2009-7-31
第十二章荧光分析法
（ fluorometry)
荧光与荧光分析法
（ fluorescene and fluorometry)
荧光 （ fluorescene):
物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低能级返回基态时发射出的光。
荧光分析法（ fluorometry)：
根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。选择性好，灵敏度高，检测限达 10-10g/ml,甚至 10-12g/ml。
电子能级的多重态电子能级的多重度,M=2S+1
S为电子自旋量子数的代数和 (0或 1)
M=1,单重态,用 S表示 （ singlestate）
M＝ 3,三重态,用 T表示 （ tripletstate）
↑↓ ↑ ↑
↑↓能量单重基态 激发单重态 激发三重态禁阻跃迁
S2
S1
S0
T1
吸收发射荧光发射磷光能量
l 2l 1 l3
外转换
l?2
体系间跨越振动弛豫内转换激发态 → 基态的能量传递途径传递途径辐射跃迁荧光 内转换 外转换体系间跨越 振动弛豫无辐射跃迁激发态停留时间短,返回速度快的途径,发生的几率大,
发光强度相对大 。
荧光,10-7～ 10-9 s,第一激发单重态的最低振动能级 → 基态磷光,10-4～ 10s,第一激发三重态的最低振动能级 → 基态磷光激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluorescence spectrum
1.荧光 (磷光 )的激发光谱曲线固定测量波长 (选最大发射波长 ),化合物发射的荧光 (磷光 )强度与照射光波长的关系曲线 。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。
2.荧光 (磷光 )的发射光谱曲线,固定激发光波长 (选最大激发波长 ),化合物发射的荧光 (或磷光强度 )与发射光波长关系曲线。
激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluorescence spectrum
萘的激发光谱（ Ⅰ ）、荧光光谱（ Ⅱ ）
和磷光光谱（ Ⅲ ）
200 260 320 380 440 500 560 620
荧光激发光谱荧光发射光谱 磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱nm
F
激发光谱与发射光谱的关系
1.Stokes位移荧光发射光谱波长大于激发光谱波长的现象 。
内转换和 振动弛豫是主要原因 。
2.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级,吸收不同波长的能量,产生不同吸收带,但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态,产生一个发射带 。
3.镜像关系通常荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称关系 。
n
m
蒽的激发光谱和荧光光谱
200 250 300 350 400 450 500 n
m
F
S0
S1*
V=0
V=1
V=2
V=0
V=1
V=2
b0b1b2
c2c1c0
E2
E1
E2
E1
b0
c0
b1
b2
c1
c2
镜像关系解释示意荧光的产生与分子结构的关系分子产生荧光必须具备的条件
1,具有强的可见紫外吸收 (长共轭分子 ）
2,具有一定的荧光效率 （?f） （ 刚性平面分子 ）
吸收激发光的光子数发射荧光的光子数?
f?
长共轭结构苯 萘 蒽
lex 205nm 286nm 356nm
lem 278nm 321nm 404nm
f 0.11 0.29 0.36
C H 2 O C O C H 3
维生素 A
lex＝ 327nm,lem＝ 510nm
刚性平面结构可降低分子振动,减少与溶剂的相互作用,故具有很强的荧光 。 如荧光素和酚酞有相似结构,荧光素有很强的荧光,酚酞却没有 。
取代基
第一类：增加分子的?电子共轭程度，
使荧光效率提高，荧光波长增长。如
-NH2,-OH,-OCH3,-NHR,-CN。
第二类：减弱分子的?电子共轭程度，使荧光减弱甚至熄灭。如,-COOH,-NO2、
-CO,-X,-NO,-SH,-X。
第三类,对?电子共轭作用较小，对荧光的影响不明显。如,-R,-SO3H,-NH3+。
荧光试剂能与弱荧光物质或无机离子反应生成强荧光物质的试剂。可扩大荧光分析法的应用范围。
荧光胺：测定脂肪伯胺和芳香伯胺。
邻苯二甲醛（ OPA）：测定伯胺,α-氨基酸。
丹酰氯,测定含有伯、仲胺基及酚基的生物碱
测定无机离子的荧光试剂影响荧光强度的外部因素
1.温度荧光强度对温度变化敏感,温度增加,荧光效率降低 。
2.溶剂溶剂的极性,氢键,配位键的形成,粘度都将使化合物的荧光发生变化 。 极性,粘度增强,荧光波长长移,强度增加 。
3.酸度对酸碱化合物,溶液 pH的影响较大,需要严格控制 。 不同荧光物质有其最适宜的 pH值范围 。
影响荧光强度的外部因素
4.荧光熄灭剂：重金属离子,卤素离子,
氧分子,硝基化合物,重氮化合物,羰基和羧基化合物 。
5.散射光：注意溶剂的拉曼散射的影响 。
瑞利光 （ Reyleigh scattering light)
拉曼光 (Raman scattering light)
波长比入射光更长的拉曼光,对荧光测定的干扰更大 。
a
b
a：硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光
b,0.1mol/L硫酸溶液在不同波长下的拉曼散射光溶液的荧光测定入射光 I0 透射光 I
荧光 F
定量依据荧光强度 F正比于 吸收的 光强度 Ia
和荧光量子效率?：
F = K’Ia
由朗伯 -比耳定律,Ia = I0(1-10-?cl )
F = K’ I0(1-10-?cl ) = K’ I0(1-e-2.3?cl)
浓度很低时,将括号项近似处理后：
F = 2.3 K’ I0?cl = Kc
注意：当?cl >0.05时,F与 C不成正比 。
定量分析方法
1.校正曲线法配制标准溶液系列，分别测定系列中各溶液的荧光强度 F，作校正曲线 F-C图，根据待测溶液的 Fx值，在图中求出待测液的 Cx。 若空白溶液的荧光强度不能校正到 0，则须作
（ F-F0） -C图。
注意：在作校正曲线时，常采用标准系列中某一浓度的溶液（或另一种能稳定发生荧光的溶液）作为基准，将其荧光强度调至 100％
或 50％，然后测定系列中其他标准溶液的荧光强度。
定量分析方法
比例法
0
0
0
0
FF
FFCC
C
C
FF
FF
s
x
sx
x
s
x
s
联立方程法荧光计光 源第一单色器或滤光片样品池 检测器第二单色器 或滤光片记录仪激发荧光
滤光片荧光计
滤光片 -单色器荧光计
荧光分光光度计氙灯高压汞灯染料激光器光电倍增管荧光法应用
1.无机化合物的分析与有机试剂配合物后测量；可测量约 60多种元素。
铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；
氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；
铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；
铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；
铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定荧光法应用
2,有机化合物的荧光分析荧光分析法主要应用于有机物、生化物质、药物的测定（ 200多种），包括：
有机化合物如：多环胺类、萘酚类、吲哚类、多环芳烃、氨基酸、蛋白质等。
药物如：吗啡、喹啉类、异喹啉类、麦角碱、麻黄碱等。
维生素如：维生素 A,B1,B2,B6,B12,E,C、
叶酸 等。
甾体、抗生素、酶、辅酶 等。
荧光分析新技术
激光荧光分析
时间分辨荧光分析
同步荧光分析
胶束增敏荧光分析
第十二章荧光分析法
（ fluorometry)
荧光与荧光分析法
（ fluorescene and fluorometry)
荧光 （ fluorescene):
物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低能级返回基态时发射出的光。
荧光分析法（ fluorometry)：
根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。选择性好，灵敏度高，检测限达 10-10g/ml,甚至 10-12g/ml。
电子能级的多重态电子能级的多重度,M=2S+1
S为电子自旋量子数的代数和 (0或 1)
M=1,单重态,用 S表示 （ singlestate）
M＝ 3,三重态,用 T表示 （ tripletstate）
↑↓ ↑ ↑
↑↓能量单重基态 激发单重态 激发三重态禁阻跃迁
S2
S1
S0
T1
吸收发射荧光发射磷光能量
l 2l 1 l3
外转换
l?2
体系间跨越振动弛豫内转换激发态 → 基态的能量传递途径传递途径辐射跃迁荧光 内转换 外转换体系间跨越 振动弛豫无辐射跃迁激发态停留时间短,返回速度快的途径,发生的几率大,
发光强度相对大 。
荧光,10-7～ 10-9 s,第一激发单重态的最低振动能级 → 基态磷光,10-4～ 10s,第一激发三重态的最低振动能级 → 基态磷光激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluorescence spectrum
1.荧光 (磷光 )的激发光谱曲线固定测量波长 (选最大发射波长 ),化合物发射的荧光 (磷光 )强度与照射光波长的关系曲线 。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。
2.荧光 (磷光 )的发射光谱曲线,固定激发光波长 (选最大激发波长 ),化合物发射的荧光 (或磷光强度 )与发射光波长关系曲线。
激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluorescence spectrum
萘的激发光谱（ Ⅰ ）、荧光光谱（ Ⅱ ）
和磷光光谱（ Ⅲ ）
200 260 320 380 440 500 560 620
荧光激发光谱荧光发射光谱 磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱nm
F
激发光谱与发射光谱的关系
1.Stokes位移荧光发射光谱波长大于激发光谱波长的现象 。
内转换和 振动弛豫是主要原因 。
2.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级,吸收不同波长的能量,产生不同吸收带,但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态,产生一个发射带 。
3.镜像关系通常荧光发射光谱与它的吸收光谱成镜像对称关系 。
n
m
蒽的激发光谱和荧光光谱
200 250 300 350 400 450 500 n
m
F
S0
S1*
V=0
V=1
V=2
V=0
V=1
V=2
b0b1b2
c2c1c0
E2
E1
E2
E1
b0
c0
b1
b2
c1
c2
镜像关系解释示意荧光的产生与分子结构的关系分子产生荧光必须具备的条件
1,具有强的可见紫外吸收 (长共轭分子 ）
2,具有一定的荧光效率 （?f） （ 刚性平面分子 ）
吸收激发光的光子数发射荧光的光子数?
f?
长共轭结构苯 萘 蒽
lex 205nm 286nm 356nm
lem 278nm 321nm 404nm
f 0.11 0.29 0.36
C H 2 O C O C H 3
维生素 A
lex＝ 327nm,lem＝ 510nm
刚性平面结构可降低分子振动,减少与溶剂的相互作用,故具有很强的荧光 。 如荧光素和酚酞有相似结构,荧光素有很强的荧光,酚酞却没有 。
取代基
第一类：增加分子的?电子共轭程度，
使荧光效率提高，荧光波长增长。如
-NH2,-OH,-OCH3,-NHR,-CN。
第二类：减弱分子的?电子共轭程度，使荧光减弱甚至熄灭。如,-COOH,-NO2、
-CO,-X,-NO,-SH,-X。
第三类,对?电子共轭作用较小，对荧光的影响不明显。如,-R,-SO3H,-NH3+。
荧光试剂能与弱荧光物质或无机离子反应生成强荧光物质的试剂。可扩大荧光分析法的应用范围。
荧光胺：测定脂肪伯胺和芳香伯胺。
邻苯二甲醛（ OPA）：测定伯胺,α-氨基酸。
丹酰氯,测定含有伯、仲胺基及酚基的生物碱
测定无机离子的荧光试剂影响荧光强度的外部因素
1.温度荧光强度对温度变化敏感,温度增加,荧光效率降低 。
2.溶剂溶剂的极性,氢键,配位键的形成,粘度都将使化合物的荧光发生变化 。 极性,粘度增强,荧光波长长移,强度增加 。
3.酸度对酸碱化合物,溶液 pH的影响较大,需要严格控制 。 不同荧光物质有其最适宜的 pH值范围 。
影响荧光强度的外部因素
4.荧光熄灭剂：重金属离子,卤素离子,
氧分子,硝基化合物,重氮化合物,羰基和羧基化合物 。
5.散射光：注意溶剂的拉曼散射的影响 。
瑞利光 （ Reyleigh scattering light)
拉曼光 (Raman scattering light)
波长比入射光更长的拉曼光,对荧光测定的干扰更大 。
a
b
a：硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光
b,0.1mol/L硫酸溶液在不同波长下的拉曼散射光溶液的荧光测定入射光 I0 透射光 I
荧光 F
定量依据荧光强度 F正比于 吸收的 光强度 Ia
和荧光量子效率?：
F = K’Ia
由朗伯 -比耳定律,Ia = I0(1-10-?cl )
F = K’ I0(1-10-?cl ) = K’ I0(1-e-2.3?cl)
浓度很低时,将括号项近似处理后：
F = 2.3 K’ I0?cl = Kc
注意：当?cl >0.05时,F与 C不成正比 。
定量分析方法
1.校正曲线法配制标准溶液系列，分别测定系列中各溶液的荧光强度 F，作校正曲线 F-C图，根据待测溶液的 Fx值，在图中求出待测液的 Cx。 若空白溶液的荧光强度不能校正到 0，则须作
（ F-F0） -C图。
注意：在作校正曲线时，常采用标准系列中某一浓度的溶液（或另一种能稳定发生荧光的溶液）作为基准，将其荧光强度调至 100％
或 50％，然后测定系列中其他标准溶液的荧光强度。
定量分析方法
比例法
0
0
0
0
FF
FFCC
C
C
FF
FF
s
x
sx
x
s
x
s
联立方程法荧光计光 源第一单色器或滤光片样品池 检测器第二单色器 或滤光片记录仪激发荧光
滤光片荧光计
滤光片 -单色器荧光计
荧光分光光度计氙灯高压汞灯染料激光器光电倍增管荧光法应用
1.无机化合物的分析与有机试剂配合物后测量；可测量约 60多种元素。
铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；
氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；
铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；
铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；
铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定荧光法应用
2,有机化合物的荧光分析荧光分析法主要应用于有机物、生化物质、药物的测定（ 200多种），包括：
有机化合物如：多环胺类、萘酚类、吲哚类、多环芳烃、氨基酸、蛋白质等。
药物如：吗啡、喹啉类、异喹啉类、麦角碱、麻黄碱等。
维生素如：维生素 A,B1,B2,B6,B12,E,C、
叶酸 等。
甾体、抗生素、酶、辅酶 等。
荧光分析新技术
激光荧光分析
时间分辨荧光分析
同步荧光分析
胶束增敏荧光分析
