 Pa。
?为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相 （ <10μm）, 液
体的流动相高速通过时, 将产生很高的压力, 因此高压, 高
速是高效液相色谱的特点之一 。
?应具有压力平稳, 脉冲小, 流量稳定可调, 耐腐蚀等特性
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(2) 梯度淋洗装置
外梯度,
利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按一
定的比例送入梯度混合室，
混合后进入色谱柱。
内梯度,
一台高压泵,通过比例
调节阀,将两种或多种不同
极性的溶剂按一定的比例抽
入高压泵中混合。
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(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态，
通常使用耐高压的六通阀进样装置，
其结构如图所示：
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(4) 高效分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径 1～ 6 mm,柱长 5～ 40 cm。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
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(5) 高效液相色谱检测器
紫外光度检测器（ UV）,最小检测量 10-9g·mL-1,对流
量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。
最常用的检测器。
2010-5-21
光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器,1024个二极管阵列, 各检测特
定波长, 计算机快速处理, 三维立体谱图, 如图所示 。
2010-5-21
三,影响分离的因素
在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项 B/U较小,
可以忽略不计, 而只有两项, 即：
H =A + C u
故液相色谱 H-u曲线与气相色谱的形状不同, 如图所示：
影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。
2010-5-21
1,影响分离的因素 —— 流速
流速大于 0.5 cm/s时,
H～ u曲线是一段斜率不大的直
线。降低流速，柱效提高不是
很大。但在实际操作中，流量
仍是一个调整分离度和出峰时
间的重要可选择参数。
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2,固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其
选用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，
但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常
高的工作，一般很少自行制备。
选择短柱、细内径提高分析速度；
研制高效柱填料是一活跃领域。
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3,流动相及流动相的极性
（ 1） 可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱
中显得特别重要 。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液, 洗脱
剂 。
（ 2） 亲水性固定液常采用疏水性流动相, 即流动相的极
性小于固定相的极性, 称为正相液液色谱法, 极性柱也称正
相柱 。
（ 3） 若流动相的极性大于固定液的极性, 则称为反相液
液色谱, 非极性柱也称为反相柱 。 组分在两种类型分离柱上
的出峰顺序相反 。
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流动相组成
流动相按组成不同可分为单组分和多组分；
按极性可分为极性, 弱极性, 非极性；
按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗 。
常用溶剂,
己烷, 四氯化碳, 甲苯, 乙酸乙酯, 乙醇, 乙腈, 水 。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相
的极性或增加选择性, 以改进分离或调整出峰时间 。
2010-5-21
选择流动相时应注意的几个问题：
（ 1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累
积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
（ 2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏
柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定
相等。
（ 3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉
淀并在柱中沉积。
（ 4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外
检测器时，流动相不应有紫外吸收。
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四,高效液相色谱法的主要分离类型
1,吸附色谱 （ 液 -固吸附色谱 ）
以固体吸附剂为固定相, 如硅胶, 氧化铝等, 较常使
用的是 5～ 10μm的硅胶吸附剂 。 流动相可以是各种不同极
性的一元或多元溶剂 。
2,分配色谱 （ 液 -液分配色谱 ）
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为
化学键合固定相, 即用化学反应的方法通过化学键将固定
液结合在担体表面 。
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3,离子交换色谱
固定相为离子交换树脂, 流动相为无机酸或无机碱
的水溶液 。 各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交
换能力的不同而得到分离 。
4,凝胶色谱 （ 空间排阻色谱 ）
以凝胶为固定相 。 凝胶是一种经过交联的, 具有立
体网状结构和不同孔径的多聚体的通称 。 如葡聚糖凝胶
,琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶, 聚苯乙烯凝胶等硬质
凝胶；
第 七 章
色谱分析法
一,高效液相色谱法
的特点
二、流程及主要部件
三,影响分离的因素
四,高效液相色谱法
的主要分离类型第七节高效液相色谱法
2010-5-21
液相色谱仪（ 1）
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液相色谱仪（ 2）
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液相色谱仪（ 3）
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液相色谱仪（ 4）
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一,高效液相色谱法的特点
特点：高压、高效、高速
高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
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二、流程及主要部件
1.流程
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2.主要部件
(1) 高压输液泵
?主要部件之一, 压力,150～ 350× 105 Pa。
?为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相 （ <10μm）, 液
体的流动相高速通过时, 将产生很高的压力, 因此高压, 高
速是高效液相色谱的特点之一 。
?应具有压力平稳, 脉冲小, 流量稳定可调, 耐腐蚀等特性
2010-5-21
(2) 梯度淋洗装置
外梯度,
利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按一
定的比例送入梯度混合室，
混合后进入色谱柱。
内梯度,
一台高压泵,通过比例
调节阀,将两种或多种不同
极性的溶剂按一定的比例抽
入高压泵中混合。
2010-5-21
(3) 进样装置
流路中为高压力工作状态，
通常使用耐高压的六通阀进样装置，
其结构如图所示：
2010-5-21
(4) 高效分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径 1～ 6 mm,柱长 5～ 40 cm。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
2010-5-21
(5) 高效液相色谱检测器
紫外光度检测器（ UV）,最小检测量 10-9g·mL-1,对流
量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。
最常用的检测器。
2010-5-21
光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器,1024个二极管阵列, 各检测特
定波长, 计算机快速处理, 三维立体谱图, 如图所示 。
2010-5-21
三,影响分离的因素
在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项 B/U较小,
可以忽略不计, 而只有两项, 即：
H =A + C u
故液相色谱 H-u曲线与气相色谱的形状不同, 如图所示：
影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。
2010-5-21
1,影响分离的因素 —— 流速
流速大于 0.5 cm/s时,
H～ u曲线是一段斜率不大的直
线。降低流速，柱效提高不是
很大。但在实际操作中，流量
仍是一个调整分离度和出峰时
间的重要可选择参数。
2010-5-21
2,固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其
选用原则与气相色谱一样。
选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，
但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常
高的工作，一般很少自行制备。
选择短柱、细内径提高分析速度；
研制高效柱填料是一活跃领域。
2010-5-21
3,流动相及流动相的极性
（ 1） 可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱
中显得特别重要 。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液, 洗脱
剂 。
（ 2） 亲水性固定液常采用疏水性流动相, 即流动相的极
性小于固定相的极性, 称为正相液液色谱法, 极性柱也称正
相柱 。
（ 3） 若流动相的极性大于固定液的极性, 则称为反相液
液色谱, 非极性柱也称为反相柱 。 组分在两种类型分离柱上
的出峰顺序相反 。
2010-5-21
流动相组成
流动相按组成不同可分为单组分和多组分；
按极性可分为极性, 弱极性, 非极性；
按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗 。
常用溶剂,
己烷, 四氯化碳, 甲苯, 乙酸乙酯, 乙醇, 乙腈, 水 。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相
的极性或增加选择性, 以改进分离或调整出峰时间 。
2010-5-21
选择流动相时应注意的几个问题：
（ 1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累
积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
（ 2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏
柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定
相等。
（ 3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉
淀并在柱中沉积。
（ 4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外
检测器时，流动相不应有紫外吸收。
2010-5-21
四,高效液相色谱法的主要分离类型
1,吸附色谱 （ 液 -固吸附色谱 ）
以固体吸附剂为固定相, 如硅胶, 氧化铝等, 较常使
用的是 5～ 10μm的硅胶吸附剂 。 流动相可以是各种不同极
性的一元或多元溶剂 。
2,分配色谱 （ 液 -液分配色谱 ）
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为
化学键合固定相, 即用化学反应的方法通过化学键将固定
液结合在担体表面 。
2010-5-21
3,离子交换色谱
固定相为离子交换树脂, 流动相为无机酸或无机碱
的水溶液 。 各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交
换能力的不同而得到分离 。
4,凝胶色谱 （ 空间排阻色谱 ）
以凝胶为固定相 。 凝胶是一种经过交联的, 具有立
体网状结构和不同孔径的多聚体的通称 。 如葡聚糖凝胶
,琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶, 聚苯乙烯凝胶等硬质
凝胶；
