第十一章 吸光光度分析法化学分析法总结酸碱滴定法配位滴定法氧化 -还原滴定法沉淀滴定法重量分析法化学分析法的特点?
化学分析与仪器分析方法比较化学分析 (Chemical analysis)：
常量组分 (>1%),Er 0.1%～ 0.2%
依据化学反应,使用玻璃仪器仪器分析 (Instrumental analysis)：
微量组分 (<1%),Er 1%～ 5%
依据物理或物理化学性质,需要特殊的仪器例,含 Fe约 0.05%的样品,称 0.2g,则
m(Fe)≈0.1mg重量法 m(Fe2O3)≈0.14mg,称不准容量法 V(K2Cr2O7)≈0.02mL,测不准光度法 结果 0.048%～ 0.052%,满足要求准确度高灵敏度高
11.1 概述 (Brief introduction)
11.1.1.光的基本性质
c－ 真空中光速 2.99792458× 108m/s
λ－ 波长,单位,m,cm,mm,?m,nm,?
1?m=10-6m,1nm=10-9m,1?=10-
10m
ν－ 频率,单位：赫芝（周） Hz 次 /秒
n－ 折射率,真空中为 1
==cV n光的传播速度,
1,波动性
光是电磁波,以巨大速度通过空间,不需要任何物质作为传播媒介的一种能量磁场向量电场向量传播方向
Y
Z X
与物质作用
2,微粒性
h－ 普朗克 (Planck)常数 6.626× 10-34J·s
－ 频率
E－ 光量子具有的能量单位,J(焦耳 ),eV(电子伏特 )
光量子，具有能量 。
Eh
3,波粒二象性结论,一定波长的光具有一定的能量，波长越长 (频率越低 )，光量子的能量越低。
单色光,具有相同能量 (相同波长 )的光。
混合光,具有不同能量 (不同波长 )的光复合在一起。
电磁波谱的波段如何划分?
==cE h h
n
真空中,
c
Eh
高能辐射区 γ射线 能量最高,来源于核能级跃迁
χ射线 来自内层电子能级的跃迁光学光谱区 紫外光 来自原子和分子外层电子能级的跃迁可见光红外光 来自分子振动和转动能级的跃迁波谱区 微波 来自分子转动能级及电子自旋能级跃迁无线电波 来自原子核自旋能级的跃迁
4,电磁波谱 (Electromagnetic
waves)
电磁辐射按波长顺序排列,称 ~。
γ射线 → X 射线 → 紫外光 → 可见光 → 红外光 → 微波 → 无线电波
5,光学光谱区
(Spectral region)
(真空紫外 )
远红外中红外近红外可见近紫外远紫外
10nm~
200nm
中层电子
200nm
~380nm
价电子
380nm
~ 780nm
价电子
780 nm
~ 2.5?m
分子振动
2.5?m
~ 50?m
分子振动
50?m
~300?m
分子转动
6,光学分析法及其分类
1）光学分析法 (Optical analysis)
依据物质发射的电磁辐射或物质与电磁辐射相互作用而建立起来的各种分析法的统称 ~。
2）分类：
(1)光谱法 (Spectrometry),利用物质与电磁辐射作用时，物质内部发生量子化能级跃迁而产生的吸收、发射或散射辐射等电磁辐射的强度随波长变化的 定性,定量 分析方法
按能量交换方向分 吸收光谱法发射光谱法
按作用结果不同分 原子光谱 → 线状光谱分子光谱 → 带状光谱
(2) 非光谱法：
利用物质与电磁辐射的相互作用,测定电磁辐射的反射,折射,干涉,衍射和偏振等基本性质变化的分析方法分类,折射法,旋光法,比浊法,χ射线衍射法
(3) 光谱法与非光谱法的区别：
光谱法,内部能级发生变化 (波长改变 )
原子吸收 /发射光谱法,原子外层电子能级跃迁 分子吸收 /发射光谱法,分子外层电子能级跃迁
非光谱法,内部能级不发生变化仅测定电磁辐射性质改变 (波长不变 )
11.2 吸光光度法
(Spectrophotometry)
— 灵敏度高,测定下限可达 10－ 5～ 10－
6mol/L,
10-4%～ 10-5%
– 准确度 能够满足微量组分的测定要求：
相对误差 2～ 5％ （ 1～ 2％）
– 操作简便快速
– 应用广泛吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有 选择性吸收 的特性而建立起来的分析方法。
11.2.1 特点 (Merits)
11.2.2 溶液中溶质分子对光的吸收
/nm 颜色 互补光
400-
450
紫 黄绿
450-
480
蓝 黄
480-
490
绿蓝 橙
490-
500
蓝绿 红
500-
560
绿 红紫
560-
580
黄绿 紫不同颜色的可见光波长及其互补光
1.物质对光的选择性吸收及吸收曲线吸收 (absorption):一种物质呈现何种颜色
,是与入射光的组成和物质本身的结构有关 。
溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点 （ 离子或分子 ） 对不同波长的光具有选择性吸收而引起的 。 当白光通过某一有色溶液时,该溶液会选择性地吸收某些波长 (wavelength)的光而让未被吸收的光透射过,即溶液呈现透射光的颜色,亦即呈现的是它吸收光的 互补光 的颜色 。
例如,KMnO4溶液选择吸收了白光中的 绿色
(500~560nm)光,与绿色光互补的紫色光因未被吸收而透过溶液,所以 KMnO4溶液呈现 紫色 。
Cr2O72-,MnO4-的吸收光谱
(Absorption spectra of Cr2O72-、
MnO4- )
400 500 600 700?/nm350
525 545
Cr2O72- MnO4
-1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
Ab
so
rb
an
ce
350
440
nm
2.吸收光谱产生的原理
物质分子内部六种运动形式：
（ 1）电子相对于原子核的运动 Ee；
（ 2） 原子核在其平衡位置附近的相对振动 Ev；
（ 3） 分子本身绕其重心的转动 Er；
（ 4） 原子的核能 En；
（ 5） 分子的平动能 Et；
（ 6） 基团间的内旋转能 Ei。
在紫外光的照射下,En不变,Et和 Ei较小。
所以，体系吸收能量而发生跃迁时：
△ E = △ Ee + △ Ev+ △ Er
分子的能级三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量
ΔEe(1~20eV)
>ΔEv (0.05~1eV)
>ΔEr
(0.005~0.05eV)
电子能级的跃迁当用 可见光或紫外光照射分子时，价电子可以跃迁产生吸收光谱，
在电子能级变化的同时
，不可避免地伴随分子振动和转动的能级变化
。因此他包含了大量谱线，并由于这些谱线的重叠而成为连续的吸收带。
分子的激发
(Excitation)
E = E2 - E1 = h?
量子化 ；选择性吸收 ;
分子结构的复杂性使其对不同波长光 的吸收程度不同；
用不同波长的单色光照射，测吸收光的程度随光波长的变化 —吸收曲线与最大吸收波长?max(wavelength
maximum)。
M + h M *
基态 (ground state) 激发态 (Excited state)
E1 △ E E2
苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱
(Absorption spectra of
benzene and toluene in
cyclohexane)
苯 (254nm) 甲苯(262nm)
A
230 250
270
吸收曲线 (absorption spectrum)的讨论：
1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。
吸光度最大处对应的波长称为 最大吸收波长
(?max)
2） 同一物质不同浓度的溶液,光吸收曲线形状相似，其最大吸收波长不变；但 在一定波长处吸光度随溶液的浓度的增加而增大 。这个特性可作为物质定量分析的依据。在实际测定时，
只有在 λmax处测定吸光度，其灵敏度最高，因此，吸收曲线是吸光光度法中选择测量波长的依据。
3） 不同物质吸收曲线的形状和最大吸收波长均不相同。光吸收曲线与物质特性有关，故据此可作为物质定性分析的依据。
11.2.3 光吸收基本定律
It
I0
b dx
I I-dI
s
1,朗伯定律 (Lambert’s law)
2,比尔定律 (Beer’s law)
A=k2c
A=lg(I0/It)=k1b
3 朗伯 -比尔定律
0
tIT=
I
= 1 0 = 1 0T - k b c - A
A = lg (I0/It) = lg(1/T) = -lgT = kbc
1) T－ 透光率
(Transmittance)
A=kbc A— 吸光度 (absorbance)b— 介质厚度 (length/cm)
c— 浓度 (concentration)
K— 吸光系数 (absorptivity)
2）吸光系数 (Absorptivity)
a的单位,L·g-1·cm-1
当 c的单位用 g·L-1表示时，用 a表示，
A＝ abc
的单位,L·mol-1·cm-1
当 c的单位用 mol·L-1表示时，用?表示,
－摩尔吸光系数 (Molar absorptivity)
A＝?bc
1%1cmE
1%1cmE 1%1cmE
当 c的单位用 g·(100mL)-1表示时，用表示,A＝ bc,叫做比消光系数
3）吸光度 (A),透光率 (T)与浓度 (c)的关系
A T
c
= 1 0 - k b cT
A=kbc
线性关系吸光度与光程的关系 A =?bc
检测器
b
样品光源
0.22
吸光度光源检测器
0.00
吸光度光源检测器
0.44
吸光度
b
样品
b
样品吸光度与浓度的关系 A =?bc
吸光度
0.00
光源检测器吸光度
0.22
光源检测器
b
吸光度
0.44
光源检测器
b
摩尔吸光系数 (?)的讨论
1） 吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数,可作为 定性鉴定的参数 ；
2） 不随浓度 c和光程长度 b的改变而改变 。 在温度和波长等条件一定时,ε仅与吸收物质本身的性质有关,与待测物浓度无关；
3） 同一吸收物质在不同波长下的 ε值是不同的 。 在最大吸收波长 λmax处的摩尔吸光系数,
常以 εmax表示 。 εmax表明了该 吸收物质最大限度的吸光能力,也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度 。
摩尔吸光系数 (ε) 的讨论
4） εmax越大表明该物质的吸光能力越强,用光度法测定该物质的灵敏度越高 。
ε>105,超高灵敏；
ε=(6～ 10） × 104,高灵敏；
ε<2× 104,不灵敏 。
5） ε在数值上等于浓度为 1mol/L,液层厚度为 1cm时该溶液在某一波长下的吸光度 。
朗伯 -比尔定律的适用条件
1) 单色光,应选用?max处或肩峰处测定
2) 吸光质点形式不变,离解、络合、缔合会破坏线性关系,应控制条件 (酸度、浓度、介质等 )
3) 稀溶液,浓度增大，分子之间作用增强亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱
Absorption spectra of Methylene blue
(nm)
a,6.36× 10-6 mol/L
b,1.27× 10-4 mol/L
c,5.97× 10-4 mol/L
亚甲蓝阳离子单体 (monomer)
max= 660 nm
二聚体 (dimer)
max= 610 nm
二聚体的生成破坏了 A与 c的线性关系
4 朗伯 -比尔定律的分析应用
(Analytical applications of Lambert-Beer’s law)
0 1 2 3 4 mg/ml
A
*
0.8
0.6
0.4
0.2
0
溶液浓度的测定
A＝?bc
A ~ c
工作曲线法
(校准曲线 )
Calibration curve
11.2.4 吸光度的测量与吸光度的加和性
A = A1 + A2 + … +An
用参比溶液 (reference solution)调 T =
100%（ A=0）,再测样品溶液的吸光度，
即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。
11.3 比色法和吸光光度法和及其仪器方便、灵敏，准确度差。常用于限界分析。
观察方向1.目视比色法
c4c3c2c1
c1 c2 c3 c4
11.3.1 光度分析的几种方法
2,光电比色法 (colorimetry)
通过滤光片 (filter)得一窄范围的光 (几十
nm)
光电比色计结构示意图灵敏度和准确度较差
3,吸光光度法和分光光度计
(spectrophotometer)
光源 单色器 吸收池 检测系统稳压电源 分光光度法的基本部件通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光,
波长可调,故选择性好,准确度高,
光路示意图分光光度计内部光的传播途径
11.3.2 分光光度计的类型
chopper
1．单光束分光光度计
特点：
使用时来回拉动吸收池
→ 移动误差
对光源要求高
比色池配对
722型分光光度计结构方框图光源吸收池 检测系统分光系统显示系统可见分光光度计可见分光光度计
2．双光束分光光度计
特点,不用拉动吸收池,可以减小移动误差
对光源要求不高
可以自动扫描吸收光谱紫外 -可见分光光度计
U-3400型紫外 -可见分光光度计
3．双波长分光光度计?特点：? 利用吸光度差值定量
消除干扰和吸收池不匹配引起的误差
11.4 分光光度计的主要部件
1,光源 (Light source),发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。
可见光区,钨灯，碘钨灯 (320 ～ 2500 nm)
紫外区,氢灯，氘灯 (180 ～ 375 nm)
2,单色器 (monochromator),将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。
棱镜,玻璃 350 ～ 3200 nm,石英 185 ～ 4000 nm
光栅,波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便单色器
①入射狭缝,光源的光由此进入单色器；
②准光装置,透镜或返射镜使入射光成为平行光束；
③色散元件,将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；
④聚焦装置,透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；
⑤出射狭缝：
单色器棱镜,依据不同波长光通过棱镜时折射率不同入射狭缝 准直透镜 棱镜 聚焦透镜 出射狭缝白光
λ 1
λ 2
800
600
500
400
光栅,在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的 等宽度等间距 条痕 (600,1200、
2400条 /mm )。
M1
M2
出射狭缝光屏透镜平面透射光栅光栅衍射示意图原理：
利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光,
光栅
3.吸收池 (cell):用于盛待测及参比溶液。
玻璃 — 能吸收 UV光，仅适用于可见光区石英 — 不吸收紫外光,适用于紫外和可见光区
要求：匹配性 （ 对光的吸收和反射应一致 ）
4,检测器 (detector),利用光电效应，将光能转成电流讯号。
光电池，光电管，光电倍增管检测器硒光电池光电管红敏管 625-1000
nm
蓝敏管 200-625 nm
Ni环（片）
碱金属光敏阴极h?
光电倍增管（ 160-700 nm）
待扫描
1个光电子可产生 106～ 107个电子光电倍增管
5,指示器 (display)
低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录多通道仪器 （ Multichannel instruments）
光电二极管阵列 (通常具有 316个硅二极管 )
Photodiode arrays (PDAs)
同时测量 200～ 820nm范围内的整个光谱,比单个检测器快 316倍,信噪比增加 316 1/2 倍,
其它类型分光光度计将光度计放入样品中,原位 (In situ)测量,
对环境和过程监测非常重要,
纤维光度计镀铝反射镜纤维光度计示意图纤维光度计
11.5 光度分析法设计
1,显色反应的选择
*灵敏度高 (High sensitivity),一般 ε>104
*选择性好 (Good selectivity)
*显色剂在测定波长处无明显吸收。
*对照性好,?λmax>60 nm,
*反应生成的有色化合物 组成恒定，稳定。
*显色条件易于控制,重现性好 。
2.显色剂 (Color reagents)
无机显色剂,[Fe(SCN)]2+,[TiO·H2O2]2+
有机显色剂,
11.5.1 显色反应 (Color reactions)
1) 生色团（发色团）
O
－ N＝ N－，－ N＝ O，
OC=S,－ N （ 共轭双键） πe
能吸收紫外 -可见光的基团
有机化合物,具有不饱和键和未成对电子的基团产生 n→ π*跃迁和 π→ π*跃迁,跃迁
E较低注,当出现几个发色团共轭,则几个发色团所产生的吸收带将消失,代之出现新的共轭吸收带,其波长将比单个发色团的吸收波长长,
强度也增强
2) 助色团
本身无紫外吸收,但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团
有机物,连有杂原子的饱和基团
例,— OH,—OR,—NH—,—
NR2—,—X
3) 红移和蓝移由于化合物结构变化 （ 共轭,引入助色团取代基 ） 或采用不同溶剂后,吸收峰位置向长波 方向 的移 动,叫 红移 ( Bathochromic
shift); 吸收峰位置向短波方向移动,叫 蓝移
(Hyptochromic sfift).
4) 增色效应和减色效应增色效应,吸收强度增强的效应减色效应,吸收强度减小的效应
5) 强带和弱带
εmax>105 → 强带 (Strong band)
εmin<103 → 弱带 (Weak band)
有机显色剂
CH3－ C－ C－ CH3
HO－ N N－ OH
＝ ＝
NN
OH
COOH
SO3H
OO型：
N
N N OH
OH
ON型,PAR
NH NH
N
S
N
S型,双硫腙
NN型,丁二酮肟邻二氮菲磺基水杨酸
11.5.2 显色条件的选择
cR cR cR
1,显色剂用量 (cM,pH一定 )
Mo(SCN)32+ 浅红
Mo(SCN)5 橙红
Mo(SCN)6- 浅红
Fe(SCN)n3-n
2,显色反应酸度（ cM,cR一定）
pH1<pH<pH2
pH
邻二氮菲－亚铁反应完全度与 pH的关系
Fe2++3R
R ( H )Fe ( A )
33
33
3
[ F e R ]
'
[ F e '] [ R ']
3
3 F e ( A ) R ( H )
[ F e R ]lg lg lg 3 lg 3 lg [ R ' ]
[ F e ']
H＋H＋A柠檬酸
cR≈[R′]=10-4mol·L-1
β3＝ 1021.3β3 FeR3
酸度的影响
3[F e R ]lg
[F e ]?
pH3.5～ 5.7为适宜的酸度范围
3,显色温度及显色时间另外，还有介质条件、有机溶剂、表面活性剂等
T1(℃ )
T2(℃ )
t(min)
A
4.干扰及消除化学法
Co2＋,Fe3+ Co
2+
FeF63- Co(SCN)2 (蓝 )
⑴ NaF SCN－
Co2+
Fe2+,Sn4+
(2)Sn2+
Co(SCN)2
SCN－
测 Co2＋ (含 Fe3+)
掩蔽法氧化还原法测 Co2＋ (生成络合物性质不同 )
Co2+,Zn2+,
Ni2+,Fe2+
CoR,ZnR
NiR,FeR
CoR,Zn2+,
Ni2+,Fe2+
钴试剂 R H+
如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，则需采取分离法。
测 Fe3＋ (控制 pH)
Fe3+,Cu2+ FeSS （ 紫红）Cu2+pH 2.5 SS
磺基水杨酸
11.5.3测量条件的选择
1,选择适当的测定波长
515 655
钍 -偶氮砷 III
A
络合物试剂
415 500
钴 -亚硝基红盐
A
络合物试剂下测定须在左右
m a x
m a x
m a xm a x
cb
A
A
A
较小的测定灵敏度高
1)仅络合物有吸收,溶剂 作参比。
如 phen—Fe2+ 标准曲线
2)待测液也有吸收,被测液 作参比。
如 测汽水中的 Fe
3)显色剂或其它试剂也有吸收,空白溶液 作参比例,邻二氮菲光度法测 Li2CO3中的 Fe，
参比溶液为不含 Li2CO3样品的所有试剂。
4)干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：
(1)掩蔽被测组分,再加入显色剂，作参比溶液,
(2)加入等量干扰组分 到空白溶液中,作参比溶液,
2.选择适当的参比溶液
11.5.4定量分析
（ 一 ） 单组分的定量方法
1．吸光系数法
2．标准曲线法
3,对照法：外标一点法
lECA定量依据：
续前
1．吸光系数法（绝对法）
要求单色光前提：
iE CAmLgCigW 求含样过程,已知稀释 )/(/)(
lE
AmLgC
i]1 0 0/[
l
ALm o lC
i]/[或
%1 0 0%
样C
Ci i
练习
例：维生素 B12 的水溶液在 361nm处的百分吸光系数为 207,用 1cm比色池测得某维生素 B12溶液的吸光度是 0.414,求该溶液的浓度
解：
mLgmLglE AC /0.20100/0 0 2 0 0.01207 414.0
练习
例：精密称取 B12样品 25.0mg,用水溶液配成
100ml。 精密吸取 10.00ml,又置 100ml容量瓶中,
加水至刻度 。 取此溶液在 1cm的吸收池中,于
361nm处测定吸光度为 0.507,求 B12的百分含量？
解：
mLgmLgC i /1045.2100/1045.21207 507.0 53
mLgC /1050.210010100 1050.2 5
2
样
%0.98%100
1050.2
1045.2%100%
5
5
12
样C
CB i
练习
例：
解：
%)0.764(
591.010010
25000.20
367
255
iE
AmLmL
mLmg
mlmLH C L
求已知测移取稀至样品稀至吡啶
mLgmLglE AC i /1092.7100/1092.7764 591.0 64
%0.99%100
250
10
100
100.2
1092.7
%100%
2
6
样C
C
i i
续前
2．标准曲线法条件前提：固定仪器和测定
CACKA
样样同上条件固定条件查得测定样品曲线分别测定配制标准系列过程：
CA
ACA
~
标样标样标样标样
A
AC
C
A
A
C
C?
示例
芦丁含量测定
mLmg
mLmLmLmg
250.3
255~0/200.0
样品标样分别移取
0.710mg/25mL
续前
3．对照法：外标一点法
注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时标样与样品浓度相近；截距为固定仪器和测定条件；前提：
0
标样 和分别测定一定过程,AA
S
i
Si A
ACC
sC
iC
C
S
i
Si A
Amm
%1 0 0% mmi i
练习?例,维生素 B
12的含量测定精密吸取 B12注射液 2.50mL,加水稀释至 10.00mL；
另配制对照液,精密称定对照品 25.00mg,加水稀释至 1000mL。 在 361nm处,用 1cm吸收池,分别测定吸光度为 0.508和 0.518,求 B12注射液注射液的浓度以及标示量的百分含量 （ 该 B12注射液的标示量为 100μg / mL）
解：
1）对照法
mLgCC ii /1.98518.0 508.01 0 0 01 0 0 000.2510 5.2
%1.98%100%12 标示量标示量 iCB
练习
2）吸光系数法
12 0 7
5 0 8.0
10
50.2
ii ClE
AC?
mLgC i /1.98
%1.98%100%12 标示量标示量 iCB
续前 （ 二 ） 多组分的定量方法
cba AAAA 总定量依据：
三种情况：
1,两组分吸收光谱不重叠 （ 互不干扰 ）
两组分在各自 λmax下不重叠 → 分别按单组分定量
a
a
aa
aa
E
ACCEA
1
1
11由
b
b
bb
bb
E
ACCEA
2
2
22由
bb
aa
AE
AE
222
111；测定；测定过程：
续前
2,两组分吸收光谱部分重叠
λ1→ 测 A1→ b组分不干扰 → 可按单组分定量测 Ca
λ2→ 测 A2→ a组分干扰 → 不能按单组分定量测 Ca
baba
aa
AEE
AE
2222
111；和测定；测定过程：
a
a
aa
aa
E
ACCEA
1
1
11由
bbaababa CECEAAA 22222由
b
a
aba
b E
CEAC
2
22
续前
3,两组分吸收光谱完全重叠 ——混合样品测定
（ 1） 解线性方程组法
（ 2） 等吸收双波长消去法
（ 3） 系数倍率法
(1)．解线性方程组法步骤：
baba
baba
AEE
AEE
2222
1111；和测定；和测定
bbaababa CECEAAA 11111
bbaababa CECEAAA 22222
baba
bbabba
a EEEE
EAEAC
1221
1221
baba
abaaba
b EEEE
EAEAC
1221
2112
(2)．等吸收双波长法步骤：
消除 a的影响测 b
baba
baba
AAA
AAA
222
111
babbaabababa AAAAAAAAA )()( 212121
aa AAa 2121 和的等吸收点选
bb
b
bb
bbba
CE
CEE
AAA
)( 21
21
b
ba
bb
ba
b E
A
EE
AC
21
续前
消去 b的影响测 a
注：须满足两个基本条件
选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点
选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大
bb AAb '2'1'2'1 和的等吸收点选
aa
a
aa
aaba
CE
CEE
AAA
)(
'
21
'2'1
a
ba
aa
ba
a E
A
EE
AC
''
'2'1
(3)．系数倍率法
前提：干扰组分 b不成峰形无等吸收点续前?步骤,b曲线上任找一点 → λ
1
另一点 → λ2
优点：同时将待测组分和干扰组分放大信号 K倍,
提高了待测组分测定灵敏度
ab
λ1 λ2
倍率因子令 K
A
A
b
b
2
1
)()(
)()(
1212
1122
12
aabb
abab
bababa
AKAAKA
AAAAK
AKAA
bA1
bA2
aaaaaba CEKEAKAA )( 1212
的干扰消除了 bCA aba
练习解：
1,取咖啡酸,在 165℃ 干燥至恒重,精密称取 10.00mg,加少量乙醇溶解,转移至 200mL容量瓶中,加水至刻度线,取此溶液 5.00mL,置于 50mL容量瓶中,加 6mol/L的 HCL 4mL,加水至刻度线 。 取此溶液于 1cm比色池中,在 323nm处测定吸光度为 0.463,已知该波长处的,求咖啡酸百分含量
9.9 2 7%11?cmE
mLgmLgC i /10900.4100/10900.419.927 463.0 64
mLgC /10000.5505200 1000.10 6
3
样
%0.98%100
10000.5
10900.4%100%
6
6
样咖啡酸
C
C i
50
5
200
1
稀释因子注：
练习解：
2,精密称取 0,0500 g样品,置于 250mL容量瓶中,加入
0.02mol/L HCL溶解,稀释至刻度 。 准确吸取 2mL,稀释至
100mL。 以 0.02mol/L HCL为空白,在 263nm处用 1cm吸收池测定透光率为 41.7%,其摩尔吸光系数为 12000,被测物分子量为 100.0,试计算 263nm处 和样品的百分含量 。%1
1cmE
12000.100 120001010%11ME cm
mLgmLg
lE
T
lE
A
C i
/10165.3100/10166.3
11 2 0 0
417.0lglg
64
mLgC /10000.4100 22500500.0 6样
%15.79%100
10000.4
10165.3%100%
6
6
样样品
C
C i
11.6 光度分析法的误差
11.6.1 偏离 Beer定律的因素依据 Beer定律,A与 C关系应为经过原点的直线偏离 Beer定律的主要因素表现为以下两个方面
1,光学因素
2,化学因素
cbA
1.光学因素
1) 非单色光的影响
Beer定律应用的重要前提 ——入射光为单色光照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定为了保证透过光对检测器的响应,必须保证一定的狭缝宽度这就使分离出来的光具一定的谱带宽度续前
21
00
21
和I为I对应的透过光光强分别和II入射光光强分别为的光组成和 λ设入射光由波长为 λ
21
bcIIcb
I
ITA 10lglg
0
0
0201
0201
0201
0201
0201
21
21
1
21
10
10
1010
II
II
II
II
II
II
T
bc
bc
bcbc
）（
又
0201
0201
1
2110
lglg
II
IIbcTA bc
）（
讨论：
入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状
结论：
选择较纯单色光（ Δλ↓,单色性 ↑ ）
选 λ max作为测定波长（ Δ?↓,S↑ 且成线性）
偏离线性关系越严重与）（
定律不成线性关系，偏离与成线性关系
cA
B e e rcA
bcA
21
21
121
2)反射光和杂散光的影响
杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内,与所选波长相距较远
杂散光来源,仪器本身缺陷；光学元件污染造成反射光和杂散光均是入射光谱带宽度内的光直接对 T产生影响
散射和反射使 T↓,A↑,吸收光谱变形注：一般可用空白对比校正消除
I0 I
3) 非平行光的影响
使光程 ↑,A↑,
吸收光谱变形
2,化学因素化学作用
Beer定律适用的另一个前提：
稀溶液浓度过高会使 c与
A关系偏离定律
11.6.2 准确度 —仪器测量误差光度计的读数误差一般为
0.2～ 2％
(ΔT),由于 T与浓度 c不是线性关系，
故不同浓度时的 ΔT
引起的误差不同。
100
80
60
40
20
0
T%
c1?c2?c3
T
T
T-透光率读数误差
c
c1
c1
c2
c2
c3
c3> <
仪器测量误差
%1 0 0
lg
4 3 4.0
%1 0 0
ln
%1 0 0%1 0 0
01.0
TT
T
TT
T
A
A
c
c
E
TdT
r
%1 0 0
ln
%1 0 0%1 0 0
ln4 3 4.0lg
1
lg
TT
dT
A
dA
c
dc
E
TT
T
bcA
r
浓度测量的相对误差与 T(或 A)的关系
10
8
6
4
2
0 20 40 60 800.7 0.4 0.2 0.1 AT%
Er r
0,4 3 4
lg
( 0,0 1 )
cT
E
c T T
T
(36.8)
0.434
实际工作中，应控制 T在 10～ 70％,A在 0.15～ 1.0之间例 1 邻二氮菲光度法测铁,?(Fe)=1.0
mg/L,b = 2cm,A = 0.38,计算?和解,cFe=1.0 mg/L=1.0× 10-3/55.85
=1.8× 10-5 mol/L
1%
1cmE
×
4 - 1 - 1
-5
0.38= = 1.1 10 L m o l cm
2 1.8 10
c =1.0 mg/L=1.0× 10-3 g
/1000mL
= 1.0× 10-4g/100mL
bc1%1cmA E=
1% m 431c -= 0,38 /2,0 10 = 1,9 10E
1%1cm 53= 1 0 = 1,1 1 0 / 5 5,8 5 =o 1,9 1 0r E / M?
11.7光度分析法的应用和其它吸光光度法如,单一组分测定
1) 金属离子,Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂
2) 磷的测定,DNA中含 P～ 9.2%,RNA中含 P～
9.5%,可得核酸量,H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3
=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O
磷钼黄 (?小 )
磷钼 (V)蓝 (?大 )
Sn2+
多组分的测定
x?1,?y?1,?x?2,?y?2由 x,y标液在?1,?2处分别测得
a) 在?1处测组分 x,在?2处测组分
y
b) 在?1处测组分 x; 在?2处测总吸收,扣除 x吸收,可求 y
c) x,y组分不能直接测定
A1=?x?1bcx+?y?1bcy(在?1处测得
A1)
A2 =?x?2bcx+?y?2bcy(在?2处测得
A2)
11.7.1 示差吸光光度法
普通分光光度法一般只适于测定微量组分，
当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。
需采用 示差法 。即提高入射光强度,并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液
。
设：待测溶液浓度为 cx,标准溶液浓度为
cs(cs < cx)。 则：
Ax= εb cx,As = εb cs
ΔＡ =Ａ x － Ａ s =εb(cx － cs ） =εbΔc
测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差 ΔＡ 。由标准曲线上查得相应的 Δc值，则待测溶液浓度 cx,cx = cs + Δc
示差法标尺扩展原理：
普通法,cs的 T=10%； cx的 T=5%
示差法,cs 做参比，调 T=100%
则,cx的 T=50% ； 标尺扩展 10倍
11.7.2 双波长分光光度法不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光 (λ 1和 λ 2)； 以参比波长 λ 1处的吸光度 Aλ 1作为参比，来消除干扰。 在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。
双波长分光光度法
ΔA ＝ Aλ 2 － Aλ 1 ＝ (ε λ 2 － ε λ 1)b c
两波长处测得的吸光度差值 ΔA与待测组分浓度 c成正比。 ε λ 1和 ε λ 2分别表示待测组分在 λ 1和 λ 2处的摩尔吸光系数。
测量波长 λ 2和参比波长 λ 1的选择与组合基本要求：
⑵在选定的两个波长 λ 1和 λ 2处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。
⑴选定的波长 λ 1和 λ 2处干扰组分应具有相同吸光度,即,ΔAy = ΔA yλ 2 － ΔA yλ 1 = 0
故,ΔAx+y = ΔA x=(ε xλ 2－ ε xλ 1)bcx
此时：测得的吸光度差 ΔA只与待测组分 x的浓度呈线性关系，而与干扰组分 y无关。若 x为干扰组分，则也可用同样的方法测定 y组分。
双波长分光光度法消除干扰在?2,A?2 = Ax2+Ay2
在?1,A?1=Ax1+Ay1
A= A?2 - A?1
= Ax2+Ay2 –(Ax1+Ay1)
= Ax2 –Ax1
=?Ax
Ay2 ＝ Ay1
Ax =(?x2－?x1)bcx
消除了 y的干扰
X被测 Y干扰
2?1?1
Ay1
AX1
Ay2
AX2
A
/nm
′
双波长分光光度法消除浑浊背景干扰
1?2
A A
1 -A?2 = △ A
△ A∝ c
例 牛奶中微量 Fe的测定
11.7.3 导数分光光度法导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面，显示了很大的优越性。
利用吸光度 (或透光度 )对波长的导数曲线来进行分析,Ｉ ＝ Ｉ 0 e-ε bc
假定入射光强度 Ｉ 0 在整个波长范围内保持恒定：
dI 0 /dλ ＝ 0
则,dI/dλ ＝－ Ｉ 0 bc e -ε bc dε /dλ
＝－ Ｉ 0 bc dε /dλ
导数分光光度法
dI/dλ ＝－ Ｉ 0 bc
dε /dλ
一阶导数信号与试样浓度呈线性关系；
测定灵敏度依赖于摩尔吸光系数对波长的变化率
dε /dλ 。 吸收曲线的拐点处 dε /dλ 最大，故其灵敏度最高。
同理可以导出其二阶和三阶导数光谱导数分光光度法 混合物导数光谱
A~?图
0
1
2
3
4
~A 图常药降压片中氢氯噻嗪含量的测定
1.氢氯噻嗪,
2.硫酸双肼肽嗪
3,盐酸可乐定
4.常药降压片
250 290 330?
4
1
2
3
1
2
A
A
肝中茚满二酮类抗凝血杀鼠剂的固相萃取方法,肝匀浆用乙腈浸提，浸提液用 6
％的 HClO4稀释，然后用 GDX100大孔树脂萃取，用二氯甲烷 5mL洗脱杀鼠剂,40℃ 挥干，剩余物用
0.1mol·L-1NaOH4mL溶解后，紫外导数光谱测定。
A
2
2
d
d
A
0.0c
d
a
b
D
a.空白肝普通光谱
b.2.5 mg/L敌鼠溶液的普通光谱
c.空白肝二阶导数光谱
d.2.5 mg/L敌鼠溶液的二阶导数光谱
11.7.4 一元弱酸离解常数的测定
HL H＋ ＋ L
HL
HL L= [ H L ] + [ L ]
KccA
KK
+ L
++
a
aa
(HL)[ H ] ( H L )=+
+ [ H ] + [ H ]
Ka＝ [H+][L]/[HL]
高酸度下，几乎全部以 HL存在，可测得 AHL＝ εHL·c(HL)；
低酸度下，几乎全部以 L存在，可测得 AL ＝ εL·c(HL).
代入整理：
AAK
A A
+HL
a L
-= [ H ]
-
[HL]
[L]
L
HL
AA
K AAa
-
p = p H + l g -或配制一系列 c相同,pH不同的溶液,测 A(设
b=1cm).
MO吸收曲线
Aa(HL)
Ab
(L)
1
2
3
4
5
6A
b65
4
32
1A
a
350 400 450 500 550 600?/nm
A
曲线 pH
1 1.10,1.38
2 2.65
3 3.06
4 3.48
5 3.98
6 5.53,6.80
由每份溶液的一对 pH,A，
可求得一个 Ka,
取平均值即可,
MO离解常数的测定作图法 LHLap p H l g AAK AA
H L L2AAA
AHL
3.32(pKa)
1 2 3 4 5 6
A
pH=pKa
pH
pHA 曲线
AL
L
HL
l g p HAAAA 曲线
0.6
0.4
0.2
0
-0.2
-0.4
-0.6
3.0 4.0 pH
HL
L [ H L ]lg g [L ]l AAAA
3.34
11.7.5 络合物组成的测定
(1)摩尔比法,固定 cM,改变 cR
1:
1
3:1
c(R)/c(M)
A
1.0 2.0 3,0
(2)等摩尔连续变化法,
M:R=1:1
0.5 0.33
cM/c cM/c
M:R=1:2
M R = M R nn?
MR (c c c ） 常数表观形成常数的测定 (设 M,R均无吸收 )
0.5
cM/cM:R=1:1
A0
A
0
0
cc
c
0
0
-
=
A A
A
cM + cR= c
)
2
[ M R ] ( 1-
==
[ M ] [ R ]
1-
=
c
K
cc
c
MmRn型?
11.7.6 光度滴定
NaOH滴定 对硝基苯酚 pKa=7.15
间硝基苯酚 pKa=8.39
pKa
=1.24
V1 V2 VNaOH/mL
对硝基苯酚间硝基苯酚 酸形均无色,
碱形均黄色典型的光度滴定曲线依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。
Vsp
滴定剂与待测物均吸收
Vsp
滴定剂吸收
Vsp
被滴物吸收
Vsp
产物吸收例：
维生素 B12 的水溶液在 361nm处的百分吸光系数为 207,用 1cm比色池测得某维生素 B12溶液的吸光度是 0.414，
求该溶液的浓度
解：
mLgmLg
bE
A
C
cm
/0.20100/00200.0
1207
414.0
1
%1
例：
精密称取 B12样品 25.0mg,用水溶液配成 100ml。
精密吸取 10.00ml,又置 100ml容量瓶中,加水至刻度 。 取此溶液在 1cm的吸收池中,于 361nm处测定吸光度为 0.507,求 B12的百分含量？ （ 百分吸光系数为 207）
解：
mLgmLgC i /1045.2100/1045.21207 507.0 53
mLgC /1050.2
100
10
100
1050.2 52
样
%0.98%100
1050.2
1045.2%100%
5
5
12
样C
CB i
例：
解：
%)0.764(
591.010010
25000.20
1
%1
255
367
iE
AmLmL
mLmg
cm
mlmLH C l
求已知测移取稀至样品稀至吡啶
mLgmLg
bE
A
C
cm
i
/1092.7100/1092.7
764
591.0
64
1
%1
%0.99%100
100
10
250
100.2
1092.7
%100%
2
6
样C
C
i i
思考题与习题习题 1.朗伯 -比耳定律的物理意义是什么？什么叫吸收曲线？什么叫标准曲线？
习题 2.摩尔吸光系数的物理意义是什么？
习题 3.为什么目视比色法可采用复合光（日光），而吸光光度法则必须采用单色光？分光光度计是如何获得单色光的？
习题 4.符合朗伯 —比尔定律的有色溶液，当其浓度增大后,λmax,T,A和 ε有无变化？有什么变化？
习题 5,6
习题 5.同吸收曲线的肩部波长相比，为什么在最大吸收波长处测量能在较宽的浓度范围内使标准曲线呈线性关系？
习题 6.两种蓝色溶液，已知每种溶液仅含有一种吸光物质，同样条件下用 1cm比色皿测得如下的吸光度值。问这两种溶液是否是同一种吸光物质？试解释之。
溶液 A770 ｎｍ A820ｎｍ
1 0.622 0.417
2 0.391 0.240
习题 7,8,9,10
习题 7.什么是适宜的吸光度读数范围？此范围的大小取决于什么因素？测定时如何才能获得合理的吸光度读数？
习题 8.显色剂的选择原则是什么？显色条件是指的哪些？如何确定适宜的显色条件？
习题 9.分光光度计由哪些部分组成？各部分有什么作用？
习题 10.某试液用 2cm比色皿测量时,T=100%
。 若用 1cm或 3cm比色皿进行测量,T及 A各是多少？（答,77.4%,0.111； 46.5%,0.333）
。
习题 11,12
习题 12.以 MnO4-形式测量合金中的锰 。 液解
0.500g合金试样并将锰全部氧化为 MnO4-后,将溶液稀释至 500mL,用 1cm比色皿在 525nm处测得该溶液的吸光度 A=0.400； 而 1.00?10-4
mol·L-1的 KMnO4在相同条件下测得的 A=0.585。
设 KMnO4溶液在此范围内服从光的吸收定律 。 试求合金试样中 Mn的质量分数 。 （ 答,0.376）
习题 11.含 Cu2+为 0.510mg·L-1的溶液，用双环己酮草酰二腙显色后，在 600nm处用 2cm比色皿测得 A=0.300。 求透光率 T,吸光系数 a和摩尔吸光系数 ε。
（ 答,79.1%； 2.9?102 L·g-1·cm-1； 1.9?104L·mol-
1·cm-1）
习题 13.
习题 13.两种无色物质 X和 Y经反应生成一种在
550nm处?=450L·mol-1·cm-1的有色配合物 XY。 该配合物的标准离解常数是 6.00?10-4。当等体积混合浓度均为 0.00100 mol·L-1的 X和 Y溶液时，
用 1cm的比色皿在 550nm处测得的 A是多少？
（答,1.59）
重点：
光吸收定律、吸收曲线、工作曲线及其应用；提高吸光分析法选择性和准确度的主要途径；吸光分析法的原理和实际应用难点,测量条件的选择，工作曲线的绘制和使用教学内容,１,概述,（ 吸光光度法的意义和应用；比色分析法和分光光度法的特点 ） 。
２、吸光光度法的基本原理。 [光的性质和物质对光的吸收； 溶液颜色和光吸收的关系,吸收曲线；朗伯 -比耳定律 (吸光度 A与透光度 T的关系,吸光系数、摩尔吸光系数、灵敏度及其意义 )]。
３、比色和分光光度法的方法和仪器：（
光度分析法的类型 -目视比色法、光电比色法、
分光光度法的测定方法、仪器原理及构造，主要讲 721,722型分光光度计）。
重点：
４、显色反应及其影响因素：（吸光光度法对显色反应的要求；影响显色反应的主要因素；
多元络合物显色体系简介和重要的显色剂）。
５,光度法测量误差及测量条件的选择,（ 偏离朗伯比耳定律的原因；仪器测量误差对分析结果的影响；适宜吸光度范围的控制；入射光波长和参比溶液的选择 ） 。
重点：
６,吸光光度法的应用,（ 工作曲线法,
标准比较法,差示法,光度滴定法,络合物组成的确定,弱酸 (碱 )电离常数的测定,其它方面的应用简介 ---双波长分光光度法,微分分光光度法,流动注射光度法 ） 。
重点：
了解光度法的意义和应用；巩固光的性质，溶液颜色和光吸收的关系，熟记光的互补示意图
。 掌握光度法的特点、测定方法、仪器使用；
朗伯 —比耳定律及其应用；摩尔吸光系数（ ε
）,桑德尔灵敏度（ｓ）及其意义； ε 与ｓ的关系；光度法对显色反应的要求；显色条件的确定和测量条件的选择；工作曲线法、标准比较法的应用。学会标准曲线的制作方法，并能根据标准曲线计算分析结果。通过自学了解差示光度滴定法、络合物组成的确定，弱酸（碱
）电离常数的测定。
要求实验方案设计参与式讨论试设计用吸光光度法测定防晒霜中 UV
A含量的实验方案（ 包括测定原理、标准物质、参比溶液、工作曲线，计算方法 ）。
化学分析与仪器分析方法比较化学分析 (Chemical analysis)：
常量组分 (>1%),Er 0.1%～ 0.2%
依据化学反应,使用玻璃仪器仪器分析 (Instrumental analysis)：
微量组分 (<1%),Er 1%～ 5%
依据物理或物理化学性质,需要特殊的仪器例,含 Fe约 0.05%的样品,称 0.2g,则
m(Fe)≈0.1mg重量法 m(Fe2O3)≈0.14mg,称不准容量法 V(K2Cr2O7)≈0.02mL,测不准光度法 结果 0.048%～ 0.052%,满足要求准确度高灵敏度高
11.1 概述 (Brief introduction)
11.1.1.光的基本性质
c－ 真空中光速 2.99792458× 108m/s
λ－ 波长,单位,m,cm,mm,?m,nm,?
1?m=10-6m,1nm=10-9m,1?=10-
10m
ν－ 频率,单位：赫芝（周） Hz 次 /秒
n－ 折射率,真空中为 1
==cV n光的传播速度,
1,波动性
光是电磁波,以巨大速度通过空间,不需要任何物质作为传播媒介的一种能量磁场向量电场向量传播方向
Y
Z X
与物质作用
2,微粒性
h－ 普朗克 (Planck)常数 6.626× 10-34J·s
－ 频率
E－ 光量子具有的能量单位,J(焦耳 ),eV(电子伏特 )
光量子，具有能量 。
Eh
3,波粒二象性结论,一定波长的光具有一定的能量，波长越长 (频率越低 )，光量子的能量越低。
单色光,具有相同能量 (相同波长 )的光。
混合光,具有不同能量 (不同波长 )的光复合在一起。
电磁波谱的波段如何划分?
==cE h h
n
真空中,
c
Eh
高能辐射区 γ射线 能量最高,来源于核能级跃迁
χ射线 来自内层电子能级的跃迁光学光谱区 紫外光 来自原子和分子外层电子能级的跃迁可见光红外光 来自分子振动和转动能级的跃迁波谱区 微波 来自分子转动能级及电子自旋能级跃迁无线电波 来自原子核自旋能级的跃迁
4,电磁波谱 (Electromagnetic
waves)
电磁辐射按波长顺序排列,称 ~。
γ射线 → X 射线 → 紫外光 → 可见光 → 红外光 → 微波 → 无线电波
5,光学光谱区
(Spectral region)
(真空紫外 )
远红外中红外近红外可见近紫外远紫外
10nm~
200nm
中层电子
200nm
~380nm
价电子
380nm
~ 780nm
价电子
780 nm
~ 2.5?m
分子振动
2.5?m
~ 50?m
分子振动
50?m
~300?m
分子转动
6,光学分析法及其分类
1）光学分析法 (Optical analysis)
依据物质发射的电磁辐射或物质与电磁辐射相互作用而建立起来的各种分析法的统称 ~。
2）分类：
(1)光谱法 (Spectrometry),利用物质与电磁辐射作用时，物质内部发生量子化能级跃迁而产生的吸收、发射或散射辐射等电磁辐射的强度随波长变化的 定性,定量 分析方法
按能量交换方向分 吸收光谱法发射光谱法
按作用结果不同分 原子光谱 → 线状光谱分子光谱 → 带状光谱
(2) 非光谱法：
利用物质与电磁辐射的相互作用,测定电磁辐射的反射,折射,干涉,衍射和偏振等基本性质变化的分析方法分类,折射法,旋光法,比浊法,χ射线衍射法
(3) 光谱法与非光谱法的区别：
光谱法,内部能级发生变化 (波长改变 )
原子吸收 /发射光谱法,原子外层电子能级跃迁 分子吸收 /发射光谱法,分子外层电子能级跃迁
非光谱法,内部能级不发生变化仅测定电磁辐射性质改变 (波长不变 )
11.2 吸光光度法
(Spectrophotometry)
— 灵敏度高,测定下限可达 10－ 5～ 10－
6mol/L,
10-4%～ 10-5%
– 准确度 能够满足微量组分的测定要求：
相对误差 2～ 5％ （ 1～ 2％）
– 操作简便快速
– 应用广泛吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有 选择性吸收 的特性而建立起来的分析方法。
11.2.1 特点 (Merits)
11.2.2 溶液中溶质分子对光的吸收
/nm 颜色 互补光
400-
450
紫 黄绿
450-
480
蓝 黄
480-
490
绿蓝 橙
490-
500
蓝绿 红
500-
560
绿 红紫
560-
580
黄绿 紫不同颜色的可见光波长及其互补光
1.物质对光的选择性吸收及吸收曲线吸收 (absorption):一种物质呈现何种颜色
,是与入射光的组成和物质本身的结构有关 。
溶液呈现不同的颜色是由溶液中的质点 （ 离子或分子 ） 对不同波长的光具有选择性吸收而引起的 。 当白光通过某一有色溶液时,该溶液会选择性地吸收某些波长 (wavelength)的光而让未被吸收的光透射过,即溶液呈现透射光的颜色,亦即呈现的是它吸收光的 互补光 的颜色 。
例如,KMnO4溶液选择吸收了白光中的 绿色
(500~560nm)光,与绿色光互补的紫色光因未被吸收而透过溶液,所以 KMnO4溶液呈现 紫色 。
Cr2O72-,MnO4-的吸收光谱
(Absorption spectra of Cr2O72-、
MnO4- )
400 500 600 700?/nm350
525 545
Cr2O72- MnO4
-1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
Ab
so
rb
an
ce
350
440
nm
2.吸收光谱产生的原理
物质分子内部六种运动形式：
（ 1）电子相对于原子核的运动 Ee；
（ 2） 原子核在其平衡位置附近的相对振动 Ev；
（ 3） 分子本身绕其重心的转动 Er；
（ 4） 原子的核能 En；
（ 5） 分子的平动能 Et；
（ 6） 基团间的内旋转能 Ei。
在紫外光的照射下,En不变,Et和 Ei较小。
所以，体系吸收能量而发生跃迁时：
△ E = △ Ee + △ Ev+ △ Er
分子的能级三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量
ΔEe(1~20eV)
>ΔEv (0.05~1eV)
>ΔEr
(0.005~0.05eV)
电子能级的跃迁当用 可见光或紫外光照射分子时，价电子可以跃迁产生吸收光谱，
在电子能级变化的同时
，不可避免地伴随分子振动和转动的能级变化
。因此他包含了大量谱线，并由于这些谱线的重叠而成为连续的吸收带。
分子的激发
(Excitation)
E = E2 - E1 = h?
量子化 ；选择性吸收 ;
分子结构的复杂性使其对不同波长光 的吸收程度不同；
用不同波长的单色光照射，测吸收光的程度随光波长的变化 —吸收曲线与最大吸收波长?max(wavelength
maximum)。
M + h M *
基态 (ground state) 激发态 (Excited state)
E1 △ E E2
苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱
(Absorption spectra of
benzene and toluene in
cyclohexane)
苯 (254nm) 甲苯(262nm)
A
230 250
270
吸收曲线 (absorption spectrum)的讨论：
1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。
吸光度最大处对应的波长称为 最大吸收波长
(?max)
2） 同一物质不同浓度的溶液,光吸收曲线形状相似，其最大吸收波长不变；但 在一定波长处吸光度随溶液的浓度的增加而增大 。这个特性可作为物质定量分析的依据。在实际测定时，
只有在 λmax处测定吸光度，其灵敏度最高，因此，吸收曲线是吸光光度法中选择测量波长的依据。
3） 不同物质吸收曲线的形状和最大吸收波长均不相同。光吸收曲线与物质特性有关，故据此可作为物质定性分析的依据。
11.2.3 光吸收基本定律
It
I0
b dx
I I-dI
s
1,朗伯定律 (Lambert’s law)
2,比尔定律 (Beer’s law)
A=k2c
A=lg(I0/It)=k1b
3 朗伯 -比尔定律
0
tIT=
I
= 1 0 = 1 0T - k b c - A
A = lg (I0/It) = lg(1/T) = -lgT = kbc
1) T－ 透光率
(Transmittance)
A=kbc A— 吸光度 (absorbance)b— 介质厚度 (length/cm)
c— 浓度 (concentration)
K— 吸光系数 (absorptivity)
2）吸光系数 (Absorptivity)
a的单位,L·g-1·cm-1
当 c的单位用 g·L-1表示时，用 a表示，
A＝ abc
的单位,L·mol-1·cm-1
当 c的单位用 mol·L-1表示时，用?表示,
－摩尔吸光系数 (Molar absorptivity)
A＝?bc
1%1cmE
1%1cmE 1%1cmE
当 c的单位用 g·(100mL)-1表示时，用表示,A＝ bc,叫做比消光系数
3）吸光度 (A),透光率 (T)与浓度 (c)的关系
A T
c
= 1 0 - k b cT
A=kbc
线性关系吸光度与光程的关系 A =?bc
检测器
b
样品光源
0.22
吸光度光源检测器
0.00
吸光度光源检测器
0.44
吸光度
b
样品
b
样品吸光度与浓度的关系 A =?bc
吸光度
0.00
光源检测器吸光度
0.22
光源检测器
b
吸光度
0.44
光源检测器
b
摩尔吸光系数 (?)的讨论
1） 吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数,可作为 定性鉴定的参数 ；
2） 不随浓度 c和光程长度 b的改变而改变 。 在温度和波长等条件一定时,ε仅与吸收物质本身的性质有关,与待测物浓度无关；
3） 同一吸收物质在不同波长下的 ε值是不同的 。 在最大吸收波长 λmax处的摩尔吸光系数,
常以 εmax表示 。 εmax表明了该 吸收物质最大限度的吸光能力,也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度 。
摩尔吸光系数 (ε) 的讨论
4） εmax越大表明该物质的吸光能力越强,用光度法测定该物质的灵敏度越高 。
ε>105,超高灵敏；
ε=(6～ 10） × 104,高灵敏；
ε<2× 104,不灵敏 。
5） ε在数值上等于浓度为 1mol/L,液层厚度为 1cm时该溶液在某一波长下的吸光度 。
朗伯 -比尔定律的适用条件
1) 单色光,应选用?max处或肩峰处测定
2) 吸光质点形式不变,离解、络合、缔合会破坏线性关系,应控制条件 (酸度、浓度、介质等 )
3) 稀溶液,浓度增大，分子之间作用增强亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱
Absorption spectra of Methylene blue
(nm)
a,6.36× 10-6 mol/L
b,1.27× 10-4 mol/L
c,5.97× 10-4 mol/L
亚甲蓝阳离子单体 (monomer)
max= 660 nm
二聚体 (dimer)
max= 610 nm
二聚体的生成破坏了 A与 c的线性关系
4 朗伯 -比尔定律的分析应用
(Analytical applications of Lambert-Beer’s law)
0 1 2 3 4 mg/ml
A
*
0.8
0.6
0.4
0.2
0
溶液浓度的测定
A＝?bc
A ~ c
工作曲线法
(校准曲线 )
Calibration curve
11.2.4 吸光度的测量与吸光度的加和性
A = A1 + A2 + … +An
用参比溶液 (reference solution)调 T =
100%（ A=0）,再测样品溶液的吸光度，
即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。
11.3 比色法和吸光光度法和及其仪器方便、灵敏，准确度差。常用于限界分析。
观察方向1.目视比色法
c4c3c2c1
c1 c2 c3 c4
11.3.1 光度分析的几种方法
2,光电比色法 (colorimetry)
通过滤光片 (filter)得一窄范围的光 (几十
nm)
光电比色计结构示意图灵敏度和准确度较差
3,吸光光度法和分光光度计
(spectrophotometer)
光源 单色器 吸收池 检测系统稳压电源 分光光度法的基本部件通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光,
波长可调,故选择性好,准确度高,
光路示意图分光光度计内部光的传播途径
11.3.2 分光光度计的类型
chopper
1．单光束分光光度计
特点：
使用时来回拉动吸收池
→ 移动误差
对光源要求高
比色池配对
722型分光光度计结构方框图光源吸收池 检测系统分光系统显示系统可见分光光度计可见分光光度计
2．双光束分光光度计
特点,不用拉动吸收池,可以减小移动误差
对光源要求不高
可以自动扫描吸收光谱紫外 -可见分光光度计
U-3400型紫外 -可见分光光度计
3．双波长分光光度计?特点：? 利用吸光度差值定量
消除干扰和吸收池不匹配引起的误差
11.4 分光光度计的主要部件
1,光源 (Light source),发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。
可见光区,钨灯，碘钨灯 (320 ～ 2500 nm)
紫外区,氢灯，氘灯 (180 ～ 375 nm)
2,单色器 (monochromator),将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。
棱镜,玻璃 350 ～ 3200 nm,石英 185 ～ 4000 nm
光栅,波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便单色器
①入射狭缝,光源的光由此进入单色器；
②准光装置,透镜或返射镜使入射光成为平行光束；
③色散元件,将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；
④聚焦装置,透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；
⑤出射狭缝：
单色器棱镜,依据不同波长光通过棱镜时折射率不同入射狭缝 准直透镜 棱镜 聚焦透镜 出射狭缝白光
λ 1
λ 2
800
600
500
400
光栅,在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的 等宽度等间距 条痕 (600,1200、
2400条 /mm )。
M1
M2
出射狭缝光屏透镜平面透射光栅光栅衍射示意图原理：
利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光,
光栅
3.吸收池 (cell):用于盛待测及参比溶液。
玻璃 — 能吸收 UV光，仅适用于可见光区石英 — 不吸收紫外光,适用于紫外和可见光区
要求：匹配性 （ 对光的吸收和反射应一致 ）
4,检测器 (detector),利用光电效应，将光能转成电流讯号。
光电池，光电管，光电倍增管检测器硒光电池光电管红敏管 625-1000
nm
蓝敏管 200-625 nm
Ni环（片）
碱金属光敏阴极h?
光电倍增管（ 160-700 nm）
待扫描
1个光电子可产生 106～ 107个电子光电倍增管
5,指示器 (display)
低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录多通道仪器 （ Multichannel instruments）
光电二极管阵列 (通常具有 316个硅二极管 )
Photodiode arrays (PDAs)
同时测量 200～ 820nm范围内的整个光谱,比单个检测器快 316倍,信噪比增加 316 1/2 倍,
其它类型分光光度计将光度计放入样品中,原位 (In situ)测量,
对环境和过程监测非常重要,
纤维光度计镀铝反射镜纤维光度计示意图纤维光度计
11.5 光度分析法设计
1,显色反应的选择
*灵敏度高 (High sensitivity),一般 ε>104
*选择性好 (Good selectivity)
*显色剂在测定波长处无明显吸收。
*对照性好,?λmax>60 nm,
*反应生成的有色化合物 组成恒定，稳定。
*显色条件易于控制,重现性好 。
2.显色剂 (Color reagents)
无机显色剂,[Fe(SCN)]2+,[TiO·H2O2]2+
有机显色剂,
11.5.1 显色反应 (Color reactions)
1) 生色团（发色团）
O
－ N＝ N－，－ N＝ O，
OC=S,－ N （ 共轭双键） πe
能吸收紫外 -可见光的基团
有机化合物,具有不饱和键和未成对电子的基团产生 n→ π*跃迁和 π→ π*跃迁,跃迁
E较低注,当出现几个发色团共轭,则几个发色团所产生的吸收带将消失,代之出现新的共轭吸收带,其波长将比单个发色团的吸收波长长,
强度也增强
2) 助色团
本身无紫外吸收,但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团
有机物,连有杂原子的饱和基团
例,— OH,—OR,—NH—,—
NR2—,—X
3) 红移和蓝移由于化合物结构变化 （ 共轭,引入助色团取代基 ） 或采用不同溶剂后,吸收峰位置向长波 方向 的移 动,叫 红移 ( Bathochromic
shift); 吸收峰位置向短波方向移动,叫 蓝移
(Hyptochromic sfift).
4) 增色效应和减色效应增色效应,吸收强度增强的效应减色效应,吸收强度减小的效应
5) 强带和弱带
εmax>105 → 强带 (Strong band)
εmin<103 → 弱带 (Weak band)
有机显色剂
CH3－ C－ C－ CH3
HO－ N N－ OH
＝ ＝
NN
OH
COOH
SO3H
OO型：
N
N N OH
OH
ON型,PAR
NH NH
N
S
N
S型,双硫腙
NN型,丁二酮肟邻二氮菲磺基水杨酸
11.5.2 显色条件的选择
cR cR cR
1,显色剂用量 (cM,pH一定 )
Mo(SCN)32+ 浅红
Mo(SCN)5 橙红
Mo(SCN)6- 浅红
Fe(SCN)n3-n
2,显色反应酸度（ cM,cR一定）
pH1<pH<pH2
pH
邻二氮菲－亚铁反应完全度与 pH的关系
Fe2++3R
R ( H )Fe ( A )
33
33
3
[ F e R ]
'
[ F e '] [ R ']
3
3 F e ( A ) R ( H )
[ F e R ]lg lg lg 3 lg 3 lg [ R ' ]
[ F e ']
H＋H＋A柠檬酸
cR≈[R′]=10-4mol·L-1
β3＝ 1021.3β3 FeR3
酸度的影响
3[F e R ]lg
[F e ]?
pH3.5～ 5.7为适宜的酸度范围
3,显色温度及显色时间另外，还有介质条件、有机溶剂、表面活性剂等
T1(℃ )
T2(℃ )
t(min)
A
4.干扰及消除化学法
Co2＋,Fe3+ Co
2+
FeF63- Co(SCN)2 (蓝 )
⑴ NaF SCN－
Co2+
Fe2+,Sn4+
(2)Sn2+
Co(SCN)2
SCN－
测 Co2＋ (含 Fe3+)
掩蔽法氧化还原法测 Co2＋ (生成络合物性质不同 )
Co2+,Zn2+,
Ni2+,Fe2+
CoR,ZnR
NiR,FeR
CoR,Zn2+,
Ni2+,Fe2+
钴试剂 R H+
如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，则需采取分离法。
测 Fe3＋ (控制 pH)
Fe3+,Cu2+ FeSS （ 紫红）Cu2+pH 2.5 SS
磺基水杨酸
11.5.3测量条件的选择
1,选择适当的测定波长
515 655
钍 -偶氮砷 III
A
络合物试剂
415 500
钴 -亚硝基红盐
A
络合物试剂下测定须在左右
m a x
m a x
m a xm a x
cb
A
A
A
较小的测定灵敏度高
1)仅络合物有吸收,溶剂 作参比。
如 phen—Fe2+ 标准曲线
2)待测液也有吸收,被测液 作参比。
如 测汽水中的 Fe
3)显色剂或其它试剂也有吸收,空白溶液 作参比例,邻二氮菲光度法测 Li2CO3中的 Fe，
参比溶液为不含 Li2CO3样品的所有试剂。
4)干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：
(1)掩蔽被测组分,再加入显色剂，作参比溶液,
(2)加入等量干扰组分 到空白溶液中,作参比溶液,
2.选择适当的参比溶液
11.5.4定量分析
（ 一 ） 单组分的定量方法
1．吸光系数法
2．标准曲线法
3,对照法：外标一点法
lECA定量依据：
续前
1．吸光系数法（绝对法）
要求单色光前提：
iE CAmLgCigW 求含样过程,已知稀释 )/(/)(
lE
AmLgC
i]1 0 0/[
l
ALm o lC
i]/[或
%1 0 0%
样C
Ci i
练习
例：维生素 B12 的水溶液在 361nm处的百分吸光系数为 207,用 1cm比色池测得某维生素 B12溶液的吸光度是 0.414,求该溶液的浓度
解：
mLgmLglE AC /0.20100/0 0 2 0 0.01207 414.0
练习
例：精密称取 B12样品 25.0mg,用水溶液配成
100ml。 精密吸取 10.00ml,又置 100ml容量瓶中,
加水至刻度 。 取此溶液在 1cm的吸收池中,于
361nm处测定吸光度为 0.507,求 B12的百分含量？
解：
mLgmLgC i /1045.2100/1045.21207 507.0 53
mLgC /1050.210010100 1050.2 5
2
样
%0.98%100
1050.2
1045.2%100%
5
5
12
样C
CB i
练习
例：
解：
%)0.764(
591.010010
25000.20
367
255
iE
AmLmL
mLmg
mlmLH C L
求已知测移取稀至样品稀至吡啶
mLgmLglE AC i /1092.7100/1092.7764 591.0 64
%0.99%100
250
10
100
100.2
1092.7
%100%
2
6
样C
C
i i
续前
2．标准曲线法条件前提：固定仪器和测定
CACKA
样样同上条件固定条件查得测定样品曲线分别测定配制标准系列过程：
CA
ACA
~
标样标样标样标样
A
AC
C
A
A
C
C?
示例
芦丁含量测定
mLmg
mLmLmLmg
250.3
255~0/200.0
样品标样分别移取
0.710mg/25mL
续前
3．对照法：外标一点法
注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时标样与样品浓度相近；截距为固定仪器和测定条件；前提：
0
标样 和分别测定一定过程,AA
S
i
Si A
ACC
sC
iC
C
S
i
Si A
Amm
%1 0 0% mmi i
练习?例,维生素 B
12的含量测定精密吸取 B12注射液 2.50mL,加水稀释至 10.00mL；
另配制对照液,精密称定对照品 25.00mg,加水稀释至 1000mL。 在 361nm处,用 1cm吸收池,分别测定吸光度为 0.508和 0.518,求 B12注射液注射液的浓度以及标示量的百分含量 （ 该 B12注射液的标示量为 100μg / mL）
解：
1）对照法
mLgCC ii /1.98518.0 508.01 0 0 01 0 0 000.2510 5.2
%1.98%100%12 标示量标示量 iCB
练习
2）吸光系数法
12 0 7
5 0 8.0
10
50.2
ii ClE
AC?
mLgC i /1.98
%1.98%100%12 标示量标示量 iCB
续前 （ 二 ） 多组分的定量方法
cba AAAA 总定量依据：
三种情况：
1,两组分吸收光谱不重叠 （ 互不干扰 ）
两组分在各自 λmax下不重叠 → 分别按单组分定量
a
a
aa
aa
E
ACCEA
1
1
11由
b
b
bb
bb
E
ACCEA
2
2
22由
bb
aa
AE
AE
222
111；测定；测定过程：
续前
2,两组分吸收光谱部分重叠
λ1→ 测 A1→ b组分不干扰 → 可按单组分定量测 Ca
λ2→ 测 A2→ a组分干扰 → 不能按单组分定量测 Ca
baba
aa
AEE
AE
2222
111；和测定；测定过程：
a
a
aa
aa
E
ACCEA
1
1
11由
bbaababa CECEAAA 22222由
b
a
aba
b E
CEAC
2
22
续前
3,两组分吸收光谱完全重叠 ——混合样品测定
（ 1） 解线性方程组法
（ 2） 等吸收双波长消去法
（ 3） 系数倍率法
(1)．解线性方程组法步骤：
baba
baba
AEE
AEE
2222
1111；和测定；和测定
bbaababa CECEAAA 11111
bbaababa CECEAAA 22222
baba
bbabba
a EEEE
EAEAC
1221
1221
baba
abaaba
b EEEE
EAEAC
1221
2112
(2)．等吸收双波长法步骤：
消除 a的影响测 b
baba
baba
AAA
AAA
222
111
babbaabababa AAAAAAAAA )()( 212121
aa AAa 2121 和的等吸收点选
bb
b
bb
bbba
CE
CEE
AAA
)( 21
21
b
ba
bb
ba
b E
A
EE
AC
21
续前
消去 b的影响测 a
注：须满足两个基本条件
选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点
选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大
bb AAb '2'1'2'1 和的等吸收点选
aa
a
aa
aaba
CE
CEE
AAA
)(
'
21
'2'1
a
ba
aa
ba
a E
A
EE
AC
''
'2'1
(3)．系数倍率法
前提：干扰组分 b不成峰形无等吸收点续前?步骤,b曲线上任找一点 → λ
1
另一点 → λ2
优点：同时将待测组分和干扰组分放大信号 K倍,
提高了待测组分测定灵敏度
ab
λ1 λ2
倍率因子令 K
A
A
b
b
2
1
)()(
)()(
1212
1122
12
aabb
abab
bababa
AKAAKA
AAAAK
AKAA
bA1
bA2
aaaaaba CEKEAKAA )( 1212
的干扰消除了 bCA aba
练习解：
1,取咖啡酸,在 165℃ 干燥至恒重,精密称取 10.00mg,加少量乙醇溶解,转移至 200mL容量瓶中,加水至刻度线,取此溶液 5.00mL,置于 50mL容量瓶中,加 6mol/L的 HCL 4mL,加水至刻度线 。 取此溶液于 1cm比色池中,在 323nm处测定吸光度为 0.463,已知该波长处的,求咖啡酸百分含量
9.9 2 7%11?cmE
mLgmLgC i /10900.4100/10900.419.927 463.0 64
mLgC /10000.5505200 1000.10 6
3
样
%0.98%100
10000.5
10900.4%100%
6
6
样咖啡酸
C
C i
50
5
200
1
稀释因子注：
练习解：
2,精密称取 0,0500 g样品,置于 250mL容量瓶中,加入
0.02mol/L HCL溶解,稀释至刻度 。 准确吸取 2mL,稀释至
100mL。 以 0.02mol/L HCL为空白,在 263nm处用 1cm吸收池测定透光率为 41.7%,其摩尔吸光系数为 12000,被测物分子量为 100.0,试计算 263nm处 和样品的百分含量 。%1
1cmE
12000.100 120001010%11ME cm
mLgmLg
lE
T
lE
A
C i
/10165.3100/10166.3
11 2 0 0
417.0lglg
64
mLgC /10000.4100 22500500.0 6样
%15.79%100
10000.4
10165.3%100%
6
6
样样品
C
C i
11.6 光度分析法的误差
11.6.1 偏离 Beer定律的因素依据 Beer定律,A与 C关系应为经过原点的直线偏离 Beer定律的主要因素表现为以下两个方面
1,光学因素
2,化学因素
cbA
1.光学因素
1) 非单色光的影响
Beer定律应用的重要前提 ——入射光为单色光照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定为了保证透过光对检测器的响应,必须保证一定的狭缝宽度这就使分离出来的光具一定的谱带宽度续前
21
00
21
和I为I对应的透过光光强分别和II入射光光强分别为的光组成和 λ设入射光由波长为 λ
21
bcIIcb
I
ITA 10lglg
0
0
0201
0201
0201
0201
0201
21
21
1
21
10
10
1010
II
II
II
II
II
II
T
bc
bc
bcbc
）（
又
0201
0201
1
2110
lglg
II
IIbcTA bc
）（
讨论：
入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状
结论：
选择较纯单色光（ Δλ↓,单色性 ↑ ）
选 λ max作为测定波长（ Δ?↓,S↑ 且成线性）
偏离线性关系越严重与）（
定律不成线性关系，偏离与成线性关系
cA
B e e rcA
bcA
21
21
121
2)反射光和杂散光的影响
杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内,与所选波长相距较远
杂散光来源,仪器本身缺陷；光学元件污染造成反射光和杂散光均是入射光谱带宽度内的光直接对 T产生影响
散射和反射使 T↓,A↑,吸收光谱变形注：一般可用空白对比校正消除
I0 I
3) 非平行光的影响
使光程 ↑,A↑,
吸收光谱变形
2,化学因素化学作用
Beer定律适用的另一个前提：
稀溶液浓度过高会使 c与
A关系偏离定律
11.6.2 准确度 —仪器测量误差光度计的读数误差一般为
0.2～ 2％
(ΔT),由于 T与浓度 c不是线性关系，
故不同浓度时的 ΔT
引起的误差不同。
100
80
60
40
20
0
T%
c1?c2?c3
T
T
T-透光率读数误差
c
c1
c1
c2
c2
c3
c3> <
仪器测量误差
%1 0 0
lg
4 3 4.0
%1 0 0
ln
%1 0 0%1 0 0
01.0
TT
T
TT
T
A
A
c
c
E
TdT
r
%1 0 0
ln
%1 0 0%1 0 0
ln4 3 4.0lg
1
lg
TT
dT
A
dA
c
dc
E
TT
T
bcA
r
浓度测量的相对误差与 T(或 A)的关系
10
8
6
4
2
0 20 40 60 800.7 0.4 0.2 0.1 AT%
Er r
0,4 3 4
lg
( 0,0 1 )
cT
E
c T T
T
(36.8)
0.434
实际工作中，应控制 T在 10～ 70％,A在 0.15～ 1.0之间例 1 邻二氮菲光度法测铁,?(Fe)=1.0
mg/L,b = 2cm,A = 0.38,计算?和解,cFe=1.0 mg/L=1.0× 10-3/55.85
=1.8× 10-5 mol/L
1%
1cmE
×
4 - 1 - 1
-5
0.38= = 1.1 10 L m o l cm
2 1.8 10
c =1.0 mg/L=1.0× 10-3 g
/1000mL
= 1.0× 10-4g/100mL
bc1%1cmA E=
1% m 431c -= 0,38 /2,0 10 = 1,9 10E
1%1cm 53= 1 0 = 1,1 1 0 / 5 5,8 5 =o 1,9 1 0r E / M?
11.7光度分析法的应用和其它吸光光度法如,单一组分测定
1) 金属离子,Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂
2) 磷的测定,DNA中含 P～ 9.2%,RNA中含 P～
9.5%,可得核酸量,H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3
=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O
磷钼黄 (?小 )
磷钼 (V)蓝 (?大 )
Sn2+
多组分的测定
x?1,?y?1,?x?2,?y?2由 x,y标液在?1,?2处分别测得
a) 在?1处测组分 x,在?2处测组分
y
b) 在?1处测组分 x; 在?2处测总吸收,扣除 x吸收,可求 y
c) x,y组分不能直接测定
A1=?x?1bcx+?y?1bcy(在?1处测得
A1)
A2 =?x?2bcx+?y?2bcy(在?2处测得
A2)
11.7.1 示差吸光光度法
普通分光光度法一般只适于测定微量组分，
当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。
需采用 示差法 。即提高入射光强度,并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液
。
设：待测溶液浓度为 cx,标准溶液浓度为
cs(cs < cx)。 则：
Ax= εb cx,As = εb cs
ΔＡ =Ａ x － Ａ s =εb(cx － cs ） =εbΔc
测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差 ΔＡ 。由标准曲线上查得相应的 Δc值，则待测溶液浓度 cx,cx = cs + Δc
示差法标尺扩展原理：
普通法,cs的 T=10%； cx的 T=5%
示差法,cs 做参比，调 T=100%
则,cx的 T=50% ； 标尺扩展 10倍
11.7.2 双波长分光光度法不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光 (λ 1和 λ 2)； 以参比波长 λ 1处的吸光度 Aλ 1作为参比，来消除干扰。 在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。
双波长分光光度法
ΔA ＝ Aλ 2 － Aλ 1 ＝ (ε λ 2 － ε λ 1)b c
两波长处测得的吸光度差值 ΔA与待测组分浓度 c成正比。 ε λ 1和 ε λ 2分别表示待测组分在 λ 1和 λ 2处的摩尔吸光系数。
测量波长 λ 2和参比波长 λ 1的选择与组合基本要求：
⑵在选定的两个波长 λ 1和 λ 2处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。
⑴选定的波长 λ 1和 λ 2处干扰组分应具有相同吸光度,即,ΔAy = ΔA yλ 2 － ΔA yλ 1 = 0
故,ΔAx+y = ΔA x=(ε xλ 2－ ε xλ 1)bcx
此时：测得的吸光度差 ΔA只与待测组分 x的浓度呈线性关系，而与干扰组分 y无关。若 x为干扰组分，则也可用同样的方法测定 y组分。
双波长分光光度法消除干扰在?2,A?2 = Ax2+Ay2
在?1,A?1=Ax1+Ay1
A= A?2 - A?1
= Ax2+Ay2 –(Ax1+Ay1)
= Ax2 –Ax1
=?Ax
Ay2 ＝ Ay1
Ax =(?x2－?x1)bcx
消除了 y的干扰
X被测 Y干扰
2?1?1
Ay1
AX1
Ay2
AX2
A
/nm
′
双波长分光光度法消除浑浊背景干扰
1?2
A A
1 -A?2 = △ A
△ A∝ c
例 牛奶中微量 Fe的测定
11.7.3 导数分光光度法导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面，显示了很大的优越性。
利用吸光度 (或透光度 )对波长的导数曲线来进行分析,Ｉ ＝ Ｉ 0 e-ε bc
假定入射光强度 Ｉ 0 在整个波长范围内保持恒定：
dI 0 /dλ ＝ 0
则,dI/dλ ＝－ Ｉ 0 bc e -ε bc dε /dλ
＝－ Ｉ 0 bc dε /dλ
导数分光光度法
dI/dλ ＝－ Ｉ 0 bc
dε /dλ
一阶导数信号与试样浓度呈线性关系；
测定灵敏度依赖于摩尔吸光系数对波长的变化率
dε /dλ 。 吸收曲线的拐点处 dε /dλ 最大，故其灵敏度最高。
同理可以导出其二阶和三阶导数光谱导数分光光度法 混合物导数光谱
A~?图
0
1
2
3
4
~A 图常药降压片中氢氯噻嗪含量的测定
1.氢氯噻嗪,
2.硫酸双肼肽嗪
3,盐酸可乐定
4.常药降压片
250 290 330?
4
1
2
3
1
2
A
A
肝中茚满二酮类抗凝血杀鼠剂的固相萃取方法,肝匀浆用乙腈浸提，浸提液用 6
％的 HClO4稀释，然后用 GDX100大孔树脂萃取，用二氯甲烷 5mL洗脱杀鼠剂,40℃ 挥干，剩余物用
0.1mol·L-1NaOH4mL溶解后，紫外导数光谱测定。
A
2
2
d
d
A
0.0c
d
a
b
D
a.空白肝普通光谱
b.2.5 mg/L敌鼠溶液的普通光谱
c.空白肝二阶导数光谱
d.2.5 mg/L敌鼠溶液的二阶导数光谱
11.7.4 一元弱酸离解常数的测定
HL H＋ ＋ L
HL
HL L= [ H L ] + [ L ]
KccA
KK
+ L
++
a
aa
(HL)[ H ] ( H L )=+
+ [ H ] + [ H ]
Ka＝ [H+][L]/[HL]
高酸度下，几乎全部以 HL存在，可测得 AHL＝ εHL·c(HL)；
低酸度下，几乎全部以 L存在，可测得 AL ＝ εL·c(HL).
代入整理：
AAK
A A
+HL
a L
-= [ H ]
-
[HL]
[L]
L
HL
AA
K AAa
-
p = p H + l g -或配制一系列 c相同,pH不同的溶液,测 A(设
b=1cm).
MO吸收曲线
Aa(HL)
Ab
(L)
1
2
3
4
5
6A
b65
4
32
1A
a
350 400 450 500 550 600?/nm
A
曲线 pH
1 1.10,1.38
2 2.65
3 3.06
4 3.48
5 3.98
6 5.53,6.80
由每份溶液的一对 pH,A，
可求得一个 Ka,
取平均值即可,
MO离解常数的测定作图法 LHLap p H l g AAK AA
H L L2AAA
AHL
3.32(pKa)
1 2 3 4 5 6
A
pH=pKa
pH
pHA 曲线
AL
L
HL
l g p HAAAA 曲线
0.6
0.4
0.2
0
-0.2
-0.4
-0.6
3.0 4.0 pH
HL
L [ H L ]lg g [L ]l AAAA
3.34
11.7.5 络合物组成的测定
(1)摩尔比法,固定 cM,改变 cR
1:
1
3:1
c(R)/c(M)
A
1.0 2.0 3,0
(2)等摩尔连续变化法,
M:R=1:1
0.5 0.33
cM/c cM/c
M:R=1:2
M R = M R nn?
MR (c c c ） 常数表观形成常数的测定 (设 M,R均无吸收 )
0.5
cM/cM:R=1:1
A0
A
0
0
cc
c
0
0
-
=
A A
A
cM + cR= c
)
2
[ M R ] ( 1-
==
[ M ] [ R ]
1-
=
c
K
cc
c
MmRn型?
11.7.6 光度滴定
NaOH滴定 对硝基苯酚 pKa=7.15
间硝基苯酚 pKa=8.39
pKa
=1.24
V1 V2 VNaOH/mL
对硝基苯酚间硝基苯酚 酸形均无色,
碱形均黄色典型的光度滴定曲线依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。
Vsp
滴定剂与待测物均吸收
Vsp
滴定剂吸收
Vsp
被滴物吸收
Vsp
产物吸收例：
维生素 B12 的水溶液在 361nm处的百分吸光系数为 207,用 1cm比色池测得某维生素 B12溶液的吸光度是 0.414，
求该溶液的浓度
解：
mLgmLg
bE
A
C
cm
/0.20100/00200.0
1207
414.0
1
%1
例：
精密称取 B12样品 25.0mg,用水溶液配成 100ml。
精密吸取 10.00ml,又置 100ml容量瓶中,加水至刻度 。 取此溶液在 1cm的吸收池中,于 361nm处测定吸光度为 0.507,求 B12的百分含量？ （ 百分吸光系数为 207）
解：
mLgmLgC i /1045.2100/1045.21207 507.0 53
mLgC /1050.2
100
10
100
1050.2 52
样
%0.98%100
1050.2
1045.2%100%
5
5
12
样C
CB i
例：
解：
%)0.764(
591.010010
25000.20
1
%1
255
367
iE
AmLmL
mLmg
cm
mlmLH C l
求已知测移取稀至样品稀至吡啶
mLgmLg
bE
A
C
cm
i
/1092.7100/1092.7
764
591.0
64
1
%1
%0.99%100
100
10
250
100.2
1092.7
%100%
2
6
样C
C
i i
思考题与习题习题 1.朗伯 -比耳定律的物理意义是什么？什么叫吸收曲线？什么叫标准曲线？
习题 2.摩尔吸光系数的物理意义是什么？
习题 3.为什么目视比色法可采用复合光（日光），而吸光光度法则必须采用单色光？分光光度计是如何获得单色光的？
习题 4.符合朗伯 —比尔定律的有色溶液，当其浓度增大后,λmax,T,A和 ε有无变化？有什么变化？
习题 5,6
习题 5.同吸收曲线的肩部波长相比，为什么在最大吸收波长处测量能在较宽的浓度范围内使标准曲线呈线性关系？
习题 6.两种蓝色溶液，已知每种溶液仅含有一种吸光物质，同样条件下用 1cm比色皿测得如下的吸光度值。问这两种溶液是否是同一种吸光物质？试解释之。
溶液 A770 ｎｍ A820ｎｍ
1 0.622 0.417
2 0.391 0.240
习题 7,8,9,10
习题 7.什么是适宜的吸光度读数范围？此范围的大小取决于什么因素？测定时如何才能获得合理的吸光度读数？
习题 8.显色剂的选择原则是什么？显色条件是指的哪些？如何确定适宜的显色条件？
习题 9.分光光度计由哪些部分组成？各部分有什么作用？
习题 10.某试液用 2cm比色皿测量时,T=100%
。 若用 1cm或 3cm比色皿进行测量,T及 A各是多少？（答,77.4%,0.111； 46.5%,0.333）
。
习题 11,12
习题 12.以 MnO4-形式测量合金中的锰 。 液解
0.500g合金试样并将锰全部氧化为 MnO4-后,将溶液稀释至 500mL,用 1cm比色皿在 525nm处测得该溶液的吸光度 A=0.400； 而 1.00?10-4
mol·L-1的 KMnO4在相同条件下测得的 A=0.585。
设 KMnO4溶液在此范围内服从光的吸收定律 。 试求合金试样中 Mn的质量分数 。 （ 答,0.376）
习题 11.含 Cu2+为 0.510mg·L-1的溶液，用双环己酮草酰二腙显色后，在 600nm处用 2cm比色皿测得 A=0.300。 求透光率 T,吸光系数 a和摩尔吸光系数 ε。
（ 答,79.1%； 2.9?102 L·g-1·cm-1； 1.9?104L·mol-
1·cm-1）
习题 13.
习题 13.两种无色物质 X和 Y经反应生成一种在
550nm处?=450L·mol-1·cm-1的有色配合物 XY。 该配合物的标准离解常数是 6.00?10-4。当等体积混合浓度均为 0.00100 mol·L-1的 X和 Y溶液时，
用 1cm的比色皿在 550nm处测得的 A是多少？
（答,1.59）
重点：
光吸收定律、吸收曲线、工作曲线及其应用；提高吸光分析法选择性和准确度的主要途径；吸光分析法的原理和实际应用难点,测量条件的选择，工作曲线的绘制和使用教学内容,１,概述,（ 吸光光度法的意义和应用；比色分析法和分光光度法的特点 ） 。
２、吸光光度法的基本原理。 [光的性质和物质对光的吸收； 溶液颜色和光吸收的关系,吸收曲线；朗伯 -比耳定律 (吸光度 A与透光度 T的关系,吸光系数、摩尔吸光系数、灵敏度及其意义 )]。
３、比色和分光光度法的方法和仪器：（
光度分析法的类型 -目视比色法、光电比色法、
分光光度法的测定方法、仪器原理及构造，主要讲 721,722型分光光度计）。
重点：
４、显色反应及其影响因素：（吸光光度法对显色反应的要求；影响显色反应的主要因素；
多元络合物显色体系简介和重要的显色剂）。
５,光度法测量误差及测量条件的选择,（ 偏离朗伯比耳定律的原因；仪器测量误差对分析结果的影响；适宜吸光度范围的控制；入射光波长和参比溶液的选择 ） 。
重点：
６,吸光光度法的应用,（ 工作曲线法,
标准比较法,差示法,光度滴定法,络合物组成的确定,弱酸 (碱 )电离常数的测定,其它方面的应用简介 ---双波长分光光度法,微分分光光度法,流动注射光度法 ） 。
重点：
了解光度法的意义和应用；巩固光的性质，溶液颜色和光吸收的关系，熟记光的互补示意图
。 掌握光度法的特点、测定方法、仪器使用；
朗伯 —比耳定律及其应用；摩尔吸光系数（ ε
）,桑德尔灵敏度（ｓ）及其意义； ε 与ｓ的关系；光度法对显色反应的要求；显色条件的确定和测量条件的选择；工作曲线法、标准比较法的应用。学会标准曲线的制作方法，并能根据标准曲线计算分析结果。通过自学了解差示光度滴定法、络合物组成的确定，弱酸（碱
）电离常数的测定。
要求实验方案设计参与式讨论试设计用吸光光度法测定防晒霜中 UV
A含量的实验方案（ 包括测定原理、标准物质、参比溶液、工作曲线，计算方法 ）。
