第七章 氨基酸发酵的微生物 7. 1概述 既含有氨基又具有α-位羧基基团的化合物称为α-氨基酸, 有些氨基酸是亚氨基羧酸，如脯氨酸。在自然界中，组成各式各样蛋白质的氨基酸共有20种，除甘氨酸外，所有组成蛋白质的天然氨基酸都是L-α-氨基（或亚氨基）羧酸，这些氨基酸通过肽键连接成为大分子的蛋白质，是所有生命的基础。其中的八种氨基酸是人类的必需氨基酸，即人类本身不能合成、必须从食物中摄入的氨基酸。这八种必须氨基酸是：苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸及色氨酸。此外，组氨酸对婴幼儿也是必须氨酸。除了上述组成蛋白质的氨基酸外，自然界中还存在各种D-氨基酸、ω-氨基酸及一些特殊的氨基酸，如氨基磺酸、氨基硫酸及氨基磷酸等，这些特殊的氨基酸也具有重要的生理作用。氨基酸在营养保健、调味品、化妆品及药品生产中都有重要的应用，因此必需以工业规模生产氨基酸以满足市场的需要。 氨基酸可以采用化学合成、从天然物质中提取（蛋白质水解）、微生物发酵及酶催化等方法生产。化学合成得到的氨基酸是消旋的DL-氨基酸，若需要的产物是L-氨基酸，必须进行光学异构体的拆分。除少数例外, 其它三种方法生产的氨基酸都是具有光学活性的L-氨基酸。 蛋白质水解得到的是各种氨基酸的混合物，要将其中的某种氨基酸分离提纯十分困难，碱性或酸性氨基酸的提纯相对容易些，如胱氨酸就是通过毛发水解方法生产的，中性氨基酸的分离就更困难。 许多氨基酸都能采用微生物发酵方法生产。利用水解酶、氨基裂解酶、以吡哆醛5’-磷酸作为辅酶的酶及NAD＋为辅酶的L-氨基酸脱氢酶等都能用于酶法合成氨基酸的生产，这些酶一般也要通过微生物发酵获得。 所有微生物在培养时都能产生氨基酸，主要用于细胞生长所必需的蛋白质合成，在野生型微生物中，细胞中合成的各种氨基酸含量由于受到负反馈调节而保持在最佳水平，积累的量很少, 因此不能直接用于工业发酵。在氨基酸的工业化生产中，一般应使微生物积累较高浓度的氨基酸，才具有实际价值。因此，利用微生物发酵生产氨基酸的关键是解除反馈调节，使氨基酸能过度积累。通常可以采用如下方法：1）刺激细胞同化起始底物；2）抑制副反应；3）刺激细胞内氨基酸合成酶系的合成并提高酶的活力；4）抑制或降低使已合成氨基酸降解的酶活；5）刺激细胞将胞内的氨基酸释放到胞外。因此如果要从一种野生型微生物出发获得氨基酸的工业化生产菌种，就必需对该微生物的代谢途径进行研究，进而对其遗传基因进行改造。遗传基因的改造可以采用传统的诱变育种方法，也能应用现代的基因重组技术，这两种方法都已广泛地用于氨基酸高产菌种的选育。 7. 1. 1微生物发酵法生产氨基酸的历史和发展趋势 1908年日本人Ikeda发现谷氨酸钠是鲜味的强化剂，开始了工业化生产氨基酸的历史。在此后的近50年中，谷氨酸的生产都是以大豆或面筋蛋白为原料、采用酸水解后分离提取的方法。1957年日本科学家Kinoshita等人发现，在培养某些微生物，如谷氨酸棒杆菌（Corynbacterium glutamicum）时会产生谷氨酸的积累，从此揭开了用微生物发酵方法生产氨基酸的历史新篇章。至今，几乎所有的氨基酸都能采用发酵法生产。谷氨酸是第一种应用发酵法进行工业化生产、也是目前产量最高的氨基酸。全世界的年产量超过50万吨，中国已经成为世界上最大的谷氨酸钠（味精）生产和消费国。 赖氨酸是人和动物的必需氨基酸之一，虽然植物蛋白中含有少量的赖氨酸，但不能满足人和动物的需要。在食物和动物饲料中添加适量的赖氨酸有利于人类健康和动物的生长。人们已经发现在某些微生物中存在着赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制，据此Nakayama等人于1961年从谷氨酸棒杆菌分离到一株高丝氨酸营养缺陷型菌种；Shhe和Sano则于1969年获得了一株苏氨酸和蛋氨酸双重营养缺陷型黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）菌种。这两个菌种的胞内苏氨酸合成都受到了阻遏，从而降低了对天冬氨酸激酶的抑制作用，促进了赖氨酸的积累，使赖氨酸的工业化生产成为可能。目前，赖氨酸生产菌的发酵水平已经达到100g/L以上, 微生物发酵法成了唯一的赖氨酸工业化生产方法。 L-苯丙氨酸是另一种人类必需的氨基酸，近年来又在新型甜味剂Aspartame（中文商品名：天冬甜精或阿斯巴甜）的合成中发现了新的应用, 因此L-苯丙氨酸的产量增加很快。1974年，Coates和Nester发现了一株β-噻吩丙氨酸抗性的枯草杆菌（Bacillus subtilis）突变株，该菌株的预苯氨酸脱氢酶活力受到抑制，解除了L-苯丙氨酸的负反馈抑制；1981年，Goto等人从乳酸发酵杆菌分离到了一株p-氟苯丙氨酸（PFP）和5-甲基色氨酸抗性的突变株，属于酪氨酸缺陷型。目前化学合成、酶法合成及微生物发酵生产苯丙氨酸都已实现工业化生产，而微生物发酵法则由于原料便宜而受到青睐。 自七十年代以来，几乎所有氨基酸的发酵法生产都进行了研究和开发，已经获得工业化生产的除了上述三种氨基酸外，还有精氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸及缬氨酸等。 获得高产菌种始终是发酵法生产氨基酸的关键。除了从野生型菌株出发，通过筛选、诱变等方法获得营养缺陷型和/或调节突变型菌株的传统方法外，利用基因重组技术获得氨基酸发酵高产菌种已经成了新的发展方向。例如，前苏联的科学家利用基因工程方法将合成L-苏氨酸的基因克隆到大肠杆菌中，L-苏氨酸的产量提高到了55g/L；能积累L-苯丙氨酸的基因工程菌也已经应用于工业生产；基因工程菌的宿主细胞已经从Gram阴性菌发展到Gram阳性菌。生产氨基酸的基因工程菌的研究还在深入地进行，必将为提高氨基酸的发酵水平作出贡献。 发酵法生产氨基酸的另一个发展方向是采用先进的发酵技术。固定化细胞发酵、连续发酵、新型的生物反应器（如气升式反应器）、及发酵过程的优化和控制等都在氨基酸发酵工业中受到重视。 从发酵液中分离提取氨基酸的新技术和新工艺对于提高氨基酸发酵工业的水平和经济效益也有十分重要的作用。一些新颖的分离方法正在氨基酸工业推广应用，如膜分离、离子交换及电渗析等。 7. 1. 2发酵法生产氨基酸的微生物 谷氨酸的产生菌可以从自然界中筛选得到，例如谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌。最初筛选得到的菌种积累谷氨酸的能力都不强，不超过30g/L。进过不断的诱变育种，现在工业用的菌种产谷氨酸能力已经超过100 g/L，有些菌种甚至达到了150 g/L以上，大大提高了生产效率，降低了生产成本。要从自然界筛选到其它氨基酸的生产菌种就不那么容易了，这是由这些氨基酸在细胞内的代谢机理决定的。至今从自然界筛选的微生物只有能积累DL-丙氨酸的嗜氨微杆菌（Microbacterium amminophilum）及产生L-缬氨酸的乳酸发酵短杆菌，但是产量都很低。其他氨基酸的产生菌几乎都是从短杆菌和棒杆菌通过诱变育种或基因工程技术获得的。这是氨基酸发酵菌种的一大特点。 除了高产外，对氨基酸生产菌种的其它要求包括抗噬菌体的侵入。噬菌体是氨基酸生产的大敌，由于感染噬菌体而引起‘倒罐’会给生产造成重大损失，因此，应该选育抗噬菌体的菌种。 7. 2 氨基酸发酵机理和菌种选育 7. 2. 1 氨基酸发酵机理 如前所述，几乎所有的微生物都能在其代谢途经中合成氨基酸以满足细胞生长的需要，但由于受到产物的负反馈抑制，细胞内各种氨基酸的浓度只能维持在生理浓度范围内，不会产生过量的积累。当以葡萄糖为碳源时，细胞内各种氨基酸代谢途径如图7.1.1所示。 葡萄糖(Glucose, C6） 组氨酸(His,C6N3) 戊糖(C5) 甘氨酸(Gly,C2N) 四碳糖(C4) 苯丙氨酸(Phe,C9N) 三糖(C3) 丝氨酸(Ser,C3N) 酪氨酸(Tyr,C9N) 莽草酸(C7) 色氨酸(Try,C11N2) 半胱氨酸(Cys,C3NS) 丙氨酸(Ala,C3N) 丙酮酸(Pyr,C3) (C5) 缬氨酸(Val,C5N) 赖氨酸(Lys,C6N2) 氨基庚二酸 (DAP,C7N2) Acetyl(C2) 亮氨酸(Leu,C6N) 蛋氨酸(Met,C5NS) 天冬氨酸(Asp,C4N) 草酰乙酸(Oxalacetate,C4) 柠檬酸(Citrate,C6) 苏氨酸(Thr,C4N) 异亮氨酸(Ileu,C6N) 脯氨酸(Pro,C5N) α-酮戊二酸(C5) 谷氨酸(Glu,C5N) 精氨酸(Arg,C6N4) 图 7.2.1 以葡萄糖为碳源时，细胞内各种氨基酸的代谢途经 从图中可以看到，细胞内氨基酸的合成具有如下特点：1）某一类氨基酸往往有一个共同的前体；2）氨基酸的生物合成与EMP途径、三羧酸循环有十分密切的关系；3）一种氨基酸可能是另一种氨基酸的前体。因此如果要细胞大量地积累氨基酸，就必需做到：1）必需解除氨基酸代谢途经中存在的产物反馈抑制；2）应该防止所合成的目标氨基酸降解或者用于合成其它细胞组分；3）若几种氨基酸有一个共同的前体，应该切断其他氨基酸的合成途经；4）应该增加细胞膜的通透性，使得细胞内合成的氨基酸能够及时释放到胞外，降低其胞内的浓度。因此在氨基酸生产菌种的育种工作中，应该在基因水平对微生物进行改造，改造的方法包括传统的诱变育种及应用现代基因工程。 下面将以谷氨酸的生物合成机理为例进行讨论。谷氨酸生产菌可以从自然界中筛选得到，但产量不高。谷氨酸是三羧酸循环中的α-酮戊二酸在L-谷氨酸脱氢酶的催化下与游离氨反应合成的。α-酮戊二酸则是由草酰琥珀酸脱羧生成、在三羧酸循环中又会在α-酮戊二酸脱氢酶复合物的催化下进一步脱去一分子二氧化碳形成琥珀酸辅酶A。正是由于上述机理，自然界筛选的细胞积累的谷氨酸浓度不高。通过诱变育种，限制细胞内α-酮戊二酸脱氢酶复合物的活性，就能防止α-酮戊二酸的降解，提高谷氨酸的产量。影响谷氨酸产量提高的另一个重要因素是细胞壁的通透性。细胞内的谷氨酸必需释放到细胞外，才能使胞内谷氨酸浓度保持在适当的水平，不至产生严重的负反馈抑制。过去曾有人认为生物素是谷氨酸产生的必要条件，但是通过深入研究表明，生物素的主要作用是改善细胞壁的通透性而并不是谷氨酸产生的必要条件。有人研究了原来不产谷氨酸的大肠杆菌经诱变后得到的α-酮戊二酸脱氢酶缺失的突变株，发现不需要生物素就能积累2.3g/L的谷氨酸。虽然亚适量的生物素（2.5～5.0μg/L）可以促进谷氨酸棒杆菌的生长和谷氨酸积累，但是过量的生物素(25～30μg/L)反而会抑制谷氨酸的有效产生。研究表明，生物素在谷氨酸合成中的作用一方面是作为乙酰辅酶A的辅基，当这种辅酶参与油酸和其他脂肪酸的合成反应时会受到C16-18饱和脂肪酸的抑制，这样有利于乙酰辅酶A进入三羧酸循环, 减少用于合成脂肪酸的消耗；生物素更重要的作用是使细胞壁中的脂肪酸含量发生变化，从而改变了细胞壁的通透性，有利于谷氨酸的释放。因此，生物素并不是谷氨酸合成的必要条件。进一步的研究表明，不仅生物素，培养基中加入油酸盐和饱和脂肪酸也能改善细胞壁的通透性, 提高谷氨酸的产量。某些抗生素，如青霉素和头孢菌素C，也会有利于谷氨酸释放到胞外，但是作用的机理不同。抗生素的加入会阻碍细胞壁的合成，使细胞膨胀、拉长，结果也是增加了细胞的通透性。 从图7.2.1还可以看到，α-酮戊二酸是谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸的共同前体，培养条件的改变会使最终产物发生变化。例如，同样是生产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌，在高浓度氯化铵存在下、保持培养基呈弱酸性并加入锌离子会提高谷氨酰胺合成酶的活力，使谷氨酸转化为谷氨酰胺；而当培养基中含有过量的生物素和高浓度氯化铵时，L-脯氨酸的积累量将超过40g/L。上述方法已经用于谷氨酰胺和L-脯氨酸的工业化生产。 7. 2. 2发酵法生产氨基酸的菌种选育 工业发酵要求选育出高产菌种。一种微生物经过育种，能够积累过量的目标产物，就可以用于工业发酵，同时也说明它的遗传基因型与野生菌相比已经发生了变化。如果目标产物的代谢途径和调控机制已经比较清楚，在菌种选育时就能够有目的地采用适当的方法对细胞内的调节控制机理进行改造，就能够比较容易地获得高产菌种。微生物中氨基酸合成的代谢途经和调控机制已经进行了深入研究，为菌种选育创造了良好的条件。根据已经掌握的微生物中氨基酸生物合成的代谢途径和调控机制，发酵法生产氨基酸的菌种选育方法主要有：选育营养缺陷型菌种；选育调节突变型菌种及用基因工程方法获得高产菌种。下面将对这三种方法分别予以讨论。 7.2.2.1从营养缺陷型突变株选育氨基酸产生菌 营养缺陷型突变株的特点是: 当菌株生长所必需的某种营养物质供应受到限制时，就不会合成产生负反馈抑制的抑制剂，从而解除了反馈抑制，使得该代谢途径下游的有关代谢产物或其前体物质能够过量积累。从氨基酸的合成途径可以看到, 各种氨基酸的合成存在着密切的关系, 有些有共同的前体; 有些是在同一条支路上合成, 既是前面一种氨基酸的反应产物, 又是后一种氨基酸合成的反应物。因此为了使某一种氨基酸大量积累, 就必须增加合成氨基酸前体的速率, 切断竞争消耗共同前体的其它氨基酸的代谢支路, 防止目标产物被下游的反应消耗。为了达到上述目标, 选育营养缺陷型突变株是最简单有效的提高目标氨基酸产量的方法。表7.2.1列出了部分氨基酸生产菌种及其遗传标记，其中的鸟氨酸和瓜氨酸是精氨酸合成的中间产物。 表7、2、1用营养缺陷型突变菌株生产的氨基酸 氨基酸 微生物 遗传标记 参考产率, G/L  L-Aspartic acid (L-天冬氨酸) Brevibacterium flavum Citrate synthase－ 10.6  L-Citrulline (L-瓜氨酸) Bacillus subtilis K Corynebacterium glutamicum Arg－ Arg－ 5 10.7  L-Leucine (L-亮氨酸) Corynebacterium glutamicum Phe－, His－, Ile－ 16.0  L-Lysine (L-赖氨酸) Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Brevibacterium lactofermentum Homoser－ Thr－, Met－ Homoser－ 13.0 0 20.2  L-Ornithine (L-鸟氨酸) Corynebacterium glutamicum Corynebacterium hydrocarbonlactum Brevibacterium lactofermentum Arthrobacter paraffineus Cit－ Cit－ Cit－ Cit－ 26.0 9.0 40%* 8.0  L-Proline (L-脯氨酸) Brevibacterium sp. Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum His－ Ile－ Ile－, SG r ** 23.0 14.8 35.0   L-Threonine (L-苏氨酸) Arthrobacter paraffineus Escherichia coli Candida guillermondii Escherichia coli Ile－ DAP－***, Met－, Ile-回复突变 Ile－, Met－, Trp－ Met－, Leu－ 9.0 0 4.0 10.5  Valine (L- 颉氨酸) Corynebacterium glutamicum Arthrobacter paraffineus Ile－, Leu－ Ile－ 30.0 9.0  *———摩尔产率；**———α，ε二氨基庚二酸；***———磺胺胍抗性 图7.2.2在产生谷氨酸的枯草杆菌中精氨酸生物合成的调节 1.N-乙酰基谷氨酸合成酶；2.N-乙酰基谷氨酰激酶；3.N-乙酰基谷氨酸-γ-半醛脱氢酶；4.N-乙酰基鸟氨酸-δ-氨基转移酶；5.N-乙酰基谷氨酸-乙酰基鸟氨酸乙酰基转移酶；6.鸟氨酸氨甲酰基转移酶；7.精氨基琥珀酸合成酶；8.精氨基琥珀酸酶 图7.2.2显示了精氨酸的合成途经。在谷氨酸棒杆菌中，从谷氨酸到精氨酸的合成途经的第一和第二个酶都受到精氨酸的反馈抑制，参与该途径生物合成的所有酶都受到精氨酸的阻遏，因此如果要利用该代谢途经生产L-鸟氨酸，就应该切断精氨酸的合成途径, 这样一来,既解除了精氨酸的阻遏和反馈抑制, 又能防止L-鸟氨酸的消耗。如果菌株的鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺失，显然就无法催化从鸟氨酸转化为瓜氨酸的反应，因此所获得的瓜氨酸营养缺陷型或精氨酸营养缺陷型的谷氨酸棒杆菌都可以防止精氨酸的生成并能大量积累L-鸟氨酸, L-鸟氨酸对葡萄糖的转化率高达36%。该营养缺陷型菌株的发酵和谷氨酸发酵十分类似，只是需要在培养基中加入适量的L-精氨酸和大量的生物素。 营养缺陷型突变株也能用于生产分支代谢途经末端的氨基酸生产，赖氨酸发酵的菌种就是其中一个典型的例子。在原核生物中L-赖氨酸是从L-天冬氨酸合成的，中间代谢产物是α，ε-二氨基庚二酸。如图7.2.3所示，苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸也是从L-天冬氨酸合成的，因此是一个分支代谢过程。从L-天冬氨酸合成上述氨基酸的代谢途经中，关键的控制点是第一个酶：天冬氨酸激酶，该酶受到L-赖氨酸和L-苏氨酸的协同反馈抑制。因此如果要使L-赖氨酸过量积累，必须降低细胞内L-苏氨酸的浓度以解除它对天冬氨酸激酶的抑制，与此同时还必须防止其他氨基酸的积累。这样在选育L-赖氨酸生产菌种时就应该选育高丝氨酸缺陷型或L-苏氨酸/L-蛋氨酸双重营养缺陷型菌株。为了防止天冬氨酸积累，在培养基中还应该加入过量的生物素。解除它对天冬氨酸激酶的抑制，与此同时还必须防止其他氨基酸的积累。这样在选育L-赖氨酸生产菌种时就应该选育高丝氨酸缺陷型或L-苏氨酸/L-蛋氨酸双重营养缺陷型菌株。 从以上两个例子的讨论中可以看到，若要选育生产某种氨基酸的营养缺陷型高产菌种，必须清楚地了解该氨基酸及其相关代谢产物的生物合成途径及调节机理，才能有的放矢地选育出合适的营养缺陷型高产菌种，达到事半功倍的效果。 蛋氨酸 异亮氨酸 α-酮丁酸 天冬氨酸 天冬氨酰磷酸 天冬氨酸-β-半醛 高丝氨酸 苏氨酸 二氢吡啶二羧酸 α，ε-二氨基庚二酸 赖氨酸 图7.2.3谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌中天冬氨酸类氨基酸生物合成的调节 反馈阻竭； 反馈抑制 组氨酸生物合成是从核糖-5-磷酸开始, 它的合成途径中没有其它的氨基酸参与, 调节机理比较简单, 组氨酸的产物反馈抑制也不是很严重, 因此要获得组氨酸高产菌种比较困难, 直到1971年才开始有组氨酸生产菌种选育的报道。一般都采用选育营养缺陷型或类似物抗性突变株的方法, 但是育种方法显得缺乏规律性, 产组氨酸水平也不是很高。例如, 有人筛选到了一株亮氨酸缺陷型的谷氨酸棒杆菌, 能够积累10g/L组氨酸; 也有人筛选出了嘌呤, 嘧啶和色氨酸类似物抗性突变株, 产量达到了15g/L; 另一个报道是采用筛选磺胺类药物抗性及苏氨酸类似物和蛋氨酸类似物抗性的黄色短杆菌, L-组氨酸的产量也只有10g/L。 例7.2.1 利用甘油缺陷型突变株从正构石蜡生产谷氨酸 几乎所有的氨基酸发酵都是以葡萄糖作为碳源生产的，但是也有例外。菊池和中尾根据青霉素能够促进谷氨酸积累的机理，发现谷氨酸的分泌与细胞壁中磷脂质的分泌有密切关系。图7.2.4显示了在葡萄糖或正烷烃为碳源时的磷脂质合成和谷氨酸合成的代谢途径和控制机理。可以看到磷脂质的合成是由甘油和乙酰辅酶A所合成的脂肪酸两者共同负责的，如果图中所示的途径（2）被切断，磷脂质的合成就只与脂肪酸有关，而脂肪酸可以通过正构烷烃的生物氧化获得。他们将溶烷棒状杆菌用MNNG进行诱变处理，得到一株甘油缺陷型菌株GL-21，发现该突变株缺少甘油井-磷酸：NADP氧化还原酶，因此不难想象催化将二羟丙酮磷酸转化为甘油三磷酸的反应，从而阻止了甘油的生物合成。该菌株在培养时只要限制甘油的供给量，就能抑制磷脂质的合成，使谷氨酸大量积累，谷氨酸产量达到了72g/L。 图7.2.4 细胞内磷脂质合成控制和谷氨酸生产 7. 2. 2. 2 选育生产氨基酸的代谢调节突变菌株 营养缺陷型突变菌株的选育方法不能用于生产非分支代谢途径中末端产物氨基酸的高产菌种，只有选育代谢调节突变株的的方法才能达到这个目的。代谢调节突变株中微生物的某些生物合成的调节机制已经缺失，这样使产物氨基酸的积累得到了强化。选育的方法是分离对氨基酸类似物具有抗性的突变株，或从营养缺陷型菌株进一步得到某种调节酶缺失的回复突变株。 一般情况下, 与天然氨基酸结构类似的化合物对于特定微生物的生长具有抑制作用。为了突出这类化合物与氨基酸在立体化学结构上具有类似性的特点，氨基酸类似物又被称为“同形物”。同形物对微生物生长的抑制作用可以通过加入相应的天然氨基酸而得到克服。如果在氨基酸的合成途经中加入同形物，就会成为相应酶的共阻遏剂或共反馈抑制剂，与此同时同形物又能抑制将氨基酸结合到蛋白质的反应。因此如果突变株对氨基酸的同形物具有抗性，就表明相应的调节酶已经丧失了对反馈抑制和反馈阻遏的敏感性。 以生产L-赖氨酸的菌种选育为例。图7.2.3已经显示了L-赖氨酸和L-苏氨酸对天冬氨酸激酶的协同反馈调节。硫代赖氨酸（SAEC）是赖氨酸的同形物，当培养基中加入SAEC时，细菌的生长受到抑制。若培养基中同时存在L-苏氨酸，抑制作用加强；但若加入L-赖氨酸，则使抑制减弱。因此如果能够选育出具有SAEC抗性的调节突变株，天冬氨酸激酶将对协同反馈调节不敏感，使突变菌株能够在SAEC和L-苏氨酸共同存在的培养基中生长，而且会大量积累L-赖氨酸。有人曾经选育出一株具有SAEC抗性的黄色短杆菌，它的L-赖氨酸产量比野生菌种提高了150倍，达到31.33g/L。 例7. 2. 2 L-赖氨酸生产菌种选育 下面以L-赖氨酸生产菌种选育为例说明营养缺陷—调节突变菌株的选育方法。L-赖氨酸和L-苏氨酸的合成途径参考图7.2.3。若以乳酸发酵棒杆菌作为出发菌种，对该菌种而言，单独或同时加入L-赖氨酸和L-苏氨酸都会抑制天冬氨酸激酶，参与L-赖氨酸合成的二氢二吡啶羧酸合成酶又会受到L-亮氨酸的阻遏，这种代谢调节作用称为“代谢联锁”。育种工作的第一步是在含SAEC的培养基上筛选出SAEC抗性的调节突变菌株，使菌株中的天冬氨酸激酶对L-赖氨酸和L-苏氨酸不敏感，L-赖氨酸生产能力达到18g/L；第二步，在SAEC抗性的调节突变菌株基础上进一步筛选出L-亮氨酸缺陷型突变株，解除L-亮氨酸对二氢二吡啶羧酸合成酶的阻遏，营养缺陷—调节突变菌株的L-赖氨酸生产能力进一步提高到41g/L。从SAEC抗性的调节突变菌株选育丙氨酸营养缺陷型也能够获得L-赖氨酸的高产菌种。丙氨酸是从丙酮酸经丙酮酸—L-氨基酸转氨酶或从L-天冬氨酸经L-天冬氨酸-β-脱氢酶合成的，而丙酮酸和L-天冬氨酸是L-赖氨酸和L-丙氨酸合成的共同前体，因此如果能够切断合成丙氨酸的代谢途径, 就增加了L-赖氨酸何尝的前体。为此在SAEC抗性的调节突变菌株基础上筛选L-丙氨酸营养缺陷型菌株的L-赖氨酸产量也能达到39g/L。另外一种提高L-赖氨酸产量的育种方法是选育具有多重抗性的突变株。γ-甲基-L-丙氨酸和α-氯代己内酰胺分别是L-丙氨酸和L-亮氨酸的同形物，而且乳酸发酵棒杆菌对这两种同形物均高度敏感，根据这一机理选育的一株对SAEC、γ-甲基-L-丙氨酸和α-氯代己内酰胺具有多重抗性的L-丙氨酸营养缺陷型菌株的L-赖氨酸产量提高到了60g/L。 表7.2.2通过调节突变和营养缺陷-调节突变 获得的氨基酸生产菌种 氨基酸  微生物  遗传标记 产量 G/L  L-Arginine (L-精氨酸) Bacillus subtilis Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Serratia marcescens B. subtilis ArgHXr, 6AUr D-Serr, D-Argr, ArgHXr, 2TAr Ile回复突变 2TAr, guanine－ Arg(Fr), Arg(Rr), Arg(D) ArgHXr, 5HURr, TRAr, 6FTr, 6AUr 28.0 25.0 8 0 17.0  L-Citrulline (L-瓜氨酸) Bacillus subtilis ArgHXr, 6AUr, Arg－ 26.2  L-Histidine (L-组氨酸) Corynebacterium glutamicum C. glutamicum C. glutamicum Serratia marcescens Streptomyces coelicolor TRAr TRAr, Leu－ TRAr,6MGr,8AGr,4TUr, 6MPr, 5MTr Histidase－, TRAr, 2MHr His-回复突变 0 11.0 0 13.0 3.5  L-isoleucine (L-异亮氨酸) Serratia marcescens Brevibacterium flavum C. glutamicum IleHXr, ABAr AHVr, OMTr Met－, AHVr, TILr, AECr, ETHr, AZLr, ABAr AHVr,AECr,Ethr(碳源是乙酸) AHVr,AECr,Ethr,(-ABr, IleHXr 0 14.5 7 37.5 30.0  L-Leucine (L-亮氨酸) Serratia marcescens Brevibacterium flavum ABAr, Ile-回复突变 TAr, Met－, Ile－ 13.5 28.0  L-Lysine (L-赖氨酸) Brevibacterium flavum Brevibacterium flavum Brevibacterium flavum Brevibacterium flavum Candida pelliculosa C. glutamicum Thrs, Mets AECr AECr, Ala－, CCLr, MLr AECr, AHVr AECr AECr, Homoser－, Leu－, Pant 25.0 32.0 60.0 29.0 3.2 42.0  L-Methionine (L-蛋氨酸) C. glutamicum Thr－, ETHr, SMEr, MetHXr 2.0  L-Phenylalanine (L-苯丙氨酸) Brevibacterium flavum Bacillus subtilis C. glutamicum B. lactofermentum MFPr 5FPr PFPr, PAPr 5MTr, PFPr, Decs, Tyr－, Met－ 2.2 6.0 9.5 24.8  L-Serine (L-丝氨酸) C. glutamicum OMSr, MSEr, ISEr 3.8  L-Threonine (L-苏氨酸) Escherichia coli Brevibacterium flavum C. glutamicum Brevibacterium flavum Serratia marcescens Serratia marcescens AHVr, Met－, Ile－ AHVr, Met－ AHVr, Met－, AECr AECr, AHVr Ile－, DAP－, AHVr Ile－, DAP－, AHVr AECr Thr dehydrogenase－, Thr deaminase－, 6.1 18.0 14.0 14.8 12.7 25.0  L-Tryptophan (L-色氨酸) Brevibacterium flavum Brevibacterium flavum C. glutamicum 5FTr MFPr Phe－ 5FTr AZSr PFPr Tyr－ 5MTr 4MTr 6FTr TrpHXr PFPr PAPr TyrHXr Phe－, PheHXr Tyr－ 6.2 10.5 12.0  L-Tyrosine (L-酪氨酸) Brevibacterium flavum C. glutamicum MFPr 3ATr, PAPr, PFPr, TyrHXr, Phe－ 1.9 17.6  L-Valine (L-缬氨酸) Brevibacterium flavum TAr 31.0  注：ABA－α-氨基丁酸；AEC－S-（β氨乙酰基）胱氨酸；AZ－氮鸟嘌呤；AHV－α-氨基β-羟基戊酸；AT－氨基-酪氨酸；AU－氮鸟嘧啶；AZL－氮亮氨酸；AZS－氮丝氨酸；CCL－α氯代己内酰胺；Dec－德夸霉素；DAP－α，ε-二氨基庚二酸；ETH－乙硫氨酸；FT－氟代色氨酸；HUR－羟基尿苷；HX－氧污酸；ISE－异丝氨酸；MFP－m-氟代苯丙氨酸；MG－巯基鸟嘌呤；MH－甲基组氨酸；ML－γ-甲基赖氨酸；MP－巯基嘌呤；MSE－γ-甲基丝氨酸；MT－甲基色氨酸；OMS－Ο-甲基丝氨酸；OMT－Ο-甲基苏氨酸；PAP－p-甲基苯丙氨酸；PFP－p-氟代苯丙氨酸；SME－硒蛋氨酸；TA－噻脞丙氨酸；TIL－硫代异亮氨酸；TRA－1,2,4-三叠氮丙氨酸；TU－硫代鸟嘧啶；Arg(Fr)－缺失精氨酸反馈抑制；Arg(Rr)－缺失精氨酸操纵子的遏制；Arg(D)—缺失精氨酸降解酶 L-苏氨酸的生产菌选育也采用营养缺陷—调节突变的方法。如前所述, L-苏氨酸的积累受到L-苏氨酸和L-赖氨酸对高丝氨酸脱氢酶的协同抑制作用，但是采用异亮氨酸营养缺陷—SAEC抗性突变株却不能达到大量积累L-苏氨酸的目的。研究发现α-氨基-β-羟基戊酸这种苏氨酸的类似物可以使得谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌对L-苏氨酸的反馈抑制不敏感，同时，参与L-苏氨酸合成的高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶受到蛋氨酸的阻遏。根据以上机理选育得到的α-氨基-β-羟基戊酸抗性的蛋氨酸营养缺陷型菌株就具有较高的L-苏氨酸生产能力。 许多事实都证明了营养缺陷型和调节突变型结合的突变株可以大大提高菌株积累氨基酸的能力，这种方法已经广泛地用于氨基酸高产菌种选育。表7.2.2列出了通过选育调节突变型和营养缺陷-调节突变型突变株, 菌株的氨基酸积累水平。 例7. 2. 2芳香族氨基酸生产菌种的选育生产菌种的选育 赤藓糖-4-磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸 DAPH合成酶 DAPH 分枝酸 分枝酸变位酶 邻氨基苯甲酸合成酶 预苯酸 邻氨基苯甲酸 预苯酸脱水酶 苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸 图7.2.5在黄色短杆菌中芳香族氨基酸生物合成途径和调节机理 反馈抑制； 抑制解除 在黄色短杆菌中，L-苯丙氨酸的生物合成途经和调节机理如图7.2.5所示。在该分支代谢途经中的第一个酶是3-脱氧-α-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸（DAHP）合成酶，该酶受到L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的负反馈抑制；邻氨基苯甲酸合成酶则受到色氨酸的强烈抑制；而分枝酸变位酶不受任何调节控制。酪氨酸预苯氨酸转氨酶也不受酪氨酸的调节，预苯氨酸脱水酶则受到L-苯丙氨酸的反馈抑制。 针对上述芳香族氨基酸生物合成的调节机理，显然, 如果要获得L-苯丙氨酸生产菌, 就必须解除L-苯丙氨酸对DAHP合成酶和预苯氨酸脱水酶的抑制。为此选育了对L-苯丙氨酸的类似物m-氟苯丙氨酸（MFP）抗性的突变株，但该突变株积累L-苯丙氨酸的能力只有2g/L。由于酪氨酸也对DAPH合成酶有抑制作用，选育了酪氨酸营养缺陷型菌株，L-苯丙氨酸的产量也只有1.8g/L。但是如果将上述两种方法结合起来，选育得到的胳氨酸营养缺陷—p-氟苯丙氨酸和5-氟代色氨酸双重抗性的突变株，L-苯丙氨酸的产量可以达到25 g/L。 与L-苯丙氨酸同属芳香族氨基酸的色氨酸和酪氨酸也都是以分枝酸作为前体合成的, 在色氨酸的分支代谢途径中, 色氨酸对该途径所有四种酶都有反馈抑制, 因此如果要积累L-色氨酸, 就要解除终端产物的反馈抑制, 选育出L-苯丙氨酸类似物(5-氟色氨酸)抗性突变株的L-色氨酸产量比出发菌株提高了7.5倍, 达到2.4g/L; 进一步筛选得到的谷氨酰胺类似物(重氮丝氨酸)抗性突变株提高了分支代谢途径第一个酶(邻氨基苯甲酸合成酶的活性, 将产量提高到了10.3g/L; 由于p-氨基苯甲酸是合成芳香族氨基酸的前体, 该中间产物是从叶酸生物合成途径中的二氢蝶酸得到, 因此如果能够强化二氢蝶酸的合成, 减少它用于其它生物合成途径的消耗, 也将提高色氨酸的产量。为此, 筛选得到了磺胺呱抗性突变株, 使L-色氨酸产量提高到了19g/L。 在酪氨酸生产菌的诱变育种时, 其它调节途径都与苯丙氨酸相同, 唯一要强调的是必须切断从预苯酸到苯丙氨酸的代谢途径, 因此需要选育苯丙氨酸抗性和酪氨酸类似物抗性的突变株。这样筛选得到的菌种的酪氨酸产量可达到17.6 g/L。 例7.2.4 L-赖氨酸生产菌种选育的另一种方法 以葡萄糖为碳源，利用Brevibacterium lactofermentum生产L-赖氨酸的代谢途经如图7.2.6所示。从图中可以看到, 如果在更广泛的范围分析赖氨酸的生物合成途径, CO2的固定化对提高碳源利用率和赖氨酸产量十分有利。 2 葡萄糖 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸 丙氨酸，亮氨酸等 CO2 CO2 4 CO2 1 生物素○ 2 乙酰辅酶A 天冬氨酸 草酰乙酸 苏氨酸 天冬氨酸半醛 三羧酸循环 丙酮酸 亮氨酸 赖氨酸 图7.2.6 在B. lactofermentum中从葡萄糖到赖氨酸的生物合成途经和调节机理 阻遏， 反馈抑制，○ 活化 1。PEP羧化酶， 丙酮酸羧化酶，3。丙酮酸激酶，4。丙酮酸脱氢酶 研究表明，该菌株的特点是羧化酶缺陷型突变株不能在葡萄糖作为唯一碳源的培养基中生长，但若培养基中加入200μg/L的生物素，突变株就能够生长，说明该菌株同时含有丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化酶，分别催化以下两个反应： 丙酮酸 + ATP + HCO3－ 草酰乙酸 + ADP + P 磷酸烯醇式丙酮酸 + HCO3－ 草酰乙酸 + P 这两个反应都具有固定CO2的作用，第一个反应需要生物素参与，而第二个反应则不需要。为了提高L-赖氨酸的产量，除了前面考虑的支路代谢中的抑制机理外，还很有必要促进天冬氨酸及其前体草酰乙酸的产生。 从图中可以看到，从PEP到草酰乙酸的代谢途经受到L-天冬氨酸的反馈抑制，这与L-赖氨酸的合成需要大量的L-天冬氨酸作为前体是矛盾的。因此从PEP到草酰乙酸的代谢途经不可取，而应该强化从丙酮酸到草酰乙酸的反应。另外, 丙酮酸激酶对乙酰辅酶A和L-天冬氨酸都不敏感，但能够被生物素诱导和激活，高浓度的生物素有利于将丙酮酸转化为草酰乙酸，进而促进赖氨酸的生物合成。由于丙酮酸是L-丙氨酸、L-亮氨酸等的共同前体，需要切断这些支路代谢途经。 根据图7.2.6的代谢机理和上述分析，Tosaka和 Takinami从野生型 B. lactofermentum出发，经过一系列的诱变育种，最终得到菌种的L-赖氨酸生产能力达到48g/L。具体的选育步骤如图7.2.7所示。 Brevibcterium lactofermentum 赖氨酸产量, g/L AJ 1511(野生型) 0.0 AJ 3445(AECr) 16.0 AJ 3424(AECr, Ala－) 33.0 AJ 3796(AECr, Ala－, CCLr) 39.0 AJ 3991(AECr, Ala－, CCLr, MLr) 43.0 AJ 11204(AECr, Ala－, CCLr, MLr, FPs) 48.0 图7.2.7从Brevibcterium lactofermentum野生菌株出发 选育赖氨酸高产菌的步骤 核糖单磷酸途径 木酮糖单磷酸途径 蛋氨酸 CH3OH HCHO HCOOH CO2 THF 5,10-CH2-THF THF 5-CH2-THF 高胱氨酸 甘氨酸 丝氨酸 丝氨酸循环 胱硫醚 乙醛酸 2-磷酸-甘油酸 图7.2.8甲醇利用菌生产氨基酸的代谢途径示意图 7.2.3利用氨基酸生物合成的前体生产氨基酸 这是一种半发酵法生产氨基酸的工艺。这种工艺的特点是：将氨基酸生物合成途径中的某一中间代谢产物加入细胞培养介质，利用活菌体将该中间代谢产物转化为氨基酸。利用前体生产氨基酸可以显著地消除或减少反馈抑制调节的影响，缺点是前体的价格要比发酵所用的碳源贵得多。半发酵法与酶法生产氨基酸的差别是：在半发酵法中前体是在发酵的开始或中间加入到培养介质中，一般须要一步以上的酶催化化反应，催化剂是活菌体，而酶法一般只须一步反应，催化剂是提纯的酶或死菌体。 半发酵法生产氨基酸的成功取决于对代谢途径的正确了解。以半发酵法生产L-异亮氨酸为例，在细菌中L-异亮氨酸是由L-苏氨酸经α-酮丁酸生物合成的，由于L-苏氨酸是L-苏氨酸脱氢酶的反馈抑制剂，使L-苏氨酸转化为α-酮丁酸和氨的反应受到了抑制，从而使L-异亮氨酸的积累受到影响。如果在培养基中加入DL-α-氨基丁酸或DL-α-羟基丁酸，则可以不经过苏氨酸脱氢酶的作用，从而可以避开受到L-异亮氨酸反馈抑制。生产L-异亮氨酸的另一种方法是在培养基中加入D-苏氨酸，该前体的加入会诱导D-苏氨酸脱氢酶的产生，并将D-苏氨酸转化为α-酮丁酸，D-苏氨酸脱氢酶不受L-异亮氨酸的反馈抑制。 用直接发酵法生产L-丝氨酸的方法尚不成熟，但是用甘氨酸作为前体与甲烯基四氢叶酸反应可以生成L-丝氨酸。能够利用甲醇的细菌都能产生甲烯基四氢叶酸，其代谢途径如图7. 2. 8所示。 其它采用加入前体的方法经半发酵法生产的氨基酸及相应的微生物列于表7.2.4。 表7.2.4利用生物转化的前体生产氨基酸 氨基酸 微生物 前体  L-组氨酸 Brevibacterium flavum 组氨醇  L-异亮氨酸 Serratia marceecens Bacillus subtilis Cornybacterium sp. Serratia marceecens Bacellus, Brevibacterium, aerobacter etc. Brevibacterium, Cornybacterium, etc. DL-α-氨基丁酸 DL-α-氨基丁酸 DL-α-氨基丁酸 D-苏氨酸 DL-α-羟基丁酸 DL-α-溴基丁酸  L-蛋氨酸 Pseudomonas denitrificans 2-羟基-4-甲基硫代丁酸  L-苯丙氨酸 Pseudomonas denitrificans 2-羟基-3-苯基丙酸  L-丝氨酸 Cornybacterium glycinophilum Pseudomonas sp. Arthrobacter globiformis sarcina albida Nocardia butanica Pseudomonas sp. 甘氨酸 甘氨酸 甘氨酸 甘氨酸 甘氨酸 甘氨酸  L-苏氨酸 Bacillus subtilis Proteus rettgeri Enterobacter L-高丝氨酸 L-高丝氨酸 DL-高丝氨酸  L-色氨酸 Claviceps purpurea Hansenula anomala 吲哚 邻氨基苯甲酸   7.2.4 利用基因重组技术获得氨基酸生产菌种 早在七十年代初，人们就试图将基因重组技术应用于获得氨基酸高产菌种。最初一般采用基因转导技术，分两步进行。首先挑选出各种调节机制完全缺失的突变组，然后将选出的突变株通过共转导技术结合在一起。 直接应用基因重组技术获得生产氨基酸的基因工程菌的研究在八十年代初就已经开始了，最早的工作是由Aiba等人在1982年报道的，他们将L-色氨酸操纵子缺失的突变株和携带L-色氨酸操纵子的质粒结合，成功地构建了生产L-色氨酸的基因工程大肠杆菌。该质粒的邻氨基苯甲酸合成酶和磷酸核糖氨基苯甲酸转移酶对反馈抑制不敏感，而作为宿主细胞的大肠杆菌则是L-色氨酸阻遏缺陷和L-色氨酸酶缺陷型的突变株。 基因重组技术在生产L-苏氨酸的工程菌构建中也获得了成功, Debabov等人早在1982年就从((氨基((-羟基戊酸(AHV)抗性L-苏氨酸生产菌的染色体中将代有AHV抗性标记的合成L-苏氨酸的基因片段用Hind III切下后克隆到pBR322质粒转入不产L-苏氨酸的突变株, 所得到的基因工程菌产L-苏氨酸能力达到55g/L。 现在, 基因工程菌的宿主细胞已经从Gram阴性菌发展到Gram阳性菌。生产氨基酸的基因工程菌的研究还在深入持久地开展下去，将为提高氨基酸的发酵水平作出贡献。 例7.3.1 利用转导杂交(Transductional cross)技术选育L-苏氨酸和L-异亮氨酸生产菌 L-苏氨酸和L-异亮氨酸是必需氨基酸之一, 其中L-异亮氨酸它有四种光学异构体, 分别为L-, D-, L-别-,-及D-别-等, 因此无法采用化学合成后在拆分的方法合成L-异亮氨酸, 可以用异亮氨酸缺陷型的大肠杆以D-苏氨酸或((氨基丁酸为前体合成。本例将介绍用转导杂交技术选育L-苏氨酸和L-异亮氨酸生产菌的方法。 出发菌株选用沙门氏菌Salmonella typhimurium, 该菌中异亮氨酸的合成途径是从天冬氨酸经苏氨酸合成异亮氨酸, 受到异亮氨酸, 缬氨酸, 亮氨酸, 苏氨酸, 赖氨酸和单氨酸的抑制或阻遏。 L-苏氨酸的选育工作分为以下几个步骤: 获得苏氨酸生产菌D-60。从野生菌种8000选育苏氨酸脱氢酶和苏氨酸脱氨酶缺陷型菌株。 以D-60为亲本, 选育出天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I对苏氨酸调节的反馈抑制不敏感的突变株(thrA11, thrA21)和对(-羟基正缬氨酸抗性的突变株(hurA1), 该物质是苏氨酸类似物, hurA1突变株中解除了对上述两种酶的阻遏。 选育赖氨酸泪水物, S-氨基乙基胱氨酸, 抗性突变株(lysC1), 该突变株解除了赖氨酸对天冬氨酸激酶III的阻遏和反馈调节。 将上面得到的四个突变株通过两次转导杂交获得一个新的菌株(T-693), 这个杂交株中已经除去了引起苏氨酸降解的酶系, 苏氨酸的产量达到了24-25g/L。 L-异亮氨酸的出发菌株也是8000野生菌株, 选育步骤如下: 筛选出异亮氨酸氧肟酸抗性突变株(GIHVLr6426), 该突变株在阻遏培养条件下的L-苏氨酸脱氢酶和乙酰氧肟酸合成酶活力很高, 在固体培养时若以L-苏氨酸为底物可大量积累异亮氨酸。 通过分析发现上面得到的GIHVLr6426菌株实际上有两种突变形式, 其中一种(iluA2)的L-苏氨酸脱氨酶对反馈抑制脱敏, 另一种(ihr-1)则加强及L-苏氨酸脱氨酶和乙酰氧肟酸合成酶II这两个组成酶的合成。 将这两个异亮氨酸调节突变株转导入上面选育的L-苏氨酸生产菌株T-693, 采用T-693与生长在GIHVLr6426菌株上的噬菌体转导杂交的方法,筛选出异亮氨酸氧肟酸抗性菌株T-803, 该菌株的L-异亮氨酸产量达到25g/L。 野生菌株和转导杂交方法获得的高产均株的基因型及各自的L-苏氨酸和L-异亮氨酸产量列于表7.3.1。 表7.3.1野生菌株和转导杂交方法获得的高产菌株的基因型及各自的产物分布 菌株 基因型 产量, g/L   lysC ThrA1 ThrA2 hurA ihr iluA L-Thr L-Ile  8000 + + + + + +  0.1  0.1  GIHVLr6426 + + + + 1 2  0.1  3.5  T-693 1 1 1 1 + 1  23.5  0.1  T-803 1 1 1 1 1 2  0.1  24.5  注: +代表存在对酶的阻遏和抑制; 1或2代表解除阻遏和抑制