第十七章 色谱分析法概论教学目标
掌握色谱法的定义和分类。
掌握色谱法的重要基本概念：分配系数、容量因子、保留时间、保留体积、死时间、死体积、峰宽、半峰宽、分离度、保留指数等及其相互关系。
熟悉四种色谱方法的基本原理和两相的特点。
掌握塔板理论的要点及塔板数、塔板高的计算。
掌握速率理论的要点，熟悉 Van Deemter方程各项意义及影响因素。
流动相色谱分析法（ chromatography)
物理或物理化学 分离分析 方法，简称色谱法或层析法。
色谱法已广泛应用于各个领域，成为 多组分混和物的最重要的分析方法 。是生命科学、
材料科学、环境科学等领域的重要分析手段，
在药物分析中有及其重要的地位。各国药典都收载了许多色谱分析方法。
高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快及应用范围广等优点。
色谱法的分类
1.按流动相和固定相分子聚集状态分类气相色谱,气固色谱（ GSC）
（ GC） 气液色谱（ GLC）
液相色谱,液固色谱（ LSC）
（ LC） 液液色谱（ LLC）
超临界 流体 色谱法
（ SFC）
色谱法的分类
2.按操作形式分类柱色谱法（ column chromatography)
填充柱色谱法毛细管柱色谱法微填充柱色谱法平面色谱法（ plane chromatography)
纸色谱法薄层色谱法薄膜色谱法毛细管电泳法
（ capillary electrophoresis)
色谱法的分类
3.按分离机制分类分配色谱法
(patition chromatography)
吸附色谱法
(adsorption chromatography)
离子交换色谱法
(ion exchange chromatography)
空间排阻色谱法
(steric exclusion chromatography)
色谱过程样品组分在 两相之间反复,分配,
样品各组分的分配系数 不同各组分保留时间不同，
得以分离。
分配系数和容量因子
1.分配系数：
K=Cs / Cm
与组分、固定性和流动相的性质及温度有关。
2.容量因子,
k=ms/mm= CsVs/CmVm
还与固定性、流动相的体积有关。
3.分配系数与容量因子的关系：
k= K Vs/Vm
色谱过程方程
tR=t0( 1 + K Vs/Vm ) =t0( 1 + k )
色谱分离的前提
tR（ A） ≠tR（ B）
即,K A ≠ K B 或 k A ≠ k B
分配色谱法 （ patition chromatography）
分离原理：
利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。与萃取的区别是什么？
mm
ss
m
s
VX
VX
C
C
K
/
/
在 LLC中,K主要与流动相的性质（种类与极性）有关；
在 GLC中 K与固定相极性和柱温有关分配色谱法 （ patition chromatography）
固定相：涂渍或化学键合在惰性载体颗粒上的一薄层液体。
流动相：
GLC中常为氢气和氮气。
LLC中为与固定液不相溶的液体。根据固定性和流动相极性相对强度，分为 正相分配色谱 （固定相极性强于流动相极性）和 反相分配色谱 （固定相极性弱于流动相极性）。
分配色谱法 （ patition chromatography）
洗脱顺序正相色谱：极性强的组分保留强，后流出。
反相色谱：极性弱的组分保留强，后流出。
C
t
a
b
C
t
b
a
正相色谱 反相色谱极性,a<b
吸附色谱法 (adsorption chromatography)
分离原理利用被分离组分对固体表面活性吸附中心吸附能力的差别而实现分离。 吸附过程是样品中各组分的分子 X与流动相分子 Y争夺吸附剂表面活性中心的过程。
Xm + nYa = Xa + nYm
mm
aa
VX
SXK
/
/?
吸附系数与吸附剂的活性、组分的性质和流动相的性质有关。
吸附色谱法 (adsorption chromatography)
固定相：多孔性微粒状物质，具有较大的比表面积，在其表面有许多吸附中心。常用吸附剂：硅胶、氧化铝、聚酰胺、高分子多孔微球等。
流动相：洗脱能力主要由其极性决定，由溶剂强度 ε0定量表示。 ε0值越大，洗脱能力越强。常采用二元以上混合溶剂。
吸附色谱法 (adsorption chromatography)
洗脱顺序：极性强的组分被吸附强，后流出。一般规律是：
烷烃非极性,不被吸附；
不饱和化合物比饱和化合物的吸附能力强,双键越多越强；
基本母核相同的化合物,取代基极性越强,吸附能力越强；
分子中取代基空间排列对吸附能力也有影响 。
常见化合物吸附能力顺序：
烷烃 <烯烃 <醚 <硝基化合物 <叔胺 <酯 <酮 <醛 <酰胺
<醇 <酚 <伯胺 <羧酸离子交换色谱法 （ ion exchange chromatography）
分离原理：利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离。分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。
R B + A R A + B
NaHR S O -
3
HNaR S O -
3
交 换再 生
ClOHR N R
3
OHClR N R
3
交 换再 生
B
A
BA K
K
ABR
BARK?
/
离子交换色谱法 （ ion exchange chromatography）
固定相：离子交换树脂、硅胶键合离子交换剂。
离子交换树脂是具有网状结构的高分子多元酸或多元碱的聚合物 。 可被交换基团：－ SO3H,
－ COOH,－ NR3+OH- 。
性能指标：交联度,交换容量,粒度等 。
流动相：一定 pH值和离子强度的缓冲溶液
（或含少量有机溶剂，如乙醇、四氢呋喃、
乙腈等）。
离子交换色谱法 （ ion exchange chromatography）
影响保留行为的因素
1.溶质离子的电荷数升高，选择性系数增大；同价阳离子水合离子半径增大，选择性系数减小
Fe3+>Al3+>Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+≥
Cu2+≥ Co2+≥Mg2+ ≥Zn2+ ≥ Mn2+ > Ag+>
Cs+> Rb+> K+≥NH4+> Na+>H+ >Li+
柠檬酸根 > PO43->SO42->I->NO3->SCN->NO2-
>Cl->HCO3- >CH3COOH- >OH- >F-
影响保留行为的因素
2.在一定范围内，树脂的交联度越大，交换容量越大，组分的保留时间越长。
3.流动相的组成和 pH值：交换能力强的离子组成的流动相洗脱能力强；流动相的离子强度增强，
洗脱能力增强。 pH值一方面影响溶质的离解
（离解度小，则保留时间减小），一方面影响弱离子交换树脂的交换容量，一般在某一 pH值交换容量有一极大值。
离子交换色谱法 （ ion exchange chromatography）
小结：请同学们完成表格样品性质 固定相 流动相分配色谱极性（溶解度）：正相色谱极性强保留强，反之则反。
极性和形成氢键能力。
极性相似相溶，与组分极性相似，
洗脱能力增强。
吸附色谱离子交换色谱空间排阻各类色谱法中影响样品组分保留值的因素物质对分离的两种情况
C
t
C
t
提高分离度 R
增加?tR
减小 w
与分配系数有关－热力学过程与动力学过程有关塔板理论－ 马丁 （ Martin） 和辛格 （ Synge） 提出基本假设：
1,在柱内一小高度内，组分可以在两相中瞬间达到分配平衡。 H为理论塔板高度。
2,载气间歇式通过色谱柱，每次进气为一个塔板体积。
3,样品和新鲜载气都加在第 0号塔板上，且样品的纵向扩散可以忽略。
4,分配系数在各塔板上是常数。
0 1 2 3 4
载气固定相分配色谱过程示意图（塔板理论示意）
kA=2 kB=0.5
0 1 2 3 4
载气固定相
kA=2 kB=0.5
分配色谱过程示意图（塔板理论示意）
0 1 2 3 4
载气固定相
kA=2 kB=0.5
分配色谱过程示意图（塔板理论示意）
0 1 2 3 4
载气固定相
kA=2 kB=0.5
分配色谱过程示意图（塔板理论示意）
0 1 2 3 4
载气固定相
kA=2 kB=0.5
分配色谱过程示意图（塔板理论示意）
塔板数浓度样品经过 N次进气后在第 r号塔板上的质量分数：
r
m
rN
sr
N mm
rNr
Nm
)!(!
!
2 9 6.06 6 7.03 3 3.0
)!33(!3
!3 333
3
3
m
如经过 3次进气后，在第三号塔板上 B的质量分数为：
流出曲线方程：
N
m
5 10 15
0.05
0.10
0.15
k=1的组分从 n＝ 5柱中的流出曲线当塔板数很大时，流出曲线趋于正态分布：
2
2
2
2
2
)(
m a x
2
)(
0
2
R
R
tt
tt
eC
e
C
C
理论塔板高和理论塔板数－柱效指标理论塔板数,
2
2/1
2
2
)/(54.5
)/(16
)/(
Wt
Wt
tn
R
R
R
理论塔板高,
n
LH?
有效理论塔板数,
2
2/1
2
2
)/'(54.5
)/'(16
)/'(
Wt
Wt
tn
R
R
Ref
有效塔板高：
ef
ef n
L
H?
塔板理论的特点和不足：
1,当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大 (塔板高度
H 越小 )，被测组分在柱内被分配的次数越多，
柱效能则越高，所得色谱峰越窄。
2,不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。
3,柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数 K 相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。
4,塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。
速率理论
Van Deemter 方程,H=A+B/u+Cu
A:涡流扩散项 （ A=2λdp）,与填充均匀度、载体的粒度有关。填充均匀度越高，载体粒度越小，则 A
越小。
B/u:纵向扩散项 （ B/u=2?Dg/u）,与组分及载气分子量、柱温、柱压、载气流速、填充情况有关。
组分及载气分子量越大，柱温越低，柱压越大，载气流速越大，则 B/u越小。
Cu:传质阻力,与固定液液膜厚度,u及组分在固定液和流动相中的扩散系数有关，前两者降低，后者增大，则 Cu降低。
涡流扩散 (eddy diffusion)示意纵向扩散示意 (longitudinal diffusion)
传质阻力示意 (mass transfer)
综上所述：可以说明柱子的 填充均匀度、载体的粒度、流动相的种类及流速、固定液液膜厚度 以及 柱温等因素对板高及峰峰扩张的影响，
它为色谱分离条件的选择提供了理论指导。
流动相线速度对塔板高的影响纵向扩散 (B/u)
流动相传质阻力固定相传质阻力
H-u关系图
u
H
0.5 1.0 1.5
0.1
0.2
0.3
0.4
H/mm
u/cm·s-1
LC
0 2.0 4.0 6.0 8.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
H/mm
u/cm·s-1
GC
掌握色谱法的定义和分类。
掌握色谱法的重要基本概念：分配系数、容量因子、保留时间、保留体积、死时间、死体积、峰宽、半峰宽、分离度、保留指数等及其相互关系。
熟悉四种色谱方法的基本原理和两相的特点。
掌握塔板理论的要点及塔板数、塔板高的计算。
掌握速率理论的要点，熟悉 Van Deemter方程各项意义及影响因素。
流动相色谱分析法（ chromatography)
物理或物理化学 分离分析 方法，简称色谱法或层析法。
色谱法已广泛应用于各个领域，成为 多组分混和物的最重要的分析方法 。是生命科学、
材料科学、环境科学等领域的重要分析手段，
在药物分析中有及其重要的地位。各国药典都收载了许多色谱分析方法。
高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快及应用范围广等优点。
色谱法的分类
1.按流动相和固定相分子聚集状态分类气相色谱,气固色谱（ GSC）
（ GC） 气液色谱（ GLC）
液相色谱,液固色谱（ LSC）
（ LC） 液液色谱（ LLC）
超临界 流体 色谱法
（ SFC）
色谱法的分类
2.按操作形式分类柱色谱法（ column chromatography)
填充柱色谱法毛细管柱色谱法微填充柱色谱法平面色谱法（ plane chromatography)
纸色谱法薄层色谱法薄膜色谱法毛细管电泳法
（ capillary electrophoresis)
色谱法的分类
3.按分离机制分类分配色谱法
(patition chromatography)
吸附色谱法
(adsorption chromatography)
离子交换色谱法
(ion exchange chromatography)
空间排阻色谱法
(steric exclusion chromatography)
色谱过程样品组分在 两相之间反复,分配,
样品各组分的分配系数 不同各组分保留时间不同，
得以分离。
分配系数和容量因子
1.分配系数：
K=Cs / Cm
与组分、固定性和流动相的性质及温度有关。
2.容量因子,
k=ms/mm= CsVs/CmVm
还与固定性、流动相的体积有关。
3.分配系数与容量因子的关系：
k= K Vs/Vm
色谱过程方程
tR=t0( 1 + K Vs/Vm ) =t0( 1 + k )
色谱分离的前提
tR（ A） ≠tR（ B）
即,K A ≠ K B 或 k A ≠ k B
分配色谱法 （ patition chromatography）
分离原理：
利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。与萃取的区别是什么？
mm
ss
m
s
VX
VX
C
C
K
/
/
在 LLC中,K主要与流动相的性质（种类与极性）有关；
在 GLC中 K与固定相极性和柱温有关分配色谱法 （ patition chromatography）
固定相：涂渍或化学键合在惰性载体颗粒上的一薄层液体。
流动相：
GLC中常为氢气和氮气。
LLC中为与固定液不相溶的液体。根据固定性和流动相极性相对强度，分为 正相分配色谱 （固定相极性强于流动相极性）和 反相分配色谱 （固定相极性弱于流动相极性）。
分配色谱法 （ patition chromatography）
洗脱顺序正相色谱：极性强的组分保留强，后流出。
反相色谱：极性弱的组分保留强，后流出。
C
t
a
b
C
t
b
a
正相色谱 反相色谱极性,a<b
吸附色谱法 (adsorption chromatography)
分离原理利用被分离组分对固体表面活性吸附中心吸附能力的差别而实现分离。 吸附过程是样品中各组分的分子 X与流动相分子 Y争夺吸附剂表面活性中心的过程。
Xm + nYa = Xa + nYm
mm
aa
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/
/?
吸附系数与吸附剂的活性、组分的性质和流动相的性质有关。
吸附色谱法 (adsorption chromatography)
固定相：多孔性微粒状物质，具有较大的比表面积，在其表面有许多吸附中心。常用吸附剂：硅胶、氧化铝、聚酰胺、高分子多孔微球等。
流动相：洗脱能力主要由其极性决定，由溶剂强度 ε0定量表示。 ε0值越大，洗脱能力越强。常采用二元以上混合溶剂。
吸附色谱法 (adsorption chromatography)
洗脱顺序：极性强的组分被吸附强，后流出。一般规律是：
烷烃非极性,不被吸附；
不饱和化合物比饱和化合物的吸附能力强,双键越多越强；
基本母核相同的化合物,取代基极性越强,吸附能力越强；
分子中取代基空间排列对吸附能力也有影响 。
常见化合物吸附能力顺序：
烷烃 <烯烃 <醚 <硝基化合物 <叔胺 <酯 <酮 <醛 <酰胺
<醇 <酚 <伯胺 <羧酸离子交换色谱法 （ ion exchange chromatography）
分离原理：利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离。分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。
R B + A R A + B
NaHR S O -
3
HNaR S O -
3
交 换再 生
ClOHR N R
3
OHClR N R
3
交 换再 生
B
A
BA K
K
ABR
BARK?
/
离子交换色谱法 （ ion exchange chromatography）
固定相：离子交换树脂、硅胶键合离子交换剂。
离子交换树脂是具有网状结构的高分子多元酸或多元碱的聚合物 。 可被交换基团：－ SO3H,
－ COOH,－ NR3+OH- 。
性能指标：交联度,交换容量,粒度等 。
流动相：一定 pH值和离子强度的缓冲溶液
（或含少量有机溶剂，如乙醇、四氢呋喃、
乙腈等）。
离子交换色谱法 （ ion exchange chromatography）
影响保留行为的因素
1.溶质离子的电荷数升高，选择性系数增大；同价阳离子水合离子半径增大，选择性系数减小
Fe3+>Al3+>Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+≥
Cu2+≥ Co2+≥Mg2+ ≥Zn2+ ≥ Mn2+ > Ag+>
Cs+> Rb+> K+≥NH4+> Na+>H+ >Li+
柠檬酸根 > PO43->SO42->I->NO3->SCN->NO2-
>Cl->HCO3- >CH3COOH- >OH- >F-
影响保留行为的因素
2.在一定范围内，树脂的交联度越大，交换容量越大，组分的保留时间越长。
3.流动相的组成和 pH值：交换能力强的离子组成的流动相洗脱能力强；流动相的离子强度增强，
洗脱能力增强。 pH值一方面影响溶质的离解
（离解度小，则保留时间减小），一方面影响弱离子交换树脂的交换容量，一般在某一 pH值交换容量有一极大值。
离子交换色谱法 （ ion exchange chromatography）
小结：请同学们完成表格样品性质 固定相 流动相分配色谱极性（溶解度）：正相色谱极性强保留强，反之则反。
极性和形成氢键能力。
极性相似相溶，与组分极性相似，
洗脱能力增强。
吸附色谱离子交换色谱空间排阻各类色谱法中影响样品组分保留值的因素物质对分离的两种情况
C
t
C
t
提高分离度 R
增加?tR
减小 w
与分配系数有关－热力学过程与动力学过程有关塔板理论－ 马丁 （ Martin） 和辛格 （ Synge） 提出基本假设：
1,在柱内一小高度内，组分可以在两相中瞬间达到分配平衡。 H为理论塔板高度。
2,载气间歇式通过色谱柱，每次进气为一个塔板体积。
3,样品和新鲜载气都加在第 0号塔板上，且样品的纵向扩散可以忽略。
4,分配系数在各塔板上是常数。
0 1 2 3 4
载气固定相分配色谱过程示意图（塔板理论示意）
kA=2 kB=0.5
0 1 2 3 4
载气固定相
kA=2 kB=0.5
分配色谱过程示意图（塔板理论示意）
0 1 2 3 4
载气固定相
kA=2 kB=0.5
分配色谱过程示意图（塔板理论示意）
0 1 2 3 4
载气固定相
kA=2 kB=0.5
分配色谱过程示意图（塔板理论示意）
0 1 2 3 4
载气固定相
kA=2 kB=0.5
分配色谱过程示意图（塔板理论示意）
塔板数浓度样品经过 N次进气后在第 r号塔板上的质量分数：
r
m
rN
sr
N mm
rNr
Nm
)!(!
!
2 9 6.06 6 7.03 3 3.0
)!33(!3
!3 333
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如经过 3次进气后，在第三号塔板上 B的质量分数为：
流出曲线方程：
N
m
5 10 15
0.05
0.10
0.15
k=1的组分从 n＝ 5柱中的流出曲线当塔板数很大时，流出曲线趋于正态分布：
2
2
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m a x
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0
2
R
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理论塔板高和理论塔板数－柱效指标理论塔板数,
2
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R
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理论塔板高,
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有效理论塔板数,
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Wt
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有效塔板高：
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塔板理论的特点和不足：
1,当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大 (塔板高度
H 越小 )，被测组分在柱内被分配的次数越多，
柱效能则越高，所得色谱峰越窄。
2,不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。
3,柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数 K 相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。
4,塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。
速率理论
Van Deemter 方程,H=A+B/u+Cu
A:涡流扩散项 （ A=2λdp）,与填充均匀度、载体的粒度有关。填充均匀度越高，载体粒度越小，则 A
越小。
B/u:纵向扩散项 （ B/u=2?Dg/u）,与组分及载气分子量、柱温、柱压、载气流速、填充情况有关。
组分及载气分子量越大，柱温越低，柱压越大，载气流速越大，则 B/u越小。
Cu:传质阻力,与固定液液膜厚度,u及组分在固定液和流动相中的扩散系数有关，前两者降低，后者增大，则 Cu降低。
涡流扩散 (eddy diffusion)示意纵向扩散示意 (longitudinal diffusion)
传质阻力示意 (mass transfer)
综上所述：可以说明柱子的 填充均匀度、载体的粒度、流动相的种类及流速、固定液液膜厚度 以及 柱温等因素对板高及峰峰扩张的影响，
它为色谱分离条件的选择提供了理论指导。
流动相线速度对塔板高的影响纵向扩散 (B/u)
流动相传质阻力固定相传质阻力
H-u关系图
u
H
0.5 1.0 1.5
0.1
0.2
0.3
0.4
H/mm
u/cm·s-1
LC
0 2.0 4.0 6.0 8.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
H/mm
u/cm·s-1
GC
